一種修飾的小幹擾核酸及其製備方法

2023-10-05 18:24:54 3

專利名稱：一種修飾的小幹擾核酸及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種修飾的小幹擾核酸及其製備方法。
背景技術：
RNA 幹擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平關閉同源基因的表達或使該基因表達沉默的現象。RNA幹擾技術又被形象 地稱為基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一種典型的轉錄後基因 調控方法，又稱轉錄後基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有 關RNA幹擾的報導出現在1990年，由兩個不同的研究小組同時報導了轉基因植物中的RNA 幹擾現象，以後又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA幹擾現 象。1999年，Hamilton和Baulcombe在發生RNA幹擾的植物中檢測到了長度為21-25個核苷 酸的RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA幹擾所必需的，被稱為小幹擾核酸(siRNA)。雙鏈 siRNA與細胞源性的相關酶和蛋白質形成RNA誘導的沉默複合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA幹擾過程中，雙鏈siRNA中的正義鏈被排除出複合體，反義鏈指導 RISC結合到靶mRNA的同源位點，然後由複合物中的核糖核酸酶111降解靶mRNA，從而關閉 靶基因的表達。但是，由於小幹擾核酸(siRNA)的穩定性較差，在體內容易被核酸酶降解，因此人 們對合成的siRNA進行化學修飾，以增加siRNA的血清穩定性，從而有效地抑制目的基因的 表達。目前，由於人們對siRNA在血清中的降解過程和機制缺乏足夠的了解，只能依靠 各自的經驗隨機地選擇siRNA分子中的多個核苷酸進行化學修飾。這種修飾策略雖然能很 好地提高siRNA分子的血清穩定性，但由於缺乏理論的指導，通常在siRNA分子中引入了過 量的修飾，增加了修飾後的siRNA的潛在細胞毒性，並在很多情況下降低了 siRNA的生物學 活性，因而制約了修飾後的siRNA在體內的應用。另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修飾的做法，也限制了一些具有較 好穩定效果，但細胞毒性相對較大的修飾方法在體內研究中的應用。因此，設計具有針對性的修飾方案，通過最少的修飾來實現最優的穩定性目的是 目前迫切需要解決的問題。

發明內容
本發明的目的在於克服現有的siRNA的修飾方案中存在盲目地引入大量的修飾 從而導致得到的修飾的小幹擾核酸細胞毒性大問題，提供一種血清穩定的、具有良好生物 活性的且細胞毒性較低的修飾的小幹擾核酸。本發明提供了一種修飾的小幹擾核酸，其包括第一片段和第二片段，並且所述第 一片段和第二片段能夠形成雙鏈區域，所述第一片段包括至少一個連續的CA序列或UG序 列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補的連續的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/ UG位點，其中，所述CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使修飾的小幹擾 核酸的穩定性高於未修飾的小幹擾核酸。本發明通過對CA/UG位點進行特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下， 即可達到增加修飾後的小幹擾核酸的血清穩定性的目的，從而降低了修飾後的小幹擾核酸 分子的潛在的細胞毒性，以及修飾對小幹擾核酸的生物學活性的影響。
具體實施例方式本發明提供了一種修飾的小幹擾核酸，其包括第一片段和第二片段，並且所述第 一片段和第二片段能夠形成雙鏈區域，所述第一片段包括至少一個連續的CA序列或UG序 列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補的連續的UG序列 或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/ UG位點，其中，所述CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使修飾的小幹擾 核酸的穩定性高於未修飾的小幹擾核酸。本發明的發明人對小幹擾核酸分子在體內的降解過程進行了細緻的研究，發現在 CA/UG位點中僅引入少量修飾的情況下，即可提高修飾的小幹擾核酸分子的穩定性，大大降 低了由於隨機地引入大量的修飾而導致的潛在細胞毒性較高，以及修飾對小幹擾核酸的生 物學活性的影響。根據本發明，所述的「第一片段」是指具有與基因編碼鏈的序列全部或部分同源的 序列的核苷酸片段，所述「第二片段」是指具有與基因編碼鏈的序列互補的序列的核苷酸片 段。所述「互補」是指兩個核苷酸在雜交條件下能夠配對，例如，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T) 或尿嘧啶(U)之間能夠配對，以及胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之間的配對。根據本發明，所述小幹擾核酸分子的標靶可以為各種基因，例如，可以將在細胞 內的功能有待分析的基因作為標靶，也可以將需要抑制其表達的基因作為標靶，例如，可 以以與疾病或紊亂相關的基因作為標靶，如癌基因、病毒基因、細胞膜表面受體基因、細 胞核受體基因或細胞信號傳導通路上的基因等。本領域的技術人員根據其標靶基因，能 夠設計得到小幹擾核酸分子(siRNA)，例如，將目的基因的靶標序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列號輸入各種小幹擾核酸設計程序，如Insert Design Tool for the shRNA Vectors(Ambion)、shRNA Explorer (Gene Link)、siDirect(Yuki Naito et al. University of Tokyo)、 SiRNA at Whitehead(Whitehead Institute for Biomedical Research), BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT)，RNAi Explorer(Gene Link)、 siRNA Target Finder(Ambion)、或 siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等， 該設計程序將會根據設計者的要求和siRNA的設計原則，針對所提供的基因或序列設計 siRNA。並且，有些程序能夠對設計好的siRNA做全基因組或mRNA轉錄組的同源性分析，從 而設計出對靶基因或靶序列特異的siRNA。上述提及的siRNA設計程序及其涉及的原則為 本領域技術人員所公知，其全部內容在此一併引入作為參考。根據本發明，所述修飾的小幹擾核酸包括多個CA/UG位點，並且該多個CA/UG位點 中的至少一個核苷酸是經過修飾的。此外，所述CA/UG位點中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷酸是經過修飾的。在這種情況下，不但能夠提高所述修飾的小幹擾核酸的穩定性、維持其生物活性，還可以進一步減少 在修飾的小幹擾核酸分子中引入的修飾數量，從而進一步地降低修飾引起的小幹擾核酸的 潛在細胞毒性。根據本發明的一個方面，所述修飾的小幹擾核酸中，除了所述CA/UG位點中的核 苷酸以外，其它核苷酸是未經過修飾的。在這種情況下，不但能夠提高所述修飾的小幹擾核 酸的穩定性、維持其生物活性，還可以使在修飾的小幹擾核酸分子中引入的修飾數量最小 化，從而進一步地降低修飾引起的小幹擾核酸的潛在細胞毒性。根據本發明的另一個方面，所述修飾的小幹擾核酸中，所述第一片段還可以包括 至少一個連續的UA序列，所述第二片段還可以包括至少一個連續的與所述第一片段的UA 序列互補的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點， 並且，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使UA/UA位點被修飾的小 幹擾核酸的穩定性高於UA/UA位點未被修飾的小幹擾核酸。本發明的發明人意外地發現， 當所述修飾的小幹擾核酸的含有CA/UG位點和UA/UA位點時，除了對CA/UG位點進行特異 性的修飾以外，對UA/UA位點中的至少一個核苷酸進行特異性修飾，不但能夠降低細胞的 毒性，還能夠進一步提高含有CA/UG位點和UA/UA位點的小幹擾核苷酸的穩定性。在本發明的一種實施方式中，本發明提供的修飾的小幹擾核酸除了包括CG/CA位 點以外，還可以多個UA/UA位點，並且該多個UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經過修飾 的。在優選的情況下，所述UA/UA位點中，只有一個尿嘧啶核苷酸是經過修飾的。在一個優選的實施方式中，本發明提供的修飾的小幹擾核酸中，除了所述CA/UG 位點和UA/UA位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經過修飾的。在這種情況下，不但能夠 提高所述修飾的小幹擾核酸的穩定性、維持其生物活性，還可以使在修飾的小幹擾核酸分 子中引入的修飾數量最小化，從而進一步地降低修飾引起的小幹擾核酸的潛在細胞毒性。根據本發明，所述修飾的小幹擾核酸可以為單鏈分子也可以為雙鏈分子。當所述修飾的小幹擾核酸為單鏈分子時，所述第一片段和第二片段之間的互補區 域形成雙鏈區域。當所述修飾的小幹擾核酸為雙鏈分子時，該修飾的小幹擾核酸包括正義鏈和反義 鏈，所述正義鏈可以為連續的核苷酸鏈，也可以為不連續的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續的 核苷酸鏈。根據本發明的一個方面，本發明提供的修飾的小幹擾核酸包括正義鏈和反義鏈， 且所述正義鏈和反義鏈為連續的核苷酸鏈，所述第一片段位於正義鏈，所述第二片段位於 反義鏈。根據本發明的另一個方面，本發明提供的修飾的小幹擾核酸包括正義鏈和反義 鏈，所述正義鏈是包括兩個或兩個以上的正義鏈部分的不連續的核苷酸鏈；所述反義鏈為 連續的核苷酸鏈；所述第一片段位於一個或多個正義鏈部分，所述第二片段位於反義鏈。本發明中，術語「正義鏈」是指當所述修飾的小幹擾核酸為雙鏈分子時，具有與基 因編碼鏈的序列全部或部分同源的序列的核苷酸片段，所述「第二片段」是指指當所述修飾 的小幹擾核酸為雙鏈分子時，具有與基因編碼鏈的序列互補的序列的核苷酸片段。並且，當 所述修飾的小幹擾核酸為雙鏈分子且所述正義鏈和反義鏈為連續的核苷酸鏈時，術語「正 義鏈」和「第一片段」可以互換使用，術語「反義鏈」和「第二片段」可以互換使用。
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本發明中，術語「正義鏈部分」是指當所述正義鏈為不連續的核苷酸時，用於組成 正義鏈的一部分核苷酸鏈；在所述正義鏈中，該正義鏈的所有正義鏈部分的總長度與所述 正義鏈的長度相等，並且，當所述正義鏈部分中包括UA/UA位點時，術語「正義鏈部分」與 「第一片段」可以互換使用。根據本發明，所述修飾的小幹擾核酸可以由核糖核苷酸組成，也可以為包括核糖 核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。根據本發明，術語「潛在細胞毒性」是指由於對核苷酸分子進行修飾而造成的對細 胞的毒性作用。本發明中，所述修飾的方式為本領域技術人員所公知，例如，本發明對所述小分子 幹擾核酸進行的化學修飾為以下的一種或幾種(1)對所述小分子幹擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對所述小分子幹擾核酸的核苷酸序列中核糖的的修飾；(3)對所述小分子幹擾核酸的核苷酸序列中鹼基的修飾。所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進行修飾，包括硫代磷酸修飾 (Phosphorthioate)和硼烷化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如圖所示分別用硫和硼烷 置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩定小分子幹擾核酸的結構，保持鹼基配對的高特 異性和高親和力。而硼烷化磷酸鹽修飾的小幹擾核酸的疏水性強，易於在血漿中形成水合 蛋白，對人體的毒副作用低於硫代磷酸酯。
硫代磷酸修飾
硼烷化磷酸鹽修飾所述核糖修飾是指對核苷酸戊糖中羥基(2' -0H)的修飾。在核糖的羥基位置引 入某些取代基如甲氧基或氟後，使血清核糖核酸酶不易識別小幹擾核酸，增加了小幹擾核 酸的穩定性。使小幹擾核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。對核苷酸戊糖中羥基的修 飾包括 2'-氟修飾(2' -fluro modification) ；2'-氧甲基修飾(2' -0ME) ；2'-甲氧 乙基修飾(2' -M0E) ；2,4' -二硝基苯酚修飾(2' -DNP modification)；鎖核酸(LNA)； 2'-氨基修飾(Amina modification) ；2'-脫氧修飾(2' -Deoxy modification)等等。
2'-脫氧修飾所述鹼基修飾是指對核苷酸的鹼基進行修飾，如在尿嘧啶的5位點引入溴或碘的 5'-溴尿嘧啶(5 『 -bromo-uracil)和5'-碘尿嘧啶(5 『 -iodo-uracil)修飾是常使 用的鹼基修飾方法，其他還有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修飾，2，6-二氨基嘌呤 (2，6-diaminopurine)修飾等。
-氟修飾
K
Bse
Lz0 0"CH2"CH2"0"CH32'-甲氧乙基修飾
、_ Base
？一 -0—^=0鎖核酸
、r
0"CH3
2'-氧甲基修飾
G^e
^O DHP
2,4' -二硝基苯酚修飾
H
V
O NH-
2'-氨基修飾
H
B
O H
8 溴尿嘧啶
碘尿嘧啶 N3-甲基脲嘧啶
2，6-二氨基嘌呤優選情況下，所述修飾為對所述小分子幹擾核酸的核苷酸序列中核糖的2』 -0H的 修飾。進一步優選為，所述修飾為所述小分子幹擾核酸的核苷酸序列中核糖的2』 -0H被甲 氧基或氟取代。上述修飾均可以增加所述小幹擾核酸的血清穩定性，增強其對血清核酸酶 水解的抵抗能力。本發明還提供了一種修飾的小幹擾核酸的製備方法，其中，該方法包括根據未修 飾的小幹擾核酸的核苷酸序列，並使用經過修飾核苷酸替代所述未修飾的小幹擾核酸的核 苷酸序列中相應位置的核苷酸，來合成修飾的小幹擾核酸，使得到的修飾的小幹擾核酸包 括第一片段和第二片段，並且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區域，所述第一片段 包括至少一個連續的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA 序列或UG序列互補的連續的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述 第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點，其中，所述CA/UG位點中的至少一個核苷酸 是經過修飾的，該修飾使修飾的小幹擾核酸的穩定性高於未修飾的小幹擾核酸。優選情況 下，使得到的修飾的小幹擾核酸的CA/UG位點中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷酸是經過修 飾的。根據本發明的一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法可以包 括根據未修飾的小幹擾核酸的核苷酸序列，並使用經過修飾核苷酸替代所述未修飾的小 幹擾核酸的核苷酸序列中相應位置的核苷酸，來合成修飾的小幹擾核酸，使得到的修飾的 小幹擾核酸包括一個CA/UG位點，並且該一個CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾 的。優選情況下，使得到的修飾的小幹擾核酸的CA/UG位點中，只有反義鏈中的胞嘧啶核苷 酸是經過修飾的。根據本發明的另一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法可以 包括根據未修飾的小幹擾核酸的核苷酸序列，並使用經過修飾核苷酸替代所述未修飾的 小幹擾核酸的核苷酸序列中相應位置的核苷酸，來合成修飾的小幹擾核酸，使得到的修飾 的小幹擾核酸包括多個CA/UG位點，並且該多個CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的。優選情況下，使得到的修飾的小幹擾核酸的CA/UG位點中，只有反義鏈中的胞嘧啶核 苷酸是經過修飾的。在一種優選的情況下，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得到的 修飾的小幹擾核酸中，除了所述CA/UG位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經過修飾的。在另一種優選的情況下，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得到 的修飾的小幹擾核酸的第一片段還包括至少一個連續的UA序列，修飾的小幹擾核酸的第 二片段還包括至少一個連續的與所述第一片段的UA序列互補的UA序列，所述第一片段的 UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點，並且，所述UA/UA位點中的至少一個核 苷酸是經過修飾的，該修飾使UA/UA位點被修飾的小幹擾核酸的穩定性高於UA/UA位點未 被修飾的小幹擾核酸。根據本發明的一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得到 的修飾的小幹擾核酸除了包括CA/UG位點以外，還包括一個UA/UA位點，並且，所述UA/UA 位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使UA/UA位點被修飾的小幹擾核酸的穩定 性高於UA/UA位點未被修飾的小幹擾核酸。根據本發明的另一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得 到的修飾的小幹擾核酸除了包括CA/UG位點以外，還包括多個UA/UA位點，並且，所述UA/UA 位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使UA/UA位點被修飾的小幹擾核酸的穩定 性高於UA/UA位點未被修飾的小幹擾核酸。本發明中，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得到的修飾的小幹 擾核酸的結構為本領域技術人員所公知，可以為各種小幹擾核酸的存在結構。例如，根據本發明的一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法 使得到的修飾的小幹擾核酸可以為髮夾結構的單鏈分子，所述第一片段和第二片段之間的 互補區域形成雙鏈區域。根據本發明的另一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得 到的修飾的小幹擾核酸可以包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈為連續的核苷酸 鏈，所述第一片段位於正義鏈，所述第二片段位於反義鏈。根據本發明的另一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得 到的修飾的小幹擾核酸可以包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈是包括兩個或兩個以上的正 義鏈部分的不連續的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續的核苷酸鏈；所述第一片段位於一個或 多個正義鏈部分，所述第二片段位於反義鏈。根據本發明的另一個方面，本發明提供的所述修飾的小幹擾核酸的製備方法使得 到的修飾的小幹擾核酸可以為為包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。本發明中，合成小幹擾核酸的方法可以為各種常規的小幹擾核酸的合成方法， 或者委託專門從事核酸合成的生物技術公司合成，如委託上海吉瑪製藥技術有限公司 (GenePharma)、廣州銳博生物科技有限公司、或英俊生物技術有限公司(invitrogen)進行 合成。一般來說，用於合成小幹擾核酸的方法包括以下四個過程(1)寡聚核糖核苷酸 的合成；⑵脫保護；⑶純化分離；⑷脫鹽。例如，具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的小幹擾核酸化學合成的具體步驟如下(1)寡聚核糖核苷酸的合成在自動DNA/RNA合成儀(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上設定合成1毫摩爾的RNA，同時設定每個循環的偶聯時間為10-15分鐘， 起始物為固相連接的5』 -0-對二甲氧基-胸苷支持物，第一個循環在固相支持物上連接一 個鹼基，然後在第n次(19 > n > 2)循環中，在第n_l次循環所連接的鹼基上連接一個鹼 基，重複此循環直至完成全部核酸序列的合成。(2)脫保護將連接有小幹擾核酸的固相支持物加入到試管中，並在此試管中加入1毫升的乙 醇/乙胺(體積比為1 3)，然後密封，置於55-70°C溫箱中，孵育2-30小時，取出連接有 小幹擾核酸的固相支持物並用雙蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脫液，並在室溫下幹 燥30分鐘。然後，加入1毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1M)，室溫放置4-12小時，再 加入2毫升乙醇，收集沉澱即得到小幹擾核酸的粗產物。(3)純化分離將得到的小幹擾核酸的粗產物溶解於2毫升濃度為1摩爾/毫升的乙酸銨水溶液 中，然後通過C18高壓液相色譜進行分離，得到純化的小幹擾核酸產物。⑷脫鹽用濃度為75重量％的乙醇水溶液洗滌純化的小幹擾核酸產物2-4次(每次2毫 升)，除去鹽份，並室溫下乾燥。然後將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫 升的緩衝液中(10mM Tris, pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，將此溶液加熱至95°C，然後緩緩將 此溶液冷卻至室溫，並維持室溫16-22小時，得到含有小幹擾核酸的溶液。上文中給出多種實施方式的目的僅為示例性地對本發明進行說明，而不是為了限 制本發明的範圍。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明，本發明所用到的試劑、培養基 均為市售商品。實施例1選取下表1-55中的基因為靶基因，並委託上海吉瑪製藥技術有限公司 (GenePharma)合成表 1-55 中的 siRNA。實施例2通過以下方法分別對表1-55中所示的siRNA進行血清穩定性檢測、基因沉默效率 檢測和細胞毒性檢測1.血清穩定性檢測將4 ii L濃度為20 ii M的未修飾的和不同化學修飾小幹擾核酸加入到含有4 y L胎 牛血清和32iiL 1XPBS溶液中，血清的終濃度為10%;在37°C條件下將反應體系孵育一定 的時間後取樣，一般為0，3和6小時；每次取10 y L樣本並進行液氮速凍，以立即中止血清 核酸酶對siRNA的作用，然後將樣本保存於-80°C條件下備用。配置20%的聚丙烯醯胺凝膠，將3iiL的上樣緩衝液(30mM EDTA，36%甘油， 0.06%溴酚藍)與siRNA的降解樣本進行混合，然後上樣，在80mA的恆流條件下電泳。電 泳結束後，用lXSybr Gold染料(Invitrogen，Cat. 11494)進行10分鐘的染色後照相，結 果如表1-55所示。
2.基因沉默效率檢測將在DMEM培養基(10% FBS，2mM L_穀氨醯胺，100個單位/毫升的青黴素和 100 u g/ml的鏈黴素)中培養的人胚胎腎細胞(HEK293)接種到24孔板中(1X105細胞 /0. 5ml培養基/孔)。待細胞生長24小時後，細胞的融合度為50%左右時，將培養基換為 Opti-MEM培養基(Gibco公司)。然後將帶有siRNA分離靶位點的重組螢火蟲螢光素酶報 告質粒和pRL-TK (編碼海腎螢光素酶)的對照質粒(Promega公司，Madison WI，USA)與化 學合成的siRNA通過Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美國)進行細胞轉染，每孔含 0. 17g重組質粒和0. 017g pRL-TK對照質粒，siRNA的終濃度為13nM。每種siRNA平行轉 染三個復孔，以只轉染同樣量的兩種報告基因質粒，不轉染siRNA的三個復孔作為對照。4 小時後再將轉染介質換成1ml DMEM培養基(10% FBS, 2mM L-穀氨醯胺，100個單位/毫升 的青黴素和100 u g/ml的鏈黴素)。24小時後收穫細胞，以10 ill細胞裂解液細胞，利用雙 螢光素酶報告基因分析系統(Dual-Luciferase Assay System, Promega公司)和酶標儀 (Novostar，BMG Labtechnologies GmbH,Germany)測定兩種螢光酶的活性，以未轉染siRNA 的孔中的報告基因的表達量作為標準對照，通過以下公式計算得到siRNA對靶位點的沉默 效率，結果如表2所示。每種siRNA每次實驗平行做3個復孔，每個實驗重複2次，結果如 表1-55所示。沉默效率=(實驗組Firefly螢光素酶的表達量/實驗組Renilla螢光素酶表達 量)/(對照組Firefly螢光素酶的表達量/對照組Renilla螢光素酶表達量)3、修飾siRNA的細胞毒性檢測將在DMEM培養基(10% FBS，2mM L_穀氨醯胺，100個單位/毫升的青黴素和 100 u g/ml的鏈黴素)中培養的人胚胎腎細胞(HEK293)接種到24孔板中(1父105細胞/ 孔)；待細胞生長24小時後，細胞的融合度為50%左右時，將培養基換為Opti-MEM培養基 (Gibco公司)；然後將化學合成的siRNA通過Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美 國)進行細胞轉染，siRNA的終濃度為13nM，每種siRNA平行轉染三個復孔，無siRNA的三 個轉染復孔作為對照；4小時後再將轉染介質換成1ml DMEM培養基(10% FBS，2mML_穀氨 醯胺，100個單位/毫升的青黴素和100 u g/ml的鏈黴素)；24小時後吸去培養液，用PBS洗 滌一次，每孔加1ml PBS和10 ill MTT (噻唑藍)染液，在37°C 5% C02的二氧化碳培養箱中 培養4-6小時；每孔加0. lml酸化異丙醇，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產物充分溶解；酶 聯免疫檢測儀測定570nm處各孔A值，並按照以下公式計算細胞生長抑制率，結果如表1-55 所示。細胞生長抑制率(％ )=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A 值 X100%。表 1
12 表 2

%
表3
表 4 表 6 表 9
5
表 10
基因人 KAZRIN (NM—201628) (SEQIDNO:2)位點2151-2170BPSIRNA穩定性表達抑制率生長抑制率10-1未修飾+32%0%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-2隨機修飾(2』-氧甲基修飾)++19%24%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-3A特異性修飾(2』-氧甲基修飾)++29%6%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUAGCUGGACUUCCUCAUGC-510-3B特異性修飾(2』-氧甲基修飾)+十30%}%5-AUCGACCUGAAGGAGUACGTTTTUA GCUGGACUUCCUCAUGC-5表11 表14 表16 表 19 表21 表 29 表31 表32
表 33
表 39 表 40 表 41 表 44 表 46 表 49 表 54 在上表1-55中黑體字母表示的「A」、「U」、「G」或」 C」字母表示經過修飾的核苷酸；「 + 」表示經血清孵育後，siRNA主帶完全消失，可見明顯的降解條帶；「++」表示經血清孵育後，siRNA主帶雖有降解但仍清晰可見，可見明顯的降解條 帶；「+++」表示經血清孵育後，siRNA主帶清晰未見降解，未見明顯的降解條帶。另外，從上表1-55中可以看出，與經過隨機修飾的小幹擾核酸相比，本發明提供 的小幹擾核酸在提高了穩定性的同時，還顯著地降低了小幹擾核酸的細胞毒性，並且對小 幹擾核酸的表達抑制效率基本沒有影響，由此可見，本發明在僅引入少量修飾的情況下，即 可達到增加修飾後的小幹擾核酸的血清穩定性的目的，從而降低了修飾後的小幹擾核酸分 子的潛在的細胞毒性，以及修飾對小幹擾核酸的生物學活性的影響。SEQUENCE LISTING
cagcctggatgacctgggaccccagaaactgccgtttgggaggcagcaacagcaacgtgc4680
ccaggcaggcagttattcccacagagtgagccagaattgtagcagggcacttgaatgcag4740
agctgatgatttgaaaccaacgttcacccaacttgtcagaaatggcacttacatggttcg4800
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權利要求
一種修飾的小幹擾核酸，其包括第一片段和第二片段，並且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區域，所述第一片段包括至少一個連續的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補的連續的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點，其特徵在於，所述CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使修飾的小幹擾核酸的穩定性高於未修飾的小幹擾核酸。
2.根據權利要求1所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小幹擾核酸包括多個CA/ UG位點，並且該多個CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的。
3.根據權利要求1所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述CA/UG位點中，只有胞嘧啶核 苷酸是經過修飾的。
4.根據權利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小幹擾 核酸中，除了所述CA/UG位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經過修飾的。
5.根據權利要求1-3中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述第一片段還 包括至少一個連續的UA序列，所述第二片段還包括至少一個與所述第一片段的UA序列互 補的連續的UA序列，所述第一片段的UA序列與所述第二片段的UA序列形成UA/UA位點， 並且，所述UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使UA/UA位點被修飾的小 幹擾核酸的穩定性高於UA/UA位點未被修飾的小幹擾核酸。
6.根據權利要求5所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小幹擾核酸包括多個UA/ UA位點，並且該多個UA/UA位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的。
7.根據權利要求5所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述UA/UA位點中，只有一個尿嘧 啶核苷酸是經過修飾的。
8.根據權利要求5所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小幹擾核酸中，除了所述 CA/UG位點和UA/UA位點中的核苷酸以外，其它核苷酸是未經過修飾的。
9.根據權利要求1-3、6-8中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，該修飾的小幹擾核 酸為髮夾結構的單鏈分子，所述第一片段和第二片段之間的互補區域形成雙鏈區域。
10.根據權利要求1-3、6-8中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小 幹擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈和反義鏈為連續的核苷酸鏈，所述第一片段位 於正義鏈，所述第二片段位於反義鏈。
11.根據權利要求1-3、6-8中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小 幹擾核酸包括正義鏈和反義鏈，所述正義鏈是包括兩個或兩個以上的正義鏈部分的不連續 的核苷酸鏈；所述反義鏈為連續的核苷酸鏈；所述第一片段位於一個或多個正義鏈部分， 所述第二片段位於反義鏈。
12.根據權利要求1-3、6-8中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，該修飾的小 幹擾核酸為包括核糖核苷酸和至少一個脫氧核糖核苷酸的雜合分子。
13.根據權利要求1-3、6-8中的中的任意一項所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述修 飾為如下的修飾中的至少一種(1)對小幹擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對小幹擾核酸的核苷酸序列中核糖的修飾；(3)對小幹擾核酸的核苷酸序列中鹼基的修飾。
14.根據權利要求13所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述修飾為對小幹擾核酸的核 苷酸序列中核糖的2』 -OH的修飾。
15.根據權利要求14所述的修飾的小幹擾核酸，其中，所述修飾為小幹擾核酸的核苷 酸序列中核糖的2』 -OH被甲氧基或氟取代。
全文摘要
本發明提供了一種修飾的小幹擾核酸，其包括第一片段和第二片段，並且所述第一片段和第二片段能夠形成雙鏈區域，所述第一片段包括至少一個連續的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一個與所述第一片段的CA序列或UG序列互補的連續的UG或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列與所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位點，其特徵在於，所述CA/UG位點中的至少一個核苷酸是經過修飾的，該修飾使修飾的小幹擾核酸的穩定性高於未修飾的小幹擾核酸。本發明增加了修飾後的小幹擾核酸的血清穩定性的目的，並且降低了修飾後的小幹擾核酸分子的潛在的細胞毒性，以及修飾對小幹擾核酸的生物學活性的影響。
文檔編號C12N15/11GK101851619SQ20091008114
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者杜權, 梁子才 申請人:北京大學