使哺乳動物的惡性細胞選擇性地處於甲硫氯酸飢餓狀態的方法

2023-10-24 20:18:32 2

專利名稱：使哺乳動物的惡性細胞選擇性地處於甲硫氯酸飢餓狀態的方法
技術領域：
本發明涉及基於惡性細胞與非惡性細胞(即「正常」)細胞之間的代謝差異，選擇性地破壞哺乳動物惡性細胞的方法。更具體地說，涉及通過將血漿甲硫氨酸和高半胱氨酸降解而使喪失了將5′-甲硫腺苷轉化為甲硫氨酸所需酶的惡性細胞處於飢餓狀態的方法。
甲硫氨酸(MET)是正常和惡性細胞生長所必需的。在某些惡性細胞中這種需求是純對的，即，沒有適當供應的MET，細胞就死亡。
在哺乳動物細胞中，MET可由三種來源獲得，從食物中獲得，或者通過從L-高半胱氨酸(高半胱氨酸)或5′-甲硫腺苷(MTA)(一種聚胺生物合成途徑的產物)生化合成獲得。在後一種情況下，由5′-甲硫腺苷磷酸化酶(MTA酶)將MTA轉化為MET。
在過去的十年中，研究者已經鑑別了許多失去了MTA酶並因此不能將MTA轉化為MET的惡性細胞系。例如，Katamari等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，781219-1223(1981)報導了3個人惡性腫瘤細胞系中23％缺乏可檢測的MTA酶，而在所研究的16個非惡性細胞系中每一個都存在MTA酶活性。MTA酶陰性細胞主要通過轉化高半胱氨酸滿足對MET的需要。但是，當高半胱氨酸得不到時，通常細胞將會死亡。
已知L-甲硫氨酸-L-脫氨基-y-巰基甲烷裂解酶(1-methionine-L-deamino-y-mercaptomemane lyase)(ED 4.4.1.11；MET酶)不僅能降解MET，也能降解高半胱氨酸。因此，從理論上說，可通過用MET酶將血漿MET和高半胱氨酸降解而使喪失MTA酶的惡性細胞(即MTA酶陰性細胞)飢餓。正常MTA酶陽性細胞預期通過連續地將MTA轉化為MET，可滿足其對MET的需求。
首先由Kreis在Cancer Treat.Rprts.631069-1072(1972)中提出了所述方法的初步方案。利用在沒有MET的培養基中培養的11個惡性細胞系，Kreis通過給所述培養物供應MET酶而能夠使惡性細胞的生長受到一定程度的抑制。Kreis還觀察到當向這些培養物中加入高半胱氨酸時，2個正常細胞系部分地避開了MET飢餓的作用。雖然體外研究令人鼓舞，但在體內使用MET酶成功地進行化療的途徑中Kreis描述了存在的幾個障礙，包括無法獲得使體內正常細胞存活的方法，純化或部分純化的酶的潛在免疫原性，以及該酶必須對體內蛋白水解酶的降解具抗性(Kries，Chemotherapy(Muggia，FM，ed.，The Hague，Boston，and LondonMartinus-Nijihoff，1983)，pp.219-248)。
研製使惡性細胞處於MET飢餓狀態的成功方法的另一障礙是需要鑑別適用於作為治療的靶目標的惡性疾病，即何種惡性細胞是MTA酶陰性。為此，研製了一種檢測方法，通過確定細胞培養物中是否存在催化活性而預測惡性細胞是否MTA酶陰性(Seidenfeld，等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866，1980)。但是，由於該活性檢測方法需要的放射性化學物質從商業途徑無法獲得，因此將其用於常規評估目前還不是可行的。而且，通過檢測細胞培養物中是否存在這種酶，而不管在進行檢測時該酶是否有催化活性，因而該活性檢測法沒有考慮到MTA酶體外催化的不穩定性。
通過研製可足夠靈敏地檢測相當微量的酶的免疫檢測法可以避免該活性檢測法的局限性。但是，從天然來源純化MTA酶用於研製在MTA酶的免疫檢測中使用的抗體已經證明是一種費力的方法，效率很低(Rangione等人，J.Biol.Chem.，26112324-12329，1986)。
即使研製出了檢測MTA酶陰性細胞的合適方法，則從天然來源生產足夠量的MET酶與生產MTA酶同樣困難。目前還沒有獲得除純化天然酶的方法以外的生產MET酶的方法，部分原因是對編碼MET酶的基因(至目前為止)僅進行了部分測序(Nakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988)。
由於上述原因，使MTA酶惡性細胞體內處於MET飢餓狀態的有效方法仍然難以成為現實。本發明滿足了這種需要。
結合檢測MTA酶陰性細胞的方法，本發明包括一種選擇性地使MTA酶陰性細胞處於飢餓狀態的改進方法。根據該方法，用治療學上有效量的MET酶，優選的是重組MET酶，更優選的是用乙二醇或一種等效分子相結合的重組MET酶治療已被確認為是MTA酶陰性的惡性細胞。更具體地說，給哺乳動物(優選的是人)施用一定劑量的MET酶，所述劑量的MET酶將使血漿MET含量降低至足以使MTA酶陰性細胞處於甲硫氨酸飢餓狀態(通常是在≤治療前甲硫氨酸水平的約10％時出現飢餓)。正常(MTA酶陽性)細胞通過基本上同時施用的MTA而獲得MET的供應。
本發明還包括檢測惡性腫瘤中MTA酶陰性細胞的方法。更具體地說，一方面包括抗-MTA酶抗體(包括單克降抗體)的製備，以及所述抗體在針對MTA酶的免疫檢測中的應用。另一方面，包括通過使用基於核酸擴增技術的檢測方法特別是聚合酶鏈反應(PCR)而檢測編碼MTA酶基因的存在。
本發明還包括從編碼MET酶基因的分離和克隆而研製的重組MET酶，從而可以生產相當量的MET酶，以用於本發明的方法中。
附圖簡述

圖1圖解顯示聚胺合成的代謝途徑以及由MTA酶對MTA的還原。
圖2將由免疫印跡分析法檢測的MTA酶陽性和MTA酶陰性人和非人細胞系進行比較。
圖3將由免疫印跡分析法檢測到的MTA酶陽性和MTA酶陰性人細胞系與原發腫瘤進行比較。
圖4將用MET酶處理的MTA酶陰性人細胞的生長情況與在富含甲硫氨酸的條件下生長的情況進行比較。
本發明詳細描述1.檢測MTA酶陰性細胞的方法附圖1圖解描述從MTA體內合成MET以及由MET酶降解MET的代謝途徑。如上文中指出的，為了使甲硫氨酸飢餓癌治療取得最好效果，必須檢測靶惡性狀態細胞中的MTA酶陰性細胞。為此，下文中描述了檢測MTA酶的另一種方法，該方法適合用於本發明方法中。
A.MTA酶的免疫檢測1.抗原MTA酶和MTA酶肽的製備通過用抗原MTA酶或MTA酶肽接種非人動物而製備特異於MTA酶的抗體。通常，根據由Ragnione等人，J.Biol.Chem.，2656241-6246(1990)描述的方法可從哺乳動物組織中分離和純化抗原MTA酶肽。在下面實施例中描述了實施本發明方法的例子。作為參考，本文中包括了全長MTA的胺基酸序列，SEQ ID NO.1。
2.用抗原性MTA酶肽免疫接種以製備抗MTA酶抗體一旦獲得了抗原MTA酶或MTA酶肽，通過將該肽導入到哺乳動物(例如兔，鼠或大鼠)而生產抗該免疫接種肽的抗體。為了說明起見，在附後的序列表中提供了兩個抗原MTA肽的胺基酸序列，SEQ ID NO.2和3。用這些肽免疫接種兔而生產的抗體對分別以1∶1500和1∶4000稀釋的純化MTA產生50％最大應答。
在用抗原MTA酶肽免疫接種動物中優先使用多次注射接種方案(參見例如，Langone等人，eds.，「Production of Antisera with Small Doses ofImmunogenMultiple Intradermal Injection」，Methods of Enzymology(Acad.Press，1981))。例如，將1mg的抗原MTA酶肽(用完全佛氏佐劑乳化)皮下注射兔，幾個星期之後注射相同抗原(於不完全佛氏佐劑)的一或多次加強劑量，可以獲得良好的抗體應答。
如果需要，利用本領域內已知技術通過接合將免疫接種肽偶合到一個載體蛋白上。這種化學偶合到該肽上的常用的載體包括釘形貝血藍蛋白(KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，以及破傷風類毒素。然後將該偶合的肽用於接種動物(例如小鼠或兔)。由於目前認為在哺乳動物種內MTA酶是保守的，因而使用一種載體蛋白加強MTA酶蛋白的免疫原性是優選的。
例如通過結合到一種基質上並從該基質上洗脫可進一步純化通過接種動物產生的多克隆抗體，其中所述基質上結合了用於產生該抗體的肽。本領域內技術人員知道在免疫領域內普遍用於多克隆抗體以及單克隆抗體的純化和/或濃縮的各種技術(參見，例如，Coligan等人，Unit 9，Current Protocals inImmunology，Wiley Interscience，1991)。
由於單克隆抗體的特異性高以及製備方便，優選將單克隆抗體用於檢測MTA酶陰性細胞。為了製備單克隆抗體，優選的是免疫接種小鼠或大鼠。本發明中使用的術語「抗體」還包括整個分子和其片段，例如能夠結合表位抗原決定基的Fab和F(ab′)2。在本文中，術語「本發明的mAb」指對MTA酶具特異性的單克隆抗體。
用於生產分泌單克隆抗體(「mAb」)的雜交瘤的一般方法是公眾熟知的(Kohler和Milstein，Nature，256495，1975)。簡單地說，正如Kohler和Milstein描述的，該技術包括從5位分別患有癌症的患者的局部排液淋巴結(regionaldraining lymph node)分離出淋巴細胞，這5名患者分別患有黑色素瘤，畸胎瘤或者子宮頸癌，神經膠質瘤或肺癌。通過外科手術獲得淋巴細胞，收集在一起，然後與SHFP-1融合，篩選出可以產生與癌細胞系相結合的抗體的雜交瘤。可利用相同技術生產和鑑別與MTA酶具特異性的mAb。
利用最常規的篩選技術(例如酶免疫吸附分析法，即ELISA)檢測mAb的基本反應模式即可完成對本發明mAb中MTA酶特異性的確認。
通過測定所檢測的mAb是否能阻止本發明的mAb與MTA酶結合，不需經過過多實驗即可確定該mAb是否具有類似於本發明mAb的特異性，從而對該mAb進行評估。如果所檢測的mAb與本發明的mAb競爭，使本發明的mAb的結合能力降低，那麼可能兩種單克隆抗體可結合到相同或密切相關的表位決定簇上。
測定一種mAb是否具有本發明mAb的特異性的另一種方法是用通常與它能發生反應的一種抗原與本發明的mAb一起預培養，並確定所檢測的mAb與該抗原的結合能力是否被抑制。如果所檢測的mAb被抑制，那麼可能它與本發明的mAb具有相同或密切相關的表位決定基特異性。
3.檢測MTA酶陰性細胞的免疫檢測方案一旦按如上所述獲得了合適的抗體，可將它們用於檢測惡性細胞中的MTA酶。下文實施例I中進一步描述了適用於該目的免疫檢測法的實例(即，一種免疫印跡方法)。但是，免疫技術領域內技術人員將會認識到，在其他免疫檢測方法中利用液相或固相(當結合到一種載體)的上文中描述的抗體也可以檢測MTA酶。
利用正向、逆向或兩者同時進行的模式操作的免疫檢測，包括用生理樣品進行的免疫組織化學檢測法可以實現用抗-MTA酶抗體檢測MTA酶。合適的免疫檢測方案包括以直接或間接方式進行的競爭性和非競爭性方案。所述免疫檢測的例子是放射性免疫檢測(RIA)和夾心(免疫測量)檢測法。本領域內技術人員將會知道或很容易認識到不需化費過多實驗進行的其他免疫檢測方法。
另外，可對免疫檢測法中使用的抗體進行可檢測的標記。標記物是可共價吸附到或牢固結合到一種核酸探針上的物質，從而使該探針可被檢測。例如，一種標記物可以是放射性同位素，一種酶底物或抑制劑，一種酶，一種不透射線的物質(包括膠態金屬)，一種螢光劑，一種化學發光分子，含有上述任何標記物的脂質體或一種特異性結合對(Specific binding pair)成員。一種合適的標記物在擴增期間不會喪失其可被檢測這一特性。
診斷領域內熟練技術人員對用於體外檢測試驗中的合適的可檢測標記是熟悉的。例如，合適的放射性同位素包括3H，125I，131I，32，14C，35S。採用γ計數器或者採用放射自顯影密度測定，採用與密度測定相結合的經擴增片段的Southern印跡分析法可直接檢測被放射性同位素標記的擴增的片段。合適的化學發光分子的例子是吖啶或魯米諾。通過插入可保護與吖啶酯衍生的探針進行雜交的靶序列免遭水解。合適的螢光劑的例子是螢光素，藻膽蛋白，稀土螯合劑，丹磺醯或若丹明。
合適的酶底物或抑制劑的例子是那些與辣根過氧化酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，β-半乳糖苷酶，丙酮酸激酶或鹼性磷酸酶乙醯膽鹼酯酶特異性結合的化合物。不透射線物質的例子是膠態金或磁粒。
一個特異性的結合對(Specific binding pair)包括兩個不同的分子，其中分子之一在其表面或其腔內具有與另一分子的特定空間和極化結構特異性結合的區域。經常將特異性結合對的成員稱作為配體和受體或配體和抗-配體。例如，如果受體是一種抗體，則配體是對應的抗原。其他特異性結合對包括激素-受體對，酶底物對，生物素-抗生物素蛋白對以及糖蛋白-受體對。還包括保留結合特異性的特異性結合對的片段和部分，如免疫球蛋白片段，包括Fab片段等等。抗體可以是單克隆或多克隆的。如果將特異性結合對的一個成員用作為標記物，優選的分離步驟包括親和層析。
該抗體還可以結合到一種載體上。公知的載體的例子包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍，直鏈澱粉，天然的和經修飾的纖維素，聚丙烯醯胺，瓊脂糖和磁鐵礦。為了達到本發明目的，載體的特徵可以是可溶性的或不溶性的。本領域內技術人員熟知其他結合抗體的合適載體，或者利用常規實驗可確定這些載體。
B.利用基於PCR的檢測法檢測MTA酶陰性細胞由於利用本文中描述的MTA酶特異性抗體進行的免疫檢測法提供的檢測手段十分容易和快速，因而免疫檢測法是檢測MTA酶陰性細胞的優選手段。但是，本領域內技術人員會認識到可以使用用於檢測惡性細胞中MTA酶陰性細胞存在的其他檢測手段。例如，利用SEQ ID NO.1中描述的核酸序列，本領域技術人員可以構建與細胞樣品中存在的MTA酶DNA進行雜交的寡核苷酸探針。相反，因為據認為MTA酶缺陷型是由於基因組缺失了編碼MTA酶蛋白的基因引起的，可以假定如果在一個細胞中未檢測到編碼MTA酶的基因，則可認為該細胞是MTA酶陰性。
在審美國專利申請(流水號NO.08/176,855(1993年12月29日申請)中提供了擴增和檢測MTA酶基因的詳細方案。將在審專利申請NO.08/176,855中公開的所述方案引入本文作為參考。
C.用於MTA酶飢餓治療的MTA酶陰性候選細胞用於作為本發明治療法(即MET飢餓療法)的候選者的惡性細胞是一種在其中未檢測具催化活性或不具催化活性的MTA酶蛋白質。在至今研究的所有惡性細胞系中，MTA陰性狀態(如果存在)是細胞群體具有的一致特性。換句話說，如果惡性狀態的一些細胞是MTA酶陰性，可預期該惡性腫瘤的所有細胞是MTA酶陰性。這與本領域內認為MTA酶缺陷型是基因缺失而不是突變造成的觀點相一致。與針對異質特徵的治療方法相比，當對處於MTA酶陰性均一的惡性細胞進行MET飢餓法的癌症治療時，顯著地提高了治療效率，其中所述針對異質特徵的治療法是例如在單克隆抗體治療法中靶擊腫瘤抗原的方法。但是，在本發明的方法中，惡性細胞「基本上缺失」MTA酶(即它們不含有可檢測量的MTA酶蛋白質)即可。
目前認為基本上缺失MTA酶的人惡性細胞包括表1惡性腫瘤由下列方法測出MTA酶缺失非小細胞肺癌 免疫檢測法◆A-549(腺肉瘤)Sk-Lu-1(腺肉瘤)H 322(支氣管肺泡癌)H 1334(大細胞癌)H 1437(腺肉瘤)H 1581(大細胞癌)*腦腫瘤細胞系 免疫檢測法◆A 172U-87MGU-138MGHs 683初級腦腫瘤免疫檢測法◆
星形細胞瘤多形性神經膠質瘤寡星形細胞瘤(Oligostrocytoma)淋巴瘤和白血病 免疫檢測法◆CEM(急性淋巴白血病)K-T-1(急性淋巴白血病)NALL-1(急性淋巴白血病)K562(慢性骨髓性白血病)DHL-9(惡性淋巴瘤)HSB 2(急性淋巴白血病)其他Walker 256腺肉瘤臨床證據**Jurkat 免疫檢測法***K 562 免疫檢測法***Capan-1(胰臟腺肉瘤) 免疫檢測法****說明*得自美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD.**由Kries等人，Cancer Res.，331866-1869(1973)報導。***由Rangione等人，Biochem.J.281533-538(1992)報導****由Kries等人，Cancer Trmt.Rpts.，631069-1072(1979)報導◆由Nobori等人，在Cancer Res.531098-1101(1993)和在Cancer Res.513193-3197(1991)檢測和報導的所有其他MTA酶缺陷型惡性細胞。
利用本文中描述的檢測技術，本領域內熟練技術人員在不需過多實驗的條件下能夠檢測到MTA酶缺陷的其他惡性細胞。
II.MET飢餓療法A.MET酶的生產為使用本發明方法，需要MTA和MET酶來源。獲得MTA的方法如上文所述。為了用於本發明方法，從微生物包括陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis)(Lockwood等人，J.Biochem.279675-682，1991)，產孢梭菌(Clostridium sporogenes)(參見例如，Kries等人，見上文，1867；EC 4.4.1.11)，以及惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)(Nakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988)中純化MET酶。
利用從惡臭假單胞菌構建的cDNA文庫，已經鑑別出了MET酶的全長核苷酸序列，並包含於序列表中的SEQ ID NO.4中；其氨其酸序列包含於SEQ ID NO.5中。
利用這些資料，利用上文中描述的有關MTA酶的已知技術，可以方便地合成MET酶或者從一個DNA克隆表達。在下文的實施例II和III中進一步提供了將MET酶克隆到大腸桿菌中並在其中表達的詳細實施例。
當將純化的，部分純化的，合成的或重組MET酶用於本發明的治療方法中時，由於後一生產方法比較容易並且免疫原性非常低因而是優選的。通過將其偶合到聚乙二醇(PEG)或者一種等效的生物相容分子上可進一步降低並且優選地降低該酶的免疫原性。預期與PEG結合後可降低MET酶結合物的體內半衰期。
按照有關對L-天冬醯胺的方法的描述(參見，例如，Benedich等人，Clin.Exp，Immunol.48273-278，1982)，通過將PEG共價聯接到MET酶上可以形成PEG-MET酶結合物。將PEG與蛋白質結合的方法是本領域內熟知的。因此在此不再進一步詳細描述。基於用結合到PEG的L-天冬醯胺酶對非何杰金氏(non-hodgkins)淋巴瘤進行治療的人臨床試驗觀察到的結果，MET酶與PEG結合後並不如預期的那樣顯著地降低其體內活性(參見，用PEG-L-天冬醯胺酶獲得的體內結果，Muss等人，Invest.New Drugs，8125-130(1990))。但是，本領域技術人員將會認識到延長蛋白質的體內半衰期的其他方法是已知的，並且這些方法適用於MET酶，這些方法包括但不限於糖基化作用和琥珀醯作用。
B.治療方法根據本發明使用MET酶作為治療基本上缺失MTA酶的惡性腫瘤的一部分。優選地，這樣的惡性腫瘤是那些可以通過局部化療治療的惡性腫瘤；即該惡性腫瘤定位並包含於身體的一個區域，通過動脈內輸注或者通過局部、皮下或等同途徑可將MET酶直接施用到惡性位點處。可進行局部化療的惡性腫瘤的例子有黑素瘤，卵巢癌(藉助於一個腹膜導管)和膀胱癌(藉助於尿道導管)。腫瘤學領域內技術人員將知道根據本發明局部化療方法治療的MTA酶陰性的其他惡性腫瘤。
本領域內技術人員還會認識到本發明的治療組合物也可以全身給藥。但是，必須要對劑量進行調整，補償該組合物的清除以及對正常細胞的潛在毒性。特別是，必須密切監視正常細胞的甲硫氨酸飢餓的臨床證據，並且如果必要可通過以額外量的MTA給藥進行補償。
優選採用本發明方法按如下所述對基本上缺失MTA酶的惡性腫瘤進行治療。
採用胃腸外途徑將MET酶施用到哺乳動物(優選的是人)，優選的途徑是通過動脈內輸注給藥。將MET酶與藥物學上可接受載體一起給藥，所述載體包括無菌水或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄欖油和可注射的有機酯例如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液，乳液或懸液，包括鹽水和緩衝介質。如上文所述，優選地將MET酶結合到PEG上以降低其免疫原性。
胃腸外載體包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸林格氏溶液或固定油。靜脈內用載體包括液體和營養補劑，電解質補充劑(例如基於林格氏葡萄糖的補充劑)等等。還可以加入防腐劑和其他添加劑例如抗微生物劑、抗氧化劑，螯合劑以及隋性氣體等等。
MET酶的用藥量從約10單位/m2-20,000單位m2，優選的是從約5000-6000單位/m2(或者當以動脈內輸注給藥時可以使用更低劑量)範圍內變化，該用藥量在一星期內分一至多次劑量給藥，使用一或幾天。一般認為，在用藥24小時內哺乳動物可清除MET酶；使用延長該酶半衰期的方法例如PEG結合，該半衰期可延長几小時至幾天時間。因此，應該監測哺乳動物血漿甲硫氨酸水平，如果必要，施用附加劑量的MET酶以使哺乳動物的血漿甲硫氨酸溶度達到治療上的顯著降低。這種降低作用足以誘導MTA酶陰性細胞的體積達到可檢測量的降低即哺乳動物負載的惡性細胞或腫瘤的體積降低。達到這一效果所使用的藥量被認為是一種「治療有效」劑量。以使用部分純化的MET酶在齧齒動物中進行的體內研究為基礎，一般認為治療有效量是將患者的血漿甲硫氨酸水平降低至約≤治療前水平的10％所需的藥劑量。
通過對在整個給藥期間從接收MET酶的患者中抽取的血樣品進行定期(並且優選是每日)體外檢測可以監測血漿甲硫氨酸水平(以及其中的變化)。通常，基於在齧齒動物中進行的研究，預期在MET酶給藥約1小時內血漿甲硫氨酸水平將降低至≤治療前水平的10％。對血漿中甲硫氨酸進行檢測的方法是本領域內熟知的；例如利用檢測酯化胺基酸(正丁基酯)的氣-液層析方法可以確定血樣品中甲硫氨酸濃度，該方法描述於Roach等人，J.Chromotog.44269-278(1969)。本領域內普通技術人員將會知道或者容易鑑別檢測血漿甲硫氨酸的其他等同的方案。
應該注意到MET酶不會降解細胞內甲硫氨酸。因此，在充足地供應MTA用於形成胞內甲硫氨酸時，通常MTA酶陽性細胞能夠在MET酶降低外源甲硫氨酸情況下生存下來。但是，在沒有外源甲硫氨酸(或者是也可由MET酶降解甲硫氨酸的底物高半胱氨酸)供應情況下，通常由於MTA酶陰性細胞對甲硫氨酸有絕對需求。因而在失去血漿甲硫氨酸時不能存活。
根據顯示惡性狀態的細胞體積降低的臨床證據(採用本領域內公知的方法測定)和/或利用本文描述的檢測手段對惡性腫瘤的MTA酶陰性細胞體積進行定期檢測可證實和監測治療效果。基於利用L-天冬醯胺酶治療人的有關臨床資料，可認預期，MET酶治療的毒性相當低，並且這些毒性主要是由過敏反應組成，可採用臨床領域內熟練技術人員熟知的方法進行治療，例如施用腎上腺素。
因此，基本上是將MTA和MET酶同時給哺乳動物施用。優選地，將MTA和MET酶同時施用。因為MTA並不作為MET酶的底物，因而將兩物質與藥物學上可接受的載體一起結合。換另一種方法，在以MET酶給藥後24小時內(優選的是給藥後立即)以MTA給藥，以便「挽救」其內源性甲硫氨酸正在逐漸消耗的MTA酶陽性細胞。
挽救正常細胞所需的MTA的用藥量將依據許多臨床因素而變化，所述監床因素包括惡性腫瘤的位置，在惡性腫瘤中MTA酶陰性細胞的體積，MET酶治療的時間長度以及患者在食物中獲得的MET量。但是，通常MTA的給藥劑量為足於保持血漿甲硫氨酸水平為約1-10μM所需的量。
已對本發明作了全面描述，下文中提出了描述本發明實施方式的最佳實施例。但是，不應將這些實施例認為是限制本發明範圍。本發明範圍由後附的權利要求進行限定。
在實施例中，縮寫「min」是指分鐘，「hrs」和「h」是指小時，量度單位(例如「ml」)與標準縮寫的定義相同。
實施例I免疫檢測法檢測MTA酶A.MTA酶抗體的製備按照Rangione等人(見上文)描述的方法從牛肝中純化MTA酶。利用常規技術對從分離到的酶的幾個胰蛋白酶裂解的肽進行測序。以所獲得的序列為基礎，採用改良的公知的Merrfield固相方法(參見，例如，Chen，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811784-1788，1984)合成肽40(18個胺基酸長；參見SEQ ID NO2)和肽51(14個胺基酸長；參見SEQ ID NO3)。所有肽含有位於羧基末端的半胱氨酸殘基，以有利於用間-馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯將該肽化學偶合到載體蛋白KLH上。
用肽-KLH結合物每隔二個月給紐西蘭白鼠(每種肽接種兩隻鼠)免疫接種。起始注射液含有在費氏完全佐劑中乳化的1mg的合成肽-KLH結合物。加強注射劑量是1mg的溶於佛氏不完全佐劑中的抗原。在注射3-4次之後，用50％飽和硫酸銨部分純化血清，並採用ELISA方法篩選抗-肽和抗-MTA酶反應性。
更具體地說，用溶於BBS(0.2M硼酸鈉-0.15M NaCl，pH 8.5)中的10μg/ml的肽或MTA酶在4℃將微滴平板預包埋過夜。將該平板在含有0.05％吐溫20的BBS中洗滌一次，然後用含有1％牛血清白蛋白的BBS一起保溫4小時以封閉非特異性結合位點。然後用對照血清或肽誘導的抗血清的幾個稀釋液的0.1ml試樣加樣，並保溫過夜。用含0.05％吐溫20的BBS將該平板洗兩次，然後與鹼性磷酸酶標記的山羊F(ab′)2抗兔免疫球蛋白(JacksonLaboratories，Inc.，West Grove，PA)(在BBS中經過1∶1000的稀釋)接觸1小時。將平板洗滌之後，向每個孔中加入0.2ml溶於0.1M NaHCO3，pH 9.0中的0.1M對-硝基苯磷酸二鈉。在30分鐘之後檢測在405nm處的吸收率。
B.利用免疫印跡分析法對MTA酶的免疫反應性進行分析的方案估測幾個人細胞系和腫瘤活檢樣品中MTA酶陰性細胞的存在(參見，表I中MTA酶陰性細胞，用「免疫檢測」標註的條目)。檢測為MTA酶陽性的其他樣品是BV-173(一種慢性骨髓性白血病，「CML」)，Molt-16(一種急性淋巴細胞性白血病，「ALL」)，Molt-4(ALL)，U 397(組織細胞淋巴瘤)，SUP-T8(ALL)，U-373MG(成膠質細胞瘤)，以及T98G(成膠質細胞瘤)。
將從酶陽性細胞製備的細胞提取物與上面描述的方法從牛肝純化的各種量的MTA酶一起在含有0.1％十二烷基硫酸鈉的12.5％聚丙烯醯胺凝膠上電泳。
更具體地說，通過在含有0.1％十二烷基硫酸鈉的12.5％聚丙烯醯胺凝膠上電泳可分離細胞粗提取物(10-150μg/泳道)。在電轉移到硝酸纖維素膜(0.45mm；Bio-Rad，Richmond，CA)上之後，用溶於BBS中的3％奶粉將非特異性的結合位點封閉。然後在室溫下用含有3％奶粉的BBS 1∶500稀釋的抗血清對該蛋白質探查16小時。在用BBS對該蛋白質進行充分洗滌之後，作125I-蛋白質A(ICN Radiochemicals，Irvine，CA)結合1小時對反應的譜帶進行檢測。將該膜洗滌並吸印至紙巾上，在-70℃置於柯達XAR-5(tm)膠片上曝光。
用一個密度計(Bio-Rad)對放射自顯影的譜帶進行掃描，利用根據純化酶的免疫反應譜帶得到的校正曲線進行定量檢測。
C.結果在非肺細胞系和活檢樣品(即在神經膠質瘤)中，67％(六中有四個)完全缺失免疫反應酶(圖2)。來自人神經膠質瘤具有不同組織學特性的6個連續的活檢樣本(表I)，5個完全缺失該酶(圖3)。對照試驗顯示，正常的人腦富含MTA酶活性(圖3，泳溢7)。因此在人神經膠質瘤中完全缺失MTA酶是一種普遍的和特異的代謝異常。
在所檢測的19個非小細胞肺癌細胞系中，6個細胞系中完全失出MTA酶(參見，表I和圖4)。
實施例II從惡臭假單胞菌克隆MET酶參照由Wakayama等人，Biochem.，271587-1591，1988公開的MET酶的部分氨酸序列，設計簡併寡核苷酸引物並用於MTA酶基因的PCR分析中。
該PCR方法擴增了一個約300bp的片段。將該300bp的PCR產物亞克隆到質粒pBluescript II KS(Stratagene，San Diego)。利用該PCR產物的內部寡核苷酸探針，該亞克隆的PCR產物的Southern印跡分析證實了該片段為MET酶基因。進一步的Southern印跡分析證明了該PCR產生的該片段與惡臭假單胞菌DNA的一個5.0kb BglII片段進行雜交。
基於這些結果，構建含有惡臭假單胞菌基因組DNA的噬菌體基因組DNA文庫。在0.8％低熔點瓊脂糖凝膠上面將BglII消化的惡臭假單胞菌電泳。從凝膠上切下大小為4/kb到6/kb的BglII片段並進行純化。利用Klenow片段，將這些BglII片段部分填平並亞克隆到噬菌體載體γ FixII中。用XhoI消化該載體並用Klenow部分填平。利用Stratagene的gigapack包裝提取物，將該文庫包裝為噬菌體顆粒。包裝之後將該文庫擴增並測其效價。
為了分離整個MET酶基因，用該PCR擴增的片段篩查該文庫。在篩查200000克隆之後分離到8個獨立的原始文庫。在這8個克隆中僅有2個克隆是真正的陽性並且是唯一的。一個克隆含有5.1kb的插入片段，另一個含有5.9kb的插入片段。將這些插入片段亞克隆到pBluescriptII KS，隨後繪製其結構圖並測序。我們確證MET酶基因的序列是1615bp(參見，SEQ IDNO.4)。
實施例III重組MET酶的表達在C5載體中表達重組MET酶基因。該載體與用於表達MTA酶的載體相同(參見，例如，實施例VII，在審美國申請NO.08-176，855，申請日1993年12月29日)。將C5重組克隆的大腸桿菌的單菌落用於接種50ml的培養物。兩者都使用補充50μg/ml氨苄青黴素的標準LB培養基並且用於大規模細菌培養。在37℃將接種過的50ml培養液培養過夜。用新鮮的LB培養基將培養過夜的培養物稀釋100倍。在37℃劇烈震蕩條件下將細胞在大規模培養中培養1.5小時(11)。為了誘導MET酶表達，向該大規模培養物中加入終濃度為0.01，0.1和1mM的異丙基硫-β-D-半乳糖苷[IPTG]，將該培養物再培養4小時。發現該蛋白質表達的最適IPTG濃度是1mM濃度。
在IPTG加入4小時後，通過在4℃及19000Xg離心10分鐘收集細胞。除去上清液，用冷的鹽水懸浮沉澱並洗滌，然後再離心。有100-200ml含有15μM 2-疏基乙醇的20mM濃度磷酸鉀緩衝液，pH7.5洗滌該重新懸浮的細胞沉澱。加入1mM EDTA和30μM吡哆醛5′-磷酸鹽(緩衝液A)。然後將沉澱再一次離心。將該洗滌過的重懸的(於緩衝液中)細胞懸液置於細胞破碎容器中。利用2200PSI氮氣壓將細胞破碎20分鐘。在4℃以13000Xg將該裂解的細胞離心20分鐘。從該細胞提取物得到的上清液進一步用染料-配體親和柱進行純化。
將細胞提取物(10ml)置於「DYEMATRIX」gel[Orange A](Amicon Inc.，Beverly，MA)柱(12×2.6cm)。按照製造商的說明裝填該柱並進行平衡。在將樣品加到柱上之後，用5倍柱體積的緩衝液A洗脫該柱以除去未結合的物質。完成該步驟之後，用溶於緩衝液A中的0-1.5M氯化鉀線性梯度溶液洗脫結合的產物。收集10ml餾分並進行Y-裂解酶檢測。集合含有甲硫氨酸y-裂解酶活性的主峰的餾分，並且用「CENTRICON 30」(Amicon Inc.)濃縮到2-3ml。
將固體(NH4)2SO4加到濃縮的餾分(0.314克/ml)中，使終濃度為2.4M，並且將該樣品以13000Xg離心10分鐘。用0.45μacrodis濾紙(Amicon，Inc.)過濾上清液，然後注射到Alkyl「SUPEROSE」(瓊脂糖)hr 5/5疏水作用-FPLC柱(pharmacia)，該柱已用溶於前面步驟中使用的緩衝液A中的2.4M(NH4)2SO4進行平衡。用線性降低的(NH4)2SO4濃度(流速為0.5ml/分鐘)洗脫結合的蛋白質。收集含有MET酶活性的餾分，並按上文描述進行濃縮。按Bradford描述的方法檢測蛋白質的濃度。
由SDS 10％甘氨酸-tris 1mm凝膠(Novex，San Diego，CA)檢測該酶製劑的純度。按照Esaki Skoda描述的方法(Meth.Enzymol.143459465(1987)，引入本文作參考)，通過檢測2-丁酮酸的產生而分析MET酶的活性。最終的酶具有300U/mg的比活，其中1U＝每分鐘產生1μM產物。
實施例IV在非小肺癌細胞系中使MTA酶陰性細胞選擇性地飢餓根據本發明的治療方法在體外細胞培養物中用MET酶和MTA處理實施例I中鑑定的MTA酶陰性非小肺癌細胞系。具體地說，在(a)補充了10％透析過的馬血清並含有甲硫氨酸的培養基中，(b)補充了10％透析過的馬血清但不含甲硫氨酸的培養基中，以及(c)補充了10％透析過的馬血清和16μMMeSAdo(5』-甲硫腺苷)的無甲硫氨酸培養基中將酶陽性(SK-MES-1)和陰性(A-549)細胞系培養4天。在缺乏甲硫氨酸的培養基中兩種細胞系，尤其是酶陰性A-549細胞的增殖明顯地遲緩(對於SK-MES-1和A-549細胞其生長分別為對照生長的27和3.3％)。當在同一個培養基中加入MTA時，提高了酶陽性SK-MES-1細胞的生長(對照的77％)。但是，在MTA存在下酶陰性A-549細胞的增殖沒有增強(為對照生長的4.3％)(表II)。
這些數據表明，在缺失甲硫氨酸，補充了MeSAdo培養基中選擇性地抑制MeSAdo磷酸化酶陰性細胞的生長。
表II生長(佔對照的％)b無甲硫氨酸細胞系 酶的狀態a無MeSAdo 有MeSAdoSK-MES-1 + 27±2.677±4.7A-549 - 3.3±0.6 4.3±1.1a+，存在；-，不存在b相對對照生長的百分數＝100×(在有或沒有MTA的缺乏甲硫氨酸培養基中細胞生長情況)/(在含有甲硫氨酸培養基中細胞的生長)。
實施例V具有重組MET酶的人惡性細胞的甲硫氨酸飢餓為了研究實施例II和III中描述的方法產生的重組MET酶的抗增殖效果，在補充了0.06U/ml重組MET酶並含有10％透析過的胎牛血清的DMEM培養基中培養人SK-MES-1和A-549細胞。三天之後，測定細胞增殖。MET酶的作用是用相對於缺乏加入的酶的培養基中細胞生長的百分數表示的。
如圖4所示，在補充了MET酶的培養基中酶陽性(SK-MES-1)和酶陰性(A-549)細胞的生長分別增加了26.6和2.96％。但是，如果加入20μMTA以作為細胞甲硫氨酸的另一種來源，在酶陽性細胞中細胞生長恢復到對照值的61.4％，而酶陰性細胞的生長降至2.0％。
序列概述SEQ ID NO1是全長MTA酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO2是抗原性MTA酶肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO3是抗原性MTA酶肽的胺基酸序列，該序列不同於SEQ IDNO.2的肽的胺基酸序列。
SEQ ID NO.4是編碼MET酶的多核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5是從SEQ ID NO.4的核苷酸序列推導的MET酶的胺基酸序列。
序列表(1)一般資料(i)申請人THE REGENTS OF THE UNIVERSITYOF CALIFORNIA(ii)發明名稱使哺乳動物的惡性細胞處於甲硫氨酸飢餓的方法(iii)序列數 5(iv)通信地址(A)收件人Robbins，Berliner Carson(B)街道201N.Figueroa Street，5th Floor(C)城市Los Angeles(D)州California(E)國家USA(F)郵編90012(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patentln Release #1.0，Version #1.25(vi)目前申請資料(A)申請號US(B)申請日(C)分類號(viii)代理人/律師資料(A)姓名Berliner，Robert(B)登記號20,121(C)案號5555-286(ix)電信資料(A)電話213-977-1001(B)傳真213-977-1003(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度2763個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..2763(xi)序列描述SEQ ID NO1TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 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GAGTACCCGA2100AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT2160TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC2220TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC2280CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA2340CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC2400ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG2460TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT2520AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT2580CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG2640CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG2700GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG2760TAC 2763(2)SED ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆甲基腺苷磷酸酶肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..17(xi)序列描述SEQID NO2Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu Glu15 10 15Gly(2)SEQ IDNO3的資料(i)序列特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆5′-甲硫腺苷磷酸酶肽(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置1..3(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gln Ile Gly Ser Met Glu15 10(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度1615個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vii)直接來源(B)克隆甲硫氨酸-γ-裂解酶(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置304..1497(xi) SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO4ATAGGATGGC CTGGTAGCCA GTGATATAGC CGTTGTCTTC CAGCAGCTTG ACCCGGCGCC 60AGCAGGGGCG AGGTGGTCAA TGCCACCTGG TCGGCAAGTT CGGCGACGGT TAGGCGGGCG 120TTGTCCTGCA AGGCGGCGAG CAGGGCGCGG TCGGTGCGGT CGAGGCTTGA AGGCATGTTT 180TGCCCTCCTG GTCCGTTAAT TATTGTTTTT GTTCCAGCAA GCACGCAGAT GCGTGGGCAA 240TTTTGGAAAA AATCGGGCAG CTCGGTGGCA TAAGCTTATA ACAAACCACA AGAGGCTGTT 300GCC ATG CGC GAC TCC CAT AAC AAC ACC GGT TTT TCC ACA CGG GCC ATT 348Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala Ile15 10 15CAC CAC GGC TAC GAC CCG CTT TCC CAC GGT GGT GCC TTG GTG CCA CCG 396His His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro20 25 30GTG TAC CAG ACC GCG ACC TAT GCC TTC 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GCC 1116Met Arg Gly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala260 265 270AAC GCC CTG GAG GTC GCG CAG TTC CTG GCC GGG CAG CCC CAG GTG GAG 1164Asn Ala Leu Glu Val Ala Gln Phe Leu Ala Gly Gln Pro Gln Val Glu275 280 285CTG ATC CAC TAC CCG GGC TTG CCG TCG TTT GCC CAG TAC GAA CTG GCA 1212Leu Ile His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gln Tyr Glu Leu Ala290 295 300CAG CGG CAG ATG CGT TTG CCG GGC GGG ATG ATT GCC TTT GAG CTC AAG 1260Gln Arg Gln Met Arg Leu Pro Gly Gly Met Ile Ala Phe Glu Leu Lys305 310 315GGC GGT ATC GAG GCC GGG CGC GGC TTC ATG AAT GCC CTG CAG CTT TTT 1308Gly Gly Ile Glu Ala Gly Arg Gly Phe Met Asn Ala Leu Gln Leu Phe320 325 330 335GCC CGT GCG GTG AGC CTG GGG GAT GCC GAG TCG CTG GCA CAG CAC CCG 1356Ala Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gln His Pro340 345 350GCG AGC ATG ACG CAC TCC AGT TAC ACG CCA CAA GAG CGG GCG CAT CAC 1404Ala Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gln Glu Arg Ala His His355 360 365GGG ATA TCA GAG GGG CTG GTG AGG TTG TCA GTG GGG CTG GAG GAT GTG 1452Gly Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val370 375 380GAG GAC CTG CTG GCA GAT ATC GAG TTG GCG TTG GAG GCG TGT GCA 1497Glu Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala385 390 395TGAACTTGCC TTGCAGGATC GGGAACACTT GCCCAATGCC TCACGGGATC AGGCGATGGC1557ACTTTGGATG AGCTGGTGAA TTGGCCGGCT TATCCAAGAG GAGTTTAAAA TGACCGTA 1615(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵(A)長度398個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Arg Asp Ser His Asn Asn Thr Gly Phe Ser Thr Arg Ala Ile His1 5 10 15His Gly Tyr Asp Pro Leu Ser His Gly Gly Ala Leu Val Pro Pro Val20 25 30Tyr Gln Thr Ala Thr Tyr Ala Phe Pro Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ala35 40 45Cys Phe Ala Gly Glu Glu Ala Gly His Phe Tyr Ser Arg Ile Ser Asn50 55 60Pro Thr Leu Ala Leu Leu Glu Gln Arg Met Ala Ser Leu Glu Gly Gly65 70 75 80Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Ser Gly Met Gly Ala Ile Thr Ser Thr85 90 95Leu Trp Thr Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Leu Ile Val Gly Arg Thr100 105 110Leu Tyr Gly Cys Thr Phe Ala Phe Leu His His Gly Ile Gly Glu Phe115 120 125Gly Val Lys Ile His His Val Asp Leu Asn Asp Ala Lys Ala Leu Lys130 135 140Ala Ala Ile Asn Ser Lys Thr Arg Met Ile Tyr Phe Glu Thr Pro Ala145 150 155 160Asn Pro Asn Met Gln Leu Val Asp Ile Ala Ala Val Val Glu Ala Val165 110 175Arg Gly Ser Asp Val Leu Val Val Val Asp Asn Thr Tyr Cys Thr Pro180 185 190Tyr Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser195 200 205Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Gly Asp Ile Thr Ala Gly Leu Val210 215 220Val Gly Arg Lys Ala Leu Val Asp Arg Ile Arg Leu Glu Gly Leu Lys225 230 235 240Asp Met Thr Gly Ala Ala Leu Ser Pro His Asp Ala Ala Leu Leu Met245 250 255Arg Gly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Asp Arg His Cys Ala Asn260 265 270Ala Leu Glu Val Ala Gln Phe Leu Ala Gly Gln Pro Gln Val Glu Leu275 280 285Ile His Tyr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Ala Gln Tyr Glu Leu Ala Gln290 295 300Arg Gln Met Arg Leu Pro Gly Gly Met Ile Ala Phe Glu Leu Lys Gly305 310 315 320Gly Ile Glu Ala Gly Arg Gly Phe Met Asn Ala Leu Gln Leu Phe Ala325 330 335Arg Ala Val Ser Leu Gly Asp Ala Glu Ser Leu Ala Gln His Pro Ala340 345 350Ser Met Thr His Ser Ser Tyr Thr Pro Gln Glu Arg Ala His His Gly355 360 365Ile Ser Glu Gly Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Val Glu370 375 380Asp Leu Leu Ala Asp Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Cys Ala385 390 39權利要求
1.一種使被懷疑是MTA酶陰性的哺乳動物的細胞選擇性地甲硫氨酸飢餓的方法，該方法包括利用檢測細胞樣品中存在或不存在具催化活性和不具催化活性的MTA酶的手段而確定該細胞是否基本上MTA酶陰性，給哺乳動物施用治療有效量的MET酶，並且基本上與此同時，將治療有效量的MTA施用給該哺乳動物，其中MET酶和MTA都是以存在於治療學上可接受的載體中的形式施用。
2.根據權利要求1所述方法，其中該MET酶是一種重組微生物蛋白，它在體內可特異性地降解哺乳動物甲硫氨酸。
3.根據權利要求2所述方法，其中該MET酶具有其本上與SEQ ID NO.5所示的相同的胺基酸序列。
4.根據權利要求2的方法，其中該MET酶由具有基本上與SEQ ID NO.4所示的相同的核苷酸序列的多核苷酸表達。
5.根據權利要求1的方法，其中該MET酶偶合到聚乙二醇上。
6.根據權利要求1所述方法，其中將該MET酶和MTA同時施用給哺乳動物。
7.根據權利要求6所述方法，其中將MET酶和MTA一起混合在相同的藥物學上可接受載體中。
8.根據權利要求1的方法，其中用於檢測存在或不存在具催化活性和不具催化活性的MTA酶的方法包括免疫檢測法。
9.根據權利要求1所述方法，其中用於檢測具催化活性的和不具催化活性的MTA酶是否存在的方法包括一種包括下列步驟的檢測法(a)獲得被懷疑是MTA酶陰性的細胞的可檢測樣本(b)向該樣品中加入與編碼MTA酶的核酸特異性雜交的寡核苷酸探針，該加入過程是在允許該探針與樣品中存在的這樣的核酸進行可檢測雜交的條件下進行的，以及(c)檢測該樣品中是否存在該核酸。
10.根據權利要求9所述方法，其中進一步將該樣品置於有助於樣品中存在的編碼MTA酶的核酸選擇性地擴增的條件下。
11.根據權利要求1所述方法，進一步包括在以MET酶給哺乳動物給藥之前和之後，測定哺乳動物的血漿甲硫氨酸水平的步驟。
12.根據權利要求11所述方法，其中MET酶的治療有效量為10單位/m2和20,000單位/m2之間並且至少施用一次，其總量應足以降低哺乳動物中檢測到的MTA酶陰性細胞的數量。
13.根據權利要求12所述方法，其中MET酶的治療有效量是將哺乳動物血漿甲硫氨酸水平降低至約≤MET酶給藥前的水平的10％所需的MET酶的量。
14.根據權利要求1所述方法，其中MTA的治療有效量是足以將哺乳動物的血漿MTA濃度保持在約1-10μM所需的量。
15.具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的DNA分子。
16.一種具催化活性的重組MET酶多肽。
17.根據權利要求16所述的多肽，其中該多肽具有基本上與SEQ IDNO.5所示序列相同的胺基酸序列。
18.一種多核苷酸，包編碼具催化活性的MET酶多肽。
19.一種具催化活性的MET酶多肽，它是由權利要求18的多核苷酸表達的。
20.根據權利要求19所述的具催化活性的MET酶多肽，其中該多核苷酸的表達是在原核細胞中進行的。
21.根據權利要求18所述多核苷酸，它具有基本上與SEQ ID NO.4所示序列相同的核苷酸序列。
22.由權利要求21所述多核苷酸表達的具催化活性的MET酶多肽。
23.根據權利要求22所述的具催化活性的MET酶，其中該多核苷酸的表達是在原核細胞中進行的。
全文摘要
一種對哺乳動物惡性細胞進行化療的改進方法，所述惡性細胞對甲硫氨酸有絕對需求但失去了5′-甲硫腺苷磷酸化酸(MTA酶)。該方法包括檢測哺乳動物中的MTA酶陰性細胞，以足以降低哺乳動物中MTA酶陰性細胞的體積的量施用甲硫氨酸γ-裂解酸，並且同時施用足以使哺乳動物非惡性細胞繼續獲得甲硫氨酸的量的5′-甲硫腺苷。也提供了檢測MTA酶陰性細胞的方法。還提供了生產和使用重組化療藥劑的方法。
文檔編號C12N9/88GK1143325SQ94195042
公開日1997年2月19日 申請日期1994年12月22日 優先權日1993年12月29日
發明者楚特穆·諾伯裡, 丹尼斯·A·卡森 申請人:加利福尼亞大學董事會