一類細胞因子的新適應症的製作方法
2023-10-07 23:46:49
專利名稱：一類細胞因子的新適應症的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞因子對促進血管再生的方法及細胞因子在治療缺血性心臟疾病中應用。
急性心肌梗塞、冠脈狹窄以及經皮冠狀動脈腔內血管成形術(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty，PTCA)后冠狀動脈再狹窄是臨床上的難題，心肌供血異常(缺血)是這些臨床病症的共同特點之一。如果對心肌的血供可以恢復，這類疾病即可以得到治療。目前已有一些傳統的臨床治療方法可用於冠脈缺血疾病，如冠狀血管搭橋手術和經皮冠狀血管氣囊擴張術對治療單根或數根冠脈血管狹窄是有效的治療方法。但是手術帶來的血管內皮損傷會極大地增加術后冠脈再狹窄的可能性。對於有著廣泛冠脈狹窄和病變的病人，採用這些技術不足以增加心臟血液的供應。因此，如果能生成新的血管並形成建立新的側枝循環血供，將會有助於這些疾病的治癒。
因此，人們花費許多努力去開拓誘導心臟血管生長的新治療方法，比如使用生長因子。目前已有一些血管生成因子，如血管內皮生長因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子α(Fibroblast GrowthFactor，αFGF)、βFGF和胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)在進行動物實驗和臨床試驗。但是，所有這些因子都尚未被批准在臨床用於血管生成，甚至未被批准用於任何其他臨床疾病。在證實這些因子的急性和慢性毒性、致癌作用以及其他任何潛在副作用之前，這些因子要用於血管生成還有很長的路要走。
人們在癌症病人的治療中採用細胞因子來提高身體的免疫能力，特別是癌症病人化療時引起白細胞下降，可注射細胞因子來提高白細胞數量，並且大量的臨床數據證明粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在增加白細胞總量時其安全性、有效性和可重複性。再如促紅細胞生成素(EPO)能增加紅細胞，臨床用於治療腎性貧血以及其他各種原因，如愛滋病、癌症等引起的貧血。白細胞介素-2(IL-2)在臨床上用作抗腫瘤藥物，但副作用比較大。
本發明目的是提供一類細胞因子在治療缺血性心臟病的藥物中應用，更具體地說細胞因子對治療急性心肌梗塞、冠脈狹窄或者冠狀動脈再狹窄疾病的藥物應用。
一類使血循環中的內皮祖細胞增加，促心肌血管生成的細胞因子在治療缺血性心臟病藥物中應用，它們包括G-CSF、GM-CSF、EPO、血小板生成素(TPO)、幹細胞因子(SCF)、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-2、IL-7、IL-8等細胞因子有動員幹細胞進入外周血的作用，使用這些細胞因子能顯著增加外周血幹細胞包括CD34+細胞的數量。因此，系統給予這些細胞因子，通過增加全身循環血液中CD34+細胞，達到促進新生血管生成。
對白血病患者進行HLA全相合的異基因外周血幹細胞移植，患者用G-CSF做動員劑，皮下注射G-CSF 10μg/kg/天，分兩次注射，共注射5天。動員前後分別採集外周血，加PE標記的CD34單抗共同避光室溫孵育20分鐘，裂解紅細胞，洗滌，固定用FACS測定CD34+細胞數。測定動員後外周血CD34+細胞是動員前的10倍多。表明系統給予G-CSF能增加循環血液中CD34+細胞。
上述細胞因子可以是用大腸桿菌、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)以及其他生物器生產的重組人G-CSF、GM-CSF，G-CSF、GM-CSF可以是重組蛋白或含有上述因子的複合物。而G-CSF、GM-CSF還可以編碼該蛋白的基因直接導入受體的方式給予，DNA或mRNA序列導入到受體細胞的方法可以是通過磷酸鈣-DNA轉運法，DEAE葡聚糖-DNA轉運法、Lipofectin試劑轉運法、基因槍技術、病毒基因轉運系統以及肌內直接注射裸DNA，然後電穿孔法。
正常人的循環血液中CD34+細胞很少，幾乎檢測不到。但我們觀察到，急性心肌梗塞病人血液循環中CD34+細胞短暫但明顯增高。6位病人在心肌梗塞的急性發作階段(0天)以及在根據臨床症狀和實驗室檢查後評定為急性心梗塞(第1天)，檢測其白細胞總數以及CD34+細胞數，計算CD34+佔白細胞數的比例。發現CD34+細胞在急性心梗發作時明顯升高，約佔白細胞總數的0.9％，但次日迅速下降，約為0.2％左右。可見血液循環中CD34+細胞在急性心肌梗塞後(當天)發生短暫升高。
本發明提供異體的CD34+細胞能遷移、分化並裝配入鼠的心肌損傷區域的新生血管中，即受損心肌可以發生血管重生。
一組對雄性無胸腺裸鼠損傷心肌然後注射DiI標記的CD34+細胞。另一組對2隻上述裸鼠施行假手術，然後注射DiI標記的CD34+細胞。再一組為損傷心肌然後注射抽取出CD34+細胞的DiI標記的外周單個核細胞，通過尾靜脈注射由正常人分離出經螢光染料DiI標記的CD34+細胞。結果可從圖2、圖3、圖4看出CD34+細胞明顯增加，注射的CD34+細胞被發現僅分布於心肌損傷區域。在心肌正常區域或其他任何器官包括肺沒有確認有該細胞，後一發現意義重大，因為細胞是靜脈注射需要通過肺部才能到達心臟，從實驗表明外源性內皮祖細胞遷移至損傷心肌，在心臟內這些細胞可以重新形成完全的血管，使用外源祖細胞對嚴重冠脈疾病患者形成新的血管可以起作用。
細胞因子藥物對治療缺血性心臟疾病，包括急性心肌梗塞、冠脈狹窄和PTCA後再狹窄中應用。
使用異體內皮原始祖細胞(CD34+細胞)治療缺血性心臟病A、適應病人急性心肌梗塞、嚴重心絞痛、PCTA一天內以及PTCA冠脈再狹窄B、血液樣本120ml靜脈血C、CD34+細胞的分離120ml血樣用於分離CD34+細胞。有兩個方法可用於CD34+細胞分離，視醫院的具體設備情況選擇其中之一。
a.使用磁性裝置分離CD34+細胞方法詳見磁性輔助細胞分離法(Magnetic Assisted Cell Sorting，MACS)所用細胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec，德國貝爾吉施格拉德巴赫)說明書，以及StemSepTM細胞分離器(StemCell Technologies Inc，加拿大溫哥華)說明書。
b.螢光標記細胞再使用流式細胞儀分離CD34+細胞當醫院有流式細胞儀時，該方法應當按說明書的標準化程序操作。
D、CD34+細胞增殖純化的CD34+細胞與RPMI+10％FCS+1％青黴素和鏈黴素孵育，37℃，濃度為500,000個細胞/毫升。另外，在培養基中加入以下試劑VEGF(5ng/ml)，βFGF(10ng/ml)，SCF(Stem Cell Factor，幹細胞因子)(100ng/ml)，IL1-beta(100ng/ml)，G-CSF(100ng/ml)，和TPO(血小板生成素)(15ng/ml)。這些細胞孵育2周。每3天換一次培養基。
E、細胞收穫孵育2周後收穫細胞，進行流式細胞儀(FACS)分析以確定CD34+細胞的純度。如果純度小於50％，需按步驟C進行CD34+細胞分離。存於-4℃備用。
F、CD34+細胞輸注急性心肌梗塞、或嚴重心絞痛、或PTCA后冠脈再狹窄病人靜脈輸入增殖並純化的CD34+細胞。
G、滅菌所有實驗必須在滅菌條件下進行。
使用G-CSF治療缺血性心臟病病人A、適應病人急性心肌梗塞、嚴重心絞痛、PTCA一天內以及PTCA冠脈再狹窄B、血液樣本20ml靜脈血C、檢測循環血中CD34+細胞數量20ml血樣用於檢測CD34+細胞水平。有兩個方法可用於CD34+細胞分離，視醫院的具體設備情況選擇其中之一。
a.使用磁性裝置分離CD34+細胞方法詳見磁性輔助細胞分離法(MACS)所用細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，德國貝爾吉施格拉德巴赫)說明書，以及StemSepTM細胞分離器(StemCell Technologies Inc.，加拿大溫哥華)說明書。
b.螢光標記細胞再使用流式細胞儀分離CD34+細胞當醫院有流式細胞儀時，該方法應當按說明書的標準化程序操作。
D、重組人G-CSF的使用重組人G-CSF靜脈注射，劑量為2.5μg/kg或5μg/kg，每日一次，3-7天或絕對中性粒細胞達到10,000mm3為止。
本發明的一類細胞因子具有下列優點1、能系統給藥，如靜脈給藥或皮下注射，不需特殊的傳輸技術，如心肌雷射打孔、開胸心肌內直接注射、冠狀動脈內注射、經皮心肌內直接注射等。
2、可多次治療3、本發明提供用於治療的藥物，如G-CSF、GM-CSF均已上臨床，其急性、慢性毒性、致癌作用，以及其他的副反應都有較系統研究，用藥比較安全。
附圖簡介
圖1是異體幹細胞供者使用G-CSF後外周血CD34+細胞變化的示意圖。
圖2是FACS檢測分離的CD34+細胞純度。
圖3是分離細胞的組織學檢查結果。
圖4是受損心肌區域DiI螢光。
圖5是受損心肌中一新血管的圖像。
實施例1檢測急性心肌梗塞病人血液循環中CD34+細胞的變化研究了6位病人，在心肌梗塞的急性發作階段(0天)以及在根據臨床症狀和實驗室檢查後評定為急性心梗後(第1天)，常規方法檢測病人的白細胞數。抽取外周血用檸檬酸鹽-磷酸鹽葡萄糖(Sigma)抗凝，以1∶3體積比用PBS液稀釋。400g離心30分鐘。收集單個核細胞。用NH4Cl溶液(NH4Cl0.155M，NaHCO312mM，EDTA 10uM)溶解紅細胞。低速離心(250g，每次5分鐘)下用含2％小牛血清(FBS)的PBS液衝洗細胞3次。製成細胞懸液，與人的複合單克隆抗體(human monoclonal antibody cocktail MoAb，catalogue#ST-230H，StemCell Technologies Inc.，加拿大溫哥華)孵育。然後加入磁性膠體(StemCell Technologies，Inc.)。用StemSep磁性分離柱(StemCellTechnolgies，Inc.)分離，游離的CD34+細胞通過柱子後被收集。檢測CD34+細胞數。計算CD34+佔白細胞數的比例。結果發現CD34+細胞在急性心梗發作時明顯升高，佔白細胞總數的0.87±0.59％，但次日即迅速下降，為0.19±0.13％。兩組配對t檢驗p＜0.05，可見血液循環中CD34+細胞在急性心肌梗塞後(當天)發生短暫升高。
實施例2檢測異體供者外周血幹細胞動員前後CD34+細胞的變化5例急性白血病患者進行HLA全相合的異基因外周血幹細胞移植，5例供者均為患者的同胞，年齡10-50歲。男性4例，女性1例。在-5天開始，供者用G-CSF做動員劑，皮下注射G-CSF 10μg/kg/天，分兩次注射，共用5天。動員前後分別採集外周血，加PE標記的CD34單抗共同避光室溫孵育20分鐘，裂解紅細胞，洗滌，再加10g/L多聚甲醛固定，FACS測定CD34+細胞數。結果見圖1。動員後外周血CD34+細胞是動員前的10.3倍，可見用G-CSF動員後供者血液循環中CD34+細胞明顯增高。
實施例3目的是證實異體基因CD34+細胞是否會遷移、分化並裝配入心肌損傷部位新的血管中19隻6周大的雄性無胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.)，分成5組。A組為主要實驗組，共8隻鼠，損傷心肌後注射DiI標記的CD34+細胞，其餘4組動物組成不同的對照組。B組2隻鼠施行假手術(施行了胸廓切開術但沒有損傷心肌)，然後注射DiI標記的CD34+細胞。C組2隻鼠損傷心肌後不注射任何細胞。D組5隻鼠損傷心肌後注射抽取出CD34+細胞的DiI標記的外周單個核細胞。E組2隻鼠損傷心肌後注射DiI染料。
鼠心肌損傷模型製作施行左側胸廓切開術暴露心臟，用25號針10-20次透壁心肌針刺造成心肌損傷。該方法造成的心肌損傷的組織表現與缺血造成的心肌梗塞相似。
術後兩天，約2×105CD34+細胞(分離自正常人志願者，用螢光染料DiI標記)通過尾靜脈注射。14天後將鼠處死，取器官並進行組織分析。除心臟外還檢查腎、肝、脾、肺和腦以確定DiI染料或DiI標記的細胞在心臟以外是否出現。
人CD34+細胞分離正常人供體的外周血用檸檬酸鹽-磷酸鹽葡萄糖(Sigma)抗凝，同實施例1中的方法，收集通過柱子後的CD34+細胞。衝洗洗脫的細胞，並放於Dulbecco氏改良Eagle培養基(GiboBRL，LifeTechnologies，紐約格蘭德島)備用。
用流式細胞儀(FACS)檢測分離出來的CD34+細胞的純度。分離的細胞與鼠抗CD34 IgG然後FITC-抗鼠IgG孵育各30分鐘。用PBS液衝洗，用FACS檢測CD34+純度。
進一步檢測分離細胞的特性，細胞塗片並用2％多聚甲醛固定。用鼠抗CD34抗體(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，加州聖胡塞)和FITC-羊抗鼠IgG(Becton Dickinson)檢測CD34抗原性。RNA探針原位雜交檢測eNOS抗Von Willebrand因子(VIII因子，DAKO)抗體免疫染色檢測VIII因子抗CD31抗體(Becton Dickinson)免疫染色檢測CD31抗原性。
分離的細胞用10uM螢光染料DiI(StemCell Technologies Inc.)在37℃標記2小時。標記好後，細胞衝洗並懸於基質以用於動物注射。
組織分析動物處死後，採集組織並固定，做組織冰凍切片。為檢測DiI螢光的存在，冰凍組織切片沒有進一步處理，用螢光顯微鏡觀察。為識別損傷區域，用標準技術進行蘇木精-曙紅(HE)染色。
結果如圖2FACS檢測分離的CD34+細胞純度。細胞用CD45和CD34抗體雙染色以分別檢測單個核細胞數和CD34+細胞數。圖2A顯示CD34+細胞富集前外周單個核細胞中僅約0.4％為CD34+。圖2B顯示通過StemSep分離柱後約64％細胞為CD34+。表明該方法能明顯富集CD34+細胞。
如圖3顯示分離細胞的特性。與抗CD34抗體免疫染色顯示分離細胞CD34抗原的表達(圖3A)；與抗人HLA1抗體免疫染色顯示相同細胞表達HLA1(圖3B)；因子VIII抗原性與CD34陽性共存(圖3C和3D)，但細胞為CD31陰性(圖3E)；eMOS表達原位雜交也是陽性(圖3F)，提示這些細胞的內皮表型。
僅在心臟受損區域觀察到DiI螢光。在這些區域內，觀察到拉長、變平的DiI+細胞沿毛細血管和較大的血管排列。這些血管中有許多完全由DiI+細胞組成。如圖4A顯示注射DiI標記CD34+細胞的鼠的損傷心肌區域低倍顯微鏡圖象，圖4B為較高倍顯微鏡圖象。即使在低倍顯微鏡下可以看見DiI螢光，並可見僅限於受損區域，鄰近正常心肌未見螢光。如這些圖所示，DiI標記的細胞有時在間質組織內隨意出現(箭頭a)，有時排列成行出現(箭頭b)，有時這些細胞形成類似血管的中間空的圓環狀(箭頭c)。標尺條在圖A相當於200μm，圖B為50μm。作為對照，心肌損傷動物靜脈注射DiI染料顯示在受損區域或非受損區域沒有出現螢光。這表明CD34+細胞遷移至心肌損傷部位並參與新血管形成。
DiI+螢光和VIII因子、CD31以及HLA1共處證實這是注射的人的細胞整合入或者是可能形成血管結構。如圖5顯示心外膜表面附近一個心肌損傷區域內一新血管鄰近組織切片圖象。一新鮮冰凍切片用一個DiI濾光器在螢光顯微鏡下顯現為一個血管結構(圖5A)。同樣這張切片再用FITC-抗HLA-1抗體免疫染色(圖5B)。陽性染色證實組成該結構的細胞來源於人，該切片的DiI信號在HLA-1染色後消失(圖片未顯示)。該切片顯示強VIII因子免疫陽性(圖5C)，這證實排列該結構的細胞為內皮表型。對另一個不同的鄰近組織切片免疫染色顯示該結構為CD34陰性(圖5D)但CD31陽性(圖5E)。說明注射的細胞進一步分化為內皮細胞，失去CD34抗原性獲得CD31抗原性。
權利要求
1.一類使血循環中的內皮祖細胞增加，促心肌血管生成的細胞因子在治療缺血性心臟病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的一類細胞因子，包括有粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、腫瘤壞死因子(TNF)、幹細胞因子(SCF)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)、白細胞介素-7(IL-7)、白細胞介素-8(IL-8)。
3.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是粒細胞集落刺激因子，可以是重組蛋白或含有上述因子的複合物。
4.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是粒細胞巨噬集落刺激因子，可以是重組蛋白或含有上述因子的複合物。
5.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是促紅細胞生成素。
6.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是血小板生成素。
7.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是白細胞介素-2。
8.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於它是腫瘤壞死因子。
9.根據權利要求1所述的一類細胞因子，其特徵在於粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，可以以編碼蛋白的基因直接介導入受體方式給予，DNA或mDNA序列導入到受體細胞的方法可以是通過磷酸鈣-DNA轉運法、DEAE葡聚糖-DNA轉運法、Lipofeetin試劑轉運法、基因槍技術、病毒基因轉運系統以及肌內直接注射裸DNA然後電穿孔法。
10.根據權利要求1所述的細胞因子在治療缺血性心臟病藥物中應用，其特徵在於缺血性心臟病為急性心肌梗塞、冠脈狹窄或者冠狀動脈再狹窄。
全文摘要
一類使血循環中的內皮祖細胞增加,促心肌血管生成的細胞因子在治療缺血性心臟病藥物中的應用,更具體地說其缺血性心臟病為急性心肌梗塞、冠脈狹窄或冠狀動脈再狹窄的藥物中應用。
文檔編號A61P9/00GK1345602SQ0013170
公開日2002年4月24日 申請日期2000年9月30日 優先權日2000年9月30日
發明者王捷, 柴嬰蕾 申請人:杭州泰士生物科技有限公司