一種寡雄腐黴原生質體的製備和再生方法與複合酶解液與流程
2023-10-18 01:52:39
本發明涉及一種微生物原生質體製備和再生方法，具體的說是一種關於生防真菌寡雄腐黴原生質體的製備和再生方法。本發明還涉及一種用於製備寡雄腐黴原生質體的複合酶解液。
技術背景
寡雄腐黴屬於卵菌門腐黴科腐黴屬，是一種土壤習居型腐生菌，其能夠在多種重要的農作物根圍定殖，對植物和動物都沒有毒性，對環境安全。寡雄腐黴的菌絲可以寄生於病原菌體內，幹擾寄主的代謝活動，消耗細胞內的養分，造成病菌死亡，同時，還能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生長活性物質，促進植物生理代謝，養分吸收和生長發育。寡雄腐黴不僅對多數致病真菌有很強的寄生或拮抗作用，並且能誘導農作物產生系統抗性，是一種非常有應用價值的生防真菌。對其進行更進一步的研究利用，特別是從分子水平對其進行功能基因、遺傳性狀改造等研究勢在必行。
原生質體是指完整細胞剝除細胞壁結構後所形成的裸露細胞，為球狀單細胞，易於攝取外源大分子、細胞器及細菌和病毒，是真菌遺傳轉化和功能研究的重要工具。製備原生質體可為該類真菌進行分子標記，以及目的基因標記與克隆提供基礎實驗材料。
真菌具有複雜的細胞壁成分，不同菌種，甚至同一菌種不同菌株的細胞壁成分也有差異，其原生質體製備和再生需要的條件也不一樣。有效去除細胞壁的同時還要維持原生質體滲透壓平衡，選擇適宜的滲透壓穩定劑是原生質體成活的保障。高效穩定的再生條件是原生質體恢復生長的唯一途徑，現有報導中採用的再生方式幾乎都是固體培養再生，可是寡雄腐黴原生質體無法在固體再生培養基中恢復生長，這就需要摸索適宜寡雄腐黴原生質體再生的方法。目前國內外鮮見關於寡雄腐黴原生質體製備方法的報導，要想對這種非常有應用價值的生防真菌寡雄腐黴從分子水平進行進一步研究利用，就需要摸索出一套適用於寡雄腐黴原生質體製備及再生的方法用於後期研究應用。
不同菌株的細胞壁成分差異顯著，因而在製備原生質體時用於去除細胞壁的複合酶解液也是千差萬別的，目前尚未有寡雄腐黴專用複合酶解液，其餘菌株所使用的複合酶解液不能去除寡雄腐黴的細胞壁，因而無法完成寡雄腐黴原生質體的製備。
技術實現要素：
本發明的目的是針對上述問題，提供一種寡雄腐黴原生質體製備及再生的方法，經該方法得到的原生質體可用於從分子水平上進行寡雄腐黴基因功能、基因改造等相關基因遺傳轉化的研究應用，本發明的第二目的是提供一種寡雄腐黴專用的高效複合酶解液體系，用於酶解寡雄腐黴菌絲孢子混合體。
本發明的內容，一是提供一種優化簡便的製備寡雄腐黴原生質體的方法，具體步驟如下：
（1）菌絲體製備：將寡雄腐黴菌絲接種在PDA平板培養基上，26℃，培養3～5d，將平板上的菌絲孢子混合體全部刮下來，用滲透壓穩定劑洗滌，離心收集寡雄腐黴菌絲孢子混合體；
（2）原生質體製備：向收集到的寡雄腐黴菌絲孢子混合體中，加入複合酶解液，充分溶解進行酶解，獲得寡雄腐黴原生質體；
（3）原生質體純化：上述獲得的寡雄腐黴原生質體與菌絲孢子的混合物，過濾除去未被酶解的菌絲與孢子體；離心收集純化後的寡雄腐黴原生質體。
作為優選，所述滲透壓穩定劑為：0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl2和10 mmol/L Tris-HCl， pH值為7.5。
作為優選，離心收集寡雄腐黴菌絲孢子混合體的條件為：5500rpm，室溫離心10min。
作為優選，複合酶解液體系為：針對每1g寡雄腐黴菌絲孢子混合體，複合酶解液的配方為， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時為0。
作為優選的，複合酶解液酶解寡雄腐黴菌絲孢子混合體的酶解條件為：30℃，80rmp,酶解2～3h。
作為優選的，離心收集純化寡雄腐黴原生質體的條件為：5500rpm，室溫離心10min。
本發明的內容二是提供一種有效的寡雄腐黴原生質體的再生培養途徑，具體步驟如下：用前述的滲透壓穩定劑洗滌重懸寡雄腐黴原生質體，並將原生質體濃度稀釋到108個/mL；將純化稀釋後的寡雄腐黴原生質體在液體再生培養基中26℃，80rpm，液體振蕩培養2～4d。
作為優選，液體再生培養基為添加了0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl2和10 mmol/L Tris-HCl的PDB液體培養基，pH值為7.5。
本發明的內容三是提供一種專用高效複合酶解液體系用於酶解寡雄腐黴菌絲孢子混合體，具體的複合酶解液體系為：針對每1g寡雄腐黴菌絲孢子混合體，複合酶解液的配方為， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時為0。
本發明的有益效果是：（1）本發明提供的原生質體製備方法保證了寡雄腐黴菌體有效破壁且破壁數量多，選用的滲透壓穩定劑可以高效的保護原生質體的完好性，優化的純化條件可以完全地將原生質體沉於管底，原生質體濃度可達109個/mL，並且可以很好地保持原生質體的完好性。（2）本發明所選用的寡雄腐黴原生質體在添加的了滲透壓穩定劑的PDB液體培養基中液體振蕩培養的再生途徑，可以高效地使寡雄腐黴原生質體再生成寡雄腐黴成熟球形菌體，再生率高達到1.25%，穩定性好，並且可以很容易的挑取單克隆菌體。（3）本發明所建立的複合酶解液體系，可以高效的使寡雄腐黴菌壁破裂釋放出原生質體，得到的原生質體品質好、數量多，能夠滿足相關研究要求。
本發明確定了高效簡便的寡雄腐黴原生質體的製備和再生方法，為寡雄腐黴在分子生物學領域的進一步應用開發提供了基礎。本發明提供的高效複合酶解液體系可以作為專用複合酶進行開發推廣，市場前景廣闊。
附圖說明
圖1是實施實例中獲得的寡雄腐黴原生質體；
圖2 是實施實例中寡雄腐黴原生質體活性檢測；
圖3 是實施實例中寡雄腐黴原生質體再生結果。
具體實施方式
下面結合具體實施實例對本發明進行詳細說明。以下實施實例有助於此領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。
以下實驗所用活性酶來自：lysing enzyme（Sigma），cellulase（Yakult），lyticase（Tiangen）。
以下實驗中使用的培養基配方如下：
PDA：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過濾掉馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用；
PDB：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過濾掉馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用。
實施例一 寡雄腐黴原生質體製備及再生。
將寡雄腐黴菌絲圓盤接種在PDA平板培養基上，26℃，培養4d，在超淨工作檯中，將4個平板上的菌絲孢子混合體用無菌接種環全部刮下來（約1g），置於離心管中；用5mL滲透壓穩定溶液（0.8M甘露醇，25mM CaCl2，10mM Tris-HCl pH7.5）洗滌菌絲孢子混合體，5500rpm，離心10min，重複洗滌離心3次，收集寡雄腐黴菌絲孢子混合體；向上一步收集到的寡雄腐黴菌絲孢子混合體中加入複合酶解液（4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase），充分溶解進行酶解，30℃，80rmp,酶解2h，獲得寡雄腐黴原生質體；上述獲得的寡雄腐黴原生質體與菌絲孢子殘渣混合物，通過4層無菌擦鏡紙過濾，除去未被酶解的菌絲與孢子體；將濾液於5500rpm，室溫離心10min，收集純化後的寡雄腐黴原生質體。
向上述獲得的寡雄腐黴原生質體中加入2mL滲透壓穩定溶液洗滌，5500rpm，室溫離心10min，用滲透壓穩定溶液重懸原生質體，使濃度達到108個/mL，以備後用；將此原生質體加入到20mL 再生液體培養基中（PDB，0.8M甘露醇，25mM CaCl2，10mM Tris-HCl），26℃，80rpm，振蕩培養2d，可再生出寡雄腐黴球形菌體（直徑2～6mm）。將此球形菌體接種在PDA固體平板上，26℃，可生長為寡雄腐黴菌絲體，生長3d菌體可鋪滿平板。
本實施實例中獲得的寡雄腐黴原生質體濃度可達109個/mL，原生質體再生率為1.25 %。通過本實例獲得的寡雄腐黴原生質體數量多、品質好，能夠滿足後續的遺傳轉化，基因改良等研究需要。
實施例二 複合酶解液成分測定實驗。
按照實施例一中所述方法，lysing enzyme，cellulase ，lyticase不同配比對寡雄腐黴菌絲孢子混合體進行酶解，收集原生質體，測定原生質體濃度，並進行原生質體再生實驗，測定原生質體再生率，根據實驗結果確定最佳複合酶解液成分，實驗結果如下表所示。
通過實驗可見，單獨使用lysing enzyme、cellulase或lyticase其中的一種酶（如⑴～⑶），或者在沒有lyticase的參與下（如⑷）對寡雄腐黴菌絲體進行酶裂解，均無法使寡雄腐黴釋放出原生質體。當1g菌絲體中加入的lyticase的活性超過200U時（如⑿），會破壞原生質體的活性使再生率降低。本發明所確定的得到寡雄腐黴原生質體所需的複合酶解液體系為（1g菌絲體）：0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticas，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時為0。
實施例三 複合酶解液酶解時間測定實驗。
採用實施例二中確定的複合酶解液，即4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase，分別酶解寡雄腐黴菌絲孢子混合體1h、1.5h、 2h、2.5h、3h、4h、5h和 過夜，其餘方法同實施例一，觀察原生質體製備情況。
實驗結果顯示，酶解1h、1.5h後，未被酶解的菌體較多，釋放出的原生質體較少；酶解4h、5h後得到的原生質體有酶解過度破裂現象，後期再生情況不好；過夜酶解後，原生質體全部被酶解為碎片殘渣；酶解2-3h，可獲得數量較多、活性較高的寡雄腐黴原生質體。
實施例四 滲透壓穩定劑成分測定實驗。
按照實施例一中所述方法，採用不同種、不同濃度的滲透壓穩定劑進行寡雄腐黴原生質體製備和再生，測定原生質體再生率，根據實驗結果確定最佳滲透壓穩定劑成分，實驗結果如下表所示。
由實驗結果可見，選用⑴～⑷組滲透壓穩定劑可再生成功，其中以⑵組最好，故製備寡雄腐黴原生質體的滲透穩定劑優選為0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl2和10 mmol/L Tris-HCl。
實施例五 寡雄腐黴原生質體再生途徑測定實驗。
實驗方法同實施例一，所有再生培養基中均添加0.8M甘露醇，25mM CaCl2和10mM Tris-HCl），僅培養方式採用⑴ 固體塗板；⑵ 固體包埋；⑶ 固液雙層；⑷ 液體振蕩培養。
實驗結果表明，⑴～⑶組再生方式均無法再生成功，採用⑷組作為寡雄腐黴原生質體再生方式，可以很好維持原生質體滲透壓，提供原生質體再生的有利條件，繼而再生為寡雄腐黴成熟菌體。在液體再生培養基中寡雄腐黴原生質體再生為單個的球形菌體，方便基因轉化後的單克隆轉化子挑選，簡化篩選流程。
以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實例方式，本領域技術人員可在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並不影響本發明的實質內容。