牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二價滅活疫苗及其製備方法和應用的製作方法
2023-10-25 06:56:27
牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二價滅活疫苗及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種預防牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎的二聯滅活疫苗及其製備方法和應用。本發明的疫苗其有效成分包括牛病毒性腹瀉Ⅰ型病毒滅活抗原以及牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活抗原，可預防不同品種的牛由該兩種病毒引起的感染，降低由上述病毒感染造成的經濟損失。疫苗可「一針兩防」，安全可靠。本發明還提供一種牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗的製備方法，採用傳代細胞系培養生產該疫苗，並對該疫苗製備方法中的病毒培養、製備工藝等進行了優化。疫苗安全和效力檢驗結果顯示：使用本發明的二聯滅活疫苗免疫牛後沒有任何局部和全身不良反應，所有的牛都產生了免疫保護，說明本發明的疫苗安全可靠，可達到「一針兩防」的目的。
【專利說明】牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二價滅活疫苗及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於獸用生物製品【技術領域】，更具體是涉及一種預防牛傳染性鼻氣管炎和牛病毒性腹瀉的二聯滅活疫苗及其製備方法和應用。
技術背景
[0002]牛病毒性腹?寫(Bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹?寫病毒(Bovineviral diarrhea virus, BVDV)引起的以發熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹灣、咳嗽及懷孕母牛流產或產出畸形胎兒為主要特徵的一種傳染病。牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viraldiarrhea virus, BVDV)屬於黃病毒科(Flaviviridae),痕病毒屬(Pestivirus)。基因組為單股正鏈RNA，由一個開放閱讀框(ORF)和5』 UTR及3』 UTR組成。1946年Olafson等首次發現並分離出BVDV。目前，該病在世界上廣泛存在。李佑民等於1983年首次從流產胎兒的脾臟中分離到了 BVDV，證明該病已在我國存在。近年來從我國多個發病牛場分離到了BVDV，給我國養牛業帶來巨大的經濟損失。對我國部分省份的牛血清樣品進行檢測，結果表明，該病在我國呈上升態勢。
[0003]牛傳染性鼻氣管炎(Infect1usbovine rhinotracheitis, IBR)是由牛皰疫病毒I型病毒(BHV-1)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床表現為上呼吸道及氣管黏膜發炎、呼吸困難、流涕等症狀，還可引起膿皰性外陰道炎、龜頭炎、結膜炎、幼牛腦膜炎、乳房炎、流產等。該病於二十世紀50年代初最早見於美國，目前世界範圍內流行。我國於1980年首次從紐西蘭進口種牛中發現此病，目前在大部分省份的奶牛、黃牛和水牛均有IBRV感染，造成較大的經濟損失，疫苗是防控該病的主要措施之一。
[0004]商品化的BVD疫苗和IBR疫苗主要為弱毒活疫苗和滅活疫苗，二者各有其優點。弱毒活疫苗能誘導免疫反應快速、免疫期持久和可誘導局部黏膜免疫。滅活疫苗的最大優勢在於其安全性，不存在排毒、無流產和持續性感染的風險，在某些情況下可代替弱毒疫苗進行使用，尤其是針對懷孕牛群和經濟價值較高的奶牛群。對於這兩種傳染病，目前我國尚沒有商品化疫苗投放市場，養牛業面臨巨大的威脅，發生疫情無計可施，在臨床病例研究中發現，BVDV和IBRV往往混合感染。因此急需研製一種能夠同時預防上述疫病的有效疫苗。本發明提供了一種能同時預防牛傳染性鼻氣管炎和牛病毒性腹瀉的二聯滅活疫苗，通過該製品進行免疫接種，可有效保障牛免受BVDV和IBRV的感染，又可「一針兩防」，省時、省力、節約成本。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供一種免疫力高、無免疫幹擾的牛病毒性腹瀉及牛傳染性鼻氣管炎的二聯滅活疫苗組合物，達到同時預防BVD和IBR的目的。
[0006]本發明的目的之二是提供所述的牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎的二聯滅活疫苗在在製備預防或治療牛傳染性鼻氣管炎及牛病毒性腹瀉藥物中的應用。
[0007]本發明的目的之三是提供一種製備牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎的二聯滅活疫苗組合物的方法。
[0008]本發明是一種牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，其特徵在於有效成分包括牛病毒性腹瀉I型病毒滅活抗原以及牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活抗原。
[0009]在本發明中，優選的，所述的牛病毒性腹瀉I型病毒滅活抗原為滅活的牛病毒性腹?寫病毒NMOl株,所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活抗原為滅活的牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，所述牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株，命名為BVDV NMOl株，分類命名為牛病毒性腹瀉病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.6032，保藏日期為2012年4月20日；所述牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，命名為IBRV LNOI/08株，分類命名為牛傳染性鼻氣管炎病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCCN0.6033，保藏日期為2012年4月20日。
[0010]本發明所用毒種IBRV LN01/08株是從發病牛鼻拭子經MDBK細胞連續傳代並經克隆純化分離所得，病毒毒價可達108_°TCID5(l/ml以上。
[0011]進一步的，本發明還提供了所述的二聯滅活疫苗在製備預防或治療牛傳染性鼻氣管炎及牛病毒性腹瀉中的應用。
[0012]更進一步的，本發明還提供了一種製備牛傳染性鼻氣管炎、牛病毒性腹瀉二聯滅活疫苗的方法，其特徵在於包括:將牛病毒性腹瀉病毒I型病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、分別進行大規模培養，收穫病毒液，將病毒液滅活後與免疫佐劑混合乳化，製備成滅活疫苗。
[0013]在本發明所述的方法中，優選的，所述的牛病毒性腹瀉I型病毒為牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株,其中所述牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.6032 ;所述牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.6033。
[0014]在本發明所述的方法中，更優選的，其包括以下步驟:
[0015](I)將細胞系進行傳代和培養；
[0016](2)將牛病毒性腹瀉病毒I型病毒NMOl株和牛傳染性鼻氣管炎病毒LNO1/08株分別接種長滿90%?100%傳代細胞的介質，用細胞維持液培養，製備生產種毒；
[0017](3)將所製備的生產種毒分別接種長滿90%?100%傳代細胞的介質，用細胞維持液培養，得到牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株病毒抗原液；
[0018](4)將牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛傳染性鼻氣管炎病毒LNO1/08株病毒抗原液分別加入滅活劑滅活，加入中和劑中和，將兩種滅活後的抗原液混合，加入免疫佐劑，乳化，即得；
[0019]其中，優選的，所述的細胞維持液為含0.5?2μ g/ml胰酶及3.5% (v/v)馬血清的DMEM培養液或MEM培養液，pH值7.0?7.2。
[0020]其中，優選的，步驟(I)中所述的傳代細胞系包括牛腎細胞系(MDBK細胞系)、牛睪丸細胞(BT細胞系)、牛鼻甲骨細胞系(BT細胞系)、Vero細胞系、BHK21細胞系、牛原代細胞、MDCK細胞系、牛子宮細胞系(NCL-1細胞系)、兔腎原代細胞系(CRL-1414)、兔腎細胞系((LLC-RKl)。
[0021]其中，優選的，所述細胞系的傳代和培養包括:將細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，細胞長滿90%?100%時，用於繼續傳代或接種病毒；其中，所述的細胞生長液為含有6%?8% (v/v)的小牛血清的DMEM培養液，pH值為7.0?7.2 ;所述細胞系的培養方法為以下任意一種:在轉瓶中培養，使其細胞密度達到2 X 15?6XlOVml ;或在生物反應器中添加附著載體進行懸浮培養或不添加任何載體進行純懸浮培養，使細胞密度達到2 X 16?5X 106/ml，所述的附著載體為微載體或紙片。
[0022]其中，優選的，步驟(1)、(2)或(3)中所述的培養溫度為33?37°C，細胞培養環境是含5%C02左右的培養箱或生物反應器或不含CO2的轉瓶；病毒培養時間為30?72小時。
[0023]其中，優選的，步驟(2)或(3)中所述的牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株的病毒接種量MOI為0.03?0.05，牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株的病毒接種量MOI為0.01?
0.03。
[0024]其中，優選的，步驟(4)中所述的滅活劑為二乙烯亞胺(BEI)，其終濃度為0.002?
0.003M ;所述的中和劑為硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉的終濃度為0.03M。
[0025]其中，優選的，步驟(4)中，每劑量疫苗內，牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液滅活前病毒含量為不低於107_°TCID5(i,牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株病毒抗原液滅活前的病毒含量為不低於17 5TCID5tl，將兩種滅活後的抗原液混合，然後按照抗原液與免疫佐劑的體積比為1-2:1-2的比例，加入免疫佐劑，混合，乳化，所述的乳化劑是206佐劑或其它礦物油佐劑，更優選的，是將54體積份數的混合抗原液與46體積份數的免疫佐劑混合。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為F4代病毒的細胞培養物的免疫螢光鑑定結果；
[0027]A.F4代病毒的細胞培養物接種細胞後使用BVDVl型單克隆抗體染色；B.F4代病毒的細胞培養物接種細胞後使用BVDV2型單克隆抗體染色；C.為陰性對照
[0028]圖2為病毒液第4代細胞培養物RT-PCR擴增結果；
[0029]1、陰性對照；2、病毒液第4代細胞培養物；M、Marker DL2000
[0030]圖3為BVDV NMOl株亞型分析結果；
[0031]圖4為BVD、IBR 二聯滅活疫苗的安全性試驗首次接種疫苗後平均體溫變化曲線；
[0032]圖5為BVD、IBR 二聯滅活疫苗的安全性試驗二次接種疫苗後平均體溫變化曲線；
[0033]圖6為BVD、IBR 二聯滅活疫苗的效力試驗免疫攻毒後平均體溫變化。
【具體實施方式】
[0034]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0035]實施例1牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株的分離鑑定
[0036](I)免疫螢光試驗
[0037]發明人從臨床採集牛血液中分離到一株病毒，該病毒在MDBK細胞上可產生典型病變，將第4代病毒液接種於長滿單層MDBK細胞的96孔細胞培養板，並設不接種空白對照，置於37°C、含5%C02培養箱培養48~72小時，丙酮固定後分別加入螢光標記的BVDVl和BVDV2單克隆抗體，37°C溼盒中作用40分鐘後，螢光顯微鏡觀察。可見加有BVDVl單克隆抗體的孔內出現特異螢光，BVDV2型單克隆抗體孔和對照組無可見螢光。如圖1所示。
[0038](2)RT_PCR鑑定根據BVDV5』UTR基因序列設計合成BVDV的特異性引物，用於檢測BVDV病毒的特異性引物。
[0039]上遊引物為:P324:5』 -ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3』 ；
[0040]下遊引物:P326:5』 -TCAACTCCATGTGCCATGTAC-3，，
[0041]結果表明病毒液第4代細胞培養物經RT-PCR擴增可得到約288bp的特異性目的片段，陰性對照無條帶。如圖2所示。
[0042](3)全基因測序參照GenBank公布BVDV全基因序列，設計合成特異性引物，用於BVDV全基因組序列測定，引物序列見表1。經病毒RNA製備、病毒cDNA生成、PCR擴增、片段回收及測序，結果表明，該病毒全長12294bp，含5』非編碼區、ORF編碼區和3』非編碼區，屬於BVDVl型。對分離毒亞型鑑定結果表明，該毒株與BVDV-1a亞型毒株同源性較高,屬BVDVla 亞型。
[0043]表1BVDV全基因序列測定引物表
【權利要求】
1.一種牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗，其特徵在於有效成分包括牛病毒性腹瀉I型病毒滅活抗原以及牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活抗原，優選的，所述的牛病毒性腹瀉I型病毒滅活抗原為滅活的牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒滅活抗原為滅活的牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為:CGMCC N0.6032 ;所述牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.6033。
2.權利要求1所述的二聯滅活疫苗在製備預防或治療牛病毒性腹瀉及牛傳染性鼻氣管炎藥物中的應用。
3.一種製備牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯滅活疫苗的方法，其特徵在於包括:將牛病毒性腹瀉病毒I型病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒分別進行大規模培養，收穫病毒液，將病毒液滅活後與免疫佐劑混合乳化，製備成滅活疫苗；優選的，所述的牛病毒性腹瀉I型病毒為牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹瀉病毒NMOl株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC N0.6032 ;所述牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為:CGMCC N0.6033。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)將細胞系進行傳代和培養； (2)將牛病毒性腹瀉病毒I型病毒NMOl株和牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株分別接種長滿90%?100%傳代細胞的介質，用細胞維持液培養，製備生產種毒； (3)將所製備的生產種毒分別接種長滿90%?100%傳代細胞的介質，用細胞維持液培養，得到牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株病毒抗原液； (4)將牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液和牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株病毒抗原液分別加入滅活劑滅活，加入中和劑中和，將兩種滅活後的抗原液混合，加入免疫佐劑，乳化，即得； 其中，所述的細胞維持液為含0.5?2 μ g/ml胰酶及3.5% (v/v)馬血清的DMEM培養液或MEM培養液，pH值為7.0?7.2。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的細胞系包括牛腎細胞系(MDBK細胞系)、牛睪丸細胞(BT細胞系)、牛鼻甲骨細胞系(BT細胞系)、Vero細胞系、BHK21細胞系、牛原代細胞、MDCK細胞系、牛子宮細胞系(NCL-1細胞系)、NCL-1細胞系、兔腎原代細胞(CRL-1414)、兔腎細胞((LLC-RKl)。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特徵在於步驟(I)中所述細胞系的傳代和培養包括:將細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，細胞長滿90%?100%時，用於繼續傳代或接種病毒；其中，所述的細胞生長液為含有6%?8% (v/v)的小牛血清的DMEM培養液，pH值為7.0?7.2 ;所述細胞系的培養方法為以下任意一種:在轉瓶中培養，使其細胞密度達到2X 15?6X 105/ml ;或在生物反應器中添加附著載體進行懸浮培養或不添加任何載體進行純懸浮培養，使細胞密度達到2X 16?5X 106/ml，所述的附著載體為微載體或紙片。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(1)、(2)或(3)中所述的培養溫度為33?37°C，細胞培養環境是含5%左右CO2的培養箱或生物反應器或不含CO2的轉瓶；病毒培養時間為30?72小時。
8.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(2)或(3)中所述的牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株的病毒接種量MOI為0.03?0.05,牛傳染性鼻氣管炎病毒LN01/08株的病毒接種量MOI為0.01?0.03。
9.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(4)中所述的滅活劑為二乙烯亞胺(BEI)，其終濃度為0.002-0.003M ;所述的中和劑為硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉的終濃度為0.03M。
10.如權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟(4)中，每劑量疫苗中，牛病毒性腹瀉I型病毒NMOl株病毒抗原液滅活前病毒含量為不低於107_°TCID5(I,牛傳染性鼻氣管炎病毒LNO1/08株病毒抗原液滅活前的病毒含量為不低於107_5TCID5(I,將兩種滅活後的抗原液混合，然後按照抗原液與免疫佐劑的體積比為1-2:1-2的比例，加入免疫佐劑，混合，乳化，所述的乳化劑是206佐劑或其它礦物油佐劑，優選的，是將54體積份數的混合抗原液與46體積份數的免疫佐劑混合。
【文檔編號】A61K39/295GK104162154SQ201310184764
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2013年5月17日
【發明者】武華, 王煒, 師新川, 吳永旺 申請人:華威特（北京）生物科技有限公司, 華威特（江蘇）生物製藥有限公司