用於增強dna修復的物質和組合物及使用方法

2023-10-22 22:18:37 4

專利名稱：用於增強dna修復的物質和組合物及使用方法
用於增強DNA修復的物質和組合物及使用方法相關申請的交叉引用本專利申請要求2008年4月四日提交的美國臨時專利申請號61/048，868的優先權，並在此全文參考併入。電子提交材料的參考併入在此一同提交的計算機可讀形式的核苷酸/胺基酸序列表在此全文參考併入，其標識如下0ne 45，799Byte ASCII (Text) file named"704595_ST25. txt，」，創建於 2009 年 4月27日。
背景技術：
細胞持續暴露在某些因素下，如會導致DNA損傷的細胞內活性組份和環境物質。 DNA修復通路(DNA repair pathways)可以將DNA損傷潛在的致突變結果降至最低，該方法主要有三種特徵形式鹼基切除修復(BER)，錯配修復(MMR)和核苷酸切除修復(NER) (Wood et al. ,Science, 291 1284-1289 (2001)) DNA損傷修復的缺陷是癌和許多遺傳性疾病，如著色性幹皮病，科凱恩氏綜合症和毛細血管擴張共濟失調症的致病原因。在紫外光(UV)照射或化學誘變劑下暴露會導致損傷DNA的積累，進而導致突變形成癌症。真核細胞通過導入NER通路應對UV照射，其識別並去除損傷的DNA，並且通過激活DNA損傷檢驗點來停止細胞的周期進程，從而為NER作用贏得時間。NER是主要的DNA修復通路，細胞通過該通路去除UV照射和化學誘變劑造成的螺旋扭曲的DNA損傷 (Friedberg et al. ,DNA Repair and Mutagenesis,2nd Edition,ASM Press,Washington, D. C. (2006)) οNER是一個多步驟過程，其使用超過30種蛋白用於實施DNA損傷的識別步驟， 切除損傷的5，和3，端來去除損傷的DNA，將DNA聚合酶填入缺口中，並通過DNA連接酶活性將新合成的DNA連接至母體DNA上(見Friedberg et al.，DNA Repair and Mutagenesis,2nd Edition, ASM Press, Washington, D. C. (2006) ；Sancar, Annu. Rev. Biochem. ,65 :43-81 (1996))。NER是由兩種不同DNA鏈特異性通路組成去除RNA聚合酶II轉錄的DNA鏈上的損害的轉錄偶聯修復通路(TCR)，修復表達基因非轉錄鏈上損傷和非活性染色質上損傷的全面性基因組修復途徑(GGR)(參見綜述Hanawalt，Oncogene, 21 :8949-8956(2002)). NER過程已經被廣泛的研究，進行切除和修復反應所必須的成份已經通過使用重組蛋白和損傷DNA模板的體外重建確定了(AbousseWira et al. , Cell, 80 :859-868(1995) ；Araujo et al. , Genes Dev.，14 :349-359(2000) ；Mu et al. , J. Biol. Chem.，271 :8285-8294(1996) ；Mu et al.，J.Biol. Chem.，270 :2415-2418(1995))。涉及DNA損傷識別的GGR通路的NER要素包括XPA-RPA、XPC-HR23B和由 DDBl (ρ 127)和DDB2(p48)亞基組成的損傷特異性DNA粘合蛋白異二聚體。這些DNA損傷傳感器中，異二聚體DDB1-DDB2對UV誘導的環丁烷嘧啶二聚體(CPDs)和6_4光生產物(6-4PPs)的親合力最強(指定的 UV-DDB 活性)(Batty et al.，J. Mol. Biol.，300 275490(2000))。E組著色性幹皮病基因(XP-E)案例的病因是DDB2突變。其特徵為損傷DNA GGR 介導切除的缺陷和皮膚癌的誘因(Wittschieben and Wood, DNA Repair (Amst), 2 1065-1069 (2003))。在UV照射後，DDBl和DDB2馬上聚集到損傷的DNA上，之後被 CUL4A 泛素連接酶泛素化並降解(Chen et al. , Mol. Cell, 22 :489-499(2006) ；Fitch et al.，DNA Repair (Amst), 2 :819-826(2003) ；Groisman et al.，Cell,113 :357-367(2003)； Rapic-Otrin et al.，Nucleic Acids Res. ,30 :2588-2598 (2002)) CUL4A 也是正常生長條件下 DDB2 更新的原因(Chen 等，J. Biol. Chem. , 276 :48175-48182 (2001) ；Nag 等，Mol. Cell Biol. ,21 :6738-6747 (2001))，其導致 UV-DDB 活性總體下降(Chen et al.，J.Biol· Chem.，276 :48175-48182(2001))。⑶L4A泛素連接酶作為一種多聚體複合物發生作用，其中⑶L4A的C末端與環脂蛋白Rbxl/ROCl/Hrtl (Rbxl)作用，從而招募E2泛素結合酶。CUL4A的N末端與DDBl 作用。DDBl進而作為接合蛋白與DDB1、CUL4A相關要素(DCAFs)結合，起到特定受體底物的作用(Angers et al.，Nature，443 :590-593 (2006) ； He et al. , Genes Dev. ,20 2949-2954(2006) ；Higa et al.，Nat Cell Biol.，8 :1277-1283(2006) Jin et al.，Mol. Cell, 23 :709-721 (2006) ；Lee and Zhou, Mol. Cell, 26 :775-780(2007))。CUL4B, CUL4 家族另一成員在序列上與CUL4A有著廣泛的同源性，並具有一些相同的冗餘功能，包括維持細胞生長和介導某些CUL4目標的泛素(mediating the ubiquitination of certain CUL4A targets)(Higa et al. , Nat. Cell Biol. ,5 :1008-1015(2003) ；Hu et al. , Nat. Cell Biol.，6 :1003-1009 Q004))。含有泛素連接酶複合物的CUL4B具有一些特殊的特徵， 例如降解性類固醇激素受體的能力(Ohtake et al. ,Nature, 446 =562-566 (2007)) 0另外， ⑶L4B突變已經被確定為導致X連接的智力缺陷的基因組缺陷(Tarpey et al. ,Am. J. Hum. Genet.，80 :345-352 (2007) ；Zou et al.，Am. J. Hum. Genet.，80 :561-566 (2007))。至今為止，大多數以DNA修復通路為目標的癌症治療使用阻止癌症細胞DNA修復的物質從而增強化學治療和放射治療的DNA損傷效力(Kelley and Fishel. Anticancer Agents Med. Chem. ,8(4) :417-25 (2008))。雖然含有T4核酸內切酶V的組合物已經被研究作為治療皮膚癌的潛在藥物，但是通過提高或加快DNA修復來降低DNA損傷引起的後果進而預防或治療疾病的研究相對較少 (Cafardi and Elmets. Expert Opin. Biol. Ther. ,8(6)(2008))。因此，用於增強細胞和動物內DNA修復的組合物和方法是需要的。本發明提供了這種組合物和方法，其可以用於預防和治療與DNA損傷相關的疾病。發明簡介本發明提供了一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的能夠幹擾CUL4A活性的物質，從而預防或治療動物體內DNA損傷相關的狀態。本發明還提供了一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的能夠幹擾CUL4A活性的物質，其中幹擾CUL4A活性的物質提高核苷酸切除修復活性，進而預防或治療動物體內DNA損傷相關的狀態。本發明還提供了一種幹擾動物體內CUL4A活性的物質及含有該物質和載體的組合物。該物質可以增強動物內核苷酸切除修復的活性。本發明進一步提供了一種識別具有調節CUL4A泛素連接酶活性的物質的方法，該方法包括(a)將CUL4A多肽，與損傷DNA結合蛋白I(DDBl)多肽和測試物質在易於形成 ⑶L4A-DDB1複合物條件下組合，(b)檢測(a)條件下形成的⑶L4A-DDB1的量，和(c)比較測試物質存在時(b)中檢測到的生成的CUL4A-DDB1複合物的量與測試物質不存在時生成的CUL4A-DDB1複合物的量，此差別可反映測試物質調節CUL4A泛素連接酶活性的能力。該被識別的調節劑可以是幹擾CUL4A泛素連接酶活性的物質。


圖IA為鼠科動物CuWa基因組位點靶向作用於LoxP框之前和之後的一系列圖表。圖IB為野生型和兩側裝接上IoxP位點的雜合(f/+)胚胎幹細胞內的CuWa位點一系列DNA印跡比較(southern blots)。圖IC為野生型(+/+)，純合子的兩側裝接上IoxP位點的(f/f)和雜合子的(f/+)小鼠的PCR擴增的尾部DNA(頂端)，和野生型的和重組的(無效)CuWa等位基因(底部)的一系列瓊脂糖凝膠。圖ID為野生型(+/+)和敲除型(-/_) 小鼠器官和胚胎纖維原細胞中CUL4A、CUL4A(A)和β -肌動蛋白水平的一系列蛋白質印跡。圖IE為Rbxl和⑶L4A或⑶L4A(A)之間作用的一系列蛋白質印跡。圖2A為Li等描述的Cul4a敲除等位基因的圖表(Mol. Cell Biol. ,22 4997-5005 (2002))，其顯示了去除的Pcid2部分。圖2B為實時定量RT-PCR評估的，空慢病毒(空載體)，慢病毒編碼的短髮夾RNA靶向的PCid2(Sh-PCid2-l，sh-PCid2D或打亂的 (scrambled) sh-Pcid2感染的野生型MEFs中Pcid2mRNA表達的柱狀圖。圖2C反映了如圖 2B處理的MEFs的生長。圖3A為FACS確定的，慢病毒編碼的GFP和短髮夾(sh) -4b或混雜(scm) -4b感染的對照組(f/f_4a)和CuWa敲除(ko_4a)MEFs在所示時間點的百分比柱狀圖。圖反映了由顯微視野對BrdU+細胞計數確定的，BrdU摻入如圖3A所示的MEFs的情況。圖4A為反映對照組(f/f)和CuWa敲除(-/-)皮膚組中CUL4A，DDB2，p21和β -肌動蛋白水平的一系列蛋白質印跡。圖4Β為反映所示慢病毒處理的MEFs中⑶L4B、⑶L4A、 DDB2、p21、XPC和β -肌動蛋白水平的一系列蛋白質印跡。圖4C包括反映脈衝跟蹤分析獲得的DDB2水平的自動射線照片和DDB2更新定量線圖。圖4D包括反映脈衝跟蹤分析獲得的Ρ21水平的自動射線照片和p21更新定量線圖。圖4E反映所示慢病毒處理的，UV照射的HCT116細胞的染色質提取物中XPC、泛素化XPC(XPC Ubn)、CUL4A和組蛋白3 (H3)水平的蛋白質印跡。圖5A-C 包括 Cul4af/f (1)、Cul4bk/d(2)、Cul4a+(3)和 Cul4a+ ；Cul4bk/d(4)MEFs 中通過實時定量RT-PCR測定的，Ddb2㈧、p21⑶和Xpc(C)水平定量柱狀圖和通過蛋白質印跡測定的，DDB2(A)、p21⑶和XPC(C)蛋白水平定量柱狀圖，其中柱號對應於圖4B中的道號。圖6為反映所示質粒轉染的細胞免疫沉澱反應中p21和⑶L4A-DDB1泛素連接酶複合物成份間作用的一系列蛋白質印跡。圖7A為對照(Cul4a〃f)和敲除(Cul4a+)MEFs中UV-DDB活性的電泳淌度移動分析圖片。標記「B」表示DDB-DNA複合物。圖7B為反映所示慢病毒處理的MEFs中UV誘導的環丁烷嘧啶二聚體(CPDs)和6-4光生產物(6-4PPs)修復的一系列線圖。圖7C為反映 UV照射後所示基因型同步MEFs中DNA合成的線圖。圖7D為反映所示基因型MEFs中UV誘導的CPDs修復的線圖。圖7E包括UV照射後所示基因型MEFs中微核子圖片和微核子定量圖表。圖8為反映UV照射或未照射的基因型MEFs中，通過流動血細胞計數測定的DNA 含量的一系列柱狀圖。圖9A為慢性UV暴露後對照(Cul4aM)和皮膚特定的CuWa敲除組(Cul4af〃 ； K14-Cre ERtam)小鼠中扁平細胞癌(SCC)發作的卡普蘭-邁耶曲線。圖9B為帶有SCC小鼠的圖片。圖9C和圖9D為蘇木精和四溴螢光素染色的SCC部分的圖片。圖9E和9F為基底表皮標記物P63和DAPI免疫染色的SCC部分的圖片。圖9C和9D所示的形態測量和圖9E 和9F所示的p63免疫染色圖案顯示腫瘤為典型的SCC。圖IOA和IOB圖表描述了⑶L4A在確立DNA修復和腫瘤抑制臨界點中可能存在的作用。⑶L4A通過分別靶向降解DDB2和p21來協調抑制NER和Gl/S DNA損傷檢驗點通路。 去除細胞中的CUL4A提升了 NER能力和Gl/S DNA損傷檢驗點反應至超過野生型細胞可到達的臨界點。圖11為反映控制腺病毒或腺病毒編碼的顯形負相(dominant negative) (DN) CUL4A片段感染的HCT116細胞中UV誘導的CPDs修復的線圖。圖12為DDBl-⑶L4A作用界面的連續剖面圖，其中顯示了與⑶L4A直接接觸的 DDBl-BPB β -螺旋推進區域(β -propeller region)(即 A400, 1402，L404, V443, E537, W561, 1587和R589)上的8個殘基。圖13為識別能夠調節CUL4A和DDBl之間作用的物質的屏幕(ALPHASCREEN 平臺，來自PerkinElmer)示意圖。圖14為用於識別⑶L4A和DDBl作用調節肽的噬菌體展示文庫篩選示意圖。發明的詳細描述本發明是基於，至少部分基於DDBl-⑶L4A泛素連接酶複合物是疾病預防和調節的重要的靶細胞的發現。本發明提供了一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的能夠幹擾CUL4A活性的物質，從而預防或治療動物體內DNA損傷相關的狀態。本發明使用的術語「預防或治療」，「治療」，「處理」和「治療性處理」表示藥品治療， 預防疾病性治療或預防性治療。「預防性治療」的例子如預防或減少得目標疾病的可能性 (即癌症或其它增生性疾病)或相關的狀態。需要處理的對象包括那些已經獲病或狀態的動物和那些傾向於患上需要預防的疾病或狀態的動物。本發明使用的術語「治療」和「治療性處理」也描述了對動物的管理和照料，用於對抗疾病或相關狀態，並且包括一組合物給藥用於緩解症狀、副作用或該疾病或狀態的其它併發症。所述動物可以是任何動物，但是優選哺乳動物。在本發明的某一實施例中，哺乳動物為小鼠或其它實驗哺乳動物。在另一是實施例中，哺乳動物為人類。術語「DNA損傷」為本領域普通技術人員所熟知，指相比DNA分子天然狀態的任何改變。DNA損傷的例子包括但不限於鹼基對錯配，DNA鹼基自發的化學變化(如互變異構移位和去氨基)，鹼基的缺失(即去嘌呤和去嘧啶)，氧自由基和離子化照射誘導的損傷(如 C-5 = C-6雙鍵的進攻和DNA鏈的斷裂造成的胸腺嘧啶損傷)，UV照射誘導的損傷(如環丁烷嘧啶二聚體和嘧啶-嘧啶酮(6-4)光生產物)和化學誘導損傷(如烷基化和鏈內或鏈間的交聯)(Friedberg and Siede, DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington, D. C. (1995))。術語「與DNA損傷相關的狀態」或「與DNA損傷相關的疾病」指以DNA損傷為致病或作用因素的任何狀態或疾病。在某一實施例中，與DNA損傷相關的狀態為癌症。癌症可以源於人類或其它哺乳動物體內一般發現的腫瘤或者由於在如實驗哺乳動物中接種產生的腫瘤。眾所周知，腫瘤包括源於不受控制和生長的細胞分裂的不正常組織塊，其也被特有的稱之為「贅生物」。在人類和其它動物狀態中有多種類型的癌症。本發明的所述方法的應用不限於任何一種特定類型或種類的癌症。所述發明方法能夠用於腫瘤細胞和相關的底物細胞，實體腫瘤和軟組織相關的腫瘤，如人體內軟組織惡性毒瘤。腫瘤或癌症可以位於皮膚 (如黑素瘤)，口腔，咽，呼吸系統，消化系統，骨頭，關節(如癌症骨轉移)，軟組織，胸部，生殖系統，泌尿系統，眼，眼眶，大腦(如神經膠質瘤)，中樞神經系統或者內分泌系統(如甲狀腺)，並不一定是原發瘤或癌症。與口腔相關的組織包括但不限於舌和口組織。癌症可以發生在消化系統組織中，包括例如食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門、肝、膽囊和胰腺。呼吸系統癌症可以影響喉、肺和支氣管並且包括例如非小細胞肺癌。癌症可以發生在組成男性和女性的生殖系統的子宮頸、子宮體、卵巢陰戶、陰道、前列腺、睪丸和陰莖，和組成泌尿系統的膀胱、腎臟、腎骨盆和輸尿管。腫瘤或癌症也可以位於頭部和/或頸部(如喉部癌和副甲狀腺癌)。腫瘤或癌症也可以位於造血系統或淋巴系統中，包括例如淋巴瘤(如霍奇金疾病和非霍奇金淋巴瘤)，多發性骨髓瘤或白血病(如急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病和類似疾病)。優選的，腫瘤或癌症位於皮膚、口腔、咽喉、肺或肝。最優選的，腫瘤或癌症位於皮膚。在本發明的另一實施例中，DNA損傷相關狀態為人類遺傳性疾病或人類遺傳性疾病的實驗動物模型。可以根據本發明提供的方法處理的人類遺傳性疾病的例子包括但不限於著色性幹皮病、科凱恩氏綜合症、毛髮低硫營養不良、範可尼症候群貧血、共濟失調毛細管擴張症(Louis-Bar症候群)和布盧姆綜合症。優選的，人類遺傳疾病為著色性幹皮病。在本發明的另一實施例中，DNA相關狀態為衰老。衰老包括動物(如人類)自然衰老過程和帶有一個或多個調節衰老過程的，可遺傳突變的基因動物(如人類)發生的加速衰老。動物衰老過程的主要原因是具有反應活性的氧類影響細胞DNA，導致肉體損傷。眾所周知，具有反應活性的氧類會引起無數的DNA損傷如鹼基修飾，單鏈或雙鏈DNA斷裂和鏈內交聯(Hasty等，Science, 299 1355-1359 (2003)) 相應的，本發明提供了增強動物DNA 修復活性進而預防和治療衰老的方法和組合物。在本發明的另一實施例中，DNA相關狀態為長時間(prolonged)暴露在UV照射下。 如上所述，UV照射誘導DNA中的環丁烷嘧啶二聚體和嘧啶-嘧啶酮(6-4)光生產物已是總所周知。UV照射產生的其它類型的DNA損傷包括但不限於涉及嘌呤的複合物損傷(如8， 8-腺嘌呤脫氫二聚物)，嘧啶水合物(如5，6- 二氫-6-羥基-胞核嘧啶)，胸腺嘧啶乙二醇禾口鏈斷裂(Friedberg and Siede,DNA Repair and Mutagenesis,ASM Press,Washington, D. C. (1995))。相應的，本發明也提供了增強動物DNA修復活性進而預防和治療長時間暴露在UV照射下的相關狀態的方法和組合物。在本發明的另一個實施例中，DNA損傷相關狀態為暴露在化學致癌物下。如上所述，化學致癌物會引起多種DNA損傷，包括但不限於烷基化，鏈內或鏈間交聯和加合物的形成。本領域普通技術人員知道許多常用的化學致癌物並且熟悉含有所給化學物致癌性信息的資料庫(如加利福尼亞大學伯克利分校的致癌物力量計劃和美國健康與公共事業部的國家毒物項目)。另外，本領域普通技術人員知道評估所給化學物的致癌性的方法(如艾姆斯氏試驗)。相應的，本發明也提供了增強動物體內DNA修復活性進而預防和治療長時間暴露在化學致癌物下相關狀態的方法和組合物。在某一實施例中，所述化學致癌物是香菸。 在另一實施中，所述化學致癌物是黃麴黴毒素。本發明也包括用於增強接受化學療法和放射治療的動物體內的DNA修復活性的組合物和方法。雖然化學療法和放射治療的主要目的是為了誘導癌細胞中DNA損傷進而抑制生長或使細胞死亡，但同時也需要增強化學療法和放射治療動物體內非癌細胞的DNA修復。本領域普通技術人員了解誘導DNA損傷的用於化學療法的化學物質。所述化學物質的例子包括但不限於鉬衍生物(如順鉬、卡波鉬和奧沙利鉬)，氮芥子氣(如二氯甲基二乙胺、 環磷醯胺和苯丁酸氮芥)和亞硝基脲(如亞硝基脲氮芥、環己亞硝脲和乙基亞硝基脲)。「有效量」或「有效治療量」指緩解(在某種程度上，由熟練的醫生判斷)動物體內疾病或狀態的一種或多種症狀。另外，「有效量」或「有效治療量」指部分或完全回復與疾病或狀態相關或引起該疾病的生理或生化參數至正常所需要的量。本領域普通臨床醫生可以確定組合物的有效治療量用於在給藥時治療或預防特定疾病狀態或病症。有效治療量所指的組合物的具體量取決於許多因素，如活性物質的具體活性，使用的傳遞設備，物質的物理特性，給藥的目的和出於對病人許多具體的考慮。確定組合物的有效量或有效治療量是本領域常規方法，屬於普通臨床醫生技術範圍內。「給藥」或「被給藥」指將物質傳遞到需要的動物中。給藥方法可以是局部、口服、 鼻內、非腸道、腸、直腸或眼部給藥。在本發明的優選實施例中，物質通過局部給藥。本發明提供了幹擾CUL4A活性的物質。本發明所述術語「物質」，「化合物」和「治療劑」指化合物，化合物的混合物、生物大分子或生物材料如細菌、植物、真菌或動物細胞(特別是哺乳動物)或疑似具有治療性質的組織製備的提取物。物質、化合物或治療劑可以純化，充分純化或部分純化。在某一實施例中，所述物質為小分子化合物。本發明使用的術語「小分子」指非生物物質或分子量小於約l，000g/mol的化合物。在另一實施例中，所述物質為多聚核苷酸。本發明使用的術語「多聚核苷酸」和「核苷酸」是指任何長度的核苷酸的多聚形，是核糖核苷酸(RNA)或是脫氧核糖核苷酸(DNA)。 這些術語指分子的一級結構，並因此包括雙鏈或單鏈DNA和雙鏈或單鏈RNA。該術語包括核苷酸類似物和修飾的多聚核苷酸如但不限於甲基化的和/或加帽的多聚核苷酸製備的RNA 或DNA的類似物等同物和類似物。合適的核苷酸在本領域是公知的並在如美國專利和本申請參考文獻中有描述。本申請使用的術語「核苷酸」指雜環鹼基、糖和一個或多個磷酸基團組成的多聚核苷酸單體。天然產生的鹼基(鳥嘌呤，(G)，腺嘌呤，(A)，胞核嘧啶，(C)，胸腺嘧啶，(T)和尿嘧啶(U))是嘌呤或嘧啶典型的衍生物。應理解天然或非天然產生的鹼基衍生物都包括在其中。天然產生的糖為戊糖(五個碳的糖)去氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)。 應理解天然或非天然產生的糖衍生物也包括在內。核苷酸通常通過磷酸鍵連接從而形成核苷酸或多聚核苷酸，另外許多其它連接方法在本技術領域也是公知(如硫代磷酸酯，硼烷磷酸酯或類似連接)。製備多聚核苷酸的方法是本領域普通技術人員熟知的(Sambrook and Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。多聚核苷酸可以是任何抑制核苷酸分子，包括但不限於小幹擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、反義低聚核苷酸、適體或核酶。在優選實施例中，多聚核苷酸是siRNA或 shRNA分子。「小幹擾RNA」或者「短幹擾RNA」或者「 siRNA」或者「短髮夾RNA」或者「 shRNA」是與目標核苷酸序列，如Cul4a mRNA互補的雙鏈RNA分子，並且能夠介導特定靶向的核苷酸降解。雙鏈RNA分子是通過第一 RNA部分和第二 RNA部分間互補配對形成的。每一部分的長度總體小於 30 個核苷酸(如 29,28,27,26,25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13, 12，11或10個核苷酸)。在某些實施例中，siRNA或shRNA中每一個部分的長度在19至25 個核苷酸。在一些siRNA分子中，RNA分子互補的第一和第二部分是髮夾結構的「幹」，從而產生shRNA分子。所述兩部分可以通過連接序列連接，其可以形成髮夾結構中的彎曲部分。 連接序列的長度可以不同。在某些實施例中，連接序列的長度可以為5，6，7，8，9，10，11，12 或13個核苷酸。代表性的連接序列為5』-TTCAGAAGG-3』，同時任何數量的序列可以用於連接第一和第二部分。第一和第二部分是互補的但是可以不完全對稱，因為髮夾結構可以含有3』或5』懸垂的核苷酸(如a 1，2，3，4或5核苷酸懸垂)。siRNAs 或 shRNAs 的設計已建有標準(見如 Elbashir et al.，Nature, 411 :494-8 (2001) ；Amarzguioui et al. , Biochem.Biophys. Res. Commun. ,316 (4) 1050-8 (2004) ；Reynolds et al. , Nat. Biotech. ,22(3) :326-30(2004) ；Brummelkamp et al.，Science，296 =550-553 (2002)) 使用合適的程序將siRNA或shRNA和基因資料庫如基因庫(GenBank)或Ensembl中的核苷酸序列比對，檢測任何候選siRNA或shRNA的序列與其它核苷酸序列交叉反應的可能性。通常會生成並篩選許多siRNAs或shRNAs從而比較他們的效力。本發明的siRNA或shRNA可以通過任何方法生成，其中包括但不限於體外轉錄，在宿主細胞中重組生產或化學合成。在某一實施例中，siRNA或shRNA是通過使用重組酶如 T7RNA聚合酶體外轉錄DNA寡聚核苷酸模板生成的。在另一實施例中，siRNA或shRNA在培養細胞中重組製備，細胞可以是原核的或是真核的。製備siRNA或shRNA的方法是本領域普通技術人員熟知的(見例如 Elbashir et al.，Nature,411 :494-8(2001) ；Brummelkamp et al. ,Science, 296 :550-553(2002) ； and Lee et al.，Nat. Biotech.，20 :500-5 U002))。在此使用的「適體」或「核苷酸配體」或「核苷酸抗體」指非天然生成的，對目標(如 CUL4A)具有理想作用的核苷酸。理想的作用包括但不限於與目標連接，解除反應的改變目標，與目標以修飾/改變目標或目標功能活性的方式反應，如在自殺性抑制劑中那樣共價連接目標，和促進目標和另一個分子的反應。在優選實施例中，理想的作用為對含有CUL4A 的複合物特定的親合力，其中適體，核苷酸配體或核苷酸抗體連接機理主要是沃森/克裡克鹼基配對或三螺旋連接(triple helix binding)。適體包括在核苷酸候選混合物中識別出來的核苷酸，其中所述核苷酸是所給目標 (如CUL4A)的配體。該方法包括(a)使候選混合物與目標接觸，其中相對於候選混合物，與目標親合力增加的核苷酸可以從候選混合物中的剩餘物中分離出來；(b)將親合力增加的核苷酸從候選混合物的剩餘物中分離出來；和(C)放大親合力增加的核苷酸從而生產富含配體的核苷酸混合物，由此可以確定目標化合物的核苷酸配體。這種確定候選適體的方法被稱為指數富集的配體系統演變(SELEX)，是本領域所熟知的(見美國專利5，270，163和 5，475，096)。「反義低聚核苷酸」指帶有與特定核苷酸序列互補序列的低聚核苷酸(即「傳感」 目標序列)並且能夠與目標序列雜交(如Cul4a mRNA)。本發明的反義低聚核苷酸可以包括DNA，RNA或其混合物。反義低聚核苷酸的序列可以與目標序列100%互補或者接近互補 (如75%或更多，85%或更多，95%或更多)。本發明的反義低聚核苷酸可以通過核酸內切酶的作用阻礙或抑制目標mRNA的翻譯或抑制目標基因的轉錄從而產生降低目標mRNA水平的作用。本發明的反義低聚核苷酸可以包括帶有上述修飾的鹼基、糖和/或磷酸基團的核苷酸。製備反義低聚核苷酸的方法是本領域公知技術(見如Crooke and Bennett, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. ,36 :107-129(1996)和美國專利 6，107,094)。「核酶」指能夠催化化學反應的RNA分子，如以核苷酸鹼基特定序列的方式重複剪切其它獨立核苷酸(即具有核酸內切酶活性)。這種具有核酸內切酶活性的核酶可能與特定目標基因(如Cul4a)在該核酶的底物結合區有互補性，並且具有在目標中準確剪切RNA 或DNA的酶活性。也就是具有核酸內切酶活性的核酶能夠在分子間或分子內剪切RNA或 DNA,以此減除目標RNA或DNA分子的活性。這種互補功能使核酶與目標RNA或DNA充分雜交從而產生剪切。本發明的核酶與目標RNA或DNA的互補性可以是50%或更多，75%或更多，90%或更多，95%或更多。優選的，互補性為100%。本發明的核酶可以包括帶有上述修飾的鹼基、糖和/或磷酸基團核苷酸。製備核酶的方法在本領域是公知技術(見如美國專利 4，987，071和 6，617，438 ；Robertson and Joyce, Nature,344 :467-468(1990))。術語「蛋白質」、「多肽」和「肽」指胺基酸殘基的聚合體。蛋白質、多肽或肽可以是全長的或是片段。術語「片段」指大小在四個胺基酸殘基至比全部胺基酸序列少一個胺基酸殘基的範圍內的全長蛋白的較短的部分。在本發明的某一實施例中，片段指蛋白質結構域的全部胺基酸序列(如⑶L4A的N末端α-螺旋區域或者DDBl的BPB β-螺旋推進結構域)。 蛋白質、多肽、肽及其片段可以通過化學合成或重組DNA技術，使用本領域公知的方法製備 (Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press，Boca Raton，Florida(2006)； Sambrook and Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001))o在本發明某一實施例中，幹擾⑶L4A活性的物質是多肽或肽。在某些實施例中，多肽或肽包括胺基酸線性聚合物。在其它實施例中，多肽或肽包括胺基酸的環狀聚合物，其中聚合鏈的氨基和羧基末端通過肽鍵互相連接。多肽或肽可以是任何長度。多肽或肽的長度可以是2個胺基酸或更多，6個胺基酸或更多，10個胺基酸或更多，或20個胺基酸或更多。 或者或另外，多肽或肽的長度可以是200個胺基酸或更少，100個胺基酸或更少，50個胺基酸或更少，40個胺基酸或更少。因此，多肽或肽可以具有以上任何兩個端值連接後的長度。 例如，多肽或肽的長度為2-200胺基酸，6-100胺基酸或10-40胺基酸。在本發明的某些實施例中，多肽或肽是從噬菌體展示文庫獲得的。合適的噬菌體展示文庫包括但不限於CXltlC/ P8+8文庫，NNS2(1/p8+8文庫和基於knottin結構支架的文庫。篩選噬菌體展示文庫的方法是本領域普通技術人員熟知的(見如Barbas et al. ,Phage Display :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(2001))。物質可以是多肽類似物。在此使用的關於多肽的術語「類似物」包括帶有與在此例舉的多肽序列基本相同的胺基酸殘基序列的任何多肽。該多肽序列中的一個或多個殘基被功能類似的殘基保守取代並展現出了在此所述的母體多肽序列的活性。保守取代的例子包括使用非極性殘基取代非極性殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；用精氨酸取代賴氨酸且反之亦然從而維持正電荷；用天冬氨酸取代穀氨酸且反之亦然從而維持負電荷；用蘇氨酸取代絲氨酸從而維持自由的-OH ；用天冬醯胺酸取代穀氨醯胺從而維持自由的-NH2。物質可以是多肽的化學衍生物。此處使用的術語「化學衍生物」指帶有通過側基團功能化反應化學衍生的一個或多個殘基的多肽對象。除了側基團衍生外，化學衍生物可以帶有一個或多個骨架修飾，包括α -氨基取代如N-甲基、N-乙基、N-丙基和類似基團，和 α-羰基取代如硫酯、硫代醯胺、胍及類似基團。這種衍生化的分子包括例如自由氨基被衍生化從而形成胺鹽酸鹽，P-甲苯磺醯基、卞酯基、t- 丁氧基羰基、氯乙醯基或甲酸基。自由的羧基可以衍生為鹽、甲基和乙酯或其它類型的酯或醯胼。自由的羥基可以衍生為0-醯基或0-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以衍生為N-苯甲基組氨酸。化學衍生物還包括那些含有二十個標準胺基酸的一個或多個天然產生的胺基酸衍生物的肽。例如4-羥基脯氨酸可以被取代為脯氨酸；5-羥基賴氨酸可以被取代為賴氨酸；3-甲基組氨酸可以被取代為組氨酸；高絲氨酸可以被取代為絲氨酸；鳥氨酸可以被取代為賴氨酸。本發明的多肽也可以包括任何相比本申請列舉的多肽序列，具有一個或多個增加和/或刪除或殘基的多肽，只要能夠維持必需的活性。物質可以是本申請所述的多聚核苷酸和多肽序列的同源物。本申請所述術語「同源物」和「同源的」指帶有與相應多聚核苷酸或多肽序列至少約80%同源性的多聚核苷酸或多肽，優選的帶有與相應多聚核苷酸或多肽序列至少約90%同源性，更優選的帶有與相應多聚核苷酸或多肽序列至少約95%同源性，更優選的帶有與相應多聚核苷酸或多肽序列至少約99%同源性。「相應多聚核苷酸或多肽」表示與相應多聚核苷酸或多肽序列比對的那些序列，其中比對的區域長度是至少約10個殘基(即核苷酸或胺基酸)，至少約15個殘基，至少約20個殘基，至少約30個殘基，至少約40個殘基，至少約50個殘基或至少約100個殘基。在生物技術領域中有多種公知的序列比對方法(見如Rosenberg，BMC Bioinformatics 6 :278(2005) ；Altschul et al.，FEBS J. 272(20) :5101-5109(2005)) 所述物質可以是擬肽。術語「擬肽」指能夠模仿或對抗作為其設計基礎的母體多肽或片段的功能的多肽缺失一個或多個結構元素的物質。例如，擬肽可以含有非天然產生的胺基酸或缺乏肽鍵。母體多肽最初可以確定為感興趣的蛋白上的連接序列或者可以是天然產生的多肽。確定擬肽的分析可以包括作為陽性對照的母體多肽用於在篩選文庫時，如擬肽文庫時進行比較。擬肽文庫是記載可能具有與母體多肽相似生物活性的化合物文庫。製備擬肽的方法是本領域普通技術人員熟知的(Kazmierski，Peptidomimetics Protocols, Humana Press,New Jersey(1998) ；Kempf,Methods Enzymol.，241 :334-354(1994) ；Hruby, Biopolymers,33 :1073-82(1993) ；Wiley et al. , Med. Res. Rev. , 13 :327-384(1993)； Claeson, Blood Coagu1. Fibrinolysis, 5 :411-436(1994))。
所述物質可以是多糖或是磷脂。術語「幹擾活性」指物質抑制目標分子表達和/或活性的能力。抑制表達可以是在mRNA或蛋白質水平，且可以是由於合成減少，降解增加或是兩者皆有。抑制活性指目標分子的生物化學或生物功能。抑制程度可以是部分的(如10%或更多，25%或更多，50%或更多或75%或更多)，基本完全的(如85%或更多，90%或更多或95%或更多)或完全的 (如98%或更多或99%或更多)。⑶L4A是一種起多聚體複合物成份作用的泛素連接酶，其中⑶L4A的C末端與環蛋白I^bxl/ROCl/Hrtl (之後用MdxI表示)相互作用從而招募E2泛素連接酶，且⑶L4A的 N末端與DDBl相互作用。DDBl進而作為適體結合DDB1、⑶L4A相關因素(DCAFs)，其起到底物受體作用(Angers et al. , Nature, 443 :590-593(2006) ；He et al. , Genes Dev. ,20 2949-2954(2006) ；Higa et al.，Nat Cell Biol.，8 :1277-1283(2006) Jin et al.，Mol. Cell, 23 :709-721 (2006) ；Lee and Zhou, Mol. Cell, 26 :775-780 (2007)) 通過含有 CUL4A 的複合物泛素化的底物包括 c-Jun，DDB2，XPC 和 p21(Liet al. ,Cell, 124 :105-117(2006)； Nishitani et al.，J. Biol. Chem.，283 :29045-52(2008))。本申請使用的術語「幹擾⑶L4A活性」指物質抑制⑶L4A表達和/或生物化學或生物功能的能力。⑶L4A的生物化學功能例子包括但不限於結合DDB1，結合Rbxl和具有泛素連接酶活性(如泛素化和不穩定化P21，泛素化和不穩定化DDB2和泛素化和不穩定化 XPC)。在某一實施例中，幹擾⑶L4A活性的物質會干擾⑶L4A與損傷DNA結合蛋白I(DDBl) 的結合。優選的，物質幹擾⑶L4AN末端α -螺旋區域與DDBl的BPB β -螺旋推進結構域間的作用。幹擾⑶L4A與DDBl連接的物質可以與⑶L4A和/或DDBl直接作用或者通過與含有⑶L4A-DDB1的複合物的另一成份連接產生間接作用。在某一實施例中，幹擾⑶L4A活性的物質競爭性地抑制動物體內內生長的⑶L4A 與DDBl的結合。該競爭性抑制劑可以是含有CUL4A片段的多肽或擬肽。優選的，CUL4A片段包括⑶L4A N末端區域(如SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 18)或其具有與⑶L4A N末端區域相似功能的類似物、同源物、衍生物或片段(如SEQ ID NO 7 or SEQ ID NO :18)。⑶L4A的生物功能的例子包括但不限於調節細胞增殖，細胞殘存(cell survival)，DNA 修復和基因完整性(genomic integrity) (Lee and Zhou. Mol. Cell, 26 775-780 (2007))。在優選實施例中，幹擾CUL4A活性的物質增加DNA修復活性。在特定優選實施例中，幹擾CUL4A活性的物質增加核苷酸切除修復活性從而預防或治療動物體內DNA 損傷相關狀態。無論物質是幹擾⑶L4A的表達還是幹擾⑶L4A的生物化學或生物功能，抑制程度可以是部分的(如10%或更多，25%或更多，50%或更多，或75%或更多)，基本完全的(如 85%或更多，90%或更多，或95%或更多)，或完全的(如98%或更多，或99%或更多)。本發明也提供了含有(a)幹擾CUL4A活性的物質和(b)載體的組合物。該組合物通常為液體，但也可以是固體或液體和固體成份的組合。理想載體為生理可接受的(如可藥用的、藥理可接受的或可用於化妝品的)載體(如賦形劑或稀釋液)。任何合適的生理可接受的載體都可用於本發明中，且該載體是本領域公知的。載體的選擇至少部分取決於目標組織和/或細胞的位置，和組合物特定的給藥方法。組合物可以進一步包括其他合適的成份，特別是用於增加組合物和/或其最終用途的穩定性。相應的，本發明組合物具有多種合適的劑型。以下劑型和方法僅僅用於舉例並不是用於限定。因為含有核苷酸分子的組合物相對尺寸大，易被內切酶降解且核苷酸分子帶負電荷，其需要輔助成份用於促進或加強細胞內的傳遞。合適成份的例子包括但不限於脂質體、 陽離子聚合物和納米粒子。選擇性的，核苷酸分子的5』或3』端可以連接富含精氨酸的肽、 膽固醇或者脂肪酸用於促進或加強細胞內的傳遞。合適的成份和共軛物是本領域內普通技術人員熟知的(見如美國專利 6，617，438 和 7，402，574 ；Whitehead et al. ,Nat. Rev. Drug Disc.，8 :129-138(2009)) ο適於腸胃外給藥的劑型包括水性和非水性、等滲消毒注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使製劑等滲於目標受體血液的溶質，和含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性或非水性消毒懸浮液。製劑可以置於單元劑量或多劑量封裝的容器中，如針劑和小瓶，可以存儲在冷幹(凍幹的)環境中，使用之前只要求加入消毒的液體賦形劑如水，用於注射。臨時注射溶液和懸浮液可是由消毒粉末、顆粒和之前描述的藥片種類製備。非腸道給藥製劑可以配製為腫瘤外給藥，靜脈注射、腹膜內注射、眼內注射、皮下注射和類似製劑。使用本領域公知的，適於口服給藥劑量的可藥用的載體配製適於腸道給藥的組合物。該載體使藥物組合物可以配製為藥片、藥丸、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液和類似製劑用於病人的攝取。口服的藥物製劑可以通過將活性化合物與固體賦形劑結合，選擇性的研磨獲得的混合物，並在需要時加入合適的輔助劑，之後處理該顆粒混合物從而獲得藥片或糖衣丸核。合適的賦形劑有碳水化合物或蛋白質填充物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；穀物中的澱粉、小麥、大米、馬鈴薯或其它植物；纖維素如甲基纖維素、羥基丙基甲基-纖維素或羧基甲基纖維素鈉；和橡膠，包括阿拉伯樹膠和黃氏膠；和蛋白質，如明膠和膠原質。如果需要，可以加入崩解製劑或增溶劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、褐藻酸或其鹽，如藻酸鈉。提供的糖衣丸核帶有合適的糖衣，如濃縮的糖溶液，其也可以含有阿拉伯樹膠、雲母、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶液或溶劑混合物。藥片或糖衣丸糖衣中可以加入染料或色素用於確認產品或有效化合物量，即劑量特徵化。適合肛門或直腸給藥的製劑可以通過將活性物質與多種基質(base)如乳化基質或水溶性基質混合來製備栓劑。適於陰道給藥的製劑可以是含有活性成份和本領域公知的合適載體的陰道栓劑、棉塞、乳劑、凝膠、軟膏、泡沫或噴霧製劑。適於眼部給藥的製劑可以通過將活性物質與含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑和使製劑等滲壓於目標對象的眼部組織的溶質的多種水性和非水性，等滲壓消毒注射溶液和含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性消毒懸浮液混合製備成注射劑、滴劑、噴霧劑或薄膜。在本發明一優選實施例中，幹擾CUL4A活性的物質單獨或與其他合適的成份組合製備成吸入給藥的氣霧劑。本發明的物質優選為以分離形式(finely divided form)與表面活性劑和推進劑的共同提供。本發明化合物通常的質量百分含量可以為約0.01%至約 20%，優選為約至約10%。表面活性劑必須是無毒的，且優選為可溶於推進劑中。典型的表面活性劑為含有6至22個碳原子的脂肪酸酯或脂肪酸偏酯，如帶有脂肪族多羥基醇或其環狀酐的己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、膽留酸(olesteric acid) 和油酸。可以使用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑可以是組合物質量的約 0. 至約20%，優選為約0.25%至約5%。組合物的平衡是普通推進的。需要時也可以包括載體，如用於鼻內傳遞的卵磷脂。氣霧劑可以置於可接受的加壓推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮或類似物。他們也可以配製為藥品用於無壓力製備，如在噴霧器或霧化器中。 該噴霧製劑可以用於如黏膜噴霧，也可以特定優選的用於預防或治療呼吸系統或空腔和咽部癌症。在特定優選實施例中，製劑為含有幹擾CUL4A活性物質和化妝品可用載體的防曬組合物。通常防曬組合物是水包油或油包水乳液，其中油相包括一種或多種防曬化合物、增溶劑、矽樹脂乳化劑、潤膚劑和其它化妝品可接受的皮膚調節劑。水相主要為水，但是通常包括輔助成份如保溼劑(如戊二醇和丙三醇)，防腐劑和增稠劑。輔助成份如香味劑、染料和提取物可以在製備後加入相或乳液中。相似的，本發明幹擾CUL4A活性的物質可以在製備後根據該物質的生理化學特徵加入到油相、水相或乳液中。術語「防曬化合物」指能夠隔離波長為^0nm-320nm(即UV-B)和/或320nm_400nm 的紫外線(即UV-A)照射的化合物。防曬化合物可以是一個或多個能吸收UV照射的有機化學製品，一個或多個反射、分散或吸收UV照射或其組合的無機化學製品。合適的防曬化合物例子包括但不限於磺異苯酮、二羥苯宗、氨基苯甲酸甲酯、4-氨基苯甲酸(PABA)、戊基二甲基PABA、辛基二甲基PABA、丙三基PABA、對-甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯、二乙醇氨對-甲氧基肉桂酸酯、對-甲氧基肉桂酸乙基己酯、二沒食子醯三油酸酯、4-二(羥基丙基) 氨基苯甲酸乙酯、2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸-2-乙基己酯、水楊酸-2-乙基己酯、原膜散酯、三乙醇胺水楊酸鹽、2-苯基並咪唑-5-磺酸、紅礦脂、二氧化鈦、氧化鋅及其組合物。防曬組合物可以適應性的採用乳液、油、凝膠、固體棒狀、噴霧和泡沫的形式。防曬組合物及製備方法是本領域普通技術人員公知的，並在如美國專利5，587，150,5, 770，183 和6, 033, 649中有描述。本發明也包括一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的含有幹擾CUL4A活性的物質和可用於化妝品的載體的防曬組合物，進而預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態。在某一實施例中，本發明的防曬組合物在UV照射前給藥。理想的，防曬組合物在UV照射前10分鐘或更長，20分鐘或更長、30分鐘或更長，或60分鐘或更長前給藥用於預防或減弱DNA損傷。在另一實施例中，防曬組合物在UV照射中給藥用於預防或減弱DNA損傷或增強DNA修復。在另一實施例中，防曬組合物在動物UV照射後給藥。理想的，防曬組合物在UV照射30分鐘或更短，1個小時或更短， 4個小時或更短，12個小時或更短，或M個小時或更短後給藥用於增強DNA修復。本發明也提供了一種對需要的動物進行幹擾CUL4A活性的物質和化療製劑共同給藥的方法。「共同給藥」表示化療製劑和幹擾⑶L4A活性的物質的給藥時間足夠近以至於幹擾CUL4A活性的物質能夠增強化療製劑的效果。在這點上，幹擾CUL4A活性的物質可以和化療製劑同時給藥。任何類型的化療製劑都可以和幹擾CUL4A活性的物質共同給藥，包括但不限於抗微管劑、抗代謝物劑、抗有絲分裂劑、DNA損害劑、促凋亡劑、誘導分化劑、抗生素、荷爾蒙及其任何組合物。合適的化療製劑包括但不限於酪氨酸激酶抑制劑(金雀異黃酮)、生物活性劑(TNF或tTF)、放射性核(mI、9°Y、mIn、211At、32P和其他已知的治療放射性核)，阿黴素、安莎類抗生素、天冬醯胺酶、博來黴素、白消安、順鉬、卡波鉬、卡氯芥、卡培他濱、瘤可寧、阿糖胞苷、環磷醯胺、喜樹鹼、氮烯唑胺、更生黴素、道諾黴素、右丙亞胺、多西他奇、阿黴素、依託泊苷、埃博黴素、氟尿核苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、 伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、巰基嘌呤、美法侖、甲氨蝶呤、雷帕黴素(西羅莫司) 和衍生物，絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、亞硝基脲、紫杉醇、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、甲基苄胼、利妥昔單抗、鏈脲黴素、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、噻替派、紫杉烷、長春鹼、長春新鹼、長春瑞濱、紫杉醇、考布他汀、盤皮海綿內酯(discodermolides)、反鉬、抗血管內皮生長因子化合物(抗VEGFs)、抗外皮生長因子受體化合物(抗EGFRs)、5氟尿嘧啶及類似物。一劑量的一種或多種化療製劑可以根據本發明方法給藥。本發明方法使用的化療製劑的類型和數量將依據特定腫瘤類型的標準化療方案確定。換句話說，在使用單個化療製劑常規治療特定癌症時，也可以使用化療製劑的組合物治療另一種癌症。化療製劑的給藥量足以治療癌症(如化療製劑的癌症有效治療量)。在給藥時，熟悉本領域技術的臨床醫生可以確定組合物的有效治療量用於治療或預防特定疾病狀態或病症。本發明也提供一種識別調節CUL4A泛素連接酶活性的物質的方法，該方法包括(a)在適於形成⑶L4A-DDB1的條件下混合⑶L4A多肽、DDBl多肽和測試物質，(b)檢測(a)條件下形成的CUL4A-DDB1複合物的量，和(c)比較測試物質存在時(b)中檢測的 ⑶L4A-DDB1複合物的量和沒有測試物質時(b)中檢測的⑶L4A-DDB1複合物的量，由此差別反映測試物質調節CUL4A泛素連接酶活性的能力。用本發明方法識別的具有CUL4A泛素連接酶活性的調節劑可以是陽性調節劑，即增加⑶L4A泛素連接酶活性的物質。調節劑可以增加⑶L4A泛素連接酶活性至相比無調節劑時泛素連接酶活性的約1. 5倍或更多，約2倍或更多，約3倍或更多，約4倍或更多，約5 倍或更多，約10倍或更多，約15倍或更多，約20倍或更多。CUL4A的調節劑可以是陰性調節劑，即降低、抑制或幹擾CUL4A泛素連接酶活性的物質。相應的，本發明提供了識別幹擾CUL4A泛素連接酶活性的物質的方法，該方法包括 (a)在適於形成⑶L4A-DDB1複合物的條件下混合⑶L4A多肽、DDBl多肽和測試物質，(b) 檢測(a)條件下形成的CUL4A-DDB1複合物的量，和(c)比較測試物質存在時(b)中檢測的 CUL4A-DDB1複合物的量和沒有測試物質時(b)中檢測的CUL4A-DDB1複合物的量，由測試物質存在時CUL4A-DDB1複合物形成的量的減少反映測試物質幹擾CUL4A泛素連接酶活性的能力。理想的，幹擾CUL4A活性的物質抑制泛素連接酶的活性，使其相比沒有幹擾物質存在時降低至少25% (如25%或更多，35%或更多，或45%或更多)。優選的，幹擾⑶L4A 活性的物質抑制泛素連接酶的活性，使其相比沒有幹擾物質存在時降低至少50% (如50% 或更多，60%或更多，或70%或更多)。最優選的，幹擾CUL4A活性的物質抑制泛素連接酶的活性，使其相比沒有幹擾物質存在時降低至少75 % (如75 %或更多，85 %或更多，或95 % 或更多)。篩選能夠調節蛋白質-蛋白質相互作用的物質的方法是本領域普通技術人員公知的。例如，測試物質可以通過傳統的本領域公知的分析如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，酶聯免疫斑點(ELISP0T分析)，放射性免疫測定或BI0C0RE分析針對調節⑶L4A-DDB1複合物的能力進行篩選，從而可以確定測試物質存在和不存在時的親合力。優選的，篩選作為高通量篩選的一部分是在多孔板上進行的。實施例中更加詳細的描述了合適的篩選分析方法。⑶L4A多肽可以是全長的⑶L4A多肽(如SEQ ID NO 1)或全長⑶L4A多肽的片段。全長CUL4A的片段長度可以是75個胺基酸或更多，100個胺基酸或更多，125個胺基酸或更多，或150個胺基酸或更多。可選的或另外，全長CUL4A多肽的片段長度為750個胺基酸或更少，600個胺基酸或更少，450個胺基酸或更少，或300個胺基酸或更少。因此，全長 CUL4A的片段長度可以是上述端值中任何兩個連接的長度。例如，全長CUL4A的片段長度可以是75-750胺基酸，150-450胺基酸或125-300胺基酸。理想的，全長CUL4A的片段包括⑶L4A整個N末端α -螺旋區域(如SEQ ID NO 7)和/或保留與DDBl多肽結合的能力。全長⑶L4A多肽片段的另一個例子包括⑶L4A整個N末端α-螺旋區域，並與含有包括SEQIDN0 5或SEQ IDNO 6片段的DDBl多肽結合。DDBl多肽可以是全長DDBl多肽(如SEQ IDNO 3)或是全長DDBl多肽的片段。全長DDBl多肽片段的長度可以是150個胺基酸或更多，200個胺基酸或更多、250個胺基酸或更多或300個胺基酸或更多。可選的或另外，全長DDBl多肽的片段長度可以是800個胺基酸或更少，600個胺基酸或更少或400個胺基酸或更少。因此，全長DDBl多肽的片段長度可以是以上端值任意兩點連接的長度。例如全長DDBl多肽的片段長度可以是150-800個胺基酸，200-600個胺基酸或250-400個胺基酸。理想的，全長DDBl多肽的片段包括DDBl的BPB β -螺旋推進結構域(如SEQ ID NO 8)和/或保留與⑶L4A多肽結合的能力。優選的，全長DDBl多肽的片段包括胺基酸殘基Α400、I402、L404、V443、E537、W561、1587和R589，這些胺基酸殘基被確定與CUL4A形成直接接觸(Angers et al.，Nature, 443 =590-593(2006)； Li et al.，Cell, 124 :105-117(2006))(圖 12)。⑶L4A多肽和/或DDBl多肽可以與處理序列或識別序列如蛋白純化標記連接。合適的蛋白純化標記例子包括但不限於GST或FLAG和聚組氨酸。優選的，蛋白純化標記為 GST或FLAG。最優選的，⑶L4A多肽和DDBl多肽的蛋白純化標記是不同的。在識別調節CUL4A泛素連接酶活性的物質的方法的優選實施例中，CUL4A多肽和 DDBl多肽被不同分子標記，且標記的⑶L4A多肽或標記的DDBl多肽被固定在雷射可激發的供體珠上，同時不固定在供體珠上的CUL4A多肽或標記的DDBl多肽被固定在含有能夠在純態氧存在時化學發光的二甲基噻吩衍生物的受體珠上。實施例對該實例作了更詳細的描述。調節⑶L4A泛素連接酶活性的測試物質可以是任何合適的物質。例如，調節⑶L4A 泛素連接酶活性的測試物質可以是小分子(如來自化學文庫的小分子)或是肽(如噬菌體表面展示的，如在噬菌體展示文庫中的)。以下實施例是對本發明的進一步說明，不應理解為限制範圍。實施例1本實施例證明了 Cul4敲除(Cul4+)小鼠的生成且將其顯型與之前公開的Cul4a 敲除小鼠比較。為了生成兩側裝接上IoxP位點的CuWa等位基因，通過Cul4a cDNA探針篩選1 個基因組文庫(英傑)。五條BAC克隆被識別，且克隆#297L07被用於產生最終目標構建子。 目標載體通過將LoxP位和pSV-FLP-Cre新黴素抗性表達框置於外顯子17的上遊1. Ikb處和將另一個LoxP位置於外顯子19下遊300bps處。5，和3，同源手臂分別為31Λ和51Λ， 且是通過BAC克隆的EXL長範圍PCR(Mratagene)生成的。在電穿孔和G418篩選後，通過 DNA印跡法識別同源重組的ES克隆。通過BamHI消化ES細胞基因組DNA，和通過DNA印跡與緊接5』同源臂上遊的(immediately upstream)探針雜交評估5』端的同源重組。野生型等位基因產生一 111Λ條帶，儘管目標等位基因由於pSV-FLP-Cre載體內額外的BamHI位點產生一 7. 3kb條帶。通過McI和I^acI的消化和緊接3』同源臂下遊的探針的雜交確定 3』端的同源重組。野生型等位基因相比目標等位基因中的71Λ條帶顯示91Λ條帶。同源重組後的兩個陽性克隆(#379和#395)通過胚泡注射生成嵌合小鼠。通過兩側裝接上IoxP位點的CuWa小鼠和E2A_Cre轉基因品系配種，種系誘導刪除外顯子17至19生成刪除的CuWa等位基因(Lakso et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，93 :5860-5865 (1996))。通過DNA印跡法和PCR確定目標基因座的傳遞 (transmission)。所有突變的動物都與C57BL/6J回交雜種12代。通過使用CelLytiC MT哺乳動物組織消散/提取劑(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)從Cul4a+、Cul4af/f或野生型同窩出生的仔畜的組織中提取蛋白質分析蛋白質表達。 用⑶L4A抗體(C-19，聖克魯斯生物技術，聖塔克魯斯市，加拿大)和β-肌動蛋白對組織和 MEF提取物進行免疫印跡(西格瑪，聖路易斯，Μ0)。用於基因打靶的短髮夾(sh) RNAs如下鼠科動物(murine) Sh-Cul4b 為 5' -GTAGTAACGAGAGAGAAGACT-3' (SEQ ID NO 9)；鼠科動物 sh-Pcid2_l 為 5，-GGCAAAGCACGAGACGTTCTT-3，(SEQ ID NO :10)；鼠科動物 sh-Pcid2_2 為 5，_GATGAAATGTT TGCAGCTCATT-3，(SEQ ID NO :11)；鼠科動物 sh_p21 為 5，-GAGAACGGTGGAACTTTGACTT_3，(SE Q ID NO 12)；打亂的 sh-Cul4b 為 5，-GTCGCAGCAATAAATACGGCT-3，(SEQ ID NO :13)；和人類 sh-Cul4a 為 5，-GAAGCTGGTCATCAAGAAC-3，(SEQ ID NO :14)。shRNAs 被亞克隆至 FUGW 慢病毒載體中且在 U6 啟動子下表達(Sui and Shi,Methods Mol. Biol. , 309 :205-218 (2005)) 生成的重組慢病毒被用於感染MEFs或HCT116細胞。通過兩次保守PCR反應和使用以下PCR引物克隆至P⑶NA3載體生成⑶L4A(A) 突變體(刪除殘基 585-727)上遊 PCR 引物為 5，-GCGATATCCGCGGACGAGGGCCCTCG-3，(SEQ ID NO 15)；第一下遊引物為 5，-CATATAGTCTCTGTCTATAAGTGACTCAATCCTTTTTTTCAAATCTCCA GGCTCCTTAAAGTCCGCCTTCAGC-3，(SEQ ID NO 16)，第二下遊引物為 5，_GCTCTAGATCATGCCACG TAGTGGTACTGATTTGGACTGTCTTTGTCTCGTTCCATATAGTCTCTGTCTATAAG-3，(SEQ ID NO :17)。通過MYC標記的CUL4A或CUL4A突變體(去除殘基585-727) (CUL4A(A))瞬時轉染的細胞的免疫沉澱反應評估⑶L4A與Rbxl間的作用。MYC標記的⑶L4A或⑶L4A突變體是由PCR和克隆到ρ⑶NA3-MYC載體生成的，其中帶有或不帶有FLAG標記的Rbxl共轉染。用抗-MYC進行免疫沉澱，用抗-MYC(Ab-I)和商業獲得的抗-FLAG(IC)抗體進行之後的蛋白質印跡。為了研究⑶L4A在DNA修復和腫瘤發生中所起的生理作用，通過Cre/lox方案生成條件性CuWa敲除小鼠。外顯子17-19橫跨重要的卡琳同源結構和類泛素化 (neddylation)位點，在胚胎幹(EQ細胞中通過同源重組在兩側裝接上IoxP位點(圖1A)。 DNA印跡確認了目標CuWa基因座存在於兩側裝接上IoxP位點的雜合(f/+)胚胎幹細胞中 (圖IB)。PCR分析確認了鼠尾DNA中的野生型、兩側裝接上IoxP位點的、和重組CuWa等位基因(圖1C)。純合子CU14af/f小鼠是健康的且表型上與野生型同窩仔畜不同。隨後通過Cul4a〃f小鼠與E2A_Cre轉基因小鼠雜交繁殖生成Cul4a+小鼠(Lakso et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,93 :5860-5865 (1996))。免疫印跡法已經確認了多種組織和 MEFs 中沒有全長CUL4A蛋白質(圖1D)。可以檢測到C末端截短的⑶L4A(指定的⑶L4A(A))， 但是相比於野生型⑶L4A，其水平已經大大降低(8% )，且不能與Rbxl作用來招募E2泛素連接酶(圖1E)。本實施例所述的Cul4a+小鼠是可發育的，在其壽命中沒有明顯的發育異常。該結果與公開的CuWa外顯子1刪除株的胚胎期致死完全不同(Li et al.，Mol. Cell Biol.， 22 =4997-5005 (2002) ) 0但是，Li等的外顯子1目標構建子也消除了位於CuWa外顯子1附近互補鏈上的Pcid2基因的表達。Pcid2編碼帶有PCI結構域的蛋白質，其保存在26S蛋白酶，C0P9信號轉導體和翻譯起始因子3複合物的必要亞基中(Hofmann and Bucher, Trends Biochem. Sci. ,23 :204-205 (1998))。Li等的外顯子1目標等位基因刪除了第一 Pcid2夕卜顯子上遊5 個鹼基對區域，留下僅ATG翻譯起始密碼子上遊的4個鹼基對(圖2A)。原代小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)中慢性短髮夾(sh)RNA引起的Pcid2表達沉默導致了發育能力迅速消失(圖2B)。與此相反，Cul4a+ MEFs中沒有發現生長停滯或細胞死亡(圖3A)。 因此，Li等觀察到的胚胎致死表型可能是由於臨近Cul4a的互補鏈上的必要Pcid2基因偶然的刪除引起的。在哺乳動物中，兩條Cul4基因(即Cul4a and Cul4b)通常是共同表達且裝配成結構相似的泛素連接酶。因此⑶L4B可以補充⑶L4A的缺失，從而保證Cul4a+小鼠的存活。相應的，Cul4a^ MEFs中Cul4b的沉默導致BrdU摻入的急劇下降和細胞發育能力的喪失(圖3A和3B)。這與之前觀察的Ddbl"- MEFs相符合(Cang et al.，Cell, 127 929-940 (2006))並且與兩種⑶L4蛋白必須去活性來去除⑶L4泛素連接酶活性的事實相一致(Higa et al.，Nat. Cell Biol.，5 :1008-1015(2003) ；Hu et al.，Nat. Cell Biol.，6 1003-1009(2004))ο本實施例證明了 Cul4敲除(Cul4+)小鼠的生成，其中Pcid2基因座未修飾。實施例2本實施例證明了 DDB2、p21和XPC在CuWa缺陷細胞中穩定性增強。從胚胎日(E) 13. 5野生型或CuWa敲除胚胎中分離MEFs。將鼠Cul4b和Pcid2和打亂的對照shRNAs亞克隆到FUGW慢病毒載體中且在如實施例1所述的U6啟動子下表達。 生成重組shCul4b和shPcid2慢病毒用於感染原代Cul4af〃和Cul4a+ MEF細胞。將含有 shRNA的FUGW慢病毒加入Cul4af/f和Cul4a+ MEFs,每12小時一次至36個小時。在感染 48小時後收穫細胞。使用⑶L4A(C-19，聖克魯斯生物技術)，⑶L-4B，DDB2(細胞信號技術， 丹弗斯，MA)，p21(聖克魯斯生物技術)，XPC，組蛋白H3和β-肌動蛋白(西格瑪，聖路易斯市，Μ0)抗體對MEF提取物進行蛋白質免疫印跡。脈衝追蹤分析Cul4a+和Cul4af/f MEFs確定DDB2的半衰期，並使用感光成像掃描儀進行定量。通過追蹤Cul4a+和Cul4af/f MEFs中的環己醯胺(CHX)來分析p21的半衰期，並通過檢測免疫印跡信號定量，其以對數標度繪製時間的函數。MYC標記的CUL4A，HA標記的DDB1，GST標記的CDT2和FLAG標記的p21瞬時轉染或未瞬時轉染的細胞的免疫沉澱反應評估p21與CUL4A-DDB1複合物成份的相互作用。之後用圖6所述的合適的抗體進行免疫沉澱反應和的蛋白質印跡。UV照射後確定HCTl 16細胞中XPC的泛素化。用慢病毒shCuWa或對照FUGW感染 HCTl 16細胞48小時，UV照射10J/m2且在UV後O小時、0. 5小時、1小時和2小時收穫。製備染色質結合的提取物並進行免疫印跡。在Cul4a+小鼠(圖4A)和Cul4a_^MEFS (圖4B)的上皮中觀察到了更高的穩定的 DDB2蛋白質水平。根據脈衝追蹤分析，E13. 5 Cul4a+胚胎衍生的原代MEFs中DDB2的半衰期延長了(圖4C)。為了確定CUL4A和CUL4B在DDB2降解中的相對作用，生成針對小鼠 Cu 14b的慢病毒並用於感染原代Cul4af〃和Cul4a+ MEFs的早期傳代(P3)。shCul4b有效降低了超過93%的小鼠CUL4B，而對DDB2水平的影響很小(圖4B，圖5A)。相反的，Cul4a 敲除或CuWa和Cul4b的消除導致DDB2蛋白質3至4. 5倍的上調，而對mRNA無該效果(圖 4B，圖5A)。作為對CuWa敲除或Cul4b沉默的回應，DDB2mRNA水平維持不變甚至微微下降 (圖 5A)。⑶L4A的刪除(圖4D)增加了 p21的半衰期，導致P21蛋白質在Cul4a+外皮(圖 4A，圖5B)和原代MEFs中積累(圖4B)。而mRNA沒有積累。RNAi引起的Cul4b沉默的影響很小，突出了 CUL4A不僅在控制DDB2和XPC穩定性中的主要作用也突出了其在控制 p21(圖4B)穩定性中的主要作用。當同時去除Cul4a and Cul4b活性導致p21進一步積累時，P21的降解可以與去活化的CuWa或Cul4b降解單獨比較(圖3A和，這是由於帶有敲低Cul4b的Cul4a+ MEFs快速生長停滯了。同樣的，共免疫沉澱反應將p21物質上置於 CUL4A-DDB1複合物中(圖6)。XPC是GGR DNA損傷識別步驟速率的限制因素，同時也是CUL4A-DDB1-DDB2E3連接 M^M^iZMitBU (Friedberg et al. ,DNA Repair and Mutagenesis,2nd Edition ASM Press,Washington,D. C. (2006) ；Sugasawa et al.，Cell，121 :387_40(K2005))。有趣的是， 在正常條件下，刪除CuWa後，XPC蛋白質在原代MEF細胞中的穩定水平增加4. 4倍，mRNA卻沒有，而Cu 14b的敲低對XPC積累影響很小(圖4B,對比道1-3，圖5C)。因此，Cul4a_^MEFs 不僅積累DDB2，而且積累速率限制性XPC DNA損傷傳感物(DNA damage sensor)，用於識別損傷和GGR。UV照射後，DDB1-DDB2複合物馬上識別損傷的DNA並通過與XPC直接結合幫助招募 XPC-HHR2;3B 複合物至 DNA 損傷位點(Fitch et al.，J. Biol. Chem.，278 46906-46910 (2003))。之後CUL4A-DDB1-DDB2E3連接酶將XPC的DNA泛素化，隨後去泛素化，而不是進行蛋白酶依賴性降解(Sugasawa et al.，Cell，121 :387-400 (2005))。XPC的泛素化對GG-NER的生理作用還未確定。因此，評估了⑶L4A去除對XPC結合染色質和UV 照射泛素修飾的影響。由於可利用的XPC抗體不能檢測MEFs中泛素化的小鼠XPC，因此用慢病毒shRNA耗盡人類HCTl 16細胞中的⑶L4A。如圖4E所示，隨著慢病毒shRNA使⑶L4A 沉默，XPC與染色質的結合增加了，這與CuWa缺失時可獲得的更高XPC水平一致(圖4B)。 另外，⑶L4A的耗盡導致了 XPC泛素化顯著抑制UV後染色質(圖4E)。共同性的，這些結果證明了正常條件下CUL4A在控制XPC水平中具體的作用和XPC泛素化在回應UV照射時對染色質的具體作用。另外，⑶L4A主要負責控制DDB2和XPC的泛素化，而⑶L4B在這些過程中的作用，如果有的話也是很少的。本實施例的三個結果反映了 CuWa缺陷細胞中DDB2、p21和XPC的穩定性增強了。
實施例3本實施例證明了 CuWa缺陷細胞中UV損傷的DNA的結合(UV-DDB)和全面性基因組修復(GGR)活性增強。在針對UV-DDB活性的損傷DNA結合分析中，5000J/m2UV照射的32P標記的DNA探針與2 μ g整個細胞的提取物培養。通過電泳遷移率變化分析評估結合(Chen et al. ,J.Biol. Chem. ，276 :48175-48182(2001))。使用之前所述的，在原代Cul4a+(k0-4a scm_4b)、Cul4bkAl(f/f-4a sh_4b)和對照Cul4aM(f/f-4a scm-4b)MEFs(圖7B，ko,敲除；k/d，敲低；scm，打亂的)中進行的方法進行CPD和6-4PP去除的GGRELISA分析。簡單的說，指數增長的MEF細胞在IOJ/ m2UV-C(254nm)下照射且立刻收穫(0小時)或允許其在如圖7B所示時間內修復。分離基因組並通過液閃計數法和煙酸己可鹼染色DNA的螢光檢測技術對其定量。將變性的基因組 DNA固定在精蛋白硫酸鹽塗層的96孔板的每一個孔內，並隨後用6-4ΡΙ^(64Μ-2，1 5000) 或 CPDs(l 5000)，抗小鼠 IgG(H+L) (1 2000，Zymed)的生物素-F(ab『 )2 片段和過氧化物酶-連黴親和素(1 10，000，Zymed)特異性單克隆抗體在37°C培養30分鐘。使用 PBS-吐溫和0. IM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液洗滌並與底物溶液(0. IM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液，0. lmg/mL四甲基聯苯氨ΤΜΒ，0. 03% H2O2)在室溫下培養30分鐘。在每個孔中加入 50 μ 1 IM H3PO4來停止酶反應。使用酶標儀(分子設備)確定Α450。通過血清飢餓72小時同步G0/G1中的原代MEFs，在放入含培養基血清後3小時進行UV照射(10J/m2)，在多個所示時間點收穫MEFs用於[3H]-胸苷摻入法(圖7C) (Gitigand Koff,Methods Mol. Biol.，142 :109-123(2000))或流動血細胞計數法(圖8)來分析細胞周期的進行。10J/m2UV照射MEFs，培養48小時，4%仲甲醛固定並進行4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色來進行微核檢測。UV損傷的DNA的識別受到可利用DDB2細胞池的限制(Fitch et al.，DNA Repair (Amst) ,2 :819-826(2003) ；Tang and Chu, DNA Repair (Amst), 1 :601-616 (2002)) 如使用抗-CPD和抗-6-4PP抗體(圖7B)的ELISA GGR分析所檢測的，相比Cul4af/f MEFs, DDB2 在Cul4a^EFs中的積累導致了 UV-DDB活性的增加(圖7A ；「B」表示DDB-DNA複合物)， 和針對CPDs和6-4ΡΙ^的GGR活性大約20%的增強，這最常見的通過NER修復的損害。與此相反，沒有發現shRNA耗盡對GGR效率的影響(圖7Β)。這些結果證明去除⑶L4A能有效提升GGR能力至超過野生型細胞可達到的臨界點。為了確定p21轉譯後在MEFs中的穩定性是否證明了實施例2執行了 p21依賴性 DNA損傷檢驗點，通過[3H]-胸苷摻入檢測G0/G1同步原代Cul4a+和UV後野生型MEFs進入S期的動力學。野生型MEFs在UV照射後12小時開始離開Gl並摻入[3H]-胸苷，且主要部分在16-20小時進入S期(圖7C)。然而，Cul4a+ MEFs UV照射後進入S期耽誤了 4-6小時。為了確認p21是造成Cul4a+ MEFs中耽誤進入S期的主要下遊目標，通過雜交 Cul4a+和Ρ2Γ/-小鼠生成Cul4a+ ；p21"_ MEFs。當然，p21的去除有效消除了 CUL4A缺失相關的，延長的Gl停滯(arrest)，且導致了加速進入S期。18%的Cul4a+ ；p21"_ MEFs在 UV照射後8小時進入S期，類似於p21+ MEFs中看到的(圖7C)。流動血細胞計數法分析進一步確認了相比野生型MEFs，Cul4a+ MEFs進入S階段至少延遲了 6小時，而去除p21 有效的消除了 Cul4a+ MEFs中的Gl模塊(圖8)。因此，p21在Cul4a+細胞中的穩定性執行了 DNA損傷反應性模塊Gl從而防止過早進入S期，且給NER機器分配額外的時間來確定和去除DNA光損傷。通過慢病毒shRNA去除或敲低Cul4a+中的p21基因導致了在CPD去除中NER活性相對於Cul4a+ MEFs降低8_11 %，突出了 p21在UV誘導光損傷去除中的上調益處(圖 7D)。值得注意的是，在單個生理UV劑量(10J/m2)M小時後，p21引發的GGR增強適中時， 就會有效的擴大重複UV進攻，使用更高UV劑量或者延長照射。在UV照射後，其維持基因組完整能力的增強進一步突出了在Cul4a+ MEFs中延長Gl停滯的優勢，因為Cul4a_^MEFs 的微核比UV照射誘導的野生型MEFs少40% (圖7E)。p21的刪除消除了 Cul4a+ MEFs防止染色體在有絲分裂期間分異混亂的能力。因此，P21在Cul4a+細胞中的穩定性是造成執行DNA損傷反應性模塊Gl和UV照射後細胞周期延遲進入S期的主要原因。該實施例的結果證明了 CuWa缺陷細胞相比野生型細胞具有增強的UV損傷DNA 結合(UV-DDB)和全面性基因修復(GGR)活性。實施例4該實施例證明了皮膚特定的CuWa敲除小鼠對UVB誘導的皮膚癌的抵抗性。Cul4af/f 小鼠與 K14-CreER (Vasioukhin, et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 96:8551-8556(1999))小鼠繁殖用於生成可誘導的皮膚特定的CuWa敲除小鼠。使用八至十二周大的同窩生的小鼠，刮去其背部皮膚每周一次用於UV照射實驗。在UVB照射前， 刮去Cul4af/f ;K14-CreERTAM小鼠的背部皮膚並在局部使用他莫昔芬/DMSO溶液來誘導去除 Cul4a的等位基因。作為對照，野生型同窩生小鼠也接受他莫昔芬/DMSO處理QOmg/天， 持續5天)。照射單個小鼠直至出現皮膚腫瘤或最長照射至48周，對應所有野生型⑶L4A 小鼠出現皮膚腫瘤的那周。在三個獨立的實驗中，使用一組四個UVB燈(TL20W/01 3IlNB 飛利浦燈，國家生物公司)照射共十三隻CUL4A敲除小鼠和十九隻野生型同窩生小鼠，最初劑量為2，500J/m2每天，之後逐漸增加至最大劑量3，500J/m2每天。通過UVX電子輻射計(型號UVX-31)測量UVB的通量。至少每周檢查一次小鼠的健康和腫瘤生長情況。如果小鼠病的過重或外部腫瘤直徑超過1.5cm，則犧牲小鼠。使用log-rank實驗測定統計顯著性。為了進一步分析，皮膚腫瘤被固定在室溫下10%福馬林中過夜，石蠟灌封的且橫截面為ΙΟμπι厚。通過傳統方法進行Η&Ε染色。對於免疫組織化學，用NE0-CLEAR 二甲苯替代品(65351-85，EMD Chemicals, NJ)去除皮膚腫瘤部分的石蠟，並在95C沸騰10分鐘，用 TRIL0GY (CMX832,Cell Marque, CA)找回抗原。在模塊化後(after blocking)，用原代抗體melan-A(A103) (sc_20032，聖克魯斯生物技術)和p63 (A4A) (sc_8431，聖克魯斯生物技術)在4C過夜培養截面，之後用第二抗體和4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染色。為了評估NER同時上調的生理影響和⑶L4A消除對Gl/S DNA損傷檢驗點的影響， 將皮膚特定的他莫昔芬可誘導的CuWa敲除小鼠和CU14af/f對照動物的UV-誘導皮膚癌發生傾向性進行比較。通過他莫昔芬局部給藥首先去除CU14af/f ；K14-CreERTM小鼠背部皮膚刮過部分的Cul4a，接著每天進行UV-B照射。CU14af/f對照小鼠在UV-B處理後27周開始出現腫瘤。在48周前，所有的CU14af/f小鼠背部被刮過的皮膚區域都出現了腫瘤(圖9A)。 組織學和免疫組織化學分析確認了對照CU14af/f小鼠的腫瘤大多數是由表皮衍生出來的扁平細胞癌(圖9B-F)。引人注意的是CU14af/f ；K14-CreER 小鼠中只有一隻保持SCC自由 (圖9A)。也出現了非-SCC腫瘤(如紡錘體細胞瘤)且如預料的，在Cul4af/f和Cul4aM ；K14-CreERTAM組中觀察到了類似的事情，因為K14-CreERTM在這些細胞類型中不表達。SCCs 腫瘤與非SCC腫瘤開始的巨大差別顯示腫瘤抵抗與CUL4A缺失間特定的聯繫。值得注意的是CU14af/m CU14aM ；K14-CreERTAM皮膚顯示了相似的細胞凋亡指數，進而表明了對SCC的抵抗性不可能是因為皮膚特定的CuWa敲除動物中增加的細胞死亡傾向性。不與任何特定理論結合，圖10為一假設模型，其根據實施例1-4所述結果顯示了 ⑶L4A在調節NER和腫瘤發生中的作用。⑶L4A分別通過DDB2和p21目標降解調節性抑制 NER和Gl/S DNA損傷檢驗點通路。因此細胞中刪除CUL4A提升NER能力和Gl/S DNA損傷檢驗點反應至超過野生型細胞可達到的臨界點。NER能力的提升和Gl/S DNA損傷檢驗點反應有助於增強對CuWa敲除小鼠腫瘤生長的抵抗性，所述增強是相比對照小鼠而言。本實施例結果反映了去除CUL4A能更好的防治UV照射引起的皮膚癌。實施例5本實施例證明了顯性負相(DN)⑶L4能增強生物體外NER。用控制腺病毒或含有DN-CUL4(SEQ ID NO :18)編碼基因的腺病毒感染HCTl 16細胞。之後用10J/m2 UV-C照射細胞。在0小時、4小時、8小時和M小時收集基因組DNA，並如實施例3所述，用探針查明CPD損傷。之後計算NER活性的速率作為CPD修復與時間的函數。相比對照細胞，UV照射的HCTl 16細胞中CPD修復發生的更早且在DN-⑶L4表達細胞中更加完全(圖11)。本實施例結果確認了顯性負相(DN)⑶L4能增強生物體外NER。實施例6該假想實施例描述了高通量篩選(HTS)分析用於識別調節(如抑制)CUL4A與 DDBl結合的物質。X射線晶體學研究揭示了 DDB1-CUL4A連接的分子細節(Angers et al.，Nature, 443 :590-593(2006) ；Li et al. ,Cell, 124 105-117 (2006)) DDBl-BPB β-螺旋推進區域內的八個殘基(Α400, 1402，L404, V443, Ε537, W561, 1587 和 R589)被確認與 CUL4A 形成直接接觸(圖12)。DDBl和CUL4A都含有介導其它Ε3成份和輔助調節劑合成的蛋白質-蛋白質作用的多個模塊區域。為了指導CUL4A-DDB1結合界面抑制劑的篩選，使用每一個結合對象的最少的結構域建立結合分析。另外，為了增強選擇性，優化分析參數，最初的篩選將集中在DDBIBPB (之後為"DDB1 (BPB) 」) (SEQ ID NO 8)和不包括CUL4A最N末端區域的N 末端α-螺旋區域間(之後「CUL4A (NTD-N) 」)(SEQ ID NO 7)的結合位點。需要注意的是科林機器高度準確有序的合成Ε3複合物成份以至於該底物將直接指向Ε2結合酶來接受泛素。雖然CUL4A最N末端形成DDBl (BPB)第二結合位點，但是DDBl (BPB)和CUL4A的α -螺旋區域間的結合中斷將會使被招募的底物定向變異，這已經由DDBl(BPB)的W561A變異證明了。其去除了結合併有效的去除了 Ε3的活性，雖然第二結合位點是完整的。圖13顯示了基於微珠的非放射性擴增螢光近均相分析的設計。該設計可以讀出 ⑶L4A (NTD-N) -DDBl (BPB)相互作用。該分析通常涉及設計用於與結合對象分別連接的供體珠和受體珠。雷射激發後，「供體」珠中的光敏劑將周圍的氧氣轉化為更強的激發單線態。 單線態氧分子交叉擴散，從而與「受體」珠中的二甲基噻吩衍生物反應在370nm化學發光。 因為發射光實際為更高的能量(更短的波長)，其進一步活躍同一珠中的螢光團。該螢光團之後在520-620nm發射光。這種層疊的化學反應僅僅在結合對象相互作用引發供體珠和受體珠間距離很接近時發生( 200nm)。如果二者對象間作用很弱或被抑制劑中斷，供體珠產生的單線態會快速衰退至基態，因為他們遭遇受體珠的可能性更小。為了使用ALPHASCREEN 系統(PerkinElmer)，使用與抗GST抗體連接的供體珠來捕獲GST-CUL4A(NTD-N)，且FLAG標記連接的受體珠被用於固定FLAG-DDB1 (BPB)。根據 division 多標記微孔板檢測儀平臺(PerkinElmer)的記錄，CUL4A(NTD-N)與DDBl (BPB) 的結合將會誘導供體珠向受體珠靠近，導致680nm激發時520nm產生冷光信號。使用384 孔微板對GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1 (BPB)的ALPHASCREEN 結合分析三次。引起信號強度超過50%抑制的化合物被確定為「選中」。⑶L4A (NTD-N)-DDBl (BPB)結合分析中檢測的參數包括親合力、結合特異性和載體 (即DMS0)敏感性。通過將定量的GST-⑶L4A (NTD-N) (50nM為起始濃度)和濃度不斷增加的 FLAG-DDB1 (BPB)複合物O_200nM)混合，並在室溫下培養2小時來確定⑶L4A(NTD-N) 和DDBl (BPB)間的親合力。最終反應量為25 μ L，其中含有每種蛋白質各5yL 和5 μ LALPHASCREEN 緩衝液。混合後，室溫培養所述板，搖晃2小時，之後加入 5 μ LALPHASCREEN GST結合供體珠和5 μ L FLAG結合受體珠QOng/mL)。讀取前在室溫下平衡該混合物1小時。每一個數據點都會進行三次。通過GraphPad Prism軟體分析結合數據，並確定表觀Kd。為了證明CUL4A(NTD-N)-DDBl (BPB)結合的特異性，使用未標記的CUL4A(NTD-N) 和DDBl (BPB)進行競爭分析。當未標記的CUL4A (NTD-N)或DDBl (BPB)的濃度增加抑制GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1 (BPB)結合時，可以確定IC5tl。陰性對照為 FLAG-DDB1 (BPB-W561A)突變體，其能夠結合 CUL4A(Li et al. , Cell, 124 105-17 (2006)) 有效的HTS分析要求蛋白質目標在DMSO濃度很強時保持完全的生物活性， 溶劑被用於溶解小分子文庫。為了測試ALPHASCREEN 形式中GST-CUL4A (NTD-N)和 FLAG-DDB1 (BPB)對DMSO的敏感度，加入結合混合物中的DMSO的濃度(0-20% )逐漸增加從而確定保持有效作用的最高濃度。這個為ALPHASCREEN 格式而進行的親合純化的重組CUL4A (NTD-N)與DDBl (BPB) 間結合分析著重於用於分析的主要蛋白質-蛋白質界面。該方法會降低發現影響全長的 ⑶L4A或DDBl其它變構結合位點的可能性。該DDBl可以改變三級結構，導致DDBl-⑶L4A 結合的有效分離。因此，另一方法採用了全長⑶L4A (如SEQ ID NO=D和DDBl (如SEQ ID NO 3)作為在ALPHASCREEN 分析形式中的結合對象，使用全長DDBl和N末端FLAG標記的全長CUL4A (通過CUL4A和MdxI共表達製備和pGEX_4T_l衍生的雙順反子pCool載體來提高表達和CUL4A的摺疊/溶解性(Li et al.，Cell, 124 105-17 (2006)))。在另一個方法中，CUL4A 片段(如 SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO 6)禾口 DDBl 或 DDBl (BPB)在 ALPHASCREEN 分析中作為結合對象使用。該分析可以識別額外的，改變E3連接酶活性必需的DDB1-CUL4A 準確合成的選中。實施例7該假想實施例描述了定量HTS分析，用於識別中斷DDBl-⑶L4A相互作用和泛素連接酶活性的小分子。
由於DDB1(BPB_W561A)中單點突變就足以中斷DDB1-CUL4A結合(Li et al.， Cell, 124 :105-17 0006))，所以，以DDB1-CUL4A界面關鍵點或誘導變構性構造變化的次級位點(secondary site)為目標的小分子才有可能有效瓦解DDBl-⑶L4A作用模塊且消除泛素連接酶的功能。通過實施例6所述的分析方法對文庫化合物進行大量的高通量篩選從而識別能夠中斷DDBl (BPB)-CUL4A(NTD-N)作用的化合物。結合反應中的每一個成份均被滴定，從而使每一個成份的最終濃度都接近線性反應範圍的頂端值。結合對象最佳的加入順序可以根據以下內容確定。首先，將GST-⑶L4A(NTD-N)與化合物培養，之後在記錄結果前加入FLAG-DDBI(BPB)。篩選是在配備有四分體吸液管(quadrant pipetting)和板堆積單元(plate stacker unit) (Beckman)的Biomek FX液體處理工作站上進行的。 DDB1 (BPB) -CUL4A (NTD-N) ALPHASCREEN 分析是在384孔微板上進行的。每個板都帶有 352特殊化合物。柱子1和柱子M含有陽性對照(GST-CUL4A(NTD-N)和FLAG-DDB1 (BPB)) 和陰性對照(GST-CUL4A (NTD-N)和 FLAG-DDB1 (BPB-W561 A))。化合物在最佳的 DMSO 濃度中稀釋並以IyL試樣量分至板孔中。這使化合物在IOyL結合反應中的最終濃度為 10mM，其在GST-CUL4A (NTD-N)和FLAG-DDB1 (BPB)處於結合分析最佳濃度和加入次序時加入。加入供體珠和受體珠並培養1小時，使用ENVISION 多板讀取器(PerkinElmer)讀取 ALPHASCREEN 信號。每一塊板的陽性和陰性對照孔的Z，得分必須都是0.5或更大Ghanget al.，J. Biomol. Screen，4 :67-73(1999))。在使用 ActivityBase 軟體包(IDBS software, Emeryville, CA)分析數據時自動計算每一塊板的Ζ』因素(用於質量分析)。在兩次獨立試驗中，引起發光信號降低50%的化合物被分類為選中並由之後二級篩選確定。進行多次二級篩選和確定性分析從而去除錯誤的陽性和非特異性抑制物。去除之前所示的在多個分析中找到多個目標的斯隆凱特林HTS核心資料庫記錄的被確定為「非特異性」的化合物。使用一系列2倍HTS形式的化合物稀釋物和選中化合物檢測選中的IC5tl 可以追擊到那些僅展現劑量依賴性抑制的化合物。選中被分為結構相關的化合物組用於識別這些選中和「非選中」(即無抑制)共同的架構並用來自化學文庫資料庫的相關結構檢查結構活性關係(SAR)。SAR分析起過濾作用，用於確定選中，並確定這些抑制劑的核心結構特徵。抑制的可逆性通過分離蛋白質複合物和測試化合物的混合物確定。如果抑制是可逆的，其去除抑制劑並恢復信號至對照水平(control level)。通過傳統的DDBl體外泛素化分析進一步測試選中化合物抑制的真實性。另外，帶有和不帶有選中化合物的降低分析(pull-down assays)作為一個獨立的分析進行從而確定DDBl (BPB)_CUL4A(NTD_N) 作用的波動。滿足所有設定標準的擊中化合物將被進一步追蹤。任何不可逆性抑制 DDBl (BPB)-CUL4A(NTD-N)結合的具體的化合物可以被進一步追蹤，因為使用最長的抗細菌和抗癌藥物屬於這一類(青黴素和5-FU)。第二輪篩選出的具有有效IC5tl值的化合物將被選擇測試其是否幹擾DDBl-⑶L4A 泛素連接酶活性和體內NER活性。在測試選中化合物體內活性之前，所有候選化合物的細胞滲透性將通過平行人工膜滲透能力分析(PAMPA)確定。其使用脂填充膜確定潛在藥物化合物的被動的，跨細胞的滲透性質(Kansy et al.，J. Med. Chem. ,41 :1007-10 (1998))。 PAMPA分析(微孔)相對簡單，便宜且直接，卻可以產生相比傳統細胞分析，如使用Caco-2 細胞分析的結果(Kansy et al.，J.Med. Chem. ,41 1007-10 (1998))。細胞滲透性好的化合物將在之後在細胞系中檢測。皮膚滲透性差的有效的領先化合物(potent leads)可以通過修飾變得更具有親脂性從而提高膜滲透性，同時注意避免影響溶解度。建立原代Cul4Afl/flPDDBlfimMEF細胞(Cang et al.，Cell，127 :929-40(2006)) 和人類HCT116克隆癌細胞作為模型細胞系來測試抑制劑對DDB2降解的影響並檢測對NER 活性的影響。用測試化合物或載體處理細胞4小時，之後收穫並溶解用於DDB2、DDBl、CUL4A 和β-肌動蛋白(對照)抗體的免疫印跡。通過上述實施例3所述的ELISA分析進一步評估選擇性提高DDB2表達量的化合物修復UV誘導的CPDs和6，4-PI^s的能力。作為對化合物特異性的控制，原代Cul4Afim和DDBlfim MEF細胞將被重組腺病毒表達的Cre重組酶感染，從而在加入選中化合物前去除內生的CuWa或DDB1，進而確定抑制作用是否真正依賴 DDBl-⑶L4A泛素連接酶。帶有針對人類⑶L4A或DDBl的shRNAs的重組慢病毒也可以用於評估化合物在人類HCT116細胞中的特異性。根據本實施例所述的方法，領導型小分子抑制劑可以與CUL4A或DDBl共結晶，從而確定抑制的分子基礎，並在上述UV皮膚癌小鼠模型系統中測試，進而評估其在防治皮膚癌生成中的效力，並進一步開發這些合成抑制劑作為預防和治療人類惡性腫瘤的抗癌藥物。實施例8該假想實施例展示了識別調節(如抑制)CUL4A泛素連接酶活性的物質的創造性方法的另一實施例，其中，該方法適於識別肽抑制劑。與DDBl (BPB)或⑶L4A (NTD-N)作用的肽抑制劑可以通過圖14所示方案對噬菌體展示文庫進行篩選來識別。簡單地說，將FLAG-DDB1 (BPB)或GST-⑶L4A(NTD-N)固定在 FLAG或GST抗體塗層的96孔ELISA板上，並在每個孔中用10 μ L噬菌文庫培養。在大量洗滌後，連接的噬菌體會被胰蛋白酶化的或低PH甘氨酸洗滌緩衝液洗滌，並在Ε. coli中感染從而擴增、排序和第二輪和第三輪篩選(panning)富集獲得強親合力的肽。選擇的肽是通過肽合成器(蛋白質技術有限公司)合成的，用HPLC純化並通過實施例6和7所述的 CUL4A (NTD-N) -DDBl (BPB) ALPHASCREEN 分析評價其在阻礙(blocking)結合界面和抑制體外DDBl泛素化上的效力。展示對結合或E3連接酶活性至少50%的抑制的肽，針對DDB2泛素化和降解的抑制以及增強對抗UV誘導DNA的CPDs或者6，4-PI^s的NER活性，在Cul4AfV fl和DDBlfim MEF細胞或人類HCT116細胞中對其進行體外評價。為了提高膜滲透性，合成肽可以與 HIV-TAT 膜轉換信號序列連接(Nagahara et al.，Nat. Med.，4 1449-52 (1998))。 識別出的肽抑制劑對抗細胞肽酶的穩定性可以通過使用逆向-irwerso肽技術和與母體肽聚集順序相反的D-胺基酸合成優化的肽來提高。這種逆向-inverso肽位於其側鏈的，方向與原結構相似，但是對體內肽酶剪切有抵抗性(Angers et al. ,Nature,443 =590-3(2006)； Van Regenmortel and Muller, Curr. Opin. Biotechnol. ,9 :377-82(1998))。噬菌體展示肽文庫的例子包括但不限於CX1(1C/p8+8文庫，NNS20/p8+8文庫和基於 knottin結構支架的文庫。其如表1所示。
權利要求
1.一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的幹擾CUL4A活性的物質，進而預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質導致DNA修復活性增加。
3.一種預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態的方法，該方法包括對需要的動物給藥有效劑量的幹擾CUL4A活性的物質，其中，幹擾CUL4A活性的物質導致核苷酸切除修復活性的提高，進而預防或治療動物體內DNA損傷相關狀態。
4.如權利要求1-3任一所述的方法，其中，DNA損傷相關狀態選自由下列組成的組群 衰老，長時間暴露在紫外照射下，暴露在化學致癌物下，癌症，著色性幹皮病，科凱恩氏綜合症，毛細血管擴張共濟失調症。
5.如權利要求4所述的方法，其中，所述DNA損傷相關狀態為癌症，其所述癌症選自由以下癌症組成的組群皮膚癌，肺癌，喉癌和肝癌。
6.如權利要求1-5任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質選自由下列組成的組群小分子，多肽，擬肽，多聚核苷酸，多糖，和磷脂。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質是多聚核苷酸，且所述多聚核苷酸選自由下列組成的組群小幹擾RNA(SiRNA)，反義低聚核苷酸，適體和核酶。
8.如權利要求1-7任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質抑制CUL4A表達。
9.如權利要求1-8任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質幹擾CUL4A與損傷DNA結合蛋白I(DDBl)的結合。
10.如權利要求1-9任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質競爭性抑制內生⑶L4A與損傷DNA結合蛋白(DDBl)的結合。
11.如權利要求9或10所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質為多肽和擬肽。
12.如權利要求11所述的方法，其中，所述多肽或擬肽包括CUL4A片段。
13.如權利要求1-12任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質是局部給藥， 口服給藥，鼻內給藥，腸胃外給藥，腸道給藥，直腸給藥或眼部給藥。
14.如權利要求1-13任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質是在含有 ⑶L4A抑制劑和載體的組合物中給藥。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述組合物是防曬組合物。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述防曬組合物包括(a)幹擾⑶L4A活性的物質，(b)選自由以下物質組成的組群的光防護量的防曬化合物磺異苯酮，二羥苯宗，氨基苯甲酸甲酯，4-氨基苯甲酸(PABA)，戊基二甲基PABA，辛基二甲基PABA，丙三基PABA， 對-甲氧基肉桂酸-2-乙氧基乙酯，二乙醇氨對-甲氧基肉桂酸酯，對-甲氧基肉桂酸乙基己酯，二沒食子醯三油酸酯，4-二(羥基丙基)氨基苯甲酸乙酯，2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸-2-乙基己酯，水楊酸-2-乙基己酯，原膜散酯，三乙醇胺水楊酸鹽，2-苯基並咪唑-5-磺酸，紅礦脂，二氧化鈦，氧化鋅及其組合物，和(c)可用於化妝品的載體。
17.如權利要求1-16任一所述的方法，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質是在動物暴露在紫外照射前，照射時或照射後給藥的。
18.如權利要求1-17任一所述的方法，進一步包括對所述動物給藥化療製劑。
19.如權利要求18所述的方法，其中，所述化療製劑選自由以下製劑組成的組群抗微管劑，抗代謝劑，抗有絲分裂劑，DNA損傷劑，促凋亡劑，誘導分化劑，抗生素和荷爾蒙。
20.如權利要求1-19任一所述的方法，其中，所述動物是哺乳動物。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。
22.—種在動物體內幹擾⑶L4A活性的物質。
23.如權利要求22所述的物質，其中，所述物質選自由下列組成的組群小分子，多肽， 擬肽，多聚核苷酸，多糖，和磷脂。
24.如權利要求23所述物質，其中，所述物質是多聚核苷酸，且所述多聚核苷酸選自由下列組成的組群，小幹擾RNA(SiRNA)，反義低聚核苷酸，適體和核酶。
25.如權利要求22- 任一所述的物質，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質在動物體內競爭性抑制內生⑶L4A與損傷DNA結合蛋白(DDBl)的結合。
26.如權利要求25所述物質，其中，所述幹擾CUL4A活性的物質是多肽或擬肽。
27.如權利要求沈所述物質，其中，多肽或擬肽包括CUL4A片段。
28.含有權利要求22-27任一所述的物質和載體的組合物。
29.如權利要求觀所述組合物，其中，所述載體是可藥用或可用於化妝品的載體。
30.如權利要求四所述組合物，其中，所述可用於化妝品的載體進一步包括選自由下列組成的組群的光防護量的防曬化合物磺異苯酮，二羥苯宗，氨基苯甲酸甲酯，4-氨基苯甲酸(PABA)，戊基二甲基PABA，辛基二甲基PABA，丙三基PABAj^-甲氧基肉桂酸_2_乙氧基乙酯，二乙醇氨對-甲氧基肉桂酸酯，對-甲氧基肉桂酸乙基己酯，二沒食子醯三油酸酯，4- 二(羥基丙基)氨基苯甲酸乙酯，2-氰基-3，3- 二苯基丙烯酸-2-乙基己酯，水楊酸-2-乙基己酯，原膜散酯，三乙醇胺水楊酸鹽，2-苯基並咪唑-5-磺酸，紅礦脂，二氧化鈦， 氧化鋅及其組合物。
31.一種識別⑶L4A泛素連接酶活性調節物質的方法，該方法包括(a)將CUL4A多肽，DDBl多肽和測試物質在易於形成CUL4A-DDB1複合物條件下組合，(b)檢測(a)條件下形成的CUL4A-DDB1的量，和(c)比較測試物質存在時(b)中檢測到的生成的CUL4A-DDB1複合物的量與測試物質不存在時(b)中檢測到的生成的⑶L4A-DDB1複合物的量，由此差別反映測試物質調節⑶L4A 泛素連接酶活性的能力。
32.—種識別⑶L4A泛素連接酶活性調節物質的方法，該方法包括(a)將CUL4A多肽，DDBl多肽和測試物質在易於形成CUL4A-DDB1複合物條件下組合，(b)檢測(a)條件下形成的CUL4A-DDB1的量，和(c)比較測試物質存在時(b)中檢測到的生成的CUL4A-DDB1複合物的量與測試物質不存在時(b)中檢測到的生成的CUL4A-DDB1複合物的量，由測試物質存在時生成的 CUL4A-DDB1複合物的量的下降反映測試物質調節CUL4A泛素連接酶活性的能力。
33.如權利要求31或32所述的方法，其中，所述CUL4A多肽是全長CUL4A多肽。
34.如權利要求31或32所述的方法，其中，所述CUL4A多肽是全長CUL4A多肽的片段。
35.如權利要求34所述的方法，其中，⑶L4A所述片段包括⑶L4AN末端α -螺旋區域。
36.如權利要求35所述的方法，其中，⑶L4A所述片段包括選自SEQID NOs :5_7組成的組群的胺基酸序列。
37.如權利要求31-36任一所述的方法，其中，所述DDBl多肽是全長DDBl多肽。
38.如權利要求31-36任一所述的方法，其中，所述DDBl多肽是全長DDBl多肽的片段。
39.如權利要求38所述的方法，其中，DDBl多肽包括DDBl的BPBβ -螺旋推進結構域。
40.如權利要求31-39任一所述的方法，其中，所述⑶L4A多肽和/或所述DDBl多肽與蛋白質純化標記連接。
41.如權利要求40所述的方法，其中，所述蛋白質純化標記是GST或FLAG。
42.如權利要求40或41所述的方法，其中，所述CUL4A多肽的蛋白質純化標記和所述 DDBl多肽的蛋白質純化標記不同。
43.如權利要求40-42任一所述的方法，其中，所述標記的CUL4A多肽或所述標記的 DDBl多肽被固定在雷射可激發的供體珠上，且不固定在所述供體珠上的所述CUL4A多肽或所述標記的DDBl多肽被固定在含有能夠在純態氧存在時化學發光的二甲基噻吩衍生物的受體珠上。
44.如權利要求31-43任一所述的方法，其中，所述測試物質是小分子。
45.如權利要求44所述的方法，其中，所述小分子從化學文庫獲得的。
46.如權利要求31-43任一所述的方法，其中，所述測試物質是肽。
47.如權利要求46所述的方法，其中，所述肽是展示在噬菌體表面的。
48.如權利要求47所述的方法，其中，所述噬菌體是從噬菌體展示文庫獲得的。
全文摘要
本發明提供了預防或治療動物DNA損傷相關狀態的方法，包括給藥一種幹擾CUL4A泛素連接酶活性的物質。本發明還提供了一種幹擾CUL4A活性的物質及包括該幹擾物質和載體的組合物。本發明所述的物質優選增強動物核苷酸切除修復活性。本發明還提供了反向或正向調控CUL4A表達和/或活性的物質的識別方法。
文檔編號G01N33/50GK102282162SQ200980115291
公開日2011年12月14日 申請日期2009年4月29日 優先權日2008年4月29日
發明者周蓬勃 申請人:康奈爾大學