一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法
2023-10-23 23:49:57 2
專利名稱：一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種苦蕎麥組培苗的快速繁殖方法，特別是涉及一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法。
背景技術：
蕎麥是一種藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由於苦蕎其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質，因而被譽為「降血糖、降血壓、降血脂」的三降食品。 隨著其營養價值和藥用價值的不斷發現，苦蕎麥植物資源越來越受到人們的青睞。由於苦蕎麥植物自花授粉的特點使其在生產育種上人工雜交難以成功，因此目前苦蕎麥在育種方面仍未獲得重大突破。
組織培養可在一定程度上解決苦養麥在育種上所遇到的一些問題。目前已有利用蕎麥的胚軸、子葉、原生質體為外植體的植株再生研究，但採用以苦蕎麥葉柄為外植體進行的植株再生研究還未見有任何的報導。
目前以蕎麥葉柄為外植體的組織培養研究只進行到愈傷組織階段，如於寒松等人的論文《利用懸浮細胞培養方法提高蕎麥中總黃酮含量的研究》和王愛國等人的論文《普通蕎麥愈傷組織誘導及其分化的正交設計試驗研究》。在王愛國等人的論文研究中，還檢測了蕎麥植物葉柄以及由蕎麥葉柄形成的愈傷組織中各自含有的總黃酮含量，結果發現蕎麥葉柄中的總黃酮含量為18. 97mg/g(高於蕎麥的其它部位)，而由蕎麥葉柄形成的愈傷組織中的總黃酮含量為58. 80mg/g，總黃酮含量共增加了 2. 1倍。
綜上所述，苦蕎麥植物由於人工雜交難以成功，因此不易選育出優良品種。而以蕎麥的胚軸、子葉、原生質體為外植體進行植株再生研究，雖然可解決苦養麥在育種上的一些問題，但由於胚軸、子葉、原生質體為幼嫩體，其總黃酮含量及其它次生代謝物含量均低於葉柄，因此用胚軸、子葉、原生質體培養出的再生植株的品種不及用葉柄培養出的再生植株的品種優良。發明內容
本發明的目的在於一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，該方法可實現苦蕎麥植物優良品種的選育和快速繁殖。
為達到上述目的，本發明採用的解決方案由如下步驟構成
(1)外植體的處理選取生長健康和無病蟲害的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄用濃度為0. 的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次；
(2)愈傷組織誘導將消毒後的葉柄外植體上的水分吸乾，再切成0. 7cm 1. 5cm 的長度，然後接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中進行培養；
(3)芽分化培養選取質地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0. 5 1. Ocm2的塊狀後，接入芽分化培養基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L中進行培養；
(4)生根培養當不定芽長至2.0 4. Ocm時，將其切下轉接到生根培養基MS+IBA 0 2. Omg/L上進行生根培養；
(5)煉苗和移栽當組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內煉苗2 4天， 再將組培苗從培養瓶中取出，洗去不定根上的培養基，將其移栽至鬆軟的土壤中生長；
上述所有培養基的pH值為5. 5 6. 7、蔗糖15 50g .L-1、瓊脂6. O 7. Og .L—1 ；
上述光照培養條件均為每天光照8 16小時、光照強度為1500 25001x、培養溫度 20 27°C。
上述步驟(1)中苦蕎葉應在晴天選取且葉齡為3 40天。
上述步驟O)中消毒後的葉柄外植體在切成0. 7cm 1. 5cm的長度前，應先切去葉柄兩端少量的游離末端，使切口保持新鮮。
上述步驟( 中葉柄外植體接入培養基的方式為正接(形態學下端插入培養基)、 反接(形態學上端插入培養基)或平放(不插入培養基即平放在培養基表面)。
上述步驟(5)中將組培苗移栽至鬆軟的土壤中生長時應適當遮光，溫度保持在 20 27°C，相對溼度在70 80%。
本發明以苦養麥葉柄為外植體，通過愈傷組織誘導、芽分化培養、生根培養和移栽，可快速繁殖品種優良的苦蕎麥再生植株，為苦蕎麥植物優良品種的選育和快速繁殖提供了一條新途徑。另外本發明所用葉柄來源豐富，取材容易，可充分利用資源。
具體實施方式
實施例1
(1)外植體的處理選取生長健康、無病蟲害、葉齡在15天左右的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄放在超淨工作檯上用濃度為0. 的升汞消毒4分鐘，再用無菌水清洗4 次；
(2)愈傷組織誘導將消毒後的葉柄外植體上的水分吸乾，並切去其兩端少量的游離末端，再沿45°方向將葉柄斜切成Icm的長度，然後採用正接(形態學下端插入培養基)的接種方式，將其接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 0. 5mg/L+2,4-D 4mg/L+IAA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6. 8g/L中進行培養，葉柄在接入培養基後第3天開始出現膨大， 並在隨後的培養過程中，可觀察到葉柄膨大處開始長出質地較緊密的愈傷組織，在培養20 天后統計其愈傷組織誘導率為100% ；
(3)芽分化培養選取質地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0. Scm2的塊狀後，接入芽分化培養基MS+6-BA 2. Omg/L+NAAO. lmg/L+KT lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6. 8g/L中進行培養，在培養30天後統計其不定芽誘導率為34. 45% ；
(4)生根培養當不定芽長至3. Ocm左右時，將其切下轉接到生根培養基MS+IBA 0. 5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6. 8g/L上進行生根培養，在培養20天後統計其生根率為 85. 0% ；
(5)煉苗和移栽當組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內煉苗3天，再將組培苗從培養瓶中取出，洗去不定根上的培養基，將其移栽至鬆軟的土壤中，適當遮光，溫度保持在左右，相對溼度在75%左右；組培苗生長健壯，成活率在90%以上；
上述所有培養基的pH值為5. 5 6. 7，光照培養條件均為每天光照8 16小時、 光照強度為1500 25001x、培養溫度20 27°C。
實施例2
將實施例1步驟中產生的不定芽切下後，轉接到不加激素的MS培養基中，其它步驟同實施例1，在培養20天後統計其生根率為71. 4%;但產生的不定根數目較少、且根細長和根毛不發達；並在後期的組培苗移栽過程中，成活率較低，為68. 8%。
實施例3
將實施例1步驟( 中葉柄接入愈傷組織誘導培養基中的接種方式改為平放(不插入培養基、平放在培養基表面)，其它步驟同實施例1 ；儘管葉柄在培養20後統計其愈傷組織誘導率也為100%，但愈傷組織生長的速度慢、產生的數量也少，僅為採用正接方式產生愈傷組織量的1/5。
權利要求
1.一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特徵在於包括如下步驟(1)外植體的處理選取生長健康和無病蟲害的苦蕎葉，切去葉片部分，將葉柄用濃度為0. 1 %的升汞消毒2 6分鐘，再用無菌水清洗3 4次；(2)愈傷組織誘導將消毒後的葉柄外植體上的水分吸乾，再切成0.7cm 1.5cm的長度，然後接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 0. 1 2. 0mg/L+2,4-D 1 6mg/L+IAA 0 lmg/L中進行培養；(3)芽分化培養選取質地較緊密、生長狀況良好的愈傷組織，將其切成0.5 1. Ocm2 的塊狀後，接入芽分化培養基MS+6-BA 1. 0 4. 0mg/L+NAA0. 1 lmg/L+KT 0 1. 5mg/L 中進行培養；(4)生根培養當不定芽長至2.0 4.Ocm時，將其切下轉接到生根培養基MS+IBA 0 2. Omg/L上進行生根培養；(5)煉苗和移栽當組培苗不定根生長健壯時，打開瓶蓋，先在室內煉苗2 4天，再將組培苗從培養瓶中取出，洗去不定根上的培養基，將其移栽至鬆軟的土壤中生長；上述所有培養基的pH值為5. 5 6. 7、蔗糖15 50g · L-1、瓊脂6. 0 7. Og · L-1 ；上述光照培養條件均為每天光照8 16小時、光照強度為1500 25001x、培養溫度 20 27°C。
2.根據權利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特徵在於步驟(1)中苦蕎葉應在晴天選取且葉齡為3 40天。
3.根據權利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特徵在於步驟(2)中消毒後的葉柄外植體在切成0. 7cm 1. 5cm的長度前，應 先切去葉柄兩端少量的游離末端，使切口保持新鮮。
4.根據權利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特徵在於步驟O)中葉柄外植體接入培養基的方式為正接、反接或平放。
5.根據權利要求1所述的一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，其特徵在於步驟(5)中將組培苗移栽至鬆軟的土壤中生長時應適當遮光，溫度保持在20 27°C， 相對溼度在70 80%。
全文摘要
本發明公開了一種以苦蕎麥葉柄為外植體的植株快速繁殖方法，該方法包括如下步驟外植體的處理→愈傷組織誘導→芽分化培養→生根培養→煉苗和移栽。本發明以苦蕎麥次生代謝物總黃酮含量高的葉柄為外植體可快速繁殖品種優良的苦蕎麥再生植株，為苦蕎麥植物優良品種的選育和快速繁殖提供一條新途徑。
文檔編號A01H4/00GK102499080SQ20111032441
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月23日 優先權日2011年10月23日
發明者孫雁霞, 宋超, 彭鐮心, 段有麗, 王躍華, 胡一冰, 趙鋼, 鄔曉勇, 鄒亮, 陳麗 申請人:成都大學