重組惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區蛋白及其製法和用途的製作方法

2023-10-23 22:10:27 1

專利名稱：重組惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區蛋白及其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和基因工程疫苗領域。更具體地，本發明涉及一種含惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區重組蛋白，編碼該重組蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該重組蛋白的方法，以及該重組蛋白在作為藥物靶蛋白以及發展瘧疾疫苗方面的應用。
背景技術：
瘧疾是人類最古老的傳染病之一，目前仍嚴重影響人類的健康。據世界衛生組織(WHO)的最新調查，約世界人口的40％仍處在瘧疾威脅之中，分布於100多個國家。目前世界上每年有3至5億人罹患瘧疾，其中約300萬人死亡。更為嚴重的是，由於瘧原蟲及蚊媒抗藥性的產生和迅速擴散，瘧疾不僅沒有得到有效控制，反而有捲土重來之勢。因此，開展全球遏制瘧疾計劃已成為WHO在新世紀兩個重點研究領域之一。
人們在瘧疾防治中依靠或期望獲得突破的主要有三個途徑抗瘧藥、瘧疾疫苗和蚊媒防制。但抗瘧藥及蚊媒防制面臨著巨大的困難和挑戰，這是因為瘧原蟲及蚊蟲抗藥性的產生和擴散。儘管目前尚未有應用價值的瘧疾疫苗問世，但普遍認為發展瘧疾疫苗是人類控制乃至消滅瘧疾的重要途徑。
大量研究表明，瘧疾是可以通過研製有效的疫苗而實現預防的。如用滅活子孢子免疫的志願者能完全保護後來的攻擊感染。再如用鼠瘧原蟲的重組抗原免疫小鼠，亦能完全保護後來同種瘧原蟲的攻擊感染。此外，瘧疾流行病學研究也顯示，死於瘧疾的主要是無瘧疾免疫力的人群，如在瘧區的兒童和非瘧區人群進入瘧區，而在瘧區的成人很少因瘧疾而死亡。如給這些無免疫力的人群接種有效的疫苗，使其達到與瘧區成人同樣的免疫力，這樣就能實現預防瘧疾和降低瘧疾死亡率的目標。因此，瘧疾疫苗研製已成為當今世界性熱點課題。
在瘧疾疫苗研究中，有兩個候選疫苗的研究曾受到廣泛關注，一是抗子孢子疫苗。該疫苗能抑制子孢子入侵肝細胞。但在後來的臨床試驗中效果不佳。據分析，其主要原因是該疫苗只產生抗子孢子免疫力，這樣即使有極個別子孢子逃避該疫苗免疫攻擊而倖存下來，就能入侵並在肝細胞生長繁殖，產生足夠的裂殖子引起宿主致病。另一個是SPf.66多價合成肽疫苗。該疫苗是一個只有3個10肽表位通過疏水胺基酸相隔連接而成45肽的多聚物[Patarroyo，M.E.，et al，induction of protective immunity against experimental infection with malaria suingSynthetic peptides，Nature，328629，1987]。該疫苗在夜猴攻擊試驗中曾取得了較好的免疫保護效果，但後來在非洲、東南亞及南美洲的現場試驗中未能取得理想的臨床效果，沒有應用價值。該疫苗失敗的原因可能是SPf.66隻有45肽，而在如此短肽序列中，可能不會有足夠的T細胞表位能與多數個體MHC分子結合，導致抗原提呈受阻。
175kD紅細胞結合抗原(EBA-175)是惡性瘧原蟲在紅內期裂體增殖時合成並在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白。對EBA-175的研究表明，它在惡性瘧原蟲的生活史中可能是一個很重要的功能蛋白。然而，雖然曾有人在大腸桿菌中表達過175kD紅細胞結合抗原(EBA-175)，但是表達的EBA-175卻沒有免疫原性。另外，出於某種未知原因，雖然有人嘗試在酵母等真核細胞中表達EBA-175，但卻尚沒有成功地表達的175kD紅細胞結合抗原的報導。因此，人們一直認為EBA-175無法作為抗瘧疾的免疫原實施應用。
綜上所述，儘管以生物技術為基礎的瘧疾疫苗研究已進行了近20年，但至今尚無有應用價值的疫苗問世。
因此，本領域迫切需要開發抗瘧疾的有效免疫原和相關疫苗。

發明內容
本發明的一個目的就是提供一種新的可用於瘧疾疫苗的免疫原。所述免疫原是含惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區(PfEBA175-IIF2)的重組蛋白。
本發明的一個目的是提供該免疫原的製法、用途以及含該免疫原的疫苗組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種重組蛋白，它包含惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2的胺基酸序列，並且具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能。更佳地，所述的重組蛋白具有SEQ ID NO2中1-314位或1-320位所示的胺基酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發明的上述重組蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列(包括1-960位或1-963位)。
在本發明第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體，以及含所述載體的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了一種產生本發明的重組蛋白的方法，它包括步驟在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達出所述的重組蛋白；和分離所述的重組蛋白。
在本發明的第五方面，提供了一種組合物，它含有本發明所述的重組蛋白或其編碼DNA分子和藥學上可接受的載體。
在另一優選例中，所述的組合物是疫苗組合物。
在本發明的第六方面，提供了一種抗體，它特異性地結合於本發明的重組蛋白。
在本發明的第七方面，提供了一種本發明重組蛋白或惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區(PfEBA175-IIF2)的用途，它被用於製備預防瘧疾疫苗。


圖1顯示了PfEBA175-IIF2重組蛋白示意圖和合成示意圖。
其中，APfEBA175-IIF2重組蛋白示意圖。
圖中顯示PfEBA175-IIF2在全長PfEBA175分子中的位置。
SP信號肽；I～VI全長Pf EBA175分子的六個區；TM跨膜區；CYT胞質區；B重組蛋白基因Pfeba175-IIf2的合成示意圖。
Pfeba175-IIf2基因的合成959bp Pfeba175-IIf2基因分成12個寡核苷酸片段，用不對稱PCR法分步進行基因拼接。基因5』和3』分別加上XhoI和EcoRI位點用於基因片段的克隆。各合成片段克隆在pBluscript載體進行序列分析。
圖2全長Pfeba175-IIf2基因的瓊脂糖凝電泳圖。
電泳顯示Pfeba175合成基因條帶(泳道1)。
圖3免疫印跡法檢測PfEBA175-IIF2的表達的電泳圖及與紅細胞的結合反應。
用瘧疾疫區現場人血清進行檢測。其中，泳道1為誘導72小時後的上清。泳道2與大鼠紅細胞的結合反應；泳道3與人紅細胞的結合反應；泳道4與神經胺酸酶處理的人紅細胞的結合反應；泳道5與胰蛋白酶處理的人紅細胞的結合反應；泳道6與兔紅細胞的結合反應；泳道7與小鼠紅細胞的結合反應；1.泳道8為誘導前的培養上清。
圖4是SDS-PAGE測定PfEBA175-IIF2的表達。
在誘導前0hr(泳道2)及誘導後12(泳道3)、24(泳道4)和48小時(泳道5)取培養上清15μl進行SDS-PAGE分離和考馬斯亮藍染色。在35KD處出現一條目的蛋白。泳道1為分子量標準。
圖5是純化的PfEBA175-IIF2重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
表達上清分離後，用Ni柱和HPLC上膠層析兩步純化，經SPS-PAGE測定獲得目的蛋白純度大於95％。泳道17.5μg；泳道215μg。
圖6顯示了PfEBA175-IIF2與瘧疾疫區病人血清的結合反應情況。
以PfEBA175-IIF2重組蛋白包被，以1∶200稀釋的瘧疾疫區病人血清為一抗，進行ELISA檢測。結果顯示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。這表明，自然感染瘧原蟲的人群產生的針對天然PfEBA175-IIF2的抗體能夠很好地識別PfEBA175-IIF2重組蛋白，進一步反應了PfEBA175-IIF2重組蛋白與天然蛋白在構象上很接近。
圖7顯示了用ELISA法測定免疫兔血清PfEBA175-IIF2特異IgG的水平。
圖8顯示了用ELISA法測定免疫鼠血清PfEBA175-IIF2特異IgG的水平。各組分別為◆IIF2單獨免疫；■IIF2聯合免疫；▲PfCP2.9單獨免疫；×PfCP2.9聯合免疫。
圖9顯示了免疫血清抑制瘧原蟲體外生長效率-1。
其中兩組分別是1 ISA720佐劑+Pf EBA175-IIF2和ISA720佐劑+Pf CSP陰性對照蛋白(均為15％血清濃度)。
圖10顯示了免疫血清抑制瘧原蟲體外生長效率-2。
其中各組分別是A.免疫猴抗血清中特異的IgG的體外抑制率B.免疫兔抗血清中特異的IgG的體外抑制率。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，通過對175kD紅細胞結合抗原不同區段的改造以及對表達系統的優化，首次成功地在酵母系統中製得了含175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2且具有免疫原性的重組蛋白。測試表明，該重組蛋白可有效地引起免疫應答，具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能等生物學特性，在構象上與175kD紅細胞結合抗原的天然構象相似。在此基礎上完成了本發明。
175kD紅細胞結合抗原(EBA-175)是惡性瘧原蟲在紅內期裂體增殖時合成並在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白，由616個胺基酸殘基組成。
EBA-175是由Camus和Hardley在1985年首次報導的，該抗原是惡性瘧原蟲在紅內期裂體增殖時合成並在裂殖體破裂時釋放入血的一種可溶性蛋白，該蛋白N-末端為信號肽序列，含有一個跨膜區以及C-末段的胞內區，胞外區可分為6個區域，其中II區和VI區為富含半胱氨酸區，II區含兩個拷貝的富含半胱氨酸區(圖1A)。
研究表明，在六種不同的惡性瘧原蟲分離株中均發現EBA-175，而所有這些分離株與EBA-175肽4抗血清和SAR175抗血清(從感染CAMP分離株之夜猴中製備)產生非常一致的陽性反應表明。這提示，也許不同株EBA-175分子之間存在細微差異，但主要功能域在蛋白結構及構象上是保守的，在生物化學及免疫學性質上是極其相似的。
EBA-175抗原有兩個重要特徵一是它能與人紅細胞血型糖蛋白的唾液酸特異結合，二是它能與裂殖子結合。在EBA-175中存在與紅細胞上受體結合的功能域。EBA-175的N端富含半胱氨酸的II區是EBA-175與紅細胞以唾液酸依賴的方式結合的功能區。II區由兩個重複片段F1和F2片段組成，F2片段是其與紅細胞結合的區域，它與紅細胞結合的方式與全長EBA-175蛋白相同。
如本文所用，術語「175kD紅細胞結合抗原功能區II區F2片段」、「175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2」或「EBA-175IIF2」可互換使用，都指175kD紅細胞結合抗原功能區II區的F2片段。該片段的序列是已知的，例如GenBank登錄號U32207中的第447-760位胺基酸。
如本文所用，術語「175kD紅細胞結合抗原功能區的重組蛋白」、「EBA-175IIF2重組蛋白」等可互換使用，都是指由惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2的胺基酸序列構成的蛋白。此外，175kD紅細胞結合抗原功能區的重組蛋白包括含有或不含有信號肽，以及含有或不含有起始甲硫氨酸的重組蛋白。
如本文所用，術語重組蛋白中「瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2的胺基酸序列」指在本發明重組蛋白中的胺基酸序列，該序列與天然的或變異的瘧原蟲EBA-175IIF2片段具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然瘧原蟲EBA-175基本上相同的抗原活性及唾液酸依賴的紅細胞結合功能等生物學特性。優選的瘧原蟲EBA-175IIF2胺基酸序列包括(但並不限於)天然的EBA-175胞外區中II區的第二個富含半胱氨酸區的胺基酸序列，及其消除了糖基化位點的該胺基酸序列。
此外，在EBA-175IIF2重組蛋白的N端或C末端還可添加其他不影響EBA-175IIF2免疫原性和紅細胞結合功能等生物學特性的胺基酸序列。較佳地，這些添加的胺基酸序列有利於表達(如信號肽)，有利於純化(如6xHis序列、釀酒酵母α-因子信號肽切割位點(Glu-Lys-Arg))，或可促進EBA-175IIF2重組蛋白的免疫原性(例如IL-2、GM-CSF等細胞因子的序列)。
編碼本發明重組蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴增或合成的方法獲得EBA-175IIF2的編碼DNA序列，形成編碼本發明重組蛋白的DNA序列。
為了提高宿主細胞的表達量，可以對EBA-175IIF2重組蛋白編碼序列進行改造，例如採用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利於基因轉錄及翻譯的序列。在本發明的一個實施例中，就採用酵母偏好的密碼子，對EBA-175IIF2重組蛋白基因進行檢測，排除在基因中不利於基因轉錄及翻譯的序列，包括內含子剪切位點，轉錄終止序列等，從而獲得了利於在酵母中表達的編碼序列。
在獲得了編碼本發明重組蛋白的DNA序列之後，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最後，培養轉化後的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的重組蛋白。
如本文所用，術語「載體」包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明新重組蛋白的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是酵母細胞。
在獲得轉化的宿主細胞後，可在適合表達本發明重組蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出重組蛋白。然後再分離出表達的重組蛋白。
另一方面，本發明還包括對EBA-175IIF2重組蛋白或其編碼DNA具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於EBA-175IIF2重組蛋白或片段。較佳地，指那些能與EBA-175IIF2重組蛋白或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的EBA-175IIF2重組蛋白結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的EBA-175IIF2重組蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達EBA-175IIF2重組蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
多克隆抗體的生產可用EBA-175IIF2重組蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於福氏佐劑等。
在本發明的另一方面，提供了含有本發明重組蛋白作為免疫原的組合物，尤其是疫苗組合物，所述的組合物含有0.001-99.9wt％所述的重組蛋白，(b)藥學上可接受的載體和(c)任選的佐劑，其中各組分之和為100wt％。本發明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染後治療疾病)。
這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與「藥學上可接受的載體」組合，這些載體包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、胺基酸聚合物、胺基酸共聚物、脂質凝集物(如油滴或脂質體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(「佐劑」)作用。
增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限於(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)ISA720佐劑；(3)福氏佐劑等。
疫苗組合物(包括抗原，藥學上可接受的載體和/或佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等可存在於這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具體地，包括免疫原性組合物在內的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。「免疫有效量」指以單劑或連續劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配製、治療醫師對醫療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的範圍內，可通過常規實驗來確定。
通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物製成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可製成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該製劑還可乳化或包封在脂質體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。
常規方法是從腸胃外(皮下或肌內)途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服、栓劑和透皮應用等。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調節劑一起給予。
一種疫苗方式是DNA疫苗，即含有編碼本發明重組蛋白的編碼序列的DNA疫苗。
在本發明的一個實例中，全合成了惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區基因，並在畢氏酵母中分泌表達該抗原，經分析其構象非常接近天然構象。該抗原的免疫血清能有效抑制瘧原蟲生長，且具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能等生物學特性。
本發明的主要優點在於(1)本發明的EBA-175IIF2重組蛋白，其構象非常接近天然蛋白構象，並具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能等良好的生物學特性。
(2)EBA-175IIF2重組蛋白的表達產物能分泌到胞外，並進入無蛋白培養上清，便於分離純化，純度可達95％以上。
(3)EBA-175IIF2重組蛋白的表達水平高。搖瓶表達量為20mg/L，而15L發酵表達產量可達300mg/L。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989或中國專利申請CN01105292.9)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1PfEBA-175IIF2基因的合成1.1.Pfeba-175IIf2全合成基因的設計重組EBA-175IIF2蛋白的序列來自惡性瘧原蟲3D7株175kD紅細胞結合抗原功能區EBA-175IIF2的胺基酸序列。選用畢氏酵母密碼子使用頻率，將該序列進行重新設計。採用計算機軟體「DNA Star」、Omiga等分析並排除在該基因序列中存在的可能不利於基因轉錄及翻譯的任何序列，如轉錄終止序列、內含子剪接位點序列、長的反向重複序列等。此外，在新設計的eba-175IIf2基因的5′和3′端分別增設XhoI和EcoRI酶切位點，以便能與表達載體連接。鑑定出該抗原序列中一個潛在糖基化位點，並通過將糖基化位點胺基酸Asn轉為Gln(見SEQ ID NO2)，從而排除這一個糖基化位點。
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1.2.Pfeba-175IIf2全合成基因的的合成參見圖1B。將eba-175IIf2合成基因序列分成12條寡核苷酸鏈，從5′到3′依次命為eba-175IIf2-1至eba-175IIf2-12，相鄰兩個寡核苷酸鏈之間有約16至20鹼基的重疊部分。採用基因軟體Oligo 4.0分析相鄰寡核苷酸鏈間重疊部分序列，以排除不利於寡核苷酸鏈拼接的序列，如髮夾結構等。
用PCR方法將12條鏈拼接成雙鏈DNA分子。PCR擴增條件為95℃10秒(變性)、55℃30秒(退火)和72℃1分30秒(延伸)，每次25個循環，產生959bp全長eba-175IIf2合成基因。PCR產物用1％瓊脂糖膠分離，並用QIAGEN DNA回收試劑盒分離目的基因(圖2)。用XhoI和EcoRI雙酶切目的基因片段，酶切條件為在20μl反應體系中含有2μg目的基因片段，1×酶切緩衝液，XhoI及EcoRI酶各5單位，37℃反應1小時。酶切片段與經同樣酶切的pBluscript載體連接，並轉化感受態DH5α大腸桿菌。抽提氨卞青黴素抗性菌落的質粒DNA，經雙酶切鑑定為正確插入後進行DNA序列分析。以排除合成時的錯誤鹼基。
將含全長無錯誤的合成基因的質粒轉入大腸桿菌DH5α，經反覆接種培養後，回收該質粒並進行序列分析，結果在eba-175IIf2基因中無發現鹼基突變。表明該合成基因能穩定存在大腸桿菌中。
測序後的Pfeba-175IIf2序列如SEQ ID NO1所示。
為使Pfeba-175IIf2基因能在畢氏酵母中分泌表達，將該基因5′端進行修飾，即在該基因的5′端加上釀酒酵母α-因子信號肽前導序列的部分序列，包括信號肽切割識別胺基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密碼子序列(核苷酸序列為aaa agagag gct gaa gct)。在Pfeba-175IIf2基因的5′及3′端分別含有XhoI及EcoRI位點用於該基因克隆入表達載體。
實施例2Pfeba-175IIf2基因在畢氏酵母中分泌表達2.1表達載體的構建Pfeba-175IIf2基因通過XhoI和EcoRI位點插入到pPIC9酵母表達質粒(購於lnvitrogen公司)。這樣，PfEBA-175IIF2的N端與該載體上釀酒酵母α-因子信號肽C末端融合。由於PfEBA-175IIF2分子N端含有該信號肽切點三個特異胺基酸Glu-lys-Arg序列。故分泌表達釋放的目的蛋白不含信號肽序列。
pPIC9K載體的基本元件與pPIC9相同，但它帶有卡那黴素抗性基因，可用G418進行高拷貝插入子的篩選。這樣，用BamHI和SalI將含Pfeba-175IIf2片段切出並插入pPIC9K表達質粒(購於lnvitrogen公司)的相應位點中，構建成pPIC9K/Pfeba-175IIf2。
2.2轉化畢氏酵母SMD1168用SalI將pPIC9K/Pfeba-175IIf2質粒線性化，10μg線性化表達質粒電轉化SMD1168畢氏酵母。轉化菌先用組氨酸缺陷平板篩選His+轉化子，然後用不同濃度G418平板篩選多拷貝插入的轉化子。抽提不同轉化子的基因組DNA，用一對目的基因內部引物PCR加以鑑定，表明表達質粒插入酵母染色體。經鑑定有插入的轉化子進行以下表達研究。
2.3PfEBA-175IIF2表達轉化子先接種在以甘油為碳源的培養基中，生長24小時後，轉接到的以甲醇為碳源的培養基中。進行誘導表達。每24小時取樣、檢測表達產物上清和細胞沉澱。SDS-PAGE和考馬斯亮藍檢測結果顯示在35kD處有明顯的PfEBA-175IIF2表達條帶，該表達帶只在甲醇誘導後出現，並隨表達時間延長，其表達產物明顯增加(圖4)。用中國瘧區瘧疾病人血清進行免疫印跡法檢測表達產物，結果可見35kD目的蛋白印跡。
實施例3.
PfEBA-175IIF2發酵與純化經對表達條件的優化研究，搖瓶表達水平可達20mg/L。用15L罐進行發酵表達。在整個發酵周期中，前期的細胞呈指數生長上升，細胞密度達OD600＝100。到甘油添加生長期，細胞生長呈直線上升，細胞密度達到OD600＝560。但到了甲醇誘導表達階段，細胞總密度基本保持不變，而目的蛋白表達是在甲醇加入後3-7hr開始，並隨時間延長，表達產率迅速提高，並不斷分泌到發酵液中，最高表達量可達300mg/L。
PfEBA-175IIF2表達產物的純化分兩步進行第一步是用Ni-NTA柱純化。由於PfEBA-175IIF2C末端含有6×His序列，故表達產物可結合到Ni-NTA親和柱上，並用250mM咪唑洗脫目的蛋白。第二步是用凝膠過濾液相法純化。經兩步純化的蛋白純度可達95％(圖5)。
實施例4用PfEBA-175IIF2免疫動物在該實施例中，先用純化的PfEBA-175IIF2為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫家兔，實驗分為7組，第一組為ISA720+PfEBA-175IIF2；第二組為ISA720+PfCP-2；第三組為ISA720+PfCSP；第四組為ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2；第五組為ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2+PfCSP；第六組為ISA720+變性PfEBA-175IIF2；第七組為ISA720佐劑對照。免疫分4次進行，每次免疫分別在第0、20、40、和61天進行。每次免疫前及免疫結束後兩周左右取血測定特異抗體水平(圖7)。具體方法如下PfEBA-175IIF2抗原與ISA720佐劑按3∶7混合，用注射器抽吸乳化至均勻。PfEBA-175IIF2抗原變性處理按以下方法進行抗原溶液與固體尿素混合，使終濃度為8M，置50℃水浴60min，加入DTT使其終濃度為20mM，置50℃水浴6hr；再加入碘乙酸鈉使其終濃度為60mM，置室溫60min，畢後用0.1M pH7.5硼酸緩衝液(100mM硼酸、137mM NaCl，調pH至7.5)透析過夜。免疫劑量為每隻家兔200μg，為1ml體積。採用皮下多點注射。四次免疫注射時間分別在D0、D20、D40和D61。在首次免疫後D33和D54、D75取血測定抗體ELISA及IFA滴度ELISA按以下程序進行採用表達PfEBA-175IIF2或惡性瘧原蟲全蟲蛋白為抗原，每孔包被量為0.1μg，加入不同稀釋度的抗血清100μl，每份稀釋血清樣本重複三孔，經37℃反應1hr和洗滌後，加入酶標二抗，用TMD底物顯色，並讀取450mM OD值。用免疫前血清確定陽性閾值，大於該值的稀釋度為抗血清陽性最終滴度。
ELISA結果顯示，佐劑對照組沒有產生特異性抗體，其餘6組均產生明顯的特異性抗體(圖7)。最高抗體滴度為1∶1,389,224；而用變性的重組PfEBA-175IIF2蛋白免疫家兔抗血清的抗體滴度只有1∶3,228。
另外，在用純化的PfEBA-175IIF2為抗原，用ISA720為免疫佐劑免疫恆河猴和BALB/c小鼠亦產生明顯的特異性抗體(圖8)。最高抗體滴度為1∶41,026(恆河猴)、1∶61,435(BALB/c小鼠)。
上述結果表明，該重組蛋白在小鼠、家兔、恆河猴免疫實驗中顯示出極高免疫原性，遠高於變性的PfEBA-175IIF2蛋白。
實施例5PfEBA-175IIF2對瘧原蟲的體外抑制試驗用於本實驗的惡性瘧原蟲FCC1/HN株取自海南省。培養按國際上通用的Trager氏蠟燭缸法進行，並按以下公式計算抑制原蟲生長率(抑制率) 具體方法如下惡性瘧原蟲FCC1/HN株按Trager和Jansen氏方法進行體外培養，每天更換培養液，每四天添加紅細胞。用於抑制試驗的原蟲需經過同步處理，即在實驗前24小時，含有各期的瘧原蟲與5％山梨醇混合，置室溫30min。經此處理的原蟲主要只含環狀體時期的原蟲。再繼續培養24小時，絕大部分已發育到裂殖體。將此時的原蟲配製成2％細胞壓積和0.5％的原蟲感染率。按實驗需要加入不同量抗血清，配製成不同抗血清濃度的起始培養物。以每孔200μl將該培養物置96孔平板中，培養24hr或72小時後，製作薄血膜、吉氏染色，用顯微鏡計數原蟲率。
抗血清製備用滅菌注射器從免疫家兔心臟取血，置滅菌離心管中，待血液凝固，血凝塊逐漸縮小溢出血清後，離心回收血清，分離的血清經56℃30min滅活及過濾除菌後用於上述抑制試驗。
除去IgG抗血清的製備用蛋白A吸附法除去抗血清中的抗體。裝填一支蛋白A-Agarose層折柱，按廠家說明書對該柱進行預處理。加抗血清於柱上，收集濾過液，反覆過柱直至在SDS-PAGE考馬斯亮藍染膠上未能見到IgG條帶。同時洗脫結合在柱上的IgG。體外抑制試驗結果(圖9)ISA720佐劑與PfEBA-175IIF2抗原的免疫血清經6.7倍稀釋後能抑制85％(恆河猴血清)及82％(家兔血清)以上原蟲的生長，且這種作用是依賴於PfEBA-175IIF2正確的空間構象。
結果如下(1)用ISA720佐劑+PfEBA-175IIF2免疫的兔血清能抑制82％原蟲生長，而只用PfCSP陰性對照組無明顯抑制作用(IR0％)。(圖9)(2)用8M尿素和DTT變性PfEBA-175IIF2蛋白，再用烷化劑進行烷化處理。經此變性處理的PfEBA-175IIF2與ISA720免疫產生的抗血清完全失去抑制瘧原蟲生長作用(IR0％)。
(4)用蛋白A柱除去各兔免疫血清中IgG，並測定這種無IgG的免疫血清的抑制惡性瘧原蟲體外生長作用。結果顯示ISA720佐劑+PfEBA-175IIF2組的免疫血清，在去除IgG後失去原有的抑制作用，其抑制率從原來的82％降為0％。
以上抑制試驗結果表明(1)PfEBA-175IIF2產生的免疫血清經6.7倍(15％血清含量)稀釋後能有效抑制瘧原蟲體外生長(＞80％的抑制率)，且這種抑制作用是抗體介導的，因為去除抗體的免疫血清失去原有的抑制作用，且這種抑制作用是IgG濃度依賴的；(2)ISA720佐劑是由法國賽比克公司研製的新型佐劑，現已批准人體應用。本結果顯示，ISA720和PfEBA-175IIF2聯合免疫產生很高的抗體水平。這為PfEBA-175IIF2作為疫苗進行臨床試驗尋找到了合適的佐劑；(3)PfEBA-175IIF2的免疫保護作用是依賴於該抗原正確的構象，經變性處理的抗原不能誘導保護性抗體。這樣，有效的PfEBA-175IIF2重組疫苗需要產生具有天然構象的表達產物。
另外，重組PfEBA175-IIF2和PfCP-2.9聯合免疫後，針對兩個重組蛋白的ELISA抗體滴度不低於兩個蛋白單獨免疫的滴度針對兩個重組蛋白的抗血清和特異性IgG在體外抑制惡性瘧原蟲生長的能力並不應聯合免疫而減弱(圖7、8)。如前所述，由於瘧原蟲生活史複雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴重的抗原變異，單價疫苗很難達到100％的有效率。因此，一個有效瘧疾疫苗需有多個抗原的摻入，而本發明中涉及到的PfEBA175-IIF2與已進入I期臨床試驗的瘧疾疫苗候選抗原PfCP-2.9進行聯合免疫所獲得的良好的實驗結果，應為這種多個抗原摻入的疫苗研製模式帶來曙光。
實施例6重組PfEBA-175IIF2與紅細胞的結合反應用無血清的RPMI1640培養液在4℃對含有重組PfEBA-175IIF2蛋白的發酵培養上清進行徹底透析。透析過的發酵培養上清液在室溫下分別與人完整的紅細胞、經過神經胺酸酶或胰蛋白酶處理的人紅細胞、小鼠、大鼠、兔的紅細胞充分混勻60分鐘。再用1M NaCl將結合在紅細胞上的蛋白洗脫下來。用SDS-PAGE和Western blot的方法來驗證重組PfEBA-175IIF2與紅細胞的結合情況。
結果如圖3所示。表明重組EBA175-IIF2可以與完整的紅細胞結合卻不能與神經氨酸酶或胰蛋白酶處理的紅細胞結合。可見重組EBA175-IIF2具有與天然蛋白極其相似的唾液酸依賴的紅細胞結合功能的生物學特性。
實施例7重組PfEBA-175IIF2與瘧疾疫區病人血清的結合反應以PfEBA175-IIF2重組蛋白包被，以1∶200稀釋的瘧疾疫區病人血清為一抗，進行ELISA檢測。
結果如圖6所示。結果顯示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。這表明，自然感染瘧原蟲的人群產生的針對天然PfEBA175-IIF2的抗體能夠很好地識別PfEBA175-IIF2重組蛋白，進一步反應了PfEBA175-IIF2重組蛋白與天然蛋白在構象上很接近。
討論瘧疾目前仍然嚴重威脅著人類的健康，瘧原蟲抗藥性的產生和迅速擴散及抗殺蟲劑蚊媒的出現和蔓延，使得瘧疾的藥物防治陷入了困境，故研製有效的瘧疾疫苗以控制瘧疾流行已成為當務之急。瘧原蟲生活史複雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴重的抗原變異，這給疫苗研製帶來困難，因而瘧疾疫苗研製的難度比人們當初想像的要高得多。在瘧原蟲生活史中，只有紅內期原蟲使人致病甚至致命，因此研製有效的紅內期瘧疾疫苗可降低瘧疾的發病率和病死率，對瘧疾的防治具有重要意義；而入侵紅細胞對惡性瘧原蟲的生存又至關重要，瘧原蟲只有入侵宿主紅細胞才能生存，因此這一過程應該是瘧原蟲紅內期生活史中的關鍵環節，而瘧原蟲入侵紅細胞是個複雜的過程，大致可分為瘧原蟲與紅細胞的吸附、瘧原蟲與紅細胞結合部位的識別與重新定向、瘧原蟲對紅細胞的攻擊、入侵等幾個階段。幹擾或者阻斷這種結合就能阻斷瘧原蟲裂殖子入侵，阻斷瘧原蟲入侵紅細胞就應該能阻止紅內期原蟲的生長，應是瘧疾疫苗發展的一個重要方面。已有的實驗證據表明，瘧原蟲入侵宿主紅細胞的過程是受體和配體介導的，且涉及到多對受體配體的相互作用，因此，對不同瘧原蟲配體蛋白的研究是瘧疾疫苗研製所必需。
總而言之，瘧原蟲生活史及抗原的複雜性使宿主免疫系統對瘧原蟲的應答反應亦十分複雜，也增加了瘧疾疫苗研製的難度，因此在疫苗候選抗原的選擇上更應該從瘧原蟲生活史中的關鍵環節入手，選擇與這樣的生活史環節關係密切的瘧原蟲蛋白對瘧疾疫苗的研製具有更重要的意義。
入侵紅細胞對惡性瘧原蟲的生存至關重要，而具有紅細胞結合功能的EBA175-IIF2蛋白勢必參與惡性瘧原蟲入侵這一重要的生命活動。研究提示，該蛋白亦具有較強的免疫原性，其免疫血清可在體外抑制瘧原蟲的生長。近年發現EBA-175抗原在紅細胞前期瘧原蟲階段也表達，使得這一瘧疾疫苗候選抗原備受研究者關注。
本發明人經過廣泛而深入的研究，從DNA水平全合成惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區蛋白基因及表達該重組蛋白。結果發現，該重組蛋白可有效地引起免疫應答，且具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能等生物學特性。
另外，由於瘧原蟲生活史複雜，抗原具有種、株、期特異性，且存在嚴重的抗原變異，單價疫苗很難達到100％的有效率。因此，一個有效瘧疾疫苗需有多個抗原的摻入，而本發明中涉及到的PfEBA175-IIF2與已進入I期臨床試驗的瘧疾疫苗候選抗原PfCP-2.9進行聯合免疫所獲得的良好的實驗結果，為開發多價疫苗帶來曙光。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110中國人民解放軍第二軍醫大學120重組惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區蛋白及其製法和用途1300545011602170PatentIn version 3.12101211963212DNA213人工序列220
221misc_feature222(1)..(963)223175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2重組蛋白的編碼序列4001gaaaagagag agcatattga tttggacgat ttttctaaat tcggttgtga caagaactcc 60gttgatacta atacgaaagt ctgggaatgc aagaaaccat acaagttgtc taccaaagac 120gtttgtgtcc ctccaagacg tcaagaattg tgtcttggca acattgatag aatctacgac 180aagaacttgc tgatgattaa agagcacatc ttggctattg ccatctatga atctaggatt 240cttaagcgta aatacaagaa caaagatgac aaggaggttt gtaaaatcat tcaaaagact 300tttgctgata tcagagacat tatcggtgga acagattact ggaacgactt gtctaatcgt 360aaactggttg gtaagattaa cactaattcc aactacgtcc atagaaataa acaaaacgat 20aagttgttta gggacgaatg gtggaaagtt attaagaaag atgtctggaa cgttatctct 80tgggtgttca aggacaaaac tgtttgtaag gaggatgaca ttgaaaacat cccacaattt 540ttcagatggt tttccgagtg gggtgatgac tactgtcagg ataaaactaa gatgattgaa 600accttgaaag ttgagtgcaa ggaaaaacca tgtgaggacg ataactgcaa gagaaaatgt 660aattcttaca aggaatggat ttccaaaaag aaagaggaat ataacaagca agcaaaacag 720taccaagagt atcagaaggg taataactac aaaatgtatt ctgaatttaa gtcaattaaa 780ccagaggttt acttgaagaa atattctgaa aagtgttcca atcttaactt cgaggatgaa 840tttaaggagg aattgcattc tgactacaag aacaaatgta ctatgtgccc agaggttaag 900gatgtcccta tttcaatcat tagaaataac gaacaaacat ctcaccatca ccatcaccat 960taa 9632102211320212PRT213人工序列220
221misc_feature222(1)..(320)223175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2重組蛋白4002Glu Lys Arg Glu His Ile Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Phe Gly Cys1 5 10 15Asp Lys Asn Ser Val Asp Thr Asn Thr Lys Val Trp Glu Cys Lys Lys20 25 30Pro Tyr Lys Leu Ser Thr Lys Asp Val Cys Val Pro Pro Arg Arg Gln35 40 45Glu Leu Cys Leu Gly Asn Ile Asp Arg Ile Tyr Asp Lys Asn Leu Leu50 55 60Met Ile Lys Glu His Ile Leu Ala Ile Ala Ile Tyr Glu Ser Arg Ile65 70 75 80Leu Lys Arg Lys Tyr Lys Asn Lys Asp Asp Lys Glu Val Cys Lys Ile85 90 95Ile Gln Lys Thr Phe Ala Asp Ile Arg Asp Ile Ile Gly Gly Thr Asp100 105 110Tyr Trp Asn Asp Leu Ser Asn Arg Lys Leu Val Gly Lys Ile Asn Thr115120 125Asn Ser Asn Tyr Val His Arg Asn Lys Gln Asn Asp Lys Leu Phe Arg130135 140Asp Glu Trp Trp Lys Val Ile Lys Lys Asp Val Trp Asn Val Ile Ser145 150155 160Trp Val Phe Lys Asp Lys Thr Val Cys Lys Glu Asp Asp Ile Glu Asn165170 175Ile Pro Gln Phe Phe Arg Trp Phe Ser Glu Trp Gly Asp Asp Tyr Cys180185 190Gln Asp Lys Thr Lys Met Ile Glu Thr Leu Lys Val Glu Cys Lys Glu195200 205Lys Pro Cys Glu Asp Asp Asn Cys Lys Arg Lys Cys Asn Ser Tyr Lys210215 220Glu Trp Ile Ser Lys Lys Lys Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ala Lys Gln225230 235 240Tyr Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Asn Asn Tyr Lys Met Tyr Ser Glu Phe245250 255Lys Ser Ile Lys Pro Glu Val Tyr Leu Lys Lys Tyr Ser Glu Lys Cys260265 270Ser Asn Leu Asn Phe Glu Asp Glu Phe Lys Glu Glu Leu His Ser Asp275280 285Tyr Lys Asn Lys Cys Thr Met Cys Pro Glu Val Lys Asp Val Pro Ile290295 300Ser Ile Ile Arg Asn Asn Glu Gln Thr Ser His His His His His His305310 315 320
權利要求
1.一種重組蛋白，其特徵在於，它包含惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區IIF2的胺基酸序列，並且具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能。
2.如權利要求1所述的重組蛋白，其特徵在於，所述的重組蛋白具有SEQ IDNO2中1-314位或1-320位所示的胺基酸序列。
3.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的重組蛋白。
4.如權利要求3所述的DNA分子，其特徵在於，它具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
5.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求3所述的DNA分子。
6.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求5所述的載體。
7.一種產生權利要求1所述的重組蛋白的方法，其特徵在於，包括步驟在適合表達所述重組蛋白的條件下，培養權利要求6所述的宿主細胞，從而表達出所述的重組蛋白；分離所述的重組蛋白。
9.一種組合物，其特徵在於，它含有權利要求1所述的重組蛋白或權利要求3所述的DNA分子和藥學上可接受的載體。
10.如權利要求9所述的組合物，其特徵在於，所述的組合物是疫苗組合物。
全文摘要
本發明提供了一種惡性瘧原蟲175kD紅細胞結合抗原功能區的重組蛋白(PfEBA175－IIF2)，編碼該重組蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該重組蛋白的方法，以及該重組蛋白在製備抗瘧疾疫苗、瘧原蟲入侵機制基礎研究方面的應用。本發明的PfEBA175－IIF2重組蛋白具有優異的免疫原性和良好的生物學特性，可在免疫個體中引發有效的抗瘧原蟲的免疫應答，且具有唾液酸依賴的紅細胞結合功能。
文檔編號C12N15/30GK1887907SQ20051002723
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月29日 優先權日2005年6月29日
發明者潘衛慶, 張冬梅 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學