人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法
2023-10-06 20:02:04
專利名稱：人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用於人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導過程。
背景技術：
神經幹細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處於分化的非終末狀態，可通過對稱或不對稱分裂出新的幹細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產生中樞神經系統的3種主要細胞，即神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。人胚來源的神經幹細胞除具有上述特點外，更以其與人體組織相容性好的的優點成為神經移植治療的理想細胞。目前誘導神經幹細胞體外分化的方法很多，最常用的是血清，而神經幹細胞在腦脊液中的存活和分化情況尚不明確。本發明通過神經幹細胞在腦脊液環境中的培養，為神經幹細胞的移植治療提供理論依據。
發明內容
為實現本發明的目的，本發明提出一種人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用於人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程應用正常成人腦脊液培養基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)將原代培養的人胚來源的神經幹細胞分化誘導為各類神經細胞，在分化的不同時間對分化的細胞進行免疫細胞化學染色，計算各類神經細胞的比例。最終分別佔(10. 88士0.79)%、 (86. 70 士 1. 99) %，少突膠質細胞很少只有0 % 2 %。具體的，本發明的人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導過程包括如下步驟Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡13周水囊引產的新鮮人胚胎，無菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細吸管反覆吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌後吹打製成細胞懸液，經100目不鏽鋼濾網過濾，製成單細胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養基，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為IX 105/ml，將原代細胞種植於25cm2培養瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養。S2:克隆誘導分化選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植於多個培養皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養，觀察其生長分化情況，分別於1、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測。S3 免疫細胞化學染色將貼附有細胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC組織化學染色試劑盒分別檢測神經微絲(neurofilament，NF)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細胞中的表達。S4 細胞計數免疫細胞化學染色NF(+)的細胞代表神經元，GFAP (+)細胞代表星型膠質細胞，Galc (+)細胞代表少突膠質細胞，蘇木精復染成藍色的細胞代表總細胞數。倒置顯微鏡下O0X)對分化的細胞隨機選擇6個獨立視野計數NF (+)的細胞數、GFAP (+)細胞數、Galc (+)細胞數及總細胞數，計算各系細胞比例並求其平均數。本發明的實驗結果表明，在最早期的分化當中神經元佔的比例較高，約為 27. 25%，正常成人腦脊液能誘導人胚來源的神經幹細胞分化成神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經幹細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經幹細胞的移植治療提供理論依據。
通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特徵和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導方法的步驟示意圖。
具體實施例方式如圖1所示為本發明的人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導方法的步驟示意圖，所述方法具體實施步驟如下Sl 原代細胞的分離和培養取胚齡13周水囊引產的新鮮人胚胎，無菌條件下分離出胚胎大腦皮層組織，剝除腦膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次，用細吸管反覆吹打組織碎塊至完全散開，離心洗滌後吹打製成細胞懸液，經100目不鏽鋼濾網過濾，製成單細胞懸液，加入含 B 27(1 50) (GibcoBRL)和 EGF (Serotec. )20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養基，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為IX 105/ml，將原代細胞種植於25cm2培養瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C、5 % (X)2條件下靜置培養。S2:克隆誘導分化選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植於多個培養皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養基(DMEM/ F12+B27+30%腦脊液)培養，觀察其生長分化情況，分別於1、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測。S3 免疫細胞化學染色將貼附有細胞的玻片取出用4%多聚甲醛固定，用SABC 組織化學染色試劑盒分別檢測神經微絲(neurofilament，NF)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、 feilc在分化細胞中的表達。S4細胞計數免疫細胞化學染色NF (+)的細胞代表神經元，GFAP (+)細胞代表星型膠質細胞，Galc (+)細胞代表少突膠質細胞，蘇木精復染成藍色的細胞代表總細胞數。倒置顯微鏡下(20 X)對分化的細胞隨機選擇6個獨立視野計數NF (+)的細胞數、GFAP (+)細胞數、Galc (+)細胞數及總細胞數，計算各系細胞比例並求其平均數。
實驗結果及分析如下人胚來源的神經幹細胞在體外懸浮生長，常聚集成球即神經球(neurosphere)。 將生長良好的神經球種植在經多聚氨酸處理的培養皿中，在含有正常成人腦脊液培養基 (DMEM/F12+B27+30%腦脊液)中可發現神經球貼壁現象。神經球在新鮮正常成人腦脊液中的分化過程與在胎牛血清中的相似，只是貼壁時間較晚04 48h)，貼壁的神經球有 50% 90%，未貼壁的神經球將逐漸死亡。貼壁的神經球2天後，周圍即有細胞分化遊出， 神經球的直徑放射狀擴大，聚集著許多由神經球中遷移出來的單極和多極細胞，形狀酷似神經元和神經膠質細胞。隨著時間延長，神經球周圍游離出來的細胞越來越多，這些細胞通過突起與鄰近細胞形成聯繫，3周以後這些細胞不再增多，呈穩定狀態。免疫細胞化學顯示，含有正常成人腦脊液培養基中，從神經球中游離分化出的細胞成單極或多極，細胞化學分別為NF(+)細胞、GFAP(+)細胞和細胞。其中NF(+) 細胞由開始時的06士3.40) %降至(10. 00士0. 74)%，GFAP⑴細胞數逐漸增多，從 (73. 53% 士3. 40)%升至(89. 83% ±1.96) %0 Galc (+)細胞在整個分化過程中均很少， 且在1周後才出現，約佔0% 1.8%。NESTIN陽性細胞數成直線下降，貼壁神經球細胞呈 Nestin抗原全陽性，使整個神經球體成藍色(間接螢光染色)，14d時尚可見部分陽性細胞， 21d尚有少量Nestin表達，30d後Nestin染色幾無陽性表現。以上結果表明，在最早期的分化當中神經元佔的比例較高，約為27. 25%，正常成人腦脊液能誘導人胚來源的神經幹細胞分化成神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經幹細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經幹細胞的移植治療提供理論依據。本發明並不局限於所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開範圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護範圍以權利要求書限定的範圍為準。
權利要求
1. 一種人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用於人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程包括步驟原代細胞的分離和培養、克隆誘導分化、免疫細胞化學染色以及細胞計數；其中所述克隆誘導分化的步驟具體為選取單細胞形成的克隆球，機械分離成單細胞懸液，種植於多個培養皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，用含有正常成人腦脊液培養基(DMEM/F12+B27+30%腦脊液)培養，觀察其生長分化情況，分別於l、3、7、14、21d行免疫細胞化學染色檢測；。
全文摘要
本發明提出一種人胚源性神經幹細胞分化誘導過程中的細胞克隆誘導分化方法，其應用於人胚源性神經幹細胞分化為神經細胞的正常成人腦脊液誘導過程，所述誘導過程包括如下步驟原代細胞的分離和培養；克隆誘導分化；免疫細胞化學染色；以及細胞計數。本發明應用正常成人腦脊液培養基將原代培養的人胚來源的神經幹細胞分化誘導為各類神經細胞，在分化的不同時間對分化的細胞進行免疫細胞化學染色，計算各類神經細胞的比例。其誘導人胚來源的神經幹細胞分化成神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞，與在胎牛血清中的分化相比星型膠質細胞比例增多，而其他類型細胞比例無顯著性差異。神經幹細胞在腦脊液中可以存活和分化，為神經幹細胞的移植治療提供理論依據。
文檔編號C12N5/0735GK102533638SQ20111044791
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者陸華 申請人:陸華