包含腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白質nmb0964的疫苗的製作方法

2023-10-24 23:59:52

專利名稱：包含腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白質nmb0964的疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於預防由奈瑟氏球菌屬(Neisseria)細菌，特別是腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的疾病的免疫原性組合物。
背景技術：
奈瑟氏球菌菌株是許多人類疾病的致病因子，需要開發針對該菌的有效疫苗。特別是淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌引起的可通過接種疫苗治療的疾病。淋病奈瑟氏球菌是淋病的病因，淋病是一種最常報導的性傳播疾病，估計全球的年發病數為6200萬例(Gerbase等，1998 Lancet 351 ；(增刊3)2-4)。淋病的臨床表現包括泌尿生殖道、咽喉或直腸黏膜炎症和新生兒眼部感染。女性淋球菌感染增加，可導致不育、異位妊娠、慢性盆腔炎和輸卵管卵巢膿腫形成。複合淋病伴有敗血病、關節炎、心內膜炎和腦膜炎。抗生素抗性的淋球菌菌株的巨大數量造成與淋病有關的發病率和併發症增加。一種有吸引力的替代抗生素治療淋病的方法可能是使用接種疫苗進行預防。目前沒有淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。腦膜炎奈瑟氏球菌是一種重要的病原體，尤其是在兒童和年青人中。敗血病和腦膜炎是侵襲性腦膜炎球菌病(IMD)最危急生命的形式。這種疾病因其高發病率和死亡率而成為全世界的健康問題。根據莢膜多糖的抗原性差異，已鑑定出13種腦膜炎奈瑟氏球菌血清群/血清型， 其中最常見的是造成全球疾病90%的A、B和C群。在歐洲、美國和幾個拉丁美洲國家，B血清群是腦膜炎球菌病的最常見原因。已開發出基於血清群A、C、W和Y的莢膜多糖的疫苗，並且表明可控制腦膜炎球菌病的爆發(Peltola等，1985 Pediatrics 76 ；91-96) 0然而，B血清群的免疫原性差， 只誘導主要是IgM同種型的短暫性抗體應答(Ala' Aldeen D and Cartwright K 1996， J. Infect. 33 ；153-157)。因此，目前沒有明顯有效的針對B血清群腦膜炎球菌的疫苗，在氣溫最溫和的國家，這種B血清群腦膜炎球菌是造成大多數腦膜炎球菌病的原因。由於B血清型腦膜炎球菌病的發病率在歐洲、澳大利亞和美國升高，多發生在5歲以下兒童中，因此這尤其成問題。由於多糖莢膜與人神經細胞黏著分子的免疫相似性而造成其免疫原性差， 因此開發針對B血清群腦膜炎球菌的疫苗顯得特別困難。因此，生產疫苗的策略一直集中在腦膜炎球菌外膜表面暴露的結構上，但卻受阻於菌株間這些抗原的明顯變異。進一步開發引入了由外膜囊泡(vesicles)構成的疫苗，其可含有許多構成細菌膜的正常內含物的蛋白質。其中之一是針對腦膜炎奈瑟氏球菌B和C血清群的古巴 VA-MENG0C-BC 疫苗(Rodriguez 等，1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440)。這種疫苗是設計來對抗在古巴通過接種計劃使用莢膜多糖AC疫苗不能消除的侵襲性腦膜炎球菌病的爆發。主要的血清群是B和C，VA-MENGOC-BC 疫苗成功控制了爆發，估計針對腦膜炎奈瑟氏球菌的B血清群菌株的疫苗功效為83% (Sierra等，1990In Neisseria,Walter Gruyter，Berl in，Μ· Achtman 等(編著)，第 129-134 頁；Sierra 等， 1991,NIPH Ann 14 ； 195-210)。這種疫苗針對某次特定爆發是有效的，然而所引起的免疫應答卻不能防禦腦膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。隨後在拉丁美洲進行了由同源和異源B血清群腦膜炎球菌菌株引起的流行病期間的功效研究表明，在年齡較大的兒童和成人中有一些功效，但是在感染風險最大的年齡較小的兒童中其功效顯著較低(Milagres等，1994，Infect. Immun. 62 ；4419-4424)。在有多菌株地方病的國家(例如英國)，這類疫苗的功效如何仍有疑問。針對異源菌株的免疫原性研究表明，只有有限的交叉反應性血清殺菌活性，尤其是在嬰幼兒中(Tappero等，1999， JAMA 281 ；1520-1527)。在挪威，使用在斯堪地那維亞盛行的典型血清型B的分離株開發出第二種外膜囊泡疫苗(Fredriksen等，1991，NIPH Ann, 14 ；67-80) 0在臨床試驗中對這種疫苗進行了試驗，發現四個月後的保護功效為57% (Bjune等，1991，Lancet，338 ；1093-1096)。現有的抗腦膜炎球菌疫苗存在各種問題。基於蛋白質的外膜疫苗往往只對少數菌株是特異性的和有效的。多糖疫苗也低於最佳水平，因為它們往往引起低下且短暫的免疫應答，特別是針對 B 血清群(L印ow 等，1986 ;Peltola 1998，Pediatrics 76 ；91-96) 奈瑟氏球菌感染代表著一個相當大的衛生保健問題，其中在淋病奈瑟氏球菌的情況下沒有可用的疫苗，而在腦膜炎奈瑟氏球菌的情況下，可用疫苗的防禦異源菌株的功效和能力有限。顯然需要開發良好的針對奈瑟氏球菌感染的疫苗，其可改進現有疫苗的功效， 並且可供防禦較大範圍的菌株。發明綜述本發明的發明人發現，奈瑟氏球菌抗原NMB0964 (NMB編號是指可獲自 neisseria, org的腦膜炎奈瑟氏球菌B群基因組序列)[在菌株Z2491的腦膜炎奈瑟氏球菌A群基因組中稱為NMAl 161，在WO 00/55327中稱為BASB082，也稱為SiuD]在整個奈瑟氏球菌屬中是一種保守抗原，可誘導針對許多奈瑟氏球菌屬菌株的殺菌抗體。本發明的發明人發現，這種抗原在細菌中起Zn2+受體的作用，且其表達受介質中的S12+水平調節。總的來講，本發明提供用於在患者中誘導針對奈瑟氏球菌屬細菌、特別是針對腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌株的免疫應答的方法和組合物。本發明的一個方面提供包含由奈瑟氏球菌屬細菌製備的分離的外膜囊泡和藥學上可接受的賦形劑的免疫原性組合物，其中當給予患者時，奈瑟氏球菌屬細菌產生足夠水平的NMB0964多肽以供產生誘導抗NMB0964抗體的囊泡。本發明可如下實現通過例如以下方法遺傳修飾奈瑟氏球菌屬細菌的NMB0964多肽產生-破壞Zur阻抑蛋白(NMB1266)的功能性表達，Zur阻抑蛋白在培養基中存在Si2+ 時關閉NMB0964的表達；用不結合^ir的啟動子、特別是比內源NMB0964啟動子更強的啟動子(例如Iac啟動子)置換NMB0964啟動子；或者通過使用低Si2+濃度(即5、4、3、2、1、 0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1,0. 05 或0. 01 μ M 以下的游離 Si2+)的培養基，例如 Roswell Park Memorial Institute 培養基 1640 (RPMI) (ICP-MS 測定其 Zn2+ 約 1. 69 μ Μ)； 或者除去培養基中的&ι2+，例如使用已知的鋅螯合劑(例如ΤΡΕΝ(Ν，Ν，Ν'，N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺))_將足夠的鋅螯合劑加入培養基中，使ΝΜΒ0964的表達最大化。奈瑟氏球菌屬細菌可缺乏莢膜多糖，例如通過破壞SiaD基因的功能性表達。可破壞奈瑟氏球菌屬細菌的msbB和/或htrB基因的功能性表達以使外膜囊泡中的LOS解毒。可破壞奈瑟氏球菌屬細菌的一種或多種下列基因的表達PorA、PorB、0pA、0pC、PiIC或FrpB。 可破壞奈瑟氏球菌屬細菌的IgtB基因的功能性表達。這類破壞方法可參見WO 01/09350 和TO2004/014417。奈瑟氏球菌屬細菌可以是L2或L3免疫型(immunotype)。由奈瑟氏球菌屬菌株製備或分離外膜囊泡(亦稱膜泡、微泡或小泡(blebs))的方法是本領域眾所周知的，可參見WO 01/09350和W02004/014417。通常，在不用洗滌劑 (detergent)或者用 0-0. 5%,0. 02-0. 4%,0. 04-0. 3%,0. 06-0. 2%或 0. 08-0. 15%洗滌劑 (例如脫氧膽酸鹽，例如用約0. 或正好0. 的脫氧膽酸鹽)提取來分離外膜囊泡。附圖簡述

圖1.蛋白質印跡檢測的TdfI。㈧生長於TSB (泳道1)、RPMI (泳道2)的HB-1 和生長於RPMI的tdfl敲除菌株(泳道3)。(B)生長於RPMI的HB-I，其中加入的TSB量逐漸遞增。(C)生長於RPMI的HB-I (泳道1)，其中補充了 0. 5 μ M鋅(泳道2)或1 μ M鋅 (泳道4)。(D)生長於RPMI的HB-I (泳道1)，其中TPEN濃度逐漸遞增(泳道2_4中分別為 0. 1、0. 5 和 ΙμΜ)圖2.野生型和zur突變株的TdfI表達。通過蛋白質印跡分析，對生長於RPMI、 RPMI與600nM鋅或TSB中的HB-I和zur突變株細胞的裂解物中存在的TdfI進行了分析。圖3. TdfI的拓撲模型。塞子結構域(plug domain)為深灰色，β鏈為淺灰色，而胞外環為白色。組氨酸/天冬氨酸序列段方框示出。圖4.通過TdfI的鋅結合和轉運。(A)通過PAR競爭測定法測定與含TdfI或不含 TdfI的外膜囊泡結合的鋅；⑶通過ICP-MS測定的野生型菌株、tdfl突變株和tonB突變株的胞內鋅濃度。圖5. TdfI的鋅調節在腦膜炎球菌中是高度保守的。生長於加鋅或不加鋅的RPMI 中的指定菌株細胞裂解物的蛋白質印跡。a得自(36)的克隆群名稱；-表明菌株通過多位點酶電泳分型，但無法確定特異性克隆。圖6. TdfI疫苗的蛋白質譜。用於免疫小鼠以產生抗血清的外膜囊泡通過 SDS-PAGE分離並用考馬斯亮藍染色。圖7. IPTG對TdfI在用於SBA的細胞上表達的影響。參見實施例1。增補圖1.腦膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的TdfI與053422、FAM18和Z2491、載體菌株α 14、α 153和α 275的TdfI的胺基酸序列比對。在序列之上標註了 iTonB box (Tb)、 塞子結構域、環和跨膜結構域(Tm)，富含His和Asp的序列段用下劃線表示。增補圖2. TdfI同源物的胺基酸序列比對。富含組氨酸天冬氨酸的序列段以灰色突出顯示。發明詳述本發明基於這樣的發現即在特定的低&12+培養條件下製備的OMV疫苗，或者由經工程改造成過量表達NMB0964或去除通過Zur介導的鋅阻抑機制的突變型腦膜炎奈瑟氏球菌菌株製備的OMV疫苗富含NMB0964，而且與不是用這些方法製備的OMV相比，這類OMV 可引起良好的殺菌抗體反應。本文的術語NMB0964多肽包括通常來自任何奈瑟氏球菌屬菌株的奈瑟氏球菌 TdfI多肽(由tdfl基因編碼)(該蛋白質在奈瑟氏球菌屬菌株中相當保守，本領域技術人員容易確定其在任何具體奈瑟氏球菌屬菌株中的同一性)。因此，該術語包括NMA1161序列和TO 00/55327的BASB082多肽序列(且本發明有關BASB082多肽的全部多肽)。例如本發明的NMB0964多肽將包括W000/55327的SEQ ID NO :2，或者與所述SEQ ID N0:2有超過 70%、80%、90%或95%序列同一性的多肽，或者包含所述SEQ ID NO :2的7、10、12、15或 20個(或更多個)連續胺基酸的免疫原性片段(特別是所述免疫原性片段能夠誘導-如有必要與蛋白質載體偶聯時-可識別所述SEQ ID NO :2的免疫應答)的多肽。當應用於任何給定的NMB0964序列時，特別優選的NMB0964免疫原性片段的實例是圖3拓撲圖中所示胞外環序列的免疫原性片段。特別提供第3胞外環(其中2個Cys殘基任選為二硫鍵連接的或未連接的)。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列可能與W000/55327的SEQ ID NO: 2中所述胞外環序列(如圖3中定義)有超過70%、80%、90%或95%序列同一性，或者可以是包含SEQ ID NO :2的所述胞外環序列(如圖3中定義)的7、10、12、15或20個(或更多個)連續胺基酸的免疫原性片段(特別是所述免疫原性片段能夠誘導-如有必要與蛋白質載體偶聯時-可以識別所述SEQ ID NO :2的免疫應答)的多肽，並且其以本發明的 NMB0964多肽提供。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列與圖3給出的第三胞外環序列的序列有超過70%、80%、90%、95%、99%或100%的序列同一性(其中任選2個Cys殘基應是保守的，且可以是或可以不是二硫鍵連接的)，或者可以是包含所述胞外環序列的7、10、 12、15或20個(或更多個)連續胺基酸的免疫原性片段(特別是所述免疫原性片段能夠引起-如有必要與蛋白質載體偶聯時-可以識別W000/55327的SEQ ID NO 2的免疫應答) 的多肽，並以本發明的NMB0964多肽提供。在一個實施方案中，NMB0964免疫原性片段多肽不是全長NMB0964(成熟序列或具有信號序列)多肽。因此，本發明的另一個方面是包含本發明的這類NMB0964免疫原性片段多肽序列和藥學上可接受的賦形劑的免疫原性組合物。在一個實施方案中，術語「當給予患者時，NMB0964多肽的水平足以提供產生誘導抗NMB0964抗體的囊泡」是指該水平足以誘導可檢測的殺菌抗體，例如SBA效價為100以上，例如，這表示採用實施例2的「血清殺菌測定法」部分的SBA測定法，在第0、21和28天給小鼠肌內注射蛋白質總含量為5μ g的本發明外膜囊泡時，第42天的血清SBA效價超過 100 (例如大於 150、200、250、300、350、400、500、700、900 或 1000)。與本發明多肽有關的異源啟動子比本發明多肽的非阻抑內源啟動子「更強(的)」 是指與使用本發明多肽的非阻抑內源啟動子相比，它的使用導致表達更多的本發明的多肽。術語「保護性免疫」是指給予哺乳動物的疫苗或免疫接種方案誘導免疫應答，其預防、延緩由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的腦膜炎球菌病的發生，或者降低由腦膜炎奈瑟氏球菌弓丨起的腦膜炎球菌病的嚴重程度，或者減輕或完全消除腦膜炎球菌病的症狀。表述「由腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌株引起的腦膜炎球菌病」包括表現在被腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群中的一個成員感染的任何臨床症狀或臨床症狀的組合。這些症狀包括但不限於腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群致病株在上呼吸道(例如鼻咽和扁桃體黏膜)的建群、細菌侵入黏膜和黏膜下層血管床、敗血病、敗血症性休克、炎症、出血性皮膚病變、激活血纖蛋白溶解和激活血液凝固、器官功能障礙(例如腎衰竭、肺衰竭和心力衰竭)、 腎上腺出血和肌梗死、毛細血管滲漏、水腫、外周肢體缺血、呼吸窘迫症候群、心包炎和腦膜炎。
本文使用的「血清群」是指通過莢膜多糖中免疫學可檢測的變異對腦膜炎奈瑟氏球菌進行的分類。已知大約12個血清群A、B、C、X、Y、ZJ9-E、W-135、H、I、K*L。任何一種血清群可包括多個血清型和多個血清亞型。「富集/富含」是指實驗人員或臨床人員操作抗原組合物中的抗原，使得與從中獲得抗原組合物的菌株中的抗原濃度相比，抗原存在的濃度(佔總重)高至少3倍，通常高至少5倍，更優選高至少10倍或高至少100倍。因此，如果特定抗原的濃度為1微克/克細菌總製備物(或細菌總蛋白)，則富集製備物可能含有至少3微克/克細菌總製備物(或細菌總蛋白)。可通過本文所述方法(例如培養條件，或通過重組方法過量表達所述多肽)，在本發明的外膜囊泡中富集本發明的NMB0964多肽。術語「異源(的)」是指兩種生物成分不會同時存在於自然界。所述成分可以是宿主細胞、基因或調節區，例如啟動子。雖然異源成分不會同時存在於自然界，但是它們可以同時起作用，像當與基因異源的啟動子與基因有效連接時一樣。另一個實例是其中奈瑟氏球菌序列與不同菌株的奈瑟氏球菌宿主異源。在兩種不同菌株中表達蛋白質的情況下，本文使用的「異源(的)」是指所述蛋白質的胺基酸序列不同。生產株可以是莢膜缺陷菌株。莢膜缺陷菌株可提供囊泡型疫苗，其使得在給予疫苗的患者中誘導顯著的自身抗體應答的風險降低(例如由產生與宿主細胞表面的唾液酸起交叉反應的抗體所致)。本文使用的「莢膜缺陷」或「缺乏莢膜多糖」是指細菌表面上的莢膜多糖水平低於天然菌株的莢膜多糖水平，或者其中經過遺傳改造的菌株的莢膜多糖水平低於該莢膜缺陷菌株從中衍生的親代菌株的莢膜多糖水平。莢膜缺陷菌株包括表面莢膜多糖產生降低至少 10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90% 或以上的菌株，並包括其中細菌表面上無可檢出莢膜多糖的菌株(例如使用抗莢膜多糖抗體通過完整細胞ELISA無法檢出的菌株)。莢膜缺陷菌株包括由於天然存在的遺傳修飾或者重組產生的遺傳修飾所引起的莢膜缺陷的菌株。本領域已知天然存在的莢膜缺陷菌株(參見例如Dolan-Livengood等， J. Infect. Dis. (2003) 187(10) :1616-28)以及鑑定和/或產生莢膜缺陷菌株的方法(參見例如 Fisseha 等(2005)Infect. Immun. 73(7) :4070-4080 ；Stephens 等(1991)Infect Immun59(ll) :4097-102 ；Frosch 等(1990)Mol Microbiol. 19904(7) :1215-1218)。可供莢膜多糖產生下降的奈瑟氏球菌宿主細胞的修飾可包括參與莢膜合成的一個或多個基因的修飾，其中所述修飾提供例如與修飾前的親本細胞相比莢膜多糖水平降低。這類遺傳修飾可包括提供菌株莢膜缺陷的一個或多個莢膜生物合成基因中核苷酸和/ 或胺基酸序列的改變(例如由一個或多個莢膜生物合成基因中一個或多個插入、缺失、取代等引起的改變)。莢膜缺陷菌株可缺少一個或多個莢膜基因或一個或多個莢膜基因可以是無功能的。特別有益的是缺乏唾液酸生物合成的菌株。這類菌株可供產生囊泡，其降低誘導與人唾液酸抗原交叉反應的抗唾液酸抗體的風險，並還可提供改進的製備安全性。唾液酸生物合成中有缺陷的菌株(由天然存在的修飾或工程改造的修飾所致)可能是在唾液酸生物合成途徑中許多不同基因的任一個有缺陷。特別有益的是由N-乙醯氨基葡萄糖-6-磷酸2-差向異構酶基因(稱為synXAAF40537. 1 或siaA AAA20475)編碼的基因產物中有缺陷的菌株，其中該基因失活的菌株尤其有益。例如，在一個實施方案中，通過破壞功能性synX基因產物的產生來製備莢膜缺陷菌株(參見例如 Swartley 等(1994) J Bacteriol. 176(5) :1530-4)。莢膜缺陷菌株還可採用非重組技術由天然菌株產生，例如，使用殺菌抗莢膜抗體選擇莢膜多糖減少的菌株。總體上如上所述，可按照本發明使用天然存在的或修飾的非天然存在的奈瑟氏球菌屬菌株來產生囊泡，所述奈瑟氏球菌屬菌株產生具有足夠NMB0964蛋白、在給予患者時提供產生抗NMB0964抗體的囊泡。在一個實施方案中，用於產生本發明的囊泡的奈瑟氏球菌屬菌株可以是天然存在的菌株，與表達不可檢出NMB0964或低水平NMB0964的菌株相比，其表達較高水平的 NMB0964。在另一個實施方案中，奈瑟氏球菌屬菌株通過重組或非重組技術修飾以產生足夠高水平的NMB0964。這類修飾菌株一般如此產生，使得NMB0964產生的增加超過未修飾親代細胞產生的 NMB0964 或超過菌株 RM1090 或 H44/76 產生的 NMB0964 的 1. 5、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5、 5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5倍或10倍以上。任何合適的菌株均可用於本實施方案，包括修飾前產生低水平或無可檢出水平的NMB0964的菌株以及與表達無可檢出水平或低水平的NMB0964的菌株相比天然產生高水平NMB0964的菌株。可採用重組技術產生修飾菌株，通常通過引入編碼NMB0964多肽的核酸或操縱內源NMB0964基因以增加內源NMB0964的表達。如上所述，這可通過引入編碼NMB0964多肽的核酸或操縱內源NMB0964基因以增加內源NMB0964的表達來進行。可通過原位改變控制NMB0964表達的調節區來增加內源NMB0964的表達。提供增加內源奈瑟氏球菌基因表達的方法是本領域已知的(參見例如WO 02/09746)。使內源NMB0964產生增加的奈瑟氏球菌宿主細胞的修飾可包括控制NMB0964表達的內源基因的全部或一部分的部分置換或完全置換，其中與未修飾親代菌株相比，所述修飾提供例如升高的轉錄活性。可通過內源調控區的變異(點突變、缺失和/或插入)、通過天然存在的或修飾的異源啟動子或者通過兩者的組合，賦予升高的轉錄活性。一般而言，遺傳修飾賦予的轉錄活性大於未修飾的內源轉錄活性(例如通過引入強啟動子)，使得NMB0964的表達增加。可用於提高NMB0964轉錄產量的典型強啟動子可包括例如porA、porB、IbpB, tbpB、pllO、hpuAB、IgtF、Opa、pllO、1st 和 hpuAB 的啟動子。PorA、RmpM 和 PorB 作為組成型強啟動子是特別有益的。PorB啟動子活性存在於相當於porB起始密碼子上遊的核苷酸 1-250的片段。本領域可獲得實現將啟動子引入宿主細胞基因組使得啟動子與內源NMB0964編碼核酸有效連接的方法。例如，將啟動子引入編碼序列上遊區域的雙交換同源重組技術， 例如在NMB0964編碼核酸序列起始ATG密碼子上遊(5 『)約IOOObp、約30_970bp、約 200-600bp、約300-500bp或約400bp處引入啟動子，以提供上調表達。啟動子的最佳位置可通過本領域可獲得的常用方法確定。例如，靶基因上遊的高活性啟動子(例如PorA、PorB或RmpM啟動子)。例如，可按照van der Ende等，hfect Immun 2000 ；68 :6685-90中的描述，使用於表達的PorA啟動子最優化。啟動子的插入可如下進行例如，PCR擴增NMB0964靶基因的上遊區段，將上遊區段克隆至載體，或在PCR擴增期間插入合適的限制位點，或使用天然存在的限制位點插入PorA啟動子區段。例如，可以克隆NMB0964基因上遊區段約700bp。使用天然存在的位於NMB0964啟動子上遊適當距離(例如約400bp)的限制性內切酶位點，在該克隆區段內插入PorA啟動子區段。可將抗生素(例如紅黴素)抗性盒插入PorA啟動子上遊更遠的區段內，可通過同源重組，使用該構建體置換野生型上遊NMB0964區段。另一種方法包括在宿主細胞基因組中具有強轉錄活性的內源啟動子下遊引入 NMB0964多肽編碼序列。例如，RmpM基因的編碼區可用NMB0964多肽的編碼序列置換。這種方法利用高活性組成型RmpM啟動子驅動表達。可將編碼NMB0964多肽的構建體引入奈瑟氏球菌宿主細胞，對奈瑟氏球菌屬菌株進行遺傳修飾以過量表達NMB0964。引入的用於表達的NMB0964在本文中稱為「外源」NMB0964。宿主細胞產生內源NMB0964，與內源NMB0964相比，外源NMB0964可具有相同或不同的胺基酸序列。 用於本發明的NMB0964多肽還包括融合蛋白，其中融合蛋白包含在其N端或C端具有融合配偶體的NMB0964多肽。有益的融合配偶體包括例如穀胱甘肽S轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、His-tag等，以及其它蛋白質的前導肽。可採用核酸或胺基酸序列的比對和比較方法測定序列同一性，該方法是本領域眾所周知的。較長序列的比較可能需要更精密的方法以獲得兩個序列的最佳比對。用於比對比較窗的序列的最佳比對可通過以下方法進行局部同源性算法(Smith and Waterman(1981)Adv. Appl.Math. 2 :482)、同源性比對算法(Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48 :443)、相似性檢索方法(Pearson and Lipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 :2444)、這些算法的計算機執行(Wisconsin遺傳學軟體包7. O版中的GAP、 BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.，Madison，WI)或目測，以及選出通過各種方法產生的最佳比對(即在比較窗內產生序列相似性的最高百分比)。可通過以下方法進行比較序列的最佳比對例如局部同源性算法(Smith and Waterman, Adv. App 1. Math. 2 :482 (1981))、同源性比對算法(Needleman and Wunsch, J Mol. Biol. 48 :443(1970))、相似性檢索方法(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3444(1988))、這些算法的計算機執行(Wisconsin遺傳學軟體包中的GAP、 BBSTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI) 或目測(通常參見 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編著， Greene Publishing Associates, Inc.禾口 John Wiley&Sons, Inc.的合資企業 Current Protocols (1995 ±曾幹丨J ) (Ausubel))。適於確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的實例為BLAST和BLAST 2. O 算法，分別可參見 Altschul 等(1990) J Mol. Biol. 215 :403-410 和 Altschuel 等(1977) Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402。執行 BLAST 分析的軟體可通過 National Center for Biotechnology Information 公開獲取(http: 1/www. ncbi. nlm. nih. govl)。該算法包括首先確定查詢序列(query sequence)中的短字碼長度(short words of length)W來鑑定高評分序列對(high scoring sequence pair, HSI3S)，當與資料庫序列中相同長度字碼比對時，其符合或滿足某一正值的閾值分數Τ。T稱為鄰域字碼分數閾值(neighborhood word score threshold) (Altschul 等，同上)。這些初始鄰域字碼採樣數(hits)用作開始檢索以查找包含它們的較長HSP的種子。字碼採樣數然後沿各個序列的兩個方向延伸直到可以增加累積比對分數為止。核苷酸序列的累積分數採用參數M(匹配殘基對的獎勵分數；總是> 0)和N(錯配殘基的處罰分數；總是< 0)計算。對於胺基酸序列，採用評分矩陣計算累積分數。各方向上字碼採樣數的延伸在以下情況下終止累積比對分數從其最大得分值下降到量X ；累積分數由於一個或多個負得分殘基比對的累積而變成零以下；或者達到任一序列的末端。BLAST算法參數W、T 和X決定比對的靈敏度和速度。以字長(W)為11、預期值(E)為10、M= 5、N = -4和兩條鏈的比較的默認值運用BLASTN程序(對於核苷酸序列)。對於胺基酸序列，以字長(W)為3、預期值(E)為10和BL0SUM62評分矩陣的默認值運用BLASTP程序(參見Henikoff&Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915 (1989))。除了計算百分比序列同一性以外，BLAST算法還進行兩個序列間相似性的統計分析(參見例如 Karlin&Altschul，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的一種相似性測量法是最小合計概率(P(N))，它提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間匹配偶然發生的概率的指標。例如，如果測試核酸與參比核酸比較的最小合計概率小於約0. 1、更優選小於約0. 01、最優選小於約0. 001，則該核酸被視為與參比序列類似。2個核酸序列或多肽具有序列同一性的另一個指標是如下所述的第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽有免疫交叉反應性。因此，某一多肽通常與第二多肽具有序列同一性，例如，其中兩個多肽只因保守取代而不同。兩個核酸序列具有序列同一性的另一個指標是兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。特定雜交條件的選擇按照本領域的標準方法進行(參見例如Sambrook等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第二版，(1989) Cold Spring Harbor，N. Y.)。嚴格雜交條件的一個實例是於50°C或以上並在0. Ix SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中雜交。嚴格雜交條件的另一個實例是在以下溶液中於42°C溫育過夜％甲醯胺、5x SSC(150mM NaCl, 15nlM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6)、5x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml 變性的已剪切鮭精DNA，接著在0. Ix SSC於約65°C洗滌過濾器。嚴格雜交條件是至少與上述代表性條件一樣嚴格的雜交條件，其中如果條件的嚴格程度至少達到上述具體嚴格條件的嚴格程度的約80%、通常至少約90%，則所述條件視為至少一樣嚴格。其它嚴格雜交條件是本領域已知的，並也可用來鑑定本發明這個具體實施方案的核酸。優選不相同的殘基位置因保守胺基酸取代而不同。保守胺基酸取代是指具有類似側鏈的殘基的可互換性。例如，具有脂族側鏈的一組胺基酸為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側鏈的一組胺基酸為絲氨酸和蘇氨酸；具有含醯胺側鏈的一組胺基酸為天冬醯胺和穀氨醯胺；具有芳族側鏈的一組胺基酸為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側鏈的一組胺基酸為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；而含硫側鏈的一組胺基酸為半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守胺基酸取代基為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬醯胺-穀氨醯胺。
容易改變以供遺傳修飾的奈瑟氏球菌在宿主細胞中表達外源NMB0964多肽的方法和組合物是本領域已知的。示例性載體和方法參見WO 02/09746和0' Dwyer et al.， Infect Immun 2004 ；72 :6511_80。將遺傳物質轉移進入奈瑟氏球菌宿主的方法包括例如綴合、轉化、電穿孔、磷酸鈣方法等。轉移方法應供引入的NMB0964編碼核酸穩定表達。NMB0964編碼核酸可以可遺傳的附加型元件(例如質粒)提供，或者可以通過基因組整合。合適載體的組成將隨即將進行的重組事件的類型而變化。整合載體可以是條件性複製質粒或自殺質粒、噬菌體、轉座子或通過限制性水解或PCR擴增獲得的線性DNA片段。 可通過以下可選擇的遺傳標記進行重組事件的選擇，例如賦予抗生素(例如卡那黴素、紅黴素、氯黴素或慶大黴素)抗性的基因、賦予重金屬和/或毒性化合物抗性的基因或補充營養缺陷突變型的基因(例如pur、leu、met、aro)。在一個實施方案中，載體是基於附加型質粒的表達載體，該質粒含有在大腸桿菌 (E. coli)和腦膜炎奈瑟氏球菌兩者中自主複製的可選擇藥物抗性標記。這類「穿梭載體」 的一個實例是質粒 pFPIO (Pagotto 等，Gene 2000 244 :13-19)。免疫接種總的說來，本發明的方法提供用於將一種或多種本發明的抗原組合物給予哺乳動物受治療者(例如人)而誘導針對一種以上奈瑟氏球菌屬細菌菌株的保護性免疫應答，從而防止由這類細菌引起的腦膜炎球菌病。具體地講，本發明的方法可提供針對腦膜炎奈瑟氏球菌的1、2、3、4種或更多種菌株的免疫保護性免疫應答或NMB0964多肽，其中所述菌株在至少一種血清群、血清型、血清亞型上不同。特別有益的是誘導針對B血清群腦膜炎奈瑟氏球菌的多個菌株的保護性免疫應答，特別是其中所述菌株在血清亞型上不同(例如具有異源PorA)。還特別有益的是就PorA和/或NMB0964而言，誘導針對彼此異源的菌株的保護性免疫應答。可以在有或沒有添加賦形劑的情況下，經口服、鼻、鼻咽、胃腸外、腸、胃、局部、經皮、皮下、肌內，以小片形式、固體形式、粉末形式、液體形式、氣霧劑形式、局部或全身給予本發明的抗原組合物。用於製備可胃腸外給予的組合物的現行方法可以是已知的，或者對本領域技術人員而言是顯而易見的，更多詳情可參見例如Remingtonts Pharmaceutical Science,15 片反，Mack Publishing Company, Easton,Pennsylvania(1980)等。口服給藥可能需要保護組合物不被消化是公認的。這通常通過將組合物與賦予其抗酸和抗酶促水解抗性的成分締合或者將組合物包裝在合適抗性載體中來實現。避免消化的方法是本領域眾所周知的。將組合物給予有患奈瑟氏球菌性疾病(Neisserial disease)風險的動物以防止或至少部分抑制奈瑟氏球菌性疾病的發生/發展及其併發症。足以實現這種情況的量定義為「治療有效量」。治療性應用的有效量將取決於例如抗原組合物、給藥方式、患者的體重和一般健康狀況以及處方醫生的診斷。可以根據患者需要和耐受的劑量和頻率以及給藥途徑給予單劑量或多劑量的抗原組合物。本文所述抗原組合物(本文亦稱免疫原性組合物)可包含囊泡的混合物，所述囊泡可來自相同或不同的菌株。在另一個實施方案中，抗原組合物可包含2、3、4、5種或更多種菌株的囊泡的混合物。
以有效誘導宿主免疫應答、特別是體液免疫應答的量給予抗原組合物。用於混合物免疫接種的量一般為約0. OOlmg-約1. 0mg/70千克患者，更常為約0. OOlmg-約0. 2mg/70 千克患者。可採用0. OOlmg/患者/天到高達約IOmg/患者/天的劑量，特別是當將抗原給予隔離部位並且不進入血流時，例如進入某一體腔或進入某一器官內腔時。口服、經鼻或局部給藥時，實際上較高的劑量(例如IO-IOOmg或以上)是合理的。首次給予混合物後可繼之以相同或不同的混合物強化免疫，優選至少一次強化免疫，更優選兩次強化免疫。通常將抗原組合物給予對於奈瑟氏球菌屬、特別是對於腦膜炎奈瑟氏球菌是首次免疫的哺乳動物。在一個具體的實施方案中，哺乳動物是約5歲以下兒童，優選約2歲以下， 且按下列任一個或多個時間給予抗原組合物出生後2周、1個月、2個月、3個月、4個月、5 個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月或11個月，或者1歲或15個月、18個月或21 個月，或者2、3、4或5歲。總的來講，優選在腦膜炎球菌病症狀最初跡象或者在可能或實際暴露於奈瑟氏球菌屬的最初跡象出現之前開始給予任何哺乳動物。
實施例應當理解的是，本文所述實施例和實施方案僅用於說明目的，本領域技術人員可在其基礎上進行各種修改或變動，並且各種修改或變動均包括在本申請的精神和範圍以及隨附權利要求書的範圍內。本文引用的所有出版物、專利和專利申請都通過引用其整體結合到本文中用於所有目的。實施例1具有TdfI上調的OMV的免疫原性TdfI是一種基因，一般認為當腦膜炎奈瑟氏球菌進入血液中時其便被表達。因此，菌株在常規培養基中生長時通常不表達Tdfl，但是可使例如野生型菌株H44/76在特殊培養條件(補充氯高鐵血紅素的RPMI培養基)下表達該蛋白質。下面的實驗詳細描述了 H44/76菌株的使用，其中通過重組法使TdfI表達成為誘導型(通過使用IPTG)。這可使 TdfI在由所述菌株製備的OMV疫苗表面過量表達，並提供一種容易的培養表達該抗原的菌株的方法，來證實所產生的抗TdfI抗體是否能夠殺死在正常培養條件(+IPTG)下表達TdfI 的這類修飾菌株。IPTG對TdfI在用於SBA的細胞上表達的影響參見圖7。通過肌內途徑，在第0、21和觀天用OMV免疫小鼠(10隻/組)三次。每次接種都使用AlPO4與MPL配製的OMV 5 48(蛋白質含量)。OMV來源於腦膜炎奈瑟氏球菌菌株 H44/76，經工程改造使得莢膜多糖和PorA下調，且LOS免疫型是galE型。對OMV進行了比較，其中TdfI上調或不上調(在IPTG誘導型啟動子控制下上調)。在第42天，使用表達或不表達TdfI (培養基中加入或不加入IPTG後)的同源菌株H44/76(B: 15:P1. 7，16)，通過血清殺菌測定法採集用於分析的血樣。腦膜炎奈瑟氏球菌菌株在具有10 μ g/ml氯黴素的GC-瓊脂培養皿上於37°C +5% CO2培養過夜。使之在補充或未補充IPTG 1000 μ M的液體TSB培養基中傳代培養3小時。 將各血清於56°C滅活30分鐘。將血清樣品在0. 5% HBSS-BSA中稀釋，然後在平底微量培養板中兩倍稀釋(8個稀釋液)成25μ1的體積。將細菌在0.5% HBSS-BSA中稀釋得到 8xl03CFU/ml，將該稀釋液12.5μ 1加入血清稀釋液中。還向每孔中加入兔補體(12. 5μ 1)。振蕩下於37°C溫育75分鐘後，將15 μ 1的混合物塗在預熱GC-瓊脂板上，於37°C +CO2溫育過夜。統計CFU，並計算殺菌百分比。SBA效價是殺菌50%的稀釋度。SBA效價對靶細胞表達TdfI的影響
SBA效價Η44/76,無 IPTG<50Η44/76,有 IPTG400; 400; 800沒有IPTG，則TdfI不在靶細胞中表達，所述靶細胞不會被得自用上調的TdfI OMV 免疫的小鼠血清殺死。TdfI表達被IPTG特異性誘導時，靶細胞表達TdfI，並被抗TdfI-OMV 小鼠血清殺死。實施例2 在腦膜炎奈瑟氏球菌中具有疫苗潛力的新的鋅調節外膜蛋白摘要由於人宿主中游離鐵的濃度低下，有效獲取鐵的機制構成致病細菌的重要毒力因子。在革蘭氏陰性菌中，TonB依賴性外膜受體參與鐵獲取。然而，在人宿主中同樣稀缺的其它金屬的跨細菌外膜轉運遠未明了。在該研究中，我們表徵了一種新的腦膜炎奈瑟氏球菌中的TonB依賴性受體。我們發現，在鋅限制情況下，細菌產生這種蛋白質，並且該蛋白質參與鋅攝取。此外，由於該蛋白質在分離菌株中十分保守，並且能夠誘導殺菌抗體，因此它便成為開發針對腦膜炎奈瑟氏球菌的疫苗的新的候選蛋白，對於腦膜炎奈瑟氏球菌，迄今尚未得到有效的通用疫苗。在呼吸道定居的許多其它病原體中存在該蛋白質的同源物，稱為Tfdl，表明了受體介導的鋅攝取對於在這個小生境中存活是特別重要的。引言革蘭氏陰性細菌的細胞被膜由兩層膜即內膜和外膜組成，其被含有肽聚糖層的周質分隔開。外膜形成隔離環境的有害化合物的屏障。大多數營養物可通過被動擴散經由大量的成通道外膜蛋白(統稱孔蛋白)穿過外膜。然而，當營養物的胞外濃度低時，擴散並不是可供選擇的方法。例如對於鐵就是這種情況。病原體在人宿主內面對低濃度的游離鐵， 其中鐵與鐵轉運蛋白和鐵貯存蛋白(例如乳鐵蛋白和運鐵蛋白)結合。因此，有效的鐵獲取機制構成重要的毒力因子，並且已在許多病原體中進行了廣泛的研究(1，2)。在鐵限制條件下生長時，革蘭氏陰性菌誘導外膜蛋白的合成，所述外膜蛋白起宿主鐵結合蛋白的受體、血紅素的受體或鐵載體的受體的作用，它們是在鐵限制下由細菌產生和分泌的小的鐵螯合化合物。這類受體的解析晶體結構顯示22鏈β桶，它們不形成開放通道，而是被N端塞子結構域封閉(3)。在配體與受體結合後，隨後的攝取是一個主動過程，需要跨內膜的質子梯度能量，其通過3個蛋白質的複合體(TonB複合體)與外膜上的受體偶聯(4，5)。雖然在許多革蘭氏陰性細菌中對鐵獲取機制進行了廣泛研究，但還是幾乎不了解有關其它必不可少的重金屬(例如鋅和錳)跨越細菌外膜的轉運。這些痕量元素的濃度在人宿主中同樣低下，例如人宿主通過產生金屬硫蛋白和鈣防衛蛋白而響應感染，從而降低入侵病原體對金屬的可獲取性(6，7)。因此，革蘭氏陰性病原體可能具有這些金屬的有效獲取機制，其機制可能類似於鐵獲取系統，也可能不同於鐵獲取系統。
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腦膜炎奈瑟氏球菌是一種專性人病原體，可以無症狀地定居在鼻咽黏膜上。細菌偶爾進入血流，可引起具有高死亡率的腦膜炎和膿毒症(8)。雖然對於腦膜炎奈瑟氏球菌的大多數致病血清群可獲得基於莢膜多糖的疫苗，但卻缺乏針對B血清群腦膜炎球菌的疫苗。B血清群菌株的多糖莢膜由於其類似於人糖蛋白而導致免疫原性差(9)。因此，對各亞類莢膜抗原作為替代性疫苗成分進行了研究；然而，這些研究由於主要外膜蛋白的高抗原變異性而歸於失敗。因此，注意力轉移到了次要抗原上，包括TonB依賴性受體。當在鐵限制下生長時，腦膜炎奈瑟氏球菌產生乳鐵蛋白(10)、運鐵蛋白(11)、血紅蛋白(12，1 和腸桿菌素(14)的TonB依賴性受體，這些受體均參與鐵攝取。根據同源性檢索，Turner等人(1 在3個奈瑟氏球菌屬菌株可獲得的基因組序列中，鑑定出推定的 TonB依賴性家族(Tdf)成員的7個其它基因。有趣的是，在不同微陣列研究中，這類tdf基因中有一些的表達似乎不受鐵可利用性的影響(16，17)，這就表明了其產物可能參與鐵以外的其它金屬的轉運。我們在本文中研究了這些受體之一的合成調節、功能和疫苗潛力，並證實該受體參與鋅的攝取。結果TdfI不是血紅素受體TdfI (在腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A菌株Z2491和B血清群菌株MC58已測序的基因組中的基因座標籤分別為NMA1161和NMB0964)之前被鑑定為存在於奈瑟氏球菌基因組中的7個新的推定TonB依賴性受體之一(1 ，而且發現在幼稚人血清(nai've human serum)存在時上調(18)。由於幾乎所有迄今研究的TonB依賴性受體都參與鐵獲取，因此我們假設，TdfI轉運鐵絡合物。這個設想得到以下事實的支持NMA1161胺基酸序列的 blast檢索(19)顯示與攝取血紅素的外膜受體有高的序列相似性，例如黏膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhal is)的 HumA (20)，達 41 % 同一性和 58%相似性。為了評價TdfI的功能，我們構建了無莢膜衍生的B血清群菌株H44/76的tdfl缺失突變株，稱為HB-I。通過點漬法分析評價，我們發現血紅素與HB-I和tdfl突變株的類似結合，而且tdfl突變株在血紅素作為唯一鐵源的板上仍可生長。我們也未發現被表達TdfI 的大腸桿菌細胞結合的血紅素增加。我們也無法補充大腸桿菌血紅素營養缺陷型(數據未顯示)。因此，我們假設，TdfI雖然與血紅素受體同源，但是不起血紅素受體的作用。鋅調節tdfl由於TdfI不是血紅素受體，且未發現受鐵調節，因此我們尋找其中我們能夠檢測在莢膜缺陷型H44/76腦膜炎奈瑟氏球菌HB-I中表達的tdfl的條件。當使細菌在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB，一種複雜的富含養分的培養基)中生長時，我們在蛋白質印跡中從未檢測到TdfI (圖1A，泳道1)。然而，當使細菌在化學成分確定的RPMI培養基生長中時，在細菌裂解物中可檢測出TdfI (圖1A，泳道2)。通過其不存在於生長在RPMI中的tdfl敲除菌株中而證實了檢出信號的特異性(圖1A，泳道3)。我們注意到，即使在RPMI中加入少量 TSB也會負面影響TdfI合成(圖1B)；顯然，TSB含有抑制tdfl轉錄的化合物。由於我們注意到RPMI不含痕量金屬源，因此我們決定測試加入含有鈷、鉬、錳、銅和鋅的痕量金屬混合物是否可抑制tdfl表達，事實上的確如此。然後我們單獨測試了所有的這些金屬，發現尤其是鋅，即使在低於μ M的濃度下，也會抑制tdfl表達(圖1C)。由於標準RPMI沒有補充具體的鋅源，據推測細菌生長需要的可用鋅來自水和/或用於配製培養基的鹽中的痕量
17鋅。我們通過電感耦合等離子體質譜法(ICP-MQ測定了 RPMI培養基的鋅濃度，發現約為十億分之110(約1.69 μ M)。當我們用具體的鋅螯合劑N，N，N' , N'-四_(2_吡啶基甲基)-乙二胺(TPEN)補充RPMI培養基時，tdfl的鋅調節變得甚至更明顯。向培養基中加入TPEN導致TdfI合成呈劑量依賴性地增加(圖1D)。然而，1 μ M TPEN以上濃度完全抑制細胞生長，據推測是由培養基中總的鋅消耗所致。加入鋅後，可恢復生長(數據未顯示)。 使用從生長在補充或未補充500ηΜ鋅或0. 5 μ M TPEN的RPMI中的培養物獲得的總RNA，通過實時定量PCR(RT-qPCR)證實了 tdfl的鋅調節。數據顯示鋅存在時的阻抑為13. 8倍，而 TPEN存在時上調3. 8倍。添加TPEN和鋅之間的倍數差異為52. 6倍。tdfl表達中轉錄調節子^ir的作用研究表明在大腸桿菌中，鋅攝取調節子bine uptake regulator, Zur)調節 znuACB基因，該基因編碼周質結合蛋白、ATP酶和將鋅從周質轉運到胞質所需要的必要內膜成分。在鋅存在時，Zur結合znuACB操縱子啟動子中的Zur結合元件(共有序列 GAAATGTTATANTATAACATTTC)，從而阻斷轉錄。在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的基因組序列中，我們鑑定出大腸桿菌zur基因的同源物(即NMB1266)和znuCBA的同源物(即NMB0588、NMB0587和 NMB0586)。另外，我們在奈瑟氏球菌tdfl的上遊區域(GtAATGTTATATaATAACAaact)和 znuC (cAAAcGTTATACagTAtCATaTC)中發現了類似於大腸桿菌Zur的序列結合共有序列(與大腸桿菌共有序列相同的核苷酸為大寫字母)。為了證實Zur參與調節tdfl表達，我們製備了菌株HB-I的Zur突變株，其實際上組成型地產生TdfI (圖2)。同樣，RT-qPCR表明， Zur參與znuA和tdfl的表達，因為與其在鋅存在下生長的親本菌株兩者相比，zur突變株的znuA和tdfl表達水平分別提高5倍和34倍。TdfI促進鋅獲取由於tdfl的表達受鋅可獲得性的調節，因此很可能TdfI作為鋅受體或含鋅絡合物起作用。我們應用PROFtmb程序(www, rostlab. org)，首次分析了胺基酸序列並構建了 TdfI的拓撲模型(圖3)。TdfI在推定的胞外環L3中含有2個半胱氨酸殘基。如果這些半胱氨酸形成二硫鍵 (得到我們通過對細菌膜流分進行的有和沒有DTT的SDS-PAGE分析的支持，其中樣品與還原劑溫育導致電泳遷移率改變，據推測是由於二硫鍵遭破壞所致)，則它們使兩個胺基酸殘基序列段緊密相鄰，兩個序列段均富含組氨酸和天冬氨酸殘基(圖幻，這可能具有功能重要性，因為同樣在大腸桿菌的周質SmA蛋白中，His和Asp殘基的序列段參與結合鋅05)。 因此，我們認為有可能TdfI結合游離鋅並將其轉運到周質中。為了驗證這個假設，我們先測定了 TdfI是否可以結合鋅。我們比較了有TdfI和沒有TdfI的外膜囊泡與4-(2-吡啶基偶氮基)間苯二酚(PAR)競爭鋅的能力。與沒有TdfI的囊泡相比，含有TdfI的外膜囊泡顯示鋅結合增加約40% (圖4A)。為了驗證鋅的轉運，我們採用ICP-MS，比較了 tdfl敲除菌株、tonB敲除菌株及其親本菌株胞內鋅的蓄積。與tdfl突變株或tonB突變株相比， HB-I蓄積了約33%以上的鋅，這就表明了 TdfI轉運游離鋅，而且這種轉運需要TonB系統 (圖 4B)。如果TdfI的確參與游離鋅的攝取，則可以預期與野生型菌株相比，在tdfl突變株中，在較高外部鋅濃度下發生znu基因表達的脫阻抑。為了驗證該設想，我們使tdfl突變株和親本菌株在具有額外的500nM鋅的RPMI培養基中生長，這大大抑制(但不完全抑制) 野生型菌株的tdfl表達(圖1C)。我們接著通過RT-qPCR測定了 tdfl和znuA mRNA的相對水平。tdfl突變株仍含有被用來檢測基因表達的tdfl基因的頭437個核苷酸。在tdfl 突變株中，表達更多的tdfl達18. 6倍和更多的znuA達7. 4倍，這就表明在所應用的生長條件下，tdfl突變株中的胞內鋅濃度的確低於親本菌株的胞內鋅濃度。同樣，在鋅存在時， znuA敲除菌株表達高水平的Tdfl，這就證實了細胞中需要SmA以維持足夠的鋅水平(圖 4C)。因此，TdfI和SiuA兩者均參與鋅的轉運。TdfI的保守性除TdfI的功能以外，我們還希望研究TdfI是否是通用腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗的候選疫苗。標準之一是抗原必須是保守的。我們先觀察了可獲得的腦膜炎奈瑟氏球菌基因組，發現TdfI與成熟蛋白質具有顯著的97-99%胺基酸同一性(圖Si)。序列差異分散在整個蛋白質中，並不集中在預測的胞外環區域，該區域在奈瑟氏球菌屬外膜蛋白中通常是抗原可變區(圖Si)。我們接著分析了不同血清群和不同克隆譜系的一組32個不同腦膜炎奈瑟氏球菌分離菌株中TdfI的存在。每個菌株都生長在補充或未補充500nM鋅的RPMI培養基中，並通過蛋白質印跡法用針對H44/76的TdfI形成的抗血清進行了分析。所有菌株表明在鋅存在時TdfI受抑制(圖5)。然後，我們希望了解TdfI與其它致病細菌的同源性。我們先用淋病奈瑟氏球菌進行了 TdfI比較，發現在這兩個奈瑟氏球菌屬菌株之間有96%同一性和97%相似性。接下來，我們應用NCBI的blast程序，用胺基酸水平上40%同一性的截止值檢索其它致病細菌中TdfI的同源物。我們鑑定出包括以下的其它致病細菌的同源物在胺基酸水平上平均有41%同一性和59%相似性，且所有TdfI同源物都具有His/Asp區域(圖S2)黏膜炎莫拉氏菌(M. catarrhalis)、副豬嗜血菌(Haemophilus parasui)、溶血性曼氏桿菌 (Mannheimia haemolytica)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、多殺巴其Jf德氏菌 (Pasteurella multocida)、百日咳鮑特氏菌(Bordetella pertussis)和胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。有趣的是，在百日咳鮑特氏菌中，tdfl同源物位於znuABC和zur基因的同源物附近，再次表明這些基因間的功能關係。此外，所有這些 TdfI同源物都含有富含His和Asp的序列段(圖S2)。TdfI誘導殺菌抗體為了研究TdfI的疫苗潛力，我們用含有過量表達水平的該蛋白質的奈瑟氏球菌外膜囊泡給小鼠免疫(圖6A)，驗證了所得血清存在的殺菌抗體。按常規，我們對生長在 TSB培養基中的細菌進行血清殺菌測定法；然而，在這些條件下，tdfl不表達。因此，我們在由異丙基β-D-I-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導型啟動子表達TdfI的菌株上測定了血清的細菌活性，並比較了在有和沒有IPTG時生長的培養物。IPTG不存在時，血清的殺菌效價 < 1 100，而在細菌生長期間存在IPTG時為1 1042。免疫前血清的效價也< 1 100。 這些數據清楚表明，TdfI能夠誘導殺菌抗體。我們還希望研究正常染色體編碼的tdfl表達水平是否足以介導補體介導的殺菌作用。為此，我們採用了在TSB培養基中組成型產生 TdfI和與野生型菌株相應地生長在所述培養基的zur敲除菌株。討論以前已在淋病奈瑟氏球菌中鑑定出鋅的高親和力auiABC攝取系統(30)。如上所述，同源物可能存在於腦膜炎球菌基因組和許多其它細菌的基因組中。在腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica)中，該ABC轉運蛋白與毒力有關(31)。在任何情況下，都未鑑定出參與鋅獲取的外膜受體，而是認為鋅通過孔蛋白擴散。然而，在人宿主中，游離鋅水平很可能太低以致於不能通過被動擴散來維持細菌生長。人血清中鋅的總量約為19μΜ，但是絕大部被白蛋白等血清蛋白結合(3幻。我們在本文中鑑定出由鋅調節的外膜受體TdfI。將700ηΜ鋅加入生長培養基中完全抑制TdfI表達。TdfI的功能是結合併轉運未結合的(游離)鋅。我們預測，鋅最初被外部環上的His/ Asp序列段結合，然後通過塞子結構域頂部的兩個組氨酸內化(圖北)。TonB系統在鋅攝取中的可能作用是將所述塞子從桶上拉開，伴隨著該運動，結合在兩個His殘基上的鋅被轉運到周質，在周質中被周質結合蛋白SiuA接受。有趣的是，在使用淋病奈瑟氏球菌的微陣列研究中報導了 tdfl和znuA表達的類似調節(33)。tdfl同源物NGO 1205和znuA同源物NG00168在缺乏NG00542基因的突變株中上調。在該研究中，所述基因由於與存在於革蘭氏陽性生物中的錳依賴性過氧化物反應性調節子同源而被定義為perR(34)。然而，這與我們定義為zur的為同一基因。Zur的定義顯然更準確，因為我們證實zur不存在或鋅不存在有相同的調節作用。定義為zur而不是PerR的更多證據來自淋病奈瑟氏球菌的相同研究。用淋球菌perR突變株進行的微陣列顯示，核糖體蛋白L31和L36同樣上調。奈瑟氏球菌基因組含有2拷貝編碼這些蛋白質的各基因，其中各蛋白質的一種形式含有鋅帶狀基序。發現鋅可得性是控制在枯草芽孢桿菌(B. subtilis)中表達的L31/L36蛋白類型的關鍵因素(34)。在淋球菌perR突變體中， 誘導特異性表達缺乏鋅帶狀結構的L31和L36共生同源物(paralog)，高度表明在perR突變體中鋅調節紊亂。而且在另一項研究(17)中，進行了微陣列以鑑定對氧化應激的反應， 而且perR和在PerR研究(33)中鑑定的任何基因都未去阻抑，並且我們也未發現錳對tdfl 和znuA表達有任何調節作用。以前報導了在活性補體存在下誘導tdfl表達(18)。在該微陣列研究中，對在血清和熱滅活血清存在下生長的腦膜炎奈瑟氏球菌的表達譜進行了比較，發現在未處理血清存在下TdfI去阻抑達23倍。初看之下鋅與補體調節之間的關係可能並不明顯。發現類似調節迴路的一種可能的解釋可能是陣列研究中細菌預先生長在具有BSA的RMPI中。已知白蛋白螯合鋅，因此，之前的生長條件可能是嚴格鋅限制的。人血清的熱處理將從白蛋白中釋放出鋅，從而抑制tdfl表達。細菌生長期間將BSA加入TSB培養基中誘導TdfI表達的事實支持這種解釋(數據未顯示)。Hagen和Cornelissen (35)的一項研究對所有Tdf蛋白對淋病奈瑟氏球菌在人上皮細胞中的胞內存活是否是必需的進行了研究。作者還測試了 TdfI同源物敲除(NG1205)， 但該突變株在胞內的存活不受影響。TdfI的保守性是顯著的；在測序的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中具有98. 6%同一性， 而在成熟蛋白的胺基酸水平上具有99. 2%相似性。在所測試的所有腦膜炎球菌中都存在 TdfI蛋白，並且所有菌株都顯示鋅調節的tdfl表達。測序的腦膜炎球菌菌株和淋球菌菌株的TdfI蛋白間，胺基酸水平上有96. 同一性和97. 3%相似性。TdfI序列的差異分散在整個蛋白質中，並不集中在特定的環上。我們發現與其它細菌同源物的TdfI平均有41 %胺基酸同一性，並且在所有情況下，His/Asp序列段都是保守的。吸引人的是，TdfI同源物特別存在於定居在人和動物呼吸道的細菌中。可能是在呼吸道的黏膜層中，未結合的鋅濃度太低以致不足以被動擴散穿過孔蛋白，因而TdfI成為細菌生長和存活的必需成分。雖然對於胞內存活TdfI不是必不可少的(35)，但是它在體液如血清和其中游離鋅濃度可能也非常低的液體中則可能是必不可少的。同樣，我們不能排除這樣的可能性即TdfI另外識別在呼吸道、血清和/或腦液可得到的絡合形式的鋅。我們進一步證實了 TdfI可在小鼠中誘導殺菌抗體，而且這些抗體特異性針對 Tdfl。同樣，當我們使用表達染色體基因座的TdfI的細菌時，我們可檢測出殺菌活性，這就表明在感染期間，抗原濃度高到足以清除腦膜炎奈瑟氏球菌。高水平的保守性和產生TdfI特異性殺菌抗體的可能性使TdfI成為良好的候選疫
田ο材料與方法所使用的縮略詞IPTG，異丙基β-D-I-硫代半乳糖苷；PAR，4-Q-吡啶基偶氮基)間苯二酚；RPMI ,Roswell Park Memorial Institute 培養基 1640 ;Tdf，TonB 依賴性家族；TPEN，N，N，N' ,N'-四O-吡啶基甲基)乙二胺；TSB，胰蛋白酶大豆肉湯；ICP-MS，電感耦合等離子體質譜法。菌株與生長條件圖5所列奈瑟氏球菌屬菌株來自實驗室保藏物。除非另有說明，否則用菌株HB-I 及其突變體進行實驗。HB-I是B血清群菌株H44/76的無莢膜衍生株(Bos&Tommassen， 2005)。在燭罐中，使腦膜炎奈瑟氏球菌在含有Vitox(Oxoid)和抗生素(適當時)(卡那黴素，100yg/ml ；氯黴素，10 μ g/ml)的GC瓊脂(Oxoid)板中於37°C生長。振蕩的同時，使液體培養物在塑料培養瓶中的TSB (Difco)或RPMI (Sigma)中於37°C生長。按標出s的濃度加入 IPTG、鋅和 TPEN。以混合物(340nMZnS04、160nM Na2MoO4,800nM MnCl2、80nM CoCl2 和 80nM CuSO4終濃度)加入金屬，或者以單獨的化合物按與混合物中的相同濃度加入，除非另有規定。以8μ M終濃度加入氯化鐵。大腸桿菌菌株DH5a和T0P10F，(Invitrogen)用於常規克隆，BL21(DE3) (Invitrogen)用於表達。使用大腸桿菌hemA突變株評價TdfI的血紅素轉運0 。使大腸桿菌在適當時補充了 100 μ g/ml氨苄西林、50 μ g/ml卡那黴素或 25 μ g/ml氯黴素的Luria-Bertani培養基中繁殖。對於大腸桿菌血紅素營養缺陷型C600 hemAr::kan(22)為補充了 5-氨基乙醯丙酸的培養基。質粒和突變體的構建使用NMB0964 (tdfl)、NMB 1730 (tonB)、NMN0586 (znuA)、NMB1266 (zur)，根據 MC58 基因組序列，設計了所有引物。為了在大腸桿菌中高水平產生蛋白質，使用分別攜帶限制位點NdeI和BamHI (粗體)的引物 0964-F-GAT CATATG CATGAAACTGAGCAATCGGTG-和 0964-R-GA GGATC CTTAAATCTTCACGTTCACGCCGCC-,通過PCR，由菌株H44/76的染色體DNA擴增無信號序列編碼部分的tdfl基因。按照生產商(Invitrogen)的建議，將所得產物克隆至pCRII-T0P0， 得到pCRII-tdfl，並利用Ndel/BamHI限制酶切位點亞克隆至pETlla (Novagen)，得到質粒 pETlla-tdfL·為了獲得tdfl缺失構建體，用弓丨物Kan-R-TG ACGCGT CTCGACGCTGAGGTCTGC-和 Kan-F-TG TGTACA GTCGACTTCAGACGGCCACG-通過 PCR 擴增卡那黴素抗性基因表達盒(36)，並在MluI和BsrGI消化後，克隆至用相同酶消化的pCRII-tdfl 中。在所得構建體pCKII-tdfl: :kan中，卡那黴素抗性表達盒取代tdfl的bp 437和1344 之間的區域。pCRII-tdfl: :kan用於用0964-R和0964-F引物的PCR，所得產物用於轉化 HB-I (37)。通過PCR測定卡那黴素抗性菌落的正確基因置換。H44/76的完整tdfl基因分別用含有NdeI和AatII識別位點(粗體)的弓 I 物 TdfI-F-GCAT CATATG GCACAAACTACACTCAAACCC-禾口 TdfI-R-AT GACGTC TTAAAACTTCACGTTCACGCCGCC-擴增。利用NdeI和AatII限制位點，將所得PCR產物克隆至 pCRII-TOPO,並亞克隆至pEmi-pldA(36)。所得質粒pEmi-tdfl構成奈瑟氏球菌複製質粒，含有IacI0基因和用於tdfl受控表達的串聯lac/tac啟動子。對於一個片段使用引物tonB-1(GTACGATGATTGTGCCGACC)、具有 AccI 限制位點(粗體)的 tonB-2 (ACTTTAAACTCC GTCGA CGCAA GTCGA CTGCGGGGGTTAA)，對於另一片段為具有限制位點AccI (粗體)的tonB-3(TTAACCCCCGCA GTCGA CTTGC GTCGA CGGAGTTTAAAGT)禾口 tonB-4 (GCCATACTGTTGCGGATTTGA)，通過擴增tonB基因上遊和下遊的DNA片段，製備產生 tonB敲除的構建體。將兩個片段分別克隆至pCRII-TOPO，然後利用引入的限制位點AccI 和pCRII-TOPO載體的SpeI位點將彼此連接。隨後用含有AccI位點的引物通過PCR擴增， 利用AccI位點克隆之前克隆至CRII-T0P0的pKD3(38)的氯黴素轉乙醯酶基因。使用引物tonB-Ι和tonB-4，使所得構建通過PCR擴增，且該線性片段用於轉化腦膜炎奈瑟氏球菌 HB-I。按照相同策略敲除zur基因。在此情況下，上遊和下遊片段用以下引物擴增zur-l(TTCGCCGATGGCGGAATACA)、具有限制位點AccI (粗體)的 zur-2 (CTTTCAGCGCAAA GTCGAC TCC GTCGAC GCGTGCCTGTTC)、具有限制位點 AccK 粗體)的 zur-3 (GAACAGGCACGC GTCGAC GGA GTCGAC TTTGCGCTGAAAG)和 zur-4(TCCTATTGCGCAATACCCCC)。腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的porA衍生株(稱為CE2001) (39)用pMF121轉化，導致缺失完整莢膜基因座並產生截短外核(truncated outer core)的脂多糖(36)。 之前已描述了含有腦膜炎奈瑟氏球菌tonB、exbB和exbD基因的pLAFR衍生質粒(13)。 SDS-PAGE和蛋白質印跡分析細胞裂解物由生長6小時的細菌製備。將細胞稀釋成OD6tltlnmI,沉澱，並在100 μ 1 含有2% SDS和5% 2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩衝液中煮沸。通過標準SDS-PAGE分離蛋白質。凝膠用考馬斯亮藍染色，或者使用25mM TriS-HCl、192mM甘氨酸、20%甲醇中的溼轉印系統(Biorad)，將蛋白質轉印至硝化纖維膜(Protran)上。膜用含有0. 吐溫 20和0. 5% Protifar (Nutricia)的PBS封閉1小時。將印跡在封閉緩衝液中與抗體一起溫育。採用山羊抗兔IgG過氧化物酶綴合的第二抗體(Biosource)和化學發光增強檢測法 (Pierce)，檢測抗體結合。免疫接種使含有pETlla-tdfl的BL21(DE3)細胞在LB中生長至OD A6tltl為0. 6，之後加入 ImM IPTG，並繼續生長2小時。TdfI蛋白在包含體中蓄積，包含體按所述方法分離(40)，使用純的蛋白質於Eurogentec給兔免疫接種。按1/5000稀釋度使用所得抗血清SN1042。在ImM IPTG存在或不存在時生長的菌株CE 1523/pEmi_tdfI的外膜囊泡通過脫氧膽酸鹽提取製備(41)，並按所述方法用於給小鼠免疫接種(32)。42天後收集10隻小鼠 /組的血清並合併。實驗遵照比利時國家相關準則和Glaxo SmithKline Biologicals的機構政策。RT-qPCR按照生產商的建議，採用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System 和 SYBR 綠色主體混合物(SYBR green master mix) (Applied Biosystems)進行 RT-qPCR。將約虹109個奈瑟氏球菌細胞重新懸浮於:3ml Trizol(Invitrogen)中來分離總 RNA。加入600 μ 1氯仿後離心，上相1 1與75%乙醇混合。將其加載到nucleospin RNA II柱(Macherey-Nagel)上，隨後用nucleospin RNA II試劑盒的緩衝液R3洗滌，用100 μ 1 水洗脫。RNA然後用Turbo DNA Free(Ambion)處理，得到無DNA的RNA。為了製備cDNA，按照生產商的建議，採用轉錄子高保真cDNA合成試劑盒(Roche)，從隨機六聚體反轉錄1 μ g 總RNA。作為對照，製備平行樣品，其中從反應混合物省略反轉錄酶。用以下循環參數，在 96孔板(Applied Biosystems)中以25 μ 1體積一式三份進行PCR :95°C 10分鐘用於酶激活，接著95°C 15秒鐘40次循環和60°C 1分鐘。繪製解鏈曲線以確保信號來自特定擴增子。 採用比較循環閾值方法(Applied Biosystems)進行數據分析以確定相對表達水平。使用 rmpM轉錄物使所有數據歸一化。ICP-MS在烏得勒支大學(Utrecht University)地球化學系綜合實驗室，用I CP-MS測定了總鋅濃度。使腦膜炎奈瑟氏球菌菌株從0. 1起始OD A550起在RPMI培養基中生長6小時； 在此時間點上，取出樣品，在ΙμΜ鋅存在下，使剩餘的培養物再生長1小時。1小時後，取出第二樣品。將兩種樣品(7ml)在磷酸緩衝鹽溶液中洗滌後，再懸浮於水中，於56°C殺滅1 小時，並於_80°C冷凍。然後使樣品融化，超聲處理後，經0.22-μ m過濾器(Millipore)過濾οPAR競爭測定法PAR競爭測定法是一種比色反應，其中在蛋白質或能夠從PAR中釋放鋅的化學試劑存在下，PAR-鋅複合物的橙色變成黃色。按照所述方法0 經下面的改動進行該測定 我們加入30 μ M鋅而不是50 μ M鋅，而且我們先測定了 PAR-鋅溶液，然後將外膜囊泡加入杯中後再次測定了溶液。這樣，我們避免了最終由UV引起的可能的顏色改變。然後將數據先歸一化至PAR-鋅測量值，然後歸一化至只有PAR樣品，得到外膜囊泡的結合值。所示結果是500nm吸收的歸一化數據。血清殺菌測定法野生型H44/76用pEmi-tdfl轉化，從隔夜生長的板中接種到振動燒瓶中，在有或沒有ImM IPTG並有125 μ M FeCl3的TSB中於37°C達3小時，直到OD A550達到0. 5。將待測血清1 100稀釋於Hank平衡鹽溶液(HBSS) (GIBCO) ,0.3% BSA中，然後在滅菌U型底 96孔微量滴定板(NUNC)中以50 μ 1體積連續稀釋O倍稀釋步驟，8次稀釋)。將細菌在 HBSS、0. 3% BSA中稀釋，得到約13，000CFU/ml，將37. 5 μ 1懸液樣品加入血清稀釋液中。振蕩的同時，將微量滴定板於37°C溫育15分鐘。隨後，將12. 5μ 1幼兔補體(Pelfreez)或作為血清毒力的對照的熱滅活(56°C達45分鐘)補體加入孔中。振蕩的同時於37°C溫育 1小時後，將微量滴定板置於冰上終止殺菌。每孔中，將20μ 1點樣到GC板，同時使板傾斜使液滴順板「流」下。在隔夜溫育後，統計菌落，計算殺菌百分比。殺菌效價定義為產生> 50%殺菌的最高血清稀釋度。參考文獻1. Ratledge, C. 2007. Iron metabolism and infection. Food. Nutr. Bull. 28 S515-523.2. Wandersman, C. and P. Delepelaire. 2004. Bacterial iron sources :from siderophores to hemophores. Annnu. Rev. Microbiol. 58 :611-647.3. Wiener, M. C. 2005. TonB-dependent outer membrane transport :going for Baroque ？ Curr. Opin. Struct. Biol. 15 :394-400.4. Postle，K. 1993. TonB protein and energy transduction between membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 25 :591-601.5. Braun，V. 2006. Energy transfer between biological membranes. ACS Chem. Biol. 1 :352-354.6. De, S. K. , M. T. McMaster, and G. K. Andrews. 1990. Endotoxin induction of murine metallothionein gene expression. J. Biol. Chem. 265 :15267-15274.7. Corbin, B. D. ， Ε. H. Seeley, A. Raab, J. Feldmann, Μ. R. Miller, V. J. Torres, K.L.Anderson，B.M.Dattilo，P. M.Dunman, R.Gerads，R. M.Caprioli，W.Nacken， W.J.Chazin，and E. P. Skaar. 2008. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 :962-965.8. Stephens，D. S.，and S. M. Zimmer. 2002. Pathogenesis，therapy and prevention of meningococcal sepsis. Curr. Infect. Dis. Rep. 4 :377-386.9. Finne, J.，Μ. Leinonen, and P. H. Makela. 1983. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitis. Implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet. 2 :355-357.10.Pettersson， A. ， A.Maas, and J.Tommassen.1994.Identification of the iroA gene product of Neisseria meningiridis as a lactoferrin receptor. J.Bacteriol. 176 :1764-1766.11. Legrain，M.，V. Mazarin，S. W. Irwin, B. Bouchon，M. J. Quentin-Millet，
E.Jacobs，and A. B. Schryvers. 1993. Cloning and characterization of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin一binding proteins Tbpl and Tbp2. Gene. 130 :73-80.12. Lewis, L. A.，Ε. Gray, Y. P. Wang, B. A. Roe，and D. W. Dyer. 1997. Molecular characterization hpuAB， the haemoglobin—haptoglobin—utilization operon of Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol. 23 :737-749.13. Stojil jkovic，L，V. Hwa, L de Saint Martin，P. 0 ' Gaora, X. Nassif,
F.Heffron，and M. So. 1995. The Neisseria meningitidis haemoglobin receptor :its role in iron utilization and virulence. Mol. Microbiol. 15 :531-541.
14. Carson, S. D. ， P. E. Klebba, S. M. Newton, and P. F. Sparling. 1999. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. J. Bacteriol. 181 2895-2901.15. Turner，P. C.，C. Ε. Thomas，I. Sto j i 1 jkovi c，C. Elkins, G. Kizel, D. A. Ala* Aldeen,and P. F. Sparling. 2001. Neisserial TonB-dependent outer-membrane proteins -detection， regulation and distribution of three putative candidates identified from the genome sequences. Microbiology. 147 :1277-1290.16. Ducey， T. F. ， Μ. B. Carson, J. Orvis, A. P. Stintzi, and D. W. Dyer. 2005. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. J. Bacteriol. 187 :4865-4874.17. Grifantini, R.，E. Frigimelica, I. Delany, E. Bartolini, S. Giovinazzi， S. Balloni, S. Agarwal, G. Galli, C. Genco, and G. Grandi. 2004. Characterization of a hovel Neisseria meningitidis Fur and iron-regulated operon required for protection from oxidative stress :utility of DNA microarray in the assignment of the biological role of hypothetical genes. Mol. Microbiol. 54 :962-979.18. Dove, J. E.，K. Yasukawa, C. R. Tinsley，and X. Nassif. 2003. Production of the signalling molecule， autoinducer-2—2， by Neisseriameningitidis :lack of evidence for a concerted transcriptional response. Microbiology. 149 :1859-1869.19. Altschul，S. F.，Τ. L Madden，A. A. Schaffer，J. Zhang，Z. Zhang，W. Miller, and D. J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST :anew generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402.20. Furano, K.，and A. A. Campagnari. 2004. Identification of ahemin utilization protein of Moraxella catarrhal is (HumA). Infect. Immun. 72 :6426-6432.21. Mazoy, R.，and M. L. Lemos. 1996. Identification of heme-binding proteins in the cell membranes of Vibrio anguilllarum. FEMS Microbiol. Lett. 135 :265-270.22. Ghigo, J. M. ， S. etoffe， and C. Wandersman. 1997. A new type of hemophore-dependent heme acquisition system of Serratia marcescens reconstituted in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179 :3572-3579.23. Patzer, S. I, and K. Hantke. 1998. The ZnuABC high-affinity zinc uptake system and its regulator Zur in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 28 :1199-1210.24. Ferguson, A. D. ，Ε. Hofmann, J. W. Coulton, K. Diederichs, andW. Welte. 1998. Siderophore—mediated iron transport :crystal structure of FhuA with bound lipopoIysaccharide. Science. 282 :2215-2220.25. Yatsunyk，L. A.，J. A. Easton，L. R. Kim, S. A. Sugarbaker, B. Bennett， R. M.Breece，Vorontsov, II，D.L.Tiemey, M. W. Crowder, andA.C. Rosenzweig. 2008. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J. Biol. Inorg. Chem. 13 :271-288.26. Bentley，S. D.，G. S. Vernikos，L. A. Snyder, C. Churcher, C. Arrowsmith， T. Chillingworth, A. Cronin，P. H. Davis, N. E. Holroyd, K. Jagels，M. Maddison，S. Moule，
25E. Rabbinowitsch, S. Sharp，L. Unwin, S. Whitehead, Μ. A. Quail, Μ. Achtman, B. Barrel 1, N.J. Saunders，and J. Parkhi11. 2007. Meningococcal genetic variation mechanisms viewed through comparative analysis of serogroup C strain FAM18. PLoS Genet. 3 e23..27. Dempsey，J. A.，W. Li taker , A. Madhur e , T. L. Snodgras s , and J. G. Cannon. 1991. Physical map of the chromosome of Neisseria gonorrhoeae FA 1090 with locations of genetic markers，including opa and pilgenes. J. Bacteriol. 173 5476-5486.28. Parkhill, J.，Μ. Achtman, K. D. James，S. D. Bentley，C. Churcher, S. R. Klee，
G.Morelli, D. Basham, D.Brown, T.Chillingworth, R. M. Davies, P. Davis, K.Devlin, T. Feltwell，N. Hamlin，S. Holroyd, K. Jagels，S. Leather，S. Moule，K. Mungal 1, M. A. Quail， M. A. Rajandream，K. M. Rutherford，M. Simmonds, J. Skelton，S. Whitehead, B. G. Spratt, and B.G. Barrel1. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain ofNeisseria meningitidis Z2491. Nature. 404 :502-506.29. Tettelin, H. ， N. J. Saunders, J. Heidelberg, A. C. Jeffries, K. E. Nelson, J. A. Eisen，K. A. Ketchum，D. W. Hood，J. F. Peden，R. J. Dodson，W. C. Nelson，M. L Gwinn, R. DeBoy, J. D. Peterson，E. K. Hickey, D. H. Haft, S. L. Salzberg，0. White, R. D. Fleischmann，B. A. Dougherty, T. Mason，A. Ciecko, D. S. Parksey, E. Blair,
H.Cittone，E. B. Clark，M. D. Cotton，T. R. Utterback，H. Khouri, H. Qin，J. Vamathevan, J. Gill，V. Scarlato，V. Masignani，M. Pizza, G. Grandi, L Sun，H. 0. Smith，C. M. Fraser, E. R. Moxon, R. Rappuo 1 i, and J. C. Venter. 2000. Complete genome sequence of Neisseria meningitidis serogroup B strain MC58. Science. 287 :1809-1815.30. Chen, C. Y.，and S. A. Morse. 2001. Identification and characterization of a high-affinity zinc uptake system in Neisseria gonorrhoeae. FEMS Microbiol. Lett. 202 :67-71.31. Ammendola, S.，P. Pasqual i，C Pistoia，P. Petrucci，P. Petrarca，G. Roti lio， and A. Battistoni. 2007. The high affinity Zn2+uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to virulence of Salmonella enterica. Infect. Immun. 75 :5867-5876.32. Stewart, A. J.，C. A. Blindauer，S. Berezenko，D. Sleep，and P. J. Sadler. 2003. Interdomain zinc site on human albumin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 :3701-3706.33. Wu, H. J. ， K. L. Seib, Y. N. Srikhanta, S. P. Kidd， J. L. Edwards, T. L. Maguire, S. M. Grimmond，M. A. Apicella，A. G. McEwan, and M. P. Jennings. 2006. PerR controls Mn—dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Mol. Microbiol. 60 :401-416.34. Nanamiya, H.，G. Akanuma, Y. Natori, R. Murayama, S. Kosono, Τ. Kudo, K. Kobayashi，N. Ogasawara, S. Μ. Park，K. Ochi，and F. Kawamura. 2004. Zinc is a key factor in controlling alternation of two types of L31 protein in the Bacillus
26subtilis ribosome. Mol. Microbiol. 52 :273-283.35. Hagen, Τ. Α. , and CN. Cornelissen. 2006. Neisseria gonorrhoeae requires expression of TonB and the putative transporter TdfF to replicate within cervical epithelial cells.Mol.Microbiol. 62 :1144-1157.36. Bos, M. P.，B. Tefsen，P. Voet，V. Weynants，J. P. M. van Putten，and J. Tommassen. 2005. Function of neisserial outer membrane phospholipase A in autolysis and assessment of its vaccine potential. Infect. Immun. 73 :2222-2231.37. Voulhoux, R.，Μ. P. Bos, J. Geurtsen，M. Mols，and J. Tommassen. 2003. Role of a highly conserved bacterial protein in outer membrane nrotein assembly. Science. 299 :262-265.38. Datsenko, K. A.，and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645.39. Tommassen，J.，P. Vermei j, M. Struyve, R. Benz，and J. T. Poolman. 1990. Isolation of Neisseria meningitidis mutants deficient in class 1 (PorA)and class 3 (PorB) outer membrane proteins. Infect. Immun. 58 :1355-1359.40. Dekker，N.，K. Merck，J. Tommassen，and H. M. Verhei j. 1995. In vitro folding of Escherichia coli outer-membrane phospholipase A. Eur. J. Biochem. 232 :214-219.41. Weynants, V. E.，CM. Feron, K. K. Goraj, M. P. Bos, P. A. Denoel, V. G. Verlant， J. Tommassen, I. R. Peak，R. C. Judd，M. P. Jennings，and J. T. Poolman. 2007. Additive and synergistic bactericidal activity of antibodies directed against minor outer membrane proteins of Neisseria meningitidis. Infect. Immun. 75 :5434-5442.42. Lim，K. H.，C. Ε. Jones，R. N. vanden Hoven, J. L. Edwards, M. L. Falsetta， M. A. Apicella,M. P. Jennings, and A. G. McEwan. 2008. Metal binding specificity of the MntABC permease of Neisseria gonorrhoeae and its influence on bacterial growth and interaction with cervical epithelial cells. Infect. Immun. 76 :3569-3576.表1.測序的奈瑟氏球菌屬菌株中成熟TdfI蛋白序列的保守性。
權利要求
1.一種包含由奈瑟氏球菌屬(Neisseria)細菌製備的分離的外膜囊泡和藥學上可接受的賦形劑的免疫原性組合物，其中當給予患者時，所述奈瑟氏球菌屬細菌產生足夠水平的NMB0964多肽以提供誘導抗NMB0964抗體的囊泡的產生。
2.權利要求1的免疫原性組合物，其中所述NMB0964多肽是奈瑟氏球菌屬細菌內源性的。
3.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌經遺傳修飾而含有編碼外源NMB0964多肽的核酸。
4.權利要求1-3的免疫原性組合物，其中所述NMB0964多肽由具有內源啟動子的 NMB0964基因表達。
5.權利要求1-4的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的NMB0964多肽產生被遺傳修飾。
6.權利要求5的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌通過破壞Zur阻抑蛋白 (NMB1266)的功能性表達而被遺傳修飾。
7.權利要求5或6的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌經遺傳修飾以提供由異源啟動子表達NMB0964多肽。
8.權利要求7的免疫原性組合物，其中所述異源啟動子不結合Zur阻抑蛋白。
9.權利要求7或8的免疫原性組合物，其中所述異源啟動子是在所述奈瑟氏球菌屬細菌中比NMB0964基因的非阻抑內源啟動子更強的啟動子。
10.權利要求7-9的免疫原性組合物，其中所述異源啟動子是IPTG誘導型Iac啟動子。
11.權利要求1-10的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平高於生長在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中的腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis) 菌株H44/76產生的水平。
12.權利要求1-10的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平等於或大於生長在Roswell Park Memorial Institute培養基1640 (RPMI)中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76產生的水平。
13.權利要求1-10的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平等於或大於生長在加有ΙμΜ ΤΡΕΝ(Ν,Ν,Ν'，N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺) 的Roswell Park Memorial Institute培養基1640 (RPMI)中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株 H44/76產生的水平。
14.權利要求1-10的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964 多肽的水平等於或大於生長在游離Zn2+小於5、4、3、2、1、0· 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3、 0. 2,0. 1,0. 05或0. 01 μ M的培養基中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Η44/76產生的水平。
15.權利要求1-14的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌是腦膜炎奈瑟氏球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群。
16.權利要求1-15的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌缺乏莢膜多糖。
17.權利要求16的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌通過破壞SiaD基因的功能性表達而缺乏莢膜多糖。
18.權利要求1-17的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的msbB和/或htrB 基因的功能性表達受到破壞。
19.權利要求1-18的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的一個或多個下列基因的表達受到破壞PorA、PorB, OpA、OpC, PiIC或FrpB。
20.權利要求1-19的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的IgtB基因的功能性表達受到破壞。
21.權利要求1-20的免疫原性組合物，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌是免疫型L2或L3。
22.權利要求1-21的免疫原性組合物，其中所述外膜囊泡通過用0-0.5%、 0. 02-0. 4%,0. 04-0. 3%,0. 06-0· 2%或0. 08-0. 15%洗滌劑提取而分離，所述洗滌劑例如脫氧膽酸鹽，例如大約或正好0.脫氧膽酸鹽。
23.一種產生免疫原性組合物的方法，所述方法包括培養產生NMB0964多肽的奈瑟氏球菌屬細菌，其中當給予患者時，所述NMB0964多肽產生的水平足以提供誘導抗NMB0964抗體的外膜囊泡的產生；由所培養的細菌製備外膜囊泡；並將所述外膜囊泡與藥學上可接受的賦形劑混合以產生適用於給予患者的免疫原性組合物。
24.權利要求23的方法，其中所述NMB0964多肽是奈瑟氏球菌屬細菌內源性的。
25.權利要求23或對的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌經遺傳修飾而含有編碼外源 NMB0964多肽的核酸。
26.權利要求23-25的方法，其中所述NMB0964多肽由具有內源啟動子的NMB0964基因表達。
27.權利要求2346的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的NMB0964多肽產生已被遺傳修飾。
28.權利要求27的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌通過破壞^ir阻抑蛋白 (NMB1266)的功能性表達而被遺傳修飾。
29.權利要求27或觀的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌經遺傳修飾以提供由異源啟動子表達NMB0964多肽。
30.權利要求四的方法，其中所述異源啟動子不結合^ir阻抑蛋白。
31.權利要求四或30的方法，其中所述異源啟動子在所述奈瑟氏球菌屬細菌中是比 NMB0964基因的非阻抑型內源啟動子更強的啟動子。
32.權利要求四-31的方法，其中所述異源啟動子是IPTG誘導型Iac啟動子。
33.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平大於生長在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76產生的水平。
34.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平等於或大於生長在Roswell Park Memorial hstitute培養基1640 (RPMI)中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76產生的水平。
35.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平等於或大於生長在加有ΙμΜ ΤΡΕΝ(Ν,Ν,Ν' ,N'-四O-吡啶基甲基)乙二胺)的Roswell Park Memorial Institute培養基1640 (RPMI)中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76產生的水平。
36.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌產生的NMB0964多肽的水平等於或大於生長在其中游離 Zn2+ 小於 5、4、3、2、1、0· 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1、 0. 05或0. 01 μ M的培養基中的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株Η44/76產生的水平。
37.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的培養是在其中游離Zn2+小於 5、4、3、2、1、0· 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2,0. 1,0. 05 或 0. 01 μ M 的培養基中進行。
38.權利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的培養是在包含Si2+螯合劑的培養基中進行。
39.權利要求38的方法，其中所述Zn2+螯合劑以0.01-100,0. 1-10,0. 3-5或0. 5-1 μ M的濃度存在於培養基中。
40.權利要求38或39的方法，其中所述存在於培養基中的Si2+螯合劑是ΤΡΕΝ。
41.權利要求23-40的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌是腦膜炎奈瑟氏球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群。
42.權利要求23-41的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌缺乏莢膜多糖。
43.權利要求23-42的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌通過破壞SiaD基因的功能性表達而缺乏莢膜多糖。
44.權利要求23-43的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的msbB和/或htrB基因的功能性表達受到破壞。
45.權利要求23-44的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的一個或多個下列基因的表達受到破壞PorA、PorB, OpA、OpC, PiIC 或 FrpB。
46.權利要求23-45的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌的IgtB基因的功能性表達受到破壞。
47.權利要求23-46的方法，其中所述奈瑟氏球菌屬細菌是免疫型L2或L3。
48.權利要求23-47的方法，其中所述製備外膜囊泡的步驟通過用0-0.5%、 0. 02-0. 4%,0. 04-0. 3%,0. 06-0. 2%或0. 08-0. 15%洗滌劑提取來進行，所述洗滌劑例如脫氧膽酸鹽，例如大約或正好0.脫氧膽酸鹽。
49.權利要求23-47的方法，其中所述製備外膜囊泡的步驟無需使用洗滌劑來進行。
50.一種誘導針對奈瑟氏球菌屬的免疫應答的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動物免疫有效量的權利要求1-22的免疫原性組合物，或者通過實施權利要求23-49的方法並給予哺乳動物免疫有效量的所製得的免疫原性組合物。
51.權利要求1-22的免疫原性組合物在製備預防奈瑟氏球菌性疾病的疫苗中的用途。
52.一種預防奈瑟氏球菌性疾病例如腦膜炎奈瑟氏球菌或腦膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗，其包含權利要求1-22的免疫原性組合物或通過權利要求23-49的方法製備的免疫原性組合物。
53.一種包含多肽和藥學上可接受的載體的免疫原性組合物，所述多肽包含與以下序列具有大於50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%序列同一性的肽序列RDQYG LPAHSHEYDDCHADIIWQKSLINKRYLQLYPHLLTEEDIDYDNPGLSCGFHDDDNAHAHTHS，或所述多肽包含所述序列的7、10、12、15或20個(或更多個)連續胺基酸的免疫原性片段，任選其中所述肽序列或所述免疫原性片段能夠誘導-如有必要與蛋白質載體偶聯時-可識別W000/55327 的SEQ ID NO 2的免疫應答。
54.權利要求53的免疫原性組合物，其中兩個Cys殘基存在於多肽中。
55.權利要求M的免疫原性組合物，其中兩個Cys殘基是二硫鍵連接的。
56.權利要求53-55的免疫原性組合物，其中所述多肽不是全長成熟NMB0964多肽，或者不是具有完整信號序列的全長NMB0964多肽。
57.權利要求53-56的免疫原性組合物，其包含Si2+鹽。
全文摘要
本發明涉及包含奈瑟氏球菌囊泡的免疫原性組合物，其具有上調的NMB0964抗原水平，使得產生針對所述抗原的殺菌抗體。首次發現，所述抗原的表達是鋅調節的，因此提供通過去除細胞或啟動子的鋅阻抑機制，或者通過去除培養基中的鋅而上調所述抗原表達的方法。
文檔編號A61K39/095GK102215863SQ200980144843
公開日2011年10月12日 申請日期2009年3月6日 優先權日2008年9月8日
發明者J·P·M·託馬森, J·普爾曼, M·P·波斯, M·斯託克, V·維南茨 申請人:烏得勒支大學, 葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司