一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法與流程
2023-10-06 20:02:09 9
本發明涉及中藥材加工技術領域，特別是一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法。
背景技術：
中藥黃芪是我國傳統的常用藥用植物，具有補氣固表、利尿、排膿、斂瘡生肌之功效，而蒙古黃芪又是黃芪中的極品。近年來，隨著保健藥日益暢銷，黃芪的用藥量越來越大，但由於長期大量、無節制採挖，未注意對自然資源的保護，野生黃芪資源幾近枯竭，大面積成規模的野生黃芪資源已十分少見。蒙古黃芪中的有效成分可以通過提取獲得，但原料、季節、地域等條件會限制黃酮的提取量，而用植物組織培養技術生產次生代謝物則可以不受地區、季節限制，節省土地和植物資源，降低成本，提高生產效率。因此，利用組織培養技術生產黃芪次生代謝產物在生物學和醫藥學領域具有重要的研究和應用價值，但採用常規組培技術進行黃芪愈傷組織培養過程中極易出現褐化現象（褐化是指在外植體誘導和分化過程中，自身組織從表面向培養基釋放褐色物質以至培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象），褐化使外植體、組織細胞、培養基發生褐變，而且對許多酶有抑制作用，影響培養材料的生長與分化，常常造成大量培養材料褐變死亡，導致科研和生產應用的失敗。因此，褐化能否得到有效控制是黃芪組織培養成功與否的關鍵所在。
技術實現要素：
本發明解決現有技術的不足，提供一種愈傷組織生長旺盛、增殖速度快、培養周期短、操作簡單、重複性好的有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案為：
一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：
A、黃芪種子篩選
選取籽粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，使用自來水衝洗30min；
B、黃芪種子浸泡
燒杯內加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種，1h之後倒出水，加入質量濃度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃條件下浸泡2h；
C、黃芪種子消毒
首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30-50s後倒出乙醇溶液，其次採用質量濃度2%的NaClO溶液消毒10-30min，後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；
D、清洗接種培養
使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗3～5次，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000～2000lux；
E、黃芪愈傷組織誘導培養和增殖培養
選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體，接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.1～0.5 mg/L、蔗糖質量濃度15～45g/L、瓊脂質量濃度4～10g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 5.8～6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質量濃度0.8～2.0mg/L、蔗糖質量濃度15～45g/L、瓊脂質量濃度4～8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 5.8～6.2。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.6～0.8 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0～6.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度6.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基和增殖培養基的瓊脂質量濃度6.0g/L，pH值調節為6.2。
所述步驟A將種子放到燒杯內，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下衝洗30min，衝洗種子在燒杯內上下旋轉。
所述步驟C中首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s後倒出乙醇溶液，其次加入質量濃度2%的NaClO溶液消毒20min後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸。
所述步驟D中使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗5次每次2min，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000lux；
所述步驟E選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體並接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.3 mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.0mg/L、萘乙酸 NAA質量濃度1.2mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 6.2。
本發明的有益效果：
1、黃芪種子篩選
選取飽滿、種皮有光澤、無有病蟲斑和損傷的黃芪種子，黃芪種子優選蒙古種子，在自來水下衝洗30min，60℃水浴中浸種1h，35℃條件下質量濃度2.5%NaHCO3浸泡2h，體積濃度75%的乙醇消毒40s，質量濃度2%的NaClO消毒20min，質量濃度0.1%的氯化汞消毒3min，無菌水清洗5次，每次2min。消毒完成後用無菌濾紙吸乾種子表明水分，接種到1/2MS培養基上，黑暗培養到萌發後轉至光照條件下培養。採用該方法對種子消毒殺菌，有利於快速打破種子休眠時間，發芽率達到75%以上，真菌和細菌汙染率小於2%。
2、黃芪愈傷組織誘導培養基和增殖培養基篩選
以7d苗齡的無菌苗為研究材料，取0.5～1.0 cm的下胚軸建立外植體，接種在愈傷組織誘導培養基上，通過對基本培養基、植物外源激素濃度及配比的多次實驗，篩選出黃芪愈傷組織誘導適宜的培養基為MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂4.5g/L，pH 6.2，下胚軸愈傷組織誘導率為70.6％，但褐化率高達90%以上，多數外植體隨著培養天數的增加逐漸褐化死亡。
增殖培養是組織培養中決定繁殖速度快慢、繁殖係數高低的關鍵階段，是由植物激素的的種類和濃度決定的，本方法中優化篩選出黃芪愈傷組織快速增殖培養基為MS、6-BA2.0mg/ L、 NAA1.2mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂4.5g/L，pH 6.2，愈傷組織增殖速度較快，增殖倍數1.84，褐化率較高，70%以上的愈傷組織隨著培養時間的延長逐漸褐化死亡。
3、不同褐變抑制劑和吸附劑對黃芪愈傷組織褐化的抑制效果
在篩選的最佳誘導培養基的基礎上，在培養基中添加一定量的抗氧化劑和吸附劑都能不同程度的降低外植體褐化率，單獨添加抗氧化劑檸檬酸0.8 g/L、抗壞血酸Vc0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP6.0g/L，褐化率較對照分別降低20%、30%和22.9%。配合使用不同種類和濃度的抗氧化劑和吸附劑進行實驗，結果顯示以0.2 g/L抗壞血酸Vc和4.0g/L聚乙烯吡咯烷酮 PVP配合使用效果最好，褐化率較對照降低58.6%。
4、固體支持物和培養條件對愈傷組織褐化的影響
培養基中的固體支持物瓊脂用量的多少和培養條件對黃芪愈傷組織褐化的影響較大。本研究通過適當提高瓊脂用量和pH值能顯著降低褐化現象，瓊脂用量為6.0g/L，pH 6.2，弱光照條件下1000lux，愈傷組織褐化率較對照降低33.5%，有利於細胞的分裂和生長。
5、有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法
在培養基中添加一定量的抗氧化劑和吸附劑都能不同程度的降低外植體褐化率，但卻不能完全抑制褐化現象的發生，但將多種方法和措施綜合運用，可使黃芪愈傷組織褐化現象得到有效抑制，取得了黃芪組織細胞離體培養的成功。
黃芪下胚軸愈傷組織誘導，最佳培養基配方為MS、6-BA 2.5 mg/L、NAA 0.3 mg/L、Vc 0.2 g/L、4.0g/L PVP＋蔗糖30g/L＋瓊脂6.0g/L，pH 6.2，培養條件光照1000lux，溫度22±3℃，相對溼度70%-80%。在此條件下培養10-20d，下胚軸愈傷組織誘導率達到100%，呈淡綠色或白色雪花狀，結構疏鬆，無褐化現象發生。
在黃芪愈傷組織增殖階段，最佳培養基配方為 MS、6-BA2.0mg/L、 NAA1.2mg/L、白砂糖30g/L、瓊脂6.0g/L，pH 6.2，培養條件同上。因在誘導階段愈傷組織褐化現象得到了有效抑制，在增殖階段去除Vc和PVP不會引起褐化發生，且去除非培養基成分有利於細胞的分裂和快速生長。採用白砂糖代替蔗糖，對黃芪愈傷組織增殖效率不會造成影響，且降低了生產成本。在此條件下愈傷組織細胞生長旺盛，增殖快，繼代周期10-15d，增值倍數3.27，愈傷組織顏色呈乳白色或淡黃綠色，有光澤，結構疏鬆易分散，無褐化現象出現。
綜上所述本發明成果是在大量實驗研究和不斷探索優化的基礎上取得的，理想的誘導和增殖培養基，黃芪愈傷誘導率達100%，愈傷組織生長旺盛，增殖速度快，經15d的培養，愈傷組織的鮮重增加至培養前的3.27倍左右。細胞增殖速度快，培養周期短，1個月內可輕鬆培養2代，產出比高，且操作簡單，重複性好，具有工廠化生產和自動化控制等優點，便於生物學和醫藥學領域對黃芪次生代謝產物的開發和利用研究。
本方法以蒙古黃芪無菌苗為研究材料，在優化篩選基本培養基的基礎上，重點研究了不同種類和濃度的褐變抑制劑、吸附劑、固體支持物和培養條件對黃芪愈傷組織褐化的影響，優化建立了一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，取得了黃芪組織細胞離體培養的圓滿成功，為今後開展黃芪次生代謝產物研究和利用開闢了新途徑。
具體實施方式
一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：
A、黃芪種子篩選
選取籽粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，使用自來水衝洗30min；
B、黃芪種子浸泡
燒杯內加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種，1h之後倒出水，加入質量濃度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃條件下浸泡2h；
C、黃芪種子消毒
首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30-50s後倒出乙醇溶液，其次採用質量濃度2%的NaClO溶液消毒10-30min，後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2-5min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；
D、清洗接種培養
使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗3～5次，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000～2000lux；
E、黃芪愈傷組織誘導培養和增殖培養
選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體，接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.0～3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.1～0.5 mg/L、蔗糖質量濃度15～45g/L、瓊脂質量濃度4～10g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 5.8～6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度1.5～3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質量濃度0.8～2.0mg/L、蔗糖質量濃度15～45g/L、瓊脂質量濃度4～8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 5.8～6.2。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.6～0.8 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.1～0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0～6.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度6.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0g/L。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基和增殖培養基的瓊脂質量濃度6.0g/L，pH值調節為6.2。
所述步驟A將種子放到燒杯內，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下衝洗30min，衝洗種子在燒杯內上下旋轉。
所述步驟C中首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s後倒出乙醇溶液，其次加入質量濃度2%的NaClO溶液消毒20min後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸。
所述步驟D中使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗5次每次2min，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000lux；
所述步驟E選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體並接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.3 mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6-苄胺基嘌呤6-BA質量濃度2.0mg/L、萘乙酸 NAA質量濃度1.2mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 6.2。
實施例1
一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：
A、黃芪種子篩選
選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下衝洗30min，衝洗種子在燒杯內上下旋轉。
B、黃芪種子浸泡
燒杯內加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之後倒出水，加入質量濃度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃條件下浸泡2h；
C、黃芪種子消毒
首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒30s後倒出乙醇溶液，其次加入質量濃度2%的NaClO溶液消毒10min後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒2min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；
D、清洗接種培養
使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗3次每次2min，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度2000lux；
E、黃芪愈傷組織誘導培養和增殖培養
選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體並接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度2.0 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.1mg/L、蔗糖質量濃度15g/L、瓊脂質量濃度4g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 5.8進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度1.5mg/ L、萘乙酸 NAA質量濃度0.8mg/L、蔗糖質量濃度15g/L、瓊脂質量濃度4g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 5.8。所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP的一種或幾種，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.6 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.1 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0g/L。
實施例2
一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：
A、黃芪種子篩選
選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下衝洗30min，衝洗種子在燒杯內上下旋轉。
B、黃芪種子浸泡
燒杯內加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之後倒出水，加入質量濃度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃條件下浸泡2h；
C、黃芪種子消毒
首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒50s後倒出乙醇溶液，其次加入質量濃度2%的NaClO溶液消毒30min後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒5min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；
D、清洗接種培養
使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗5次2min，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000lux；
E、黃芪愈傷組織誘導培養和增殖培養
選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體並接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度3.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.5 mg/L、蔗糖質量濃度45g/L、瓊脂質量濃度10g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度3.0mg/ L、萘乙酸 NAA質量濃度2.0mg/L、蔗糖質量濃度45g/L、瓊脂質量濃度8g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 6.2。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內加入抗氧化劑檸檬酸、抗壞血酸Vc或聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗氧化劑檸檬酸質量濃度0.8 g/L、抗壞血酸Vc質量濃度0.3 g/L和聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度6.0g/L。
實施例3
一種有效抑制黃芪愈傷組織褐化的方法，包括如下步驟：
A、黃芪種子篩選
選取子粒飽滿、無病蟲斑和損傷的黃芪種子，用紗布蒙住燒杯口，使用自來水下衝洗30min，衝洗種子在燒杯內上下旋轉；
B、黃芪種子浸泡
燒杯內加入蒸餾水放在60℃水浴中浸種1h之後倒出水，加入質量濃度2.5%的NaHCO3溶液，在35℃條件下浸泡2h；
C、黃芪種子消毒
首先加入體積濃度75%的乙醇溶液消毒40s後倒出乙醇溶液，其次加入質量濃度2%的NaClO溶液消毒20min後倒出NaClO溶液，最後加入質量濃度0.1%氯化汞溶液消毒3min後倒出氯化汞溶液，期間不斷輕輕搖晃容器使NaClO溶液和氯化汞溶液與種子充分接觸；
D、清洗接種培養
使用無菌水衝洗種子表面去除消毒液，反覆衝洗5次每次2min，衝洗完成後用濾紙吸乾種子表面水分，接種到1/2MS培養基中並放入紙箱內，紙箱外套黑色塑膠袋放置於培養室中，培養溫度23±2℃，待種子萌發後轉至光照條件下培養，光照強度1000lux；
E、黃芪愈傷組織誘導培養和增殖培養
所述步驟E選取步驟D中培養苗齡7天的無菌苗，截取0.5～1.0 cm的下胚軸為外植體並接種在愈傷組織誘導培養基上培養10～20d，愈傷組織誘導培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度2.5 mg/L、萘乙酸NAA 質量濃度0.3 mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，愈傷組織誘導培養基pH值調節為 6.2進行誘導培養；接著進行愈傷組織快速增殖培養10～15d，增殖培養基為MS培養基、6 苄基嘌呤6BA質量濃度2.0mg/ L、萘乙酸 NAA質量濃度1.2mg/L、蔗糖質量濃度30g/L、瓊脂質量濃度6g/L，黃芪愈傷組織快速增殖培養基pH值調節為 6.2。
所述步驟E中愈傷組織誘導培養基內混合加入抗壞血酸Vc和聚乙烯吡咯烷酮PVP，抗壞血酸Vc質量濃度0.2 g/L、聚乙烯吡咯烷酮PVP質量濃度4.0g/L。