一種核甙酸引物的設計與應用的製作方法

2023-10-06 06:13:09 1

專利名稱：一種核甙酸引物的設計與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種核甙酸引物的設計與應用，特別是一種應用於聚合酶鏈反應的核甙酸引物的設計與應用。
目前，核甙酸引物用於人體心肌疾病肌球蛋白DNA突變的研究，已有報導，如Friedman E，GordeladzeJO，Geiman JJ，et al.Hypertrohic cardiomyopathyfai-lure to demonstrate mutations in exon 13 ofthe cardiac beta-myosin heavy chain gene.BasicRes Cardiol 1992;87106112. Friedman設計的M1引物(核甙酸序列為5′ CTT ACC AAC TTT GCT CTT GCC)與3′Ⅰ引物(核甙酸序列為5′ AAC TCT CAT CCC ACC ATG CC)配合使用，僅可對肌球蛋白重鏈基因第8746至第8951位的205bp DNA片段進行擴增，即只能擴增一個突變點區域，分析效率低。而位於第13和第14外顯子的肌球蛋白基因第8848位和第9124位最易發生突變，導致心臟病，對這第二個突變點區域尚需設計新的引物進行擴增，否則就無法研究該區段內存在的基因突變。
本發明的目的是，設計一種能與M1引物配合使用，擴增肌球蛋白兩個最常見突變點區域DNA片段的核甙酸引物，研究該區域內存在的基因突變。
本發明的技術方案是，根據肌球蛋白重鏈基因序列及引物設計的基本規則，利用電腦分析該引物的特異性，預測其擴增效果，設計出M3寡聚核甙酸引物，其核甙酸序列為5′ TGA CTG CCT CTG TCA CCA CA3′，並用人工將其合成，經過測定濃度，應用於聚合酶鏈反應。
本發明M3引物與M1引物合用，可以擴增肌球蛋白重鏈基因第8746至第9303位的DNA片段，該區域內包括第13(8848位)和第14(9124位)外顯子，前者易由G突變為A，該突變可由DdeI酶切識別，突變後在該位置多一個DdeI切點，後者易由C突變為T，可由NIa3識別，突變後在該位置多一個NIa3切點。電泳後可直接看到突變結果。同時該擴增片段存在的各種突變均可由單鏈構象多態性分析法檢出。本發明M3引物與M1引物合用，擴增效率很高，特異性強，只擴增出一條帶，包括兩個常見的易發突變位點，因此用同一次擴增結果，可以同時分析兩個突變位點是否存在，分析效率提高一倍。
本發明M3引物應用實施例根據所測的M3引物濃度，用TE0.1(10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA，pH8.0)把引物稀釋為50pmol/μl，加0.5-0.1μl至以下反應體系中，同時加入等量M1dH20 37μl10xPCR緩衝液 5μldATP dCTP dGTP dTTP 各2μmol/L人外周血或心肌DNA模板 100mg高純度石蠟油 30μ在基因擴增儀上95℃變性5分鐘後，加入TaqDNA聚合酶2單位後，94℃變性40S，62℃退火30S，72℃延伸90S，共運行45個循環，其中後20循環的72℃延伸90S後，每循環自動增加4秒。運行完畢後取20μl進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，同時還可取10μl加等體積95%甲醯胺溴酚藍進行SSCP，銀染色觀察結果。
M1M3擴增片段為557bp，如果在第8848位存在點突變，用Ddel酶切後會產生小於正常的片段，分別為394，68，63，32bp。與突變前片段(426，68，63bp)在電泳上顯著不同;如果在第9124位存在點突變，用Nla3酶切也產生小於正常的片段，分別為175，145，141，56，40與突變前片段不同。不用酶切時可用SSCP篩檢可能存在的所有突變。
權利要求
1.一種核甙酸引物，其特徵是根據肌球蛋白重鏈基因組DNA序列，設計對應擴增效果的M3寡聚核甙酸引物，經人工合成，其核甙酸序列為5′ TGA CTG CCT CTGTCA CCA CA3′。
2.權利要求1的M3寡聚核甙酸引物與M1引物配合使用，應用於聚合酶鏈反應，擴增肌球蛋白重鏈基因第8746至第9303位的DNA片段。
全文摘要
一種核甙酸引物，根據肌球蛋白重鏈基因序列及引物設計的基本規則，利用電腦分析該引物的特異性，預測其擴增效果，設計出M3寡聚核甙酸引物，其核甙酸序列為5′TGA CTG CCTCTG TCA CCA CA3′，並用人工將其合成，經過測定濃度，應用於聚合酶鏈反應，研究擴增區域內存在的基因突變。
文檔編號C12Q1/68GK1103110SQ9311511
公開日1995年5月31日 申請日期1993年11月20日 優先權日1993年11月20日
發明者李運有 申請人:江蘇省人民醫院