腦突觸體的分離方法

2023-10-24 07:13:02 2

專利名稱：腦突觸體的分離方法
技術領域：
本發明涉及一種腦突觸體的分離方法。
背景技術：
腦突觸體是通過細胞分離技術得到的中樞神經系統神經末梢的膨大部 分。體內神經原與神經原的連接與信號傳遞是通過神經末梢的突觸實現的， 突觸末梢含有神經遞質。當神經衝動到達神經末梢，突觸體釋放神經遞質作 用於次一級神經原，使之產生效應。不同的神經末梢含有不同的神經遞質， 單胺類、穀氨酸、甘氨酸等神經遞質釋放後是通過突觸前膜再攝取後使其作 用消失的。因此腦突觸體是生理和藥理工作者研究的重要部位之一，可用於 與這些神經遞質的攝取活動相關的研究，例如可用於這些神經遞質的抑制劑
和興奮劑的藥理研究。其中，腦突觸體用於單胺類神經遞質，如5-羥色胺 (5-HT)、去甲腎上腺素(NA)和多巴胺(DA)攝取作用的研究，並作為 作用於單胺類遞質再攝取環節的抗精神病藥的篩選模型，是國際公認的、先 進的研究方法。
本發明人曾在文獻報導的方法上，對腦突觸體分離方法進行了研究和改 進(董文心，李建其，倪湘蓮，黃成均.腦突觸體攝取5-羥色胺研究方法的 建立及應用.中國醫藥工業雜誌.2001. 31 (3): 118-120)，其主要步驟為1) 將大鼠斷頭後迅速取出大腦，在低溫條件(4"C的生理鹽水)下去除軟腦膜 及血管組織，取大腦皮層2ml於0.32M(30ml)的蔗糖溶液中勻漿後，以1500g 平衡離心(4°C) 10min，目的是去除大的細胞碎片；2)取上清液於17000g 再次平衡離心(4°C) 30min，目的是收集此液體中的所有組織，進行下面的梯度離心，以分離腦突觸體；3)隨後將沉澱懸浮後置於0.32M、0.8M和1.2M 的蔗糖梯度離心管中以38000g的離心力進行梯度離心60min，用穿刺針小 心收集位於0.8M和1.2M界面之間的懸浮液，此懸浮液即含有腦突觸體；4) 對收集的腦突觸體懸液再次進行離心以20000g的速度(4°C) 30min，所得 沉澱物即精製的腦突觸體。該方法所製備的突觸體懸液中的蛋白含量穩定在 5.6~6.8g/L(6.18±0.36g/L， n=14)，其組間變異為5.8%，在選定300nmol 'I/V 管的3H-單胺作為底物濃度時，突觸體的含量在120-220yg蛋白滑之間， 突觸體攝取單胺的效力無差異，不需每次進行蛋白測定，大大簡化了實驗程 序；而且可以同時進行對5-HT、 NA和DA的再攝取研究。採用該方法對一 些已知單胺再攝取抑制劑的代表藥進行研究，測得的IC50值與文獻報導非常 吻合，而且還篩選出了具有很強的雙重再攝取抑制(5-HT、 NA)作用的新 藥(CNZL02111934.1、 US 10/516,205)。然而此方法操作步驟還較煩瑣，特 別是用穿刺針小心收集位於0.8M和1.2M界面之間的懸浮液的步驟操作難度 較大，若操作不當，則會造成突觸體含量的變化；而且分離時間也較長。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種較上述現有方法步驟簡化、時間縮 短而突觸體懸液中的蛋白含量無明顯變化的、改進的腦突觸體的分離方法。
本發明人通過諸多試驗後發現，將現有方法步驟重新組合，通過控制離 心速度和時間，將含有腦突觸體的離體腦組織(大腦皮層)首先置於0.32M 和1.2M的蔗糖溶液中進行離心，首先去除在1.2M的蔗糖溶液中可沉澱的大 的細胞碎片與沉渣；接著將含有腦突觸體的0.32M的蔗糖溶液置於0.8M的 蔗糖溶液中再次離心，將原來位於0.8M和1.2M界面的突觸體懸浮液直接離 心沉澱於管底，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
因此，本發明的技術方案為 一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步① 將離體大腦皮層組織於0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接置於1.2M 的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20-60分鐘後，用吸管吸去下層的 1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置於0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離 心20 60分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
其中，離心速度越快，相同時間內沉澱更充分；換言之，為達到同樣的 離心效果，所需時間可縮短。當然，考慮到常用的離心設備及能耗，本發明 步驟①中的離心速度一般優選在20000 40000g範圍，而步驟②中的離心速 度優選在30000 40000g範圍。
更佳地，步驟①中的離心速度為20000g，離心時間為30分鐘。 步驟②中的離心速度為30000g，離心時間為30分鐘。 同常規，本發明的兩個離心步驟在低溫(4'C)條件下進行；而0.32M 的蔗糖溶液用量只要能使離體大腦皮層組織勻漿完全即可，通常與離體大腦 皮層組織的體積比至少為10:1，較佳地為15 20:1; 1.2M或0.8M的蔗糖溶
液的用量只要能與0.32M的蔗糖溶液清楚分界，並能接納其中沉澱物即可， 通常其與離體大腦皮層組織的體積比至少為5:1。
根據本發明，所說的腦突觸體通常來源於試驗動物，故本發明以常用的 試驗大鼠為例來說明。
本發明分離方法的步驟，特別是離心步驟由4步改為2步，簡化了操作 程序；離心時間由130min可以縮短為60min左右，縮短了跨度一整天的腦 突觸體攝取單胺實驗的整個實驗進程；省略了操作難度較大、對突觸體含量 影響較大的用穿刺針小心收集位於0.8M和1.2M界面的懸浮液的步驟;所制 備的突觸體的蛋白含量非常穩定，較現有方法無明顯降低，穩定在4.5 5g/L， 符合在選定300nM/管的3H-單胺作為底物濃度時，突觸體的含量在120-220 Ug蛋白/管之間的標準，提供了足量的突觸小體(突觸體)以供再攝取所需 (如表l所示)。表l在定量的SH-5-HT底物濃度下，每管所需突觸小體的作用量
0=4, x±s)
蛋白含量(突觸體)3H-5-HT計數(cpm)
120ug/管300畫1.L-1/管678.5 ±4.95
220U e/管300應ol.L-1 /管695.5 ±86.9

圖1為氟西汀對腦突觸體攝取SH-5-HT抑制作用的量效關係圖(r^4， x ±s)。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。
首先根據常規方法，將Wistar或SD大鼠(上海斯萊克實驗動物責任有 限公司)斷頭後迅速取出大腦，在低溫條件(4"的生理鹽水)下去除軟腦 膜及血管組織，取大腦皮層進行下列實施例的試驗。
其中，突觸體懸液(懸浮於lml人工腦脊液中)中突觸體的含量以每升 溶液中所含的蛋白量來定量，採用上海申索試劑有限公司的總蛋白試劑盒 (雙縮脲比色法)來進行蛋白測定。離心機為(德國Sigma公司，3K30型 高速冷凍離心機)。
實施例1
① 將離體大腦皮層組織2ml於20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接 置於10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡離心30分鐘後，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置於10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 離心30分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.8g蛋白/L。 實施例2① 將離體大腦皮層組織2ml於20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接 置於10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以40000g平衡離心20分鐘後，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置於10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 離心60分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.9g蛋白/L。 實施例3
① 將離體大腦皮層組織2ml於30ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接 置於10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡離心60分鐘後，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置於10ml、0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 離心20分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為4.6g蛋白/L。 實施例4
① 將離體大腦皮層組織2ml於20ml、 0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接 置於10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以30000g平衡離心40分鐘後，用吸管吸去 下層的1.2M的蔗糖溶液；
② 將步驟①得到的上清液置於10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 離心40分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
突觸體懸液中突觸體的含量為5.0g蛋白/L。 應用實施例1
採用本發明方法製備腦突觸體，並進行氟西汀對腦突觸體攝取5-HT抑 制試驗(試驗步驟參照現有技術如CNZL02111934.1)。試管中先加入l.Oml Tris-Krebs緩衝液，隨後加入20 " 1突觸小體懸液(實施例1的腦突觸體用 人工腦脊液懸浮)，繼之加入O.lmM的氟西汀10tU，混合均勻，37'C水浴 中溫浴5min。再加入10"1底物(3H-5-HT)，混勻，37°(:溫浴5min。將試管迅速放入4"C冰水中終止反應，真空抽濾，並洗滌2次。取下濾膜，60-70
'c烘乾，將濾膜放入閃爍瓶內，加入甲苯閃爍液，於e-液閃計數器計數。
突觸體的淨攝取量37。C的cpm值(主動再攝取)減去0。C的cpm值(非特 異性聚集)，其量效關係圖如圖1所示。
測得的5-HT再攝取抑制劑的代表藥氟西汀的ICs。值為0.04 ix mol，U1/ 管，與文獻報導非常吻合(0.049umoH/1)。
權利要求
1、一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步驟①將離體大腦皮層組織於0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接置於1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20～60分鐘後，用吸管吸去下層的1.2M的蔗糖溶液；②將步驟①得到的上清液置於0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離心20～60分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。
2、 如權利要求1所述的分離方法，其特徵在於步驟①中的離心速度為 20000~40000g，步驟②中的離心速度為30000~40000g。
3、 如權利要求2所述的分離方法，其特徵在於步驟①中的離心速度為 20000g，離心時間為30分鐘。
4、 如權利要求2所述的分離方法，其特徵在於步驟②中的離心速度為 30000g，離心時間為30分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種腦突觸體的分離方法，其包括下列步驟①將含有腦突觸體的腦組織於0.32M的蔗糖溶液中勻漿後，直接置於1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡離心20～60分鐘後，用吸管吸去下層的1.2M的蔗糖溶液；②將步驟①得到的上清液置於0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡離心20～60分鐘後，取沉澱物即為精製的腦突觸體。本發明分離方法較現有技術簡化了操作步驟、縮短了分離時間，而且所分離的腦突觸體的蛋白含量非常穩定，在用於單胺類神經遞質的攝取試驗時，具有準確性高、重複性好、效率高和操作簡單的特點。
文檔編號C12N5/06GK101294145SQ20071003987
公開日2008年10月29日 申請日期2007年4月24日 優先權日2007年4月24日
發明者倪湘蓮, 董文心, 顧豐華 申請人:上海醫藥工業研究院