一種驗證二硫鍵對木聚糖酶熱穩定性影響的方法

2023-10-05 20:11:09

專利名稱：一種驗證二硫鍵對木聚糖酶熱穩定性影響的方法
技術領域：
本發明涉及源自11家族耐熱雜合木聚糖酶AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對分析，突變木聚糖酶AExIIAg5t工程菌的構建以及突變木聚糖酶的高效表達、純化和活性測定的方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一類重要的工業用酶。它主要是作用於木聚糖主鏈,隨機地切開木聚糖內部的木糖苷鍵，水解產物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。近幾年，由於木聚糖酶在飼料工業、食品加工及釀造等行業具有潛在的工業應用和經濟價值，尤其是在工業造紙上的應用，減少因漂白產生的環境汙染，受到了越來越多的關注。然而在許多工業中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進行操作，因此對木聚糖酶熱穩定性的研究也引起了國內外研究的高度重視。根據木聚糖酶催化區域的結構和性質分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由於11家族的木聚糖酶分子量較小，且結構比較簡單，更適合作為理論研究的分子模型。許多研究結果表明11家族木聚糖酶的N末端區域對其穩定性起著很重要的作用。Lee等人對木聚糖酶XynA的N端進行刪除突變，突變酶的熱穩定性喪失但活性不變，從而確定了 N端是其熱穩定區，盧雪麗等人引入二硫鍵提高黑麴黴XynIII熱穩定性的研究。但N端二硫鍵對11家族耐熱雜合木聚糖酶AExllA的熱穩定性分析未見有文獻或專利報告。本發明能為11家族木聚糖酶AExllA的熱穩定機制的闡明、熱穩定性蛋白工程的改造等奠定理論基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型地利用計算機和生物信息學知識，對11家族木聚糖酶AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對分析，運用基因工程的方法構建突變木聚糖酶工程菌以及突變木聚糖酶的高效表達、酶活性、最適溫度的測定方法。本發明的技術方案一種源自11家族木聚糖酶AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對分析後，得出在端引入了一個二硫鍵(Cys5-Cys32)，利用定點突變法將5位的半胱氨酸突變為蘇氨酸(C5T)突變前後的基因分別為AExIIA和AExIIAg5t。AExIIAc5t基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。11家族木聚糖酶pPIC9K_AExllA由江南大學醫藥學院分子生物學實驗室製備和保藏。所述的由完整mRNA序列推導的AExIIAg5t胺基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的突變木聚糖酶的活性測定方法於25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩衝液配製的質量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma,USA)溶液2. 4mL, 50°C預熱IOmin,在A管中加入O. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應15min ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻後各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，並從木糖標準曲線上查出相應的還原糖 (以木糖計)含量並折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產生 I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個木聚糖酶活性單位(IU)。
所述的突變酶的最適溫度和熱穩定性的測定
在不同溫度下，按上述方法測定酶活性，以最高酶活性為100%計算相對酶活性。 T-表示最適溫度。將酶液置於不同溫度下保溫不同時間，按上述方法測定殘餘酶活性，以未處理的酶活性為100%。t1/2A表示在A°C下酶的半衰期，即殘餘酶活性為50%時的保溫時間。
所述的突變木聚糖酶基因的設計、克隆及表達
(I)同源建模模擬AExllA的空間結構在PDB資料庫中進行同源比對，尋找到與 AExllA 一級結構同源性較高、分別來源於繩狀青黴菌Penicillium funiculosum(lTEl)、 E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌Hypocrea jecorina (IENX)的11家族木聚糖酶晶體結構，作為同源建模的模板。利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action =f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http: //salilab. org/modeller/)程序對 AExllA 進行同源建模。通過對AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對，發現在AExllA的 N端引入了一個二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點突變法將其5位的半胱氨酸突變為蘇氨酸 (C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對AExllA熱穩定性的影響，突變前後的基因分別為AExllA 和 AEx I IAc5t。
(2)突變基因AExIIAg5t及表達質粒的構建
根據pPIC9K_AExllA(本實驗是保存)設計引物
Fl 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT~3/，含 EcoR I 酶切位點和突變點 Thr5。
Rl 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點。
以本實驗室保存的pPIC9K_AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進行PCR反應。 940C 2min ;30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin0 PCR 產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接；轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序測序正確的pUCm-T-AExllAraT與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AExllAG5T(圖I)， 並對重組質粒進行測序鑑定。
(3)GS115/AExllAC5T的構建、表達、產物純化及活性測定用Sal I對 pPIC9K-AExlIAc5t進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;按照手冊上的標準流程進行誘導表達；發酵液經離心後經過超濾膜濃縮、離子交換層析、凝膠過濾層析純化和SDS-PAGE分析；純化的酶按照活性及最適宜溫度的測定方法的測定。
本發明的有益成果本研究利用定點突變法去除AExllAN端二硫鍵後，其最適溫度和熱穩定性明顯降低，由此證實該二硫鍵是影響AExllA熱穩定性的主要原因之一。同時為11家族木聚糖酶的耐熱機制提供了準確可靠的實驗依據。


圖I :重組質粒pPIC9K_AExllAG5T的構建示意圖
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發明的操作方法。但是這些實施例僅用於詳細說明本發明，而不用於限制本發明的範圍。實施例I同源建模模擬AExllA的空間結構在PDB資料庫中進行同源比對，尋找到與AExllA —級結構同源性較高、分別來源於繩狀青黴菌 Penicillium funiculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌 Hypocreajecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶體結構，作為同源建模的模板。利用SALIGN(http://salilab.org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9.9 (http://salilab. org/modeller/)程序對AExllA進行同源建模。通過對AExllA結構的同源建模及 其與AoXynllA結構的比對,發現在AExllA的N端引入了一個二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點突變法將其5位的半胱氨酸突變為蘇氨酸(C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對AExllA熱穩定性的影響，突變前後的基因分別為AExllA和AExllAG5T。實施例2突變基因AExIIAg5t及表達質粒的構建根據pPIC9K_AExllA(本實驗是保存)設計引物Fl 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT~3/，含 EcoR I 酶切位點和突變點Thr5Rl 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點以本實驗室保存的pPIC9K_AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進行PCR反應。940C 2min ;30 個循環，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin0 PCR 產物用 I %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶並與PUCm-T連接；轉化JM109，經酶切鑑定正確後送上海生工測序正確的pUCm-T-AExllAraT與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AExllAG5T(圖I)，並對重組質粒進行測序鑑定。實施例3GS115/AExllAraT的構建、表達、產物純化及活性測定用Sal I對pPIC9K_AExllAraT進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;該工程菌用1.0%甲醇誘導72h，DNS法測得發酵液中突變木聚糖酶活性與AExllA基本一致。發酵液經離心後的上清液為突變AExIIAc5t粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和Si^phadex G-75凝膠過濾層析純化，純化後經SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示突變木聚糖酶分子量與AExllA基本一致；該突變木聚糖酶最適作用溫度60°C低於AExllA 的最適溫度 85°C，其 t1/27° 和 t1/28° 分別為 3. O、I. Omin，低於 AExllA 的 197 和 25min。
權利要求
1.一種對來源於米麴黴Aspergillus oryzae的11家族的雜合木聚糖酶AExllA進行耐熱分析。通過對AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對分析,定向突變以研究熱穩定提高的原因，突變後的核苷酸(AExIIAg5t)序列為SEQ ID NO :1。
2.由權利要求I所述的突變的木聚糖酶基因(AExllAra)編碼的突變木聚糖酶(AExIIAg5t),其完整的胺基酸序列對應於序列表中的為SEQ ID NO :2。
3.AExllA結構的同源建模及其與AoXynllA結構的比對分析 同源建模AExllA的空間結構登錄蛋白質結構資料庫Protein data bank (http://rcsb. org)，經BLAST比對，找到與AExllA —級結構具有高度同源的，分別來自繩狀青黴菌Penicilliumfuniculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和紅褐肉座菌 Hypocrea jecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶體結構，作為同源建模的模板；其相似性分別為63. 7%、78. 8%和60. 9% ο 利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http://salilab. org/modeller/)程序對 AEx IlA 進行同源建模； 經比對發現由於N端替換,在AExl IA分子結構中引入了一個二硫鍵(Cys5-Cys32),其連接兩個反向平行的摺疊股(Al和Α2)，可能會通過降低蛋白質解摺疊狀態的熵，而對其熱穩定性提高有一定的作用。
4.突變木聚糖酶工程菌的構建和表達方法 (1)突變基因AExIIAg5t及表達質粒的構建 根據pPIC9K-AExllA(本實驗是保存)設計引物，將其中的Cys5突變為Thr5 Fl 5/ -GA ATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT-3'，含 EcoR I 酶切位點和突變點 Thr5 Rl :5, -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位點 以pPIC9K-AExllA為模板，以Fl和Rl為引物進行PCR反應。94°C 2min ；30個循環，940C 30s, 550C 30s, 72°C 40s ；72°C IOmin0將PCR的目的條帶進行克隆、測序；測序正確的pUCm-T-AExllAG5T與pPIC9K質粒均用EcoR I和Not I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-AExllAe5T，並對重組質粒進行測序鑑定； (2)GS115/AExI IAc5t的構建、表達、產物純化及活性測定 用Sal I對pPIC9K-AExllAraT進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/AExllAraT ;該工程菌用I. 0%甲醇誘導72h，DNS法測得發酵液中突變木聚糖酶活性與原酶AExllA基本一致。發酵液經離心後的上清液為突變AExIIAc5t粗酶液，經截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和S印hadex G-75凝膠過濾層析純化，純化後經SDS-PAGE檢測為單一條帶，並顯示突變木聚糖酶分子量與原酶AExlIA基本一致；該突變木聚糖酶最適作用溫度60°C，低於原酶AExlIA的最適溫度85°C;其t1/2 和t1/28°分別為3. O、I. Omin低於原酶AExllA的·197 和 25min。
全文摘要
本發明提出了一種對來源於米麴黴Aspergillus oryzae的11家族的雜合木聚糖酶AEx11A進行耐熱分析，通過對AEx11A結構的同源建模及其與AoXyn11A結構的比對，發現在AEx11A的N端引入了一個二硫鍵(Cys5-Cys32)。利用定點突變法將其5位的半胱氨酸突變為蘇氨酸(C5T)，去除該二硫鍵，以探討其對AEx11A熱穩定性的影響，結果發現突變酶(AEx11AC5T)的Topt由突變前的75℃降為60℃、t1/270和t1/280分別由突變前的197和25min縮短為3.0和1.0min，說明N端二硫鍵對11家族木聚糖酶熱穩定性有一定的影響。能為11家族木聚糖酶的熱穩定機制的闡明、熱穩定性蛋白工程的改造等奠定理論基礎。
文檔編號C12N9/42GK102978224SQ20121056263
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者鄔敏辰, 餘濤, 殷欣, 李劍芳 申請人:江南大學