新的癌基因nrf2的製作方法

2023-10-07 04:19:14 5

專利名稱：新的癌基因nrf2的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌症藥物的的功效預測、癌症的預後預測、及癌症治療的領域。更具體的說，本發明涉及以檢測NRF2異常為手段的mTOR相關癌症藥物的功效預測方法；以檢測 NRF2異常為手段的癌症預後預測方法；及抑制NRF2基因或蛋白質的癌症治療劑。
背景技術：
已知環境因素諸如吸菸、輻射、由病毒感染引起的慢性炎症等，及暴露於有毒化學物質影響癌症的發作和發展。先前的研究揭示了由引起DNA和蛋白質異常的因素導致的氧化應激與癌症的發展有關。活生物體具有針對此類氧化應激的生理學防禦機制。一種被稱作核因子 erythroid 2相關因子2 (NRM)的轉錄因子被認為是在該生理學防禦系統的分子機制中發揮作用的重要分子之一。NRF2是一種具有高轉錄誘導能力的DNA結合分子，其在細胞暴露於氧化應激時被激活，而且誘導多組酶表達(諸如減輕氧化應激的穀胱甘肽還原酶)來保護細胞免於由應激引起的失調。例如，已知NRF2是將啟動信號傳遞給抗氧化應答元件(ARE)成分的重要轉錄因子，ARE是控制保護細胞免於致癌物、氧化劑、和其它有毒化合物作用的基因產物轉錄的 DNA調節元件。有人報告，一種由ARE介導的、具有抑制性活性的增強因子可提高核中的 NRF2/K平(參見 Yuesheng et al. Molecular Cancer Therapeutics，3 (7) 885-893，2004)。 在苯並-α -吡喃的口服施用模型中，NRF2敲除小鼠中的癌症數目表現出與野生型相比增多(參見 Ramos-Gomez et al. Proc. Natl Acad. ki. USA，98，3410-3415，2001)。另外，文獻提示抗癌劑奧體普拉提高NRF2表達，而且在NRF2敲除小鼠中未觀察到奧體普拉的抗癌效果，如此，NRF2表達增強可導致抗癌效果。另外，報告了在活的生物體中，NRF2的存在受Kelch樣ECH關聯蛋白I(KEAPl) 的負反饋控制，而且人們正在開發KEAPl抑制劑作為抗癌劑(參見Ewan，Drug Discovery Today, 10 (14) 950-951，2005)。因此預期增強NRF2表達的靶向NRF2或KEAPl的藥物可用作抗癌劑。另一方面，報告了在肺癌中，觀察到NRF2因KEAPl活性降低(由KEAPl基因突變引起)而持續激活，而且激活的NRF2誘導抗氧化蛋白持續表達。報告了 NRF2表達升高可能是癌細胞對順鉬的抗性的原因之一(參見Ohta et al. Cancer Res.，68，1303-1309，2008 和國際公開文本W02006/U8041)。還報告了使用順鉬、美法侖、苯丁酸氮芥和BCNU等烷化劑可提高受ARE調節的基因諸如NRF2的表達。有人提出受ARE調節的基因表達產物增多可能涉及癌細胞對抗癌劑的抗性。還提出能結合NRF2的所有反式視黃酸(ATRA)可能能夠增強化療藥物的效果(參見國際公開文本W02008/012534)。如此，施用烷化抗癌劑似乎可激活NRF2，而且NRF2可能在針對烷化抗癌劑的抗性中起作用。烷化抗癌劑通過交聯癌細胞中DNA的鹼基來破壞增殖。施用烷化劑後NRF2激活的機制仍然有待解釋。雖然根據NRF2的細胞保護作用可以推測NRF2導致針對烷化抗癌藥物效果的抗性獲得的一部分機制，但是總體機制尚未完全闡明。尚未報告烷化抗癌劑以外的抗癌劑與NRF2之間的關係。如上所述，人們認為在癌細胞中觀察到的NRF2激活主要是基於KEAPl基因突變而導致的KEAPl活性降低。尚不知道癌細胞中突變與NRF2激活之間的關係，及NRF2因突變而激活與癌症的惡性改變之間的關係。尤其是，人們認為NRF2在由氧化應激等引起的癌症發作中具有抗癌效果。認為NRF2相當遏制癌症的惡性改變。關於化療劑，有人提出NRF2 對施用烷化劑有響應，而且至少全反式視黃酸增強烷化劑的效果。然而，完全不清楚全反式視黃酸的效果是否基於NRF2遏制效果，而且，如果是的話，也不知道這種抑制作用背後的機制。因此，全然不知道NRF2遏制與烷化抗癌劑以外的抗癌劑之間的關係。雷帕黴素的哺乳動物靶物(mTOR)是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，它被鑑定為大環內酯抗生素雷帕黴素的靶分子，並且充當細胞生長、細胞增殖、細胞運動、細胞存活、蛋白質合成和轉錄的調節物。由於雷帕黴素誘導缺乏P53功能的癌細胞凋亡，因此認為mTOR抑制劑具有抗癌活性(參見 Shile Huang et al. Molecular Cell，11，1491-1501，2003)。另外， mTOR抑制劑正在作為抗癌劑進行開發，用於例如腎癌和胰腺導管癌。還知道mTOR是一種胰島素受體酪氨酸激酶。一項關於高血糖患者中腦血管內皮細胞凋亡的研究的結論稱，mTOR抑制劑可阻礙人腦血管內皮細胞的胰島素誘導性NRF2介導型穀氨酸-L-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLc)的表達、氧化還原平衡、及存活(參見 Okouchi, Masahiro et al. Current Neurovascular Research, 3 (4) 249-261, 2006)。然而， 尤其是就癌症治療領域而言，NRF2表達對mTOR抑制劑作用的影響尚未有人報告。發明概述本發明涉及一種通過檢測NRF2基因突變來預測癌症的方法。尤其是，本發明涉及一種預測mTOR相關癌症藥物的功效的方法、一種通過檢測NRF2基因突變來選擇有效患者的方法、或一種預測癌症預後的方法。本發明還涉及通過抑制NRF2基因或NRF2蛋白質來治療癌症的方法，或使用NRF2基因或NRF2蛋白質抑制劑作為活性組分的癌症治療劑。在一個具體的實施方案中，本發明涉及通過檢測NRF2基因突變或蛋白來提供有關mTOR相關癌症藥物的功效預測方法的信息的方法，或者通過檢測NRF2基因突變或蛋白來選擇有效患者的方法。另外，本發明涉及通過檢測NRF2基因或蛋白突變來預測mTOR相關癌症的藥物的有效性或選擇有效患者的方法。具體而言，本發明涉及一種用於預測mTOR相關癌症藥物在NRF2基因或蛋白具有突變時有效的方法。本發明還涉及一種能夠檢測NRF2 中的突變，用於預測mTOR相關癌症藥物的有效性的試劑盒。例如，本發明涉及包含能夠結合NRF2基因的核酸或能夠結合NRF2蛋白質的物質(例如抗體)的試劑盒，其中該核酸和該物質能夠檢測NRF2中的突變。或者，本發明涉及一種能檢測NRF2因突變而發生的功能改變的試劑盒。例如，本發明還涉及一種檢測KEAPl對NRF2的消化的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明涉及一種通過檢測來自癌症患者的癌組織細胞中的 NRF2中的突變來提供關於癌症的惡性或關於預後質量的信息的方法。或者，本發明涉及一種診斷癌症惡性或預測癌症預後的方法，其包括檢測來自癌症患者的癌組織細胞中NRF2 中的突變，並將NRF2中具有突變的患者診斷為惡性，或將NRF2中具有突變的患者預測為預後不良。或者，本發明涉及一種用於診斷癌症或預測預後的試劑盒，其能夠檢測NRF2中的突變。例如，本發明涉及一種包含能夠結合NRF2基因的核酸或能夠結合NRF2蛋白質的物質(諸如抗體)的試劑盒，其中該核酸和該物質能夠檢測NRF2中的突變。另外，本發明涉及一種能夠使用基因擴增技術(諸如PCR)檢測突變的試劑盒。例外，本發明涉及一種包含入侵探針(invader probe)、等位基因探針(allele probe)、三鏈體特異性DNA酶、和通用螢光標記探針及淬滅探針的試劑盒，例如Mvader(TM)測定試劑盒等。另外，本發明包括一種能夠測量由突變引起的NRF2功能變化(metergasia)的試劑盒。例如，本發明還涉及一種能檢測KEAPl對NRF2的消化的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明涉及一種用於治療癌症的方法，其包括抑制NRF2基因或NRF2蛋白。本發明包括一種用於治療癌症的方法，其包括遏制NRF2基因表達。另外， 本發明涉及一種治療癌症的方法，包括遏制NRF2蛋白質的表達或活性。此外，本發明涉及一種含有NRF2基因或NRF2蛋白的抑制劑的癌症藥物。具體而言，本發明涉及一種用於治療癌症的藥劑，其包含NRF2的反義、dsRNA、核酶、適體，NFR結合蛋白的片段，或抗體或其片段，作為活性組分。更具體地說，本發明涉及下述發明。(1) 一種獲得用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的信息的方法，該方法包括(a)檢測源自患者的樣品中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白； 和(b)將測得的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者的癌症對mTOR相關癌症藥物的響應關聯起來。(2) 一種從源自患者的腫瘤樣品獲得用於預測患者的癌症對mTOR相關癌症藥物的響應的信息的方法，該方法包括 (a)檢測源自患者的樣品中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白；(b)依據檢測到的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平而歸類為癌症響應類別之一，其中歸類結果依賴於編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型 NRF2蛋白的表達水平；並(c)以屬於所歸類的癌症響應類別之一的癌症所特有的已知性質為基礎來預測患者的癌症對癌症藥物的響應。(3)依照O)的方法，其中高水平的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型 NRF2蛋白指示患者對mTOR相關癌症藥物有高度響應性。(4) 一種用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒，其包含至少一種選自⑴至(iv)的物質(i)結合編碼NRF2的DNA或RNA而不結合編碼突變型NRF2的DNA或RNA的物質；(ii)不結合NRF2基因而結合突變型NRF2基因的物質；(iii)結合NRF2蛋白而不結合突變型NRF2蛋白的物質；和(iv)不結合NRF2蛋白而結合突變型NRF2蛋白的物質。(5) 一種獲得用於預測癌症患者的預後的信息的方法，該方法包括 (a)檢測源自患者的樣品中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白；以及 (b)將測得的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者的預後關聯起來。
(6)依照(5)的方法，其中高水平的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或突變型NRF2 蛋白的指示患者的預後不良。(7) 一種癌症藥物，其含有NRF2抑制劑作為活性成分。(8)依照權利要求(7)的癌症藥物，其中所述NRF2抑制劑是反義核酸、dsRNA、核酶、適體、NRF2結合蛋白片段、或抗體或其片段。本發明的功效預測方法能夠在施用前預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應或預測mTOR相關癌症藥物是否對癌症患者產生效果。因此，利用本發明能夠選擇預期對癌症患者有效的藥物，並避免對預期不會產生有效響應的患者多餘地施用癌症藥物，由此使患者免遭多餘的副作用的痛苦。本發明能夠提供用於選擇癌症藥物的信息。另外，通過預測癌症患者的預後，本發明能提供有意義的信息來為癌症患者決定治療方案策略。另外，本發明的抑制NRF2基因或NRF2蛋白質的方法或本發明包含NRF2基因或NRF2蛋白質抑制劑的治療藥物可用作新的癌症治療方法或新的治療藥物。附圖簡述

圖1顯示與mTOR相關的生物學途徑。圖2顯示食道癌臨床樣品和食道癌細胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)中NRF2 基因中突變的位置及由此引起的胺基酸替代。圖3顯示使用針對NRF2的抗體通過免疫組織化學染色檢測正常食道(A和B)和食道癌(C)中NRF2表達的結果。圖中箭頭代表表達NRF2的細胞。圖是圖3A的一部分的放大視圖。圖4顯示通過NRF2基因突變篩選的食道癌病例中手術後存活時間與基因突變的有無之間的關係的統計分析(Kaplan-Meier分析)的結果。圖中垂直軸代表累積存活率， 水平軸代表手術後經過的天數。圖5顯示對具有NRF2基因突變的食道癌細胞系(KYSE-50和KYSE-180)施用或不施用dsRNA後細胞增殖的變化。圖中垂直軸是施用NRF2dsRNA的細胞數與施用對照dsRNA 的細胞數的比。圖6顯示對沒有NRF2基因異常的食道癌細胞系(KYSE-30、KYSE-140, KYSE-170、 KYSE-270)和具有NRF2基因異常的癌細胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE_180)進行雷帕黴素處理所導致的增殖變化。圖中垂直軸顯示當具有OnM雷帕黴素(沒有藥物)的細胞數設為 100 %時，每種細胞系的細胞數的比。圖中水平軸顯示雷帕黴素的劑量。圖7顯示對沒有NRF2基因異常的肺癌細胞系(SQ-5、QG-56)和具有NRF2基因異常的癌細胞系(LK-2、EBC-1)進行雷帕黴素處理所導致的增殖變化。圖中垂直軸顯示當具有OnM雷帕黴素(沒有藥物)的細胞數設為100%時，每種細胞系的細胞數的比。圖中水平軸顯示雷帕黴素的劑量。圖8顯示對沒有NRF2基因異常的頭頸癌細胞系(H0-1-N_1、HSC2)和具有NRF2基因異常的癌細胞系(HO-1-u-l)進行雷帕黴素處理所導致的增殖變化。圖中垂直軸顯示當具有OnM雷帕黴素(沒有藥物)的細胞數設為100%時，每種細胞系的細胞數的比。圖中水平軸顯示雷帕黴素的劑量。發明詳述A. mTOR相關癌症藥物的預測
在一個方面，本發明涉及用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法或試劑盒，或獲得用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的信息的方法。如本文中所使用的，「mTOR相關癌症藥物」不受限制，只要是可抑制mTOR或涉及 mTOR上遊或下遊途徑的物質的表達或活性，且對於癌症治療有效的藥物即可。mTOR相關癌症藥物包括直接抑制mTOR的藥物(mTOR抑制劑)，例如化療藥，如西羅莫司(也稱作雷帕黴素)、依維莫司、temsirolimus和deferolimus ；蛋白質，如抗體；肽，如抗體片段；和核酸， 如適體、反義核酸(antisense)、和dsRNA。由於NRF2抑制劑可抑制mTOR途徑，因此本發明的NRF2抑制劑也可以作為mTOR抑制劑包括在內。已知mTOR途徑參與了多種途徑，如圖 1所示。不過，特別優選的涉及mTOR途徑且被本發明中的mTOR相關癌症藥物所靶向的物質有例如I型磷酸肌醇3-激酶(下文縮寫為「PII」)、丙酮酸脫氫酶激酶1 (下文縮寫為 「PDK1」)、！^506結合蛋白(FKBP12)、Akt (也稱作蛋白激酶B (PKB))、p70核糖體蛋白S6激酶 1(下文縮寫為「361(1」)、^皿N端激酶(下文縮寫為「JNK」)、和低氧誘導因子Ia (下文縮寫為「HIF1 α 」)。因此，PII 抑制劑，如 TG100115、TCN-P、LY294002、渥曼青黴素、BFZ235、 和 SFl 126 ；PDKl 抑制劑，如 UCN-01、BX912、B_3012、和 0SU030313 ；FKBP12 抑制劑，如 AP1903 和他克莫司；Akt 抑制劑，如 XL418、LY^4002、渥曼青黴素、TCN-P, BV-1701-1、FPA-124, KP372-1、和 GSK690693 ；S6K1 抑制劑，如 XL418 和 H-89 JNK 抑制劑，如 AMl 11、SP600125、美國專利No. 7，199，IM中記載的化合物、和AS601245 ；及HIFl α抑制劑，如ΡΧ478和SF1U6， 也包括在本發明中的mTOR相關癌症藥物中。如本文中所使用的，「對mTOR相關癌症藥物的響應」意指當給癌症患者施用mTOR 相關癌症藥物時，對至少一項代表癌症患者狀況的指標的效果，其中該效果是由施用mTOR 相關癌症藥物引起的。所述的指標包括腫瘤尺寸的縮小、對腫瘤生長的遏制、轉移、預後質量、復發(recidivation)、再發(recurrence)、等。如本文中所使用的，「對mTOR相關癌症藥物的響應良好」意指接受mTOR相關癌症藥物的癌症患者與不接受mTOR相關癌症藥物的癌症患者相比顯示癌症患者中疾病狀況的至少一項指標的有效性，包括例如腫瘤尺寸的縮小、腫瘤生長的遏制、轉移的遏制或沒有轉移、預後的改善、沒有復發、或沒有再發，等。如本文中所使用的，「編碼突變型NRF2基因的DNA或RNA」指在編碼正常NRF2的 (脫氧核糖)核苷酸或核糖核苷酸序列的任何部分中具有突變的DNA或RNA，例如在SEQ ID NO. 1的部分序列中具有突變的DNA。如本文中所使用的，「突變型NRF2蛋白」指在構成正常 NRF2的胺基酸序列(SEQ ID N02)的一部分中具有突變的蛋白質。具體而言，編碼突變型 NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白是這樣的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或蛋白， 其中NRF2蛋白的表達水平由於突變而提高。在一個更具體的方面，突變型NRF2蛋白包括如下的蛋白質，其中NRF2蛋白第M位色氨酸被半胱氨酸或賴氨酸替代、NRF2蛋白的第沈位穀氨醯胺被穀氨酸替代、NRF2蛋白的第觀位異亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30 位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位穀氨醯胺被組氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被纈氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位穀氨酸被賴氨酸替代、NRF2蛋白的第80位蘇氨酸被賴氨酸或脯氨酸替代、和/或 NRF2蛋白的第82位穀氨酸被天冬氨酸替代。突變型NRF2基因包括編碼如下突變型NRF2 蛋白的基因，其中NRF2蛋白的第M位色氨酸被半胱氨酸或賴氨酸替代、NRF2蛋白的第沈位穀氨醯胺被穀氨酸替代、NRF2蛋白的第28位異亮氨酸被甘氨酸替代、NRF2蛋白的第30位亮氨酸被苯丙氨酸替代、NRF2蛋白的第31位甘氨酸被丙氨酸替代、NRF2蛋白的第75位穀氨醯胺被組氨酸替代、NRF2蛋白的第77位天冬氨酸被纈氨酸或甘氨酸替代、NRF2蛋白的第79位穀氨酸被賴氨酸替代、NRF2蛋白的第80位蘇氨酸被賴氨酸或脯氨酸替代、和/或 NRF2蛋白的第82位穀氨酸被天冬氨酸替代。編碼突變型NRF的DNA或RNA的水平，是指通過能檢測突變型基因的程序測量得出的編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平，包括通過如 Southern印跡、Northern印跡、ASO法等使用雜交的方法或者通過如PCR-SSCP、ARMS、直接凝膠測定等使用PCR的方法測量得出的水平，或者作為通過適合於每一種測量方法的軟體計算得出的數值給出的水平。如本文中所使用的，術語「將...與...關聯起來」用於描述與編碼突變型NRF2 的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的測量水平與患者對mTOR相關癌症藥物的響應之間的聯繫，以確定患者對mTOR相關癌症藥物的響應時，意思是比較受試者中編碼突變型NRF2的 DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的存在或水平與對mTOR相關癌症藥物的響應不良的患者或已知對mTOR相關癌症藥物的響應不良的患者或對mTOR相關癌症藥物的響應良好的患者或預測對mTOR相關癌症藥物的響應良好的患者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平。用於比較的患者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平可以例如基於本發明的公開內容，通過測量源自先前發現對mTOR相關癌症藥物的響應的患者的樣品中的突變型NRF2基因或突變型NRF2蛋白的水平，或者結合使用其它對mTOR相關癌症藥物的響應的指標的其它評估方法進行評估來獲得。通過使用編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平，可以確定患者對mTOR相關癌症藥物有響應的可能性。可以利用統計分析將編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與對mTOR相關癌症藥物的響應關聯起來。通過比較兩組或更多組，並確定置信區間和 / 或 P 值來確定統計顯著性(Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons, NewYord，1983)。本發明的置信區間可以是例如 90%、95 %、98%、99 %、99. 5 %、 99. 9%、或 99. 99%0 另外，本發明的 ρ 值可以是例如 0. 1,0. 05,0. 025,0. 02,0. 01,0. 005、 0. 001,0. 0005,0. 0002、或 0. 0001。優選的是，依據其存在或不存在，可以將編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白與患者對mTOR相關癌症藥物的響應關聯起來。又例如，通過與為編碼突變型 NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白作為對mTOR相關癌症藥物的響應指標而建立的閾值水平比較，可以將源自患者的樣品中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者對mTOR相關癌症藥物的響應關聯起來。此類閾值水平可以例如用不小於 50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或 98% 的靈敏度來確定。閾值水平可以例如用不小於 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、或 98% 的特異性來確定。確定對mTOR相關癌症藥物的響應，是指預測施用mTOR相關癌症藥物對患者狀況的過程或結果，並不意味著能以100%的準確度預測施用對患者狀況的過程或結果。確定對mTOR相關癌症藥物的響應，是指確定通過施用抗癌劑是否能增加某些過程或結果的可能性，而並不意味著通過與某些過程或結果不發生的情況比較來確定該過程或結果發生的可能性。即，確定對mTOR相關癌症藥物的響應的結果顯示，通過施用mTOR相關癌症藥物， 在編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平升高的患者中與不顯示此類特徵的患者相比更有可能觀察到特定過程或結果。如本文中所使用的，「癌症響應類別」指提供相似特性的癌症類群。更特別地，癌症響應類別是指表現相似的特定基因表達的表達樣式，或表現相似的臨床狀況的癌症類群。 屬於某個癌症響應類別的成員表現相同或相似的對mTOR相關癌症藥物的響應。屬於某響應類別的成員的基因表達或臨床狀況優選不同於且可區別於不屬於該響應類別的成員的基因表達或臨床狀況。這樣的基因表達優選為突變型NRF2基因表達。癌症響應類別可以包括至少兩個類別，即「對mTOR的響應高的」和「對mTOR的響應低的」。此外還可以包括很多個類別。如本文中所使用的，「歸類為癌症響應類別之一」是指依據源自患者的樣品中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或(突變型)NRF2蛋白質的水平將癌症患者分類。所說的水平通常意指DNA、RNA或蛋白質的量，如表達水平，但是可以意指突變的水平(level of mutation)，如突變的數目或程度。分類可以依據絕對或相對指標來進行。例如，可以通過依據患者的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白水平將目標患者歸類入具有預定水平的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的類群來進行分類。或者，在確定了包括目標患者在內的一群非特定的患者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平後，可以依據編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白相對水平的差異將這些患者歸類到兩個或更多個類群中。另外，可以使用與健康個體中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平相比的差異程度作為指標來進行歸類。優選的是，比較後，當編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平較高時，將受試者歸類到對mTOR具有較高響應的類別中。在一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法或試劑盒可基於使用核酸分子的已知方法來實施，如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、螢光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法等，可以包括在這樣的方法中。使用預測試劑盒，可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。具體而言，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法可以例如用下述步驟來實施(a)製備源自患者的樣品；(b)使樣品與至少一種核酸接觸，其中該核酸選自(i)和(ii) (i)特異性結合編碼正常NRF2的DNA或RNA而不結合編碼突變型NRF2的DNA或 RNA的核酸，和結合編碼正常NRF2的DNA或RNA與編碼突變型NRF2的DNA或RNA的核酸， 和(ii)不結合編碼正常NRF2的DNA或RNA而特異性結合編碼突變型NRF2的DNA或 RNA的核酸；(c)檢測DNA或RNA對核酸的結合併測量編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平； 並(d)根據編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應，其中編碼突變型NRF2的DNA或RNA的存在或增多指示患者高度可能對mTOR相關癌症藥物有響應。本發明的用於基於使用核酸分子的已知方法來預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒包括特異性結合特定基因(例如編碼正常NRF2的DNA或RNA、編碼突變型NRF2的DNA或RNA、或二者)的核酸。具體而言，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒包含至少一種選自(i)至(iv)的物質(i)結合編碼NRF2的DNA或RNA而不結合編碼突變型NRF2的DNA或RNA的物質；(ii)不結合NRF2基因而結合突變型NRF2基因的物質；(iii)結合NRF2蛋白而不結合突變型NRF2蛋白的物質；和(iv)不結合NRF2蛋白而結合突變型NRF2蛋白的物質。用於試劑盒的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料製備含有期望核酸的基因，然後使用設計用於擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。在另一個實施方案中，本發明的方法或試劑盒可以基於使用PCR的已知方法。 例如，ARMS (Amplification Refractory Mutation System，擴增不應突變系統)法、 RT-PCR(逆轉錄酶-PCR)法、嵌套PCR法、等可以包括在此類方法中。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法),PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO (序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴增片段長度多態性)法、MVR-PCR法、和 PCR-SSCP(單鏈構象多態性)法來檢測。試劑盒的分析可以定性地、定量地、或半定量地進行。具體而言，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法可以例如用下述步驟來實施(a)製備源自患者的樣品；(b)擴增至少一種選自編碼正常NRF2的DNA或RNA和編碼突變型NRF2的DNA或 RNA的核酸；(c)檢測核酸的擴增水平並測量編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平；並(d)根據編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應，其中編碼突變型NRF2的DNA或RNA的存在或增多指示患者對mTOR相關癌症藥物有高度響應。本發明基於使用PCR的已知方法來預測癌症患者對mTOR相關癌症的響應的試劑盒包括特異性結合特定基因(例如編碼正常NRF2的DNA或RNA、編碼突變型NRF2的DNA或 RNA、或二者)的一部分的引物。試劑盒中使用的引物可以通過化學合成來製備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考本說明書的公開內容和已知信息來適當地設計，並通過化學合成來製備。在另一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法可以例如使用已知方法，如Invader (TM)法來實施(參見例如Kwiatkowski, R. W. et al. 「 Clinical genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay. 「 Mol. Diagn.，4 :353-364,1999)。例如，依照本說明書，用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法可以用下述步驟來實施(a)製備源自患者的樣品；(b)通過使樣品與下面⑴和(ii)描述的核酸接觸，與互補於等位基因探針 (allele probe)的DNA形成三鏈體
(i)等位基因特異性探針，其包含與編碼正常NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼(flap))，和/或包含與編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)，和(ii)入侵探針(invader probe)，其包含與編碼正常NRF2的DNA和/或編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列；(c)使對三鏈體特異性DNA酶與從(b)獲得的核酸樣品接觸，從而從核酸形成的三鏈體釋放襟翼；(d)使釋放的襟翼與包含與襟翼互補的序列的通用螢光標記探針和淬滅探針接觸；(e)通過使三鏈體特異性DNA酶與自(d)獲得的核酸樣品接觸來釋放螢光標記探針，進而生成螢光；並(f)通過檢測生成的螢光來測量編碼突變型NRF2的DNA的水平，其中編碼突變型 NRF2的DNA的存在或增多指示患者高度可能對mTOR有響應。在一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒可以是適合於上述化 3(1吐(TM)法的試劑盒。例如，本發明用於預測癌症患者對mTOR 相關癌症藥物的響應的試劑盒可以包括下列各項包含與編碼正常NRF2的DNA的一部分互補的序列及與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)的等位基因特異性探針，和/或包含與編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列及與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼) 的等位基因特異性探針，包含與編碼正常NRF2的DNA和/或編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列的入侵探針，三鏈體特異性DNA酶，和與淬滅探針一起提供的通用螢光標記探針。襟翼優選在等位基因特異性探針間是不同的。螢光標記物可以合適地選自本領域技術人員已知的螢光標記物，而且優選在通用螢光標記探針間是不同的。例如，FAM和VIC 可用作螢光標記物。上述本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒中包括的探針可以通過化學合成來製備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考本說明書的公開內容和已知信息來恰當設計，並通過化學合成來製備，或者可以通過從生物材料製備含有期望核酸序列的基因，並使用設計用於擴增期望核酸序列的引物擴增它來製備。本發明的試劑盒中包括的三鏈體特異性DNA酶是商品化的(例如Cleavase，Third Wave Japan, inc)。在另一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法或試劑盒可以基於使用抗體分子的已知方法。例如，可以包括ELISA(Catty， I aykundalia，1989)、放射免疫測定法(Catty，Murphy，1989)、免疫組織化學法(Heider et al.，1993),Western印跡、等作為此類方法。在另一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法可以包括(a)製備源自患者的樣品；(b)使至少一種抗體與樣品接觸，其中該抗體選自下面⑴和(ii)(i)特異性結合NRF2蛋白質而不結合突變型NRF2蛋白的抗體，和結合NRF2蛋白質和突變型NRF2蛋白的抗體，和(ii)不結合NRF2蛋白質而特異性結合突變型NRF2蛋白的抗體；
(c)檢測蛋白質對抗體的結合併測量突變型NRF2蛋白的表達水平；並(d)根據突變型NRF2蛋白的表達水平來預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應，其中突變型NRF2蛋白的表達或升高的表達指示患者高度可能對mTOR有響應。本發明的試劑盒包括特異性結合特定蛋白質(例如NRF2蛋白、突變型NRF2蛋白、 或二者)的抗體或其片段。可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發明的試劑盒中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括F(ab' )2、Fab'、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dSFv)或其聚合物、二聚化V區(雙抗體)、或含有CDR的肽。如本文中所使用的， CDR 的定義見 Kabat et al. , 「 Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, 1983,或Chothia et al. , J. Mol. Biol., 196,901-917,1987。本發明的試劑盒可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的胺基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，製備保留整個或部分靶蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物後，從經過免疫的動物獲得免疫細胞並融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然後從雜交瘤培養物收集抗體。最後可以通過使用被用作抗原的NRF2蛋白或突變型NRF2蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對NRF2蛋白或突變型NRF2蛋白的單克隆抗體。可以如下製備多克隆抗體用與上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然後使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如， 可以如下螢光標記蛋白質或肽用磷酸鹽緩衝液清洗蛋白質或肽，添加用DMS0、緩衝劑、等準備的染料，然後混合溶液，再於室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-NH2、生物素標記試劑盒-SH(Dojindc) Laboratories)；鹼性磷酸酶標記試劑盒諸如鹼性磷酸酶標記試劑盒_NH2、鹼性磷酸酶標記試劑盒-SH(Dojindc) Laboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-NH2、過氧化物酶標記試劑盒-NH2 (Dojindo Laboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories)；螢光標記試劑盒諸如螢光素標記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor (TM) 555標記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor (TM) 647 標記試劑盒-NH2 (Dojindo Laboratories)；及 DyLight 547 禾口 DyLight647 (Techno Chemical Corp.)、Zenon (TM)、Alexa Fluor (TM)抗體標記試劑盒、Qdot(TM)抗體標記試劑盒(Invitrogen Corporation)和EZ-標記物蛋白質標記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。作為依照本說明書的預測方法和預測試劑盒的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適於本發明的免疫學測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材料。優選的是，使用組織，尤其是癌組織作為樣品。對於本發明用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的方法，感興趣的癌症類型不受特別限制，而且優選是實體癌，諸如肺癌、頭頸癌、食道癌、宮頸癌、膽癌、乳腺癌、和惡性黑素瘤。試劑盒的分析可以定性地、定量地、或半定量地實施。B.癌症的預後在另一個方面，本發明涉及用於預測癌症患者的預後的方法或試劑盒，或獲得用於預測癌症患者的預後的信息的方法。在本發明中，預後預測可以是確定患者的作為癌症的結果的復發、轉移或尤其是死亡的風險。如本文中所使用的，「預後」意指癌症患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長後的過程或結果(例如轉移的有無、生命狀態、等)。在本說明書中，預後可以是通過手術處理抑制或緩解腫瘤生長後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態。預後可以通過檢查生物標誌物即突變型NRF2蛋白或編碼突變型NRF2蛋白的基因來預測。預後預測可以這樣進行根據生物標誌物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預後是良好還是不良，或者確定良好預後或不良預後的概率。如本文中所使用的，「預後確定」和「預後評估」與「預後預測」同義使用。如本文中所使用的，「預後良好」是指在通過手術處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之後，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況。或者，預後好可以意指在這樣長時間內存活、無轉移、無復發、或無再發。例如，預後良好可以意指至少 3年或尤其是至少5年存活，優選沒有轉移或復發。預後良好最優選的狀態是長期無疾病的存活。如本文中所使用的，「預後良好」還可以包括任何這樣的狀態，其中可以發現疾病如轉移，但是惡性低且不嚴重地影響生存能力。如本文中所使用的，「預後不良」意指患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長後的短時期(例如1、2、3、4、5年或更短)內發生致命狀況。或者，預後差可以意指在這樣的短時期裡死亡、轉移、復發、或再發。例如，預後差可以意指至少3年或尤其至少5年內復發、轉移、或死亡。如本文中所使用的，術語「將...與...關聯起來」，用於與編碼突變型NRF2的DNA 或RNA或者突變型NRF2蛋白的測得的表達水平與患者的響應之間的聯繫以確定患者的響應時，意指將受試者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的存在或水平與響應不良的患者或已知響應不良的患者或響應良好的患者或預測響應良好的患者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平進行比較。同樣，「將...與...關聯起來」用於比較受試者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的存在或水平與沒有發生癌症的健康受試者中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平。用於比較的患者中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平可以例如基於本發明的公開內容，通過測量源自先前發現響應的患者的樣品中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平，或者通過結合使用其它響應指標的其它評估方法進行評估來獲得。編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平可用於預測患者可能的死亡、復發或轉移。可以通過使用統計分析將預後因素與預後關聯起來。通過比較兩組或更多組，並確定置信區間和/或P值來確定統計顯著性(Dowdy and Wearden，Statistics for Research, John Wiely & Sons，NewYord，1983)。本發明的置信區間可以是例如90%,95%,98%,99%,99. 5%,99. 9%、或99. 99%。另外，本發明的ρ值可以是例如 0. 1,0. 05,0. 025,0. 02,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005,0. 0002、或 0. 0001。例如，通過其存在或不存在，可以將本發明的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白與患者的響應關聯起來。又例如，通過與為本發明編碼突變型NRF2的DNA 或RNA或者突變型NRF2蛋白作為預後指標而建立的閾值水平比較，可以將源自患者獲得樣品中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者的響應關聯起來。 這樣的閾值水平可以例如用不小於50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、 97、或98%的靈敏度來確定。閾值水平可以例如用不小於40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、91、92、93、94、95、96、97、或 98% 的特異性來確定。預後確定意指預測患者狀況的過程或結果，並不意味著能以100%的準確度預測患者狀況的過程或結果。預後確定意指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而並不意味著通過與某些過程或結果不發生的情況比較來確定發生某些過程或結果的可能性。艮口， 預後確定結果顯示，在其本發明突變型NRF2基因或突變型NRF2蛋白的水平升高或降低的患者中，與不顯示該特徵的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。在一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者的預後的方法或試劑盒可基於使用核酸分子的已知方法。例如，此類方法可以包括Southern雜交、Northern雜交、點雜交、螢光原位雜交(FISH)、DNA微陣列等。試劑盒的樣品可以使用例如從活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適於本發明的免疫學測定即可，可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的樣品。優選的是，用於試劑盒的樣品是組織，尤其是癌組織。可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。本發明用於預測癌症患者的預後的方法可以例如用下述步驟來進行(a)製備源自患者的樣品；(b)使至少一種核酸與樣品接觸，其中該核酸選自(i)和(ii)(i)特異性結合編碼正常NRF2的DNA或RNA而不結合編碼突變型NRF2的DNA或 RNA的核酸，和結合編碼正常NRF2的DNA或RNA與編碼突變型NRF2的DNA或RNA的核酸， 和(ii)不結合編碼正常NRF2的DNA或RNA而特異性結合編碼突變型NRF2的DNA或 RNA的核酸；(C)檢測核酸對DNA或RNA的結合併測量編碼突變型NRF2的DNA或RNA的水平； 並(d)根據編碼突變型NRF2的DNA或RNA的表達水平預測癌症患者的預後，其中編碼突變型NRF2的DNA或RNA的表達或升高的表達指示癌症患者的預後不良。本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒包括特異性結合特定DNA或RNA(例如編碼正常NRF2的DNA或RNA、編碼突變型NRF2的DNA或RNA、或二者)的核酸。具體而言， 本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒包含至少一種選自(i)至(iv)的物質(i)結合編碼NRF2的DNA或RNA而不結合編碼突變型NRF2的DNA或RNA的物質；(ii)不結合NRF2基因而結合突變型NRF2基因的物質；(iii)結合NRF2蛋白而不結合突變型NRF2蛋白的物質；和
(iv)不結合NRF2蛋白而結合突變型NRF2蛋白的物質。用於試劑盒的核酸可以通過化學合成來製備，或通過從生物材料製備含有期望核酸序列的基因，並使用設計用於擴增期望核酸序列的引物擴增它來製備。在另一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者的預後的方法可以例如使用稱作 hvader (TM)法的方法來進行(參見例如Kwiatkowski，R. W. et al. 「 Clinical genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay. " Mol. Diagn. ,4 :353-364, 1999)。例如，用於預測癌症患者的預後的方法可以用下述步驟來進行(a)製備源自患者的樣品；(b)通過使樣品與下面⑴和(ii)描述的核酸接觸，與互補於等位基因探針的 DNA形成三鏈體(i)等位基因特異性探針，其包含與編碼正常NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)，和/或包含與編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)，和(ii)入侵探針，其包含與編碼正常NRF2的DNA和/或編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列；(c)通過使三鏈體特異性DNA酶與從(b)獲得的核酸樣品接觸，自核酸形成的三鏈體釋放出襟翼；(d)使釋放的襟翼與包含與襟翼互補的序列的通用螢光標記探針和淬滅探針接觸；(e)通過使三鏈體特異性DNA酶與從(d)獲得的核酸樣品接觸來釋放螢光標記探針，進而生成螢光；並(f)通過檢測生成的螢光來測量編碼突變型NRF2的DNA的水平，其中編碼突變型 NRF2的DNA的存在或增多指示癌症患者的預後不良。在一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒可以是適合於上述 Invader(TM)法的試劑盒。例如，本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒可以包括包含與編碼正常NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)的等位基因特異性探針、和/或包含與編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列和與淬滅探針的一部分互補的序列(襟翼)的等位基因特異性探針，包含與編碼正常NRF2的DNA和 /或編碼突變型NRF2的DNA的一部分互補的序列的入侵探針，三鏈體特異性DNA酶，和與淬滅探針一起提供的通用螢光標記探針。襟翼優選在等位基因特異性探針之間是不同的。螢光標記物可以合適地選自本領域技術人員已知的螢光標記物，而且優選在通用螢光標記探針間是不同的。例如，FAM和VIC可用作螢光標記物。本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒中包括的探針可以通過化學合成來製備，通過本領域技術人員知道的方法參考本說明書的公開內容和已知信息來恰當設計，並通過化學合成來製備，或者可以通過自生物材料製備含有期望核酸序列的基因，並使用設計用於擴增期望核酸序列的引物擴增它來製備。本發明的試劑盒中包括的三鏈體特異性 DNA 酶是商品化的(例如 Cleavase，Third Wave Japan, inc)。在另一個實施方案中，本發明用於預測癌症患者的預後的方法或試劑盒可以基於使用抗體分子的已知方法。例如，此類方法可以包括ELISA(Catty，Raykundalia，1989)、放射免疫測定法(Catty，Murphy，1989)、免疫組織化學法(Heider et al.，1993)、Western 印跡等。本發明用於預測癌症患者的預後的方法可以例如用下述步驟來進行(a)製備源自患者的樣品；(b)使至少一種抗體與樣品接觸，其中該抗體選自⑴和(ii)(i)特異性結合NRF2蛋白而不結合突變型NRF2蛋白的抗體，和結合NRF2蛋白與突變型NRF2蛋白的抗體，(ii)不結合NRF2蛋白而特異性結合突變型NRF2蛋白的抗體；(c)檢測蛋白質對抗體的結合併測量突變型NRF2蛋白的表達水平；並(d)根據突變型NRF2蛋白的表達水平來預測癌症患者的預後，其中突變型NRF2蛋白的表達或升高的表達指示癌症患者的預後不良。本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒包括結合特定蛋白質(例如NRF2蛋白質、突變型NRF2蛋白、或二者)的抗體或其片段。可以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類另O、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即可。本發明的試劑盒中的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段是指如下所述的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽，其保留抗體對抗原的結合活性。抗體片段可以包括F(ab' )2、Fab'、Fab、 單鏈Fv (scFv)、二硫化物鍵合的Fv (dsFv)或其聚合物、二聚化V區(雙抗體)、或含有CDR 的肽。如本文中所使用的，CDR的定義見Kabat et al.，「 Sequences of Proteins of Immunological Interest" , U. S. Department of Health and Human Services,1983,或 Chothia et al.，J. Mol. Biol.，196,901-917，1987。本發明的試劑盒可以包括編碼本發明試劑盒中包括的抗體或編碼抗體片段的胺基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。本發明用於預測癌症患者的預後的試劑盒使用的抗體可以通過上文所述方法來獲得。同樣，標記物與抗體或其片段的結合可以通過上文所示方法來實施。另外，商品化的標記試劑盒，諸如上文所列的，可用於標記。為了正確地標記，可以通過使用適宜的儀器來檢測經過標記的抗體或其片段。作為用於預測癌症患者的預後的試劑盒的樣品，可以使用例如從活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適於本發明的免疫學測定即可，可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的樣品。優選的是，用於試劑盒的樣品是組織，尤其是癌組織。可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。在上述本發明用於預測癌症患者的預後的方法中，感興趣的癌症類型不受特別限制，而且優選是實體癌，諸如肺癌、頭頸癌、食道癌、宮頸癌、膽癌、乳腺癌、 和惡性黑素瘤。C.癌症藥物的篩選在另一個方面，本發明涉及用於篩選癌症藥物的方法。由於編碼突變型NRF2的 DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白可用作癌症患者預後的指示物，因此編碼突變型NRF2的 DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白也可用於癌症藥物的篩選中作為患者預後改善的指示物。 例如，可以通過在對癌細胞添加測試藥物後或在對癌症模型動物施用測試藥物後的某個時期測量編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平來測定癌症藥物改善癌症預後的效果。更具體地說，當編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平在添加或施用測試藥物後降低或觀察不到時，可選擇該藥物作為改善癌症預後的治療藥物。D.癌症藥物在另一個方面，本發明涉及含有NRF2抑制劑作為活性組分的癌症藥物。如本文中所使用的，「 「NRF2抑制劑」不受限制，只要它抑制NRF2蛋白質的功能或表達或者NRF2基因的表達即可，可包括諸如反義核酸、dsRNA、核酶、適體、NRF2結合蛋白的片段、NRF2抗體或其片段、或結合蛋白。「反義核酸」指含有與編碼NRF2的mRNA互補的序列的核酸。反義核酸可以由DNA、 RNA或二者組成。反義核酸不需要與靶NRF2的mRNA 100%互補。反義核酸可含有非互補鹼基，只要它能夠在嚴格條件(Sambrook et al. 1989)下特異性雜交即可。當將反義核酸引入細胞時，它結合靶多核苷酸並抑制轉錄、RNA加工、翻譯或穩定性。除反義多核苷酸之外，反義核酸還包括多核苷酸模擬物，它含有經過修飾的主鏈、和3'和5'端部分。這樣的反義核酸可以根據NRF2序列信息來恰當設計並使用本領域技術人員公知的方法(例如化學合成)來生成。「dsRNA」指含有雙鏈RNA結構，通過RNA幹擾(RNAi)來抑制基因表達的RNA，包括 siRNA (短幹擾RNA)和shRNA (短髮夾RNA)。dsRNA不需要與靶基因序列具有100%的同源性，只要它可抑制靶基因表達即可。為了穩定化或其它目的，可以將dsRNA的一部分用DNA 替代。優選的是，siRNA是21-23個鹼基的雙鏈RNA。siRNA可以通過本領域技術人員公知的方法來製備，例如通過化學合成或作為天然存在RNA的類似物。shRNA是具有髮夾轉角 (hairpin turn)結構的短鏈RNA。shRNA可以通過本領域技術人員公知的方法來製備，例如通過化學合成或通過將編碼shRNA的DNA引入細胞並表達DNA.「核酶」指具有催化活性的RNA，它能夠切割、粘貼、插入、和轉移RNA。核酶的結構可以包括錘頭、髮夾等。「適體」指結合某物質諸如蛋白質的核酸。適體可以是RNA或DNA。核酸的形式可以是雙鏈或單鏈。適體的長度無限制，只要它能夠特異性結合靶分子即可，可以由例如 10至200個核苷酸、優選10至100個核苷酸、更優選15至80個核苷酸、進一步更優選15 至50個核苷酸組成。適體可以使用本領域技術人員公知的方法來選擇。例如，可以採用 SELEX (通過指數式富集進行的配體的系統進化)(Tuerk，C. and Gold, L.，1990，Science, 249,505-510)。"NRF2結合蛋白的片段」指結合NRF2且抑制NRF2實施原始功能的蛋白質的片段。NRF2結合蛋白可以包括例如鐵蛋白、輕質多肽(FTL)、jim癌基因(JUN)、組織蛋白酶 1^1(0^1)、白介素增強子結合因子3(11^3)、1^六 1、普列克底物蛋白(pleckstrin)同源域相互作用蛋白(PHIP)、erythroid衍生的核因子2 (NFE2)、v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物G(MAFG)、和V-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因家族蛋白K(MAFK)。例如，NRF2結合蛋白的片段可以通過製備此類蛋白質的部分肽並選擇結合NRF2的肽來獲得。此外，可以恰當修飾該肽以改進其穩定性或增強其抑制活性，而且可以在肽的一部分中引入胺基酸突變。本發明的試劑盒或治療藥物中使用的抗NRF2抗體或其片段所識別的胺基酸的數目沒有特別限制，只要抗體能夠結合NRF2即可。當抗體用作治療藥物時，優選的是它可識別儘可能多的胺基酸，只要它能夠抑制NRF2的功能。抗體或其片段識別的胺基酸的數目是至少一個，更優選至少三個。抗體的免疫球蛋白類別不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、 IgD或IgY，優選是IgG。本申請的抗體可以包括任何抗體同種型。如本文中所使用的，「抗體片段」指如下所述的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽，其保留抗體對抗原的活性。抗體片段可以包括F(ab' )2、Fab'、Fab、單鏈 Fv (下文縮寫為「scFv」)、二硫化物鍵合的Fv (下文縮寫為「dsFv」)或其聚合物、二聚化V 區(下文縮寫為「雙抗體」)、或含有CDR的肽。F(ab' )2指通過用蛋白水解酶胃蛋白酶加工IgG獲得的片段，它是具有抗原親合力的分子量約100，000的抗體片段。Fab'指通過切割F(ab')鉸鏈區上的二硫鍵生成的抗體片段，分子量約50，000，具有抗原親合力。sdFv是這樣的多肽，其中一個VH和一個VL 通過肽接頭接合在一起，並且抗原親合力。dsFv指如下所述的具有抗原親合力的片段，其中 VH和VL中被半胱氨酸替代的胺基酸殘基經二硫鍵接合在一起。雙抗體指二聚化的scFv片段。本發明的雙抗體可以是單特異性的或雙特異性的(多特異性抗體)。二聚化的scFv可以是相同的或不同的。含有⑶R的肽指含有至少一個選自重鏈可變區⑶R1、⑶R2、和⑶R3 及輕鏈可變區CDR1、CDR2、和CDR3的CDR胺基酸序列的肽。本發明的抗體可以通過用含有NRF2或NRF2 —部分的肽免疫非人哺乳動物或鳥來生成，在必要時使用佐劑(例如礦物油或鋁沉澱物和熱滅活的細菌或脂多糖、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、等)。用作免疫原的NRF2不受限制，只要它是哺乳動物NRF2即可，諸如小鼠、家兔、和人NRF2，優選是人NRF2。用於製備本發明抗體的免疫原可以通過將含有編碼NRF2的cDNA 的載體引入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、等並表達它來獲得。當含有NRF2 —部分的肽用作免疫原時，它可以通過將包含編碼這樣的肽的cDNA的表達載體引入大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等，並表達它來製備。當使用含有NRF2 —部分的肽作為免疫原時， 可以使用含有NRF2—部分的肽或組合肽，其中一種或多種NRF2—部分經接頭接合在一起。含有NRF2或NRF2 —部分的肽可以通過化學合成來生成，其中使用Fmoc法、Boc 法、等等。例如，含有期望胺基酸序列的肽可以如下來獲得，即將含有NRF2或NRF2 —部分的肽的C端胺基酸固定化到聚苯乙烯樹脂上，使用縮合劑諸如二異丁基碳二亞胺(DIC)使受9-芴甲氧羰基(Fmoc基團)或叔丁氧羰基(Boc基團)保護的胺基酸反應以將去保護的胺基酸連接到C端胺基酸，並重複清洗和去保護過程。含有NRF2或NRF2 —部分的肽也可以使用自動化肽合成儀來合成。此類肽合成儀可以包括例如 PSSM-8 (Shimazu Corporation)、433A 型|太合成儀(Applied Biosystems, Inc. ) > ACT 396Apex (Advanced ChemTech Inc.)、等。待免疫的動物不受限制，只要能生成雜交瘤即可，可以使用諸如小鼠、大鼠、倉鼠、 家兔、雞和鴨、等。優選的是，免疫使用小鼠或大鼠，更優選小鼠，而且最優選NRF2敲除小鼠。免疫原可以例如通過皮下注射、腹膜內注射、靜脈內注射、皮內注射、肌肉內注射、或足底注射來施用，優選通過皮下注射或腹膜內注射。免疫原的量不受限制，只要它足以產生抗體即可，優選0. 1至1000微克，更優選1至500微克，進一步更優選10至100微克。免疫可以實施一次或數次，間以適當的間隔。免疫優選實施2至5次，間隔時間為1至5周，更優選實施3次，間隔時間為3周。最後一次免疫後1-2周，從經過免疫的動物的眼窩或尾靜脈收集血液樣品，並使用其血清測量抗體效價。抗體效價的測量可以通過本領域技術人員公知的方法來實施，例如放射性同位素免疫測定(RIA)、固相酶聯免疫吸附測定(ELISA)、 螢光抗體技術、和被動血細胞凝集測定，優選通過ELISA來實施。可以通過對顯示足夠抗體效價的動物的血清進行純化來獲得本發明的抗體。本發明的單克隆抗體可以通過培養從按照上文所述方法免疫的動物獲得的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞融合而得到的雜交瘤來生成。此類融合方法可以是例如Milstein 等人的方法(Galfre, G. & Milstein, C.，Methods Enzymo 1. 73 :3-46,1981) 要使用的抗體生成細胞可以從經過上文所述方法免疫且在血清中顯示足夠抗體效價的小鼠或大鼠的下述部位收集脾、胰、淋巴結、和外周血，優選脾。要使用的骨髓瘤細胞不受限制，只要該細胞衍生自哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、家兔、或人，並且可以在體外增殖即可。 此類細胞可以包括例如 P3-X63Ag8 (X63) (Nature, 256,495,1975)、P3/NSl/l_Ag4_l (NSl) (Eur. J. Immunol. ,6,292,1976) > P3X63Ag8Ul (P3U1) (Curr. Top. Microbiol. Immunol. ，81， 1，1978)、P3X63Ag8. 653(653)(J. Immunol.，123，1548，1979)、Sp2/0_Agl4(Sp2/0)(Nature, 276，269，1978)、Sp2/0/F0_2 (F0-2) (J. Immunol. Methods, 35，1，1980)，優選 P3U1。將遵循上文所述方法獲得的抗體生成細胞和骨髓瘤細胞用培養基、PBS (磷酸鹽緩衝鹽水)等清洗，然後添加細胞凝集培養基諸如聚乙二醇(下文縮寫為「PEG」 MElsevier Publishing, 1988)來進行融合。要融合的抗體生成細胞和骨髓瘤細胞的比可以在例如 2 1至1 2的範圍內。細胞融合實施後，在培養基諸如HAT (次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培養基中培養雜交瘤以容許選擇性擴增。培養後，收集培養物上清液，並通過ELISA等來選擇結合抗原蛋白但不結合非抗原蛋白的樣品。通過有限稀釋法將樣品單細胞化，並選擇穩定顯示高抗體效價的細胞。可以通過在體外培養通過上文所述方法獲得的雜交瘤，然後純化培養物來，獲得單克隆抗體。或者，可以通過將雜交瘤移植給先前向腹腔內施用了角鯊烷的同基因動物或免疫缺陷動物，然後製備腹水，然後收集腹水進行純化來獲得本發明的單克隆抗體。單克隆抗體的純化可以通過在離心分離後使用蛋白A柱、蛋白G柱等收集IgG級分來實現。當抗體類別是IgY和IgM時，純化可以使用巰基吡啶作為配體在柱上進行。純化可以使用NRF2 固定化柱、離子交換層析、疏水相互作用層析等來進行，無論抗體是什麼類別。當抗體用作治療藥物時，優選使用人源化嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體作為抗體。人源化嵌合抗體可以如下來獲得構建DNA，其編碼源自非人動物、可結合NRF2以抑制NRF2功能的單克隆抗體的VH和VL ；將構建好的DNA整合到源自人的免疫球蛋白的恆定區的cDNA中，將整合好的DNA引入表達載體，再將載體引入適宜的宿主細胞以表達它 (Morrison, S. L. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，6851-6855，1984)。人源化抗體可以如下來獲得構建編碼如下所述的V區的DNA，其中，源自非人動物的編碼結合NRF2以抑制NRF2功能的單克隆抗體的VH和VL的CDR的胺基酸序列被移植到人抗體的VH和VL的FR中；將構建的DNA整合到源自免疫球蛋白的恆定區的cDNA中，將整合好的DNA引入表達載體，並將載體引入適宜的宿主細胞以表達它(參見L. Rieohmann et al. , Nature,332,323,1988 ；Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. ,4,773-783, 1991 ；Clark Μ.，Immunol.Today.，21，397-402，2000)。
人抗體可以例如通過使用人抗體噬菌體文庫或人抗體生成轉基因小鼠來獲得 (Tomizuka et al.，Nature Genet.，15，146-156 (1997))。人抗體噬菌體文庫是指由在表面上展示人抗體Fab或scFv等所成的融合蛋白的噬菌體所構成的文庫，它們是通過將來自由源於人B細胞的各種序列組成的抗體基因集合中的VH基因和VL基因引入噬菌體基因而得到的。這樣的人抗體噬菌體文庫可以包括幼稚(未免疫)文庫，其是通過使用 RT-PCR從外周血淋巴細胞等擴增正常人中的抗體VH基因和VL基因，並生成其文庫而創建的(Cambridge Antibody Technology ；Medical Research Council ；Dyax Corp. , etc.)；合成文庫，其是通過選擇人B細胞中的特定功能性抗體基因，用編碼足夠長度的隨機化胺基酸序列的寡核苷酸替代V基因片段中抗原結合區一部分諸如CDR3區，並生成其文庫而創建的(Biolnvent International AB. ；Crucell ；and MorphoSys AG)；禾口免疫文庫，其是從癌症、自身免疫性疾病或傳染病患者或作為疫苗接種過感興趣抗原的人的淋巴細胞創建的。抗體片段，諸如F(ab' )2、Fab'、Fab、SCFV、dsFV或其聚合物，雙抗體，或含有CDR 的肽，可以通過下述方式來生成。F(ab' )2片段可以通過用蛋白水解酶胃蛋白酶處理結合 NRF2的本發明IgG，在重鏈胺基酸殘基234處切割，作為分子量具有大約100，000的具有抗原親合力的抗體片段而獲得。或者，本發明的F(ab' )2片段可以通過經由硫醚鍵或二硫鍵連接Fab'(下文會描述)來獲得。本發明的Fab'片段可以通過用還原劑二硫蘇糖醇處理通過上文所述方式獲得的結合NRF2的F(ab' )2來獲得。或者，本發明的Fab'片段可以如下獲得將編碼結合NRF2的抗體的Fab'的DNA插入表達載體，將載體引入宿主細胞， 並表達它。Fab片段可以作為具有抗原親合力、分子量為大約50，000的抗體片段(其中重鏈N端大約一半的區域和輕鏈的整個區域經二硫鍵接合在一起)通過用蛋白水解酶木瓜蛋白酶處理結合NRF2的抗體，在重鏈胺基酸殘基2M處切割來獲得。另外，Fab片段可以如下來獲得將編碼結合NRF2的抗體的Fab的DNA插入表達載體，將載體引入宿主細胞，並表達DNA。scFv可以如下來獲得獲取編碼NRF2結合抗體的VH和VL的cDNA，將編碼接頭序列的DNA插入這些cDNA之間而構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入表達載體，將載體引入宿主細胞，並表達DNA。接頭的長度不受限制，只要接頭容許VH與VL之間的聯合即可，優選 10至20個殘基，更優選15個殘基。接頭的序列不受限制，只要它不抑制兩個結構域(即 VH和VL)的多肽鏈的摺疊即可。接頭優選由甘氨酸和/或絲氨酸組成，由更優選GGGGS (G: 甘氨酸，S 絲氨酸)序列或其重複序列組成。dsFv可以如下來獲得通過位點特異性突變用半胱氨酸殘基替代VH和VL中的各一個胺基酸殘基，並藉由半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接VH和VL。要取代的胺基酸不受限制，只要基於構象該胺基酸殘基不影響抗原結合。雙抗體可以如下來獲得構建編碼上述scFv的DNA，使得接頭的胺基酸序列可以是8個殘基或更少(優選5個殘基)，將該DNA插入表達載體，將載體引入宿主細胞，並表達它。雙特異性雙抗體可以通過組合來自兩種不同類型scFv的VH和VL的DNA來獲得。含有⑶R的肽可以如下獲得構建包含編碼結合NRF2的抗體的VH或VL的CDR的胺基酸序列的DNA的 DNA，將該DNA插入表達載體，將載體引入宿主細胞，並表達它。本發明的藥物可以作為醫藥單獨施用或與其它藥物一起施用。可以與本發明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發明的治療性或預防性藥物的效果即可，優選的是，用於治療或預防癌症的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環磷醯胺、環磷醯胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴胼、美法侖、和雷莫司汀；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物鹼，諸如伊立替康、依託泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春鹼；抗癌抗生素，諸如放線菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、淨司他丁 stimalamer、柔紅黴素、多柔比星、吡柔比星、博來黴素、培洛黴素、絲裂黴素C、和米託蒽醌； 基於鉬的藥物，諸如奧沙利鉬、卡鉬、順鉬、和奈達鉬；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、託瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、 潑尼松龍、磷雌酚、米託坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾劑，諸如幹擾素α、幹擾素β、幹擾素Y、白介素、烏苯美司、幹BCG、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。本發明藥物的配製劑不受限制，只要它能施用於患者即可，優選注射配製劑。本發明藥物的配製劑可以包括例如液體配製劑或冷凍乾燥配製劑。本發明的藥物可以包括可注射形式、添加劑(例如增溶劑，諸如丙二醇和乙二胺等；緩衝劑，諸如磷酸鹽；張度劑， 例如氯化鈉和甘油；穩定劑，諸如亞硫酸鹽；防腐劑，諸如酚；及安撫劑，諸如利多卡因) (參見"Iyakuhin Tenkabutsu Jiten(曰本藥品添加劑事典)"，Yakuji Nippo limited 禾口" Handbook of Pharmaceutical Excipients Fifth Edition" APhA Publications)。 當本發明的藥物作為可注射形式使用時，可以使用安瓿、管形瓶、載藥注射器、筆式注射筒、 靜脈內袋等作為貯藏容器。本發明藥物的施用路徑不受限制，只要它能發揮期望的治療效果或預防效果即可，優選靜脈內施用。具體而言，它可以施用到血管中，例如靜脈內或冠狀動脈內。本發明藥物的施用方法可以包括通過注射或靜脈內滴注進行的靜脈內施用，和通過肌肉內注射進行的肌肉內施用。本發明的藥物可以通過單次的、連續的、或間歇的給藥來施用。例如，本發明的藥物可以連續施用1分鐘至2周。本發明的藥物優選連續施用5分鐘至1小時，更優選的是，將它連續施用5分鐘至15分鐘。本發明藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或預防效果即可，可以依據症狀、性別、年齡、等來恰當地確定。本發明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例如對癌症的治療效果或預防效果作為指標來確定。本發明的治療藥物或預防藥物的劑量優選是 lng/kg 至 10mg/kg，更優選 10ng/kg 至 lmg/kg，進一步優選 50ng/kg 至 500ug/kg，進一步更優選 50ng/kg 至 100ug/kg，進一步更優選 50ng/kg 至 50ug/kg，最優選 50ng/kg 至 5ug/
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實施例下文描述了本發明的詳細實施例。然而，本發明絕非限於實施例中描述的方面。實施例1 食道癌中的NRF2基因突變自食道癌的臨床樣品(通過手術切除的標本)和食道癌細胞系(KYSE-50、 KYSE-70、KYSE-180)提取DNA後，通過PCR擴增NRF2基因，然後通過測序分析來測定序列。 使用的引物及它們的序列顯示於表1。通過PCR擴增每一個外顯子後，使用相同的引物進行測序反應，並用完全自動毛細管測序儀(ABI 3130)對序列解碼。PCR條件為30秒94°C，30 個循環(30秒94°C，30秒55 °C，和90秒72 °C，和5分鐘72 °C。表1
引物序列序列編號NRF2-EX1正向引物5' GCCGCCACCAGAGCCGCCCTGTC 3'3NRF2-EX1正向引物(內部的)5' AGCCCCAACACACGGTCCACAGCT 3'4NRF2-EX1反向引物5' GAAGCCGGTTGCGGCTGTCCCTC 3'5NRF2-EX2正向引物5' ACCATCMCAGTGGCATAATGTG 3'6NRF2-EX2反向引物5' GGCAAAGCTGGAACTCAAATCCAG 3'7NRF2-EX3正向引物5' TGAATATTTAGCTTGGCAATGTGA 3'8NRF2-EX3反向引物5' GGAGATTCATTGACGGGACTTAC 3'9NRF2-EX4正向引物5' GTTTTGTAGTGGTGCCTTAGAGC 3'10NRF2-EX4反向引物5' TAATAGCACCCTCCAATCCTTCC 3'11NRF2-EX5-1正向引物5' CTGAAGATAATGTGGGTAGGGAG 3'12NRF2-EX5-1反向引物5' TAGAAGTTCAGAGAGTGAATGGC 3'13NRF2-EX5-2正向引物5' TCTGCTTTCATAGCTGAGCCCAG 3'14NRF2-EX5-2反向引物5' CAGGCMTTCTTTCTCTGGTGTG 3'15NRF2-EX5-3正向引物5' ACCCTTGTCACCATCTCAGGGGC 3'16NRF2-EX5-3反向引物5' CATCTTCATCACGTAGCATGCTG 3'17NRF2-EX5-4正向引物5' AAATGACAAAAGCCTTCACCTAC 3'18NRF2-EX5-4反向引物5' GCATTTCACATCACAGTAGGAGC 3'19 圖2顯示了在食道癌臨床樣品和食道癌細胞系(KYSE-50、KYSE-70、KYSE-180)中突變在NRF2基因中的位置及其引起的胺基酸替代。在晚期癌症中檢測到一處突變(18/82， 22% )，而在早期癌症中沒有檢測到突變(0/36)。實施例2 正常食道上皮中和食道癌中的NRF2基因表達使用針對NRF2的抗體通過免疫組織化學染色檢測了正常食道中(A和B)和食道癌中(C)的NRF2表達。自福馬林固定、石蠟包埋的食道癌樣品製備厚度3微米的標本，並使它與多克隆抗NRF2抗體(C-20，Santa Cruz Biotechnology，稀釋100倍)反應。然後使用免疫組織學方法使表達可視化(染色褐色)。結果顯示於圖3。在圖中，箭號代表具有表達的細胞。圖:3B是圖3A的一部分的放大視圖。在正常食道上皮中觀察到局限於基細胞底層的NRF2表達，而且在食道癌細胞中觀察到NRF2表達的升高。實施例3 癌症患者NRF2基因異常與生機預後之間的相關性針對篩選NRF2基因突變的食道癌病例，以統計學分析(Kaplan-Meier分析)了手術後存活時間與基因突變的有無之間的相關性。結果顯示於圖4。在它們之間有顯著的相關性，統計學值為0.005。與沒有NRF2 基因異常的癌症患者相比，NRF2基因中具有突變的癌症患者的生存預後不良。此結果提示 NRF2基因中具有異常的患者在手術後可能需要積極的治療。實施例4 針對NRF2的dsRNA對癌細胞的生長遏制效果具有NRF2基因突變的食道癌細胞系(KYSE-50和KYSE-180)的NRF2基因表達受到dsRNA遏制。將食道癌細胞系以5000個細胞/孔接種入96孔板，並使用 Lipofectamine(Lipofectamine RNAiMax, Invitrogen)弓| 入)^JM dsRNA(ON—TARGET plus Non-targeting Pool, Dharmacon, D-001810-10)或針對 NRF2 的 dsRNA(NRF2dsRNA, 5' -UAAAGUGGCUGCUCAGAAUUU-3' (SEQ IDNO 20)和 5' -pAUUCUGAGCAGCCACUUUAUU-3『 (S EQ ID NO 21))。然後將它們於37°C溫育72小時。然後通過針對NADH活性的MTS測定法 (CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega)測定存活細胞數目。結果顯示於圖5。在圖中，顯示NRF2dsRNA的細胞計數對對照dsRNA的細胞計數的比。當具有NRF2基因突變的食道癌細胞系(KYSE-50和KYSE-180)中NRF2基因表達受到 dsRNA遏制時，發現了與對照相比(KYSE-50)或38% (KYSE-180)的增殖遏制效果。實施例5 通過生物統計分析對與NRF2激活有關的分子途徑的鑑定為了調查由NRF2突變所致的基因表達變化，比較了在引入有突變型NRF2基因的細胞中表達的基因與在對照細胞中表達的基因之間的表達水平，並分析了因NRF2突變而變化的一組基因。將兩種不同的突變型NRF2基因(NRF2-TK和NRF2-LF)引入293細胞，並建立了持續表達突變型NRF2的克隆。從建立的細胞和對照細胞(只引入載體的細胞)提取RNA。用Cy3-CPT標記0. 5mg總RNA後，使用Agilent基因表達微陣列對大約30，000種基因測量表達水平。貞用 IBMT ^ (Sartor Μ. A, Tomlinson C. R. ， Wesselkamper S. C. ， Sivaganesan S.，Leikauf G. D.，Medvedovic. Intensity-based hierarchical Bayes method improves testing for differentially expressed genes in microarray experiments. BMC Bioinformatics. 7 :538-54, 2006)比較了 NRF2變體的兩個微陣列中的基因表達和對照細胞的兩個微陣列中的基因表達。通過分析，獲得了指示基因間表達的顯著差異的P值。使用 Benjamini & Hochberg法(Benjamini, Y, and Hochberg, Y(1995). Controlling the false discovery rate -.a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B，57，289-300)修正了獲得的ρ值，稱其為修正後的P值。P值小於0. 05的基因視為有統計學意義的基因，而且獲得了 2290種適宜的基因。為了檢查這2290種基因是否集中在特定途徑中，針對BROAD研究所(MsigDB，C2)公開的基因集資料庫(Subramanian A,Tamayo P,Mootha VK,Mukherjee S,Ebert BL,Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, Mesirov JP (2005). 「 Gene set enrichment analysis -.a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles" . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (43) :15545-50)進行了基於超幾何分布的統計舉檢驗(Boyle, Ε. I.，Weng，S.，Gollub，J. ,Jin, H.，Botstein，D. ,Cherry, J. Μ. , Sherlock, G. (2004)GO :TermFinder_open source software for accessing Gene Ontology information and finding significantly enriched Gene Ontology terms associated with a list of genes, Bioinformatics 20, 3710-3715)。然後通過上文所述 Benjamini & Hochberg法修正了獲得的ρ值。ρ值小於0. 05的基因集視為有統計學意義的基因集。結果，自有統計學意義的基因集發現了 PENG_RAPAMYCIN_DN。PENG_RAPAMYCIN_DN 的P值顯示於表2。使用生物統計學技術，鑑定PENG_RAPAMYCIN_DN及其它途徑為被NRF2 基因活化顯著激活的分子途徑。PENG_RAPAMYCIN_DN是其表達在用mTOR途徑抑制劑雷帕黴素處理時降低的分子途徑。換言之，它是能充當mTOR途徑激活的指標的途徑(Peng et al·，Mol. Cell Biol. 2002Aug ；22 (15) :5575-5584)。表權利要求
1.一種獲得用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的信息的方法，該方法包括(a)檢測源自患者的樣品中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白；並(b)將測得的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者的癌症對mTOR相關癌症藥物的響應關聯起來。
2.一種從源自患者的腫瘤樣品獲得用於預測患者的癌症對mTOR相關癌症藥物的響應的信息的方法，該方法包括(a)檢測源自患者的樣品中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白；(b)依據檢測到的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平歸類到癌症響應類別之一中，其中歸類結果依賴於編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2 蛋白的表達水平；並(c)基於屬於所歸類的癌症響應類別之一的癌症所特有的已知特性來預測患者的癌症對癌症藥物的響應。
3.依照權利要求2的方法，其中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的高表達水平指示患者對mTOR相關癌症藥物有高響應。
4.一種用於預測癌症患者對mTOR相關癌症藥物的響應的試劑盒，其包含至少一種選自⑴至(iv)的物質(i)結合NRF2基因而不結合編碼突變型NRF2的DNA或RNA的物質；(ii)不結合NRF2基因而結合編碼突變型NRF2的DNA或RNA的物質；(iii)結合NRF2蛋白而不結合突變型NRF2蛋白的物質；和(iv)不結合NRF2蛋白而結合突變型NRF2蛋白的物質。
5.一種獲得用於預測癌症患者的預後的信息的方法，該方法包括(a)檢測源自患者的樣品中的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白；並(b)將測得的編碼突變型NRF2的DNA或RNA或者突變型NRF2蛋白的水平與患者的預後關聯起來。
6.依照權利要求5的方法，其中編碼突變型NRF2的DNA或RNA或突變型NRF2蛋白的高表達水平指示患者的預後不良。
7.—種癌症藥物，其含有NRF2抑制劑作為活性組分。
8.依照權利要求7的癌症藥物，其中所述NRF2抑制劑是反義核酸、dsRNA、核酶、適體、 NRF2結合蛋白片段、或抗體或其片段。
全文摘要
本發明提供可用作mTOR相關抗癌劑的功效預測或預後預測的指示物的標誌物，及新的抗癌劑。本發明提供用於癌症藥物的功效評估的方法，特別是檢測NRF2異常來預測mTOR相關癌症藥物的功效的方法。另外，本發明提供用於癌症的預後預測方法，特別是通過檢測NRF2異常來預測癌症的預後的方法。另外，本發明提供新的靶向NRF2的抗癌劑。
文檔編號C12Q1/68GK102264916SQ20098012888
公開日2011年11月30日 申請日期2009年7月15日 優先權日2008年7月25日
發明者柴田龍弘, 齊藤秀 申請人:獨立行政法人國立癌症研究中心, 英福康姆株式會社