具有抗菌活性的對映體化合物的製作方法

2023-10-07 06:14:59

專利名稱：：具有抗菌活性的對映體化合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及抑制細菌甲硫氨醯-tRNA合成酶(MetRS)的雙環雜芳族化合物的新對映體並涉及用於製備它們的方法及它們作為抗菌藥在治療中的用途。此夕卜，本發明涉及這些對映體化合物在治療基於艱難梭菌(C/o欲W"m^^/fe)的感染和疾病中的用途。
背景技術：
：隨著"病菌"造成人類疾病的認識，對抗菌藥物的探究始於19世紀晚期。在過去一個世紀中，科學家們己經開發了用於靶向和抑制眾多菌株的多種藥物。尤其，開發了稱作抗生素的抗菌藥，並且它們在工業化世界各處中廣泛應用以治療大多數已知的細菌感染。最初，抗生素如青黴素通過阻斷肽基轉移酶(一種負責構築細菌細胞壁的酶)的作用而抑制細菌複製。然而，由於濫用及多種菌株的耐藥性適應，多種抗生素已經部分或全部地喪失其在治療感染中的效力。靶向分子生長新機制的一系列抗菌藥物將用於避免進一步增強抗生素耐藥性。此類靶標之一是tRNA合成酶。tRNA合成酶參與蛋白質的生物合成，從而預期對其抑制可以導致細胞生長停止。因此，例如，化合物莫匹羅星已經證實是異亮氨醯tRNA合成酶的抑制劑。莫匹羅星由生物螢光假單胞菌(/^e"必mo"m^MowsceZ附)產生，並且是在GlaxoSmithKline銷售的產品Baetroban⑧中作為活性成份使用的抗菌藥。每一種tRNA合成酶代表用於發現藥物的獨立耙。如此的tRNA合成酶抑制劑因有用作抗菌藥的潛能而具有重大治療價值，其中所述的tRNA合成酶抑制劑對細菌細胞的選擇性勝於對哺乳動物細胞的選擇性。革蘭氏陽性生物-金黃色葡萄球菌(5:aMre"s)中的tRNA合成酶基因的序列最近已經測定(例如見SmithKlineBeecham關於金黃色葡萄球菌MetRS的歐洲專利申請號97300317.1)，因而有助於鑑別抑制劑的方法。此外，其它致病菌(例如革蘭氏陰性生物-流感嗜血桿菌(i/./^7wewz^))中的tRNA合成酶基因的序列也已經發表(R.D.Fleischmann等，Science,269，496-512,1995)。最近已經有人披露了幾種化合物對於MetRS的抑制活性及作為抗菌藥的潛能。具體而言，Jarvest等描述了顯示某種程度MetRS抑制作用的多種雙環雜芳族化合物，包括一種特殊化合物，該化合物是具有左旋四氫喹啉化合物的R構型的對映體((Bioorg.&Med.Chem.Lett.14(2004)3937-3941)。一種特別令人感興趣的細菌靶標是生物艱難梭菌(C7oWn^"md驕a7e，C.d驕"7e)。艱難梭菌正變成更普遍的傳染源，其中三分之一的健康個體是該種生物的攜帶者(Bartlett和Peri，N.Eng.JMed.，353，2503-2505，2005;Clabots等，JInfect，Dis.,166，561-567，1992;McFarland等，N.EnglJMed.，320，204-210，1989)。感染和患病風險在免疫缺陷者、老人尤其護理環境(例如養老院、醫院、醫生診所)中的老人中變得日益普遍。傳統抗菌藥物幾乎不在治療艱難梭菌表現出前景，實際上僅萬古黴素經FDA批准用於治療艱難梭菌相關性腹瀉(CDAD)。因此，本領域中需要獲得治療基於艱難梭菌的感染的額外方法，尤其是避免常規抗生素治療並且因而避免抗生素耐藥性的療法。在這種背景下發現了本發明。發明詳述本發明提供用作細菌甲硫氨醯-tRNA合成酶(MetRS)的強效抑制劑的新化合物。證實本發明的化合物作為針對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌藥具有廣泛的適用性。MetRS抑制劑針對革蘭氏陽性生物具有最佳活性，而針對革蘭陰性生物的活性則弱得多。尤其，證實本發明的化合物具有針對艱難梭菌的出乎意料強效的抗菌活性。本發明的化合物是新的雙環雜芳類對映體，所述對映體對細菌MetRS顯示出乎意料且強效的抑制作用。這些化合物很少或不顯示對哺乳動物MetRS的抑制作用。本發明的化合物作為抗菌藥用於治療。尤其，本發明的化合物顯示針對革蘭氏陽性菌並且尤其針對艱難梭菌的出乎意料的強效。本發明提供式(I)的化合物:其中Ar是右手側(RHS)取代基並且具有取代或未取代的芳基或雜芳基；X選自由NH、O、S、SO、S02或CH2組成的組；n是1、2或3;*表示不對稱碳原子，其中當n是2或3時，貝^是R構型；其中當n是1且X是CH2時，貝^是R構型；並且其中當n是1且X選自由NH、O、S、SO或S02組成的組時，貝ip是s構型。m是0、1、2、3或4;並且R1獨立地選自滷素、氰基、羥基、(C,-6)烷基(任選地由滷素、羥基、氨基、羧基或(CL6)烷氧羰基取代)、((:3.7)環烷基、(d，6)烷氧基、氨基、單-或雙-(C,-6)烷基氨基、醯基氨基、羧基、(Q-6)垸氧羰基、羧基(CL6)烷氧基、(C"6)烷硫基、(d,6)烷基亞磺醯基、(cl6)烷基磺醯基、氨磺醯、単-和雙-(Cl6)烷基氨磺醯、氨基甲醯基、單-和雙-(cl6)烷基氨基甲醯基和雜環。本發明的優選實施方案是式(IIa)和(IIb)的化合物X選自由NH、O、S、SO、S02或CH2組成的組；n是1、2或3;*表示不對稱碳原子，其中當n是2或3時，貝lp是R構型；其中當n逢,其中:是l且X是CH2時，則t是R構型；並且其中當n是l時且X選自由NH、O、S、SO或S02組成的組時，貝I戶是S構型；R1獨立地選自卣素、氰基、羥基、(C,-6)烷基(任選地由卣素、羥基、氨基、羧基或(Q-6)烷氧羰基取代)、(Cw)環烷基、(Cw)垸氧基、氨基、單-或雙-(CL6)烷基氨基、醯基氨基、羧基、(CL6)烷氧羰基、羧基(CL6)垸氧基、(CK6)垸硫基、(d.6)烷基亞磺醯基基、(d.6)垸基磺醯基、氨磺醯、單-和雙-(C,-6)垸基氨磺醯、氨基甲醯基、單-和雙-(CL6)垸基氨基甲醯基和雜環；m是0、1、2、3或4;p是0、1、2或3;W獨立地選自滷素、氰基、羥基、(Cw)垸基(任選地由滷素、羥基、氨基、羧基或(CL6)烷氧羰基取代)、(Cw)環烷基、(d-6)垸氧基、氨基、單-或雙-(C^)垸基氨基、醯基氨基、羧基、(Cw)烷氧羰基、羧基(C,-6)垸氧基、(d-6)烷硫基、(C^6)烷基亞磺醯基、(CL6)烷基磺醯基、氨磺醯、単-和雙-(Cl6)焼基氨磺醯、氨基甲醯基、單-和雙-(Q》垸基氨基甲醯基和雜環；並且當Z,是S時，Z2和Z3是CH;當Z2是S時，Z,和Zs是CH;並且當Z3是S時，Zt和Z2是CH。式(IIa)和式(IIb)的化合物是手性非外消旋的，並且可分離為高對映體過量的其R或S構型。在一些實施方案中，式(II)的化合物含有至少有60%對映體過量的R對映體或S對映體，並且可以是對映體純的，其中所述化合物基本上100%是單一對映體(如由旋光度、手性HPLC所測量，或基於重量/重量所測量)。在優選的實施方案中，本發明的對映體化合物具有R構型或S構型。一組優選的式(IIa)和式(IIb)化合物是這樣的化合物，其中所述式的左手側(LHS)如同式(III)和式(IV)中所顯示那樣，而所述式的右手側(RHS)(或Ar)是噻吩並吡啶酮基團(式III)或喹諾酮基團(式IV):其中-X如式(IIa)和(IIb)中所定義。R1如式(IIa)和(IIb)中所定義。在更優選的實施方案中，(R')m可以進一步定義為在所述環上的第6、8位取代，其中它們可以是相同或不同的取代基，並且優選是溴、氯、碘或硫烷；m如式(na)和(IIb沖所定義；rz如式(IIa)和(IIb)中所定義；和P如式(IIa)和(IIb)中所定義。如上所述，式(III)和(IV)的特徵是以星號(*)標註的不對稱碳原子。包圍該碳原子的鍵產生式(ni)或(iv)的化合物中的r構型。式(m)或(iv)的化合物通常是手性非外消旋的，並且可以分離為高對映體過量的R對映體。在一些實施方案中，式(III)或(IV)的化合物含有至少60%的R對映體，並且可以是對映體純的，其中所述化合物基本上10(P/。是R構型(如由旋光度、手性HPLC或重量所測量)。在優選的實施方案中，具有式(m)或(iv)的化合物均處於R構型。另一組優選的式(IIa)和式(IIb)化合物是這樣的化合物，其中所述式的LHS是二氫苯並呋喃基團，並且所述式的RHS是噻吩並吡啶酮基團(式IV):其中R1如式(IIa)和(IIb)中所定義。在更優選的實施方案中，(R')m可以進一步定義為在所述環上的第5、7位取代，其中它們可以是相同或不同的取代基，並且優選是溴、氯、碘或硫烷；m如式(IIa)和(IIb)中所定義；W如式(IIa)和(IIb)中所定義；並且如上所述，式(V)的特徵是以星號("標註的不對稱碳原子。包圍該碳原子的鍵產生S構型。式(V)的化合物通常是手性非外消旋的，並且可以分離為高對映體過量的S對映體。在一些實施方案中，式V)的化合物含有至少60%的S對映體，並且可以是對映體純的，其中所述化合物基本上100%是S構型(如由旋光度或重量所測量)。在優選的實施方案中，具有式(V)的化合物均處於S構型。幾種優選的本發明化合物包括實施例1-12的化合物。尤其，本發明的優選化合物包括式VI-XI的化合物(下文所示並且參見表1):5-[3-((R)(-)-5,7-二溴-1，2，3,4-四氫-萘-1-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮(式VI);5畫[3-((R)(+)-8-溴-6-氯-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮(式VII);5-[3-((R)(+)-M-二溴-l，2，3，4-四氫-喹啉-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮(式VIII);5-[3-((R)(+)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮(式IX);2-[3-((R)(+)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-lH-喹啉-4-酮(式X);5-[3-((S)-5，7-二溴-苯並呋喃-3-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮(式XI)。表1提供本文中所述化合物的總結，顯示了LHS(左手側)和RHS(右手側)官能團tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12鹽可以通過無機酸和有機酸形成。從中可以形成式(I-XI)化合物的可藥用鹽的適合無機酸和有機酸的代表性實例包括順丁烯二酸、反丁烯二酸、苯甲酸、抗壞血酸、雙羥萘酸、琥珀酸、雙亞甲基水楊酸、甲磺酸、乙二磺酸、乙酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡萄糖酸、天門冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、衣康酸、乙醇酸、對氨基苯甲酸、穀氨酸、苯磺酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸、環己氨磺酸、磷酸和硝酸。當在本文中使用時，術語"烷基"以及相似術語(如"烷氧基")包括全部的直鏈和支鏈異構體。烷基的代表性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基和正己基。當在本文中使用時，術語"烯基"以及術語"炔基"包括全部的直鏈和支鏈異構體。其代表性實例包括乙烯基、乙炔基和l-丙炔基。用於烷基和烯基的優選取代基包括，例如並且除非另有定義，滷素、氰基、疊氮基、硝基、羧基、(d-6)烷氧羰基、氨基甲醯基、單-或雙-(C,-6)垸基氨基甲醯基、磺基、氨磺醯、單-或雙-(CL6)垸基氨磺醯、氨基、單-或雙-(CL6)烷氨基、醯基氨基、脲基、(d-6)垸氧羰基氨基、2，2,2-三氯乙氧基羰基氨基、芳基、雜環基、羥基、(Cw)垸氧基、醯氧基、橋氧基、醯基、2-噻吩醯基(thienoyl)、(C一垸硫基、(CL6)烷基亞磺醯基、((^.6)烷基磺醯基、肟基、(CL6)垸氧亞氨基、聯氨基、亞聯氨基、苯甲醛肟基(benzohydroximoyl)、胍基、脒基和亞氨基烷基氨基。當在本文中使用時，除非另外定義，術語"芳基"包括任選地由至多到5個、優選至多到3個取代基取代的苯基或萘基。在被取代時，芳基可具有至多到4個取代基。用於芳基的優選取代基包括，例如並且除非另外定義:滷素、氰基、(Cu6)烷基、單氟至全氟的(d.3)垸基、(Cw)環垸基、(所需化合物根據2007年9月11日提交的名為"SubstitutedThienopyridoneCompoundswithAntibacterialActivity"的美國專禾伸請系列號11/853,314中所述方法製備為外消旋混合物。所述外消旋物然後通過手性固相色譜法分離。所述外消旋物轉變成氨基甲酸酯官能性如叔丁氧羰基(Boc)，作為促進手性分離的方法。化合物的外消旋混合物在己知條件下用THF中的氫化鈉和Boc-酐進行Boc保護(方法I中的氨基甲酸酯形成)。這種Boc-保護的外消旋混合物然後通過製備型手性色譜法(prep-HPLC)分離成單一對映體，隨後分離出對映體(見方法I中的手性分離法)。隨後將分離的對映體脫保護(見方法I中的氨基甲酸酯去除)，以產生嵩度富含對映體形式的最終化合物。在一個實施方案中，富含對映體的本發明化合物可以通過如方法II中描述的催化性不對稱合成法製備。方法IIformulaseeoriginaldocumentpage15H乂H還原性胺化H義H所需的化合物通過使酮經催化性不對稱轉移氫化成醇，隨後經中間疊氮化合物轉變成胺而製備為富含對映體的形式。還原性胺化和除去保護基方法Iformulaseeoriginaldocumentpage15團可產生最終化合物。本發明的化合物具有針對一系列重要致病菌的活性，其中所述的重要致病菌包括革蘭氏陽性生物，如葡萄球菌屬CSto//9;foax^)例如金黃色葡萄球菌OxfordOS.fl^e^Oxford)和凝固酶陰性葡萄球菌菌株如表皮葡萄球菌(5".e/!'afe/7mW";鏈球菌屬(5^e/tococc/)如化膿鏈球菌(5".;yoge"as)ATCC19615和肺炎鏈球菌R60S./"ewmo"z'aeR6);梭菌屬(C7o^Ww/w)如艱難梭菌孢子，以及腸球菌屬(五"teracocc/)如糞腸球菌10&/^^/&1)和屎腸球菌(五./^d腦)。優選地，本發明的化合物也具有針對革蘭氏陰性生物的活性，其中所述的革蘭氏陰性生物例如是嗜血桿菌屬(Z/flemo;M""如流感嗜血桿菌Ql(//./"ywe"加eQl);莫拉菌屬(Moraxe/to)如卡他莫拉菌1502(Mcata^r/wto1502);螺桿菌屬(7/e//co6acfer)如幽門螺桿菌(//./^/on〕ATCC700824;和埃希氏菌屬CEsc/2er/cM7)如大腸桿菌DC0(￡.Co//DC0)。本發明最優選的化合物具有針對以下生物的活性艱難梭菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌和卡他莫拉菌。此外，本發明的化合物具有針對葡萄球菌屬生物(如金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌菌株(如表皮葡萄球菌))的活性，其中所述細菌對其它抗菌藥(如p-內醯胺抗生素例如甲氧西林、大環內酯類、氨基糖甙類、噁唑垸酮類(oxazolidinone)和林可醯胺類)有耐藥性(包括多重耐藥性)。本發明的化合物也具有針對糞腸球菌(包括萬古黴素耐藥菌株)的活性，並且因此可用於治療與VRE生物相關的感染。另外，本發明的化合物用於治療耐受莫匹羅星的葡萄球菌屬生物。本發明的化合物尤其有力地對抗包括艱難梭菌在內的梭菌屬(即對其有活性)。因此，本發明的化合物可以用於治療與艱難梭菌相關的感染，例如，偽膜性腸炎、中毒性巨結腸和其它抗生素相關性腹瀉(AAD)。然而，本發明的化合物對哺乳動物細胞無活性。這導致對致病菌高活性與對哺乳動物細胞低活性或無活性的最佳組合，從而允許這些化合物用於哺乳動物治療。可以加以治療的細菌感染包括在人中的胃腸道感染、呼吸道感染、中耳炎、腦膜炎、心內膜炎、皮膚及軟組織感染；在牛中的乳腺炎；和在家畜如豬和牛中的呼吸道感染。因此，在另一方面，本發明提供治療人或非人動物中細菌感染的方法，所述方法包括給需要如此治療的人或非人動物施用治療有效量的如上文定義的式(I)-(XI)化合物。本發明的化合物可以與其它已知的抗菌藥聯合施用或可以組合在一起，例如，具有式(vm)和(ix)化合物組合的療法。應當理解，具有廣譜抗菌活性(包括對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的活性)的本發明化合物將廣泛在社區中用於社區獲得性感染的經驗療法。相比而言，具有更明確抗菌譜例如抗革蘭氏陽性菌活性的本發明化合物更有可能用於其中已鑑定到病因性致病生物的環境。本發明提供了包含式(i)-(xi)化合物與可藥用載體或賦形劑的藥用組合物。本發明還提供藥用組合物，所述組合物包含式(i)-(xi)的化合物與可藥用載體或賦形劑的組合。例如，本發明的藥用組合物可以包括式(vii)化合物和式(ix)化合物與所述載體或賦形劑的組合。本發明還提供治療哺乳動物中、特別是人類和家畜中細菌感染的方法，所述方法包括給有需要的患者施用式(I)-(XI)的化合物或本發明的組合物。在一些實施方案中，所述細菌感染是基於梭菌屬的感染，並且常常是艱難梭菌感染。本發明另外還提供式(I)-(XI)的化合物在製備用於治療細菌感染的藥物組合物中的用途。與其它抗生素類似，可以將本發明的化合物和組合物配製成用於以任何便利的方式施用，以用於人或獸醫藥物。本發明的化合物和組合物可以配製用於任意途徑(例如口服、局部用、胃腸外或經直腸)施用。所述組合物可以例如以片劑、膠囊、.散劑、顆粒劑、錠劑、霜劑、栓劑、軟膏劑、凝膠劑、洗劑、糖漿劑或液體製劑(例如溶液劑或混懸劑)的形式配製，所述組合物可以配製用於口服使用或處於無菌形式用於通過注射或輸注的胃腸外施用。用於口服施用的片劑和膠囊劑可以是單位劑型，並且可以含有常規賦形劑，所述的賦形劑包括，例如，結合劑，如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯垸酮；填充劑，如乳糖、蔗糖、玉米澱粉、磷酸鈣、山梨糖醇或甘氨酸；製片潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化矽；崩解劑，如馬鈴薯澱粉；可藥用溼潤劑，例如十二烷基硫酸鈉。所述片劑可以根據常規製藥慣例中已熟知的方法包衣。口服液體製劑可以是以下形式，例如水質或油質混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑，或可以作為使用前以水或其它適合載體重新恢復的乾燥產品存在。該類液體製劑可以含有常規添加劑，所述的添加劑包括，例如，混懸劑，例如山梨糖醇，甲基纖維素、葡萄糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪；乳化劑，例如卵磷脂、失水山梨糖醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(可以包括食用油)，例如，杏仁油、油狀酯(例如甘油)、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸；並且根據需要，常用增香劑和著色劑。意圖用於局部施用的本發明組合物例如可以是以下形式軟膏劑、霜劑、洗劑、眼膏劑、滴眼劑、滴耳劑、浸漬敷料和氣溶膠劑，並且可以含有適宜的常規添加劑，包括，例如，防腐劑、輔助藥物滲透的溶劑以及在軟膏劑、凝膠劑和霜劑中的軟化劑。所述局部用製劑也可以含有兼容性常用載體例如霜劑或軟膏劑基質，以及用於洗劑的乙醇或油醇。此類載體可以構成所述製劑重量的約1%-約98%，更常見地，它們將構成所述製劑重量的達約80%。本發明的組合物可以配製為栓劑，所述栓劑其可以含有常用栓劑基質例如可可豆脂或其它甘油酯。意圖用於胃腸外施用的本發明組合物可以便利地採取流體單位劑型，其中所述的流體單位劑型可以使用所述化合物和無菌載體(優選水)加以製備。根據載體和所使用的濃度，所述化合物可以懸浮在或溶解於所述載體中。在製備溶液劑時，所述化合物可以溶解在注射用水中並且進行無菌過濾，隨後灌入適宜小瓶或安瓿，然後加以密封。有利地，可以在載體中溶解常用添加劑，所述添加劑包括例如局部麻醉藥、防腐劑和緩衝劑。為增強溶液的穩定性，溶液可以在灌入小瓶之後冷凍，並且在真空下除去水；所得凍乾粉末然後可以密封在小瓶中，並且可以提供附帶一小瓶注射用水以便在使用前重新恢復所述液體。胃腸外混懸劑可以按照基本上相同的方式製備，不同之處在於所述化合物混懸而非溶解在載體中並且滅菌不能由200780043263.9以通過在懸浮於無菌載體之前暴露於環氧乙烷進行滅菌。有利地，在此類混懸液中包含表面活性劑或溼潤劑以促進所述化合物的均勻分布。本發明的化合物或組合物可以以抗菌有效量適宜地施用至患者。在一些情況下，本發明的化合物和組合物以抗菌有效量施用以便治療患有梭菌感染、且尤其是患有艱難梭菌感染的患者。本發明的組合物可以根據施用方法，適宜地含有0.1%-60%重量、優選地含有10-60%重量的本發明化合物(基於所述組合物的總重量)。本發明的化合物可以按日劑量1.0-100mg/kg體重適宜地施用至患者。對於成年人(體重大約70kg)而言，可以每日施用50-3000mg、如約1500mg的本發明化合物。適宜地，成年人用劑量是每日5-40mg/kg。不過，根據正常臨床實踐，可以使用更高或更低的劑量。當本發明的組合物作為單位劑型施用時，每個單位劑量可以適宜地包含25-1000mg、優選為50-500mg的本發明化合物。實施例僅提供以下實施例用於說明目的，而不意於限定本發明的範圍。實施例l:合成方法(手性分離和不對稱催化合成)以下實施例和實驗描述製備和使用本發明的方式及方法，並且是說明性而非限制性的。本發明的化合物、其鹽及其中間體，可以按照本文中所述方法或通過本化學領域中的多種已知方法製備或者生產。19方法I:通過手性分離的合成法方法Iformulaseeoriginaldocumentpage20方法B或Co乂n^^n力方法D或EHN^^(sTAr3(i)灘丄.(6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基H3-(7-氧代-4，7-二氫-噻吩並3，2-W吡啶-5-基氨基)-丙萄-氨基甲酸叔丁酯的製備5-[3-(6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮根據2007年9月11日提交的名為"SubstitutedThienopyridoneCompoundsw池AntibacterialActivity"的美國專利申請系列號11/853,314中所述方法製備為外消旋混合物，並且與四氫呋喃(0.02M)和1.5當量氫化鈉(作為礦物油中60%的混懸液)混合。使反應在室溫下攪拌30分鐘並且分批添加1.04當量Boc-酐。在添加完成後，使反應攪拌過夜。除去溶劑並且這種原材料通過矽膠柱層析法純化，用乙酸乙酯和己烷0-100%梯度洗脫以產生作為黃色油的標題化合物。灘5:上述的外消旋混合物通過製備型手性色譜法(prep-HPLC)分離成單一對映體。對於(6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基)-[3-(7-氧代-4，7-二氫-噻吩並[3，2-6]吡啶-5-基氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯，分離到300mg批量第一(R-(+)-對映體(式IX)洗脫對映體和300mg批量第二(S-(-)-對映體)洗脫對映體，二者e.e均〉990/0。製備型HPLC條件柱ChiralpakAD;250x20mm;DiacelChemicalIndustriesLTD洗脫液庚烷/EtOH(卯/10)流速6.0ml/分鐘UV:256nm樣品50mg/ml注入體積500^1停留時間R-(+)-對映體，約37分鐘S-(-)-對映體，約47分鐘分析型HPLC條件柱ChiralcelOD-H;150x4,6mm;DiacelChemicalIndustriesLTD洗脫液庚垸/IPA(90/10)流速0.5ml/分鐘UV:256，328nm樣品約lmg/ml注入體積20^1停留時間R-(+)-對映體，約41分鐘S-(-)-對映體，約46分鐘將類似於方法A製備的叔丁基6,8-二溴-1,2,3，4-四氫喹啉-4-基(3-(7-氧代-4，7-二氫噻吩並[3,2-6]吡啶-5-基氨基)丙基)氨基甲酸酯的外消旋混合物通過製備型HPLC(pre-HPLC)分離單一對映體。分離到113mg批量第一洗脫對映體(式VIII，R-(+)-對映體，e.e》99。/。)和70mg批量第二洗脫對映體(S-(-)-對映體，e.e.85%)。通過又一次製備型HPLC進一步純化所述第二洗脫對映體獲得5.5mg這種對映體，e.e.>99%。製備型HPLC條件柱ChiralcelOD-H;250x20mm;DiacelChemicalIndustriesLTD洗脫液庚烷/EtOH/Et2NH(95/5/0.2%)流速10ml/分鐘UV:256，238nm樣品85mg/ml注入體80pil積分析型HPLC條件柱ChiralcelOD-H;150x4.6mm;DiacelChemicalIndustriesLTD洗脫液庚^/IPA(90/10)流速0.5ml/分鐘UV:256,328nm樣品約lmg/ml注入體積20^1停留時間R-(+)-對映體，約41分鐘S-(-)-對映體，約46分鐘方組'所述的((R)(+)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基)-[3-(7-氧代-4,7-二氫-噻吩並[3，2-6]吡啶-5-基氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯溶解在二噁烷中的4.0MHC1中，並且使其攪拌過夜，在此期間產物從溶液中油析出來(oilout)。將約一半的二噁垸經蒸發除去，並且將剩餘物質攪拌幾小時。產物從溶液中作為灰白色固體析出(該固體通過真空抽濾法分離並在真空下乾燥以產生作為灰白色固體的標題化合物)。方組'用HC1處理((R)(+)-6,8-二溴-l,2，3，4-四氫-喹啉-4-基)-[3-(7-氧代-4，7-二氫-噻吩並[3，2-6]吡啶-5-基氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁酯(以THF中的濃HC1製備的4.0M溶液)。將該溶液攪拌過夜。通過蒸發除去溶劑，用醚攪拌所得白色固體。該固體通過真空抽濾法分離。將固體分離並在真空下乾燥，以產生作為白色固體的標題化合物(該固體通過真空抽濾法分離並在真空下乾燥以產生作為灰白色固體的標題化合物)。方法II:通過不對稱還原的合成法方法II,(CH>4^H2HCI不對稱還原方法F5QHNH2HCI、;W雄，W(，l)還原性胺化方法I^^'、f"(R、"^H2)保護基去除方法J(R1)m^^&(，+。^Vr67式I5-(3-氧代丙氨基)噻吩並3，2-6吡啶-7-基苯甲酸酯HCI鹽(化合物7的實例)的製備中間體2，2-二甲基-5-(甲基磺醯基噻吩-3-基氨基-亞甲萄-1，3二噁垸-4，6-二酮的製備3-噻吩異硫氰酸酯(472.5g，3.34mol)與二甲基亞碸(1.9L)中的2,2-二甲基-l，3-二噁烷-4,6-二酮(433.2g，3.006moi)混合。三乙胺(516mL，3.67mol)經130分鐘逐滴添加，同時維持反應溫度低於20。C。在添加後，將所得混合物在室溫下攪拌16小時。經70分鐘緩慢添加碘甲垸(426.7g，3.006mol)，同時維持反應溫度低於20。C。在添加結束後，該混合物在室溫下攪拌l小時。緩慢地添加稀鹽酸水溶液(含有46mL37%HC1的4.8L水)以析出產物，同時溫度保持低於30。C。攪拌該混合物2小時。將固體濾出並且用水淋洗。所得的潮溼固體懸浮在EtOH(6L)中，並且隨後在減壓下除去此溶劑。所得淤漿溶解於沸騰的甲醇(4.0L)中，用脫色炭(Noritbrand牌，130g)處理，在回流下維持40分鐘。所述的熱溶液經Cdite543墊過濾，並且濾餅用沸騰的甲醇(1L)淋洗。使濾液在室溫下靜置24小時。將固體濾出並乾燥以產生408.4g(45Q/。)的中間體2，2-二甲基-5-(甲基磺醯-噻吩-3-基氨基-亞甲基)-[1，3]二噁垸-4,6-二酮的淡棕色晶體。^NMR(400MHz，CDC13)51.76(s，6H)，2.38(s,3H)，7.09(d，IHJ=5Hz)，7.25(d,1H,J=3.2Hz)，7.38(dd,1H,J=3.2，5Hz)，12.7(brs，1H)。中間體5-((3，3-二乙氧基丙氨基)(噻吩-3-基氨基)亞甲基)-2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮的製備3,3-二乙氧基丙胺(210.7g，1.43mol)按部分經60分鐘添加至2,2-二甲基-5-(甲基磺醯-噻吩-3-基氨基-亞甲基)-[1，3]二噁垸-4,6-二酮(407.38，L36mo1)在二氯甲烷(1.7L)和甲醇(0.36L)中的溶液，同時反應溫度用水浴保持低於25°C。在室溫下攪拌1.5小時後，反應混合物用二氯甲垸(0.8L)稀釋。將有機層分離並用氯化銨水溶液(400mL，由200mL飽和NH4Cl溶液和200mL水製成)、鹽水(300mL)洗滌，並且在硫酸鎂上乾燥。在減壓下濃縮該反應混合物產生了深色油。添加二甲苯(500ml)並且將混合物在減壓下濃縮以產生中間體5-((3，3-二乙氧基丙氨基)(噻吩-3-基氨基)亞甲基)-2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮。所得的深色油在下一個步驟中直接使用，無需進一步純化。！HNMR(400MHz，CDC13)51.65(m，6H)，1.73(s，6H)，1.78(m,2H)，2.98(q,2H，J=6.4Hz)，3,45(m,2H),3.60(m，2H),4.50(t,1H，J=5.2Hz)，6.98(dd,1H,J=1.6，5.2Hz),7.05(dd，1H,J=1.2，3.2Hz)，7.33(dd，1H，J=3.2，5.2Hz)，10.2(s,1H)，11.3(s，1H)。中間體5-(3，3-二乙氧基丙氨基)-7-氧代-4，7-二氫噻吩並3，2-6吡啶-6-羧酸的製備將5-((3，3-二乙氧基丙氨基)(噻吩-3-基氨基)亞甲基)-2，2-二甲基-l,3-二噁烷-4,6-二酮(1.62mol)懸浮於二甲苯(2.4L)中的六甲基二矽氮烷溶液(1.08L，5.18moI)內，並且回流加熱24小時。冷卻至室溫後，將混合物在減壓下濃縮以產生深色油。將這種深色油小心地用甲醇(0.5L)處理以形成棕色固體，隨後添加乙醚(1.6L)。將所得固體過濾並且用MeOH/乙醚(1:3)(0.SL)洗滌。此固體在真空下乾燥以產生432.2g(78%)作為米黃色固體的所需中間體5-(3，3-二乙氧基丙氨基)-7-氧代-4，7-二氫噻吩並[3，2-6]吡啶-6-羧酸。)HNMR(400MHz,DMSOd6)S1.09(m,6H)，1.91(m，2H)，3.40(m,2H)，3.58(m,2H),4.06(s，1H)，4.60(t，1H，J=5.2Hz)，7.28(d，1H，J=4.8Hz)，8.05(d，lH,J=4.8Hz),9.94(m，1H),11.8(s，1H)。中間體5-(3，3-二乙氧基丙氨基)噻吩並3，2-6吡澱-7-醇鈉的製備5-(3，3-二乙氧基丙氨基)-7-氧代-4,7-二氫噻吩並[3,2-6]吡啶-6-羧酸(432g，1.27mol)與甲氧化鈉(95Q/。純度，75.8g，1.33mol)混合併且懸浮於二甲苯(2L)中。所得混合物回流加熱2小時。反應混合物以攪拌逐漸冷卻至室溫以產生淡棕色固體。將該固體通過過濾收集並用甲苯洗滌，並且在真空下於50-60°C乾燥48小時以產生所需中間體5-(3,3-二乙氧基丙氨基)噻吩並[3，2-6]吡啶-7-醇鈉(固體)。這種粗產物在下個步驟中使用，無需進一步純化。'HNMR(400MHz，DMSOdg)51.08(m，6H),1.72(q，2H,J=6.8Hz)，3.15(m,2H),4.55(t，1H,J=6Hz),6.22(s，1H)，6.98(d,1H,J=5.2Hz)，7.53(d，1H,J=5.2Hz)。中間體5-(3，3-二乙氧基丙氨基)噻吩並3，2-W吡啶-7-基苯甲酸酯的製備將5-(3,3-二乙氧基丙氨基)噻吩並[3，2-6]吡啶-7-醇鈉(445.7g，L40mo1)懸浮在DMSO(2.8L)中。在室溫按部分添加苯甲酸酐(332.9g，1.47mol)。在添加後，反應混合物在室溫下攪拌3小時。該混合物用乙酸乙酯(6L)稀釋。所得有機溶液用水(6L)洗滌。分離的水層用乙酸乙酯(2L)萃取。合併的有機層經硫酸鎂乾燥並過濾。在減壓下除去溶劑並在真空下乾燥，產生作為深色油的所需中間體5-(3,3-二乙氧基丙氨基)噻吩射3，2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯。這種產物在下個步驟中使用，無需進一步純化。'HNMR(400MHz，CDC13)51.09(m，6H),1.99(m，2H)，3.50(m,4H)，3.70(m，2H),4.60(t,1H，J=5.6Hz),7.30(d，1H，J=4.8Hz)，7.55(m，3H)，7.67(d,1H,J=4.8Hz),8.24(m，2H)。標題化合物5-(3-氧代丙氨萄噻吩並[3，2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯HC1鹽(化合物7的實例)的製備來自上文的粗製5-(3,3-二乙氧基丙氨基)噻吩並[3，2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯(677.3g，1.68mol)溶解於3.0LTHF中。然後，逐滴添加12NHC1(1.68mol，0.14L)，同時用冰水浴維持反應溫度低於20。C。攪拌5分鐘後，固體析出。所得混合物在室溫下攪拌l小時，隨後添加乙酸乙酯(2.0L)。該混合物攪拌30分鐘。將固體濾出，用乙酸乙酯(250mlx2)淋洗，隨後在減壓下於55。C乾燥以產生作為淡棕色固體的標題化合物5-(3-氧代丙氨基)噻吩射3，2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯HC1鹽。'HNMR(400MHz,DMSOd6)52.20(m，2H)，3.56(m，2H),6.31(t,1H,J=3.6NHz),7.83-7.87(m，2H)，7.96(d，1H，J=6,0Hz)，8.16-8.20(m，2H)，8.35(d，1H，J=5.6Hz),10.20(s,1H)。6，8-二溴-苯並二氫吡哺-4(S)-醇的製備向含有乙腈(0.3M)中的6,8-二溴苯並二氫吡喃-4-酮和5/2甲酸/三乙胺(按體積佔30。/。)的混合物添加(lS,2S)-(+)-N-對甲苯磺醯-l，2-二苯基亞乙基二胺(lmolo/。)和二氯(對異丙基苯甲烷)釕(II)二聚體(0.5mol%)。攪拌24小時後，將該反應用乙酸乙酯稀釋並且用鹽水/碳酸氫鈉(l")洗滌。將有機相在減壓下濃縮以產生作為棕褐色固體的該標題化合物。〗HNMR(400MHz,CDC13)S7.59(d，lH),7.41(d，1H),4.78(ABq,1H)，4.38(m,2H),2.08(m,2H),1.91(d,1H)。灘。4(R)-疊氮基-6，8-二溴-苯並二氫吡喃的製備將含有四氫呋喃中的6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4(S)醇(0.17M)和1.2當量二苯基磷醯基疊氮化物的溶液在室溫下攪拌15分鐘。將此溶液冷卻至10°C並且添加2.5當量l,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。將該混合物攪拌，同時逐漸加溫至室溫並維持48小時。該混合物用乙酸乙酯稀釋並且用鹽水、隨後用水洗滌。濃縮有機相被以產生作為棕褐色油的該標題化合物。NMR(400MHz，CDC13)57.65(d,1H),7.32(d,1H)，4.57(t,1H)，4,43(m，1H):4.31(m，1H)，2.18(m，1H)，2.08(m，1H)。鹽酸6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4(R)-基胺的製備向四氫呋喃中的4(R)-疊氮基-6,8-二溴-苯並二氫吡喃的冰冷溶液(0.16M)添加1.2當量三甲基膦。將混合物加溫至室溫並維持16小時。濃縮該混合物產生粗製胺。將粗製胺溶解於乙腈(0.20M)，添加2當量的鹽酸。將混合物攪拌16小時，將固體濾出、用乙腈洗滌並乾燥以產生作為灰白色固體的標題化合物。'H畫R(400固z，CD3OD)57.75(d，1H)，7.60(dd,1H),4.62(t，1H),4.40(m，2H)，2.40(m,1H),2.20(m，1H)。灘/.'5-3-(6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基胺)丙氨基-噻吩並3，2-A吡啶-7-基苯甲酸酯的製備將5-(3-氧代丙胺)噻吩並[3，2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯鹽酸鹽與1當量四氫呋喃中的鹽酸6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4(R)-基胺(0，35M)混合，隨後添加3當量三乙胺。攪拌1小時後，添加1.3當量三乙醯氧基硼氫化鈉，將混合物攪拌2小時。將此反應用乙酸乙酯稀釋並且用碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥。將粗產物過濾、除去溶劑並通過用二氯甲烷中的0-10%甲醇洗脫的柱層析法純化，產生作為棕色油的該標題化合物。JHNMR(400MHz,CDC13)S8.24(m,2H)，7.70(m,1H)，7.56(m,3H),7.50(d,1H),7,40(d，1H)，7.24(d，1H),6.58(m，1H)，4.34(m,2H)，3.77(t，1H):3.56(m，2H)，2.85(m，2H),2.0(m，2H)。灘/.、'二鹽酸5-3-(6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基胺)丙氨基-4H-噻吩並3，2-A吡啶-7-酮的製備向含有乙酸乙酯(2.5M)和四氫呋喃(1,2M)中的5-[3-(6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基胺)丙氨基]-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-基苯甲酸酯的溶液添加2.5當量在甲醇中的2M氨。攪拌24小時後，將混合物用乙酸乙酯稀釋，並且將固體濾出、用乙酸乙酯淋洗並乾燥。粗製材料通過用二氯甲烷中的0-10°/0氨/甲醇洗脫的柱層析法純化，產生作為游離鹼的此標題化合物。將這種化合物溶解於無水乙醇(0.4M)並添加3當量的4N鹽酸。將混合物加熱至75°C並且用脫色炭處理。所得混合物經Cdite墊進行過濾，並且將濾墊用溫的乙醇/4N鹽酸淋洗。將濾液在室溫下攪拌16小時直至形成無色固體。將此固體濾出、用乙醇/2N鹽酸淋洗並且在真空下於95-10(TC乾燥以產生作為灰白色固體的目的化合物。'HNMR(400MHz,CD3OD):58.04(d，1H)，7.77(s，1H)，7.71(s,1H),7.45(d,1H),6.26(s，1H)，4.62(br，s,1H)，4.52-4.38(m,2H),3.59(t,2H),3.41(m，1H),3.28(m，1H),2.41(m，2H)，2.18(m,2H)。實施例2:二鹽酸5-3-((R)(+)6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並3，2-A吡啶-7-酮(式IX，本發明化合物)的合成使用如方法I(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備該標題化合物並且將其分離為第一洗脫對映體。可選地，該標題化合物根據方法n(方法F-J)製備。該標題化合物在這兩種情況下均作為灰白色固體分離。'HNMR(400MHz,CD3OD):S8.04(d,1H),7.77(s，1H),7.71(s，1H)，7.45(d，1H)，6,26(s,1H)，4.62(br,s，1H)，4.52-4.38(m，2H)，3.59(t，2H),3.41(m,1H),3.28(m，1H),2.41(m，2H)，2.18(m，2H)。MS(ES+):魔514(M+l)。旋光度\^011中，20。C下c=0.503mM)。將二鹽酸5-[3-((R)(+)6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮(式IX)和艱難梭菌MetRS的共晶體生長出來。對此共晶體的X-射線衍射產生了解析度1.72A模式。IX化合物的三維結構明確地被賦予R絕對構型。實施例3:二鹽酸5-3-((S)(-)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基-4H-噻吩並3，2-6吡啶-7-酮(參比化合物)的合成使用如方法I(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備此標題化合物並且將其分離為第二洗脫對映體。可選地，此標題化合物根據方法n製備，其中在方法F中使用(lR,2R)-(-)-N-對甲苯磺醯-l,2-二苯基亞乙基二胺(1mol。/。)和二氯(對異丙基苯甲垸)釕(II)二聚體，隨後按照方法G-J進行。所述標題化合物在這兩種情況下均作為灰白色固體分離。'HNMR(400MHz，CD3OD):58.04(d,1H)，7.77(s,1H)，7.71(s，1H)，7.45(d,1H)，6.26(s，1H),4.62(br,t，4.52-4,38(m2H),3.59(t，2H),3.41(m,1H),3.27(m,1H),2.41(m，2H)，2.17(m，2H)。MS(ES+):M/Z514(M+l)。旋光度[a]589=-21.70(在MeOH中，20。C下c=0.507mM)。實施例4:二鹽酸5-[3-((R)(+)-8-溴-6-氯-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基l-4H-噻吩並[3，2-6吡啶-7-酮(式VII，本發明化合物)的合成使用如實施例1(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備所述標題化合物並且將其分離為第一洗脫對映體'HNMR(400MHz,CD3OD):58.05(d,1H)，7.66(s,1H)，7.56(s,1H)，7.43(d,1H),6.25(s，1H),4.62(t,1H)，4.52-4.38(m,2H)，3.58(t，2H)，3.39(m,1H)，3.29(m，1H)，2.41(m，2H),2.17(m，2H)。MS(ES+):M/Z470(M+l)。旋光度問589=+36.86(在]^6011中，20。C下c-0,510mM)。實施例5:二鹽酸5-3-((S)(-)-8-溴-6-氯-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨萄-4H-噻吩並3，2-6吡啶-7-酮(參比化合物)的合成使用如方法I(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備所述標題化合物並且將其分離為第二洗脫對映體'HNMR(400MHz，CD3OD):S8.05(d，1H)，7.66(s，1H),7.59(s,1H)，7.45(d，1H),6.26(s，1H),4.63(t，1H),4.52-4.38(m,2H)，3.57(t，2H)，3.41(m，1H),3.30(m，1H),2.42(m2H)，2.18(m2H)。MS(ES+):M/Z470(M+l)。旋光度[a]589:-35.24(在MeOH中，20°C下c=0.500mM)。實施例6:二鹽酸2-3-((R)(+)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基卜lH-喹啉-4-酮(式X，本發明化合物)的合成。使用如實施例1(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備以下化合物並且將其分離為第一洗脫對映體'HNMR(400MHz,CD3OD):58.10(d，1H)，7.卯(br，1H),7.78-7.75(m，3H)，7.48(t,1H),6,38(s，1H),4.65(t,1H)，4.48(m,2H),3.70(m,2H)，3.44(m1H),3.31(m,1H)，2.48(m,1H),2.40(m，1H)，2.23(m，2H)。MS(ES+):M/Z508(M+l)。旋光度589=+23.22(在1\46011中，20°C下c=0.500mM)。實施例7:二鹽酸2-[3-((S)(-)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-lH-喹啉-4-酮(參比化合物)的合成使用如實施例1(方法A、B和D)中描述的合成反應，製備以下化合物並且將其分離為第二洗脫對映體'HNMR(400固z，CD3OD):S8.10(d,1H)，7,90(br，1H)，7.78-7.75(m，3H)，7.48(t,1H)，6.38(s，1H)，4.65(t，1H),4.48(m,2H),3.70(m，2H)，3.44(m:1H)，3.31(m，1H),2.48(m,1H)，2.40(m，1H)，2.23(m,2H)。MS(ES+):匿508(M+l)。旋光度[a]589^-24.51(在MeOH中，20。C下c=0.506mM)。實施例8:三鹽酸5-[3-((R)(+)-6，8-二溴-l，2，3，4-四氫-喹啉-4-基氨基)-丙氨基-4H-噻吩並[3，2-A吡啶-7-酮(式VIII,本發明化合物)的合成使用如實施例1(方法A、C和E)中描述的合成反應，製備以下化合物並且將其分離為第一洗脫對映體。可選地，該標題化合物根據方法n(方法F-J)製備。所述標題化合物在這兩種情況下均作為灰白色固體分離。NMR(400MHz,CD3OD):58.05(d，1H)，7.58(s，1H)，7.44(d，1H)，7.42(s,1H),6.25(s，1H)，4.48(br，s,1H)，3.63-3.53(m，4印，3.38(m,1H)，3.21(m，1H)，2.43(m,1H),2.14(m,2H)，2.07(m，1H)。MS(ES+):魔513(M+l)。旋光度[a]589-十72.26(在MeOH中，20°C下c=0.507mM)。實施例9:三鹽酸5-[3-((S)(-)-6，8-二溴-l，2^，4-四氫-喹啉-4-基氨基)-丙氨基-4H-噻吩並3，2-6吡啶-7-酮(參比化合物)的合成使用如實施例1(方法A、C和E)中描述的合成反應，製備以下化合物並且將其分離為第二洗脫對映體。可選地，該標題化合物根據方法n製備，其中在方法F中使用(lR，2R)-(-)-N-對甲苯磺醯-l,2-二苯基亞乙基二胺(1聚體，隨後按照方法G-J進行。所述標題化合物在這兩種情況下均作為灰白色固體分離。力NMR(400畫z，CD3OD):58.04(d，1H)，7.58(s，1H),7.43(d，1H),7.42(s,1H)，6.23(s,1H),4.48(br，s,1H)，3.63-3.52(m，4H),3.37(m,1H)，3.22(m,1H)，2.42(m，1H),2.20-2.00(m，3H)。MS(ES+):M/Z513(M+l)。實施例10:5-3-((R)-5，7-二溴-l，2，3，4-四氫-萘-l-基氨基)丙氨基-4H-噻吩並3，2-6吡啶-7-酮(式VI，本發明化合物)此標題化合物根據方法II(方法F-J)製備。此標題化合物作為灰白色固'HNMR(400MHz,CD3OD):S7.68(d，1H)，7.59(d，2H)，7.00(d，lH)，5.57(s，1H)，3.80(t，1H),3.32(t,2H)，2,76(m,3H)，2.61(m,1H),1.97(m,1H):1.86(m,4H)，1.72(m,1H)。MS(ES+):鹿512(M+l》。旋光度[a]589=-22.30(在MeOH中，20°C下c=0.870mM)。實施例11:5-3-((S)-5，7-二溴-2，3-二氫-苯並呋喃-3-基氨基)-丙氨基l-4H-噻吩並[3，2-司吡啶-7-酮(本發明化合物，式XI)此標題化合物根據方法n(方法F-j)製備。該標題化合物作為灰白色固體分離。體分離。'HNMR(400MHz,CD3OD):57.69(d,1H),7.46(d,2H),7.06(d,IH)，5.54(s，IH)，4.60(m，2H)，4.47(m，IH)，3.30(m,2H)，2.73(m，IH)，2.61(m,1H),L80(m，2H)。MS(ES+):M/Z500(M+l))。旋光度[a]589=-1.93(在MeOH中，20。C下c=0.725m)。實施例12:5-[3-((R)-5，7-二溴-2，3-二氫-苯並呋喃-3-基氨基)-丙氨基-4H-噻吩並[3，2-6吡啶-7-酮(參比化合物)此標題化合物根據方法II製備，其中在方法F中使用(l民2R)-(-)-N-對甲苯磺醯-1，2-二苯基亞乙基二胺(1mol。/(0和二氯(對異丙基苯甲垸)釕(ll)二聚體，隨後按照方法G-J進行。所述標題化合物作為灰白色固體分離。formulaseeoriginaldocumentpage33'HNMR(400MHz,CD3OD):57.70(d，1H),7.48(d，2H)，7.06(d,1H)，5.56(s，1H)，4.63(m，2H)，4.50(dd，1H)，3.30(m,2H)，2,75(m，1H),2.63(m，1H)，1.81(m,2H)。MS(ES+):M/Z500(M+l)。實施例13:MetRS的表達和純化以下實施例描述了表達和純化用於實施例14和15中0f示功能測定中的艱難梭菌MetRS。過量產生載體的克隆擴增添加氨基端6xHis標籤的艱難梭菌MetRS並且將其克隆至pETcoco-2。使用以下引物從基因組DNA中擴增DNA:5'-CTGCAGAGCTAGCAAACCGAGTTTTTATGTAAC-3'(正向)(SEQIDNO:l)，5'-CTTTCTAAGCTTCTACTAACGAACCTCGGATCC-3'(反向)(SEQIDNO:2)。擴增的DNA用Sph1和HindIII限制性核酸內切酶處理，這兩種酶在消化後被熱滅活。將片段經乙醇沉澱並且與已經用相同核酸內切酶及蝦鹼性磷酸酶處理的pETcoco-2載體(Novagen)混合。連接這些片段並且將連接混合物轉化至感受態大腸桿菌DH10內。將轉化體塗布在含5(^g/ml氨苄青黴素的加葡萄糖的F培養基上。在葡萄糖中的生長維持了驅動複製因子TrfA表達的pBAD啟動子的阻遏狀態，因此維持低拷貝數。所得表達克隆，即pETcoco-Cdiff-MRS，通過從兩個方向上對插入物測序加以驗證。艱難梭菌MetRS的純化。表達載體pETcoco-Cdiff-MRS轉化至RosettaDE3表達菌株並且用來接種4升補充有10ng/mL氯黴素、50pg/mL氨苄青黴素、0.2。/。葡萄糖的F培養基。此培養物用lmMIPTG在OD0.66上誘導。在誘導作用4小時後收穫細胞(產率=38g細胞沉澱)。通過^l每冷凍細胞(39g細胞)在Tris-蔗糖緩衝液中的78g1:1混懸液添加至已經預溫到45'C的107.25mlTris-蔗糖緩衝液(2.75ml/g細胞)中裂解沉澱的細胞，其中所述的冷凍細胞貯存在-20^。向攪拌的混合物添加1.95ml的0.5M1,4-二硫蘇糖醇(DTT)(0.05ml/g細胞)和9.75ml裂解緩衝液(調節至pH7.5的Tris-蔗糖緩衝液中的2MNaCl，0.3M亞精胺)(0.25ml/g細胞)。所述淤槳的pH值以pH試紙進行檢測，並且通過添加50ml2MTris鹼調節至pH8.0。添加溶菌酶(117mg)至20mlTris-蔗糖緩衝液(3mg溶菌酶/g細胞)。將所述淤漿分配至離心瓶中並在4°C溫育1小時，隨後在37"C溫育4分鐘。不溶性細胞成分通過離心法(23,000xg，60分鐘，4。C)除去。回收的上清液(192ml)構成級分I。將級分I上樣至15mLNi-NTA柱，其中所述的Ni-NTA柱用上樣緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10%甘油，40mMKCl，10mM咪唑，pH6.8和7mM(3-巰基乙醇)平衡。該柱用10倍柱體積的洗滌緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10%甘袖，800mMKCl，20mM咪唑，pH6.8和7mM|3-巰基乙醇)洗滌。將所述蛋白質在10倍柱體積的從洗滌緩衝液至洗脫緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10%甘油，40mMKC1，250mM咪唑，pH6.8和7mM卩-巰基乙醇)的梯度中以0.5mL/分鐘洗脫，收集3mL級分。收集級分並且對其通過SDS-PAGE分析蛋白質。在艱難梭菌MetRStRNA載荷測定(chargingassay)中分析級分。將具有峰活性的級分匯集以形成級分II(60mg，1.3mg/ml)。級分II具有每毫克3.2xl05單位的比活性。基於用考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠的光密度測定值，估計純度大於97%。實施例14:對映體化合物是艱難梭菌MetRS的有力抑制劑分析本發明的化合物旨在確定它們抑制MetRS的能力。測定法如下進行反應混合物(每lml)tableseeoriginaldocumentpage35每個反應通過添加適當稀釋的(與抑制劑預溫育的)純酶至25^反應混合物內在室溫持續10分鐘而啟動。通過添加含磷酸二酯酶(PDE)SPA珠(0.833mg/ml)的150^1的167mM，pH2.15檸檬酸鈉終止所述反應。放射標記產物與SPA珠的結合使得所述同位素充分接近，從而使得來自氖的輻射激發SPA珠內的閃爍體。任何未結合的放射標記物沒有充分靠近該閃爍體，從而不能促使這種能量轉移，故無信號生成。反應終止後，將平板在Mistral3000E平板離心機內以2500轉/分鐘離心5分鐘(或可選地使之靜置1小時)。所述測定法在96-孔Optiplates(Packard公司)平板中進行。平板在TopCount(Packard公司，96孔式計數儀)上計數。試劑混合的大腸桿菌MRE-600tRNA和ATP從Boehringer-Mannheim購買，L型[甲基」H]甲硫氨酸和磷酸二酯酶閃爍迫近(SPA)珠來自AmershamPharmaciaBiotech,而其它試齊廿從來自Sigma。結果本發明的純對映體(實施例2、4、6、8、10)、全部R對映體以及(實施例ll)S對映體構型具有在範圍(Ki=15-25pM)內對艱難梭菌MetRS的極強抑制作用。所述全部對映體相對於哺乳動物酶具有高度選擇性(不抑制大鼠MetRS)。這些實施例的外消旋混合物具有比純對映體低大約50%的活性。相比之下，相反構型的異構體(實施例3、5、7、9)、全部S對映體以及(實施例12)R對映體具有在範圍(Kj-24，000-80，000pM)內對艱難梭菌MetRS的極弱抑制作用。這是具有相反構型的異構體之間在活性上出乎意料的巨大差異。此外，該數據表明本發明的化合物對抑制艱難梭菌MetRS顯示強選擇性，但對哺乳動物MetRS具有很小抑制活性或無抑制活性。MetRS抑制劑是甲硫氨酸的競爭性抑制劑並且是ATP的非競爭性抑制劑。實施例15:對映體化合物具有針對艱難梭菌的強抗菌活性。還測定了本發明(式(VI)-(XI》化合物抑制艱難梭菌生長的能力。根據CLSL，使用基於瓊脂的標準測定法確定MIC9o(抑制90%艱難梭菌生長所需要的最低抑制濃度)。生物測試全部化合物針對一組非重複性艱難梭菌臨床分離株的抗菌活性。所述的生物在補充20%甘油的布氏肉湯內冷凍貯存。所述生物從冷凍裝置中取出並且在CDC瓊脂上傳代培養2次以確保純度和生長。將平板在厭氧條件下溫育至少24小時。檢測細菌菌落的形態黃顏色，磨砂玻璃狀質地和特徵性氣味。檢測的對照生物是脆弱擬桿菌(5a"m^M/rag/fe)ATCC25285。抗微生物易感性檢驗抗微生物易感性檢驗通過瓊脂稀釋法在補充有維生素K,、氯化血紅素和5%已溶綿羊血的布氏瓊脂上根據CLSI指南(CLSI，Mll-A2)實施。將試驗化合物連續稀釋並添加至熔化的補充布氏瓊脂。在每個抗菌平板系列接種之前和之後接種不含藥物的平板並且將它們用作生長對照。在兩組藥物平板後，厭氧/好氧生長對照在不含藥物的平板上實施。將細菌菌落在布氏肉湯中懸浮至與0.5McFarland標準物的濁度相等的濁度，並且以遞送1(^CFU/點的Steersreplicator施加在平板上。該平板在厭氧條件下於35。C溫育24小時，隨後讀取結果。最小抑制濃度(MIC)是完全抑制生長或與不含藥物的生長對照相比，引起生長外觀顯著減少的濃度。結果本發明的純對映體(實施例2、4、6、8、10)、全部R對映體和(實施例11的)S對映體針對艱難梭菌具有極強抗菌活性(MIC9(^0.25pg/ml至4.0pg/ml)。這些實施例的外消旋混合物具有比純對映體低大約50%的活性(MIC90=0.50jig/ml至8.0jig/ml)。相比之下，相反構型的異構體(實施例3、5、7、9)、全部S對映體和(實施例12)R對映體針對艱難梭菌MetRS具有極弱抗菌活性(MIC928.0(ig/ml至〉32.0昭/ml)。這些結果表明本發明的純對映體化合物針對艱難梭菌的強烈活性一般約0.25-1.0pg/ml。此外，ICso數據表明本發明的化合物對艱難梭菌MetRS具有特異性，針對抗哺乳動物MetRS顯示很小活性或無活性。MetRS抑制劑化合物針對艱難梭菌和革蘭氏陽性菌顯示強活性，同時不影響正常腸道菌群。這些實施例中的數據顯示了純R對映體(實施例2、4、6、8、IO)和S對映體(實施例ll)與其相反構型異構體(實施例3、5、7、9、12)的極弱活性相比的強而出乎意料的抗菌效力。實施例16:本發明的化合物針對其它細菌具有強抗菌活性測試了本發明化合物(實施例2、4、6、8、10和11)針對一組革蘭氏陽性菌的抗菌活性。使用CLST參考肉湯微量稀釋法，針對革蘭氏陽性好氧菌測試化合物。針對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌(5:/we/wo/;^c"力獲得數據。測試的化合物針對全部分離株顯示強抗菌活性，MIC60%的存活。存活的動物具有健康的GI外觀及組織病理學。對倉鼠口服施用MetRS抑制劑後，在其中觀察到低全身暴露量和低生物利用度。本實施例中的數據表明本發明的化合物在治療艱難梭菌感染動物的能力方面是可比的，或優於萬古黴素。實施例18:本發明的化合物影響艱難梭菌中毒素產生艱難梭菌的病原性與其產生胞外毒素A和B的能力相關。超高產毒素菌株導致最近伴有高死亡率的暴發。與此相反，不產生毒素的分離株無致病性。由於毒素生產需要活躍的蛋白質合成，故對蛋白質合成方法的抑制預計可抑制毒素的從頭產生。因此，體外評估MetRS抑制劑對艱難梭菌產生毒素的影響。方法艱難梭菌ATCC43255以厭氧方式在CDC厭氧菌瓊脂(Remel，Lenexa，KS)上培育和維持。為測試抗菌藥對生長的影響，將細胞在35°C於96-孔腦心浸液(Bffl)肉湯培養基中以厭氧方式培育40小時，初始接種量106CFU/mL。為測試抗菌藥在高艱難梭菌細胞密度下對毒素產生的影響，細胞在35°C於96-孔腦心浸液(BHI)肉湯培養基中以厭氧方式培育24小時。耗盡的培養基隨後替換為含有濃度0.015-16pg/mL的MetRS押製劑和對照藥物的新鮮肉湯。4日後，生長和細胞活力分別通過595nm處的光密度量值和通過在CDC厭氧菌瓊脂上培養而加以監測。收集培養上清液，並且使用抗毒素A單克隆抗體(Novi;sBiologicals，Centennial,CO)，通過ELIFA(酶聯免疫流式測定法)檢測毒素A。結果MetRS抑制劑5-[3-(6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮和5-(3-{3,5-二溴-2-[2-(4-甲基-噻唑-5-基)-乙氧基]-苄氨基卜丙氨基)-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮在濃度^).25i^g/mL抑制肉湯中的艱難梭菌生長。在高細胞密度、4日齡穩定期培養物中，毒素產生受濃度低至0.25jag/mL的以下4種不同MetRS抑制劑抑制(5-[3-(6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮、5-(3-{3，5-二溴-2-[2-(4-甲基-噻唑-5-基)-乙氧基]-苄氨基}-丙氨基)-4&噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮、二鹽酸R-(+)-5-[3-(6,8—二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7畫酮、三鹽酸5-[3-(6,8-二溴-l,2,3，4-四氫-喹啉-4-基氨基)國丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮)。相反，需要濃度高得多(4》16pg/mL)的參比藥(甲硝唑、萬古黴素、左氧氟沙星)來抑制毒素產生。結論MetRS抑制劑對肉湯培養中的艱難梭菌生長及毒素產生顯示抑制作用。此外，穩定期培養中的毒素產生受到有效阻斷。作為抑菌性MetRS抑制劑抑制毒素產生的結果，艱難梭菌變得基本上不產生毒素，並且因此變得無致病性。該種效果是蛋白質合成抑制劑如MetRS抑制劑獨有的，其中蛋白質合成抑制劑的作用模式不要求細菌正活躍地生長。實施例19:本發明的化合物影響艱難梭菌中的芽孢產生-艱難梭菌是因能夠形成耐熱、乾燥和多種清潔劑如消毒劑的芽胞而聞名的一種生物。環境中存在的芽孢可以充當致病生物的源頭。艱難梭菌感染常常由攝入在胃腸道內萌發並引起CDAD的芽孢引發。還認為芽孢在CDAD治療後滯留於消化道內是疾病復發的一個主要原因。降低艱難梭菌產生芽孢或降低芽孢萌發的能力可能代表這種疾病治療中的重要突破。芽孢外被主要由蛋白質組成，芽孢外被的產生需要蛋白質合成，預期抑制活躍蛋白質合成將影響這種生物中的芽孢產生。因而，體外評估了MetRS抑制劑對艱難梭菌芽孢產生的影響。方法評估了MetRS抑制劑對艱難梭菌4個臨床分離株的芽胞形成的影響，其中所述的臨床分離株包括屬於BIVNAP1基因型的2個最近暴發的分離株。艱難梭菌菌株在補充布氏血上培育24-48小時，並且將菌落懸浮在鹽水中以獲得與0.5McFarland標準物等效的濁度。將艱難梭菌的混懸液(10mL)塗布在補充有5%已溶綿羊血的新鮮布氏瓊脂平板的表面上，所述的新鮮布氏瓊脂平板含有濃度0.06-2pg/mL的MetRS抑制劑，並且在35°C以厭氧方式溫育96小時。還塗布用來接種含MetRS的平板的等分的相同細胞混懸液用於活力計數，並且額外的250pL等份試樣用250mL無水乙醇在室溫下處理1小時以消除營養細胞並允許計數芽孢。在化合物存在下溫育96小時後再次對全部4種菌株測定芽孢/總細胞比，並且並將其用於比較MetRS抑制劑與不含藥物的對照對芽孢形成率的影響。結果.-4種艱難梭菌菌株中有3種菌株產生可測量數目的芽孢並且如上所述進行評估。在全部菌株中，用5-[3-((R)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩射3，2-6]吡啶-7-酮(式DC,實施例2)對全部菌株的處理顯示在0.25xMIC(〈2。/。芽孢)和0.5xMIC(〈。/。芽孢)上減少芽胞產生。這與用甲硝唑治療後獲得的結果形成鮮明對比，在甲硝唑治療中測試的全部菌株在暴露於亞MIC濃度的甲硝唑後表現芽胞產生顯著增加(至多到100%芽孢)。萬古黴素處理在2種菌株中誘導了相似的芽胞產生增加，但在1種菌株中沒有誘導相似的芽胞產生增加，其中芽胞計數仍然是低的。結論在亞MIC(0.25x和0.5xMIC)上的5-[3-((R)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮有效地阻止艱難梭菌的營養細胞形成芽孢。這些數據表明5-[3-((R)-6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]—4H-噻吩射3，2-6]吡啶-7-酮也可能在防止暴發和降低復發率中發揮有用功能，其中復發率與環境中艱難梭菌芽孢的廣泛流行相關。雖然本發明已經參考眾多實施方案具體地進行顯示和描述，但是本領域技術人員會理解，可以對本文中披露的多種實施方案作出形式和細節方面的改變而不脫離本發明精神和範圍，並且本文披露的多種實施方案不意圖起到限制權利要求範圍的作用。權利要求1.式(IIa)或(IIb)的旋光化合物其中X選自由NH、O、S、SO、SO2或CH2組成的組；n是1、2或3；*代表不對稱碳原子，其中當n是2或3時，則*是R構型；其中當n是1且X是CH2時，則*是R構型；並且其中當n是1且X選自由NH、O、S、SO或SO2組成的組時，則*是S構型；R1獨立地選自滷素、氰基、羥基、(C1-6)烷基(任選地由滷素、羥基、氨基、羧基或(C1-6)烷氧羰基取代)、(C3-7)環烷基、(C1-6)烷氧基、氨基、單-或雙-(C1-6)烷基氨基、醯基氨基、羧基、(C1-6)烷氧羰基、羧基(C1-6)烷氧基、(C1-6)烷硫基、(C1-6)烷基亞磺醯基、(C1-6)烷基磺醯基、氨磺醯、單-和雙-(C1-6)烷基氨磺醯、氨基甲醯基、單-和雙-(C1-6)烷基氨基甲醯基和雜環；m是0、1、2、3或4；p是0、1、2或3；R2獨立地選自滷素、氰基、羥基、(C1-6)烷基(任選地由滷素、羥基、氨基、羧基或(C1-6)烷氧羰基取代)、(C3-7)環烷基、(C1-6)烷氧基、氨基、單-或雙-(C1-6)烷基氨基、醯基氨基、羧基、(C1-6)烷氧羰基、羧基(C1-6)烷氧基、(C1-6)烷硫基、(C1-6)烷基亞磺醯基、(C1-6)烷基磺醯基、氨磺醯、單-和雙-(C1-6)烷基氨磺醯、氨基甲醯基、單-和雙-(C1-6)烷基氨基甲醯基和雜環；並且當Z1是S時，Z2和Z3是CH；當Z2是S時，Z1和Z3是CH；並且當Z3是S時，Z1和Z2是CH。2.權利要求1的旋光化合物，具有式(III):formulaseeoriginaldocumentpage33.權利要求2的旋光化合物，其中(R"m是第6、8位取代並且可以是相同或不同的取代基，其中所述的取代基選自由溴、氯、碘和硫垸組成的組。4.權利要求1的旋光化合物，具有式(IV):formulaseeoriginaldocumentpage35.權利要求4的旋光化合物，其中(R^是第6、8位取代並且可以是相同或不同的取代基，其中所述的取代基選自由溴、氯、碘和硫烷組成的組。6.權利要求1的旋光化合物，具有式OO:formulaseeoriginaldocumentpage37.權利要求6的旋光化合物，其中(R')m是第5、7位取代並且可以是相同或不同的取代基，其中所述的取代基選自由溴、氯、碘和硫烷組成的組。8.權利要求1的旋光化合物，其選自於以下化合物組成的組5-[3-((R)(-)-5,7-二溴-l,2，3,4-四氫-萘-l-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3，2-6]吡啶-7-酮；5-[3-((R)(+)-8-溴-6-氯-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮；5-[3-((R)(+)-6，8-二溴-l,2,3，4-四氫-喹啉-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮；5-[3-((R)(+)-6,8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩並[3,2-6]吡啶-7-酮；2-[3-((R)(+)-6，8-二溴-苯並二氫吡喃-4-基氨基)-丙氨基]-lH-喹啉-4-酮；和5-[3-((S)-5,7-二溴-苯並呋喃-3-基氨基)-丙氨基]-4H-噻吩射3，2-6]吡啶-7-酮。9.權利要求1的化合物的鹽。10.權利要求9的鹽，其中所述鹽是可藥用鹽。11.權利要求l的化合物，其用於治療細菌感染。12.用於治療人的細菌感染的方法，包括給所述人施用治療感染有效量的權利要求1的化合物。13.用於治療人的細菌感染的藥用組合物，其包含有效量的權利要求1的化合物，從而減少所述細菌的生長，該製劑還包含可藥用載體或賦形劑。全文摘要本發明披露了作為細菌甲硫氨醯合成酶((MetRS)抑制劑的處於對映體過量的新化合物。還披露了所述化合物的製備方法和它們作為抗菌藥在治療中的用途、尤其是它們在治療艱難梭菌感染中的用途。文檔編號A61K31/4743GK101652140SQ200780043263公開日2010年2月17日申請日期2007年9月11日優先權日2006年9月26日發明者A·C·哲爾克什,J·吉萊絲,N·亞尼奇,S·斯特朗,孫喜成申請人:克萊斯通公司