幹擾素在治療腫瘤中的用途及相關的產品和方法

2023-10-08 00:17:54 3

幹擾素在治療腫瘤中的用途及相關的產品和方法
【專利摘要】本發明涉及幹擾素在治療腫瘤中的用途及相關的產品和方法。特別地，本發明涉及腫瘤治療領域，尤其是克服腫瘤對抗體療法的抗性。具體而言，本發明涉及通過幹擾素、特別是I型幹擾素以及其與阻斷PD-1/PDL通路的化合物的聯合使用而抑制腫瘤的生長與復發，並引起腫瘤消退的應用、相關的產品及方法。
【專利說明】幹擾素在治療腫瘤中的用途及相關的產品和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及腫瘤治療領域，特別是克服腫瘤對抗體療法的抗性。具體而言，本發明涉及通過幹擾素、例如I型幹擾素以及其與阻斷ro-Ι (程序性死亡因子，Programmeddeath-1)/PDL (程序性死亡因子配體，PD-1Ligand)通路的化合物的聯合使用而抑制腫瘤的生長與復發，並引起腫瘤消退。
【背景技術】
[0002]目前公認的觀點是，靶向致癌性受體的抗體(例如西妥昔單抗和赫塞汀)具有抗腫瘤效果，因為它們能夠阻斷生長信號誘導、使細胞周期停止和/或通過凋亡或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)來誘導細胞死亡。然而，關於抗體介導的抗腫瘤機制的大多數研究是基於來自體外培養或體內異種移植模型的人腫瘤實驗，它們沒有包括獲得性免疫應答的貢獻。最近，使用免疫活性宿主進行的研究表明，通過抗-⑶20，抗-Neu和抗-EGFR抗體療法帶來的持久抗腫瘤保護的確依賴於細胞免疫應答(Abes等人，2010; Park等人，2010; Yang等人，2013)。然而，仍未確定抗體治療是否以及如何活化T細胞應答。
[0003]目前，用於改進抗體的治療效果的大多數策略著重於增加對腫瘤細胞的細胞毒性。一種策略是將抗體與細胞毒性藥物(包括化學治療劑)相綴合而形成抗體-藥物複合體(ADC)，與單獨的抗體相比這實現了更好的抗腫瘤效果，並且與單獨的細胞毒性化學治療相比，這產生了更小的副作用(Fayad等人，2013; Hurvitz等人，2013; Krop等人，2012)。但是，ADC的長期保護效果仍然未知。也未能清楚地確定在這種治療的過程中是否也會活化非特異性T細胞，從而增加產生有害的副作用的潛在可能。
[0004]與第一代抗體相似，在長期使用ADC之後能夠產生宿主抗性。的確，雖然ADC的潛在細胞毒性效果起初引起消退，許多患者經歷了復發或產生了轉移。對於這種抗性，一種可能的解釋是抗體抗性克隆在起初的抗體處理之前或之後產生，從而分別引起原發或獲得性的抗性。
[0005]因此，亟需一種新型的抗腫瘤療法，其能夠有效地引起腫瘤的消退並且可以克服腫瘤細胞對於所述療法的抗性而最終實現對腫瘤的治癒和/或防止腫瘤的復發。

【發明內容】

[0006]抗體免疫治療通過靶向與腫瘤相關的表面標記物而用於治療癌症已有將近16年(Scott等人,2012)。祀向致癌性受體已被顯示是有效的，因為針對這些受體的抗體治療能夠在體外明顯地抑制腫瘤細胞生長並且在免疫缺陷型小鼠內的人腫瘤異種移植模型中在體內部分地抑制腫瘤生長(Hynes和Lane，2005; Li等人，2005)。抗體療法的主要治療效果起初被歸因於通過信號傳導直接殺死腫瘤細胞。然而，最近，人們認識到免疫細胞上的Fe受體(FcR)信號傳導也是很重要的，因為在小鼠模型中、在體內，當缺乏FcR信號傳導時抗體介導的抗腫瘤效果大大降低(Clynes等人，2000)，並且FcR多態性與人乳腺癌患者中的臨床結果相關(Musolino等人，2008)。這些數據提出了下述可能性:抗體療法的抗腫瘤效果也取決於由先天性細胞產生的抗體依賴性細胞毒性，以及獲得性免疫細胞依賴的免疫反應(ADCC)。[0007]雖然有上面所示的抗體介導的抗腫瘤效果，對於實現有效的針對癌症的抗體療法仍存在若干障礙。首先，許多患者在經歷了長期和昂貴的治療後仍對主要的抗體療法會產生抗性。例如，80 - 90%的結腸癌患者對西妥昔單抗(抗EGFR)有抗性(Bardelli和Siena，2010)，66 - 88%的乳腺癌患者對赫塞汀(抗-HER2)有抗性(Cobleigh等人，1999)。第二，在長期的治療之後，起初對抗體療法有響應的患者中的腫瘤細胞很可能產生出天然的或獲得性的抗體抗性克隆，這是癌症復發的主要原因。大多數的研究關注的是致癌性信號傳導的內在抗性，例如被靶向的致癌基因中的突變或與促成抗體抗性的致癌通路相關的基因中的突變。在下列腫瘤細胞中能夠發生對西妥昔單抗的原發性及獲得性抗性:含有EGFR本身、或者下遊的介導子KRAS和BRAF中的突變的腫瘤細胞，以及含有經擴增的Her2 (EGFR的二聚化伴侶)的腫瘤細胞(Bardelli和Siena, 2010;Misale等人,2012; Sharma等人，2007; Wheeler等人,2008; Yonesaka等人,2011)。為了增強通過抗體治療殺傷腫瘤細胞的效力以及降低宿主的抗性，開發了第二代基於抗體的治療，其是由與某些抗體綴合的細胞毒性藥物或者放射性物質組成的，以增強直接的殺傷(Fayad等人,2013;Hurvitz等人，2013; Krop等人，2012)。另一種改進直接細胞毒性效應的策略涉及靶向不同的表位或甚至相關的受體(Bostrom等人，2009)。目前，克服宿主中對抗體的抗性的主要策略是開發靶向腫瘤細胞中經突變的致癌基因或經突變的與致癌通路相關的基因的藥物。例如，BRAF抑制劑被用於靶向西妥昔單抗抗性腫瘤(Yoon等人，2011)。
[0008]綜上所述，對抗體的抗性是對於基於抗體的癌症療法的主要挑戰。而目前克服所述對於抗體的抗性的策略著重於改進:1)通過抗體和細胞毒性藥物綴合進行的對腫瘤細胞的直接殺傷，或者2)通過非特異性抗CD3活化進行的對腫瘤細胞的雙特異性T細胞結合子增強靶向T細胞殺傷。由於腫瘤細胞的異質性以及它們所處的環境，這些直接殺傷的策略不能靶向所有的腫瘤細胞，並且最終仍會引起抗體抗性。
[0009]為了探求更有效的策略來改進抗體免疫療法，需要鑑別關鍵性的分子，它們使抗體介導的抗腫瘤應答與所引起的獲得性免疫抗腫瘤應答相聯繫。
[0010]幹擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，其可抑制病毒複製，同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，並增強抗病毒能力。幹擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。目前通用的分類方法將幹擾素分為三型:I型有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十餘個亞型，IFN-β僅有一個亞型。I型幹擾素具有抑制病毒複製、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性、參與免疫調節、抗腫瘤等作用；II型:只有IFN-Y，且只有一種亞型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物學活性為免疫調節作用;III 型:即 IFN-λ I (IL-29)、IFN- λ 2 (IL_28a)和 IFN-λ (IL_28b)。IFN-ω屬於IFN-α家族，其結構和大小與其它IFN-α稍有差異，但抗原性有較大的不同。
[0011]最近，發現幹擾素(IFN)(例如I型幹擾素)的增加與抗癌的臨床免疫應答有利地相關(Fuertes等人，2011)。此外，幹擾素信號傳導對於在自發性腫瘤排斥和各種抗腫瘤療法的過程中引發抗腫瘤T細胞應答是至關重要的(Burnette等人,2011; Diamond等人，2011 ;Fuertes等人,2011; Stagg等人,2011)。這些數據表明幹擾素對於引發針對腫瘤細胞的抗腫瘤特異性T細胞應答是關鍵的。也報導了幹擾素在病毒感染的過程中活化記憶T細胞(Kohlmeier等人，2010)。然而，至今為止，幹擾素被謹慎地用於臨床中且效果有限(Trinchieri,2010)o的確，人們對這類細胞因子的作用理解得非常有限，因為其在不同的疾病模型中可能作為免疫活化劑或者免疫抑制劑起作用(Gonzalez-Navajas等人，2012)，並且潛在的嚴重副作用伴隨短的半衰期限制了其在腫瘤治療中的應用。
[0012]另一方面，在抗體響應性腫瘤模型中，在ADCC過程中或由應激的抗體結合腫瘤細胞釋放的免疫活化性分子能夠有效地活化抗原呈遞細胞(APC)，增強其誘導細胞毒性T細胞應答的能力。然而，這種免疫應答是弱的和瞬時的，特別是當腫瘤已建立時。在抗體抗性腫瘤模型中，需要其它的策略來再活化被免疫抑制性腫瘤微環境抑制的APC或T細胞。當前的發明人最近觀察到了將CpG與西妥昔單抗偶聯極大地增強了其治療效果，推測這是通過活化腫瘤微環境內的樹突細胞和激發隨後的獲得性免疫應答(Yang等人，2013)。這些研究表明了設計用於推動獲得性免疫的活化的方法對於基於抗體的癌症療法的長期成功是重要的、甚至可以是關鍵的。
[0013]作為對這一想法的支持，最近的臨床實驗使用了抗體來阻斷T細胞上的共抑制性信號，這包括CTLA-4，PD-1和H)-L1。B7-⑶28家族有許多能削弱T細胞應答並促進T細胞耐受的抑制性信號通路，其中近年發現的ro-1/PD-L通路由於獨特的抑制功能而引人矚目，被認為是影響自身免疫和感染性疾病慢性化的重要因素，該通路包括ro-Ι與它的兩個配體:PD_L1 和 ΗΧ2。PD-1 (programmed cell deathl),也稱 CD279,屬於免疫球蛋白超家族成員，含有兩個酪氨酸信號基序的胞質區，其一組成免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM),另一為免疫受體酪氨酸交換基序(Immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)。ITSM 募集憐酸酶 SHP-1和SHP-2，使TCR或BCR傳遞的效應信號發生去磷酸化，同時，PD-1信號降低⑶28介導的信號，抑制Akt激酶磷酸化、糖代謝及Bcl-XL的表達。I3D-1表達較為廣泛，胸腺發育階段ro-1主要表達於雙陰性細胞上，活化後的外周⑶4+、⑶8+T細胞、B細胞和單核細胞可以誘導表達，NK-T細胞上表達水平較低。
[0014]PD-1有PD-Ll和PD-L2兩種配體，PD-Ll較PD-L2的表達廣泛，而PD-L2的親和力是 PD-Ll 的 2 ~6 倍。PD-L2(也稱 B7-DC 或 CD273)在樹突狀細胞(dendritic cells, DC)、巨噬細胞和培養的骨髓源肥大細胞上可誘導表達；而I3D-Ll (也稱B7-H1或⑶274)在鼠類T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間充質幹細胞和培養的骨髓源肥大細胞組成性表達，活化後表達增強，人I3D-Ll的組成性表達水平較鼠類低。PD-Ll還表達於許多的非造血類型的細胞上，在免疫豁免部位，如眼和胎盤也有表達，PD-Ll在這些組織中可能調節自身反應性T細胞或B細胞和炎性應答。
[0015]最近的研究顯示出逆轉T細胞抑制(例如，通過阻斷ro-1/PDL)是改進治療效果的有利方式，但是令人遺憾地，這也帶來了嚴重的副作用(Brahmer等人,2012; Topalian等人，2012; Weber，2007)。並且，臨床數據顯示出，對於I3D-1阻斷的應答率在所選的患者庫中仍然是相對低的(15-25%)，並且這種應答在很大程度上取決於I3D-Ll在腫瘤組織中的表達以及起初的淋巴細胞浸潤(Topalian等人，2012)。因此，癌症免疫療法的關鍵性問題是如何進一步逆轉所述微環境中的免疫抑制以重新活化特異性的抗腫瘤T細胞應答，從而實現對基於抗體的免疫療法的更高的應答率和長期的有效性。
[0016]所以，急需新一代的基於抗體的藥物以更有效地靶向腫瘤組織和減少系統性的副作用。
[0017]本發明中表明了聯合幹擾素(例如I型幹擾素)的抗體療法(例如抗體-幹擾素β )不直接靶向腫瘤細胞，因為幹擾素受體-缺陷性小鼠中的幹擾素受體-充分性腫瘤對抗體-幹擾素β沒有響應。此外，骨髓移植(BMT)實驗顯示出，需要在源自骨髓的細胞上表達幹擾素受體，這表明其中不涉及幹擾素的抗血管生成效果。為了確定ADCC與獲得性免疫應答的相對貢獻，發明人用抗體-幹擾素β處理了免疫缺陷性Rag-1KO小鼠，並且觀察到了在缺乏獲得性免疫細胞的情況下，抗體-幹擾素β完全不能抑制腫瘤生長。雖然T細胞和樹突細胞均能夠響應於幹擾素β，發明人進一步確定了樹突細胞是必需的表達幹擾素受體的細胞，因為具有I型幹擾素受體-缺陷性樹突細胞的小鼠對於抗體-幹擾素β完全沒有響應，而具有I型幹擾素受體-缺陷性T細胞的小鼠僅顯示出略微降低的腫瘤抑制。此外，來自經抗體幹擾素β處理的小鼠的樹突細胞能夠直接活化腫瘤特異性T細胞，這表明聯合了幹擾素(如I型幹擾素)的抗體療法(例如抗體-幹擾素β )處理增加了樹突細胞抗原呈遞和T細胞活化。因 此，樹突細胞很有可能直接響應於聯合了幹擾素的抗體療法(例如抗體-幹擾素β )以增加抗原呈遞和T細胞活化，而所述抗原呈遞和T細胞活化重新激活T細胞。
[0018]在本發明中，發明人還顯示了抗體處理本身能夠誘導幹擾素(例如I型幹擾素)產生，其促成樹突細胞活化以及隨後產生抗腫瘤T細胞免疫性。這還表明了腫瘤微環境中的主要抑制性細胞類型是樹突細胞而非T細胞，因為當I型幹擾素受體在樹突細胞中選擇性缺失時，聯合了 I型幹擾素的抗體療法(例如抗體-幹擾素β融合蛋白)的治療效果就消失了。因此，除了靶向T細胞之外還靶向樹突細胞能夠進一步增加抗體療法的效力。
[0019]為了平衡免疫介導的損傷與正在進行的免疫應答，在免疫活化之後宿主免疫性通常誘導抑制性的信號傳導。在這之中，腫瘤組織中的ro-Li上調作為癌症免疫治療過程中的一種保護性機制是最值得注意的，而發明人在用聯合幹擾素(如I型幹擾素)的抗體療法進行處理之後觀察到了這個現象。的確，阻斷ro-Li/ro-1通路進一步增強了抗腫瘤效果並清除了腫瘤。這對於ro-Li/ro-1是特異性的，因為當將聯合I型幹擾素的抗體療法與阻斷來自T細胞上兩種其它的重要抑制性分子(CTLA-4或BTLA)的信號傳導的抗體相組合時，沒有觀察到協同效果。這清楚地表明了靶向由主動免疫療法特異性地誘導的抑制性通路能夠指導未來的臨床治療。
[0020]從上文中的分析可以了解到，優先靶向致癌性受體的抗體(Ab)越來越多地被用於癌症治療，但是在長期和昂貴的治療之後，腫瘤常常發展出對這些抗體的抗性。當前的發明人用幹擾素(例如I型幹擾素，如幹擾素β )來武裝抗體，作為新一代的生物製劑，其遠遠優越於第一代的抗體療法並獨立於各種抵抗機制而被用於控制對抗體療法有抗性的腫瘤。這種新的策略是通過重新活化和重新橋接被抑制的先天性和獲得性免疫而控制對抗體的抗性。從機理上來講，抗體與I型幹擾素的聯合應用主要靶向腫瘤內的樹突細胞，其通過增加腫瘤相關微環境中的交叉誘導而重新活化細胞毒性T細胞。此外，在腫瘤內阻斷由抗體與I型幹擾素的聯合應用而誘導的ro-1/PD-Ll通路的信號傳導進一步克服了阻礙治療的抗性並且完全清除了更大的已建立的腫瘤。因此，本發明建立了新一代基於抗體的免疫療法，其能夠清除對抗體有抗性的腫瘤。
[0021]因此，本發明的新一代基於免疫的抗體治療能夠通過重新激活腫瘤內的先天性和獲得性免疫細胞並產生靶向多個腫瘤突變抗原的特異性T細胞應答而克服上文提及的使用抗體療法的問題。因此，這種新的策略可能能夠清除抗體不能直接靶向的腫瘤細胞。
[0022]在另外的方面，PD-1/ro-L通路不僅在調節自身耐受中發揮重要作用，在抗微生物感染免疫中也有關鍵作用。許多引起慢性感染的微生物可能大多利用ro-1/PD-L通路削弱抗感染免疫，並促進持續感染。與急性感染或疫苗接種後產生強力的效應和記憶性CD8+T細胞不同，在慢性病毒感染時，病毒特異性CD8+T細胞的功能通常都會減弱。在慢性感染模型中，如小鼠LCMV感染或靈長類SIV感染，或HIV、HBV、HCV等病毒感染，通常可以觀察到無功能的病毒特異性⑶8+T細胞持續存在，這一現象稱作耗竭(exhaustion), T細胞耗竭代表一系列免疫缺陷。隨病毒載量的升高，病毒特異性T細胞的功能受損更加嚴重，增殖和產生IL-2的能力在早期即消失，產生效應性細胞因子和溶細胞的功能在後期消失。
[0023]與此同時，幹擾素(IFN)作為一種廣譜抗病毒劑，也被顯示能夠抑制病毒的複製；同時還可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，並增強抗病毒能力。因而，根據本發明還可以了解到，聯合使用幹擾素(例如I型幹擾素，如幹擾素β)，特別是與抗體相結合(例如融合，特別是以融合蛋白的形式存在)的幹擾素以及阻斷ro-1/PD-L通路的信號傳導的試劑(例如抗TOLi抗體)也可被用於治療微生物感染、病毒感染和/或其它的傳染性疾病。
[0024]因此，本發明的一個方面涉及幹擾素，如I型幹擾素，例如IFNP或IFNa 5用於製備藥物的用途，所 述藥物用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性。
[0025]在一個實施方案中，所述幹擾素(如I型幹擾素)與結合腫瘤相關抗原的靶向部分(例如抗體)相連(例如形成融合蛋白)，其中所述靶向部分與所述幹擾素直接相連或通過連接子相連。在一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的N端。在另一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的C端。在一個具體的實施方案中，所述幹擾素可以與兩個或兩個以上的所述靶向部分相連，從而形成多特異性(例如雙特異性)分子(如多特異性融合蛋白，如雙特異性融合蛋白)。
[0026]在所述幹擾素與所述靶向部分通過連接子相連而形成融合蛋白的情形中，所述連接子可以包含任意適當長度的胺基酸序列，例如，所述連接子可以包含1-10、1-20、1-30或更多個胺基酸(或由其組成)，例如所述連接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 或更多個胺基酸，或由所述
胺基酸組成。
[0027]在具體的實施方案中，所述靶向部分為抗體，例如抗EGFR抗體或抗Neu抗體。
[0028]在其它的具體實施方案中，所述腫瘤為惡性腫瘤，例如惡性的固體腫瘤，其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤。
[0029]在另一個方面，本發明涉及幹擾素(例如I型幹擾素，如IFN-β或IFNa 5)與阻斷PD-1/PDL信號傳導通路的化合物(例如抗體，如抗PDl或I3D-Ll的拮抗性抗體)共同用於製備藥物(例如藥物試劑盒)的用途，其中所述藥物用於治療腫瘤(例如惡性的固體腫瘤，特別是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤)，例如用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性。其中，所述幹擾素與所述阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物在所述藥物中可以不相互混合的形式彼此獨立存在，或以不影響彼此效力的方式混合存在。
[0030]在一個具體的實施方案中，上述對於抗體療法有抗性的腫瘤或攜帶所述腫瘤的宿主在下列一項或多項中有缺陷:1)幹擾素(如I型幹擾素)，例如幹擾素α 5或幹擾素β的表達和/或功能；2)幹擾素受體(如I型幹擾素受體)的表達和/或功能，特別是樹突細胞上的幹擾素受體的表達和/或功能；3)樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生的抗腫瘤細胞毒性T細胞。
[0031]其中，在具體的實施方案中，所述幹擾素(如I型幹擾素)可以與結合腫瘤相關抗原的靶向部分(例如抗體)相連(例如形成融合蛋白)，其中所述靶向部分與所述幹擾素直接相連或通過連接子相連。在一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的N端。在另一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的C端。在一個具體的實施方案中，所述幹擾素可以與兩個或兩個以上的所述靶向部分相連，從而形成多特異性(例如雙特異性)分子(如多特異性融合蛋白，如雙特異性融合蛋白)。 [0032]在所述幹擾素與所述靶向部分通過連接子相連而形成融合蛋白的情形中，所述連接子可以包含任意適當長度的胺基酸序列，例如，所述連接子可以包含1-10、1-20、1-30或更多個胺基酸(或由其組成)，例如所述連接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 或更多個胺基酸，或由所述
胺基酸組成。
[0033]在另外的方面，本發明涉及一種試劑盒，其含有:
[0034]a)幹擾素，例如I型幹擾素，如IFN β或IFN α 5 ;和
[0035]b)阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物，例如抗體，如抗I3DLl抗體。
[0036]其中在使用所述試劑盒時，所述幹擾素(例如I型幹擾素，如IFNP或IFNa 5)與所述阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物可被同時、順次(以任何順序)或分別向有需要的受試者施用。並且在所述試劑盒中，所述幹擾素(例如I型幹擾素，如IFNii或IFNa 5)與所述阻斷H)-1/PDL信號傳導通路的化合物可以彼此不互相混合的形式存在(例如各自在單獨的空間中存在)；或者以不影響彼此的效力的形式混合存在。
[0037]其中，在具體的實施方案中，所述試劑盒中的所述幹擾素(如I型幹擾素)可以與結合腫瘤相關抗原的靶向部分(例如抗體)相連(例如形成融合蛋白)，其中所述靶向部分與所述幹擾素直接相連或通過連接子相連。在一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的N端。在另一個具體的實施方案中，所述靶向部分位於所述幹擾素的C端。在一個具體的實施方案中，所述幹擾素可以與兩個或兩個以上的所述靶向部分相連，從而形成多特異性(例如雙特異性)分子(如多特異性融合蛋白，如雙特異性融合蛋白)。
[0038]在所述幹擾素與所述靶向部分通過連接子相連而形成融合蛋白的情形中，所述連接子可以包含任意適當長度的胺基酸序列，例如，所述連接子可以包含1-10、1-20、1-30或更多個胺基酸(或由其組成)，例如所述連接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 或更多個胺基酸，或由所述胺基酸組成。
[0039]在另一個具體實施方案中，所述靶向部分為抗體，例如抗EGFR抗體或抗Neu抗體。
[0040]在另外的具體實施方案中，所述腫瘤為惡性腫瘤，例如惡性的固體腫瘤，其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤。特別地，所述腫瘤可以為乳腺腫瘤或黑色素瘤。
[0041]在一個具體實施方案中，所述腫瘤或攜帶所述腫瘤的宿主在下列一項或多項中有缺陷:1)幹擾素(如I型幹擾素)，例如幹擾素α 5或幹擾素β的表達和/或功能；2)幹擾素受體(如I型幹擾素受體)的表達和/或功能，特別是樹突細胞上的所述幹擾素受體的表達和/或功能；3)樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生的抗腫瘤細胞毒性T細胞。
[0042]在另外的方面，本發明還涉及一種試劑盒，其含有:
[0043]a)如上文中所限定的幹擾素；和
[0044]b)使用說明書，其中記載了所述試劑盒用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性。
[0045]在其它的方面，本發明涉及一種治療腫瘤(例如，用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性)的方法，所述方法包括向患者施用治療有效量的如上文中所限定的幹擾素或者如上文中所限定的本發明試劑盒。
[0046]在具體的實施方案中，所述患者對於抗體療法有抗性。在其它的實施方案中，所述患者在下列一項或多項中有缺陷:幹擾素，例如I型幹擾素，如幹擾素α 5或幹擾素β的表達和/或功能；2)幹擾素受體的表達和/或功能，特別是樹突細胞上的幹擾素受體的表達和/或功能；3)樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生的抗腫瘤細胞毒性T細胞。
[0047]在另外的實施方案中，所述預防和/或治療方法還包括同時、順次(以任何順序)或分別向所述患者施用:1)如上文中所限定的幹擾素；和2)阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物，例如抗體，如抗I3DLl抗體。
[0048]在又一個方面，本發明涉及如上文所限定的幹擾素、或者本發明的試劑盒，其用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性。
[0049]在其它的方面，本發明的I型幹擾素、試劑盒或方法可被用於與抗腫瘤的抗體療法或其它抗腫瘤療法(例如化學療法、放射性療法等)聯合施用(例如同時或者以任何順序順次施用)。
[0050]此外，任選地，本發明所述的試劑和/或試劑盒中可進一步包含藥學上可接受的載體。
[0051]總之，本發明給癌症免疫治療領域帶來了若干重要的影響。首先，其建立了一種途徑來產生新一代基於抗體的治療(例如聯合I型幹擾素的抗體療法，例如抗體-幹擾素β融合蛋白)，其使得獲得性免疫應答能夠更有效地應對抗體抗性和復發。然後，增強細胞毒性T細胞應答轉而能夠殺死更多的腫瘤細胞以產生下列正反饋循環:細胞毒性T細胞介導的腫瘤細胞死亡引發內源性危險/先天信號傳導，其進一步產生針對腫瘤的先天性和獲得性免疫，並最終引起更完全的腫瘤消退。第二，本發明提供了證據表明，幹擾素(如I型幹擾素)(其將先天性和獲得性抗腫瘤免疫相聯繫)對於抗體介導的腫瘤消退而言是關鍵的因素，並因此提供了用於癌症免疫療法的重要靶標。第三，本發明揭示了樹突細胞是腫瘤中主要的耐受細胞類型，表明它們在確定免疫抑制性腫瘤微環境中起主要作用。因此，靶向樹突細胞將是用於改進癌症免疫治療的效力的另一個重要的策略。第四，本發明提出了拮抗由免疫治療誘導的獲得性抗性將使得免疫治療的治療效果最大化並最終治癒宿主的腫瘤。總之，本發明中所採用的策略對於優化靶向免疫治療而言指出了若干新的方向，其可極大地影響抗腫瘤藥物的發現和臨床癌症治療。【專利附圖】

【附圖說明】[0052]圖1.在抗體介導的腫瘤消退過程中誘導了幹擾素產生並且其對於所述腫瘤消退過程是必須的。A)向WT BALB/c小鼠(n=4/組)皮下注射了 5X IO5TUBO細胞，在第14天時施用100 μ g的抗Neu(左欄)或對照IgG。向WT B6小鼠(n=4/組)皮下注射了7X105B16-EGFR細胞，並在第14天時施用了 100 μ g的抗EGFR(右欄)或對照IgG。四天之後，將腫瘤消化並分離出腫瘤組織中的CD45+和0045_群。進行了實時PCR以檢測I型幹擾素的mRNA水平的表達。B)向WT BALB/c小鼠(n=5/組)皮下注射了 5 X 105TUB0_EGFR細胞，在第14天和21天施用了 100 μ g的抗Neu。在同一天腫瘤內施用了 200 μ g的抗I型幹擾素受體或對照Ig。每周兩次測量腫瘤的生長並進行比較。C)向WT B6小鼠(n=5/組)皮下注射了 5 X IO5Bie-EGFR細胞，在第14天和21天腫瘤內施用了 2 X IO9腺病毒-幹擾素β或對照病毒。每周兩次測量腫瘤生長並進行比較。*，與對照組相比Ρ〈0.05。顯示了三組實驗中的一組代表性實驗結果。
[0053]圖2.Ab-1FN β極大地提高了抗體的抗腫瘤效果。Α)向WT BALB/c小鼠(n=5/組)皮下注射了 5X 15TUBo-EGFR並在第14，18和22天時用25 μ g的抗EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。每周兩次測量腫瘤生長並進行比較。B)向WT Β6小鼠(η=5/組)皮下注射了 I X 106B16-EGFR並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。每周兩次測量了腫瘤生長並進行比較。C)向RaglKO小鼠(η=5/組)皮下注射3Χ106Η460細胞，並在第13天時過繼轉移2X 1060TI LN細胞。在第14，18和22天時施用了 25 yg的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。D)向Neuon7on1-Tg雌性小鼠(η=5/組)皮下注射了 I X 106Ν0Ρ23並在第14，18和22天時用25 yg的抗-Neu-幹擾素β或對照抗體進行處理。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。*，與對照組相比Ρ〈0.05。顯示了三組實驗中有代表性的一組。
[0054]圖3.抗-EGFR-幹擾素β能夠誘導抗腫瘤特異性細胞毒性T細胞應答，其促成腫瘤消退。Α)向WT和RaglKO Β6小鼠(η=5/組)皮下注射了 5Χ 105B16_EGFR_SIY細胞，並且在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。每周兩次監控腫瘤生長。B)在最後一次處理之後的第7天，收集了 dLN細胞並進行了幹擾素YELISP0T測定。C)向WT B6小鼠(n=5/組)皮下注射了 5X 105B16_EGFR_SIY並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。與抗-EGFR-幹擾素β同一天施用了 CD8-耗竭抗體(200yg/小鼠)。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。D)在最後一次處理後的第7天，收集了 dLN細胞並進行了幹擾素YELISP0T測定。*，相比於對照組P〈0.05。顯示了三組實驗中代表性的一組。
[0055]圖4.抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果要求在宿主造血細胞上表達I型幹擾素受體。Α)向WT和I型幹擾素受體IKO Β6小鼠(η=5/組)皮下注射5 X 105B16_EGFR_SIY細胞並且在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。每周兩次監控腫瘤生長。B)在最後一次處理之後的第7天時，收集dLN，脾和經腫瘤浸潤的細胞並通過CBA測定檢測了上清液中的幹擾素產生。C)在所示的骨髓嵌合體重構之後30天，向小鼠皮下注射了 5X105B16-EGFR-SIY並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照Ig進行處理。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。*，相比於對照組P<0.05o顯不了兩組代表性實驗之一。
[0056]圖5.抗-EGFR-幹擾素β恢復了樹突細胞的交叉呈遞能力。Α)向WTB6小鼠(η=5/組)皮下注射了 5Χ 105B16-EGFR-SIY並且在第14和18天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行了處理。在最後一次處理之後的第7天，收集了 dLN細胞並進行了幹擾素Y ELISP0T測定。B)向WT B6小鼠(n=5/組)皮下注射了 5X 105B16_EGFR-SIY並在第14和18天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行了處理。在第一次處理之後的第8天，通過⑶Ilc+陽性選擇純化了來自dLN的樹突細胞並用經純化的幼稚2C T細胞進行了孵育。2天後測量了幹擾素產生。C)通過流式細胞計數測量了樹突細胞活化標記物。D)在所示的骨髓嵌合物重構之後30天，向小鼠皮下注射了 5X105B16-EGFR-SIY並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照Ig進行了處理。與所述處理同一天施用了 DT或PBS。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。*，相較於對照組Ρ〈0.05。顯示了兩組實驗中有代表性的一組。
[0057]圖6.樹突細胞是直接響應於抗-EGFR-幹擾素β處理的主要細胞類型。Α)向WT和CDllc-Cre I型幹擾素受體Iflraimrai小鼠(η=5/組)皮下注射了 5X 105B16_EGFR_SIY並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行了處理。每周兩次測量腫瘤生長並進行了比較。B)向WT和⑶4-Cre I型幹擾素受體lfl°x/fl°x小鼠(n=5/組)皮下注射了 5X105B16-EGFR-SIY並在第14，18和22天時用25 μ g的抗EGFR-幹擾素β或對照抗體進行了處理。每周兩次測量腫瘤生長並進行了比較。*，相較於對照組Ρ〈0.05。顯示了兩組實驗中有代表性的一組。
[0058]圖7.拮抗由抗-EGFR-幹擾素β誘導的TO-Ll表達實現了腫瘤完全消退的結果。Α)向WT Β6小鼠皮下注射了 5X105B16-EGFR-SIY細胞並在第14天時用25yg的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行處理。兩天之後，收集腫瘤細胞並通過流式細胞計數來分析H)-L1表達。紅線表示經對照Ig處理的組，而藍線表示經抗-EGFR-幹擾素β處理的組。B)B16-EGFR細胞，在體外細胞培養過程中用0.02yg/ml的抗-EGFR-幹擾素β進行了處理。一天之後，收集了腫瘤細胞並通過流式細胞計數對ro-Li表達進行了分析。紅線表示經對照Ig刺激的細胞，而藍線表示經抗-EGFR-幹擾素β刺激的細胞。C)向WT Β6小鼠(η=5/組)皮下注射了 5X105B16-EGFR-SIY細胞，並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β或對照抗體進行了處理。與抗-EGFR-幹擾素β同一天施用了 TO-Ll阻斷性抗體(400 μ g/小鼠)。每周兩次測量腫瘤生長並進行了比較。D)在最後一次處理後的第14天，收集脾細胞並進行了幹擾素YELISP0T測定。*，相比於對照組P〈0.05。顯示了三組實驗中代表性的一組。
[0059]圖8.提出的I型幹擾素如何將先天性和獲得性抗腫瘤免疫相聯繫的模型。在抗體療法之後，從抗體響應性腫瘤而非抗體抗性腫瘤釋放的DAMP將誘導I型幹擾素產生。Ab-幹擾素在抗體抗性腫瘤中原位模擬I型幹擾素產生。I型幹擾素同時增加樹突細胞交叉呈遞，以產生更好的細胞毒性T細胞應答，其直接激活τ細胞並且還誘導ro-Li表達以削弱抗腫瘤免疫性。Ab-幹擾素與ro-Ll阻斷相結合使得抗腫瘤免疫應答最大化。
[0060]圖9.抗-EGFR-1FNP 能夠將 IFNP 遞送至 EGFR+細胞。A)抗-EGFR-1FN^ 融合蛋白的結構。B)用hlg，抗-EGFR或抗-EGFR-1FNP及抗-人IgG ?(^^^對麼431細胞進行染色。C)用5xl05B16-EGFR細胞皮下注射WT B6小鼠(n=5/組)並在第14天用25 μ g的抗-EGFR-1FNP進行處理。在不同的時間點，通過hlg ELISA測量不同組織中抗-EGFR-1FNii的濃度。顯示了三組代表性實驗中的一組。
[0061]圖10.抗-EGFR-1FNii的副作用。用不同劑量的抗-EGFR-1FNβ靜脈內注射Β6小鼠。在所示的時間點，通過BD CBA試劑盒測量血清中所示細胞因子的濃度。
[0062]圖11.對於抗-EGFR-1FNP誘導的腫瘤消退，不需要CD20+，NKl.1+和Ly_6G+細胞。用5x105B16-EGFR皮下注射WT B6小鼠(n=5/組)並在第14，18和22天時用25 μ g的抗-EGFR-1FNii或對照Ab進行處理。與抗-EGFR-1FNii同一天施用了所示的刪除特定細胞群的Ab (200 μ g/小鼠)。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。
[0063]圖12.通過抗-EGFR-1FN^在體外直接活化DC和T細胞。在體外培養了來自WTB6小鼠的脾細胞並用所示濃度的抗-EGFR-1FNii進行了處理。一天之後，收集了細胞用於通過流式細胞計數分析T細胞上⑶69和樹突細胞上⑶86的表達。[0064]圖13.抗-EGFR-1FNii與抗-CTLA4和抗-BTLA之間沒有協同性抗腫瘤效果。用5xl05B16-EGFR細胞皮下注射WT B6小鼠(n=5/組)並在第14、18和22天用25 μ g的抗-EGFR-1FNP或對照抗體進行處理。與抗-EGFR-1FNP同一天施用CTLA4或BTLA阻斷性抗體(400 μ g/小鼠)。每周兩次測量了腫瘤生長並進行了比較。
[0065]圖14.本發明實施例中對聯合幹擾素的抗體療法有響應的腫瘤模型的總結。
具體實施方案
[0066]術語及定義
[0067]除非特別說明，本申請中所使用的術語和定義均是本領域中慣常使用的含義並且為本領域技術人員所知曉。
[0068]如本申請中所使用的，術語「腫瘤位點」是指含有或被懷疑含有腫瘤細胞的體內或離體位置。所述腫瘤位點包括固體腫瘤以及接近或鄰近腫瘤生長處的位置。
[0069]如本申請中所使用的，術語「施用」是指全身性和/或局部施用。術語「全身性施用」是指非局部地施用，從而所施用的物質可能影響整個身體中的若干器官或組織；或者從而所施用的物質可能穿越整個身體中的數個器官或組織而到達靶位點。例如，向受試者的循環系統施用可引起治療性產物在多於一個組織或器官中從所施用的載體表達，或者可引起治療性產物在特異性位點處由所施用的載體表達，例如，這是由於天然的趨向性或由於與組織特異性啟動子元件的可操作連接。本領域技術人員將理解，所述全身性施用涵蓋各種形式的施用，這包括但不限於:腸胃外施用、靜脈內施用、肌內施用、皮下施用、經皮施用、口服等。
[0070]術語「局部施用」是指在特異性位點處或其周圍施用。本領域技術人員將理解，局部施用涵蓋各種形式的施用，例如直接注射到特定位點處或注射到其周圍(例如腫瘤內施用)。
[0071]如本文中所使用的，術語「治療有效量」是指達到治療目的疾病或病況(例如腫瘤/癌症，例如用於使腫瘤消退或減小腫瘤的大小)所需的本發明的幹擾素，或者本發明試劑盒中組分的量。可以通過實踐、按照常規的方式來關於特定的目的而確定所述有效量。特別地，所述治療有效量可以是達到下述目的所需的量:減少癌細胞的數目；減少腫瘤大小；抑制(即減緩或停止)癌細胞浸潤到外周器官中；抑制(即減緩或停止)腫瘤轉移；抑制腫瘤生長；和/或緩解與癌症相關的一種或多種症狀。
[0072]術語「抗體」涵蓋例如，單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段(其顯示出所需的生物學或免疫學活性)。在本申請中，術語「免疫球蛋白」(Ig)與抗體可互換地使用。所述抗體可特異性地靶向腫瘤抗原，例如表面腫瘤抗原，例如EGFR，CD4，CD8、Neu等。
[0073]術語「幹擾素」包括完整的幹擾素分子(例如人幹擾素、小鼠幹擾素，例如人或小鼠I型幹擾素，如幹擾素α或β )、其功能性片段、衍生物、等同物或任何功能性變體，其能夠實現所需的生物學功能，例如誘導腫瘤特異性T細胞的擴增、特別是樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生抗腫瘤細胞毒性T細胞。在本發明的情境中，所述幹擾素可選自I型、II型和 / 或 III 型幹擾素，例如 IFN-a , IFN- β、IFN-Y、IFN-λ I (IL-29)、IFN-λ 2 (IL_28a)、IFN- λ (IL-28b )和 IFN- ω 等。
[0074]術語「功能性變體」是指，經過修飾(例如突變、插入、刪除。融合、綴合、交聯等)而與親本分子(例如幹擾素) 不同，但是保留了所需的其生物學活性的變體。
[0075]可通過本領域已知的各種常規的方法來使幹擾素、其片段或其功能性變體與所述靶向部分向連接。所述連接可以是直接或間接的(例如通過連接子)，例如，可以通過形成融合蛋白、綴合或化學連接而實現。當所述連接形成融合蛋白時，其可通過例如重組技術或肽合成技術而實現。在某些實施方案中，所述融合蛋白也可包含連接子，所述連接子不破壞所形成的產物的目的特性(例如誘導抗腫瘤細胞毒性T細胞的產生)。例如，所述靶向部分可位於所述幹擾素的N端或C端。在一個具體的實施方案中，所述幹擾素可以與兩個或兩個以上的所述靶向部分相連，從而形成多特異性(例如雙特異性)分子(如多特異性融合蛋白，如雙特異性融合蛋白)。在所述幹擾素與所述靶向部分通過連接子相連而形成融合蛋白的情形中，所述連接子可以包含任意適當長度的胺基酸序列，例如，所述連接子可以包含ι-?ο、1-20,1-30或更多個胺基酸(或由其組成)，例如所述連接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31 或更多個胺基酸，或由所述胺基酸組成
[0076]本領域技術人員能夠根據具體的病況、疾病類型(例如腫瘤類型、腫瘤的發展階段等)、嚴重程度、患者體質、可能聯合施用的其它療法、之前曾施用過的療法等而選擇適當的劑型和施用方式。
[0077]術語「癌症」是指通常被表徵為不受調節的細胞生長的病況(例如在哺乳動物、例如人中)。所述癌症包括但不限於，例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤等。
[0078]術語「抗體療法」是指通過使用特異性靶向目的組織或位點的抗體來進行治療的方法。在本發明的情境中，其特別是指用靶向腫瘤細胞的特異性抗體來治療腫瘤(例如癌症)的方法。
[0079]在本發明的情境中，「對抗體療法的抗性」是指，在使用特定的抗體製劑進行治療後，腫瘤(例如癌症)或攜帶所述腫瘤的患者對於所述治療沒有響應(例如，腫瘤細胞沒有被殺死、腫瘤沒有消退)，和/或所述療法不能引起所述腫瘤的消退、減少或抑制腫瘤的轉移或
進一步生長。
[0080]在本申請中，術語「腫瘤相關抗原」包括例如腫瘤表面抗原，這包括但不限於例如表皮生長因子受體家族(EGFR)的成員，這包括EGFR，HERl，HER2，HER4和HER8等(Nam, N.Η., &Parang, Κ.(2003), Current targets for anti cancer dr μ g discovery.Current Dr μ g Targets,4(2),159-179), STEAP(six-transmembrane epithelialantigen of the prostate;Hubert 等人，STEAP:a prostate-specific cell-surfaceantigen highly expressed in human prostate tumors., Proc Natl Acad Sci U SA.1999;96(25):14523-8.), CD55(Hsu 等人，Generation and characterization ofmonoclonal antibodies directed against the surface antigens of cervical cancercells.，Hybrid Hybridomics.2004;23(2):121-5)。
[0081]能用於本發明的其它合適的抗體包括利妥昔單抗(RituxanTM,嵌合的抗⑶20抗體)，Campath-1H(抗CD52抗體)，和任何癌症特異性細胞表面抗原的抗體。下列示例性地列出了針對特定癌症類型的、適於與幹擾素結合而用於本發明的目的的抗體:阿侖珠單抗(Campath?)用於慢性白血病；貝伐珠單抗(Avastin?)用於結腸癌和肺癌；西妥昔單抗(Erbitux?)用於結腸癌和頭頸癌；吉妥珠單抗(Mylotarg?)用於急性髓性白血病；Ibritumomab (Zevalin?)用於非霍奇金淋巴瘤；帕木單抗(Vectibix?)用於結腸癌；利妥昔單抗(Rituxan?)用於非霍奇金淋巴瘤；託西莫單抗(Bexxar?)用於非霍奇金淋巴瘤；和曲妥珠單抗(赫塞汀?)用於乳腺癌。
[0082]在本發明中，「藥學上可接受的載體」是指不會在所施用的細胞或受試者中引發過敏反應或其他不適影響，並且不會影響藥物活性的載體。合適的可藥用載體包括但不限於，例如，一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩衝液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質的組合。藥學上可接受的載體還可進一步包括能提高核酸、多肽、病毒顆粒或細胞的保存期限或效用的微量輔助物質，例如溼潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液。
[0083]在本申請中，在幹擾素和/或其受體中「有缺陷」是指所述幹擾素或幹擾素受體的表達不能達到實現其生物學功能所需的水平，或者所表達的幹擾素或幹擾素受體不能發揮所需的生物學功能(例如以突變的形式存在)，或者幹擾素(或幹擾素受體)不能夠與其受體(配體)相互作用而引起下遊的信號傳導。
[0084]下面的實施例僅僅是為了更好地闡釋本發明，而不意在以任何方式限制本發明。
[0085]實施例
[0086]材料和方法
[0087]小鼠
[0088]C57BL/6J 和 BALB/c 小鼠購自 Harlan。Ragl+，2C CD8+TCR轉基因小鼠，CDllc-DTR轉基因小鼠，⑶Ilc-Cre和⑶4_Cre轉基因小鼠購自JAX。IFN ARl+小鼠是由芝加哥大學的Anita Chong博士提供的。IFN ARlfim小鼠是由德國漢諾瓦實驗感染研究所的UlrichKalinke博士提供的(Kamphuis, Junt等人2006)。Neu。1"17。1"11轉基因小鼠(B6背景)是由加拿大 Trev & Joyce Deeley Research Centre, British Columbia 的 Brad H.Nelson 博士提供的(Wall，Milne等人2007)。所有的小鼠都是在特定的無病原體條件下飼養的。動物護理和使用是根據研究所及NIH的方案和指導進行的，並且所有的研究都獲得了芝加哥大學動物護理和使用委員會的批准。
[0089]細胞系和試劑
[0090]H460購自ATCC。TUBO是從BALB/c Neu-轉基因小鼠中的自髮乳腺腫瘤克隆的。TUB0-EGFR是在用pSEB-EGFR進行轉染或用含有2 μ g/mL殺稻瘟菌素(InvivoGen)的質粒進行轉染後選擇的。用表達人EGFR或EGFR-SIY的慢病毒進行轉導後，挑選B16-EGFR和B16-EGFR-SIY的單克隆。N0P23是從B6Neu°T-1/OT-n轉基因小鼠中的自髮乳腺腫瘤克隆的，並且是由加拿大 Trev & Joyce Deeley Research Centre 的 Brad H.Nelson 博士提供的。在5%C02的條件下培養H460，TUBO, B16以及它們的衍生物，並將它們在體外維持在補充了 10%熱滅活的胎牛血清(Sigma), 2mmol/L L-穀氨醯胺,0.lmmol/L MEM非必需胺基酸，100單位/mL青黴素和100 μ g/mL鏈黴素的DMEM中。抗EGFR mAb西妥昔單抗購自Imclone。抗-CD8 (YTS169.4.2)，抗-NK1.1 (PK136)，抗-Neu (7.16.4)抗體是實驗室內部製造的。抗-PD-Ll (10F.9G2)和抗-Ly_6G(lA8)抗體購自 BioXcell。抗-CD20 (OT2)抗體是由 Ouyang Wenjun(Genentech, San Franscisco)提供的。抗-1 型幹擾素受體(MAR-5A3)抗體是由Robert Schreiber博士(華盛頓大學，聖路易斯)提供的。表達鼠幹擾素β的腺病毒是如之前所描述的製備的(Burnette等人，2011)。
[0091]Ab-1FN β融合蛋白的產生
[0092]從抗-EGFR(LA22)雜交瘤(ATCC)中克隆了抗EGFR的V區域。將重鏈和輕鏈的V區域分別克隆到Abvec-1gGl和Abvec-kappa中(Smith等人,2009)。然後,將小鼠幹擾素β插入重鏈的C末端作為含有SGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:1)連接子的融合蛋白。將含有幹擾素β的整個重鏈和輕鏈分別克隆到ρΕΕ6.4和pEE12.4(Lonza)中。然後用NotI和BamHI消化這兩個載體。將來自經消化的pEE6.4質粒的完整的hCMV_MIE_重鏈/SV40轉錄單元與來自經消化的pEE12.4質粒的大的Not1-BamHI片段(含有輕鍊表達盒)相連接。將含有重鏈和輕鏈二者的質粒轉染到CHO細胞中並且根據指導手冊(Lonza)建立穩定的克隆。根據指導手冊(Repligen Corporation)通過蛋白A柱純化含有抗-EGFR-幹擾素β的上清液。以相同的方式產生了抗-Neu-幹擾素β，不同之處在於V區域的cDNA來自抗-Neu (7.16.4)雜交瘤。
[0093]腫瘤生長和 處理
[0094]將大約6 X IO5TUBO, TUB0-EGFR，B16-EGFR，B16-EGFR-SIY 或 Ν0Ρ23 細胞在右側腹處皮下注射到6至8周大的小鼠中。沿著三個正交軸(a，b和c)測量了腫瘤體積並計算了腫瘤體積為abc/2。在腫瘤接種之後的第14，18和22天，通過三次腫瘤內注射25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β抗體或對照抗體來處理小鼠。對於⑶8耗竭實驗，與所述抗-EGFR-幹擾素β處理同時，腹腔內地注射200μ8的抗-⑶8抗體。將大約6X10eH460細胞在右側腹處皮下注射到6至8周大的RaglKO小鼠中。在腫瘤建立之後(約14天)，通過靜脈內注射將來自OTI TCR轉基因小鼠的2 X IO6LN細胞繼受性地轉移到小鼠中。一天後，通過三次腫瘤內注射25 μ g的抗-EGFR-幹擾素β抗體或對照抗體來處理小鼠。
[0095]抗體處理後I型幹擾素mRNA的表達
[0096]將大約6 X IO5TUBO, TUB0-EGFR或B16-EGFR細胞在右側腹皮下注射到6至8周大的小鼠中。在腫瘤接種後的第14和16天，通過兩次腫瘤內注射100 μ g的抗-Neu，抗-EGFR或對照抗體來處理小鼠。用lmg/ml的膠原酶VIII (Sigma)和200 μ g/ml的DNA酶I (Sigma)在37°C下消化腫瘤30分鐘。通過FACS AriaII (BD Bioscience)分選活的CD45+和CD45-細胞群。通過RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)分離總的RNA並通過Sensiscript RT試劑盒(Qiagen)將其反轉錄為cDNA。通過定量實時PCR分析I型幹擾素mRNA的表達水平。用於所述測定的引物如下:[0097]小鼠幹擾素α 5，5』-ATGAAGTCCATCAGCAGCTC (SEQ ID NO: 2),5' -AGGGGCTGTGTTTCTTCTCT (SEQ ID NO:3);
[0098]β -肌動蛋白，5，-ACACCCGCCACCAGTTCGC ( SEQ ID NO: 4),5』-ATGGGGTACTTCAGGGTCAGGATA (SEQ ID NO:5)。
[0099]通過ELISP0T測定來測量分泌幹擾素Y的T細胞
[0100]通過ELISP0T測定測量SIY肽反應性T細胞。將脾或淋巴結細胞重懸在補充了10%FCS，2mmol/L L-穀氨醯胺，100單位/mL青黴素，和100 μ g/mL鏈黴素的RPMI1640中。一共將1-4X IO5個脾或淋巴結細胞用於此測定。將SIY肽以5 μ g/mL的濃度加入。在48h的孵育後，根據指導手冊通過幹擾素Y ELISP0T試劑盒(BD Bioscience)或CBA測定(BDBioscience)確定了幹擾素Y的產生。用ImmunoSpot分析儀(細胞毒性T細胞)計數了所見到的細胞因子點。
[0101]離體樹突細胞交叉呈遞測定
[0102]在第14天和17天，用25 μ g的抗-EGFR、或抗-EGFR-幹擾素β腫瘤內注射來處理攜帶B16-EGFR-SIY的小鼠。四天之後，用lmg/ml的膠原酶VIII (Sigma)和200 μ g/ml DNA酶I(Sigma)在37°C下將 引流淋巴結消化15分鐘。通過⑶Ilc陽性選擇試劑盒(Stemcell)純化樹突細胞。將大約I X IO5樹突細胞與經純化的2 X 1052C T細胞混合(含有或不含5yg/mL的SIY肽)以重新刺激T細胞。兩天之後，收集了上清液，並且通過CBA測定(BD Bioscience)測量了幹擾素Y。
[0103]離體T細胞活化測定
[0104]在第14和17天時，通過用25 μ g的抗-EGFR或抗-EGFR-幹擾素β進行腫瘤內注射而處理攜帶有B16-EGFR-SIY的小鼠。四天之後，通過T細胞陰性選擇試劑盒(Stemcell)純化了 dLN T細胞。將來自幼稚小鼠的大約I X IO5經純化的樹突細胞與2 X IO5T細胞混合在一起(含有或不含5 μ g/mL的SIY肽)以再刺激T細胞。兩天之後，收集上清液並通過CBA測定(BD Bioscience)來測量幹擾素Y。
[0105]骨髓嵌合體的產生
[0106]用1000rads的單一劑量致死輻射WT小鼠。次日，將2_3xl06WT，IFN ARl+或CDllc-DTR Tg供體骨髓細胞通過靜脈內過繼轉移至所述經輻射的小鼠。重構後，將小鼠保持在複方磺胺甲惡唑(Bactrim)抗生素中(在飲用水中稀釋的)4周。在重構之後的5_6周，用腫瘤細胞注射小鼠。
[0107]檢測mAb和融合蛋白製備物中的內毒素
[0108]通過鱟變形細胞溶解物測定(Cambrex inc.MD)測量了內毒素。對於所有的mAb製備物，測定了內毒素的量為〈0.2E.U./mg mAb。
[0109]流式細胞計數分析
[0110]用抗CD16/32 (抗-Fe Y III/II受體，克隆2.4G2)孵育單細胞懸浮液10分鐘，然後用綴合的抗體進行染色。所有經突光標記的單克隆抗體均購自Biolegend或eBioscience。在FACSC自動流式細胞計數儀(BD Biosciences)上對樣品進行分析，並且用Flowjo軟體(TreeStar, Inc.)分析了數據。
[0111]統計學分析
[0112]使用未配對Student雙尾t測試比較了平均值。誤差條表示SD。統計學上顯著的差異ρ〈0.05和ρ〈0.01分別被標註以*和**。
[0113]實施例1
[0114]需要I型幹擾素用於體內針對抗體療法的有效腫瘤應答
[0115]已顯現出I型幹擾素作為潛在的關鍵性危險信號在自發性腫瘤排斥和各種抗腫瘤療法中引發抗腫瘤的T細胞應答當前的發明人假設了抗致癌性受體抗體在腫瘤組織中誘導I型幹擾素的產生，而橋接先天性和獲得性免疫。為了測試在本文所述的模型中，腫瘤對抗致癌性受體抗體的敏感性是否與處理後I型幹擾素的水平相關，發明人首先製備了兩個不同的腫瘤細胞系，即抗體響應性細胞系和抗體抗性細胞系。TUBO乳腺腫瘤細胞源自Her2/neu Tg小鼠，其中Neu是細胞生長的主要信號，而TUBO細胞被用作抗-neu抗體響應性腫瘤細胞系。經EGFR轉染的B16黑色素瘤細胞系(其中EGFR不能夠遞送生長信號)被用作完全抵抗抗EGFR處理的腫瘤細胞系。發明人用相應的抗體處理了攜帶這些腫瘤的小鼠並且評估了處理後腫瘤內I型幹擾素的產生。發明人發現了幹擾素α5和幹擾素β的產生在抗體響應性腫瘤模型中增加了，但是在抗體抗性腫瘤模型中沒有增加(圖1A以及未顯示的數據)，這表明增加的I型幹擾素的產生是由抗體誘導的致癌性受體阻斷和應激作用引起的。為了測試體內由抗體介導的抗腫瘤效果是否需要I型幹擾素，發明人在抗體響應性TUBO腫瘤小鼠模型中、在抗Neu處理的過程中用抗-1型幹擾素受體阻斷抗體處理了小鼠。發明人發現了，阻斷I型幹擾素信號傳導損害了抗Neu抗體的治療效果(圖1Β)，這表明I型幹擾素對於抗體介導的腫瘤消退而言的確是關鍵性的細胞因子。因此，這提出了下述可能性:受損的I型幹擾素可能限制帶有抗體抗性腫瘤的宿主中的免疫應答。為了進一步測試將其它的I型幹擾素直接遞送到腫瘤中是否足以控制腫瘤生長(甚至在抗體抗性腫瘤中)，用編碼幹擾素β的腺病毒(腺病毒-幹擾素β )處理了兩組攜帶腫瘤的小鼠。如圖1C中所示，Ad-幹擾素β處理本身就足以控制抗體抗性腫瘤和抗體響應性腫瘤的生長(數據未顯示)。綜上所述，這些數據表明，將I型幹擾素靶向到腫瘤中可能足以克服腫瘤免疫迴避。
[0116]實施例2
[0117]幹擾素β的靶向遞送增強抗體介導的治療效果
[0118]實施例1中的數據表明將I型幹擾素靶向到腫瘤中具有潛在的免疫治療效果，特別是可用於克服腫瘤對於抗體療法的抗性。為了進一步驗證此結論並進一步提高治療效果，當前的發明人製備了抗-EGFR-幹擾素β (Ab-1FNii)融合蛋白以靶向地將幹擾素β直接遞送到表達EGFR的腫瘤組織中(圖9Α)。當前的發明人首先檢查了此融合蛋白中抗-EGFR和幹擾素β的抗腫瘤功能是否仍保持完好。發明人發現，所述融合蛋白能夠結合EGFR+細胞(圖9Β) 並且能夠激活I型幹擾素受體信號通路(數據未顯示)，因此可知，融合蛋白中抗-EGFR和幹擾素β的抗腫瘤功能都得到了很好的保持。發明人然後檢測了抗-EGFR-幹擾素β是否能夠在體內特異性地將幹擾素β遞送到EGFR+腫瘤位點。結果證實了，在起初注射之後，抗-EGFR-幹擾素β的濃度在幾乎整整一周中在腫瘤組織中都保持較高水平(圖9C)，而其在起初注射後不到一周的時間中就在其它組織中顯著地降低。此外，發明人通過測量血清細胞因子、ALT和AST水平而檢測了抗-EGFR-幹擾素β的副作用。在發明人所檢測的細胞因子中包括TNF，IL-12，幹擾素Y，MCP-1，IL-6和IL-10，在注射後6小時和一天時幹擾素Y和MCP-1的表達水平略有增加(圖10)。發明人還觀察到了在經過上面所述的處理之後，ALT和AST的水平沒有增加(數據未顯示)。[0119]為了比較新一代抗-EGFR-幹擾素β融合蛋白與第一代抗-EGFR抗體(西妥昔單抗)之間的抗腫瘤治療效果，發明人用每一種試劑治療了攜帶已建立的EFGR+腫瘤的宿主。令人驚訝地，發明人觀察到在有部分抗性的腫瘤模型中，與單獨使用抗-EGFR抗體相比，抗-EGFR-幹擾素β在更低的劑量和更短的持續時間中有有效得多的治療效果(圖2Α)。在乳腺內脂肪部分腫瘤注射模型中類似地觀察到了提高的抗腫瘤效果(數據未顯示)。為了進一步測試Ab-1FNP是否能夠在具有完全抗性的腫瘤模型中控制腫瘤生長，發明人測試了抗-EGFR-幹擾素β在B16-EGFR模型中的效力。如所預測的，單獨的抗-EGFR處理不能夠在體內抑制B16-EGFR腫瘤生長，而抗-EGFR-幹擾素β處理再次能夠有力地控制腫瘤生長(圖2Β)。已報導了 KRAS突變是促成臨床中抗-EGFR抗性的關鍵因子為了測試抗-EGFR-幹擾素β在KRAS突變誘導的抗體抗性腫瘤模型中是否是有效的，發明人在之前構建的獲得性免疫重構Rag-1KO小鼠中用抗-EGFR-幹擾素β處理了 KRAS突變的Η460人腫瘤。即使在這個模型中，相比於單獨使用抗-EGFR，抗-EGFR-幹擾素β也顯示出了優越的治療效果(圖2C)。為了測試抗-EGFR-幹擾素β是否能夠控制腫瘤轉移，當前的發明人向WT小鼠靜脈內注射了 B16-EGFR以模擬腫瘤轉移。發明人發現了與單獨使用抗-EGFR相t匕，抗-EGFR-幹擾素β能夠更好地控制轉移性的腫瘤並且還能夠延長小鼠的存活(數據未顯不)O
[0120]由抗-Neu抗體導的抗腫瘤免疫性在neu Tg小鼠中大大降低，這是因為由於轉基因表達的性質而使得在早期生命階段，所有的乳腺中的高neu表達(作為自我以及腫瘤相關抗原)耐受宿主免疫細胞。為了測試Ab-1FNP是否能夠打破這種耐受性並在neu Tg小鼠中誘導neu+腫瘤的消退,在neu Tg宿主中建立了 neu+腫瘤系N0P23 (最初是從neu Tg小鼠產生的)令人驚訝地，與單獨使用抗-Neu抗體相比，抗-Neu-幹擾素β更顯著地抑制了腫瘤生長(圖2D)。總之，這些數據表明，對於控制腫瘤(甚至是在抗體抗性腫瘤模型和耐受的宿主中)而言，與第一代抗體療法相比，Ab-1FNP融合蛋白療法能夠以低劑量、在短時間內達到優越得多的效果(圖14)。
[0121]實施例3
[0122]抗-EGFR-幹擾素β融合蛋白的治療效果取決於獲得性免疫
[0123]I型幹擾素對於腫瘤的生長具有多種潛在的效果，這包括抑制增殖、抑制血管生成、激活天然免疫細胞、橋接先天和獲得性免疫以及直接激活獲得性免疫應答。為了評估在眾多其他的抗-EGFR-幹擾素β抗腫瘤效果中，獲得性免疫的相對貢獻，用抗-EGFR-幹擾素β處理了攜帶B16-EGFR的Β6 Ragl KO小鼠。與在WT小鼠中觀察到的治療效果相反，相似劑量的抗-EGFR-幹擾素β不能抑制這些免疫受損的Ragl KO小鼠中的腫瘤(圖3Α)。因此，這些數據支持了下述結論:抗-EGFR-幹擾素β介導的治療效果在很大程度上需要獲得性免疫。
[0124]CD8+T淋巴細胞是參與控制許多腫瘤的生長的主要細胞群。為了確定它們是否也參與抗-EGFR-幹擾素β介導的抗腫瘤效果，發明人在引發階段中追蹤了抗腫瘤T細胞應答。發明人首先建立了 B16-EGFR-SIY腫瘤細胞系，其中SIY肽(SIYRYYGL)被異位表達在人EGFR分子中；這一 SIY肽是作為替代標誌，其可被內源性或2C Tg⑶8+Τ細胞特異性地識別。在用抗-EGFR-幹擾素β處理之後，從攜帶腫瘤的小鼠中分離了引流淋巴結(dLN)淋巴細胞，並用SIY肽進行了刺激，且測量了幹擾素Y的產生，作為被激活的T細胞的效應子-功能指標。如圖3B中所示，與單獨的抗-EGFR處理相比，抗-EGFR-幹擾素β處理增加了來自腫瘤抗原特異性T細胞的幹擾素Y產生。為了了解CD8+細胞對於抗EGFR-幹擾素β的治療效果是否是關鍵的，發明人在攜帶B16-EGFR的WT Β6小鼠中、在抗-EGFR-幹擾素β處理的過程中施用了 CD8耗竭抗體，並測量了腫瘤生長。CD8+細胞耗竭大大地降低了抗-EGFR-幹擾素β的治療效果(圖3C)，這表明需要獲得性的免疫應答來控制腫瘤生長。與這一發現相一致，發明人發現了在用抗-CD8進行耗竭後體外的T細胞應答大大降低(圖3D)。其它細胞的耗竭(包括NK和B細胞)沒有影響抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果(圖11)。發明人因此推測，抗-EGFR-幹擾素β誘導了對腫瘤特異性細胞毒性T細胞的更有效的引發，引起對腫瘤生長的抑制。總之，這些數據表明抗-EGFR-幹擾素β處理能夠增加T細胞引發，而這促成了抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果。
[0125]實施例4
[0126]抗-EGFR-幹擾素β的治療效果需要在宿主造血細胞上表達I型幹擾素受體
[0127] I型幹擾素受體在幾乎所有的細胞類型中都廣泛表達，因此正常的細胞和腫瘤細胞都是潛在的抗-EGFR-幹擾素β靶標。已報導了抗-⑶20-幹擾素α融合蛋白的效力需要在腫瘤細胞上表達I型幹擾素受體因此，發明人推斷對於抗-EGFR-幹擾素β的治療效果而言，可能也需要由腫瘤細胞表達的I型幹擾素受體。為此，發明人比較了攜帶腫瘤的I型幹擾素受體敲除(KO)小鼠中的抗腫瘤效果，所述小鼠在宿主細胞上缺乏I型幹擾素受體的表達，但是在腫瘤細胞上表達I型幹擾素受體。令人驚訝地，在I型幹擾素受體KO小鼠中，抗-EGFR-幹擾素β的治療效果被完全破壞了(圖4Α)，並且沒有觀察到增加的細胞毒性T細胞應答(圖4Β)。這些結果表明，抗-EGFR-幹擾素β的治療效果在宿主細胞中需要由I型幹擾素受體介導的活化，但在腫瘤細胞中不需要。由於所有的宿主組織都表達I型幹擾素受體，發明人構建了 I型幹擾素受體骨髓嵌合(BMC)小鼠，以進一步分析是否需要表達I型幹擾素受體的造血細胞或宿主基質細胞來實現抗腫瘤效果。發明人發現了，需要在造血細胞上表達I型幹擾素受體，因為在I型幹擾素受體KO BM重構的小鼠中抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果嚴重受損(圖4C)。這些數據表明抗-EGFR-幹擾素β不是通過直接抑制腫瘤細胞生長、而是通過激活宿主造血細胞(其然後改變腫瘤微環境)而介導其抗腫瘤效應。
[0128]實施例5
[0129]提高的樹突細胞交叉呈遞促成抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果
[0130]鑑於⑶8+細胞對於抗-EGFR-幹擾素β治療的抗腫瘤效果是關鍵性的，發明人進一步探索了抗-EGFR-幹擾素β如何增強細胞毒性T細胞應答的根本機制。發明人觀察到，即使沒有外源性SIY肽的刺激，在抗-EGFR-幹擾素β處理之後也有幹擾素Y產生性⑶8+細胞的顯著增加，這表明APC的交叉呈遞增加了(圖5Α)。因為交叉呈遞是激活細胞毒性T細胞用於抗腫瘤免疫的主要引發性機制發明人推測所述交叉呈遞的增加對於恢復樹突細胞功能以重新活化腫瘤內和引流淋巴結內的細胞毒性T細胞可能是關鍵性的。為了開始研究抗-EGFR-幹擾素β能夠增加APC的交叉呈遞的可能性，發明人使用了體內的抗原特異性系統以追蹤腫瘤-抗原特異性T細胞的引發和活化。因此，評估了來自經抗-EGFR-幹擾素β處理的攜帶B16-EGFR-SIY的小鼠的dLN的樹突細胞，通過在離體測定中用SIY-反應性2C T細胞孵育它們而檢測其增強特異性抗腫瘤細胞毒性T細胞應答的能力。的確，與抗-EGFR處理相比，來自經抗-EGFR-幹擾素β處理的小鼠的樹突細胞誘導了更多由2C T細胞產生的幹擾素Y (約33倍)，甚至在沒有外源性SIY肽的再刺激時也是如此(圖5Β)。綜合而言，這些數據表明，經抗-EGFR-幹擾素β活化的樹突細胞通過增加交叉引發功能而增強了 CD8+T細胞活化。此外，這些結果表明，是所述融合蛋白的幹擾素β組分引起了樹突細胞交叉呈遞通路的活化，因為單獨的抗-EGFR沒有誘導強的樹突細胞活化。為了測試抗-EGFR-幹擾素β是否也增加了直接引發功能，將外源的抗原產生性肽(SIY)添加到培養基中，其進一步增加了 SIY-特異性2C T細胞應答。在外源SIY-肽再刺激之後，與抗-EGFR處理相比，來自經抗-EGFR-幹擾素β處理的小鼠的樹突細胞誘導2C T細胞產生約2倍更多的幹擾素Y (圖5Β)。這些結果表明，與來自單獨經抗-EGFR處理的小鼠的樹突細胞相比，來自經抗-EGFR-幹擾素β處理的宿主的dLN的樹突細胞很有可能在更大程度上被活化。的確，這些樹突細胞具有活化標誌物(包括CD86)的高表達,如通過流式細胞計數所評估的(圖5C)。為了進一步解析由抗-EGFR-幹擾素β誘導的樹突細胞活化是否促成了增強的T細胞活化，在抗-EGFR-幹擾素β處理的過程中，用DT處理攜帶腫瘤的⑶Ilc-DTRBMC小鼠以耗竭樹突細胞。發明人發現，當不存在樹突細胞時，所述由抗-EGFR-幹擾素β介導的治療效果顯著受損(圖OT)。總之，這些數據表明增加的樹突細胞交叉呈遞引起改善的⑶8+細胞毒性T細胞引發和功能，而這可能是抗EGFR-幹擾素β的治療效果的主要根本性機制。
[0131]實施例6 [0132]抗-EGFR-幹擾素β直接靶向樹突細胞以逆轉耐受的腫瘤微環境用於改進的抗腫瘤效果
[0133]本申請的數據表明，增加的交叉誘導對於通過抗-EGFR-幹擾素β處理帶來改進的抗腫瘤效果是重要的。然而，如何通過抗-EGFR-幹擾素β處理而活化樹突細胞的機制仍不清楚。特別地，需要鑑別出直接促成抗-EGFR-幹擾素β的治療效果的表達I型幹擾素受體的細胞。為了解決這個問題，將I型幹擾素受體fl/fl小鼠與各種Cre-Tg小鼠一同哺育。當I型幹擾素受體在⑶Ilc-Cre-1型幹擾素受體fl/fl小鼠中的⑶Ilc+細胞中選擇性缺失時,抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果顯著減少(圖6Α)，這表明，通過抗-EGFR-幹擾素β直接活化樹突細胞可能是對其治療效果做出主要貢獻的因素。當I型幹擾素受體在⑶4-Cre-1型幹擾素受體fl/f~j、鼠的T細胞中選擇性缺失時，抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果略微受損但沒有顯著受損(圖6Β)，這表明使I型幹擾素受體直接靶向T細胞可使已經被樹突細胞激活的T細胞被進一步活化，從而產生改進的抗腫瘤效果。為了進一步測試這一想法，發明人在體外測定中評估了抗-EGFR-幹擾素β刺激在樹突細胞和T細胞活化中的效果；的確，抗-EGFR-幹擾素β增加了經純化的樹突細胞和T細胞的活化(圖12)。這些數據結合在一起表明了，I型幹擾素受體表達性樹突細胞的直接活化在抗-EGFR-幹擾素β介導的治療效果中起主要作用，而通過在T細胞上表達I型幹擾素受體進一步增強了這種作用。
[0134]實施例7
[0135]拮抗抗-EGFR-幹擾素β誘導的TO-Ll表達實現了無腫瘤的效果
[0136]雖然與單獨的抗-EGFR抗體相比，抗-EGFR-幹擾素β融合實現了更有效的抗腫瘤效果，殘留的腫瘤最終會復發。發明人因此想了解，抗-EGFR-幹擾素β處理是否可能誘導抑制性分子的表達以防止組織損傷，而這將隨著時間弱化抗腫瘤效果。發明人在抗-EGFR-幹擾素β處理後評估了 PD-Ll的表達，並且在體內和體外都清楚地觀察到了腫瘤細胞上增加的I3D-Ll表達(圖7A和7B)。發明人然後測試了組合的抗-PD-Ll和抗-EGFR-幹擾素β處理是否能夠進一步增強抗-EGFR-幹擾素β的長期效果。令人驚訝地，當聯合使用抗-PD-Ll與抗-EGFR-幹擾素β處理時，長期治療效果得到了顯著提高；在所述處理之後，小鼠保持無腫瘤至少60天並且對腫瘤刺激有抗性(圖7C，以及未顯示的數據)。此外，通過抗-PD-LI處理阻斷ro-1與ro-Ll的相互作用進一步提高了特異性的抗腫瘤T細胞應答(圖7D)。相反，當將抗-EGFR-幹擾素β與另外兩個在T細胞上表達的主要抑制分子的抗體抗-CTLA-4、抗-BTLA組合施用時，沒有觀察到任何類似的協同效果(圖13)。總之，發明人的數據表明拮抗腫瘤細胞上由抗-EGFR-幹擾素β誘導的I3D-Ll表達能夠使抗-EGFR-幹擾素β的抗腫瘤效果最大化並獲得令人印象深刻的無腫瘤結果，甚至對於抗體抗性腫瘤也是如此。這種基於組合的策略很可能增加抗體抗性宿主的整體應答和治癒率，甚至在不能響應抗-PD-1抗體(其直接阻斷τ細胞表達的ro-1)的宿主中也能實現。
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【權利要求】
1.幹擾素與阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物(例如抗體，如抗TOLi抗體)共同用於製備藥物(例如藥物試劑盒)的用途，其中所述藥物用於治療腫瘤，例如惡性的固體腫瘤，特別是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤。
2.幹擾素與阻斷ro-1/PDL信號傳導通路的化合物(例如抗體，如抗PDLl抗體)共同用於製備藥物(例如藥物試劑盒)的用途，其中所述藥物用於克服腫瘤(例如惡性的固體腫瘤，特別是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤)對於抗體療法的抗性。
3.根據權利要求1或2的用途，其中所述幹擾素為I型幹擾素，優選幹擾素α和/或幹擾素β。
4.根據權利要求1-3中任一項的用途，其中所述幹擾素與結合腫瘤相關抗原的靶向部分(例如抗體，如抗EGFR抗體或抗Neu抗體)相連(例如形成融合蛋白)，其中所述靶向部分與所述幹擾素直接相連或通過連接子相連。
5.根據權利要求2-4中任一項的用途，其中所述對於抗體療法有抗性的腫瘤或攜帶所述腫瘤的宿主在下列一項或多項中有缺陷: 1)幹擾素，例如I型幹擾素，如幹擾素α5和/或幹擾素β的表達和/或功能； 2)幹擾素受體，如I型幹擾素受體的表達和/或功能，特別是樹突細胞上的所述幹擾素受體的表達和/或功能；和/或 3)樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生的抗腫瘤細胞毒性T細胞。
6.試劑盒，其含有: a)幹擾素，例如I型幹擾素，如IFNβ和/或IFN α 5 ;和 b)阻斷H)-1/PDL信號傳導通路的化合物，例如抗體，如抗PDLl抗體。
7.權利要求6的試劑盒，其中所述幹擾素與結合腫瘤相關抗原的靶向部分(例如抗體)相連(例如形成融合蛋白)，其中所述靶向部分與所述幹擾素直接相連或通過連接子相連。
8.根據權利要求7的試劑盒,其中所述祀向部分為抗體,例如抗EGFR抗體或抗Neu抗體。
9.根據權利要求6— 8中任一項的試劑盒，其中所述腫瘤為惡性腫瘤，例如惡性的固體腫瘤，其包括例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，結腸癌，皮膚癌，頭頸癌，淋巴瘤或黑色素瘤。
10.根據權利要求6— 8中任一項的試劑盒，其中所述腫瘤或攜帶所述腫瘤的宿主在下列一項或多項中有缺陷: 1)幹擾素，例如I型幹擾素，如幹擾素α5和/或幹擾素β的表達和/或功能； 2)幹擾素受體，如I型幹擾素受體的表達和/或功能，特別是樹突細胞上的所述幹擾素受體的表達和/或功能；和/或 3)樹突細胞的交叉呈遞以及由此產生抗腫瘤細胞毒性T細胞。
【文檔編號】A61K38/21GK103536917SQ201310525752
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】楊選明, 傅陽心 申請人:蘇州丁孚靶點生物技術有限公司