製備重組形式的人β-澱粉樣蛋白的方法和這些蛋白質的應用的製作方法
2023-10-11 05:14:04
專利名稱：：製備重組形式的人β-澱粉樣蛋白的方法和這些蛋白質的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及克隆、表達和分離重組形式的澱粉樣P蛋白，其含N-末端甲硫氨酸(和/或者一種或多種其它胺基酸殘基)，以及用這些重組蛋白質的方法。背景信息澱粉樣P(l-42)蛋白(也被稱為AP(l-42))是長度範圍有1-39,1-40，1_41，1-42和1-43個殘基的蛋白質家族。1-42型是阿耳茨海默和先天愚型患者腦中蛋白質、液體、碳水化合物和鹽組成的不可溶性細月包外沉積(老年或神經炎斑)的中心成份(Masters等，PNAS82,4245-4249,1985)。特別是，澱粉樣P(1-42)和相似衍生物)蛋白質具有42個胺基酸的多肽，其通過蛋白水解過程衍生自澱粉樣前體蛋白(APP)。除了人變體，這也包括人之外的生物(特別是其它哺乳動物，尤其是大鼠)中出現的澱粉樣P(l-42)蛋白異構產物。該蛋白質在水環境中傾向於聚合，其可以非常不同的分子形式出現。已經證明，不可溶性蛋白沉積與痴呆病症(如，阿耳茨海默氏病)的發生或進程的簡單相關性並不令人信服(Terry等，Ann.Neurol.30.572-580(1991),Dickson等，Neurobiol.Agmg16,285-298(1995))。相反，突觸和認知感覺的喪失似乎更與可溶形式的AP(l-42)相關(Lue等，Am.J.Pathol.155,853-862(1999);McLean等,Ann.Neurol.46,860-866(1999))。在可溶形式的AP(l-42)中，根據推測會造成痴呆病症(如，阿耳茨海默氏病)的分子類型，本質上有兩種不同的假設。首先，假i殳有AP(l-42)初原纖維的細胞毒作用。後者仍是可溶的、纖維狀的、相對高凝集度的aP(l-42)形式，其分子量範圍為150-250kDa(Arispe等PNAS90,567(1993),Lashuel等，Nature418,291(2002》，由於具有形成孔的性質，其顯然會通過神經元細胞膜造成不受控的鈣流入。其次，分子量範圍為15-30kDa的寡聚AP(l-42)衍生物已經被描述(M.P.Lambert等PNAS95,6448-6453(1998))。這些非纖維狀的寡聚物也被稱為澱粉樣衍生的、擴散性和致痴呆的配體或ADDL的(參見美國專利6,218,506;國際申請WO01/10900;和Lambert等，同上)可在對海馬切片神經元的長期增強率顯示出有抑制作用的製品中被找到。可是，以前對寡聚物研究狀態的特徵在於實際相關的種類間有很大不確定性。文獻中的信息有很大差異。例如，美國專利6,218,506描述ADDL有3至12個亞基，而國際申請WO01/10900描述的ADDL有多至24個亞基(也可參見Luhrs等，PNAS102(48)，17342-17347(2005))。另外，有報導出現N-末端截短形式的Ap(l-42)蛋白與阿耳茨海默氏病有關耳關。除了AP(l-42),早在1985年，N-末端截4豆形式也在死亡的阿耳茨海默患者腦的沉積物中祐:才全測到(C.Masters等，PNAS82,4245-4249(1985))。因此，也知道腦中出現的特定蛋白酶(如neprilysin(NEP24.11)或IDE(胰島素降解酶的簡稱)能降解AP(1-42)(D.J.Selkoe,Neuron32,177-180,(2001))。可是，N-末端截短形式在阿耳茨海默氏病發病機理中的重要性還不清楚(Lee等，JBS278,4458-4466(2003))。有趣的是，一些患有零星或家族性阿耳茨海默氏病或先天愚型的患者優先積聚這些截短形式(J.Naslund等，PNAS91,8378-8382,(1994),C.Russo等，Nature405,531-532,(2000),T.C.Saido等，Neuron14，457-466,(1995))。相對近期的研究(Sergeant等，J.ofNeurochemistry85,1581-1591,(2003))顯示死亡阿耳茨海默患者腦中所有不可溶性肽的60%是基於N-末端截短形式的。根據以上觀點，當然有需求要製備大量(各種形式的)澱粉樣P蛋白質來達到研究和結果測試的需要，所述研究和結果測試涉及才企測人的阿耳茨海默氏病，更重要的是，涉及開發預防和治療阿耳茨海默氏病的生物和小分子。進一步，這類製備能進行進一步研究蛋白質與阿耳茨海默病因的關聯性質。因此，製備足量和天然樣功能形式的這種蛋白質的價值無法估量。另外，以前的體外研究依賴於化學合成的序列，其可能由肽的天然裂解點而得到。而且，體內研究通常依賴於生物合成的澱粉樣P,其不言而喻是由天然裂解點而得到的。因此，具有在原核重組系統(如大腸桿菌)中產生大量天然和突變的澱粉樣肽的能力當然優選存在於當前的製備方法中。10本文引用的所有專利和文獻全文都納入本文參考。發明筒述本發明涵蓋純化的P-澱粉樣蛋白，其與式[X+Y]所示的蛋白質有至少70%胺基酸序列同一性，其中"X"包含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自曱硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而"Y"包含天然澱粉樣P蛋白質胺基酸序列的全部或部分。特別是，"Y"可以包含天然P-澱粉樣蛋白的39至43個連續的胺基酸。"Y"還包括已知的人家族性突變變體，其與天然p-澱粉樣蛋白的胺基酸序列有至少70%序列同一性。根據阿耳茨海默前體蛋白質(APP)的編號的序列，這些人家族性突變包括但不限於Glu665Asp(Peacock,等，AnnNeurol.1994Apr;35(4):432-8);Lys/Met670/Asn/Leu(瑞典)(Mullan,等，NatGenet1992Aug;1(5):345-7);Ala673Thr(Peacock,等，Neurology.1993Jun;43(6):1254-6);His677Arg(Janssen,等Neurology.2003Jan28;60(2):235國9);Asp678Asn(Wakutani,等JNeurolNeurosurgPsychiatry.2004Jul;75(7):1039-42);Ala692Gly(弗蘭德)(Kumar-Singh等，AmJPathol.2002Aug1;161(2)-.507-520);Glu693Gly(北極)Kamino,等，AmJHumGenet.1992Nov;51(5):998-1014);Glu693Gln(荷蘭)(VanBroeckhoven等Science.1990Jun1;248(4959):1120陽2);Glu693Lys(義大利)(Tsubuki,等，Lancet.2003Jun7;361(9373):1957-8);Asp694Asn(愛荷華)(Grabowski,等，AnnNeurol.2001Jun;49(6):697-705);Ala713Thr(Carter,等，NatGenet.1992Dec;2(4)-.255-6);Ala713Val(Jones,等，NatGenet.1992Jul;1(4):306-9)。如上所示，"X"可以是諸如甲石克氨酸。另外，本發明包括分離的核酸分子，其編碼與式[X+Y]所示的蛋白質有至少70%胺基酸序列同一性的P-澱粉樣蛋白，其中"X"含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自曱硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而"Y"包含天然澱粉樣P蛋白質胺基酸序列的全部或部分。"X"和"Y"可如上定義。本發明還包括含分離的核酸分子的載體以及含該載體的宿主細月包。另外，本發明涵蓋製備與式[乂+Y]所示的蛋白質有至少70%胺基酸序列同一性的純化的P-澱粉樣蛋白的方法，其中"X"包含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自曱硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而"Y"包含天然澱粉樣P蛋白質胺基酸序列的全部或部分。該方法包括以下步驟a)將編碼上述P-澱粉樣蛋白的核酸分子轉染入載體;和b)用一段時間並在足以由宿主細胞表達P-澱粉樣蛋白的條件下將步驟a)的所述載體轉化入宿主細胞。宿主細胞可以是原核(例如，大腸桿菌、桿菌、鏈球菌或乳酸菌)或真核細胞(例如，昆蟲細胞、酵母細胞或哺乳動物細力包)的。而且，本發明包括結合和/或由如上所述P-澱4分樣蛋白Met形式的分離的抗體。它可以是單克隆或多克隆的。優選它是單克隆的並是人或人源化的。該抗體可具有至少0.50微摩爾的特異結合常數(Kd)、每摩爾大於-30千焦耳的結合焓和/或每個澱粉樣球聚體至少一個抗體的抗體與澱粉樣球聚體結合率。(重要的是，應注意到，該抗體也可結合抗原(例如，AP(1-42)或AP(1-40))的非Met形式)。另外，本發明包括治療或預防需要治療或預防的患者中的阿耳茨海默氏病的方法該方法包括向所述患者以足以實現所述治療或預防的量給藥上述分離的抗體。抗體可以以任何合適的治療途徑給藥，包括如，月幾肉內、l爭月永內或皮下。另外，本發明包括分離的Met-P-澱粉樣肽寡聚物，其包含1)鏈內反平行方向的殘基19至21和殘基30至32和2)鏈間平行方向的殘基34-38。寡聚物還包含對於選自以下的原子對具有分子內質子間距為約1.8-6.5埃的A-P(1隱42)肽F19(麗)-I32(NH),F19(NH)畫I32(HB),F19(NH)-132(HG絲)，A21(NH)畫A30(NH),A21(NH)-A30(HB#),A21(nh)-131(hd1#),a21(nh)-131(hg1弁)，132(nh)-f19(hd弁)，132(nh)-F19(HB弁)和A30(NH)畫A21(HB#)。本發明另外包括分離的Met-P-澱粉樣肽寡聚物，其中寡聚物包含對於選自以下的原子對肽鏈A和肽鏈B間分子間質子間距為約1.8-5.5埃的a隱P(l-42)肽g33(nh)-g34(nh)，m35(nh)-v36(nh),g37(nh)-G38(NH),G33(NH)-V18(CYH3),V18(麗)-V18(CYH3),L34(NH)-L34(C5H3)，M35(NH)-V36(CyH^),G38(NH)-V39(C^H3)和V39(NH)-V39((CYH3)。寡聚物還包含分子內反平行P摺疊，其至少含殘基19-21和30-32和原子對{f19co,132n}，{132co,f19n}，{a21co,a30n}，和(A30CO,A21N)，而且距離為3.3+0.5A,其中CO表示主鏈氧原子，而且所述殘基的phi(小)角範圍為-180至-30和所述殘基的psi(cl))角範圍為約60至180或約-180至-150。另外，本發明包括分離的Met-P-澱粉樣寡聚物，其中寡聚物包含分子間平行P摺疊，其至少含至少兩種P-澱粉樣肽(標記為A和B)的殘基34-38,其中以下原子對(G33CO(A),L34N(B)〉，(L34CO(B),M35N(A)},{M35CO(A),V36N(B)),{V36CO(B),G37N(A)},和(G37CO(B),G38N(A))(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0.5A,而且所述殘基的phi((p)角範圍為-180至-30和所述殘基的？31(40角範圍為60至180或-180至-150。另外，本發明包括另一種結合至少一種P-澱粉樣N-Metl-42寡聚物的分離的抗體。該寡聚物可選自如(a)分子內反平行P摺疊，其至少含殘基19-21和30-32,其中以下原子對{F19CO,132N},(132CO,F19N):{A21CO,A30N},和(A30CO,A21N}(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0.5A,而且所述殘基的phi(cp)角範圍為-180至-30和所述殘基的psi(40角範圍為約60至180或-180至-150;和(b)分子間平行P摺疊，其至少含至少兩種P-澱粉樣肽(標記為A和B)的殘基34-38,其中以下原子對{G33CO(A),L34N(B)},{L34CO(B),M35N(A)},{M35CO(A),V36N(B)}，{V36CO(B),G37N(A)}，和(G37CO(B),G38N(A))(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0.5A,而且所述殘基的phi(cp)角範圍為-180至-30和所述殘基的psi(4))角範圍為約60至180或-180至-150。該抗體-寡聚物複合物具有包含至少兩種N-Met1-42P-澱粉樣肽的3維結構，其依次包含任何圖20和21所示的物理i午可的構象。(該抗體也可結合抗原的非Met形式以及Met和非Met形式的截短部分。)另外，本發明包括純化的含Met的球聚體，其包含至少兩種上述分離的P-澱粉樣蛋白以及結合純化的球聚體的分離的抗體。對於與診斷應用相關的，本發明包括診斷懷疑患有該疾病的患者中阿耳茨海默氏病的方法。該方法包括如下步驟a)從患者中分離生物樣品；b)用一段時間並在足以形成球聚體/抗體複合物的條件下，使生物樣品接觸一種或多種分離的抗體；和c)檢測樣品中球聚體/抗體複合物的存在性，存在複合物表示所述患者中診斷出阿耳茨海默氏病。本發明還包括診斷懷疑患有該疾病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括如下步驟a)從患者中分離生物樣品；b)用一段時間並在13足以形成抗體/球聚體複合物的條件下使生物樣品接觸含Met形式的球聚體；c)用一段時間並在足以使綴合物結合結合的抗體的條件下，將綴合物加入得到的抗體/球聚體複合物，其中綴合物包含與能產生可檢測信號的信號產生化合物相連的抗體；和d)通過檢測信號產生化合物產生的信號來檢測可能出現於生物樣品中的抗體的存在性，信號表示患者中診斷出阿耳茨海默氏病。本發明還包括診斷懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括以下步驟a)從患者中分離生物樣品；b)用一段時間並在足以形成抗體/純化的球聚體複合物的條件下，使所述生物樣品接觸上述含Met形式的球聚體；和c)檢測樣品中抗體/純化的球聚體複合物的存在性，存在複合物表示患者中診斷出阿耳茨海默氏病。另外，本發明包括另一種診斷懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括以下步驟a)從患者中分離生物樣品；用一段時間並在足以形成抗抗體/抗體複合物的條件下，使生物樣品接觸特異於樣品中抗體的抗抗體；b)用一段時間並在足以使綴合物結合結合的抗體的條件下，將綴合物加入得到的抗抗體/抗體複合物，其中綴合物包含與能產生可檢測信號的信號產生化合物相連的含Met的球聚體；和c)檢測信號產生化合物產生的信號，信號表示患者中診斷出阿耳茨海默氏病。本發明還包括疫苗，其包含上述純化的Met-P-澱粉樣蛋白和藥學上可接受的佐劑。另外，本發明包括疫苗，其含由純化的Met-P-澱粉樣蛋白產生的或結合蛋白質的抗體、和藥學上可接受的佐劑。另外，本發明還包括預防或治療需要預防或治療的患者中的阿耳茨海默氏病的方法，其包括向患者以足以實現預防或治療的量給藥上述疫苗的步驟。另外，本發明包括鑑定治療或預防阿耳茨海默氏病的化合物的方法。該方法包括以下步驟a)用一段時間並在足以使一種或多種化合物結合或中和純化的球聚體的條件下，將一種或多種感興趣的化合物暴露於上述含Met的純化的球聚體；和b)鑑定那些結合或中和純化的球聚體的化合物，鑑定出的化合物用於治療或預防阿耳茨海默氏病。而且，本發明包括設計用於治療或預防患者中的阿耳茨海默氏病的小分子的方法該方法包括如下步驟a)分析諸如上述純化的含Met的球聚體、上述分離的含Met的P-澱粉樣蛋白組合物、或分離的含Met的P-澱粉樣蛋白組合物組裝體的蛋白質的3維結構；b)鑑定步驟a)選出的蛋白質表面上的一種或多種表位；和c)設計結合步驟b)鑑定出的表位的小分子，所述小分子用於治療或預防阿耳茨海默氏病。本發明還包括鑑定用於治療或預防阿耳茨海默氏病的單克隆抗體的方法。該方法包括如下步驟a)用一段時間並在足以4吏一種或多種單克隆抗體與所述球聚體結合併形成球聚體/抗體複合物的條件下，使上述純化的含Met的球聚體暴露於單克隆抗體文庫；b)鑑定球聚體/抗體複合物的存在性；和c)確定一種或多種帶有複合物的抗體的同一性，所述一種或多種抗體用於治療或預防阿耳茨海默氏病。另外，本發明包括穩定含Met的(或不含Met的)Met-澱粉樣P(1-42)寡聚物或其部分的樣品的方法，其包括的步驟為用一段時間(即，1-2小時)並以足以實現所述穩定的量(即，5%水懸浮液或溶液)將烷基鏈去汙劑或'液體力口入才羊品0本發明還包括純化的含Met的球聚體，其含至少兩種上述分離的澱粉樣P蛋白質。另外，本發明涵蓋分離的抗體，其結合圖21所示蛋白質的胺基酸殘基E22-D23-V24-G25-S26-N27-K28。本發明還包括該表位本身。該序列可進一步在K28之後包含G29。另外，本發明包括至少圖21的蛋白質的始於第A21位的2、3、4、5、6、7、8、9或10個連續的胺基酸。另外，應當注意到，該表位可以在除了上述Met形式的Ap蛋白質之外的非Met形式的AP(l-42)蛋白質和Ap(l-40)蛋白質中找到。另外，必須注意到，預計由於微生物中存在天然蛋白酶，大腸桿菌中小肽的表達(如本發明的那些)會迅速降解。可是，本發明顯示，曱硫氨酸形式的澱粉樣P蛋白質在宿主細胞表達中仍舊完全完整，而且另外的特徵有，產生的蛋白質包含由被稱為APP的澱粉樣前體蛋白編碼的精確胺基酸序列。附圖簡述圖l(A)圖示了編碼e-澱粉樣肽的基因的DNA序列(SEQIDNO:l)。克隆所用的核苷酸限制性位點顯示了但沒有包括在設計的引物15中。顯示了起始的Met(ATG)和終止密碼子(TGA)。圖1(B)顯示了衍生自澱粉樣前體蛋白質(APP)體內加工過程的天然澱粉樣P(1-42)蛋白的胺基酸序列(SEQIDNO:2)。圖2圖示了多種形式的含天然N-末端曱硫氨酸的澱粉樣P肽或蛋白質，其從天然序列(包括已知的突變變體)殘基40至44(SEQIDNO:3=1-39,SEQIDNO:4=1-40,SEQIDNO:5=1-41,SEQIDNO:6=1-42和SEQIDNO:7=l隱43)延伸出。圖3代表重組澱粉樣|3的純化方案。圖4代表重組Met澱粉樣P1-42的MALDI質譜。肽的理論分子量是4645Da。觀察到的值是4648Da。3Da的差異在儀器精度限制之內。圖5圖示了ELISA結果，其證實了小鼠單克隆抗體A的選擇性超過針對由重組澱粉樣蛋白(序列Met-AP1-42)製備的球聚體的小鼠單克隆抗體B。圖6圖示了ELISA測試的結果，其比較了小鼠單克隆抗體A、小鼠單克隆抗體B、小鼠單克隆抗體C和針對由重組澱粉樣蛋白(序列Met-AP1-42)製備的球聚體的小鼠單克隆抗體的結合性。圖7圖示了ELISA測試的結果，其比較了小鼠單克隆抗體A、小鼠單克隆抗體B、小鼠單克隆抗體C和針對由重組澱粉樣蛋白(序列Met-AP1-42)製備的球聚體截短序列殘基20-42的小鼠單克隆抗體D的結合性。圖8概述了用合成的澱粉樣肽或重組全長澱粉樣肽製備球聚體中所用的步驟。圖9描述了由合成的Bachem肽(l-42)或重組MetA-(3(Metl-42)製備的球聚體的各種凝膠上樣量的SDS-PAGE凝膠(帶有分子量標準)。圖IO描述了流體力學分析(沉積速度和動態光散射(DLS))由重組MetA-Pl-42製備的球聚體的結果。圖11描述了由重組MetA-P1-42製備的球聚體或購自SigmaChemicalCo.(St.Loms,MO)的金納米球的有代表性的原子力顯微鏡(AFM)圖像。僅對於邊緣圖像，最銳利的特徵越亮。圖像越暗，特徵越接近於雲母晶片基質表面的表面。圖12至14描述了在沒有SDS(圖15)、有0.05。/oSDS(圖16)和0.2%SDS(圖17)時顯現的球聚體(30微克/mL單體澱粉樣蛋白濃度)的有代表16性的AFM圖像。在每幅圖中，左:高度圖，右，邊緣圖。最高(左)和最銳利(右)的特徵在每幅圖中(分別)較亮。圖像越暗，特徵越接近於雲母晶片基質表面的表面。圖15圖示了單克隆抗體A與由重組MetA-P1-42製備的球聚體的結合結果。結合直接通過等溫滴定熱量測定法(ITC)來測量。在該例子中，熱量計小室含86微摩爾(基於單體單位)濃度的澱粉樣P。用A抗體滴定為132微摩爾。兩者都是在含35mMNaCl的5mM磷酸鈉緩衝液(pHT4)中。擬合的解離常數(結合的Kd)為490納摩爾(或0.^uM),觀察到的結合焓是-47.5千焦耳/摩爾，而且表觀結合化學計量是每個抗體分子6.3個澱粉樣P分子。結合流體力學分析，該結果提示每個球聚體單位有兩個全長抗體組合位點。圖16描述了含15:^-標記的N-MetAP1-42的90%H2O/10%D20溶液(A欄)和交換成100%D20溶液一天之後(B欄)的"N"H異核單量子關聯能譜法(HSQC)圖譜。圖n(A)代表N-met澱粉樣P肽1-42的序列。用NMR鑑定的兩條P鏈加了框(SEQIDN0:8)。圖17(B)代表分析NMR數據的鏈間NOE而筌定出的AP1-42反平行P摺疊(SEQIDN0:9)(aas28-39);SEQIDNO:10(aas17-23))。圖18描述了基於固態NMR和觀察到的混合了本文所述球聚體的平行/反平行結構途徑的以前推測平行P-摺疊纖維結構途徑(Sciaretta等，Biochemistry2005,44:6003-6014)間的顯著結構差異。圖19描述了據信是通過SDS(約1.5%)中溶液狀態的NMR觀察到的最小球聚體種類的(1-2nm高)並混合有些微較大(4-5nm)完全球聚體的AFM圖。僅對於邊緣圖像；最銳利的特徵越亮。圖像越暗，特徵越接近於雲母晶片基質表面的表面。圖20概述了N-MetAP1-42樣品上獲得的NMR數據。虛線表示用混合樣品([U-15N2H]4^e^^^p[U-14N,2H]-標記的樣品，以1:1比率混合)在"N-過濾的和"N-編輯的3DNOESY實驗中觀察到的分子間NH-NHNOE。箭頭實線表示用混合樣品([U-15N,2H]-標記的樣品以1:1比率與含選擇性IVL殘基的13C-標記的質子化曱基的[U，N,2H]-標記的樣品混合)在"N-解析的3DNOESY實驗中觀察到的側鏈由NH至曱基(箭頭)的NOE。實線表示用帶有2H背景中lie,Val,Leu殘基的選擇性"C-標記的質子化曱基的統一"N-標記的樣品在"N-解析的3DNOESY實驗中觀察到的分子內NH-NHNOE。箭頭虛線表示用[U-15N]國標記的樣品在"N-解析的3DNOESY實驗中觀察到的分子內NOE。用圈表示在NH/ND交換實驗中顯示出慢交換的主鏈醯胺。圖21描述了與NMR數據一致的N-Met-P-澱;盼樣肽1-42重複單位的結構才莫型。用帶有程序CNX(Brunger等，ActaCrystallogr.D54(Pt5),905_21(l"8))和來自本文分析的NMR數據的NOE衍生的距離約束的模擬退火規程來計算結構。帶狀圖所示的殘基對應於黑色的殘基。圖22描述了球聚體中3個"假設的"較高階排列的澱粉樣肽相互作用，其發源於溶液中觀察到的三聚、四聚或五聚中間體形式(圖12,SDS膠)。較高階聚集也如本文所述般聚集，而且通過流體力學而被觀察到。這些排列基於由分子間聚集和永久形成平行澱粉樣肽P摺疊纖維的驅動力形成的沿著C-末端平行摺疊區域而存在的分子間相互作用(參見圖20)。這不是指要限制其他潛在排列的澱粉樣肽或暗示它們不存在。圖23描述了有代表性的支撐由體外所見的鏈內和鏈間P摺疊相互作用混合體向澱粉樣構象轉變轉換的Met-A-P1-42樣品的圖表和原子力和電子顯微圖(參見圖s20和21)。球聚體在存在上述SDS或脂肪酸時形成並其中實際有上述SDS或脂肪酸存在。如本圖所示，描繪了SDS。必須闡明包圍球聚體結構的SDS的精確方向。轉換發生在鏈內反平行P-摺疊相互作用打開並形成完全平行摺疊從而導致澱粉樣纖維形成的時候。形成的纖維和反平行區域"打開"後產生的聚集形式的肽在圖中AFM和TEM圖片中一皮觀察到。4支低的TEM圖片描述了有代表性的切片，其帶有尺度y二260nm,x=372nm。觀察到的纖維寬度為6nm。如前述製備純化的Metl-42球聚體樣品。Metl-42終濃度為0.03mg/mL並用2%乙酸鈾醯染色，用於通過傳遞電子顯擺吏4竟(TEM)以337,500X放大倍率成像。較低的AFM圖像描述了有代表性的切片，其帶有尺度y=250nm,x=500nm。圖像顯示觀察到種類分散場。如前述製備純化的Metl-42球聚體樣品。Metl-42初濃度為1.1mg/mL,在納米級純水中以20:1稀釋(最終0.055mg/mL),並於4C溫育2+周。在新切開的雲母晶片上沉積20uL並溫育5-8分鐘，然後用600uL納米級純水沖洗雲母晶片並進行AFM掃描。如圖X和Y所示，.球聚體選擇性抗體選擇性結合帶有混合的分子內反平行p摺疊(約為殘基18-33)和平行P摺疊(約為殘基34-39)的肽中產生的表位。造成體外形成球聚體的機理或多個機理與體內觀察到的那些有區別。圖24描述了本發明觀察到的球聚體P-澱粉樣成分的坐標。坐標用於P-澱粉樣肽N-Metl-42球聚體的二聚成分模型。一種分子的序列編號是15-42,而另一種分子的序列編號是115-142。圖25圖示了球聚體(B欄)和原纖維(C欄)形式的澱粉樣P肽的主鏈醯胺保護性的比較。圖26圖示了用C"-SDS使SDS與AP球聚體的結合。圖27圖示了表示成其N-末端Met形式的人家族性突變的阿耳茨海默肽。發明詳述本發明涉及重組形式的澱粉樣P蛋白質以及其製備方法。更具體地，本發明包括式[X十Y]所示的澱粉樣P蛋白質，其中"X"包含肽氨基或N-末端胺基酸序列選自甲硫氨酸(Met)、纈氨酸(VaI)和亮氨酸(Leu)的一種或多種胺基酸。"X"包含優選Met。另外，"Y"代表肽內除了"X"胺基酸或氨基末端的酸的胺基酸數量。特別是，"Y"代表39-43的整數並代表天然澱粉樣P(1-42)胺基酸序列的部分或全部。按照天然胺基酸選擇的38-43範圍內的數，該胺基酸序列起始於任何胺基酸"數"或位於天然1-42序列(例如，胺基酸1,胺基酸5，胺基酸12,胺基酸22,胺基酸35等)內並終止於任何胺基酸數或位於天然序列內。本發明蛋白質的其他性質包括能結合如圖X-Y所示的抗體。結合特徵是l)Kd小於或等於OJO微摩爾；2)有利結合焓(負△H)大於每摩爾負30千焦耳；和3)抗體與澱粉樣蛋白結合率為至少每個澱粉樣球聚體一個抗體。除了本發明的胺基酸序列或蛋白質，本發明還包括胺基酸序列，其包含、對應於、等同於、或互補於有至少約70%、優選至少越80%、並更優選至少約90%同一性的本發明蛋白質的胺基酸序列。(此外，所有介於70%和100%的整數(和其分數)也一皮認為是在本發明涉及同一性百分數的範圍內)。應當注意到，本發明還涵蓋分離的核苷酸序列，其編碼本發明蛋白質以及那些具有包含、對應於、等同於、或互補於有至少約70%、優選19至少越80%、並更優選至少約90%同一性的這些編碼核苷酸序列的序列。(所有介於70%和100%的整數(和其分數)也祐匸認為是在本發明涉及同一性百分數的範圍內)。這類序列可衍生自任何來源，分離自天然來源、通過半合成途徑生產、或重新合成。特別是，這類序列可分離或衍生自實施例所述之外的來源(例如，細菌，真菌，藻類，小鼠或人)。為了本發明的目的，核苷酸序列"片段"被定義為對應於特定核苷酸序列區域的約至少6、優選至少約8、更優選至少約10個核苷酸、並更優選至少約15核苷酸的連續序列。術語"同一性"指在一個核苷酸對一個核苷酸的基礎上通過特定比較窗或片段得到的兩個序列的相關性。因此，同一性被定義為兩個DNA片段(或兩個胺基酸序列)相同鏈(正義或反義)間的相同、相應或相等程度。"序列同一性百分數"的計算是比較兩個特定區域上優化排列的序列，確定相同鹼基或胺基酸在序列中出現的數量從而得到匹配的位置數，將這些位置數除以比較的片段中位置總數並將結果乘100。優化排列序列可通過Smith&Waterman,Appl.Math.2:482(1981)的算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的算法、Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988)的方法和實現相關算法的電腦程式(例如，ClustalMacawPileup(http:〃cragm.stanford.edu/biochem218/UMultiple.pdf;Higgms等，CABIOS.5L151-153(1989》，FASTDB(Intelligenetics),BLAST(NationalCenterforBiomedicalInformation;Altschul等，NucleicAcidsResearch25:3389-3402(1997》,PILEUP(GeneticsComputerGroup,Madison,WI)或GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,Madison,WI).(參見美國專利5,912,120)來進行。為了本發明的目的，"互補性"被定義為兩個DNA片段間的相關程度。在適合形成雙螺旋的條件下，測定一個DNA片段的正義鏈與另一個DNA片段反義鏈雜交的能力，來確定它。"互補"被定義為根據規範鹼基配對身見則與給定序列配對的序列。例如，一個核苷酸鏈中的序列A-G-T"互補"於另一個鏈中的T-C-A。在雙螺旋中，腺。票呤出現於一條鏈中，胸腺嘧啶出現於另一條鏈中。相似地，在鳥噤P令在一條^T連中一皮找到時，^^嘧。定出現於另一條中。兩個20DNA片段核苷酸序列間相關性越大，兩個DNA片段間形成雜合雙聚體的能力越大。2個胺基酸序列間的"相似性"被定義為在兩個序列中存在一系列相同和保守的胺基酸殘基。2個胺基酸序列間的相似程度越高，這2個序列的相應、相同或相等性越高。("2個胺基酸序列間的同一性^l定義為在兩個序列中存在一系列完全相同或不可變的胺基酸殘基。)"互補性"、"同一性"和"相似性"的定義是所屬領域普通技術人員已知的。"編碼的"指編碼多肽序列的核酸序列，其中多肽序列或其部分包含核酸序列編碼的多肽的至少3個胺基酸、更優選至少8個胺基酸、並更優選至少15個胺基酸的胺基酸序列。另外，核酸分子與另一個核酸分子"雜交"，這時，單鏈形式的核酸分子能在合適的溫度和離子強度條件下能與另一個核酸分子退火(參見Sambrook等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork))。溫度和離子強度條件確定了雜交的"嚴緊性"。本文所用的術語"雜交"一般用於指核酸在合適的嚴緊性條件下的雜交，根據探針序列和靶序列的性質，這對所屬領域技術人員來說是^^艮顯而易見的。雜交和洗滌條件是現有公知的，而且能容易實現條件調節，這取決於各種溶液的溫育時間、溫度和/或離子強度所期望的嚴緊性。參見如上述的Sambrook等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989),ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork和本文參考的那些(也可參見ShortProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等編和Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,"OverviewofprinciplesofHybridizationandthestrategyofNucleicAddassays"(1993),都納入本文參考。)具體地，通過雜交序列長度(特別是探針序列長度)、核酸的相對G-C含量和允許的錯配量來規定條件的選擇。期望在具有較低互補程度的鏈間雜交時，優選低嚴緊條件，期望完美或接近完美的互補時，優選高嚴緊條件。對於典型的高嚴緊條件，雜交溶液含6XS.S.C,O.OlMEDTA、lxDenhardt氏溶液和0.5%SDS。對克隆的DNA片段，在約68攝氏度下進行雜交3至4小時，而對總真核DNA,進行約12至約16小時。對於中等嚴緊性，人們可利用濾膜預雜交，並與3X氯化鈉、種檬酸鈉(SSC)、50%曱醯胺(佔該緩衝液的0.1M,pH7.5)和5XDenhardt氏溶液的溶液雜交。然後，人們可在37攝氏度預雜交4小時，然後在37攝氏度與總量等於3,000,000cpm的標記的探針雜交16小時，然後在2XSSC和0.P/。SDS溶液中洗滌，於室溫洗4次，每次1分鐘，並在60攝氏度洗4次，每次30分鐘。接著乾燥，將其暴露於膠片上。對於低嚴緊性，雜交溫度降至雙聚體溶解溫度(Tm)下約12攝氏度。已知Tm是G-C含量和雙聚體長度以及溶液離子強度的函數。"雜交"需要兩個核酸包含互補序列。可是，根據雜交嚴緊性，會發生鹼基間錯配。如上所示，適於雜交核酸的嚴緊性取決於核酸長度和互補程度。這些變化是現有公知的。更具體地，2個核苷酸序列間相似或同源性程度越大，雜交具有那些序列的核酸的Tm值越大。為了雜交長度大於100核香酸的，已經可用計算Tm的方程(參見Sambrook等，同上)。為了與較短的核酸雜交，錯配位置變得更重要，而且寡核苷酸長度決定其特異性(參見Sambrook等，同上)。本文所用的"分離的核酸片段或序歹'J"是單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，其任選包含合成的、非天然的或改變的核苷酸鹼基。DNA多聚體形式的分離的核酸片段包含一種或多種cDNA、基因組DNA或合成的DNA片段。(特定多聚核苷酸"片段"指多聚核苷酸序列，其包含與特定核苷酸序列區域相同或互補的約有至少約6個核苦酸、優選至少約8個核苷酸、更優選至少約10核苷酸、並更優選至少約15個核苷酸、和最優選至少約25個核苷酸的連續序列。)核苷酸(通常在它們的5'-單磷酸形式中被找到)根據單字母命名而被稱作以下名稱"A"為腺苷酸或脫氧A泉苷酸(分別4十對RNA或DNA),"C'為力包嘧咬核苦酸或脫氧力包嘧啶核苷酸，"G"為烏噪呤核香酸或脫氧鳥噤呤核苷酸，"U"為尿苷酸，'T'為胸腺嘧啶核苷酸，"R"為噤呤(A或G),"Y"為嘧啶(C或T),"K"為G或T，"H"為A或C或T,T'為次黃噪呤核苷，和"N"為任意核苦酸。術語"功能等價的片段或亞片段"和"功能等價片段或亞片段"在本文中可互換使用。這些術語指分離的核酸片段的部分或亞序列，其保留改變基因表達或產生某種表型的能力而無論片段或亞片段是否編碼活性酶。術語"同源性"、"同源的"、"基本相似"和"基本相應"在本文中可互換使用。它們指核酸片段，其中一種或多種核苷酸鹼基中的變化不影響核酸片段介導基因表達或產生某種表型的能力。這些術語也指本發明核酸片段的修飾，如缺失或插入一種或多種核苷酸，其相對於最初、未修飾的片段，基本不改變所得的核酸片段的功能性質。因此可理解，所屬領域技術人員將認識到本發明涵蓋的大於特定示例性的序列。"基因"指表達特定蛋白質的核酸片段，包括調解序列前(5'非編碼序列)和後(3'非編碼序列)的編碼序列。"天然基因"指與其自身調節序列一起天然能找到的基因。相反，"嵌合構建體"指核酸片段的組合，其正常情況下不會天然在一起。因此，嵌合構建體可包含衍生自不同的來源的調節序列和編碼序列、或衍生自相同的來源但以不同於正常情況下能天然找到的方式排列的調節序列和編碼序列。(術語"分離的"指從其天然環境取出序列。)"外來"基因指通常宿主生物中找不到的基因，但其可通過基因轉移導入宿主生物中。by.外來基因可包含插入到非天然生物、或嵌合構建體中的天然基因。"轉基因"是通過轉化過程導入基因組中的基因。"編碼序列"指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。"調節序列"指位於編碼序列上遊(5'非編碼序列)、之內、或下遊(3'非編碼序列)的核苷酸序列，而且其能影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性、或翻譯。調節序列可包括但不限於，啟動子、翻譯前導序列、內含子、和聚腺苷化識別序列。"啟動子"指能控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。啟動子序列由最接近的和較末梢的上遊元件組成，後面的元件通常^L稱為增強子。因此，"增強子"是DNA序列，其能刺激啟動子活性並可以啟動子的天然元件或插入增強啟動子水平或組織特異性的異種元件。啟動子序列也可位於基因的轉錄部分內、和/或轉錄序列的下遊。啟動子可完整地源自天然基因，或包含源自發現的不同天然啟動子的不同元件，或甚至可包含合成的DNA片段。所屬領域技術人員能理解，不同的啟動子可在不同的組織或細胞類型中、或在不同的發育階段、或在響應不同環境條件時指導基因表達。使基因在多數宿主細胞類型中在大多數情況下表達的啟動子通常被稱為"構成型啟動子"。進一步認識的是，由於在多數情況下，調節序列的確切界限不能完全確定，因此有一些變化的DNA片段可具有相同的啟動子活性。23"內含子"是基因中間隔序列，其不編碼蛋白質序列部分。因此，這類序列轉錄成RNA,但是然後被切割而不被翻譯。該術語應用於切掉的RNA序列。"外顯子"是基因序列部分，其被翻譯並在源於基因的成熟的信使RNA中被找到，但不必是編碼最終基因產物的序列部分。"翻譯前導序列"指位於基因啟動子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導序列出現在翻譯起始序列的完全加工的mRNA上遊。翻譯前導序列可影響初級轉錄子向mRNA的加工、mRNA穩定性或翻譯效率。已經描述了翻譯前導序列的例子(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)MolecularBiotechnology3:225)。"3'非編碼序列"指位於編碼序列下遊的DNA序列，而且包括聚腺苷化識別序列和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達的調節信號的序列。聚腺苷化信號的特徵通常在於影響聚腺苷酸鏈加到mRNA前體的3，末端。Ingelbrecht等，PlantCell1:671-680(1989)例示了使用不同的3'非編碼序列。"RNA轉錄子"指RNA聚合酶催化轉錄DNA序列而得的產物。當RNA轉錄子是DNA序列完美互補拷貝時，它一皮稱為初級轉錄子，或它可以是衍生自轉錄後加工的初級轉錄子的RNA序列並一皮稱為成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"指沒有內含子而且可有細胞翻i奪成蛋白質的RNA。"cDNA"指互補於並用反轉錄酶合成自mRNA模板的DNA。CDNA可以是單鏈的或利用DNA聚合酶I的Klenow片段轉化成雙鏈。"正義"RNA指包括mRNA並可在細胞中或在體外翻譯成蛋白質的RNA轉錄子。"反義RNA"指互補於全部或部分耙初級轉錄子或mRNA並阻斷粑基因表達的RNA轉錄子(美國專利5,107,065)。反義RNA的互補可以在特定基因轉錄子的任何部分內，即在5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子，或編碼序列中。"功能性RNA"指反義RNA、核酶RNA、或不可翻譯但對細胞過程有影響的RNA。術語"互補"和"反互補"在涉及mRNA轉錄子時可在本文中互換使用，並指定義信使反義RNA。術語"內源RNA"指用本發明重組構建體(無論天然產生的或非天然產生的，即通過重組方式、誘變等到入的)轉化前由出現在宿主基因組中任何核酸序列編碼的任何RNA。術語"非天然產生的"指人工的，與在正常情況下能天然找到的不一致的。術語"可操作相連的"指核酸序列相連在核酸片段上，由此一個的功能由另一個調控。例如，啟動子可操作相連於編碼序列，這時它能調節那個編碼序列的表達(即，編碼序列在啟動子的轉錄控制之下)。編碼序列能以正義或反義方向可操作相連於調節序列。在另一個實施例中，本發明的互補RNA區域能直接或間接地可操作相連於靶mRNA5'、或靶mRNA3'、或靶mRNA內，或者第一互補區域在輩巴mRNA5，而其互補在3'。本文所用的術語"表達"指產生功能性最終產物。表達基因包括轉錄基因和翻譯mRNA成前體或成熟蛋白質。"反義抑制"指產生能抑制靶蛋白質表達的反義RNA轉錄子。"共抑制"指產生能抑制表達相同或基本相似外來或內源基因的正義RNA轉錄子(美國專利5,231,020)。"成熟"蛋白質指翻譯後加工的多肽；即，初級翻譯產物中出現的任何前體或原肽去除而得的一個。"前體"蛋白質指mRNA的初級翻"^產物；即，其中前體或原肽仍存在。前體或原肽可以是但不限於細胞內定位信"穩定轉化"指將核酸片段轉化進宿主生物基因組，形成遺傳性穩定遺傳。相反，"瞬時轉化"指將核酸片段轉化進宿主生物的核、或含DNA的細胞器，導致基因表達而不整合或穩定遺傳。含轉化的核酸片段的宿主生物被稱為"轉基因"生物。本文所用的術語"轉化"指穩定轉化和瞬時轉化。本文所用的標準重組DNA和分子克隆技術是現有^^知的並完全描述於Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,1989(後文的"Sambrook")。術語"重組"指兩種不同方式分裂的序列片段的人工組合，例如，通過化學合成或通過基因工程技術操縱分離的核酸片段而組合。"PCR"或"聚合酶鏈式反應"是合成大量特定DNA片段的技術，其有一系列重複循環組成(PerkinElmerCetusInstruments,Norwalk,CT)。通常，雙鏈DNA被熱變性，兩個互補於靶片段3'邊界的引物低溫退火，然後中等溫度延伸。一組這3個連續步驟被稱為循環。聚合酶鏈式反應("PCR")是通過重複複製模板在短期內用於擴增DNA幾百萬倍的有力技術。(Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263-273(1986);Erlich等，歐洲專利申請50,424;歐洲專利申請84,796;歐洲專利申請258,017;歐洲專利申請237,362;Mullis,歐洲專利申請201,184;Mullis等，美國專利4，683,202;Erlich,美國專利4,582,788;和Saiki等，美國專利4,683,194)。該過程使用特定體外合成寡核苷酸組來引發DNA合成.引物的設計取決於要分析的DNA序列。通過續斷高溫熔解^f莫板、讓引物與^t板中的互補序列技術退火、然後用DNA聚合酶複製模板的許多循環(通常為20-50個)，來實現該技術。PCR反應的產物通過瓊脂糖凝膠分離接著溴乙錠染色並用UV透視觀察來分析。或者，可將放射性dNTP加入PCR從而使標記整合入產物。在該情況中通過將凝膠在x射線膠片上曝光來使PCR產物可見。放射性PCR產物的額外優點是能定量各擴增產物水平。術語"重組構建體"、"表達構建體"和"重組表達構建體"在本文中可互換使用。這些術語指基因材料的功能單位，其能用所屬領域技術人員公知的標準方法插入細胞基因組中。這類構建體可以自身或與載體協同使方法，這是所屬領域技術人員公知的。例如，可使用質粒。技術人員知道必須在載體上出現以成功轉化、選擇和繁殖含本發明任何分離的核酸片段的宿主細胞的遺傳原件。技術人員也會認識到不同的獨立轉化事件會造成不同水平和才莫式的表達(Jones等，(1985)EMBOJ.4:2411-2418;DeAlmeida等，(1989)Mol.Gen.Genetics228:78-86),因此必須篩選多種事件以獲得展示期望表達水平和模式的系。可通過Southern分析DNA、Northern分析mRNA表達、Western分析蛋白質表達、或表型分析來完成該篩選。一旦分離了編碼感興趣的P-澱粉樣蛋白的核苷酸序列，則可通過使用載體或構建體，將其導入原核或真核宿主細胞，優選是原核宿主細胞，如大腸桿菌。也必須將編碼表達蛋白質N-末端的核苷酸序列導入載體。另夕卜，載體(例如，噬菌體、粘粒或質粒)可包含編碼天然澱粉樣P蛋白質相關部分的核苷酸序列、編碼N-末端的核苷酸序列、以及在宿主細胞中有功能並能引發蛋白質表達的任何調節序列(例如，啟動子)。調節序列(例如，啟動子)可操作地相連、或可操作相連於核苷酸序列。(如果啟動子或調節序列影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子或調節序列如所26述與編碼序列"可操作相連"。)合適的啟動子包括如，T7lac啟動子、T7啟動子、pBAD、tet啟動子、Lac啟動子、Trc啟動子、Trc啟動子和PL啟動子，它們所有都可用於試著在細菌細胞(例如，如大腸桿菌)中表達蛋白質。如果人們利用昆蟲作為宿主細胞，則可利用啟動子，如多角體蛋白、PIO、MT、Ac5和OplE2。如果人們優選在病毒中表達蛋白質，則可使用pCMV、pUbC和pU6作為啟動子。哺乳動物細胞中可用的啟動子包括如，CMV，U6,EF-l,pCMV-2xTet02,pUbC,SV40,b-酪素和RSV。合適的酵母啟動子包括AOXl，GAP,AUG1,GAL1,nmtl,nmt41，nmt81和TEF1。構建體中出現的序列的選擇取決於期望的表達產物以及宿主細胞的性質。如上所述，一旦構建成載體，那麼可通過所屬領域普通技術人員已知的方法，包括如轉染、轉化和電穿孔，來將它導入選擇的宿主細胞中(參見MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，笫1-3巻,編者Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。然後在允許核苷酸序列表達以產生期望的、編碼的、隨後收穫並純化的澱粉樣P蛋白質的合適條件下，培養宿主細胞。合適的原核宿主細胞的例子包括如，細菌(如，大腸桿菌)、桿菌、鏈球菌和乳酸菌。合適的真核宿主細i包例子包括如，昆蟲細力包(例如，SF9,SF21和Hi5)、酵母細胞、S.pombe、哺乳動物細胞和果蠅細胞。宿主細胞中的表達可以瞬時或穩定方式來實現。瞬時表達可由導入的構建體產生，所述構建體包含宿主細胞中有功能的表達信號，但該構建體不複製並4艮少整合入宿主細胞，或在宿主細胞不增殖時。瞬時表達也可通過誘導出與感興趣的基因可操作相連的調節啟動子的活性來實現;但是，這些可誘導系統通常展示出低基本水平的表達。穩定表達可通過道如能整合進宿主基因組或在宿主細胞中自發複製的構建體來實現。通過是用位於或轉染有表達構建體的選擇性標記，然後選擇表達該標記的細胞，來選出穩定表達感興趣的基因。當穩定表達由整合引起時，構建體整合位置可在宿主基因組中隨機產生或能通過使用含與宿主基因組的同源性足以與宿主基因座位革巴重組的區域的構建體而輩巴向。當構建體靶向於內源基因座位，所有或一些轉錄和翻譯調節區域可由內源基因座位提供。也可使用轉基因哺乳動物從而表達感興趣的蛋白質。更具體地，一27旦產生上述構建體，它可被插入胚胎的原核中。然後將胚胎植入受體雌性動物。或者，也可使用核轉移法(Schnieke等，Science278:2130-2133(1997))。然後允許妊娠和分娩(參見如，美國專利5,750,176和美國專利5，700，671)。用作宿主的哺乳動物可選自諸如，小鼠、大鼠、兔、豬、山羊、綿羊、馬和奶牛。可是，由於它能將編碼感興趣的蛋白質的DNA整合入其基因組，可使用任何哺乳動物。除了上述過程，業內人士熟悉標準資料，其描述了特定構建條件和過程、操縱和分離大分子(例如，DNA分子、質粒等)、產生重組生物和篩選和分離可隆，(參見例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1989》Maliga等,MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress(1995);Birren等,GenomeAnalysis:DetectingGenes,1,ColdSpringHarbor,NewYork(1998);Birren等，GenomeAnalysisAnalyzingDNA,2,ColdSpringHarbor,NewYork(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,編.Clark,Springer,NewYork(1997》。本文的術語"AP(X-Y)"指包括X和Y的人澱粉樣P蛋白質的胺基酸位置X至胺基酸位置Y的胺基酸序列，特別是胺基酸序列何天然產生的變體(特別是帶有至少一個選自A2T,H6R,D7N,A21G("弗蘭德")，E22G("北極")，E22Q("荷蘭")，E22K("義大利")，D23N("愛荷華")，A42T和A42V的突變的那些)的胺基酸位置X至胺基酸位置Y的胺基酸序列，其中數值是相對於包括X和Y的AP肽或帶有3個額外胺基酸替換的序列(其都不阻止球聚體形成)的起點的，本文的"額外"胺基酸替換是任何偏離天然發現的規範序列的。更具體地，本文的術語"A|3(l-42)"指包括1和42的人澱粉樣P蛋白質的胺基酸位置1至胺基酸位置42的胺基酸序列，特別是胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA(對應於胺基酸位置1至42)或其任何天然產生的變體(特別是帶有至少一個選自A2T,H6R，D7N,A21G("弗蘭德")，E22G("北極")，E22Q("荷蘭")，E22K("義大利")，D23N("愛荷華")，A42T和A42V的突變的那些)的胺基酸位置1至胺基酸位置42的胺基酸序列，其中數值是相對於包括1和42的AP肽或帶有3個額外胺基酸替換的序列(其都不阻止球聚體形成)的起點的。同樣，本文的術語"AP(l-40)"指包括1和40的人澱粉樣P蛋白質的胺基酸位置1至胺基酸位置40的胺基酸序列，特別是胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV或其任何天然產生的變體(特別是帶有至少一個選自A2T，H6R,D7N，A21G("弗蘭德"),E22G("北極")，E22Q("荷蘭"),E22K("義大利")，D23N("愛荷華")，A42T和A42V的突變的那些)的胺基酸位置1至胺基酸位置40的胺基酸序列，其中數值是相對於包括1和40的AP肽或帶有3個額外胺基酸替換的序列(其都不阻止球聚體形成)的起點的。本文的術語"AP(X-Y)球聚體"(AP(X-Y)球寡聚物)指如上定義的可溶、球狀、非共價連接的AP(X-Y)肽，其具有同質性和獨特物理特徵。AP(X-Y)球聚體是穩定、非纖維狀、寡聚聚合的AP(X-Y)肽，其通過與陰離子去汙劑一起溫育而獲得。與單體和纖維相反，這些球聚體的特徵在於定義的亞單位聚合數(例如，如WO2004/067561所述，早期聚合形式，n=4-6,寡聚物A",而晚期聚合形式，n=12-14,"寡聚物B")。球聚體具有3維球型結構("熔化的小球"，參見Barghorn等，2005,JNeurochem，95,834-847)。它們進一步的特徵在於一種或多種以下特4正:-用混合蛋白酶(如嗜熱菌蛋白酶或內切蛋白酶GIuC)裂解N-末端胺基酸X-23，形成截短的形式的A卩(X-Y)球聚體；國混合蛋白酶和抗體不可接近的C-末端胺基酸24隱Y;-截短形式的這些AP(X-Y)球聚體維持其球聚體構象帶有較佳可接近性的核心表位AP(20-Y)的球聚體3維核心結構。根據本發明和特別是為了評估本發明抗體的結合親和性的目的，本文的術語(X-Y)球聚體"指WO2004/067561(其納入本文參考)所述的過程而得的產物。所述過程包括解除天然、重組或合成的AP(X-Y)肽或其衍生物的摺疊；將至少部分未摺疊的AP(X-Y)肽或其衍生物暴露於去汙劑，減低去汙劑活性並繼續溫育。為了解除肽的摺疊，可使氫鍵裂解劑(例如，六氟異丙醇(HFIP))作用於蛋白質。當作用溫度為約20至50攝氏度(特別是約35至40攝氏度)時，幾分鐘(例如約10至60分鐘)的作用時間就足夠了。接著在混合有水溶性緩沖液(例如，二曱亞碸(DMSO))的合適有機溶劑中溶解經蒸發乾燥(優選是濃縮形式)的殘餘物，產生至少部分未摺疊的肽或其衍生物的懸浮液，用於以後使用。如果需要，在間歇期將儲存懸浮液低溫(例如約-20攝氏度)儲存。或者，肽或其衍生物可置於微酸(優選水溶液)中，例如約10mMHC1水溶液。通常溫育幾分鐘後，離心去除不可溶性成分。一般在10,000g離心幾分鐘。這些方法步驟優選在室溫進行，即溫度範圍為20至30攝氏度。離心獲得的上清含AP(X-Y)肽或其衍生物並可低溫儲存，例如間歇時間儲存在約-20攝氏度。以下暴露於去汙劑涉及寡聚化肽或其衍生物以得到中間體寡聚物(在WO2004/067561中一皮稱為寡聚物A)。為此，讓去汙劑作用於至少部分未摺疊的肽或其衍生物，直至產生足夠的中間體寡聚物。優選要使用離子去汙劑，特別是陰離子去汙劑。根據具體的實施方案，使用式(I):R-X的去汙劑，其中R基為具有6至20個、優選10至14個碳原子的未分支或分支烷基，或具有6至20個、優選10至14個碳原子的未分支或分支鏈烯基，X基為酸性基團或其鹽，其中X優選自-COO—M+、-SCVM+,特別是-OSCVM+,而且M+是氬陽離子、或者無機或有機陽離子，優選自鹼性金屬和鹼土金屬陽離子以及銨陽離子。具有式(I)的去汙劑是有利的，其中R是未分支烷基，必須特別提及的是l-烷基。特別優選十二烷基石黃酸鈉(SDS)。也可以有利地4吏用月桂酸和油酸。去汙劑十二烷醯月幾氨酸的鈉鹽(也稱為肌氨醯NL-30或Gardol)也格外有利。去汙劑作用時間尤其依賴於進行寡聚化的蛋白質是否解摺疊，如果是，還有解摺疊的程度。根據解摺疊步驟，如果預先以氫鍵斷裂試劑(即，特別是以六氟異丙醇)處理蛋白質，當作用溫度約為20至5CTC、特別是約為35至40。C時，數小時範圍內的作用時間是足夠的，有利地為約1至20、特別是約2至10小時的作用時間。如果以較少解摺疊或基本沒有解摺疊的肽或其衍生物為起始點，以相應較長的作用時間為宜。如果肽或其衍生物經過預處理，例如，根據上述步驟的HFIP處理的備選方案，或者將肽或其衍生物直接進行寡聚化，則當作用溫度約為20至50。C、特別是約為35至4(TC時，約5至30小時、特別是約10至20小時範圍內的作用時間足夠了。溫育後，宜通過離心去除不溶性組分。於10000g數分鐘為宜。所選擇的去汙劑濃度取決於所使用的去汙劑。如果使用SDS,濃度範圍為0.01至1%、優選0.05至0.5%重量，例如約0.2%重量，這經證明是有利的。如果使用月桂酸或油酸，略高的濃度是有利的，例如，在0.05至2%、優選O.l至0.5%重量的範圍，例如約0.5%重量。去汙劑作用應在接近於生理範圍的鹽濃度下發生。因此，尤其以50至500mM、優選100至200mM範圍內、特別是140mM的NaCl濃度為宜。接著減小去汙劑作用和持續溫育進一步涉及寡聚化得到本發明的Ap(X-Y)球聚體(在WO2004/067561中被稱為寡聚物B)。由於得自前面步驟的組合物有規律地包含去汙劑和生理範圍的鹽濃度，然後宜降低去汙劑的作用並也優選降低鹽濃度。這可以通過降低去汙劑和鹽的濃度而解決，例如通過稀釋，宜使用水或低鹽濃度緩衝液，例如Tris-HCl(pH7.3)。在約2至10範圍內、有利地在3至8範圍內、特別是約為4的稀釋因子經證明為適宜的。也可以添加中和所述去汙劑作用的物質實現去汙劑作用的降低。這些物質的實例包括能夠絡合去汙劑的物質，像能夠在純化和提取措施過程中穩定細胞的物質，例如特定的EO/PO阻斷共聚物，特別是以商品名Pluronic⑧F68的阻斷共聚物。烷氧基化、特別是乙氧基化烷基酚，例如Tnton⑧X系列的乙氧基化t-辛基酚(特別是TritonX100)、3-(3-(膽醯胺基丙基二曱氨基)-l-丙磺酸鹽(CHAPS⑧)或烷氧基化、特別是乙氧基化山梨聚糖脂肪酯，例如Tween⑧系列的那些，特別是Tween⑧20,在特定的臨界微嚢濃度附近或之上的濃度範圍內。隨後，溫育該溶液直至產生足夠的本發明Ap(X-Y)球聚體。當作用溫度約為20至50°C、特別是約為35至4(TC時，數小時範圍內、優選約10至30小時範圍內、特別是約15至25小時範圍內的作用時間是足夠的。然後可以濃縮溶液，並且可能的殘餘物可以通過離心去除。本文中也證明以10000g數分鐘為宜。離心後獲得的上清液含本發明AP(X-Y)球聚體。本發明A(3(X-Y)球聚體最終可以本來的方式來收穫，如通過超濾、透析、沉澱或離心。如果在變性條件下通過諸如SDS-PAGE電泳分離AP(X-Y)球聚體以產生兩個條帶(如AP(l-42)的表觀分子量為38/48kDa),這是優選的，而且如果分離這兩個條帶前用二醛處理寡聚物來使31之合併成一個，這是尤其優選的。如果大小排阻層析球聚體會形成單峰(例如，AP(l-42)的相應分子量為約60kDa),這也是優選的。始於AP(l-42)肽的所述過程特別適於獲得AP(l-42)球聚體。優選球聚體顯示出與神經元細胞的親和性。優選球聚體也顯示出神經調節效應。根據本發明的另一方面，本文的術語"AP(X-Y)球聚體"指基本由AP(X-Y)亞基組成的球聚體，其中如果12個亞基中平均至少有11個是AP(X-Y)型的，則這是優選的，如果小於10%的球聚體包含任何非AP(X-Y)肽，則這是更優選的，而且如果製劑中非AP(X-Y)肽含量低於;f全測閾值，則這是最優選的。更具體地，本文的術語"AP(l-42)球聚體"指基本由以上定義的AP(X-Y)單位組成的球聚體；本文的術語"AP(12-42)球聚體"指基本由以上定義的AP(12-42)單位組成的球聚體；而且本文的術語"AP(20-42)球聚體"指基本由以上定義的AP(20-42)單位組成的球聚體。本文的術語"交聯的AP(X-Y)球聚體"指通過交聯(優選化學交聯，更優選醛交聯，最優選二醛交聯球聚體的組成單位)上述AP(X-Y)球聚體而獲得的分子。在本發明的另一個方面中，交聯的球聚體基本是球聚體，其中單位通過共價鍵至少部分連接，而不止是通過非共價相互作用連在一起。本文的術語"AP(X-Y)球聚體衍生物"特別是指通過共價連接方便檢測基團而標記的球聚體，所述基團優選螢光團，例如，螢光素、硫氰酸酯、藻紅蛋白、水母螢光蛋白、高爾基體螢光蛋白或其任何組合或螢光活性衍生物；發色團；化學發光團，例如，螢光素酶，優選Photinuspyralis焚光素酶、弧菌螢光素酶、或其任何組合或有化學發光的衍生物;酶活性基團，例如，過氧化物酶，例如，辣根過氧化物酶，或其任何有酶活性的衍生物；電子密集基團，例如，含重金屬的基團，例如含金基團；半抗原，例如，苯酚衍生的半抗原；強抗原結構，例如，預計有抗原性的肽序列，例如通過Kolaskar和Tongaonkar算法預測有抗原性的；另一分子的適體；螯合基團，例如，六組氨酸基;天然或天然衍生的蛋白質結構，其進一步介導特定的蛋白質-蛋白質相互作用，例如，fos/jun對的成員；磁性基團，例如鐵磁性基團;或放射性基團，例如含！H,14C,32P,35S或125I或其任何組合的基團；或通過共價或非共價高親和相互作用來標記球聚體，優選共價連接於方便失活、螯合、降解或沉澱的基團，優選標記有促進體內降解的基團，更優選標記有泛素，其中如果該標記的寡聚物在體內組裝，則是特別優選的;或通過以上任何組合來修飾球聚體。這些將它們與蛋白質連接的標記和標示的基團和方法是現有已知的。在球聚化之前、之中或之後進行標記和/或標示。在本發明的另一個方面中，球聚體衍生物是通過標記和/或標示反應而由球聚體得到的分子。相應地，本文的術語"AI3(X-Y)單體衍生物"特別是指如所述用於標記或標示球聚體的AP單體。本文的術語"較大親和性"指相互作用程度，其中一方面未結合的抗體和未結合的球聚體和另一方面抗體-球聚體複合物之間的平衡更傾向於抗體-球聚體複合物。同樣，本文的術語"較小親和性"指相互作用程度，其中一方面未結合的抗體和未結合的球聚體和另一方面抗體-球聚體複合物之間的平衡更傾向於未結合的抗體和未結合的球聚體。本文的術語"AP(X-Y)單體"指分離形式的AP(X-Y)肽，優選基本不參與與其他AP肽非共價相互作用的AP(X-Y)肽形式。特別是，AP(X-Y)單體通常以水溶液形式提供。在本發明特別優選的實施方案中，單體水溶液含0.05%至0.2%、更優選約0.1%NH4OH。在本發明另一個特別優選的實施方案中，單體水溶液含0.05%至0.2%、更優選約0.1%NaOH。使用時，宜於以合適的方式稀釋所述溶液。另外，通常宜於在製備後2小時內、特別是l小時內、尤其是30分鐘內使用所述溶液。本文的術語"原纖維"指包含非共價連接各AP(X-Y)肽組裝體的分子結構，其在電子顯微鏡下顯示出纖維結構，其結合剛果紅然後在偏振光下顯示出雙折射，而且其X-射線衍射模式是交叉-P結構。在本發明的另一個方面中，原纖維是由如下過程而得的分子結構，所述過程包擴在無去汙劑的情況(例如，在O.lMHC1中)下自誘導聚合匯聚合適的AP肽，導致形成大於24、優選大於100個單位的聚集體。該過程是現有公知的。A|3(X-Y)原纖維可方使J也以水溶液形式使用。在本發明特別優選的實施方案中，原纖維水溶液的製備是將AP肽溶解於0.1%NH4OH,用20mMNaH2P04、140mMNaCl(pH7.4)以1:4稀釋，然後重新將pH調節成7.4,以374聶氏度溫育溶液20h，然後10000g離心10分鐘並重懸於20mMNaH2P04、140mMNaCl(pH7.4)33中。本文的術語"AP(X-Y)原纖維"指基本由AP(X-Y)亞基組成的原纖維，其中如果平均至少90。/。的亞基是AP(X-Y)型的，則是優選的，如果至少98%的亞基是AP(X-Y)型的，則是更優選的，而且如果非AP(X-Y)肽含量低於檢測閾值，則是最優選的。重組澱粉樣B蛋白質的應用。根據本發明方法製備的蛋白質有許多有趣的效用，如這些方法本身那樣。例如，這些方法去掉了用有機合成法製備肽的需求。另外，這些方法大量節約了生產成本，因為大規模重組表達大大便宜於肽合成。另外，本發明方法能方便地導入與各種當前鑑定的阿耳茨海默家族病症以及任何將來鑑定的相關的任何天然產生的胺基酸變體。而且，本發明方法讓人們能製備合適量的起始材料，用於製備其他可接著用於製備治療阿耳茨海默氏病的單克隆抗體(或其它抗體)的材料。另外，方法讓人們能製備用於如下用途的球聚體(參見如，國際申請WO2004/067561;Barghorn等，J.Neurochem.200595,834-847):1)基於人免疫的介入療法(例如，J求聚體可用於活化免疫)；2)人診斷測試或基於動物的替代測試系統(例如，表位(即，球聚體或其部分)可在人或動物模型中檢測以診斷疾病或確定姑息療法)；3)大或小規模篩選，用以開發小分子(即，非抗體或非生物物質)抗阿耳茨海默氏病預防或治療劑或預防或治療與特徵在於認知損傷的阿耳茨海默氏病相關的神經疾病；4)基於晶體檢測或NMR結構設計的研究，用以開發小分子抗阿耳茨海默氏病(相關疾病)的預防或治療劑；5)基於晶體檢測或NMR結構設計的研究，以開發抗體或其它基於蛋白質的抗阿耳茨海默氏病(相關疾病)的預防或治療劑；和6)製備球聚體用於基於RNAi的設計研究，以開發抗阿耳茨海默氏病的預防或治療劑。(為了本發明的目的，"球聚體"被定義為生物結構，其包含非共價連接的各澱粉樣肽的小組裝體，所述澱粉樣肽含平行分子間P摺疊和反平行分子內P摺疊。球聚體是亞穩定、可溶的，而且其二級結構不同於形成原纖維的(如上)亞基。一段時間內它最終將通過所述構象"轉換"途經轉化成完全平行p摺疊的纖維形式(圖18和23)。特別是，觀察到的球聚體相互作用的二級結構和可能的3維和四級結構如圖20、21和22所示[也可參見圖18中的坐標]。球聚體還不同於寡聚物，因為球聚體的物理尺寸受其分子內和分子間相互作用限制;這些導致高受限形式的寡聚物。球聚體尺寸由球聚體組裝體內存在的分子間相互作用和分子內相互作用限制。它包含根據本文定義的尺寸範圍定義的獨特二級結構內的各單體對單體平行P-摺疊相互作用。預計大得多的澱粉樣寡聚物(纖維形式)優先包含鏈間平行P摺疊二級結構。這些較大的寡聚物和纖維形式由動力學開啟澱粉樣"轉換"結構而形成(圖23)。通過比較，球聚體的優先特徵在於包含我們所定義的混合的鏈間平行和鏈內反平行結構。結構由作為一個重複單位的至少2個分子組成。重複單位含至少由澱粉樣P蛋白質的殘基19-21和30-32組成的2個分子內反平行P摺疊、和至少由澱粉樣P蛋白質殘基34-38組成的一個分子間平行P摺疊(圖21)。反平行P摺疊具有有兩個P鏈形成的P-髮夾結構，其通過環連接。通過(NOE)主鏈醯胺(如實線所示)之間和距離介於1.8和6埃的主鏈醯胺和它們的側鏈(箭頭虛線所示)(圖20)之間的交叉鏈核質子進動效應，來定義該反平行P摺疊結構(也可參見下表l)。表1NOESY譜中觀察到的長程NOE長程分子內NOEA30NHA21NHA21NHF19NH132NH132NH,HB,HG絲A3。NH,HB#131HD1#,HG1#F19HD#,HB#A21HB#長程分子間NOEG33NHG34NHM35NHV36NHG37NHG38NHG33NHVI8CVH3V18NHV18CvH3L34麗L34CSH3V36CyH3V39CYH3V39CVH3M35NHG38NHV39NH通過主鏈NH-NH(虛線所示)之間和主鏈NH和側鏈曱基(箭頭實線所示)之間的分子間NOE,來定義互相對準的平行P摺疊(圖20)。分子內對分子間NOE利用不同的同位素標記的樣品來區分。製備以下樣品(樣品A)均一["N]-標記的質子化樣品；(樣品B)2H背景中帶有lie、val、Leu殘基的選擇性"C-標記的質子化曱基均一["N]-標記的樣品；(樣品C)混合樣品，其中一個分子標記有[U-"N,2H],而另一個標記的有[U-14N,2H],其以1:1比率混合；(樣品D)混合樣品，其中帶有[U-"N,2H]-標記的肽的[U-"N,2H]-標記的肽以1:1比率混合，其含IVL殘基的選擇性130標記的質子化甲基。樣品A和B的3D"N-解析的NOESY譜中觀察到了實線所示的分子內NH-NHNOE(圖20),而在樣品C的"N-過濾的和"N-編輯的3DNOESY語中沒有。用樣品A如箭頭虛線所示的(圖20)"N-解析的3DNOESY觀察到了主鏈醯胺和它們側鏈間的其他分子內NOE。這些NOE數據再次表明存在有反平行P摺疊結構。樣品C的過濾的和"N-編輯的3DNOESY譜中沒有觀察到虛線所示的分子間(圖20)。這些NOE清晰地確認了互相對準的平行分子間P摺疊。如箭頭實線所示的(圖20)樣品D的"N-解析的iH,H和"C"HNOESY譜中觀察到了一個分子上的主鏈醯胺15NH和另一個分子上的13CH3曱基之間的其他分子間NOE。這些分子間NOE再次表明互相對準的平行P摺疊結構附符合phi(cj))角-120±50和psiO)角140±50。根據NH/ND交換實驗，其中凍幹水溶性"N-標記的樣品並溶於D20中，對於含樣品的020,用至少20分鐘得到P摺疊中交換而保護的胺。保護的胺用殘基上的圈來表示(圖20)。這些緩慢交換的胺多數位於P-摺疊中並可能是氬鍵連接的。用來自NMR數據分析的NOE衍生的距離約束(參見表1)，通過模擬退火規程[M.Nilges,等，FEBSLett.229,317-324,(1988)]用程序CNX來計算結構[A.T.Brunger,等，ActaCrystallogr.D54(Pt5),905-21,36(1998)]。G33位於反平行和平行P摺疊之間的連接處。未定義該殘基的構象，它可以是任何符合任何物理許可構象的phi、psi角。該實體(可能是二聚體)的有代表性的構象如圖21所示，其坐標在圖24中給出。應當注意到，本發明澱粉樣P實體結構之一的完整結構坐標包括圖24所示的那些以及來自保留的胺基酸主鏈原子(或其保守替換)的+/-均方根偏差。對於有關平均坐標位置的20個算得的最有利的結構的平行P-摺疊胺基酸殘基34-38的均方根偏差，對於主鏈原子(Ca,N，和C')為0.51±0.29埃，而對於所有重原子，為1.04±0.36埃。^!不利的平均坐標位置，對於主鏈原子(Ca,N,和C')為0.51±1.29埃，而對於所有重原子，為1.04±1.36埃。不利的平均坐標位置，對於主鏈原子(Ca,N,和C')為0.51±2.29埃，而對於所有重原子，為1.04±2.36埃。對於有關平均坐標位置的20個算得的最有利的結構的反平行P摺疊胺基酸殘基19-21和30-32的均方根偏差，對於主鏈原子(Ca,N,和C)為0.67±0.23埃，而對於所有重原子，為1.52±0.36埃。較不利的平均坐標位置，對於主鏈原子(Ca,N,和C')為0.67±1.23埃，而對於所有重原子，為1.52+1.36埃。最不利的平均坐標位置，對於主鏈原子(Ca,N,和C')為0.67±2.23埃，而對於所有重原子，為1.52±2.36》矣以上均方根偏差(rmsd)是實驗確定的數值。由於未定義平行P摺疊和反平行P摺疊間的方向，因此目前沒有確定對於完整結構坐標的rmsd。("均方根偏差"是平均值偏差坐標的算術平均值的平方根，它是表示本文所述的結構坐標的偏差或變化的方式。)另外，可用現有已知的分子建模方法來鑑定本文所述的澱粉樣P分子(例如，二聚體)的一種或多種活性位點或結合槽。具體來說，如圖21所示，用結構坐標表徵3維模型。然後，根據該模型，計算使推測的活性位點可見、可鑑定並可基於諸如分子表面結構、表面電荷、空間排列、存在的反應性胺基酸和疏水和親水性來表徵。然後，可用由各種澱4分樣P複合物、竟爭和非竟爭抑制實驗產生的化學位移幹擾譜，和/或通過生成並表徵澱粉樣P突變來鑑定關鍵殘基或活性位點特徵，由此可進一步改進該推測的活性位點。(參見美國專利6,934,639.)通過從澱粉樣P分子的3維模型來測定並進行計算機擬合分析，由此來鑑定與活性位點相互作用或相關的試劑。計算機擬合分析用各種計算機軟體程序如下評估推測的活性位點和鑑定到的試劑間的"合適性"1)用活性位點的同源性建模或結構坐標來產生推測活性位點的3維模型，和2)確定推測的活性位點和鑑定到的試劑間的相關程度。相關程度可用計算機或用結合測試實驗確定。另外，應當注意到，本發明的蛋白質、球聚體和寡聚物(以及抗其的抗體)可用於多種診斷測試中。在本發明的一個實施方案中，蛋白質、球聚體或寡聚物、或其部分被包被在固相上(或存在於液相中)。然後，讓測試或生物樣品(例如，全血、腦脊髓液、血清等)接觸固相。如果樣品中存在抗體，則該抗體結合固相上的抗原，然後通過直接或間接方法來檢測。直接方法包括簡單檢測複合物本身的存在性以及由此得到的抗體的的存在性。在間接方法中，將綴合物加入結合的抗體。綴合物包含第二抗體，其結合第一結合抗體，其連接有產生信號的化合物或標記。如果第二抗體結合結合的第一抗體，則產生信號的化合物產生可測量的信號。然後，該信號表明測試樣品中存在第一抗體。用於診斷免疫測試中的固相實例有多孔和非多孔材料、乳膠粒、磁顆粒、微粒(參見美國專利5,705,330)、珠、膜、微滴定孔和塑料管。如果需要，根據所需測試進行形式特徵來確定標記綴合物中出現的抗原或抗體的固相材泮+和方法的選定。如上所述，綴合物(或指示劑)將包含抗體(或根據測試，可能是抗抗體)，其連接於產生信號的化合物或標記。該產生信號的化合物或"標記"是本身可檢測的或可與一種或多種其他化合物反應來產生可;f企測的產物。產生信號的化合物的實例包括色原體、放射性同位素(例如，1251,131I，32P,3H,MS和MC)、化學發光化合物(例如，吖t定)、顆粒(可見的或螢光的)、核酸、複合試劑、或催化劑(如酶(例如，鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣糹艮過氧化物酶、P-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。對於酶應用(例如，鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶)的情況，加入產生顏色、螢光、或光的底物能產生可檢測信號。也可使用其它檢測系統，如時間解析的螢光、內反射螢光、擴增(例如，聚合酶鏈式反應)和拉曼光譜。以上免疫測試可4全測的生物流體的例子包括血漿、全血、幹全血、血清、腦脊髓液或組織和細胞的水溶性或有機-水溶性提取物。在本發明的另一個實施方案中，測試樣品可暴露於包被有本發明的特定抗體(例如，人或人源化的單克隆抗體、多克隆抗體等)的固相(或液相)。如果存在於樣品，則上述球聚體、寡聚物或蛋白質結合固相，然後可通過上述直接或間接方法檢測。更具體地，間接方法涉及添加含連有標記或產生信號的化合物的第二抗體(其結合結合的抗原)的綴合物。當第二抗體結合結合的抗原時，那麼產生可檢測信號表明測試樣品中存在阿耳茨海默蛋白質，如球聚體、寡聚物、肽、或其部分。本發明還涵蓋第三個檢測測試樣品中抗體的存在性的方法。該包括如下步驟(a)用一段時間並在足以形成抗抗體/抗原複合物的條件下，用特異於抗原(例如，蛋白質、球聚體或寡聚物、或其部分)的抗抗體接觸懷疑含抗體的樣品；(b)用一段時間並在足以使抗原結合結合的抗體的條件下，將抗原加入得到的抗抗體/抗原複合物中，該抗原含本文所述的蛋白質、球聚體、寡聚物、或其部分；和(c)將綴合物加入得到的抗體/抗體/抗原複合物中，該綴合物包含的組合物含連接於能檢測可檢測信號的信號產生化合物的單克隆或多克隆抗體，該單克隆或多克隆抗體抗該抗原；和(d)通過檢測信號產生化合物產生的信號來檢測測試樣品中可能存在的抗體的存在性。可用包含抗體與抗抗體對照或校準物。本發明還包括疫苗，其包含一種或多種本文定義的抗原(即，蛋白質、寡聚物、球聚體、或其部分)和藥學上可接受的佐劑(例如，弗氏佐劑或磷酸緩衝鹽液)。試劑盒也包括在本發明的範圍內。更具體地，本發明包括確定患者中抗體存在性的試劑盒。特別是，確定測試樣品中抗體存在性的試劑盒包含a)本文定義的抗原(例如，蛋白質、球聚體、寡聚物、或其部分;和b)綴合物，其包含連接於能產生可檢測信號的信號產生化合物的抗體。試劑盒也可含對照或校準物，其包含結合抗原的試劑。本發明還包括檢測測試樣品中的抗體的另一類試劑盒。試劑盒可包含a)特異於感興趣的抗體的抗抗體，和b)以上定義的抗原或其部分。也可包括對照或校準物，其包含結合抗原的試劑。更具體地，試劑盒可包含a)特異於抗體的抗抗體和b)含抗原的綴合物，該綴合物連接於能產生可檢測信號的信號產生化合物。此外，試劑盒也可包含校準物對照，其包含結合抗原的試劑。試劑盒也可包含一個容器(如小瓶、瓶或繃帶，其中每個容器帶有39預設的固相)和另一個含各綴合物的容器。這些試劑盒也可包含進行測試所需的其它試劑(如洗滌、加工和指示劑)的小瓶或容器。另外，本發明包括抗並用選自如下的抗原產生的人源化的抗體北極(E693G)突變，荷蘭(E693Q)突變，義大利突變(E693K),愛荷華(D694N)突變和佛蘭德(A692G)突變。該抗體可識別澱4分樣|3肽的天然人序列和至少一個突變的序列。該抗體可給藥於經鑑定帶有該突變的患者，用於治療。該抗體具有雙可變結構域並可識別天然的人澱粉樣P序列和至少一個上述家族性突變。該抗體也可以是雙特異性的。另外，本發明包括檢測懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中突變的澱粉樣P肽序列的方法。該方法包含如下步驟a)從患者中分離生物樣品;b)用一段時間並在足以形成突變的抗原/抗體複合物的條件下，使所述生物樣品接觸以上直接所述的抗體;和c)檢測突變的抗原/抗體複合物的存在性，所述複合物表示所述患者帶有突變的澱粉樣e肽序列和由此而得的阿耳茨海默氏病。另外，本發明包括分離的球聚體，其每摩爾澱粉樣肽包含約至少0.5-2.0摩爾的十二烷基磺酸鈉(SDS)或脂肪酸。球聚體最優選存在約1.0摩爾SDS。本發明還包括分離的球聚體的表位。(可通過肽和SDS(或脂肪酸)的混合物來形成表位。另外，本發明還包括結合表位的分離的抗體。該抗體還可阻斷澱粉樣P肽聚集體的形成。阻斷可發生在肽二聚體、肽三聚體、肽四聚體、肽五聚體、肽六聚體、肽七聚體、肽八聚體、肽九聚體、肽十聚體、肽十一聚體、肽十二聚體、肽十三聚體和肽十四聚體的階段。而且，本發明還包括分離的球聚體，其包含澱4分樣P肽。該肽包含具有選自如下突變的胺基酸序列北極(E693G)突變，荷蘭(E693Q)突變，義大利突變(E693K)，愛荷華(D694N)突變和佛蘭德(A692G)突變。本發明還包括該球聚體的表位(即，肽和SDS(或脂肪酸)混合物形成的表位、和球聚體，但其在免疫學上不同於天然人澱粉樣P肽序列的免疫反應性表位。而且，本發明包括分離的抗體(例如，單克隆抗體)，相對於天然人澱粉樣肽的表位，其優先結合上述表位。該抗體也可用於治療患家族性阿耳茨海默氏病的患者。本發明還涵蓋分離的抗體(例如，單克隆抗體)，其可用於治療(上述)家族性形式的阿耳茨海默氏病，並具有與家族性突變表位(其不同於在治療零星阿耳茨海默氏病時存在的表位)有關的偏好和選擇性表位反應性。另外，本發明包括預防或治需要預防或治療的療患者中的的阿耳茨海默氏病方法，其包括向患者以足以實現預防或治療的量給藥任何一種或多種上述分離的抗體。另外，本發明包括含澱粉樣P肽的分離的球聚體。肽包含胺基酸，其根據氫-氘交換行為能展示出約33%或更少保護或交換，其中胺基酸選自2(Asp),3(Ala),4(Glu)，5(Phe),7(His),8(asp),9(Ser),10(Gly),17(Lys),20(Phe),21(Phe),22(Ala),25(Val),26(Gly)，29(Lys)和30(Gly)。分離的球聚體包含澱粉樣P肽。而且，本發明包括含澱粉樣P肽的分離的球聚體。肽包含胺基酸，其根據氫-氘交換行為能展示出約33%至約66%保護或交換，其中所述胺基酸選自16(Gln),31(Ala),32(11e)，42(Ile)和43(Ala)。而且，本發明涵蓋含澱粉樣P肽的分離的球聚體。肽包含胺基酸，其根據氫-氘交換行為能展示出約66%或更多保護或交換，其中胺基酸選自12(Glu)18(Leu)，19(Val),24(Asp),33(Ile),34(GIy)，35(Leu),36(Met),38(Gly),39(Gly)和40(Val)。人家族性突變預計如圖27中所見的表示成其M-末端Met形式的人家族性突變的阿耳茨海默肽與天然序列球聚體形式產生的抗體有不同(更低)的反應性。例如，對於如下家族性突變，結合由天然序列的球聚體產生的抗體A的能力將會下降:北極(E693G),荷蘭(E693Q),義大利(E693K)，愛荷華(D694N)和弗蘭德(A692G)。該減小的與突變的球聚形式結合的能力由該抗體A表位區域中改變的序列/結構而造成。人源化形式的抗體在治療患有與這些突變相關的家族性形式的阿耳茨海默氏病的患者中的應用將需要抗體，其針對含這些區域的序列的球聚體表位而開發。抗體A樣抗體本身對於這些家族性突變將沒有治療活性，因為他們會顯示出減低的識別體內球聚體中出現的家族性表位的能力。本發明可通過使用如下非限制性實施例來例示實施例IAp-澱粉樣肽的克隆AP-澱粉樣肽是合成構建的。特別是，圖1圖示了編碼本文所述的肽的DNA序列以及該肽的胺基酸序列。在載體pET29上設計覆蓋了編碼A(3-澱粉樣肽的序列和克隆其所需的限制性位點的引物(參見下表2)並用於退火反應以產生用於與所需大腸桿菌表達載體進行連接反應的片段。一起退火這些寡片段之後，通過用DNA連接酶連接來將它們整合入pET29NdelXhol位點(Invitrogen,Carlsbad,CA)從而形成pET29-AP澱粉樣肽[l-42]的天然形式。通過DNA測序確證最終的構建體。通過定點誘變(SDM)用模板pET29-AB澱粉樣肽[l-42]來製備P澱粉樣肽[1-39,40,42和43]。在使用快速改變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)的獨立SDM反應中，使用引物對SDMamy-39s和as、SDMatny-40s和as、SDMamy-41s和as、SDMamy-43s和as(參見表2)。通過DNA測序確證新構建體pET29-AP澱粉樣肽[1-39]、pET29-AB澱粉樣肽[1-40]、pET29-AB澱粉樣肽[l-41]和pET29-A(3澱粉樣肽[1-43〗。得到的構建體用於轉化大腸桿菌BL21(DE3)來檢測表達。通過在用ImMIPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖呋喃苦)誘導後於37攝氏度培養4hr,由此來進行肽的表達。由測試表達產生的期望大小的蛋白質的不可溶性級分在靠馬斯染色的SDS蛋白質凝膠上顯現。表2A.amy隱lTATGGATGCGGAATTTCGCCATGATAGCGGCTATGAAG(SEQIDNO:11)amy-2CAAA(SEQIDNO:12)amy畫3GGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGTGTGGTGATTGCGTGAC(SEQIDNO:13)amy-4TCCGCATCCA(SEQIDNON42amy-AAAA(SEQIDNO:15)B.SDMamy-43(+)GGGTGGTGTGGTGATTGCGACCTGACTCGAGCACCACCACC(SEQIDNO:17)SDMamy-43(-)GGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGTCGCAATCACCACACCACCC(SEQIDNO:18)SDMamy國41(+)GGTGGGTGGTGTGGTGATTTGACTCGAGCACCACCACC(SEQIDNO:19)SDMamy-41(-)GGTGGTGGTGCTCGAGTCAAATCACCACACCACCCACC(SEQIDNO:20)SDMamy-40(+)GATGGTGGGTGGTGTGGTGTGACTCGAGCACCACCACC(SEQIDNO:21)SDMamy-40(-)GGTGGTGGTGCTCGAGTCACACCACACCACCCACCATC(SEQIDNO:22)SDMamy-39(+)CCTGATGGTGGGTGGTGTGTGACTCGAGCACCACC(SEQIDNO:23)SDMamy-39(-)GGTGGTGCTCGAGTCACACACCACCCACCATCAGG(SEQIDNO:24)A部分包括合成AP澱粉樣肽[1-42]所用的引物的核苷酸序列。B部分包括SDM上所用的引物的核苷酸序列，用於修飾pET29-AP澱粉樣肽[l畫42]並製備pET29-AP澱粉樣肽[1-39]、[1-40]、[1曙41]、和[1國43]。實施例II0-澱粉樣蛋白的發酵和表達l)A-P(1-39):[產生未標記的材料]將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到添加有50mg/L卡那黴素的150mLM9預培養基中。預培養物置於軌道搖床(185rpm)上並於30攝氏度溫育。當培養物的OD,腿達到0.468時，將全部預培養物轉移至含18L培養基的新Brunswick科學(Edison,NJ)微發酵罐中。發酵培養基(每升L)由如下成分組成11.32gNa2HP04*7H20、3gKH2P04、0.5gNaCl、lmLl%DF-60防沫劑、1.5gNH4C1、3.55g葡萄糖、2mL1MMgS04、0.1mL1MCaCl2、0.02mLFeS04(40mg/mL)、2mL卡那黴素(25mg/mL)、和0.633mL痕量元素溶液[每L含5NHC1:10gMnS04'H20;10gAlCl3H20;4gCoCl2;2gZnS047H20;2gNa2Mo04'2H20;1gCuCl2'2H20;0.5gH3B04]。溫度起初控制在30.0才聶氏度。以2wm將空氣噴入發酵罐，而且在D02濃度落於45%以下時，通過級聯控制系統增加攪拌速度，來將溶解氧濃度[D02]維持在大於45%的空氣飽和度上。在運行期間通過自動加入4NH2S04和4NKOH,來將pH控制在7.0上。在OD600nm為2.0時，將溫度設置點改變到41。C,並通過加入lmMIPTG來i秀導表達A-P。在全部表達階段，通過加入30%葡萄糖溶液，使葡萄糖濃度維持在Og/L以上。誘導後3h收穫細胞。2)A-e(1-40):[產生"N標記的材料]將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到添加有50mg/L卡那黴素的150mL15N-M9預培養基中。預培養物置於軌道搖床(185rpm)上並於30攝氏度溫育。當培養物的OD6nm達到0.468時，將75mL預培養物轉移至含18L培養基的新Brunswick科學(Edison，NJ)微發酵罐中。發酵培養基(每升L)由如下成分組成11.32gNa2HP〇4*7H20、3gKH2P04、0.5gNaCl、1mL1%DF-60防沫劑、1.5g15N-NH4Cl、3.55g葡萄糖、2mLlMMgS04、0.1mLlMCaCl2、0.02mLFeS〇4(40mg/mL)、2mL卡那黴素(25mg/mL)、和0.633mL痕量元素溶液[每L含5NHC1:10gMnS04'H20;10gAlCl3H20;4gCoCl2;2gZnS047H20;2gNa2Mo04'2H20;1gCuCl2'2H20;0.5gH3B04]。溫度起初控制在30.0攝氏度。以2vvm將空氣噴入發酵罐，而且在D02濃度落於45%以下時，通過級聯控制系統增加攪拌速度，來將溶解氧濃度維持在大於45%的空氣飽和度上。在運行期間通過自動加入4NH2S04和4NKOH,來將pH控制在7.0上。在OD6oonm為1.5時，將溫度設置點改變到4rC,並通過加入lmMIPTG來誘導表達A-P。在全部表達階段，通過加入30%葡萄糖溶液，使葡萄糖濃度維持在0g/L以上。誘導後3h收穫細胞。3)A-P〖l畫41):將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到添加有50mg/L卡那黴素的150mL15N-M9預培養基中。預培養物置於軌道搖床(185rpm)上並於30攝氏度溫育。當培養物的OD,^達到0.424時，將全部預培養物轉移至含18L培養基的新Brunswick科學(Edison,NJ)微發酵罐中。發酵培養基(每升L)由如下成分組成11.32gNa2HP04*7H20、3gKH2P04、0.5gNaCl、1mL1%DF-60防沫劑、1.5g15N-NH4Cl、3.55g葡萄糖、2mL1MMgS04、0.1mL1MCaCl2、0.02mLFeS04(40mg/mL)、2mL卡那黴素(25mg/mL)、和0.633mL痕量元素溶液[每L含5NHC1:10gMnS04'H20;10gAlCl3H2〇；4gCoCl2;2gZnS047H20;2gNa2Mo04'2H20;1gCuCl2'2H20;0.5gH3B04]。溫度起初控制在30.0攝氏度。以2vvm將空氣噴入發酵罐，而且在D02濃度落於45%以下時，通過級聯控制系統增加攪拌速度，來將溶解氧濃度[D02]維持在大於45%的空氣飽和度上。在運行期間通過自動加入4NH2S04和4NKOH,來將pH控制在7.0上。在OD600nm為1.8時，將溫度設置點改變到41°C,並通過加入lmMIPTG來誘導表達A-P。在全部表達階段，通過加入30。/。葡萄糖溶液，使葡萄糖濃度維持在0g/L以上。誘導後3小時收穫細胞。4)A-0(1-42):將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到添加有50mg/L卡那黴素的150mL15N-M9預培養基中。預培養物置於軌道搖床(185rpm)上並於30攝氏度溫育。當培養物的0D6(K)nm達到0.520時，將75mL預培養物轉移至含18L培養基的新Brunswick科學(Edison,NJ)微發酵罐中。發酵培養基(每升L)由如下成分組成11.32gNa2HP04*7H20、3gKH2P04、0.5gNaCl、1mL1%DF-60防沫劑、1.5g15N-NH4Cl、3.55g葡萄糖、2mLlMMgS04、0.1mLlMCaCl2、0.02mLFeS04(40mg/mL)、2mL卡那黴素(25mg/mL)、和0.633mL痕量元素溶液[每L含5NHC1:10gMnS04'H20;10gAlCl3H20;4gCoCl2;2gZnS04'7H20;2gNa2Mo04'2H20;1gCuCl2'2H20;0.5gH3B04]。溫度起初控制在30.0攝氏度。以2vvm將空氣噴入發酵罐，而且在D02濃度落於45%以下時，通過級聯控制系統增加攪拌速度，來將溶解氧濃度[D02]維持在大於45%的空氣飽和度上。在運行期間通過自動加入4NH2S04和4NKOH，來將pH控制在7.0上。在OD6oonm為1.5時，將溫度設置點改變到41°C,並通過加入lmMIPTG來誘導表達A-P。在全部表達階段，通過加入30%葡萄糖溶液，使葡萄糖濃度維持在0g/L以上。誘導後3h收穫細胞。5)A-3(1-42):[產生未標記的材料]將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到包含添加有卡那黴素(50mg/L)的1L恐怖肉湯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的六連發酵瓶中。將瓶於304聶氏度轉移至軌道搖床(185rpm)上。當培養物的OD6CK)nm達到0.45時，通過加入lmMIPTG來誘導表達A-P並將瓶於4rC轉移至軌道搖床上。誘導後3h收穫細胞。6)A-pn-43):將表達質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)並置於添加有卡那黴素(50mg/L)的LB上。37。C溫育過夜後，平板上長出的轉化子用於接種到包含添加有卡那黴素(50mg/L)的1L恐怖肉湯(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的14連發酵瓶中。將瓶於30攝氏度轉移至軌道搖床(185rpm)上。當培養物的OD6QQnm達到0.44時，通過加入lmMIPTG來i秀導表達A-P並將瓶於4rc轉移至軌道搖床上。誘導後3h收穫細胞。實施例III重組表達的B-澱粉樣蛋白的純化為純化重組人澱粉樣蛋白而開發的全部方案如圖3所示並如下所述。起始樣品所有分離的樣品的起始材料是冷凍在-80攝氏度的細胞漿，其得自大腸桿菌細胞培養物的收穫物。細胞培養物源自多重1升搖瓶培養或源自多至35升的發酵罐發酵。培養基由豐富的培養基組成，能產生未標記的材料或最小培養基，其含有或不含有外加的用於製備各種標記的A-P樣品的標記。搖瓶或發酵罐發酵可使用不同的培養基。行動1:從瓶中取細胞裂解物和包涵體製品的冷凍的細胞漿，並將其加入到燒杯中的5-10體積冷的裂解緩衝液中，將於室溫其置於搖床上。裂解緩衝液由100mMtris(最終4攝氏度的pH為7.5至7.8)組成。對於來自發酵罐培養的細i包漿，將0.1%tritonX100加入裂解緩衝液。Benzonase(EMDBiosciences,Madison,WI)力口入到;農度為O.lul/ml的細胞裂解物中。使冷凍的細胞漿攪動，直至沉澱全部重懸起來。這通常在45-60分鐘內完成。如不哦需要，用組織勻漿器臨時使懸浮液均一化以幫助該過程。用M-110L微流化劑(Microflmdics,Newton,PA)進行細胞裂解，置於水下的冷卻旋管中；或使用冷的法國壓力細胞(SLMAminco,Rochester,NY)進行。裂解的材料於15攝氏度置於250mLnalgene(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)離心並瓦中、或置於或50ml圓底聚碳酸酯離心管中，並在JLA16.25轉子(BeckmanInstruments,PaloAlto,CA)中於4攝氏度以23000xG離心30分鐘。輕輕倒出上清液，取樣，然後棄去。4亍動2:包涵體和沉澱的洗滌加入冷的50mMtris緩衝液(pH7.5至7.8)來洗滌以上得到的沉澱。用組織勻漿器重懸材料並如上在JLA16.25轉子中以23000xG離心。總共3次如此用tris洗包涵體材4+。每次收集上清液樣品，用於SDSPAGE分析。474亍動3:水洗Tns緩衝液洗後進行最後一次水洗。這樣進行是為了在冷凍乾燥樣品前去除大多數tris緩衝液。在該步驟中，所有材料同時合併到一個瓶中。如上在JLA16.25轉子中以23000xG最後離心重懸的樣品。收集上清液樣品，用於SDSPAGE分析，然後棄去。離心得到的沉澱沉澱於水(用於NMR的樣品)或含0.1%三氟乙酸的水中。加入後者進行發酵罐發酵，其中大量材料同時被加工了。注意到，只用水冷凍乾燥的材料是帶高靜電的，非常難於大量處理，而加入三氟乙酸製備的凍幹的材料在以後處理時容易並安全得多。調節重懸樣品的最終體積從而得到薄薄的漿片，其在冷凍(剝落)過程期間易於擴散到冷凍乾燥機瓶壁上。行動4:冷凍乾燥剝落冷凍重懸的樣品並置於冷凍乾燥機上，凍幹過夜或至完成過程所需的時間。在50ml聚丙烯圓錐管中凍幹小樣，由此它們不必轉移出那兒。行動5:提取所用的提取溶劑是V-A)DMSO;V-B)七氟丁酸(HFBA)和V-C)三氟乙酸。用氟酸的途徑基於純TFA中A-P1-42或1-40的高溶解性[Jao,等,(1997),'TrifluoroaceticPretreatmentReproduciblyDisaggregatestheAmyloidP-peptide".Int.J.Exp.Clin.Invest"V4,第240-252頁]。純TFA用於為了結構而製備A-P的第一步。純TFA從肽中去除所有過去以前的結構並可使之高度可溶。行動5A:DMSO提取DMSO是最常用的溶劑，用於從凍幹的包涵體樣品中提取肽。根據起始細胞漿的量得到來自發酵罐發酵的10-20g這種凍幹的材料。在加溫搖床上的600mL玻璃燒杯中，將300mLDMSO[二曱亞碸]力。溫至37攝氏度。將凍幹的材料小心加入到DMSO中而不產生塵埃。轉移後，用組織勻漿器使懸浮液均一。攪動再持續15分鐘。全部過程超過45分鐘。燒杯用玻璃板蓋住。停止攪動和加熱，並使材料在發熱罩的板上放置過夜。使樣品溫度在任何時候不超過37攝氏度。總體積約350mL,在第二天早上於25°C以23000xG在JLA16.25轉子的兩個250mLnalgene瓶中離心30分鐘。輕輕將DMSO上清液倒入600mL玻璃燒瓶中。再將4850mLDMSO加入每個瓶中，然後均一化並離心。合併兩個樣品，總共得到約400ml。棄去沉澱，因為在以前的實驗中SDSPAGE顯示該過程基本能提取所有的肽。NMR樣品一般含5至10gm細胞將。將(從水中)凍幹的包涵體材料裝入50ml聚丙烯圓錐管。將25mlDMSO加入該管並臨時使樣品均一化以形成懸浮液。一般使其於室溫至於板上約4小時，然而有時出於方便進行溫育過夜。將重懸的沉澱轉移至聚碳酸酯離心管中並於25。C在JLA16.25轉子中以23000xG離心30分鐘。沉澱量少並棄去。輕輕將上清液倒入50ml圓錐管中。在幾個這種樣品平行處理成到這種階段時有時，將其冷凍於-20攝氏度，等待層析。行動6:用於層析的製品用於層析的製品進行DMSO透析，溶入反相柱平tf洗脫液(10%乙腈溶於含0.1%氫氧化銨的水中(以下行動6A))。只要樣品體積相對於柱體積小時(通常小於10%柱體積)，也可將DMSO提取物(以下行動6B)直接用於反相柱。這可在有分析刻度的柱上進行。對於NMR樣品，25mlDMSO樣品用0.1%氫氧化銨稀釋成250ml並直接用於柱上。行動6A:透析或稀釋將DMSO提取物仔細流入6000-8000定點透析膜(SpectrumLaboratories,RanchoDominguez,CA)，其長度足以容納約1.5L。用10L15%乙腈透析，向其中加入10mL濃氨水(0.P/ov/v)。在4反上進行透析4小時。定期更換透析膜以重新分配濃DMSO並加速透析過程。4小時後，將膜置於新換的10L相同緩衝液中，並再持續該過程2小時。在透析末尾，取出樣品並於25。C以23000xG離心30分鐘。基本沒有沉澱。在透析末尾，將350-400mlDMSO提取物體積加倍。將全部樣品移入2L量筒並用0.1%氨水稀釋2倍，^使總體積多至2000ml。進行稀釋以確保樣品可結合反相柱(行動6A)行動6A:層析將PolymerLabs(Amherst,MA)的15-20微米、300A、PLPR-S反相樹脂手工裝於2.2X25cm,(95mL)乾淨的柱。循環乂人75%乙腈+0.1%氨水(75。/。B)開始進行並平衡至10%B。將柱連於PharmaciaP500泵(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ),和於室溫一誇1400mL泵過柱過49夜，置於板上超過1000分鐘。第二天早上，用約250mL10。/。B用P500泵洗柱，然後連接至BeckmanHPLC(PaloAlto,CA)。用10。/oB持續洗，直至280nm處的吸收到達基線，然後開始從10%B往30%B梯度洗超過200分鐘(0.1%梯度)。全部吸收保持在1個吸收單位，流速為5mL/分鐘。手工收集材料。收集約50個級分。它們體積可變，但最大約10mL。在30。/。B時，用30。/。B持續洗脫柱並收集洗脫液。以後4艮據痕量棄去該洗脫液。100uL每個級分置於真空離心乾燥器上乾燥，並將100uLlX樣品緩衝液加入試管中。讓樣品進行SDSPAGE,並讓級分在4攝氏度保存過夜。SDSPAGE後，決定棄去PLPRS反相材料來代替試著再生它，因為它可能因本4侖不純物而潛在地汙染下一4侖。第二天早上，將每個凝膠得到結果的進行合併。材料用3500定點膜在Amicon(MilliporeInc，Billerica,CA)攪拌的細胞上濃縮，在約4小時中從350濃縮至50mL。溶解全部樣品。然後凍幹過夜。第二天早上，用種重器仔細將其轉移入兩個預先稱重的50mL聚丙烯圓錐管。轉移的總重量為250mg力。330mg(總共580mg)凍幹的材料。這儲存於-2CTC。全部過程在5個工作日內進行。以下是純化表，其^^皮稱為表3。tableseeoriginaldocumentpage50作用6B:直接使用。將含10ul濃氨水(l%v/v)lmL的DMSO加入到20mg固體物中。用超聲臨時處理材泮牛以重懸固體物，然後離心。0.5/1mL可溶於DMSO的材料用於3u分析性0.46x25cmPLPR-S柱(步驟2.1)上。SDSPAGE分析為純的A-P是用約30%B洗脫的。在SDSPAGE凝膠上觀察到預先形成的球聚體的特徵模式。凍乾材料並通過圖8簡述的球聚體形成規程進行處理，而且在圖9所示的SDSPAGE上得到條帶^t式。在第二次嘗試中，製備出溶於DMSO的10mg/mL(不添加氨水)物質。lmL該樣品的一半直接注入分析柱。在這種情況下，在柱上進行pH改變。用預期的。/。B洗脫肽，並進行合併(用SDSPAGE分析)、凍幹，並通過球聚體形成流程處理形成如前的有功能的球聚體。對於NMR樣品，25mlDMSO樣品用0.1%氫氧化銨稀釋成250ml並直接用於柱上。作用5B、5C:酸提取途徑也可用七氟丁酸、(HFBA)和三氟乙酸進行提取。作用7A1、7A2、7A3:用於層析的製品300mL無水HFBA置於加溫攪拌板上的600mL玻璃燒瓶中。將凍幹的IB樣品(10g)在強力攪拌的條件下在通風櫥中加入到HFBA中。如果需要，用組織勻漿器和探測超聲波器解聚任何形成的團塊。將材料加熱至40攝氏度，進行冷卻，並在避光的條件下在板上放置過夜。第二天早上，HFBA溶解的IB樣品(其大部分是溶液)置於旋轉蒸發器上，用約40。C作為水浴溫度以去除大部分HPBA。小心不要乾燥瓶壁上的固體物。(當材料像粘液漿般時，將約50ml1,1,1,3,3,3,六氟異丙醇(HFIP)加入燒瓶。用組織勻漿器和/或超聲探測器，通過加熱、旋轉燒瓶，使漿體溶解入HFIP。)當所有都成為溶液時，在蒸發器上去除HFIP使樣品粘結成粘液漿。加入另外50mL等分的HFIP並重複該過程。將50mLDMSO加入燒瓶，這時樣品呈漿體粘結狀。樣品顏色變成深褐色並輕微加熱以溶解入DMSO。將其在室溫放置過夜。第二天早上，瓶底有沉澱，而上清液是澄清的。離心樣品並棄去沉澱。作用8:將提取物加入含乙酸的水中緩慢將1體積該提取物加入2體積含30%乙酸的水中，於室溫快速攪拌。於室溫持續攪拌30分鐘，然後離心樣品以去除少量不可溶性物質。其間，用30%乙酸裝5X90cm(~1800mL)SephadexG50(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)柱並置於冷室中備用。150-200mL溶於33。/。DMSO的樣品用於G50,小心處理不要讓樣品凍結。用30%乙酸以1.5mL/分鐘洗脫約1.2柱體積的樣品。得到3個峰。棄去第一個(即，空白)峰。第二個峰包含幾乎純的A-|3。第三個峰包含一些A-p,但還含提取溶劑，也將其棄去。凍幹中間的峰，加熱在最小量的DMSO(~10-20mL)中處理。作用9A:酸性反相層析離心掉樣品中的不可溶性材料並用於在20%B(含0.1%TFA的20%乙腈)中平衡的VydacTP214C4反相柱(Grace-Vydac,Hesperia,CA)。在基於矽土的C4柱上用TFA系統中約60%B洗脫A-P。凍幹合併物，溶於10mLDMSO中。作用9B:石成性反相層析然後將DMSO樣品用於作用5A途徑所述的PLPR-S反相系統，以得到純的A-P並將其轉化成銨鹽形勢，然後凍幹。檢驗最終組合物任何這些方法製備的純的澱粉樣p肽顯示出所觀察到的質量為4645至4648Da(圖4)。這與預計所用的DNA表達序列存在N-末端甲硫氨酸一致。基於表達所用的各表達序列，其他克隆的澱粉樣P形式也顯示出預期的質量。實施例IV從重組P-澱粉樣蛋白中製備球聚體標準流程按比例增加時使用倍增因數。步驟1:2X3mg人澱粉樣P(1-42)(BachemBiosciences,KingofPrussia,PA)+2X500uLHFIP(六氟異丙醇)(6mg/mL懸浮液)溶於兩個1.6mL移液管(2x500pL部分)(EppendorfNorthamerica,Westbury,NY);於37。C震蕩1.5h(產生澄清溶液)；步驟2:在真空離心千燥器中乾燥1.5h;步驟3:溶於2等分各132juLDMSO的重懸的乾燥材料在水浴中用超聲處理20秒，在平板震蕩器上輕微震蕩10分鐘；和步驟4:儲存於-20攝氏度，以備進一步使用。這產生了溶於DMSO的5mM澱粉樣P(l-42)儲存懸浮液第1天結束步驟5:15mLFalcon管注滿690juL20mM磷酸鈉；140mMNaCl;pH7.4緩沖液；步驟6:加入60juL溶於DMSO的5mM澱粉樣P(l-42)儲存懸浮液(400juM澱4分樣P(l-42));步驟7:加入75ju1含2%SDS的水(0.2%SDS);步驟8:於37。C溫育6-8h;和步驟9:加入2475|uL水，用水稀釋4倍，最終體積為3.3mL(132/60X3.3=7.26mL)步驟10:於37。C溫育18-20h,第2天結束，第2晚步驟lla:以3000xG離心10分鐘；步驟llb:或者(濃縮前，如果要交聯)步驟lla後交聯,-步驟12:用30kDaCentriprep(MilliporeInc,Billerica,CA)濃縮上清液至1mL;步驟13:用PBS/4(PBS=石岸酸緩衝鹽液，1mMKC1,154mMNaCl,4mM磷酸，pH7.4;PBS/4=用水稀釋1至4倍的PBS,最終pH7.4)透析樣品過夜，於4C用12-15kDa定點管離心濃度在移液管中以10,000xG10分鐘(澄清的沉澱)並等分成2S0uL,冷凍於JOC進行Bradford、Sup-12的SDSPAGE。第3天結束只要一次處理足夠的肽，通常能得到高產量。備選/替換法步驟12:用YM10膜在攪動的小室(Amicon,MilliporeInc,Billerica,CA))上進行濃縮；步驟13:用PBS/4平衡的SephadexG25柱進行替換透析。為了代替Bradford法，使用計算的吸收度。實施例V由此製備的重組B-澱粉樣蛋白和球聚體的特徵在不同研究位置上用製備的單克隆抗體進行ELISA來比較合成的和源於重組的澱粉樣。圖5是用大腸桿菌種產生的Met-AP1-42肽製備的AP球聚體的直接ELISA。通過以濃度依賴性方式結合球聚體特異性抗體來證明顯示出的球聚體表位。檢測到兩種不同的抗體A,其由不同洲的分開的實業公司製備(1^=1^(1^^^51^『611;八？=AbbottPark)。抗體B不能識別全長APl-42肽製備的球聚體，因此不能結合球聚體。ELISA比較鑑定出現在全長和截短的重組澱粉樣球聚體中的球聚體表53魚圖6提供的ELISA數據顯示了在檢測含重組人澱粉樣肽Metl-42的全長球聚體時小鼠單克隆抗體A、C、D和B之間的差異(圖2)。該圖顯示，抗體A以比抗體C和D更低濃度識別(更緊密結合)這些球聚體，其都能比10F11單克隆抗體更緊密地結合。通過比較，圖7提供的ELISA數據顯示了，所有抗體識別用蛋白水解酶嗜熱菌蛋白酶截短的球聚體，其(主要)包含從殘基20至殘基42的澱粉樣序列(參見圖2)。該ELISA數據顯示，這些抗體已幾乎相同的親和性識別截短的球聚體。綜合圖6和7，表明抗體A對球聚體表位是高度選擇性的(如以下NMR衍生的結構數據所定義的)。抗體C、D和B有區別地優先結合截短20-42序列形式(圖2)的澱粉樣。對截短的澱粉樣蛋白選擇性的最大差異由抗體B顯示出。基於表位相互作用中的這些差異，更優選帶有像抗體C或D抗體那樣的表位結合特徵的抗體，而最優選帶有抗體A表位結合特徵的抗體，用於結合含在20-42(或20-43)澱粉樣序列範圍內的球聚體表位。進行點印跡分析抗9種不同的合成的澱粉樣P和APP製品的一系列mAb(A、B、C和D)(數據未顯示)。除了確證圖5、6和7所示的ELISA結果，這些點印跡與以下提供的NMR結構數據也形成了確立反應性表位(特別是"關閉"形式的P澱粉樣構象轉換的)的優選實施方案的基礎(圖3)。在該關閉形式中，暴露出表位並可用於免疫反應。在"開》文"的形式中，澱粉樣原纖維迅速聚集形成較大的完全平行摺疊結構，因此作為不同表位而無更長的可利用度。(纖維形式幾乎互斥性地與單克隆抗體C反應，而單克隆抗體A與二醛交聯或未交聯的球聚體和截短的澱粉樣20-42反應。而單克隆抗體D和B與嗜熱菌蛋白酶截短的或嗜熱菌蛋白酶和EndoGluC截短的序列12-42反應(數據未顯示)。ELISA材料微滴定板來自NuncImmunoPlate,其平底，有Maxi-Sorb表面(目錄號#439454)。綴合物(第二抗體)是來自JacksonImmunoResearch的驢抗小鼠HRPO綴合物(目錄號弁715-035-150)。HRPO底物是3,3',5'5'-四曱基對二氨基聯苯液體底物(TMB)(Sigma,(目錄號#T4444)。脫脂奶粉(NFDM)來自BioRad(目錄號#170-6404)。所有其他化學物質來自常規來源。緩衝液和溶液PBST緩衝液用0.05%Tween20製備的Sigma於100mLPBST來製備含0.5%BSA的PBST。封閉溶液是含3%NFDM的PBST。綴合物稀釋劑是含1%NFDM的PBST。包被緩衝液是100mMNaHC03(pH8.2)。HRPO終止溶液是2MH2S04。ELISA板的包被要測試的澱粉樣球聚體用包^皮緩沖液稀釋成1.0ug/mL。每孔加入100uL來包被。用封板膜密封孔並置於4。C過夜。平板的封閉/人孔中去除包^皮溶液。用150uLPBST(可選)洗孔2-3X。加入300uL封閉溶液(含3%NFDM的PBST)。然後用封板膜覆—蓋孔並於室溫震蕩溫育2小時。ELISA第一抗體從孔中去除封閉溶液。用UOuLPBST(可選)洗2-3X。加入100uL第一抗體溶液。對於全長met+AP1-42球聚體，使用0.04至100ug/mL的抗體5F7溶液。用含0.5%BSA的PBST稀釋抗體，用封板膜覆蓋並於室溫震蕩溫育2至3hr。ELISA第二抗體(HRPO綴合物)從孔中去除第一抗體溶液，用150uLPBST(必需)洗2-3X,並加入200uL用含1%NFDM的PBST以1:5000稀釋的第二抗體(HRPO綴合物)溶液。用封板膜覆蓋孔並於室溫震蕩溫育lhr。底物顯色從孔中去除綴合物溶液，用200uLPBST(必需)洗2-3X。然後每孔加入100uLHRPO底物溶液。然後讓其顯色，進行觀察(即，藍色)。(通常在室溫進行反應5-10分鐘。)每孔加入50uL終止溶液，使顏色由藍變黃。用微滴定板讀數儀在對空進行A450nm讀數。最好在加入終止溶液的30分鐘內讀數。用嗜熱菌蛋白酶截短球聚體向約20mL9mg球聚體加入45ul含4mg/ml嗜熱菌蛋白酶(Calbiochem)的PBS(180ug嗜熱菌蛋白酶或9000uL/180uL以約1比50(v/v)稀釋)。讓反應在室溫進行過夜。第二天早上，可看見反應混合物是澄清的。加入0.5mMEDTA以終止嗜熱菌蛋白酶反應。為了製備用於分析的最終產物，如下進行色譜用氬氧化銨調節1mL截短的球聚體至pH10。然後將其用於7mm聚合物反相柱，以去除SDS(polymerlaboratories,AmherstMA.)並以1%/分鐘梯度洗脫。主要洗脫級分含純化的截短的(20-42)球聚體。點印跡材料、過程和樣品的製備一組多種合成的澱粉樣^和阿耳茨海默前體蛋白質(APP)作為抗原以不同濃度(IOOpmol，10pmol,1pmol和0.1pmol)點樣在硝化纖維摺紙(轉印跡轉移基質(目錄號55162-0113)純硝化纖維膜(0.45jum,BIO-RADLaboratories,Inc.,2000AlfredNobelDrive，Hercules,CA)上，用Hamiltan注射器電樣成約2-5mm的點，並用氣流乾燥(欄1-10)。檢測試劑NBT/BCIP片(目錄號l697471),其來自德國的RocheDiagosticsGmbH,RocheAppliedScience,Nonne歴ald2,82372Penzberg。牛白蛋白SIGMA-ALDRICH(目錄號A-7888)(BSA),來自St.Louis,Missouri63178。封閉含5%脫脂奶^f分的TBS。緩沖溶液TBS,25mMTrisHCl-pH7.5,150mMNaCl;TTBS,25mMTrisHClpH7.5,150mMNaCl,0.05%Tween20;PBS,20mM碌酸,pH7.4,140mMNaCl,0.2mg/mlBSA抗體I:0.2jug/ml抗體(每膜20ml=〉4pgAb),其溶於含1%脫脂奶粉的TBS。抗體II:1:5000稀釋(20mlper膜=>4Ab)的抗小鼠-AP,其溶於含1%脫脂奶4分的TBS過程1)1jul抗原稀釋液(l-5)以約1cm距離點樣。2)於室溫乾燥10分鐘。3)封閉加入30ml含5%脫脂奶粉的TBS來封閉膜並於室溫溫育1.5h。4)洗滌輕輕倒出封閉溶液並於室溫用20mlTTBS洗膜10分鐘。5)抗體I:用含1%脫脂奶粉的TBS稀釋第一抗體至0.2yg/ml。每膜用20ml。於室溫溫育過夜。6)洗滌:用20mlTTBS進行2次，每次10分鐘，用20mlTBS進4亍1次，10分鐘。7)抗體II:用含1%脫脂奶粉的TBS稀釋第二抗體至1:5000。每膜用20ml。於室溫溫育lh。8)洗滌用20mlTTBS進行2次，每次10分鐘，用20mlTBS進4亍1次，10分鐘。9)顯色將1片NBT/BCIP溶於20ml水中。輕輕倒出洗液並用顯色溶液覆蓋膜約10分鐘。封閉:用水洗各樣品如下製備按照S.Barghorn等JoN.2005,95,834-847來製備澱粉樣P(1-42)球聚體。含澱粉樣P(l-42)的HFIP如下製備1mg/ml澱粉樣P(l-42)於37。C溶於HFIP1.5h;在真空離心乾燥器中乾燥；將乾燥的材料重懸於DMSO中；稀釋於含0.1%聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物F68的PBS中，於20攝氏度攪拌lh;以3000g離心20分鐘。沉澱重懸於含1%聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物F68的PBS中；超聲處理20秒並用水以1:6.7稀釋，在20攝氏度攪拌lh。然後，以3000g離心樣品20分鐘，棄去上清液並存於-80攝氏度。由上述澱粉樣P(l-42)球聚體製備澱粉樣P(20-42)球聚體。由澱粉樣P(l-42)球聚體如下製備交聯的澱粉樣P(l-42)球聚體於室溫用1mM二醛處理lmg/ml澱粉樣P(l-42)球聚體2h,然後於RT用5mM乙醇胺處理30分鐘。根據Lambert等PNAS95,6448-6453,1998製備ADDL的。如下製備截短的澱粉樣P(12-42)球聚體:用1/93(v/v)EndoGluC蛋白質酶(RocheBiosciences,Indianapolis,IN)於20攝氏度處理澱粉樣P(l-42)球聚體20h;用過量二異丙基氟代磷酸(DIFP)終止反應；然後用30kD分子量定點離心製備法濃縮並用1/4PBS透析，其中透析液調節成有0.1%SDS含量;透析後將其存於-80攝氏度。如下製備含澱粉樣P(l-40)的HFIP:於37攝氏度將1mg/ml澱粉樣(3(l-40)溶於HFIP中lh;在真空離心乾燥器中乾燥，重懸的乾燥材料溶於DMSO並存於-80攝氏度；如下製備含澱粉樣P(1-42)的0.1%NH40H:1mg/ml澱粉樣P(1-42)溶於0.1。/。NH4OH並存於-80攝氏度。如下製備澱粉樣P(l-42)纖維1mg/ml澱粉樣P(1-42)溶於0.1%NH40H;以1:4用PBS稀釋；用HCl將pH調節至pH7.4;於37。C溫育20h;以10000xG離心10分鐘；重懸沉澱於PBS中並存於-80才聶氏度。APP(第一個點lpmol)由SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO提供。未預料的結構特點和生物物理特徵a)流體力學特點圖10描述了由重組MetA-P1-42製備的球聚體的流體力學分牙斤(沉積速度和動力學光散射(DLS))結果。上欄描述了一系列如上所述製備的重組Met-AP球聚體的有代表性的沉積速度圖譜，而且所述球聚體在2.5mM磷酸鈉、0.65mMKCl、34.5mMNaCl(pH7.4)中離心。如箭頭所示，掃描時間向右增加，圖譜包括一系列由BeckmanXLI分析型超離心產生的各S形掃描結果。上欄的x軸距離離心中心有幾釐米，而y軸是幹涉帶的相對位移。下欄描述了在所有分析時間期中完全沉積分布(上欄)的C圖，其是根據Schuck(BiophysicalJournal,2000，78:1606-1619)用SEDFIT來計算的。得自動力學光散射的C分析和獨立的結果在圖中有概述。它們表明，球聚體具有約63kDa的分子量，其大約相當於球聚體包含14個Met-A-P單體(14x4645)=65030Da。b)用於分析型超離心、沉積速度實驗的實驗規程用藍寶石窗將樣品上樣於標準的兩部分小室中。用4洞或8洞轉子檢測所有樣品。條件如下溫度20C,轉子速度42,000rpm,收集幹涉數據；以連續模式用0.003cm的徑向步長收集280nm處的吸收數據。每步收集一個數據點(不進行信號平均)。通常，在不大於9小時的進程中收集200個掃描點或更少。c)擬合數據用兩個互補方法來擬合數據如在SEDFITv8.9(Schuck,2000)中執行的，進行連續S分布分析(C分析，圖7),來理解樣品的整體異質性。用最大熵算法擬合徑向和時間獨立性噪聲並從數據中去除。用程序SVEDBERG(Philo,J.S.,1997,BiophysicalJournal,72:435-444)將未處理的移動界面譜(圖6,上欄)擬合成改良的Fujita-MacCosham函數。這能確定沉降係數(S)和擴散係數(D),由此來計算由該模型說明的物質種類的分子量(Mr)。對於該分析，可視化檢查掃描結果，並僅用合適的掃描結果。挑出掃描結果的標準包括足夠清除出半月板和有足夠的剩餘高水平區域留下(即，沒有沉積太遠)。^t型包括單一種類和多個種類(最大多至3)。d)擬合結果C分析C分析提示了主要單一種類帶有S~4，也會出現少量較高階58的集聚。該較大的種類峰有點寬，這提示了可能存在多個未解析的種類。將摩擦係數全局擬合(所有種類)成f/f0=1.54,這提示了出現的寡聚物不是簡單的球。SVEDBERG分析:儘管可能用單一種類來擬合數據，但在加入額外的潛在種類時可得到更好的擬合。通過殘餘的較低系統變量和擬合參數適合度降低38%，來判斷擬合是否改善。對於主要成份(基於種類去巻積而得的92%的材料)，擬合回歸到值為S2o,w=4.1、和D2o,w二5.5。利用這些值得到Mr為68kDa,這表明寡聚物有14個肽單位。得到形狀因數f/fo^1.42,這再次表明是更長的球形。為兩組分由寬分布的較大的S值代表，這表明它們可能包含少量(小於10%)未解析的較高階聚集體。使結果清晰可見的互補分析方法使^t型適應分子量的修正值——其代表球聚體組裝體中特定數量的寡聚物。然後，由這些擬合得到的殘差平方的總合對每個可能的球聚體大小增加值作圖。該分析出現在用於兩個成分(主要成份是球聚體，次要成分是較高階的種類)擬合的圖21中。在該圖中，通過固定推測的聚集體分子量(Mr增加值=4645)進行擬合主要成份10至18肽的寡聚狀態，並在SVEDBERG中進行擬合。得到的擬合適合度參數(平方和)對每個球聚體的肽的數量作圖，用於強制擬合。最小值(最低擬合誤差)出現在每個球聚體有約14個肽的寡聚狀態。全面的沉積分析提示，球等量半徑約為3.6nm,而DLS提示值為約3.9nm。用裝有APD檢測儀的雷射散射系統(ALVInstruments,德國)進行DLS研究。雷射波長為647nm寬的氪離子雷射(CoherentInstruments:CA),而且選擇的散射角介於40和150度。在水浴控制的20C溫度時測量樣品。利用正身見化(拉普拉斯導位算法(參見如，SPIEProceedings第1430巻"PhotonCorrelationSpectroscopy:MulticomponentSystems"糹扁者K.S.Schmitz,ISBN:0-8194-0520-5,第266頁)來進行多成分的相關函數分析。用能反向散射APD檢測的DLS平板讀數儀DynaPro(ProteinSolution,WyattInstruments,CA),用158度的散射角進行額外的DLS測量。二極體雷射具有819.7nm的發射波長；檢測但不控制溫度(T-25C)。e)原子力顯微鏡觀察球聚體圖14描述了球聚體(上欄)和金納米球(下欄)有代表性的AFM掃描結果。X和Y軸的維度相等，沒個顯示出長度為250nm的標記。在相同設置的條件下掃描每個樣品，在每種情況下，秋聚體和納米球長度似乎延伸了3至5nm(Z軸)。根據NIST(NationalInstituteofStandardsandTechnology)3D參考標準，用20nm深的凹槽進行Z軸的絕對校準。標準得自Nanodevices公司(VeecoInstruments的分支機構,WoodburyNY)。該標準(N^O)得到的重複高度測量值揭示平均高度為19.卯9nm而且標準差為0.228nm。Veeco/DigitalInstruments保證4吏高度測量4交準成0至20nm範圍內的線性關係。為了確定球聚體高度範圍內的AFM性能，而且為了評估AFM頂部的側面4醜曲來測量X和Y維度，用AFM測量膠體金納米球(直徑平均為5nm)。金納米球購自Sigma(StLouis,MO,目錄號弁G-1402,1otl03K91851),而且Sigma的技術專家聲明顆粒將顯示出3.5至6.5nm的大小範圍。使用金納米球，因為AFM成像工具頂部以輕敲模式AFM通常所用的力不能壓縮這些納米球。通過比較，以前顯示當用AFM成像時，澱粉樣聚集體輕微扭曲(Stine等，1996)。廠商(Veeco/DigitalInstruments)指定AFM頂部曲率半徑為10nm(Veeco模型#TESP,其頂部實際由NanoWorldAG(Neuchatel,瑞士)製造；type:NCH-W，單位號:12543L320,彈簧常數28-54癒)。根據成<象測定，金納米球(實際為3-5nm)似乎有約15nm的直徑，這表明側邊圖像失真因數為4至7。上圖中單圖像的球聚體測得約23nm或去掉了側邊扭曲約3.2至4.2nm。這些尺度符合由(以上)流體力學和光散射分析確定的球等量半徑。用水由Barnstead納米級純水系統(APSWaterServicesCorp.,VanNuys,CA)將樣品稀釋至0.029mg/ml的濃度。使用前監測水的電導率，所有所用的水的最小電導率為1S.0MQ-cm。沉積前，用Eppendorf微離心機(EppendorfAG,Hamburg,德國)以14000rpm離心樣品10分鐘。20微升樣品沉積於1/2"直徑的新剪裁的雲母盤(RubyRedMicaSheets,目錄號#71850,ElectronMicroscopySciences,Ft.Washington,PA)上。每個樣品置於帶有溼紙巾的密閉培養皿中，並使之溫育7分鐘。然後，用1ml納米級純水(等分成5-200ul)衝洗每個樣品並使之在輕微流動的氣流下乾燥。在Veeco/DigitalInstruments毫微秒示波器Ilia(Veeco,SantaBarbara,CA)上進行原子力顯微鏡(AFM)分析。用TESP頂部(fo280kHz)進行輕敲才莫式AFM。在高度和振幅衝莫式下於4nm、2nm、和1nm收集圖像。利用切面分析'高度模式，的圖片來確定各球聚體的高度(參見Stine等，1996,J.Prot.Chem.,15,193-203)。圖12、13和14描述了有代表性的球聚體AFM圖像，其在沒有SDS(圖12)、0.05。/。SDS(圖13)和0.2。/。SDS(圖14)的情況下可見。對於這些濃度的Met-AP肽(30ug/mL單體濃度或更大)，在存在SDS的情況下，大大減少了肽迅速(幾十分鐘)形成大密度的纖維聚集體的傾向，而且通過SDS阻止形成這些較高階的纖維聚集體使肽穩定。通過SDS處理產生的全部球聚體穩定了它們，使之不能迅速聚集成較大的纖維形式。據信SDS的十二烷基磺酸鏈上的磺酸部分能通過肽的球聚組裝物結合的負電荷的磺酸基之間的電荷-電荷排斥，來阻斷聚集成更大的種類。由於在製備球聚體的過程中降低了SDS濃度(圖8),透析後僅保留了殘存量。該過程得到的肽的球聚組裝物的獨特結構/構象(圖20-24)(由於它們本身構象特點)而由此不能迅速聚集形成分子量有幾十萬或數百萬道爾頓的大纖維聚集體。這些穩定的球聚體出現獨特的表位區域(不同於澱粉樣原纖維上的表位)，其能與人自體抗體和小鼠單克隆抗體反應(圖5-7)。在生物學上，體內產生澱粉樣肽發生在細胞膜的天然中(圖23)。在該場合下，澱粉樣肽總是暴露於並甚至嵌入細胞膜。常規的生物學知識為，該膜包括雙層兩性分子的生物液體。因此預計用於產生球聚體的SDS;f莫擬了細胞液體膜的天然兩性分子環境。在該兩性分子環境中，澱粉樣蛋白自組裝成出現(暴露)了前述表位區域的球聚結構。體外過程得到的球聚體已經用於確定呈現出表位的肽二級結構(圖17-24)，從而用於選擇和設計合適的治療性(阻斷)單克隆抗體。這些球聚體也已用於產生能活化抗阿耳茨海默氏病免疫的潛在疫苗。另外，這些球聚體也已用作為分子工具來發現小分子試劑(藥物)，其能阻斷球聚體形成或改變球聚體與其他細胞實體相互作用，由此減輕或消除疾病進程。另外，也可用穩定的球聚體，來產生診斷測試方法以預測疾病傾向或監測治療劑的功效。預計超過SDS的兩性分子試劑單獨或與已知的天然脂肪酸或去汙劑的組合也將用於在體外製備球聚體。預計可用於製備球聚體的化學試劑的部分列表包括以下種類的一種或多種辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十二酸、十四酸、11,14-二十二烯酸、13-二十二烯酸胺、13-epi-12-氧植物二酸、13(Z)-二十二烯酸，17-十八碳炔酸、1-二十烷醯基甘油、l-二十烷醯基甘油-d5、2-二十烷醯基甘油、2-二十烷醯基甘油-d5、2-二十烷醯基甘油醚、2-氟棕櫚酸、2-羥基肉豆蔻酸、2-61亞油酸甘油，3-闢u代十四酸、4,5-去氬二十二碳六烯酸、5,6-去氫花生四烯酸、7,7-二甲基-5,8-二十二烯酸、8,11-二十二烯酸、9,12-十八烯酸、9-十八胺腎上腺酸、a-亞油酸、a-亞油酸乙醇胺花生四烯酸、花生四烯酸-d8、花生四烯酸曱基酯、花生四烯酸(無過氧化物)、花生四烯酸(鈉鹽)、花生四烯酸乙醇胺、花生四烯酸乙醇胺-d8、花生四烯酸甘氨酸、花生四烯酸m-硝基苯胺、花生四烯酸p-硝基苯胺、花生四烯酸三氟曱基酮、cis-十八碳四烯酸、綴合的亞油酸(10E,12Z)、綴合的亞油酸(9E,HE)、綴合的亞油酸(9Z,UE),癸醯基m-硝基苯胺、癸醯基p-硝基苯胺、二高-Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸乙酯、二高-Y-亞麻酸曱基酯、二高-y-亞麻酸乙醇胺、二十二碳六烯酸、二十二碳六烯酸-d5、二十二碳五烯酸、二十二碳四烯酸乙醇胺、二十二碳三烯酸、二十碳五烯酸、二十碳五烯酸(無過氧化物)、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸(112,14z,17z)、二十碳三烯酸(5z，8z,iiz)、二十碳五烯酸、反油酸、y-亞麻酸、月桂酸、反十/^碳烯酸、亞油酸、亞油酸-d4、亞油酸(無過氧化i物)、亞油醯乙醇胺，蜂蜜酸乙醇胺、曱基a-亞油酸氟代磷酸、曱基花生四烯酸氟代磷酸、曱基Y-亞麻酸鹽、甲基Y-亞油酸氟代磷酸、N-油醯甘氨酸、N-油醯牛磺酸、N-椋櫚酸牛^黃酸、N-硬酯醯牛^黃酸、油酸、油酸-2,6-二異丙基苯胺、油醯乙醇胺、油醯苯胺、油醯三氟甲基酮、co-3花生四烯酸、co-3花生四烯酸-d8、軟脂酸、軟脂醯乙醇胺、軟脂醯三氟曱基酮、植烷酸、硬脂酸、硬脂酸甲基酯、硬脂醯乙醇胺、創傷酸、傘形基花生四烯酸、1-丁烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、1-庚烷磺酸鈉、辛基磺酸鈉、壬基磺酸鈉、(十二烷基磺酸鈉)十二烷基磺酸鋰、1-十二烷磺酸鈉，十四烷基磺酸鈉、十六烷基磺酸鈉、已烷磺酸鈉、十八烷基磺酸鈉、月桂醚磺酸鈉、2-羥基-3-硫代丙基十二酸、N-月桂基肌氨酸二辛基硫代琥珀酸鹽、D0SS、二-2乙已基硫代琥珀酸鹽和鈉鹽。f)球聚體的等溫滴定熱量測定圖15描述了單克隆抗體A與由重組MetA-Pl-42製備的球聚體結合結果。用等溫滴定熱量測定(ITC)來直接測量結合。在該實施例中，熱量計小室包括濃度為86微摩爾(基於單體單位)的澱粉樣P。用132微摩爾的抗體滴定。兩者溶於含35mMNaCl(pH7.4)的5mM磷酸鈉緩衝液中。擬合的解離常數(結合Kd)為4卯納摩爾(或0.46uM),觀察到的結合焓為每摩爾-47.5千焦耳，而且結合的表觀化學計量為每個抗體分子有6.3個澱粉樣P分子。綜合流體力學分析(圖13和21),這提示每個球聚體單元有約兩個抗原結合位點。g)NMR特徵樣品製備:同位素購自Cambridge同位素實驗室和Isotec。所用製備用於NMR研究的標記的樣品使用最少培養基[Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989]。將N-Met1-42肽克隆進pET29a載體並在大腸桿菌BL21(DE3)株中表達。於36攝氏度搖瓶培養細胞，直至OD達到1.0,然後於42攝氏度表達2小時。均一["N]-標記的樣品培養於含1g/L15NH4C1和3g/L葡萄糖的H20培養基中。均一["N,2H]-標記的樣品培養於含1g/L15NH4C1和3g/LD-葡萄糖-dl2的D20培養基中。均一["N,2H]-標記的樣品培養於含1g/L15NH4C1和3g/LD-葡萄糖-dl2的D20培養基中。均一["N,2H,13C]-標記的樣品培養於含1g/L15NH4C1和3g/LD-葡萄糖-d12的100%020培養基中。2H背景中帶有Ile、Val、Leu殘基的選擇性"C-標記的質子化曱基的均一["N]-標記的樣品通過在培養基中培養細胞來製備，所述培養基含100%D2O、D-葡萄糖-d12(3g/L)、和15NH4C1(1g/L),並向培養基添加3-"C-ot-酮丁酸酯(標記異亮氨酸曱基用50mg/L)和3,3-13C2-oc-酮異戊酸酯(同時標記纈氨酸和亮氨酸曱基用100mg/L)。表達的肽如以上實施例III所述的進行純化。通過使用Barghorn等(J.Neurochem.200595,834-847)公開的規程，用含1.5%SDS-d25和lx磷酸緩衝鹽液(pH7.4)的緩衝液(GIBCO)製備並濃縮NMR樣品成終濃度為16mg/ml。為了製備混合的樣品，帶有不同標記方案的純化的肽以1:1比率混合，然後根據規程進行樣品製備。NMR譜:於25。C在BrukerDRX600或DRX800NMR光語計上收集NMR譜。用三重共振實-驗(HNCA,HN(CO)CA,HN(CA)CB,HN(COCA)CB)[T.Yamazaki,等，J.Am.Chem.Soc.116,11655-11666,(1994)]用均一[15N,2H,13C]-標記的樣品分派主鏈的12H、15N、和13C共振值。用均一"N-標記的樣品由15N-編輯的NOESY譜來分派^a和側鏈信號共振值[S.W.Fesik,等，J.Magn.Reson.78,588-593,(1988);G.M.Clore,等，Meths.Enzymol.239,349-363,(1994)]。用2H背景中帶有Ile、Val、Leu殘基的選擇性13C-標記的質子化甲基的均一"N-標記的樣品由3D"N-解析的NOESY實-瞼來分派主鏈醯胺NH-NHNOE63值。如前述，用混合樣品進行15N-過濾的和15N-編輯的3DNOESY實驗[M.Ikura,等，J.Am.Chem.Soc.114,2433-2440,(1992);G.W.Vuister,等，J.Am.Chem.Soc.116,9206-9210,(1994)],所述樣品中[U-15N2H]-標記的和[U-"N,2H]-標記的樣品以1:1比率混合。分離的混合的樣品用於15N-過濾的和15N-編輯的3DNOESY實驗中，所述樣品中[U-15N,2H]-標記的肽和含IVL殘基的選擇性130標記的質子化甲基的[U-14N,2H]-標記的肽以1:1比率混合。這些實驗中所用的NOESY混合時間範圍為80至400毫秒。結構計算:根據模擬退火規程[M.Nilges,等，FEBSLett.229,317-324,(1988)]用程序CNX[A.T.Bmnger,等，ActaCrystallogr.D54(Pt5),905-21,(1998)]計算P-澱粉樣肽N-met1-42重複單位的結構。結構計算中包括了由分析NMR數據得到的總共178距離約束。另外，基於Cot和CP化學位移的分析，結構計算中包括了P摺疊區域中的444)角約束[G.Cornilescu,等，J.Biomol.NMR13,289-302,(1999)]。總之，製備澱粉樣P肽N-Met1-42(被稱為APl-42)的可溶球聚體並通過NMR來研究。15N-標記的AP1-42在90%H20/10%D20溶液中的"N"H異核單量子關聯能譜法(HSQC)圖譜(圖23A)清楚顯示，相對於溶液中未知摺疊的肽的化學位移，圖譜中的交叉峰^艮好地被分散了並向前場高度轉換。在交換到100%020溶液中後，一天後在020中仍能清楚地觀察到了向前場轉換的胺(圖16B),這表明這些胺質子受保護不備溶劑化和可能的氳鍵化。這些結果表明，溶液中觀察到的AP1-42形式是高度結構化的。另夕卜，對均一211,15N，和"C-標記的形式的AP1-42集成一套NMR三重共振主鏈實驗。15N"HHSQC譜中大部分位移的交叉峰被分派為各主鏈醯胺。基於Ca和Cp共振分配的化學位移，發現兩個P鏈存在N-MetAP1-42的殘基17-23和28-39(圖17和20)。通過使用不同的同位素-標記的樣品，觀察到的分子內對分子間NOE在"N-過濾的和15N-編輯的3DNOESY實驗中有差異。數據分析和結構計算表明觀察到的N-MetAP1-42結構包含混合的平4亍/反平行P摺疊(圖s20,21和24)。這些對N-MetAP1-42溶液的NMR研究提示，J求聚體途徑中肽摺疊展示出的結構不同於如Sciarretta等(Biochemisty2005,44，6003-6014)所述的原纖維途徑的原纖維聚合結構。最小重複性鏈內和鏈間相互作用是64^L察到的那些並如本文所述。實施例VI開發雜交瘤細l包系的實例用大量現有已知的技術製備單克隆抗體，包括應用雜交瘤、重組、和噬菌體展示技術、或其組合。例如，用雜交瘤技術製備單克隆抗體，所述技術包括現有已知的和教導的那些，例如參見Harlow等，Antibody:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版.1988);Hammerling,等,參見MonoclonalAntibodiesandT曙CellHybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(所述參考文獻全文那如本文參考)。本文所用的術語"單克隆抗體"不限於通過雜交瘤技術製備的抗體。術語"單克隆抗體"指衍生自單一克隆(包括任何真核、原核、或噬菌體克隆)的抗體，而不是產生其的方法。本文所述的用於生產一種單克隆抗體(例如，單克隆抗體A)的特定規程如下免疫小鼠:用含50ug抗原的CFA皮下免疫Balb/c和A/J小鼠(6-8周大)。每個三周用含50ug抗原的Immuneasy(Qiagen)強4匕免疫動物，總共進行3次強化。融合前4天，用10ug抗原靜脈內強化免疫小鼠。細胞融合和雜交瘤篩選用標準技術免疫的動物的脾細胞與SP2/0-Agl4骨髓瘤細胞以5:1的比率融合。融合後7至10天，當觀察到肉眼可見的克隆時，用ELISA測試抗體與AP20-42的SN。通過限制稀釋來按比例增加ELISA陽性孔中的細胞病進行克隆。抗體同種型的確定:用ZymedEIA同種分型試劑盒確定抗A|320-42Mab的同種型。4姿比例增加並純化單克隆抗體:雜交瘤在培養基中擴大培養，所述培養基含5%低IgG含量的胎牛血清(Hyclone)。收穫上清液並濃縮。用蛋白質A層析並在PBS中透析來純化Mab。血清滴度:用20-42免疫10隻小鼠。所有小鼠血清轉化至1:5000-10,000的ELISA滴度(1/2MaxOD450nm)。用非Met形式的澱粉樣P蛋白質生產本文所述的單克隆抗體A、B和D。用非Metl-42形式的澱粉樣P蛋白質生產本文所述的單克隆抗體C。65實施例VII用C"-SDS使SDS與A0球聚體結合13.5mLAP球聚體用0.05%SDS濃縮成0.62mL。0.3mL該濃縮的材料用於10mLEconoPacDG10柱。手工收集0.25mL級分。圖X的小圖表顯示出用SDS洗脫的游離單體區域，其帶有擴展的y軸。提供了肽(實心方塊)和SDS(實心圓)的濃度、以及SDS與肽(空心三角)的比率。SDS與球聚體峰(級分14和15)上的肽的比率介於每分子肽有約0.5至約1.5分子的SDS。層析分離顯示通過進行大小排阻層析使SDS與AP肽分離了。結果如圖25所示。在文獻中，用放射性標記的去汙劑和大小排阻層析測量蛋白質-去汙劑聚集體中結合的去汙劑的量是很成熟的。Tanford和同事已經使用它研究各種蛋白質，包括牛血清白蛋白(Makino等，(l973),J.Biol.Chem.,248:4926-4932)、幾種在SDS中的蛋白質(Tanford等，(1974),Biochemistry,13:2369-2376);並被引用作為表徵去汙劑溶液中的膜蛋白的常規方法(Tanford和Reynolds,(1976),BBA,457:133-170)。Moller和同事也已經用該方法進行研究去汙劑與膜蛋白的結合(Moller和leMaire,(1993),J.Biol.Chem.2658:18659-18672)。LeMaire和同事也已經廣泛使用該方法，尤其用0&2+-依賴性ATP酶(Rivas等，(1982),Anal.Biochem.，123:194-200)。主要才艮據Hummel和Dryer((1962),BBA,63:530-532)首次描述得早期研究蛋白質-酉己體相互作用的工作，Helenius和Simmons專門修改了該方法來檢測蛋白質去汙劑相互作用((1972),J.Biol.Chem.,247:3656-3661))。去汙劑與蛋白質在大小排阻層析柱上的共遷移證明了蛋白質和去汙劑間的物理相互作用。根據Helemus和Simmons(同前)，"結合蛋白質的去汙劑的量能通過與蛋白質共洗脫的放射活性的去汙劑的量來測量。"該技術部分基於以下需求，即層析凝膠要有效地排除蛋白質而包括配體(在球聚體的情況下是SDS)(Andreu,(1985),MethodsinEnzymology,117:346-354)。在這些實-驗中，我們在SDS的CMC(臨界膠態濃度)以下工作，由此去汙劑分子溶解成單體。作為單體，它們進入脫鹽樹脂(如所用的DG10)的孑L中，而AP球聚體將被排除掉。因此，樹脂能有效地從AP球聚體和任何結合它們的SDS中分離游離的SDS。發現與AP球聚體共遷移的SDS被描述成是結合的。在經典使用該方法的情況下，大小排阻柱在背景水平的SDS中平衡。然後觀察SDS與蛋白質的結合，如果伴隨有蛋白質洗脫，則去汙劑水平會提升高於該背景水平。在本文中，在緩沖液中缺失任何竟爭性去汙劑的情況下，通過SDS結合來進行檢測。該方法提供了結合SDS的更嚴緊的探針，因為沒有現成提供的游離SDS來代替層析期間任何排除出AP球聚體的那些。可是，它導致洗脫球聚體峰中肽與SDS的表觀化學計量比率改變，因為層析時插入(凝膠層析基質)的SDS與洗脫的AP球聚體不完全分離(因為它結合於球聚體)。實施例VIII比較球聚體和原纖維形式的澱粉樣P肽的主鏈醯胺保護作用球聚體的主鏈醯胺交換實驗水性緩衝液中的球聚體樣品在液氮瓶中冷凍並凍幹過夜。這些凍幹的樣品中的一些儲存於-70攝氏度並用作參照樣品(不溶於D20中)。然後將剩下的凍幹的樣品溶於D20中。在4攝氏度下交換性H/D交換發生的不同時期之後，將這些樣品在液氮瓶中冷凍以終止H/D交換並凍幹。然後，在用含0.07%氘化的二氯乙酸(Cambridge同位素同位素實驗室公司，Andover,MA)的480ulDMSO-d6(Cambridge同位素實驗室公司Andover,MA)溶解這些交換了的樣品以及未交換的(參照)樣品之後，在3分鐘內收集1維和2維"N"HHSQC譜。在酸化的DMSO-d6中溶解球聚體之後，多聚球聚體被轉化成單體。通過集成一套使用[U-15N,13C]-標記的樣品的主鏈實驗(T.Yamazaki等，(1994)J.Am.Chem.Soc.116,11655-11666),來分派在酸化的DMSO-d6溶劑中的該單體形式的澱粉樣P肽的"N"HHSQC譜的值。根據這些分派值，分析澱粉樣.P肽的各殘基的峰強度並得到它們的主鏈醯胺保護因數。保護因數被定義為D20中交換後觀察到的樣品交叉峰強度與沒有進行D20交換的樣品強度的比率。這些交換實驗中用的單體濃度為0.5mM。基於IDNMR語的脂肪族CH3區域強度來校準保護因數計算中所用的峰強度。前球聚體(早期支被步驟中的肽)主鏈醯胺交換實驗:在含1.5%SDS-d25和lx磷酸緩衝鹽液(pH7.4)(GIBCO/Invitrogen,Carlsbad,CA)的緩衝液中凍幹"N-標記的樣品之後，然後將乾燥的樣品溶於D20中並收集一系列"N/HHSQC譜。在這些實驗中檢測緩慢交換的胺。用Met-澱粉樣P進行實驗，但是為了方便與文獻中的數據(參見下文)進行圖解比較，N-末端Met殘基排除出圖中的欄目中(參見圖26)。保護因數被定義為D20中交換後觀察到的樣品"N"HHSQC譜中交叉峰強度與沒有進行D20交換的樣品強度的比率。對於球聚體，收集主鏈醯胺保護實驗的重複數據集並用於報導它們平均和標準的偏差。排除掉球聚體中的殘基D1、D7、S8、和H14,因為它們在當前實^r中所用的DMSO/酸性溶劑中顯示出固有的快速回復交換率。由於殘基對(Ell和D23)、(V18和V36)、和(D2和141)(如B欄中的星號所示)的譜線重疊，僅能報導這些主鏈醯胺對的平均保護因數。結果，通過評估各殘基展示的最高和最低的保護因數(假設最大保護因數為80%),並通過使用這些界限的標準差，可得到這些重疊殘基所示的不確定性。B欄所示的球聚體的胺保護是針對在D20中交換了5天的樣品。在D20中溫育20分鐘(黑條)和120分鐘(亮灰條)後，根據Olofsson等((2006),JBC281,477-483)得出C欄中的原纖維主鏈醯胺保護。另外，A欄顯示了前球聚體的主鏈分配和胺交換數據。用+和-號分別表示分配的和未分配的殘基。如序列下實心、半實心、和空心圓分別所示，有早期製備階段(前球聚體)肽特徵的主鏈醯胺顯示出緩慢、中等、和快速的交換率。與觀察到中心和C-末端殘基(C欄)的胺交換率緩慢的纖維形式相反，緩慢的交換率主要在前球聚體(A欄)和球聚體(B欄)中的C-末端12個殘基處^L觀察到。因此，這個比較證實了前前球聚體(A欄)和球聚體(B欄)形式的澱粉樣P肽展現出非常相似的胺交換率，這與採用相似核心結構的兩種形式一致。相反，前球聚體和球聚體形式都展示出不顯著同於纖維形式肽的中心區域的NH/ND交換率，這提示它們具有不同於纖維形式的結構核心。68tableseeoriginaldocumentpage69權利要求1.純化的β-澱粉樣蛋白，其與式[X+Y]所示蛋白質有至少70％胺基酸序列同一性，其中″X″包含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自甲硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而「Y″包含天然澱粉樣β蛋白質胺基酸序列的全部或部分。2.權利要求1的純化的P-澱粉樣蛋白，其中"Y"包含所述天然P-澱粉樣蛋白的39至43個連續的胺基酸。3.權利要求2的純化的P-澱粉樣蛋白，其中"Y"包含選自Glu665Asp,Lys/Met670/Asn/Leu,Ala673Thr,His677Arg,Asp678Asn,Ala692Gly,Glu693Gly,GluP93Gln,Asp694Asn,Ala713Thr和Ala713Val的突變。4.權利要求2或權利要求3的純化的P-澱粉樣蛋白，其中"X"是甲硫氨酸。5.分離的核酸分子，其編碼與式[X+Y]所示的蛋白質有至少70%胺基酸序列同一性的P-澱粉樣蛋白，其中"X"含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自曱硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而"Y"包含天然澱粉樣卩蛋白質胺基酸序列的全部或部分。6.含權利要求5的所述分離的核酸分子的載體。7.含權利要求6的所述載體的宿主細胞。8.製備與式[乂+Y]所示的蛋白質有至少70%胺基酸序列同一性的純化的P-澱粉樣蛋白的方法，其中"X"包含位於所述蛋白質氨基末端的一種或多種選自曱硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸的胺基酸，而"Y"包含天然澱粉樣P蛋白質胺基酸序列的全部或部分，其包括以下步驟a.將編碼權利要求1所述P-澱粉樣蛋白的核酸分子轉染入載體;和b.用一段時間並在足以由所述宿主細胞表達所述P-澱粉樣蛋白的條件下將步驟a)的所述載體轉化入宿主細胞。9.權利要求8的方法，其中所述宿主細胞是原核或真核的。10.權利要求9的方法，其中所述原核宿主細胞選自大腸桿菌、桿菌、鏈球菌和乳酸菌。11.權利要求9的方法，其中所述真核細胞選自昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。12.結合權利要求1所述P-澱粉樣蛋白的分離的抗體。13.權利要求12的分離的抗體，其中所述抗體是單克隆或多克隆的。14.權利要求13的分離的抗體，其中所述抗體是單克隆的並是人或人源化的。15.權利要求14的分離的抗體，其中所述抗體具有至少0.50微摩爾的特異結合常數(Kd)。16.權利要求14的分離的抗體，其中所述抗體具有大於每摩爾-30千焦耳的結合焓。17.權利要求14的分離的抗體，其中所述抗體具有每個澱粉樣球聚體至少一個抗體的抗體對澱粉樣球聚體結合率。18.治療或預防需要所述治療或預防的患者中的阿耳茨海默氏病的12所述分離的抗體。19.權利要求18的方法，其中所述分離的抗體通過選自肌肉內、靜脈內和皮下的途徑給藥。20.分離的P-澱粉樣肽寡聚物，其包含1)鏈內反平行方向的殘基19至21和殘基30至32和2)鏈間平4亍方向的殘基34-38,其中所述寡聚物包含對於選自以下的原子對具有分子內質子間距為約1.8-6.5埃的A-P(l畫42)肽F19(NH)-132(NH),F19(NH)-132(HB),F19(NH)-132(HG絲)，A21(NH)-A30(麗)，A21(NH)-A30(HB#),A21(麗)-131(HD1#),A21(NH)畫I31(HG1#),132(NH)-F19(HD1#),132(NH)-F19(HB#)和A30(NH)-A21(HB#)。21.分離的P-澱粉樣肽寡聚物，其包含對於選自以下的原子對肽鏈A和肽鏈B間分子間質子間距為約1.8-6.5埃的A-e(l-42)肽G33(NH)-G34(NH),M35(NH)-V36(麗)，G37(NH)-G38(NH),G33(NH)-V18(CYH3),V18(NH)-V18(CyH3),L34(NH)-L34(C5H3),M35(NH)-v36(cyh3),g38(nh)-v39(cyHg)和v39(nh)-v39((cyh3),其中所述寡聚物包含分子內反平行P摺疊，其至少含殘基19-21和30-32和原子對{F19CO,I32N},{I32CO,F19N}，{A21CO,A30N),和(A30CO,A21N),而且距離為3.3+0.5A,其中CO表示主鏈氧原子，而且所述殘基的phi((1))角範圍為-180至-30和所述殘基的psi(c!O角範圍為約60至180或約-180至-150。22.分離的P-澱粉樣寡聚物，其中所述寡聚物包含分子間平行P摺疊，其至少含至少兩種P-澱粉樣肽(標記為A和B)的殘基34-38,其中以下原子對{G33CO(A),L34N(B)}，{L34CO(B),M35N(A)},{M35CO(A),V36N(B)),(V36CO(B),G37N(A)),和(G37CO(B),G38N(A》(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0JA,而且所述殘基的phi(cj))角範圍為-180至-30和所述殘基的psiO)角範圍為約60至180或-180至-150。23.結合至少一種P-澱粉樣N-Metl-42寡聚物的分離的抗體，其中所述寡聚物選自(a)分子內反平行P摺疊，其至少含殘基19-21和30-32,其中以下原子對{F19CO,132N},(132CO,F19N)，{A21CO,A30N}，和(A30CO:A21N}(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0.5A,而且所述殘基的phi(4))角範圍為-180至-30和所述殘基的？8"40角範圍為約60至180或-180至-150;和(b)分子間平行P摺疊，其至少含至少兩種P-澱粉樣肽(標記為A和B)的殘基34-38,其中以下原子對{G33CO(A),L34N(B)}，{L34CO(B),M35N(A)},{M35CO(A),V36N(B)},{V36CO(B),G37N(A)},和(G37CO(B),G38N(A))(其中CO表示主鏈氧原子)距離為3.3±0.5A,而且所述殘基的phi(cj))角範圍為-180至-30和所述殘基的psi(O))角範圍為約60至180或-180至-150。24.權利要求23的分離的抗體，其中至少兩種N-Metl-42P-澱粉樣肽的3維結構包含任何圖x和Y所示的物理許可的構象。25.純化的球聚體，其包含至少兩種權利要求1所述分離的P-澱粉樣蛋白。26.結合權利要求25所述純化的球聚體的分離的抗體。27.診斷懷疑患有該疾病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括如下步驟a.從所述患者中分離生物樣品；b.用一段時間並在足以形成球聚體/抗體複合物的條件下，4吏所述生物樣品接觸權利要求12或權利要求26所述分離的抗體;和c.檢測所述樣品中所述球聚體/抗體複合物的存在性，存在所述複合物表示所述患者中診斷出阿耳茨海默氏病。28.診斷懷疑患有該疾病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包4舌如下步驟a.從所述患者中分離生物樣品；b.用一段時間並在足以形成抗體/球聚體複合物的條件下使所述生物樣品接觸權利要求25所述球聚體；c.用一段時間並在足以使所述綴合物結合結合的抗體的條件下，將綴合物加入得到的抗體/球聚體複合物，其中所述綴合物包含與能產生可檢測信號的信號產生化合物相連的抗體;和述生物樣品中的抗體的存在性，所述信號表示所述患者中;斷出阿耳茨海默氏病。29.診斷懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括以下步驟a.從所述患者中分離生物樣品；b.用一段時間並在足以形成抗體/純化的球聚體複合物的條件下，使所述生物樣品接觸權利要求25所述球聚體;和c.檢測所述樣品中所述抗體/純化的d.球聚體複合物的存在性，存在所述複合物表示所述患者中:^斷出阿耳茨海默氏病。30.診斷懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中阿耳茨海默氏病的方法，其包括以下步驟a.從所述患者中分離生物樣品；b.用一段時間並在足以形成抗抗體/抗體複合物的條件下，-使所述生物樣品接觸特異於所述樣品中抗體的抗抗體；c.用一段時間並在足以使所述綴合物結合的抗體的條件下，將綴合物加入得到的抗抗體/抗體複合物，其中所述綴合物包含與能產生可^f全測信號的信號產生化合物相連的權利要求31所述球聚體；和d.檢測所述信號產生化合物產生的信號，所述信號表示所述患者中診斷出阿耳茨海默氏病。31.包含權利要求12或權利要求26所述分離的抗體的組合物。32.疫苗，其包含權利要求1或權利要求25所述純化的P-澱;盼樣蛋白和藥學上可接受的佐劑。33.預防或治療需要所述預防或治療的患者中的阿耳茨海默氏病的方法，其包括向所述患者以足以實現所述預防或治療的量給藥權利要求31所述組合物的步驟。34.預防或治療需要所述預防或治療的患者中的阿耳茨海默氏病的方法，其包括向所述患者以足以實現所述預防或治療的量給藥權利要求32所述組合物的步驟。35.鑑定治療或預防阿耳茨海默氏病的化合物的方法，其包括以下步驟a)用一段時間並在足以使所述一種或多種化合物結合或中和所述純化的球聚體的條件下，將一種或多種感興趣的化合物暴露於權利要求31所述純化的球聚體；和b)鑑定那些結合或中和所述純化的球聚體的化合物，所述鑑定出的化合物用於治療或預防阿耳茨海默氏病。36.設計用於治療或預防患者中的阿耳茨海默氏病的小分子的方法，其包括如下步驟a)分析選自權利要求25所述純化的球聚體、權利要求25所述分離的P-澱粉樣肽寡聚物和權利要求25所述分離的寡聚物組裝體的蛋白質的3維結構；b)養定所述步驟a)選出的蛋白質表面上的一種或多種表位;和c)設計結合所述一種或多種步驟b)鑑定出的表位的小分子，所述小分子用於治療或預防阿耳茨海默氏病。37.鑑定用於治療或預防阿耳茨海默氏病的單克隆抗體的方法，其包括如下步驟a)用一段時間並在足以使一種或多種所述單克隆抗體與所述球聚體結合併形成球聚體/抗體複合物的條件下，使權利要求25所述純化的球聚體暴露於單克隆抗體文庫；b)筌定所述球聚體/抗體複合物的存在性；c)和確定一種或多種帶有所述複合物的抗體的同一性，所述一種或多種抗體用於治療或預防阿耳茨海默氏病。38.穩定Met-澱粉樣P(l-42)寡聚物或其部分的樣品的方法，其包括的步驟為用一段時間並以足以實現所述穩定的量將烷基鏈去汙劑或液體加入所述樣品。39.疫苗，其包含權利要求26所述分離的抗體和藥學上可接受的佐劑。40.包含圖27的連續的胺基酸殘基E22-D23-V24-G25-S26-N27-K28(SEQIDNO:25)的表位。41.結合權利要求40所述表位的分離的抗體。42.由選自以下的抗原產生的人源化抗體北極(E693G)突變，荷蘭(E693Q)突變，義大利突變(E693K),愛荷華(D694N)突變和佛蘭德(A692G)突變。43.權利要求1的人源化抗體，其中所述抗體識別澱粉樣P肽的天然人序列和至少一種所述突變的序列。44.檢測懷疑患有阿耳茨海默氏病的患者中突變的澱粉樣P月大序列的方法，其包括如下步驟a)從所述患者中分離生物樣品；b)用一段時間並在足以形成突變抗原/抗體複合物的條件下4吏所述生物樣品接觸權利要求42所述抗體;和c)檢測所述突變抗原/抗體複合物的存在性，所述複合物表示所述患者有突變的澱粉樣P肽序列並由此有阿耳茨海默氏病。45.分離的球聚體，其每摩爾澱粉樣肽包含約至少0.5-2.0摩爾十二烷基磺酸鈉(SDS)或脂肪酸。46.權利要求45所述分離的球聚體的表位。47.結合權利要求46所述表位的分離的抗體。48.權利要求47的分離的抗體，其阻斷澱粉樣P肽聚合體的形成。49.包含澱粉樣P肽的分離的球聚體，其中所述肽包含帶有選自以下突變的胺基酸序列北極(E693G)突變，荷蘭(E693Q)突變，義大利突變(E693K),愛荷華(D694N)突變和佛蘭德(A692G)突變。50.分離的抗體，其相對於所述天然人澱粉樣肽優先結合權利要求46所述表位。51.預防或治療需要所述預防或治療的患者中的阿耳茨海默氏病的方法，其包括向所述患者以足以實現所述預防或治療的量給藥權利要求50所述分離的抗體。52.包含澱粉樣P肽的分離的球聚體，其中所述肽包含根據氫-氖交換行為展示出約33%或更少保護或交換的胺基酸，其中所述胺基酸選自2(Asp),3(Ala),4(Glu),5(Phe),7(His),8(asp),9(Ser),10(Gly)，17(Lys),20(Phe)，21(Phe),22(Ala)，25(Val)，26(Gly),29(Lys)和30(Gly)。53.包含澱粉樣P肽的分離的球聚體，其中所述肽包含根據氫-氘交換行為展示出約33%至約66%保護或交換的胺基酸，其中所述胺基酸選自16(Gln),31(Ala),32(lie),42(Ile)和43(Ala)。54.包含澱粉樣P肽的分離的球聚體，其中所述肽包含根據氫-氘交換行為展示出約66%或更多保護或交換的胺基酸，其中所述胺基酸選自12(Glu)18(Leu),19(Val),24(Asp),33(Ile),34(Gly)，35(Leu),36(Met),38(Gly),39(Gly)和40(Val)。全文摘要本發明涉及克隆、表達和分離重組形式的β-澱粉樣蛋白，其含N-末端甲硫氨酸(或者一種或多種胺基酸)，以及用該重組蛋白質製備治療性抗體、鑑定治療性小分子、和進行診斷測試的方法。文檔編號C07K14/435GK101528770SQ200680051750公開日2009年9月9日申請日期2006年11月30日優先權日2005年11月30日發明者A·佩拉達-羅佩斯,B·拉布克沃斯基,E·T·奧列尼查克,J·E·哈蘭,L·於,R·P·埃達爾吉,T·F·霍爾奇曼申請人:艾博特公司;艾博特股份有限兩合公司