縮氨基硫脲類化合物在治療神經膠質瘤方面的應用的製作方法

2023-10-06 10:32:39 4

本發明涉及下面式(I)縮氨基硫脲類化合物，其幾何異構體及其藥物上可接受的鹽和/或其溶劑化物和/或其水合物，及含有此化合物的藥物組合物，用於治療神經膠質瘤，或上調細胞中miR-494(microRNA-494)水平，或下調細胞中Cdc20(Cell division cycle protein 20)水平方面的用途。

背景技術：

化合物331(式I化合物)，化學名為雙-2-吡啶基酮縮氨基硫脲(di-2-pyridylketone thiosemicarbazone，DpT)，是縮氨基硫脲類化合物的一員，這一類化合物由雪梨大學的Richardson教授組首先合成並報導(Yuan J，Lovejoy DB，Richardson DR，Novel di-2-pyridyl-derived iron chelators with marked and selective antitumor activity：in vitro and in vivo assessment[J].Blood，2004，104(5)：1450-8.)。

目前對這一類化合物的研究主要集中在它的一個二甲基取代物，即：雙-2-吡啶基酮-4，4-二甲基-3-縮氨基硫脲(di-2-pyridylketone-4，4-dimethyl-3-thiosemicarbazone，Dp44mT)上。Richardson將這一類化合物與鐵或銅離子螯合，發現其螯合物對腫瘤細胞具有選擇性的殺傷作用(Whitnall M，Howard J，Ponka P，et al.，A class of iron chelators with a wide spectrum of potent antitumor activity that overcomes resistance to chemotherapeutics[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(40)：14901-6.)。這主要是因為金屬螯合劑可減少腫瘤中的鐵、銅等離子，進而減少氧自由基的產生，從而抑制腫瘤細胞的生長。動物實驗結果也顯示Dp44mT能夠顯著減小動物身上的活體瘤。最近的研究還發現Dp44mT在乳腺癌細胞中對拓撲異構酶II具有選擇性的抑制作用。目前人們針對縮氨基硫脲類化合物的抗癌作用機制研究普遍認為，該類化合物是作為金屬離子螯合劑來發揮抗癌作用。

神經膠質瘤(Glioma)是最常見的顱內腫瘤，約佔所有顱內腫瘤的50％左右。目前臨床上IV型神經膠質瘤是惡性程度最高的腦部腫瘤，至今無法治癒。多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)起源於腦部神經膠質細胞，成年腦癌患者中約80％為浸潤性的星形細胞瘤。由於該腫瘤是浸潤性生長物，其和正常腦組織沒有明顯的界限，因此難以被完全切除或根本不能手術。血腦屏障的存在，又使得化學藥物和一般抗腫瘤的中藥難以發揮療效。該腫瘤細胞對放療亦不甚敏感，非常容易復發。因此腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預後最差的腫瘤之一。因此，積極研究神經膠質瘤的發病原因、尋找惡性膠質瘤治療切實有效的治療手段已成為目前亟待解決的關鍵問題。

技術實現要素：

本發明目的是尋找新結構的miR-494激動劑，可用於選擇性治療神經膠質瘤等惡性腫瘤。本發明通過創造性的研究發現式(I)縮氨基硫脲類化合物(化合物代號331)，具有上調細胞中miR-494水平，和下調細胞中Cdc20水平方面的作用，在治療神經膠質瘤方面具有很好的效果。

本發明提供具有式I結構的的縮氨基硫脲類化合物，其幾何異構體，及其藥物上可接受的鹽和/或其溶劑化物或其水合物：

根據本發明，本發明化合物的可藥用鹽包括其無機或有機酸鹽，本發明涉及此鹽的所有形式，特別是式(I)化合物吡啶環上或硫脲結構上鹼性氮原子與酸根締合形成的酸加成鹽。其中包括但不限於：鹽酸鹽，氫澳酸鹽，氫腆酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，乙酸鹽，丙酸鹽，丁酸鹽，草酸鹽，三甲基乙酸鹽，己二酸鹽，藻酸鹽，乳酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，琥珀酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，苦味酸鹽，天冬氨酸鹽，葡糖酸鹽，苯甲酸鹽，甲磺酸鹽，乙磺酸鹽，苯磺酸鹽，對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽等。

根據本發明，式(I)化合物作用於神經膠質瘤的機理不是通過此前認為的金屬離子螯合劑機理，而是通過上調神經膠質瘤細胞中的miR-494水平使Cdc20水平降低，進而抑制腫瘤細胞的有絲分裂，使細胞的生長周期停滯，最後導致細胞死亡。

本發明的發明人在經過長期研究後，發現了式(I)化合物在細胞內的一些新作用特點：

第一，式(I)化合物可以誘導細胞發生顯著自噬；

第二，式(I)化合物抑制細胞的生長與增殖，使細胞的生長周期停滯在細胞分裂的G0/G1或S期；

第三，式(I)化合物能夠誘導細胞進入靜止狀態，即可逆性的周期停滯；

第四，式(I)化合物誘導的細胞自噬是保護性的，在將自噬的抑制劑與3-3-1聯合作用於細胞時，細胞的死亡率上升，並且細胞由靜止狀態轉變 為衰老狀態，即不可逆的生長停止；

第五，式(I)化合物與一些其他藥物的聯合使用之後對腫瘤細胞的殺傷效果呈現出一種增強效應(1+1＞2)。

特別的，本發明發現化合物式(I)化合物可通過抑制細胞有絲分裂的方式達到抑制神經膠質瘤細胞生長的目的，而不是通過傳統的作為金屬離子螯合劑的抗癌機制。

具體的，本發明發現式(I)化合物可使神經膠質瘤細胞中的miR-494水平上升，繼而導致Cdc20水平顯著下調。而Cdc20是APC/C(anaphase-promoting complex/cyclosome)的重要輔助因子，它們形成的APC/C-Cdc20複合物在細胞有絲分裂的過程中扮演重要角色。因此，降低Cdc20的水平可阻礙APC/C-Cdc20複合物的形成，造成細胞有絲分裂活性減少，最終導致細胞死亡。

本發明涉及的式(I)化合物可選擇性的誘導神經膠質瘤細胞凋亡，而對星形膠質細胞沒有影響。

本發明所述式(I)化合物是一種新型的miR-494激動劑，可用於選擇性治療神經膠質瘤等惡性腫瘤。

本發明所述式(I)化合物可直接或間接抑制Cdc20水平，可用於選擇性治療神經膠質瘤等惡性腫瘤。

本發明涉及的式(I)化合物能引起神經膠質細胞中的有絲分裂障礙，並誘導凋亡。

本發明涉及的式(I)化合物對心、肝、脾、腎以及腦等器官無明顯損傷，安全性高。

本發明還涉及含有式(I)化合物及其藥學上可接受的鹽和/或其藥物上可接受的溶劑化物或其水合物和藥物上可接受的載體的藥物組合物。該藥物組合物可以經多種途徑施用，例如口服片劑，膠囊，粉劑，口服液，注射劑和透皮製劑。根據常規的藥物上的慣例，藥學上可接受的載 體包括稀釋劑、填充劑、崩解劑、潤溼劑、潤滑劑、著色劑、調味劑或其它常規添加劑。典型的藥學上可接受的載體包括例如微晶纖維素、澱粉、交連聚維酮、聚維酮、聚乙烯吡咯烷酮、麥芽糖醇，檸檬酸，十二烷基磺酸鈉或硬脂酸鎂等。

本發明的另一個方面涉及藥物組合物，其含有本發明化合物的消旋體和至少一種藥學上可接受的載體。所述藥物組合物可以根據不同給藥途徑而製備成各種形式。

附圖說明

圖1.化合物331選擇性誘導神經膠質瘤細胞死亡。(a)化合物331的結構。(b)經化合物331處理後能夠誘導人神經膠質瘤細胞(U251，SF767)和大鼠神經膠質瘤細胞(C6)的死亡，但是無法誘導正常星形細胞死亡。所有細胞利用10μM或者20μM的化合物331處理24h，48h和72h。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。(c)化合物331的處理能夠顯著誘導人神經膠質瘤細胞(U251，SF767)和大鼠神經膠質瘤細胞(C6)的增殖抑制，但不能誘導正常星形細胞的增殖抑制。所有細胞利用10μM或者20μM的化合物331處理24h，48h和72h。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**表示和對照組相比p＜0.01。(d)利用DMSO對照以及化合物331(10μM，24h or 20μM，24h)來處理神經膠質瘤細胞。將細胞收集之後，將3000個細胞在培養液中孵育10天，之後利用結晶紫(0.4g/L)將細胞染色。(e)每個培養皿中集落的數量。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**表示和對照組相比p＜0.01。

圖2.化合物331的體內抗腫瘤活性。(a，b)化合物331對神經膠質瘤細胞的抑制。6周齡雌性裸鼠(BALB/c-nu)用於本實驗。將U251細胞收集用PBS 重懸後，以皮下注射方式接種至小鼠側面(每側8×106個細胞)。注射之後，當腫瘤大小長至50mm3時，用化合物331進行灌胃給藥(劑量分別為10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，0.9％生理鹽水作為對照)，每日給藥，持續給藥3周。(c)化合物331對人類異種移植腫瘤細胞的體積的影響。(d)化合物331對腫瘤生長速率的影響。(e)化合物331對人類異種移植腫瘤細胞的總重量影響。(f)化合物331對裸鼠體重的影響。(g)化合物331及對照組21天治療後(10mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg)裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟以及腦部切片的蘇木精-伊紅染色結果。(c-f)數據以「平均值±標準差「的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**表示和對照組相比p＜0.01。

圖3.化合物331處理神經膠質瘤細胞後，對細胞基因表達譜的影響。(a)如何挑選U251、C6細胞經化合物331處理後表現出的相對高表達基因、RNA水平顯著變化基因以及不變基因的示意圖。(b)DAVID分析的基因功能(倍數＞1或者倍數＜-1，p＜0.01)。(c)IPA報告。RNA測序數據按照信號通路以及統計學差異顯著性排序。排名前十的通路列出(d)化合物331處理後，原本在神經膠質瘤細胞中上調基因的下調情況，以及原本下調基因的過表達情況。Cdc20的過表達能夠逆轉化合物331對細胞增殖活力的抑制。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**表示和對照組相比p＜0.01。

圖4.化合物331能夠下調神經膠質瘤細胞中的Cdc20水平。(a)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞或者星形細胞，以及轉染Cdc20的兩種細胞後，進行Cdc20免疫印記分析的結果。(b)化合物331給藥組小鼠腫瘤細胞組織的Cdc20免疫印記分析，給藥劑量分別為10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg。(c)a組實驗中免疫印記數據的定量分析，數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。*p＜0.05，**p＜0.01。(d)b組 實驗中免疫印記數據的定量分析，數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。*p＜0.05，**p＜0.01。(e)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞或者星形細胞，以及轉染Cdc20的兩種細胞後，進行Cdc20實時定量RT-PCR分析的結果。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(f)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(化合物331處理24小時之前轉染)後，進行細胞增殖活力分析的結果。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。*p＜0.05，**p＜0.01。(g)用化合物331(20μM，24h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(331處理24小時之前轉染)。之後將細胞收集並且將3000個細胞繼續培養10天。之後用結晶紫(0.4g/L)將細胞染色。(h)每個培養皿細胞集落數量的統計。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(i)將化合物331治療組小鼠的腫瘤取出後，進行Cdc20染色之後的代表性照片。治療方式為(10mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg)連續給藥21天。

圖5.化合物331誘導的神經膠質瘤細胞有絲分裂破壞。(a)用化合物331(20μM，24h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(331處理24小時之前轉染)。其代表性有絲分裂照片，箭頭表示細胞具有兩個以上細胞核。標尺為200μm。(b)a圖中細胞的局部放大。(c)具有兩個以上細胞核細胞的計數。具有兩個以上細胞核細胞在5個隨機區域中進行計數，每個區域計100個細胞。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(d)細胞周期分析。化合物331的處理(20μM，48h)可誘導G2/M期細胞的聚集。(e)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的細胞後(331處理24小時之前轉染)，進行細胞周期分布的定量統計(G1，S and G2/M)。

圖6.化合物331誘導的神經膠質瘤細胞凋亡。(a)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的細胞後(331處理24小時之前轉染)，進行鈣磷脂結合蛋白V的流式細胞分析以及PI。(b)化合物331處理(20μM，48h)引起的半胱天冬酶-3/7蛋白酶活性上調，以及這種上調能夠被Cdc20過表達(331處理24小時之前轉染)所逆轉。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

圖7.化合物331選擇性下調神經膠質瘤細胞中的miR-494。(a)用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染miR-494抑制劑的該種細胞後(331處理前24h轉染)，進行Cdc20免疫印記分析的結果。「Inhibitor-NC」代表未加抑制劑的對照組。(b)a圖中免疫印記數據的量化。數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(c)將神經膠質瘤細胞轉染miR-494類似物72小時後，對Cdc20的免疫印跡分析。「mimic-NC」代表未加類似物的對照組。(d)c圖中免疫印記數據的量化。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**＜0.01。(e)MiR-494抑制劑(化合物331處理前24h轉染)能夠顯著逆轉化合物331(20μM，48h)誘導的細胞死亡。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(f)miR-494類似物(72小時)能夠顯著誘導神經膠質瘤細胞死亡。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。(g)化合物331處理(20μM，48h)後，對miR-494的定量RT-PCR分析。數據以平均值±標準差的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。*p＜0.05，**p＜0.01。(h)化合物331誘導細胞死亡的通路示意圖。

具體實施方式

下面的實施例是本發明說明性優選實施方案，對本發明不構成任何限制。

實施例1：化合物331選擇性誘導神經膠質瘤細胞凋亡實驗

本發明中用到的實驗材料和實驗方法：

(1)細胞培養和細胞系

大鼠星形膠質細胞的獲取方法：大鼠的星形膠質細胞來自新出生的SD鼠腦，實驗設計得到北京大學機構的認可，實驗過程中動物的保護和利用嚴格遵循動物保護和利用協會以及NIH的相關指導方針。簡而言之，新鮮的鼠腦用0.25％的胰蛋白酶裂解，然後用胎牛血清將胰蛋白酶滅活，混合物通過移液管磨碎，隨後通過70μm的無菌濾膜，離心，然後用PBS(0.003MKCl，0.14MNaCl，0.01MNa2HPO4，0.002MKH2PO4，pH 7.2)洗滌沉澱，最後以5×104cell/ml的密度鋪板。細胞在密閉的培養瓶中以250g的重量震蕩培養18小時，當細胞在培養瓶的表面融合就獲得了鼠的星形膠質細胞。

大鼠C6細胞、人類U251細胞及SF767細胞的獲取方法：大鼠的C6神經膠質瘤細胞，人的U251神經膠質瘤細胞以及SF767神經膠質瘤細胞均從中國協和醫科大學細胞資源中心獲得。C6神經膠質瘤細胞的培養條件為37℃、不含酚磺酞的10％FBS的DMEM以及5％CO2，每48小時換液一次。U251神經膠質瘤細胞和SF767神經膠質瘤細胞的培養條件為37℃、不含酚磺酞的10％FBS的MEM-EBSS以及5％CO2，每48小時換液一次。

(2)細胞活力和克隆遺傳性分析

細胞活力用CellTiterAQueous One Solution Cell Proliferation Assay測定。以每孔1000細胞的濃度鋪96孔板，在37℃、增溼的5％CO2條件下培養24小時，隨後用化合物或者轉染試劑處理細胞，待處理之後，每孔加入20μL CellTiterAQueous One Solution的反應物，在37℃、增溼的5％CO2條件下培養1-2小時，最後用Varioskan Flash reader測定OD490值。細胞活力的百分比＝[(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)]×100％。用臺盼藍對細胞 染色然後用血細胞計數器計數。對於克隆遺傳性分析，神經膠質瘤細胞用化合物331(20μM，24h)或者同時轉染的含有Cdc20過表達的質粒(用331處理之前的24h)處理。然後收集細胞，其中3000細胞多培養10天。然後用結晶紫染色並拍照。

(3)腫瘤異種移植實驗

實驗設計得到北京大學機構的認可。實驗過程中動物的保護和利用嚴格遵循動物保護和利用協會以及NIH的相關指導方針。實驗中所用小鼠為6周齡的雌性裸鼠(BALB/c-nu)，收集U251細胞用PBS重懸，然後以8×106cells/flank皮下注射小鼠的側腹。當腫瘤大小達到50mm3左右時，將化合物331(10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，0.9％生理鹽水作為對照)通過胃每天給藥，持續3周。然後用測徑器測量每組腫瘤大小，用如下公式估計腫瘤的體積：腫瘤體積(mm3)＝L(長)×W(寬)2/2。對於組織學研究，用4％福馬林固定腫瘤組織。

(4)組織病理學

收集裸鼠的組織用10％的福馬林固定，然後用標準技術進行組織學檢查。心臟、肝、脾、腎和腦用石蠟包埋，然後切割之後用蘇木精和伊紅染色，最後放到載玻片上用光學顯微鏡照相。

(5)RNA-seq

用RNeasy mini Kit提取化合物331處理組細胞和對照組細胞中總的RNA，然後利用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent)，在RNAPico 6000晶片上將RNA片段進行跑樣。簡單來說，帶有poly(A)尾巴的mRNAs從總的RNA中分離，之後反轉錄成cDNA，然後用QiaQuickPCR extraction kit純化，序列適配器被結紮成短的片段，200-700bp大小的片段用瓊脂糖凝膠電泳分離然後進行15個循環的PCR擴增。最後，準備好的文庫用Illumina HiSeqTM2000(Illumina)進行排序，然後用q-PCR和Agilent 2100Bioanalyzer進行檢驗。從每個組獲得的結果都將與人的基因組和鼠的基因組進行匹配。特異性 匹配的結果將用於以下分析。對於產生的基因計數，明白的映射結果首先被使用。特色的計數通過PPKM的方法而標準化，這種方法能夠清除不同基因長度和序列偏差對計算基因表達的影響，因此，基因表達的計算能夠直接用於比較不同群組間的基因表達。為了檢測不同表達水平，p值(單側)相當於不同的基因表達檢測(具有相等變量的雙樣本t檢測)。差別表達的基因分析產生大量的多重性的問題，其中數千的假設被同時檢測。第一類誤差和第二類誤差通過FDR方法進行校正。

(6)實時螢光定量PCR

收集從每個實驗組細胞中分離的RNA，2μg總的RNA通過Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA依照製造商提供的實驗步驟。取100ng的cDNA用於qRT-PCR，用SYBR Green PCR Master Mix檢測miR-494和Cdc20的表達，實時螢光定量PCR反應在iCycler Real Time PCRSystem上進行依照製造商的建議。MiRNA和mRNA的數量用ΔCt的方法計算。U6shRNAqRT-PCR Primer Set用於檢測miR-494的參照基因。miR-494的表達水平被每個樣品的U6shRNA標準化。Cdc20的表達水平被每個樣品的GAPDH標準化。人類Cdc20用的引物序列如下：F引物：(5』-GAGGGTGGCTGGGTTCCT-3』)；R引物：(5'-GCCTTGACAGCCCCTTGAT-3』)。鼠Cdc20用的引物序列如下：F引物：(5'-CCCAATGCACCGATTGCT-3』)；R引物：(5'-GCTGGGCCTGTGGCTTCT-3』)。Real-time PCR量化每個樣品都同時跑3份然後測定其平均值。目標基因和看家基因的擴增效率大致相等，因此能夠利用Ct方法進行相對定量分析，擴增條件為：40個循環，95℃10s，60℃30s.

(7)蛋白印跡

用細胞裂解液(50mMTris，pH8.0，150mMNaCl，1％NP-40，0.1％SDS)裂解培養的細胞，獲得細胞中的蛋白，然後用BCA分析試劑盒測定蛋白濃度。 所有的蛋白提取物100℃煮沸5min，使其變性，然後用10％的SDS-PAGE在80V下跑電泳1.5h使不同大小的蛋白分離。蛋白與PVDF膜在100V電壓下作用2h，使其充分在PVDF膜上印跡。然後膜用5％的TBST稀釋的牛血清白蛋白室溫封閉半小時，加入一抗：抗-Cdc20和β-actin，TBST洗3次，加入二抗：HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶4000稀釋)然後通過增強的化學發光法進行檢測。最後用BioRadChemiDox(BioRad的化學發光成像儀)分析吸光度。相對密度由Cdc20/β-actin的絕對密度決定。

(8)免疫染色

細胞在4℃PBS-Triton存在下被通透，然後用10％牛血清白蛋白在室溫下進行封閉，隨後和抗α微管蛋白的抗體孵育，4℃過夜。Cy3接合的抗兔抗體作為二抗，DAPI(10μg/ml)在暗處染核15min，蓋玻片用ImmunonTM mounting medium包埋後放到載玻片上，結果用螢光顯微鏡和數位化照相機進行分析，含有兩個或者多個核的細胞被算入到5個隨機區域內，在每個區域內計算100個細胞。

(9)細胞分裂周期分析

收集細胞，用PBS洗兩次，然後用70％冷乙醇過夜固定。孵育之後，細胞用PBS洗3次，然後用300μL含有0.1mg/ml Rnase、50μg/ml碘化丙啶以及0.2％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS重懸，室溫暗處孵育30min，然後把樣品放到Falcon管中，用Becton Dickinson FACStarPLUS讀數。最後用ModFit software軟體進行數據分析。

(10)膜聯蛋白V-FITC/PI FACS(螢光激活細胞分選)凋亡實驗

根據膜聯蛋白V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(Solarbio)的說明書，將細胞用胰酶消化並用PBS洗滌兩次。用加入10μL膜聯蛋白V-FITC和10μL PI的結合緩衝液將細胞輕輕重懸混勻，避光室溫孵育15min。向樣品中加入300μL結合緩衝液，並在1小時內利用Becton Dickinson FACStarPLUS(Becton Dickinson)流式細胞儀進行分析。

(11)半胱天冬酶活性實驗

利用Apo-One同源半胱天冬酶-3/7實驗(Promega)進行半胱天冬酶-3/7活性測定。簡述之，將104個細胞進行收集後，利用同源半胱天冬酶-3/7試劑進行裂解。裂解物在37℃孵育4小時，之後在485/530nm進行螢光測定。根據化合物331處理的樣品與331聯合Cdc20過表達處理的樣品與對照組之間的比值，對半胱天冬酶-3/7的相對活性進行測定。

(12)統計學分析

利用方差分析(ANOVA)進行統計學顯著性的計算。因此方差分析的結果也利用Sheffé’s分析來體現。數據以平均值±標準差的形式來體現。p＜0.05表示具有統計學差異。

選擇人神經膠質瘤細胞(U251，SF767)和大鼠神經膠質瘤細胞(C6)U251、SF767及C6細胞系，利用10μM或者20μM的化合物331(附圖1a)處理24h、48h和72h，分別給藥10μM和20μM，記錄24h、48h及72h後的效果，實驗結果(附圖1b，c，d，e)顯示，化合物331的處理能夠顯著誘導人神經膠質瘤細胞(U251，SF767)和大鼠神經膠質瘤細胞(C6細胞)的增殖抑制，但不能誘導正常星形細胞的增殖抑制。

該實驗結果說明化合物331具有選擇性抑制神經膠質瘤細胞生長增殖的作用。該實驗中數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

實施例2：測試化合物331對人類異種移植神經膠質瘤細胞的抑制效果

本實驗中小鼠用6周齡雌性裸鼠(BALB/c-nu)。

將U251細胞收集用PBS重懸後，以皮下注射方式接種至小鼠側面(每側8×106個細胞)。注射之後，當腫瘤大小長至50mm3時，用化合物331進行灌胃給藥(劑量分別為10mg/kg，40mg/kg，80mg/kg，0.9％生理鹽水作為對照)，每日給藥，持續給藥3周。與對照組相比，給予化合物331後小鼠的腫瘤體積和重量顯著降低(附圖2a，b，c，e)；同時，給予化合物331後大幅降低了腫 瘤細胞的日生長率(附圖2d)，而小鼠的體重並未明顯改變(附圖2f)。

該實驗說明，化合物331可有效抑制人類異種移植神經膠質瘤細胞的生長。該實驗中數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

實施例3：評價化合物331的安全性

以劑量10mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg給予化合物331二十一天後，進行裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟以及腦部切片的H&E染色實驗，結果顯示化合物331沒有造成這些器官的明顯損傷(附圖2g)。

該實驗證明化合物331在10mg/kg、40mg/kg及80mg/kg劑量下，能夠保證藥效及安全性。該實驗中數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

實施例4：考察化合物331處理神經膠質瘤細胞後，對細胞基因表達譜的影響

利用RNA-Seq技術對經化合物331處理的細胞和對照組細胞進行RNA測序，考察化合物331誘導的細胞凋亡過程中不同基因的表達譜。分別挑選人類膠質瘤細胞U251和大鼠膠質瘤細胞C6進行處理。通過該分析結果(附圖3a)，可以確定化合物331對細胞基因表達譜的影響。在U251細胞中，與空白對照組相比，共有767個基因上調(fold＞1，p value＜0.05)，1780個基因下調(fold＜-1，p value＜0.05)。而在C6細胞中，與空白對照組相比，共有4846個基因上調(fold＞1，p value＜0.05)，2517個基因下調(fold＜-1，p value＜0.05)。通過分析發現，細胞基因表達譜中發生變化數量最多的是那些與細胞周期相關的基因(附圖3b)，這說明用化合物331處理U251細胞和C6細胞後，大部分發生改變的基因都與生長周期的變化有關。然後，挑出U251細胞和C6細胞中共有的受影響較大的357個基因，用IPA軟體(Ingenuity Systems Inc.)分析這357個基因的RNA測序數據，發現受影響最大的兩類基因信號通路也都與細胞周期相關(附圖3c)。

為了定義與誘導神經膠質瘤細胞凋亡相關的基因，我們從化合物331 處理過的U251細胞和C6細胞中，挑選出它們共有的RNA水平變化較大的基因(fold＞2or fold＜-2)，然後在這些變化較大的基因中挑選了變化最大的12個基因(RPKM＞5)(見表1)進行特別考察。

表1化合物331處理過的U251細胞和C6細胞中，RNA水平變化較大基因(fold＞2or fold＜-2)中的高表達基因(RPKM＞5)

選擇U251細胞，對上調的基因採用轉染相應shRNAs的方法處理；同時，對下調的基因，採用轉染相應過表達質粒的方法處理。分別轉染處理完畢後，給予化合物331(20μM，24h)，結果發現在轉染Cdc20過表達質粒組中，U251細胞的細胞活性出現了最大程度的變化(增長)(附圖3d)，這說明Cdc20是化合物331發揮細胞增殖抑制活性的關鍵基因。

以上實驗通過DAVID和IPA的整體分析說明，Cdc20在化合物331誘導腫瘤細胞凋亡中扮演重要角色。實驗數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**表示和對照組相比p＜0.01。

實施例5：考察化合物331對神經膠質細胞瘤中Cdc20水平的調控能力

用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞和星形細胞，以及分別轉染Cdc20的細胞後，進行Cdc20免疫印記分析。通過Western blot以及RT-PCR的結果證明，在化合物331處理的體外(附圖4a，c，e)及體內神經膠質瘤細胞中，Cdc20水平均明顯下調(附圖4b，d)。而在星形膠質瘤細胞中，Cdc20不管是在mRNA水平還是蛋白水平，都未見明顯變化(20μM，48h)(附圖4a，c，e)。過表達Cdc20的神經膠質瘤細胞經化合物331(20μM，48h)處理後，細胞活力明顯高於被處理的普通神經膠質瘤細胞組(附圖4f)。

對神經膠質瘤細胞異種抑制的小鼠給予化合物331進行治療，治療方式為(10mg/kg，40mg/kg and 80mg/kg)連續給藥21天，然後將治療組小鼠的腫瘤取出，可發現腫瘤細胞中Cdc20的表達水平明顯下降(附圖4i)。

另外，用化合物331(20μM，24h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(331處理24小時之前轉染)。然後將細胞收集並且將3000個細胞繼續培養10天，之後將細胞用結晶紫(0.4g/L)染色，觀察化合物331對高表達的Cdc20的神經膠質瘤細胞的影響。結果發現高表達的Cdc20可以解除化合物331對腫瘤生長的抑制作用(附圖4f)，

以上實驗說明化合物331在體內及體外都能有效下調普通神經膠質瘤細胞中的Cdc20水平；並且，高表達的Cdc20可以解除化合物331對腫瘤生長的抑制作用；同時也說明，下調Cdc20水平，是化合物331發揮抗神經膠質瘤細胞作用的關鍵。該實驗中數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

實施例6：化合物331誘導神經膠質瘤細胞有絲分裂障礙及凋亡

用化合物331(20μM，24h)分別處理普通的神經膠質瘤細胞(U251和SF767)(普通組)，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(於化合物331處理24小時之前轉染)(過表達組)。本實驗結果顯示化合物331增加了普通組的多核細胞(有絲分裂障礙的標誌物)數量(附圖5a，b，c)，並誘導G2/M阻 滯(附圖5d，e)；而在Cdc20過表達組中，多核細胞數量增加和G2/M阻滯的效果並不明顯(附圖5a，c，d，e)。

另外，流式細胞儀分析顯示，用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞，以及轉染Cdc20的神經膠質瘤細胞(於化合物331處理24小時之前轉染)後(U251和SF767)，可使annexin V-positive和PI-negative細胞的比率顯著增加(附圖6a)。化合物331(20μM，48h)還可明顯增加神經膠質瘤細胞中caspase-3/7的酶活性(附圖6b)，這說明化合物331促進了神經膠質瘤細胞的凋亡。同樣的，在Cdc20過表達的細胞中，化合物331(20μM，48h)的這種促進annexin V-positive和PI-negative，以及caspase-3/7增加的現象被削弱(附圖6a，b)。

以上實驗說明，化合物331可顯著增加神經膠質瘤細胞中多核細胞的數量、造成有絲分裂阻滯並誘導腫瘤細胞凋亡。並且，化合物331的這種阻滯有絲分裂和誘導腫瘤細胞凋亡的功能是通過下調Cdc20水平來實現的。該實驗中數據以「平均值±標準差」的形式來體現三次獨立重複實驗的結果。**p＜0.01。

實施例7：化合物331選擇性上調神經膠質瘤細胞中的miR-494

已有多項證據表明miR-494的過表達可導致Cdc20水平下降(Yamanaka，S.，et al.，Coordinated effects of microRNA-494induce G(2)/M arrest in human cholangiocarcinoma.Cell Cycle，2012.11(14)：p.2729-38.)。在本實驗中，用化合物331(20μM，48h)處理普通的神經膠質瘤細胞(普通組)、轉染miR-494抑制劑的經膠質瘤細胞(化合物331處理前24h轉染)，以及過表達miR-494的細胞，然後進行Cdc20免疫印記分析(Western Blot)。實驗結果顯示，轉染miR-494抑制劑組的Cdc20水平顯著升高，明顯高於普通組(附圖7a，b)。而過表達miR-494組的Cdc20水平顯著降低，低於未過表達組和空白組(附圖7c，d)。在細胞活性方面，MiR-494抑制劑能夠顯著逆轉化合物331(20μM，48h)誘導的神經膠質瘤細胞死亡(附圖7e)，而過表 達的MiR-494(miR-494類似物)顯著誘導神經膠質瘤細胞死亡(附圖7f)。

此外，用化合物331處理普通神經膠質瘤細胞(20μM，48h)後，對miR-494的定量RT-PCR分析。結果顯示，細胞中miR-494的水平顯著上升(附圖7g)。

以上實驗說明，化合物331可上調神經膠質瘤細胞中miR-494的水平；同時證明，miR-494是Cdc20的上遊調節因子，miR-494表達增加可抑制Cdc20水平，miR-494表達下降可上調Cdc20水平。化合物331通過上調miR-494表達，進而下調Cdc20水平，造成神經膠質瘤細胞有絲分裂障礙，最終阻礙腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡(附圖7h)。