糖基聚乙二醇化的因子Ⅸ的製作方法

2023-10-22 15:56:12 2

專利名稱：糖基聚乙二醇化的因子Ⅸ的製作方法
本申請要求下列申請的優先權U.S.臨時專利申請No.60/527,089(在2003年12月3日提交，此處引用其整體作為參考用於所有目的)；U.S.臨時專利申請No.60/539,387(2004年1月26日提交)；U.S.臨時專利申請No.60/592,744(2004年7月29日提交)；U.S.臨時專利申請號60/614,518(2004年9月29日提交)；和U.S.臨時專利申請號60/623,387(2004年10月29日提交)，此處引用其各自整體作為參考用於所有目的。
背景技術：
維生素K依賴性蛋白質(例如因子IX)在其氨基端45個殘基中包含9到13個γ-羧基穀氨酸殘基(Gla)。Gla殘基通過肝中利用維生素K羧化蛋白質前體中穀氨酸殘基側鏈的酶產生。維生素K依賴性蛋白質與大量生物學過程有關，其中最詳細描述的為凝血(Nelsestuen，Vitam.Horm.58355-389(2000)綜述)。維生素K依賴性蛋白質包括蛋白質Z、蛋白質S、凝血酶原(因子II)、因子X、因子IX、蛋白質C、因子VII、Gas6和基質GLA蛋白質。因子VII、IX、X和II用於促凝過程而蛋白質C、蛋白質S和蛋白質Z用於抗凝作用。Gas6是由生長停滯特異基因6(gas6)編碼的生長停滯激素並與蛋白質S相關。見Manfioletti等，Mol.Cell.Biol.134976-4985(1993)。基質GLA蛋白質通常發現於骨中並對阻止循環中軟組織鈣化是關鍵的。Luo等，Nature 38678-81(1997)。
調節血液凝固是代表了許多主要健康問題(包括不能形成血塊和血栓、形成不需要的血塊)的過程。在許多情形下使用阻止不需要的血塊形成的試劑且許多試劑是可用的。不幸的是，多數現有療法具有不良的副作用。口服抗凝血劑例如華法林(Warfarlin)通過抑制維生素K在肝中的作用而作用，從而阻止維生素K依賴性蛋白質穀氨酸殘基的完全羧化，引起循環系統中活性蛋白質濃度降低和形成血塊能力降低。藥物與其靶標的競爭性使華法林療法複雜化。飲食中維生素K的波動可引起華法林過量或不足。凝結活性的波動為該療法的不良結果。
注射的物質例如肝素(包括低分子量肝素)也是常用的抗凝血劑。另外，這些化合物使用過量並必須小心監控。
更新種類的抗凝血劑包括活性位點修飾的維生素K依賴性凝血因子例如因子VIIa和IXa。活性位點被絲氨酸蛋白酶抑制劑例如胺基酸或短肽的氯甲基酮衍生物封閉。活性位點修飾的蛋白質保留與其各自的輔因子形成複合物的能力，但是是失活的，從而不產生酶活性並阻止輔因子與各自的活性酶複合。簡言之，這些蛋白質顯示提供無其他抗凝血劑不良副作用的抗凝療法的益處。活性位點修飾的因子Xa為該組中另一可能的抗凝血劑。其輔因子蛋白質為因子Va。活性位點修飾的激活蛋白C(APC)可能也是凝血的有效抑制子。見Sorensen等，J.Biol.Chem.27211863-11868(1997)。活性位點修飾的APC結合因子Va並阻止因子Xa結合。
使用維生素K依賴性凝血因子的主要阻礙在於成本。維生素K依賴性蛋白質的生物合成依賴於完整的穀氨酸羧化體系，其存在於少量動物細胞類型中。這些蛋白質的超量生產受限於該酶體系。另外，這些蛋白質的有效劑量較高。通常劑量為1000ug肽/kg體重。見Harker等，1997，如上。
另一阻止治療肽使用的現象是眾所周知的蛋白質糖基化方面，即這些肽顯示的體內相對短的半衰期。總之，短的體內半衰期問題意味著治療糖肽必須時常以高劑量給藥，最終轉化為必須更高(與製備更有效的產生更長效用的糖蛋白治療劑的方法相比)的醫療費。
例如，因子VIIa說明了該問題。因子VII和VIIa在人中有大約2-4小時的循環半衰期。即在2-4小時內，肽在血清中的濃度減少一半。當使用因子VIIa作為促凝血劑治療某些形式的血友病時，標準方案為每兩小時注射高劑量(45到90.mu.g/kg體重)VIIa。見Hedner等，Transfus.Med.Rev.778-83(1993)。因此，使用這些蛋白質作為促凝血劑或抗凝血劑(在因子VIIa情況下)要求以頻繁間隔和高劑量施用蛋白質。
提供成本效益好的糖肽療法問題的一種解決方法為提供具有更長體內半衰期的肽。例如，已經通過將合成聚合物附著在肽主鏈上產生了具有改進的藥物代謝動力學性質的糖肽治療劑。示例性的與肽綴合的多聚體為聚乙二醇(「PEG」)。使用PEG衍生肽治療劑被證明減少了肽的免疫原性。例如，U.S.專利No.4,179,337(Davis等)公開了非免疫原的多肽例如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶聯的酶和肽激素。除減少免疫原性外，循環中的清除時間也因為所述多肽的PEG綴合物的尺寸增大而延長。
PEG及其衍生物附著肽的主要方式為通過肽胺基酸殘基的非特異性成鍵(見例如U.S.專利號4,088,538、U.S.專利號4,496,689、U.S.專利號4,414,147、U.S.專利號4,055,635和PCT WO 87/00056)。PEG附著肽的另一方式為通過非特異性氧化糖肽上的糖基殘基(見例如WO 94/05332)。
在這些非特異性方法中，聚乙二醇以隨機、非特異性方式加至肽主鏈的反應性殘基上。當然，隨機加入PEG具有其缺點，包括缺乏最終產物同質性，和可能降低肽的生物學或酶活性。因此，為了產生治療肽，引起特異標記的、容易鑑定的、基本同質的產物的衍生策略是佔優勢的。已經發展了這樣的方法。
特異標記的、同質的肽治療劑可通過酶作用在體外產生。與通常的合成多聚體或其他標記附著至肽的非特異性方法不同，基於酶的合成具有區域選擇性和立體選擇性的優點。用於標記的肽合成中的兩種主要類型的酶為糖基轉移酶(例如唾液酸轉移酶、寡糖基轉移酶和N-乙醯氨基葡糖轉移酶)和糖苷酶。這些酶可用於糖的特異附著，糖隨後可被修飾以包含治療部分。另外，糖基轉移酶和修飾的糖苷酶可用於將修飾的糖直接轉移至肽主鏈(見例如U.S.專利6,399,336和U.S.專利申請出版物20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，此處引用各項作為參考)。結合化學和酶合成元素的方法也是已知的(見例如Yamamoto等，Carbohydr.Res.305415-422(1998)和U.S.專利申請出版物20040137557，此處引用作為參考)。
因子IX是非常有價值的治療肽。儘管現在使用市售形式的因子IX，這些肽可通過增強產生的分離糖蛋白產物藥物代謝動力學的修飾來改進。因此，本領域仍需要具有改進效用和更佳藥物代謝動力學的更長效的因子IX肽。此外，為了對最大數量的個體有效，必須能夠以工業規模產生具有改進治療藥物代謝動力學的因子IX肽，其具有可預測的、基本同質的結構，該結構能夠容易地一次又一次地複製。
幸運的，現在已經發現具有改進的藥物代謝動力學的因子IX肽和製備他們的方法。除了具有改進的藥物代謝動力學的因子IX肽之外，本發明還提供工業可行的和成本效益好的用於生產這些因子IX肽的方法。本發明的因子IX肽包含修飾基團例如PEG部分、治療部分、生物分子等等。本發明因此滿足了對用於治療疾病和病症(其中因子IX提供了有效的治療)具有改進的治療功效和改進的藥物代謝動力學的因子IX肽的需要。
發明概述目前發現用一個或多個聚乙二醇部分受控修飾因子IX提供了具有改進的藥物代謝動力學性質的新因子IX衍生物。此外，已發現並發展了用於可靠製造本發明修飾的因子IX肽的成本效益好的方法。
一方面，本發明提供包括
部分的因子IX肽。在上式中，D為-OH或R1-L-HN-。符號G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1為包含直鏈或分支聚乙二醇殘基的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭。通常，當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。如本領域技術人員將理解的，在文中公布的唾液酸類似物中，COOH還代表COO-或其鹽。
在另一方面，本發明提供製造包含上述部分的PEG化因子IX的方法。本發明的方法包括(a)在適合轉移的條件下，將底物因子IX肽與PEG-唾液酸供體和轉移PEG-唾液酸至因子IX肽胺基酸或糖基殘基上的酶接觸。示範的PEG-唾液酸供體部分具有式 在一個實施方案中宿主細胞為哺乳動物細胞。在其他實施方案中宿主細胞為昆蟲細胞、植物細胞、細菌或真菌。
在另一方面，本發明提供治療有此需要的受試者中疾病的方法，其中該疾病特徵為受試者中凝血受損。該方法包括向受試者施用能夠有效改善受試者中病症的數量的本發明因子IX肽綴合物的步驟。該方法能治療的示範的病症為血友病。
在另一方面，本發明提供包含本發明因子IX肽和藥學可用載體的藥物製劑。
本領域技術人員將根據下文詳述明白其他本發明的目的和優點。
附圖描述

圖1為因子IX的結構，顯示潛在糖基化位點Asn 157、Asn 167；Ser 53、Ser 61、Thr 159、Thr 169和Thr 172的存在和定位。
圖2為顯示示範的本發明實施方案的圖，其中因子IX肽上糖殘基被重構並糖基聚乙二醇化(A)唾液酸部分用唾液酸酶去除且產生的半乳糖殘基用圖5的唾液酸衍生物糖基聚乙二醇化；(B)甘露糖殘基用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(C)N-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(D)O-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(E)來自2(A)的因子IX的SDS PAGE凝膠；(F)來自產生2(C)和2(D)的反應的因子IX的SDS PAGE凝膠。
圖3為比較未糖基化的因子IX和酶促糖基聚乙二醇化的因子IX的體內停留壽命的曲線。
圖4為比較圖3所示種類活性的表格。
圖5為因子IX的胺基酸序列。
圖6為與未聚乙二醇化的因子IX比較，多種糖基聚乙二醇化的因子IX分子的藥物代謝動力學性質圖形表示。
圖7是本發明中使用的代表性的修飾的糖種類圖表。
圖8是本發明中使用的代表性修飾的糖種類的圖表。
圖9是用於將修飾的唾液酸部分(如文中公開的那些)和未修飾的唾液酸部分轉移至受體的唾液酸轉移酶圖表。
發明詳述及優選的實施方案縮寫PEG，聚乙二醇；PPG，聚丙二醇；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，巖藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙醯半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙醯氨基葡糖基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸(mannosaminyl acetate)；Xyl，木糖基和NeuAc，唾液酸(N-乙醯神經氨酸基)；M6P，甘露糖-6-磷酸；Sia，唾液酸，N-乙醯神經氨酸基及其衍生物和類似物。
定義除非另有說明，文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。通常，文中使用的術語以及細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學和雜交中的實驗室操作為本領域熟知並常規使用的。標準技術用於核酸和肽合成。技術和操作通常根據本文件中各處提供的本領域常規方法和多種一般參考(一般參見Sambrook等《MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL》，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，文中引用作為參考)執行。文中使用的術語以及分析化學和下述有機合成的實驗室操作為本領域熟知並通常使用的。標準技術或其變更用於化學合成和化學分析。
所有文中描述的寡糖以非還原糖(即Gal)名稱或縮寫描述，跟著是糖苷鍵構型(α或β)、環鍵(1或2)、與鍵有關的還原糖的環位置(2、3、4、6或8)，然後是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優選吡喃糖。標準糖生物學命名法綜述見《Essentials ofGlycobiology》，Varki等編輯，CSHL Press(1999)。
寡糖被認為具有還原性末端和非還原性末端，無論還原性末端的寡糖是否事實上為還原性糖。與公認的術語相同，文中所述的寡糖用左側為非還原性末端和右側為還原性末端表示。
術語「唾液酸」是指九碳羧化糖家族的任何成員。唾液酸家族最常見的成員為N-乙醯神經氨酸(2-酮-5-乙醯胺基-3，5-雙脫氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-1-onic acid(常縮寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的另一成員為N-乙醇醯-神經氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙醯基團被羥基化。再一唾液酸家族成員為2-酮-3-脫氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代唾液酸例如9-O-C1-C6醯基-Neu5Ac如9-O-乳醯基-Neu5Ac或9-O-乙醯基-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。唾液酸家族綜述見例如Varki，Glycobiology 225-40(1992)；《Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function》R.Schauer編輯(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化過程中唾液酸化合物的合成及使用在1992年十月1日公布的國際申請書WO 92/16640中公開。
「肽」是指多聚體，其中單體為胺基酸並通過醯胺鍵結合，也可稱為多肽。另外，非天然胺基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸亦包括在內。非基因編碼的胺基酸也可用於本發明。另外，本發明也可使用被修飾含有活性基團、糖基化位點、多聚體、治療部分、生物分子等的胺基酸。本發明中使用的所有胺基酸可為d-或1-異構體。通常優選1-異構體。此外，其他肽模擬物(peptidomimetics)也可用於本發明。文中所用「肽」是指糖基化和非糖基化的肽。還包括被表達肽的體系不完全糖基化的肽。一般的綜述見Spatola，A.F.，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，B.Weinstein編輯，Marcel Dekker，New York，267頁(1983)。
術語「肽綴合物」是指本發明的種類，其中肽與文中公開的修飾的糖綴合。
術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及與天然存在的胺基酸以相似方式作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸為由遺傳密碼編碼的以及隨後被修飾的胺基酸(例如羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸)。胺基酸類似物是指具有與天然存在胺基酸相同的基本化學結構的化合物，即與氫結合的α碳、羧基、氨基和R基團(例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶)。這些類似物有修飾的R基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保持了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸一般化學結構不同的結構，但以與天然存在胺基酸類似形式作用的化學化合物。文中使用「胺基酸」，無論其在接頭中或肽序列組成中，都指該胺基酸的D-和L-異構體以及這兩種異構體的混合。
文中使用術語「修飾的糖」是指天然或非天然存在的碳水化合物，其在本發明方法中被酶促加至肽的胺基酸或糖基殘基上。修飾的糖選自許多酶底物，包括但不僅限於糖核苷酸(單-、雙-和三磷酸)、活化的糖(例如糖基滷化物、糖基甲磺酸)、和既未活化又非核苷酸的糖。「修飾的糖」用「修飾基團」共價官能化。有用的修飾基團包括但不僅限於PEG部分、治療部分、診斷部分、生物分子等。修飾基團優選不是天然存在或未修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團官能化的部位使得其不阻礙「修飾的糖」被酶加至肽上。
術語「水溶性的」是指在水中具有若干可檢測程度溶解性的部分。檢測和/或定量溶解性的方法為本領域所熟知的。示範的水溶性多聚體包括肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有混合序列或由單一胺基酸序列組成(例如聚賴氨酸)。示範的多糖為聚唾液酸。示範的聚醚為聚乙二醇。聚乙二胺為示範的聚胺，且聚丙烯酸為代表性的聚羧酸。
水溶性多聚體的多聚體主鏈可為聚乙二醇(即PEG)。然而，應該理解其他相關的多聚體也適合用於本發明實踐，而且術語PEG或聚乙二醇的使用旨在包括並不僅限於該方面。術語PEG包括聚乙二醇的任何形式，包括烷氧基PEG、雙官能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、分支PEG、側掛型PEG(即有一個或多個官能團懸掛在多聚體主鏈上的PEG或相關多聚體)或帶有可降解鍵的PEG。
多聚體主鏈可以是線性的或分支的。分支的多聚體主鏈通常為本領域已知。一般的，分支的多聚體具有中樞分支核心部分和結合在中樞分支核心的許多線性多聚體鏈。PEG通常以分支形式使用，其可通過向多種多元醇(例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇)加成環氧乙烷來製備。中樞分支部分還可產生自一些胺基酸例如賴氨酸。分支聚乙二醇通常可以R(-PEG-OH)m方式表示，其中R代表核心部分例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的數目。多臂PEG分子(例如U.S.專利No.5,932,462中所述，在文中引用其整體作為參考)也可作為多聚體主鏈使用。
許多其他的多聚體也適用於本發明。非肽且水溶性的具有2到大約300末端的多聚體主鏈在本發明尤其有用。合適的多聚體實例包括但不僅限於其他聚亞烷基二醇例如聚丙二醇(「PPG」)，乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚氧乙基多元醇、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羥丙基甲基丙烯醯胺、聚α-羥基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)(例如在U.S.Pat.No.5,629,384中所描述的，文中引用其整體作為參考)和其共聚物，三元共聚物及混合物。儘管多聚體主鏈每條鏈的分子量可變，其一般在從大約100Da至大約100,000Da的範圍內，通常從大約6000Da到大約80,000Da。
文中在向病人施用肽藥物的上下文中使用「曲線下面積」或「AUC」是指從零到無窮大作為時間函數的描述病人體循環中藥物濃度的曲線下的總面積。
文中在向病人施用肽藥物的上下文中使用術語「半衰期」或「t1/2」是指藥物在病人中的血漿濃度降至一半需要的時間。依賴於多重清除機制、重新分配和本領域其他熟知的機制，可以存在超過一個關於肽藥物的半衰期。通常，定義α和β半衰期使得α期與重新分配相關，且β期與清除相關。然而，對於大部分被限制在血液中的蛋白質藥物而言，至少存在兩個清除半衰期。對一些糖基化的肽來說，快速β期清除可由巨噬細胞或內皮細胞上識別末端半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、N-乙醯葡萄糖胺、甘露糖或巖藻糖的受體介導。較慢的β期清除可通過腎小球對有效半徑＜2nm(大約68kD)分子的過濾和/或在組織中特異或非特異吸收和代謝發生。糖基聚乙二醇化可給末端糖(例如半乳糖或N-乙醯半乳糖胺)加帽從而阻斷通過識別這些糖的受體的快速α期清除。還可給予較大的半徑並因此減少分布容量及組織吸收，從而延長晚β期。因此，糖基聚乙二醇化對α期和β期半衰期的精確影響將依賴於大小、糖基化狀態和如本領域熟知的其他參數而變化。「半衰期」的進一步解釋可見《Pharmaceutical Biotechnology》(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar編輯，Harwood Publishers，Amsterdam，101-120頁)。
文中使用術語「糖綴合」是指修飾的糖種類與多肽(例如因子IX肽底物)的胺基酸或糖基殘基的酶介導結合。「糖綴合」的下位類別為「糖基聚乙二醇化」，其中修飾的糖的修飾基團為聚乙二醇和其烴基衍生物(例如m-PEG)或其活性衍生物(例如H2N-PEG，HOOC-PEG)。
術語「大規模的」和「工業規模的」可互換使用，並指在單個反應循環完成時產生至少大約250mg，優選至少大約500mg，且更優選至少大約1g糖綴合物的反應循環。
文中使用術語「糖基連接基團」是指與修飾基團(例如PEG部分、治療部分、生物分子)共價結合的糖基殘基；糖基連接基團連接修飾基團和綴合物殘餘部分。在本發明方法中，「糖基連接基團」共價結合在糖基化的或非糖基化的肽上，從而將試劑連接在肽的胺基酸和/或糖基殘基上。「糖基連接基團」通常通過「修飾的糖」酶促附著在肽的胺基酸和/或糖基殘基上而從「修飾的糖」得來。糖基連接基團可為糖衍生的結構，其在修飾基團-修飾的糖盒形成時降解(例如氧化→Schiff鹼形成→還原)或糖基連接基團可是完整的。「完整的糖基連接基團」是指衍生自其中將修飾基團結合至綴合物殘餘部分的糖單體未降解(例如被如高碘酸鈉氧化)的部分的連接基團。本發明的「完整的糖基連接基團」可衍生自天然存在的寡糖，通過向親本糖結構加成糖基單位或從中移除一個或多個糖基單位。
文中使用術語「靶向部分」是指將選擇性定位於身體特定組織或區域的種類。定位由分子決定子的特異識別、靶向劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水性相互作用等介導。其他將試劑靶向至特定組織或區域的機制為本領域技術人員已知。示範的靶向部分包括抗體、抗體片段、運鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)等。
文中使用「治療部分」是指任何可用於治療的試劑，包括但不僅限於抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細胞毒素和放射性試劑。「治療部分」包括生物活性劑前藥(其中多於一個的治療部分結合在載體上的構建體例如多價體)。治療部分還包括蛋白質和包含蛋白質的構建體。示範的蛋白質包括但不僅限於粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、幹擾素(例如幹擾素α、-β、-γ)、白介素(例如白介素II)、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人體絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)和抗體融合蛋白質(例如腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結構域融合蛋白質)。
文中使用「可藥用載體」包括任何與綴合物組合後保留綴合物活性並與受試者免疫系統無反應的物質。實例包括但不僅限於任何標準藥物載體例如磷酸鹽緩衝鹽水、水、乳液(例如油/水乳液)以及多種類型的溼潤劑。其他載體也可包括滅菌溶液、片劑(包括包衣片劑)和膠囊。一般這些載體包含賦形劑例如澱粉、乳、糖、某種類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油脂、樹膠、二元醇或其他已知賦形劑。這些載體還可包括香料添加劑或著色添加劑或其他成分。包含這些載體的組合物根據熟知的常規方法配製。
文中使用「施用」是指口服、作為栓劑使用、局部接觸、靜脈內、腹膜內、肌肉內、病灶內或鼻內或皮下施用，或向受試者植入緩釋裝置(例如微型滲透泵)。施用通過任何途徑進行，包括腸胃外和跨黏膜(例如口腔的、鼻的、陰道的、直腸的或經皮膚的)。腸胃外給藥包括例如靜脈內、肌肉內、微動脈內、皮內、皮下的、腹膜內的、心室內和顱內的。另外，當注射旨在治療腫瘤例如誘導細胞調亡時，可直接施用至腫瘤和/或腫瘤周圍組織。其他模式的遞送包括但不僅限於使用脂質體製劑、靜脈輸注液、透皮貼劑等。
術語「改善」是指在治療病理或病症中任何成功的標記，包括任何客觀的或主觀的參數例如症狀的減輕、緩和或消除或病人身體或精神狀態的改善。症狀的改善可基於客觀的或主觀的參數，包括體格檢查和/或精神評估的結果。
術語「治療」是指對疾病或病症的「治療」，包括阻止病症或疾病在可能患該疾病但未經歷或顯示該疾病症狀的動物上發生(預防療法)、抑制疾病(減緩或阻止其發展)、使得疾病症狀或副作用減輕(包括姑息療法)和解除疾病(使疾病消退)。
術語「有效量」或「治療有效量」或任何語法上相等的術語是指當施用於動物以治療疾病時足夠引起對該疾病治療的數量。
術語「分離的」是指物質，其本質上或基本上不含有用於產生該物質的成分。就本發明肽綴合物而言，術語「分離的」是指本質上或基本上不含有用於製備肽綴合物的混合物中通常伴隨材料的成分的材料。「分離的」和「純的」可互換使用。一般的，本發明分離的肽綴合物具有的純度水平優選以範圍表達。肽綴合物純度範圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，且純度範圍的上限為大約70％、大約80％或大於大約90％。
當肽綴合物純度大於大約90％時，其純度也優選以範圍表示，純度範圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。純度範圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％純度。
純度由領域公認的任何分析方法確定(例如銀染凝膠、聚丙烯醯胺凝膠電泳上的譜帶強度、HPLC或相似方法)文中使用「群體的基本上每個成員」描述本發明肽綴合物群體的特徵，其中加至肽的選定比例的修飾的糖被加至肽上多個同樣的受體位點。「群體的基本上每個成員」是講與修飾的糖綴合的肽上位點的「同質性」並涉及本發明的綴合物，其為至少約80％、優選至少約90％和更優選至少約95％同質。
「同質性」指與修飾的糖基結合的受體部分群體的結構一致性。因此，在本發明肽綴合物(其中每個修飾的糖部分與受體位點結合，該受體位點與每個其他修飾的糖結合的受體位點有相同結構)中，肽綴合物被稱為大約100％同質的。同質性通常以範圍表達。肽綴合物同質性範圍的下限為大約60％、大約70％或大約80％，且純度範圍上限為大約70％、大約80％、大約90％或大於大約90％。
當肽綴合物大於或等於大約90％同質時，其同質性也優選以範圍表達。同質性範圍的下限為大約90％、大約92％、大約94％、大約96％或大約98％。純度範圍的上限為大約92％、大約94％、大約96％、大約98％或大約100％同質性。肽綴合物的同質性通常通過一種或多種本領域技術人員已知的方法確定，例如液相層析質譜法(LC-MS)、基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALDITOF)、毛細管電泳等。上述討論同樣適用於其他O-糖基化和N-糖基化位點。
當涉及糖肽種類時，「基本均一的糖型」或「基本均一的糖基化模式」是指被目的糖基轉移酶(例如巖藻糖基轉移酶)糖基化的受體部分比例。例如，在α1，2巖藻糖基轉移酶情況下，如果在本發明肽綴合物中基本所有的(如下定義)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸化的類似物均被巖藻糖化，則存在基本均一的巖藻糖化模式。本領域技術人員將理解起始物質可含有糖基化的受體部分(例如巖藻糖化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算出的糖基化百分比將包括被本發明方法糖基化的受體部分以及在起始材料中已經被糖基化的受體部分。
上述「基本均一的」定義中術語「基本」通常是指至少大約40％、至少大約70％、至少大約80％、或更優選的至少大約90％，和更優選的至少大約95％的特定糖基轉移酶受體部分被糖基化。例如，如果因子IX肽綴合物包括Ser連接的糖基殘基，群體中至少大約70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、或更優選99.8％的肽將有相同的糖基殘基與相同的Ser殘基共價結合。
當取代基團被其常用由左至右寫的化學式指定時，其同等地包含由從右至左書寫所造成的化學相等的取代基，例如-CH2O-也旨在描述-OCH2-。
除非另有說明，術語「烴基(alkyl)」自身或作為另一取代基的一部分是指具有指定數量碳原子(即C1-C10是指一到十個碳)的直鏈或支鏈或環烴基，或其組合，其可為完全飽和的、單或多不飽和的，並可包含雙或多價基團。飽和烴基的實例包括(但不僅限於)例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、環己基甲基、環丙甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或異構體。不飽和烴基為具有一個或多個雙鍵或三鍵的烴基。不飽和烴基的實例為(但不僅限於)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-丁二烯基、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高級同系物及異構體。
除非另有說明，術語「烴基」還旨在包括如下更詳細定義的烴衍生物，例如「雜烴基(heteroalkyl)」。被限制為碳氫化合物基團的烴基稱為「同烴基(homoalkyl)」。
術語「亞烷基」自身或作為另一取代物的部分是指來自於烷的二價基團，如以-CH2CH2CH2CH2-(但不僅限於)為例，並還包括如下文作為「雜亞烷基」描述的那些基團。通常，烴基(或亞烷基)基團會有1到24個碳原子，本發明優選具有10或更少碳原子的那些基團。「低級烴基」或「低級亞烷基」為較短鏈的烴基或亞烷基基團，通常具有八個或更少的碳原子。
術語「烷氧基」、「烷氨基」和「烷硫基」(或硫代烷氧基)以其常規含義使用，並指各自通過氧原子、氨基或硫原子與分子剩餘部分結合的烷基。
除非另有說明，術語「雜烴基」自身或與另一術語組合是指穩定的直鏈或支鏈或環狀烴基或其組合，由所述數量的碳原子和至少一個選自O、N、Si和S的雜原子組成，其中氮和硫原子可任選地被氧化且氮雜原子可任選地被季銨化。雜原子O、N、S和Si可被置於雜烴基基團任何內部位置或烴基基團結合分子剩餘部分的位置。實例包括(但不僅限於)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多可有兩個連續雜原子，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似的，術語「雜亞烷基」自身或作為另一取代基的部分是指來自雜烴基的二價基團，如以-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-(但不僅限於)為例。對於雜亞烷基基團，雜原子也可佔據鏈末端之一或兩端(例如亞烷氧基、亞烷基雙氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基等)。另外，對於亞烷基和雜亞烷基連接基團，連接基團式的書寫方向不表示連接基團的方向。例如，式-C(O)2R』-既代表-C(O)2R＇-也代表-R′C(O)2-。
除非另有說明，術語「環烴」和「雜環烴」自身或與其他術語組合分別表示「烴基」和「雜烴基」的環狀形式。另外，對雜環烴來說，雜原子可佔據雜環與分子剩餘部分連接的位置。環烴的實例包括但不僅限於環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等。雜環烴的實例包括但不限於1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有說明，術語「滷素」自身或作為另一取代基的部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，術語如「滷烴基」旨在包括單滷烴基和多滷烴基。例如，術語「滷代(C1-C4)烴基」旨在包括(但不僅限於)三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有說明，術語「芳基」是指多不飽和的、芳香族取代基，其可為單環或相互稠合或共價連接的多環(優選1到3個環)。術語「雜芳基」是指包含一個到四個選自N、O和S的雜原子的芳香基團(或環)，其中氮和硫原子可任選地被氧化，且氮原子可任選地季銨化。雜芳基可通過雜原子附著於分子的剩餘部分。芳基和雜芳基基團的非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯並[b]呋喃基、苯[b]噻吩基、2，3-二氫苯[1，4]二氧芑-6基、苯[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基和6-喹啉基。上述各芳基和雜芳基環體系的取代基選自下述合適的取代基。
簡言之，與其他術語(例如芳氧基、arylthioxy，芳烴基)組合使用的術語「芳基」包括如上文定義的芳基和雜芳基環。因此，術語「芳烴基「旨在包括其中芳基附著於烴基基團的那些基團(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)被例如氧原子代替的烴基(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧)丙基等)。
各上述術語(例如「烴基」、「雜烴基」、「芳基」和「雜芳基」)旨在包括所指基團的取代或非取代形式。下文提供了每種類型基團的優選的取代基。
烴基和雜烴基的取代基(包括通常被稱為亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜鏈烯基、炔基、環烴、雜環烷烴、環烯基和雜環烯基)通常被稱為「烴基取代基」，且其可為一個或多個選自(但不僅限於)-OR』、＝O、＝NR』、＝N-OR』、-NR』R」、-SR』、-滷素、-SiR』R」R、-OC(O)R』-、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2的基團，數量從0到(2m』+1)，其中m』為該基團中碳原子總數量。R′、R″、R和R」」各自優選獨立的表示氫、取代或非取代的雜烴基、取代或非取代的芳基(例如1-3個滷素取代的芳基)、取代或非取代的烴基、烷氧基、或硫代烷氧基基團或芳烴基。當本發明化合物包含多於一個R基團，例如當存在超過一個這些基團時每個R基團被獨立地選擇例如各自為R′、R″、R和R」」。當R』和R」結合在同一氮原子上時，它們可與氮原子一起形成5-、6-或7-元的環。例如，-NR』R」旨在包括但不僅限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。根據上述取代基的討論，本領域技術人員將理解術語「烴基」旨在包括含有與除氫基團外基團例如滷烴基(例如-CF3和-CF2CF3)和醯基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)結合的碳原子的基團。
與烴基的取代基類似，芳基和雜芳基基團的取代基通常被稱為「芳基取代基」。該取代基選自例如滷素、-OR』、＝O、＝NR』、＝N-OR』、-NR』R」、-SR』、-滷素、-SiR』R」R、-OC(O)R』、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烴基，數量從0到芳環體系開價的總數量；且其中R′、R″、R和R」」優選的獨立選自氫、取代或非取代的烴基、取代或非取代的雜烴基、取代或非取代的芳基和取代或非取代的雜芳基。當本發明化合物包含多於一個R基團，例如當存在多於一個這些基團時每個R基團被獨立地選擇例如各自為R′、R″、R和R」」。在下面的方案中，符號X代表上述的「R」。
芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-T-C(O)-(CRR』)q-U-的取代基代替，其中T和U獨立地為-NR-、-O-、-CRR』-或單鍵，且q為從0到3的整數。或者，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨立的為-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR′-或單鍵，且r為從1到4的整數。這樣形成的新環的一個單鍵可任選地被雙鍵代替。或者，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-(CRR′)s-X-(CR」R)d-的取代基代替，其中s和d獨立地為從0到3的整數，且X為-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S-(O)2NR＇-。取代基R、R′、R″和R優選獨立選自氫或取代的或非取代的(C1-C6)烴基。
文中使用術語「雜原子」旨在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和矽(Si)。
序論如上所述，因子IX在凝血級聯繫統中是至關重要的。圖1提供了因子IX的結構和序列。體內因子IX的缺乏表徵了一種類型的血友病(B型)。該疾病的治療通常限於靜脈傳輸因子IX的人血漿蛋白濃縮物。然而，除時間和費用的實踐缺點外，傳輸血液濃縮物涉及使病人傳染病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合症或血栓栓塞性疾病的風險。
當因子IX證明其自身是治療應用的重要和有用化合物時，從重組細胞製備因子IX的現有方法(U.S.專利No.4,770,999)引起具有相當短生物學半衰期以及不準確糖基化方式的產物，該產物可能引起免疫原性、功能缺失、對達到相同效應的更大和更頻繁劑量的提高的需要等。
為了提高用於治療目的的重組因子IX的效力，本發明提供了糖基化的和非糖基化的因子IX肽與多聚體如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等的綴合物。該綴合物可另外地或可選地通過與不同種類例如治療部分、診斷部分、靶向部分等進一步綴合而被修飾。
本發明的綴合物通過修飾的糖酶促附著至糖基化或非糖基化的肽上形成。糖基化位點和糖殘基為修飾基團綴合(例如通過糖綴合)肽提供了位點。示範的修飾基團為水溶性多聚體，如聚乙二醇(例如甲氧基聚乙二醇)。因子IX肽的修飾可促進重組的因子IX在患者循環中的穩定性和滯留時間，和/或減少重組的因子IX的抗原性。
本發明的方法使得裝配具有基本上同質衍生模式的肽和糖肽成為可能。本發明中使用的酶通常對肽的特定的胺基酸殘基、胺基酸殘基組合或特定的糖基殘基具有選擇性。該方法也實用於大規模製備修飾肽和糖肽。因此，本發明的方法提供了大規模製備具有預選的均一衍生模式的糖肽的實用方法。
本發明還提供了具有提高的治療半衰期(歸功於例如降低的清除率，或降低的被免疫系統或網狀內皮系統(RES)吸收的速率)的糖基化或非糖基化肽綴合物。此外，本發明的方法提供了掩蔽肽上抗原決定簇的方法，從而降低或消除了對該肽的宿主免疫應答。也可使用靶向劑的選擇性附著以將肽靶向至對特定靶向劑特異的特定組織或細胞表面受體。
綴合物首先，本發明提供了選擇的修飾基團和因子IX肽之間的綴合物。
肽和修飾基團之間的連接包括插入肽和選定部分之間的糖基連接基團。如文中所述，選定的部分基本上是任意可附著在糖單位上，產生被合適的轉移酶(其將修飾的糖加至肽上)識別的「修飾的糖」的種類。修飾的糖的糖元件被插入肽和選定的部分之間時，成為「糖基連接基團」，例如「完整的糖基連接基團」。糖基連接基團由任何在用修飾基團修飾後成為酶(其將修飾的糖加至肽的胺基酸或糖基殘基上)底物的單糖或寡糖形成。
糖基連接基團可為，或可包括，在加入修飾基團前或加入修飾基團時被降解性修飾的糖部分。例如，糖基連接基團可衍生自糖殘基，其由完整糖例如通過偏高碘酸的作用氧化降解為相應的醛，並隨後用適當的胺轉化為席夫鹼，然後還原為相應的胺。
示範的本發明綴合物符合一般的結構 其中符號a、b、c、d和s代表正的非零整數；且t為0或正整數。「試劑」為治療劑、生物活性劑、可探測標記、水溶性部分(例如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG)等。「試劑」可為肽例如酶、抗體、抗原等。接頭可為任何廣範圍的連接基團，如下。或者，接頭可為單鍵或「零級接頭」。
在示範的實施方案中，選擇的修飾基團為水溶性多聚體如m-PEG。水溶性多聚體通過糖基連接基團共價附著在肽上。糖基連接基團共價附著於肽的胺基酸殘基或糖基殘基上。本發明還提供了胺基酸殘基和糖殘基用糖基連接基團修飾的綴合物。
示範的水溶性多聚體為聚乙二醇例如甲氧基聚乙二醇。本發明使用的聚乙二醇不受限制於任何特定的形式或分子量範圍。對於非分支的聚乙二醇分子，分子量優選在500和100,000之間。優選使用分子量2,000-60,000道爾頓且更優選從大約5,000至大約30,000道爾頓。
在另一實施方案中，聚乙二醇為含有多於一個附著的PEG部分的分支PEG。分支PEG的實例描述於U.S.專利No.5,932,462；U.S.專利No.5,342,940；U.S.專利No.5,643,575；U.S.專利No.5,919,455；U.S.專利No.6,113,906；U.S.專利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。文中公開了另外的分支多聚體種類。
在優選的實施方案中，分支PEG的各聚乙二醇分子量等於或大於大約2,000、5,000、10,000、15,000、20,000、40,000、50,000和60,000道爾頓。
除提供通過酶促加入糖基連接基團形成的綴合物外，本發明提供取代模式高度同質的綴合物。使用本發明的方法可能形成肽綴合物，其中本發明綴合物群體中基本上所有修飾的糖部分都結合在多拷貝結構一致的胺基酸或糖基殘基上。因此，另一方面，本發明提供了具有通過完整的糖基連接基團共價結合肽的水溶性多聚體部分群體的肽綴合物。在優選的本發明綴合物中，群體中基本上每個成員通過糖基連接基團結合肽糖基殘基，且糖基連接基團結合的各肽糖基殘基具有相同的結構。
還提供了具有通過糖基連接基團與之結合的水溶性多聚體部分群體的肽綴合物。在優選的實施方案中，水溶性多聚體部分群體中的基本上每個成員通過糖基連接基團結合肽的胺基酸殘基，且糖基連接基團附著的各胺基酸殘基具有相同的結構。
本發明還提供了上述綴合物的類似綴合物，其中肽通過完整的糖基連接基團綴合治療部分、診斷部分、靶向部分、毒素部分等。上述各部分可為小分子、天然多聚體(如多肽)或合成多聚體。本發明的肽包含至少一個N-或O-連接的糖基化位點，其被包括PEG部分的糖基殘基糖基化。PEG通過完整的糖基連接基團共價附著於因子IX肽。糖基連接基團共價附著於因子IX肽的胺基酸殘基或糖基殘基。或者，糖基連接基團附著於糖肽的一個或多個糖基單位。本發明還提供糖基連接基團既附著於胺基酸殘基又附著於糖基殘基的綴合物。
在示範的實施方案中，因子IX肽包含具有式
的部分。
在上式中，D選自-OH和R1-L-HN-。G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基。R1為包含直鏈或支鏈聚乙二醇殘基的部分。L為接頭，其為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的成員。因此，當D為OH時，G為R1-L-，而當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。
在一個實施方案中，R1-L具有式 其中a為0至20的整數。
在示範的實施方案中，R1具有選自 的結構，其中e和f為獨立地選自從1到2500的整數，而q為從1到20的整數。在其他實施方案中，R1具有選自
的結構，其中e、f和f』為獨立地選自從1到2500的整數，而q和q』為獨立地選自1到20的整數。
在另一實施方案中，本發明提供因子IX肽綴合物，其中R1具有選自
的結構，其中e、f和f』為獨立選自1到2500的整數；而q、q』和q』』為獨立的選自1到20的整數。
在其他實施方案中，R1具有選自 的結構，其中e和f為獨立地選自1到2500的整數。
在另一示範的實施方案中，本發明提供包含具有式 的部分的肽。該Gal可附著於胺基酸或直接或間接(例如通過糖基殘基)附著於胺基酸的糖基殘基上。
在其他實施方案中，該部分具有式
Gal可附著於胺基酸或直接或間接(例如通過糖基殘基)附著於胺基酸的糖基殘基上。
在示範的實施方案中，該結構伴隨因子IX上O-糖基化位點的糖基聚乙二醇化(圖2B)在另一示範的實施方案中，該肽包含根據式 的部分，其中AA為所述肽的胺基酸殘基，且在上述的每個結構中，D和G如文中所述。
示範的肽胺基酸殘基(一個或多個上述種類可與之綴合)包括絲氨酸和蘇氨酸，例如SEQ.ID.NO1的絲氨酸53或61或蘇氨酸159、162或172。
在另一示範的實施方案中，本發明提供包含具有式 的糖基殘基的因子IX綴合物。
其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨立地選自0和1的整數。指數q為1。指數e、f、g和h獨立地選自從0到6的整數。指數j、k、l和m為獨立地選自從0到100的整數。指數v、w、x和y獨立地選自0和1，且v、w、x和y中至少一個為1。符號AA代表因子IX肽的胺基酸殘基。
符號Sia-(R)代表具有式 的基團，其中D選自-OH和R1-L-HN-。符號G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1代表包括直鏈或支鏈聚乙二醇殘基的部分。L為接頭，其為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的成員。一般的，當D為OH時，G為R1-L-，而當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-HN-。
在另一個示範的實施方案中，在本發明的綴合物中PEG修飾的唾液酸部分具有式 其中「s」代表從0到20的整數，且n為從1到2500的整數。在選定的實施方案中，s為1而PEG為大約20kD。
在另一示範的實施方案中，PEG修飾的唾液酸具有式
其中L為連接唾液酸部分和PEG部分的取代或非取代烴基或取代或非取代的雜烴基接頭部分。
在示範的實施方案中，其中糖基殘基具有上文公開的結構，其與Asn157和Asn167的一個或二者都綴合。
因子IX已被克隆及測序。基本上具有任何序列的任何因子IX肽被作為本發明綴合物的因子IX肽組分使用。在示範的實施方案中，該肽具有SEQ ID NO1給出的序列YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT.
本發明絕非僅限於文中公開的序列。因子IX變體為本領域所熟知的，如描述於例如U.S.專利Nos.4,770,999、5,521,070(其中第一個位置的酪氨酸被丙氨酸取代)、U.S.專利No.6,037,452(其中因子XI與烯化氧基團連接)和U.S.專利No.6,046,380(其中編碼因子IX的DNA在至少一個剪接位點被修飾)。如文中所指，因子IX的變體為本領域所熟知的，且本公開內容包括這些已知的或將來將要發展的或公開的變體。
用於確定突變的或修飾的因子IX活性的方法可通過使用本領域描述的方法來實現，例如如Biggs(1972，Human Blood CoagulationHaemostasis and Thrombosis第一版，Oxford，Blackwell，Scientific，614頁)中所述的一步活化部分凝血致活酶時間實驗法。簡言之，為了測定根據本發明方法發展的因子IX分子的生物活性，該測定法可使用等體積的活化部分凝血致活酶試劑、使用本領域熟知的無菌靜脈切開放血術從血友病B患者中分離的缺乏因子IX的血漿和正常混合血漿作為標準，或樣品來完成。在該實驗中，一個單位的活性被定義為一毫升正常混合血漿中存在的數量。另外，根據因子IX將缺乏因子IX患者的血漿凝血時間降低至正常能力測定生物活性可如例如Proctor和Rapaport(Amer.J.Clin.Path.36212(1961)所述來完成。
本發明的肽包括至少一個N連接或O連接的糖基化位點，其中至少一個與包含PEG部分的糖基殘基綴合。PEG通過完整的糖基連接基團共價附著於肽。該糖基連接基團共價附著於肽的胺基酸殘基或糖基殘基。或者，糖基連接基團附著於糖肽的一個或多個糖基單位。本發明還提供綴合物，其中糖基連接基團既附著於胺基酸殘基又附著於糖基殘基。
PEG部分直接附著於完整的糖基接頭，或通過非糖基接頭(例如取代或非取代的烴基、取代或非取代的雜烴基)附著。
修飾的糖本發明使用修飾的糖和修飾的糖核苷酸以形成修飾的糖的綴合物。在本發明的修飾的糖化合物中，糖部分優選為糖、脫氧糖、氨基糖或N-醯基糖。術語「糖」及其等價物″糖基″是指單體、二聚體、寡聚體和多聚體。糖部分還用修飾基團官能化。修飾基團通常通過與糖上胺、巰基或羥基(例如伯羥基)部分綴合而綴合在糖部分上。在示範的實施方案中，修飾基團通過胺部分附著在糖上，例如通過在胺與修飾基團的活性衍生物間反應形成的醯胺、氨基甲酸乙酯或脲。
任何糖可用於本發明綴合物的糖核心。在形成本發明組合物時有用的示範的糖核心包括但不僅限於葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-氨基類似物等。糖核心可為天然存在的結構或其可被修飾以產生用於綴合修飾基團的位點。例如，在一個實施方案中，本發明提供唾液酸衍生物，其中9-羥基部分被胺代替。該胺非常容易用選擇的修飾基團的活性類似物衍生。
在示範的實施方案中，本發明利用具有式 的修飾的糖胺。其中G為糖基部分，L為鍵或接頭而R1為修飾基團。示範的鍵為糖基部分上NH2和修飾基團上互補反應性的基團之間形成的鍵。因此，示範的鍵包括(但不局限於)NHR1、OR1、SR1等。例如，當R1包含羧酸部分時，該部分可被激活並與糖基殘基上NH2部分偶聯，提供具有NHC(O)R1結構的鍵。類似的，OH和SH基團可各自轉化為相應的醚或硫醚衍生物。
示範的接頭包括烴基和雜烴基部分。接頭包括連接基團，例如以醯基為基礎的連接基團如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。連接基團為本發明種類組分之間形成的鍵，例如在糖基部分和接頭(L)之間，或接頭和修飾基團(R1)之間。其他連接基團為醚、硫醚和胺。例如，在一個實施方案中，接頭為胺基酸殘基，例如甘氨酸殘基。甘氨酸的羧酸部分通過與糖基殘基上的胺反應轉化為相應的醯胺，且甘氨酸的胺通過與修飾基團上活性羧酸或碳酸酯反應轉化為相應的醯胺或氨基甲酸乙酯。
另一個示範的接頭為PEG部分或用胺基酸殘基官能化的PEG部分。該PEG通過PEG一端的胺基酸殘基與糖基基團結合併通過另一PEG末端與R1結合。或者，胺基酸殘基結合R1而不與胺基酸結合的PEG端與糖基基團結合。
可作為NH-L-R1範例的種類有式-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNH}tR1，其中指數s和t為獨立的0或1。指數a、b和d為獨立的從0到20的整數，且c為從1到2500的整數。其他類似的接頭以其中-NH部分被另一基團例如-S、-O或-CH2代替的種類為基礎。
更具體的，本發明利用其中NH-L-R1為NHC(O)(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NH(CH2)aNHC(O)(CH2)b(OCH2CH2)cO(CH2)dNHR1、NHC(O)(CH2)aNHR1、NH(CH2)aNHR1和NHR1的化合物。在這些式中，指數a、b和d為獨立選自從0到20的整數，優選從1到5。指數c為1到2500的整數。
在下面的討論中，本發明使用選定的唾液酸衍生物進行說明。本領域技術人員將認可討論著眼於說明的清晰度且公開的結構和組成通常適用於糖基團、修飾的糖基團、有活性的修飾的糖基團和修飾的糖基團綴合物種類。
在說明性的實施方案中，G為唾液酸且本發明使用的選定的化合物具有式
如本領域技術人員將理解的，上面示範的化合物中唾液酸部分可用任何其他的氨基糖代替，包括但不局限於葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、它們的N-乙醯基衍生物等。
在另一說明性的實施方案中，糖的伯羥基部分用修飾基團官能化。例如，唾液酸的9-羥基可轉化為相應的胺並官能化以產生本發明的化合物。根據該實施方案的通式包括 在另一示範的實施方案中，本發明利用修飾的糖，其中6-羥基的位置轉化為相應的胺部分，該部分帶有例如上面公開的接頭-修飾基團盒。可作為這些修飾的糖的核心的示範的糖基團包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根據該實施方案代表性的修飾的糖具有式
其中R3-R5和R7為獨立選自H、OH、C(O)CH3、NH和NHC(O)CH3的成員。R6為如上所述的OR1、NHR1或NH-L-R1。
本發明使用的選定的綴合物基於甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或基於具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立體化學的種類。這些化合物的通式為 在另一示範的實施方案中，本發明利用如上公開的活化為相應的核苷酸糖的化合物。本發明使用的示範的糖核苷酸的修飾形式包括核苷酸單、雙或三磷酸或其類似物。在優選的實施方案中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更優選地，修飾的糖核苷酸的糖核苷酸部分選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示範的實施方案中，核苷酸磷酸附著於C-1。
因此，在糖基部分為唾液酸的說明性的實施方案中，本發明利用具有式
的化合物。其中L-R1如上所述，且L1-R1代表結合修飾基團的接頭。如同L，根據L1的示範的接頭類型包括鍵、烴基或雜烴基部分。根據這些實施方案，示範的修飾的糖核苷酸化合物在圖7和圖8中公開。
在另一示範的實施方案中，本發明提供本發明修飾的糖和底物因子IX肽之間形成的綴合物。在該實施方案中，修飾的糖的糖部分成為底物和修飾基團間的糖基連接基團。示範的糖基連接基團為完整的糖基連接基團，其中形成連接基團的糖基部分不被化學(如偏高碘酸鈉)或酶(如氧化酶)降解。本發明選定的綴合物包含結合在氨基糖(例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修飾基團。根據該基序的示範的修飾基團-完整的糖基連接基團盒基於唾液酸結構，例如具有式 的那些。
在上式中，L1和R1如上所述。
在另一示範的實施方案中，綴合物在底物因子IX和糖部分之間形成，其中修飾基團通過糖基部分6-碳位置的接頭附著。因此，根據該實施方案的說明性的綴合物具有式 其中基團如上所述。技術人員將理解上面公開的修飾的糖部分還可通過2、3、4、或5碳原子上的氧或氮原子與底物綴合。
該實施方案中使用的說明性化合物包括具有式 的化合物，其中R基團和指數如上所述。
本發明還提供了用L-R1在6-碳位置修飾的糖核苷酸用途。根據本實施方案的示範的種類包括
其中R基團和L代表上述部分。指數「y」為0、1或2。
本發明使用的另一示範的核苷酸糖基於具有GDP甘露糖立體化學的種類。根據本實施方案示範的種類有結構 在另一示範的實施方案中，本發明提供了綴合物，其中修飾的糖基於UDP半乳糖的立體化學。本發明使用的示範的核苷酸糖有結構
在另一示範的實施方案中，核苷酸糖基於葡萄糖的立體化學。根據本實施方案的示範的種類有式 修飾基團R1為許多種類例如水溶性多聚體、水不溶性多聚體、治療劑、診斷劑等中之任一。示範的修飾基團性質在下文更詳細地描述。
修飾基團水溶性多聚體許多水溶性多聚體為本領域技術人員已知，並在實踐本發明中有用。術語水溶性多聚體包括例如糖(例如葡聚糖、直鏈澱粉、透明質酸、聚唾液酸、類肝素、肝素等)、聚胺基酸(例如聚天冬氨酸和聚穀氨酸)、核酸、合成聚合體(如聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇)、肽、蛋白質等種類。本發明可應用任何水溶性多聚體，唯一的限制為該多聚體必須包含綴合物剩餘部分可與之綴合的位點。
活化多聚體的方法還可見WO 94/17039、U.S.專利No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193，U.S.專利No.5,219,564、U.S.專利No.5,122,614、WO 90/13540、U.S.專利No.5,281,698以及WO 93/15189，且關於活化的多聚體和肽例如凝血因子VIII(WO94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、氧載體分子(U.S.專利No.4,412,989)核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
優選的水溶性多聚體為多聚體樣品中大部分多聚體分子有大致相同的分子量；這樣的多聚體為″單分布的(homodisperse)″。
還通過聚乙二醇綴合物說明了本發明。可獲得若干關於PEG官能化和綴合的綜述和專題文章。見例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology，13530-65(1987)；Wong等，EnzymeMicrob.Technol.14866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等，Pharmazie，575-29(2002)。製備反應性PEG分子並使用反應性分子形成綴合物的途徑為本領域已知。例如U.S.專利No.5,672,662公開了選自線性或分支聚環氧烷、聚(氧乙基化的多元醇)、聚烯醇和聚烯丙醯嗎啉的多聚體酸的活性酯的水溶性且可分離的綴合物。
U.S.專利No.6,376,604公開了通過將多聚體的末端羥基與雙(1-苯三唑基碳酸酯)在有機溶劑中反應製備水溶性且非肽多聚體的水溶性1-苯三唑基碳酸酯的方法。該活性酯用於與生物活性劑例如蛋白質或肽形成綴合物。
WO 99/45964描述了包含生物活性劑和活性水溶性多聚體的綴合物，其包含的多聚體主鏈有至少一個末端與多聚體主鏈通過穩定鍵連接，其中至少一個末端含有具有與分支部分連接的近端反應基團的分支部分，其中生物活性劑與至少一個近端反應基團連接。其他分支聚乙二醇描述於WO 96/21469、U.S.專利No.5,932,462描述了由包含含有反應官能團的分支末端的分支PEG分子形成的綴合物。自由反應基團能夠與生物活性種類例如蛋白質或肽反應，形成聚乙二醇和生物活性種類間的綴合物。U.S.專利No.5,446,090描述了雙功能PEG接頭及其在形成PEG接頭兩端均有肽的綴合物中的用途。
包含可降解PEG鍵的綴合物描述於WO 99/34833；和WO 99/14259，以及U.S.專利No.6,348,558。這些可降解鍵適用於本發明。
在本發明上下文中，在文中公開的分支多聚體的形成和這些分支多聚體與其他種類例如糖、糖核苷酸等綴合中使用上面公開的本領域公認的多聚體活化方法。
本發明中使用的示範的聚乙二醇分子包括但不僅限於具有式 的聚乙二醇分子。其中R8為H、OH、NH2、取代或未取代的烴基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烴基、取代或未取代的雜烴基，例如縮醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q、或-(CH2)qC(Y)Z1。指數「e」表示從1到2500的整數。指數b、d和q獨立地表示從0到20的整數。符號Z和Z1獨立的表示OH、NH2、離去基團例如咪唑、對硝基苯基、HOBT、四唑、滷化物、S-R9、活性酯類的醇部分；-(CH2)pC(Y1)V或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符號Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符號X、Y、Y1、A1和U獨立的表示部分O、S、N-R11。符號V表示OH、NH2、滷素、S-R12、活性酯類的醇部分、活性醯胺的胺部分、糖核苷酸和蛋白質。指數p、q、s和v為獨立地選自0到20整數的成員。符號R9、R10、R11和R12獨立地表示H、取代或未取代的烴基、取代或未取代的雜烴基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環烴基和取代或未取代的雜芳基。
在另一示範的實施方案中，聚乙二醇分子選自下面
在形成本發明綴合物中有用的聚乙二醇可為線性或分支的。適用於本發明用途的分支聚乙二醇分子包括但不僅限於下式所述的 其中R8和R8』獨立地選自上文定義為R8的基團。A1和A2獨立地選自上文定義為A1的基團。指數e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X1和X1』獨立的選自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH。
在其他示範的實施方案中，分支PEG基於半胱氨酸、絲氨酸和雙賴氨酸核心。因此，更多的示範的分支PEG包括
在另一實施方案中，分支PEG部分基於三賴氨酸肽。該三賴氨酸可被單、雙、三或四PEG化。根據該實施方案示範的種類具有式 其中e、f和f』獨立地選自從1到2500的整數；且q、q』和q」獨立選自從1到20的整數。
在本發明示範的實施方案中，PEG為m-PEG(5kD、10kD、15kD、20kD或30kD)。示範的分支PEG種類為絲氨酸或半胱氨酸-(m-PEG)2，其中m-PEG為20KD的m-PEG。
如技術人員將理解的，本發明使用的分支多聚體包括上文公開的主題的變體。例如上面所示雙賴氨酸-PEG綴合物可包含三個聚合的亞基，第三個結合在上文結構中顯示未修飾的α-胺上。類似地，用三個或四個聚合的亞基官能化的三賴氨酸的應用在本發明範圍內。
本發明使用的另外的示範的種類包括
和這些種類的碳酸酯及活性酯，例如 其他適合於活化製備文中公開的化合物時使用的線性PEG的活化基團或離去基團包括，但不僅限於種類
被這些和其他種類活化的PEG分子和製造活化的PEG的方法在WO04/083259中公開。
本領域技術人員將理解分支多聚體的一個或多個m-PEG臂可被具有不同末端例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烴基等的PEG部分替代。另外，上述結構容易通過在α-碳原子和「胺基酸」側鏈官能團之間插入烴基接頭(或去除碳原子)而被修飾。因此，「同系」衍生物及高級同系物，以及低級同系物為本發明使用的分支PEG的有用「胺基酸」核心。
文中公開的分支PEG種類通過例如下面方案公開的方法可容易地製備 其中Xa為O或S且r為從1到5的整數。參數e和f為從1到2500的獨立選擇的整數。
因此，根據該方案，天然或非天然的胺基酸與活性m-PEG衍生物接觸(在本情況下為甲苯磺酸酯)，通過烷化側鏈雜原子Xa而形成1。單官能化的m-PEG胺基酸與活性m-PEG衍生物處於N-醯化條件下，從而組合成分支m-PEG2。如技術人員會理解的，甲苯磺酸離去基團可用任何合適的離去基團代替，例如滷素、甲磺酸、三氟甲基磺酸酯等。類似的，用於醯化胺的反應性碳酸酯可用活性酯例如N-羥基琥珀醯亞胺等代替，或該酸可用脫水劑如二環己基碳二亞胺、羰二咪唑等原位活化。
在示範的實施方案中，修飾基團為PEG部分，然而，任何修飾基團(如水溶性多聚體、水不溶性多聚體、治療部分等)可通過適當的鍵被整合進糖基部分。修飾的糖通過酶方法、化學方法或其組合形成，從而產生修飾的糖。在示範的實施方案中，糖在任何允許修飾基團結合併仍然允許糖作為能夠將修飾的糖與肽偶合的酶的底物的位點用活性胺取代。在示範的實施方案中，當半乳糖胺為修飾的糖時，胺部分在6-位附著於碳原子。
水溶性多聚體修飾的種類本發明使用水溶性多聚體修飾的核苷酸糖種類，其中糖部分用水溶性多聚體修飾。示範的修飾的糖核苷酸帶有通過糖上胺部分修飾的糖基團。修飾的糖核苷酸例如糖核苷酸的糖基胺衍生物在本發明的方法中也是有用的。例如(無修飾基團的)糖基胺可與肽(或其他種類)酶促綴合且游離的糖基胺部分隨後與所需的修飾基團綴合。另外，修飾的糖核苷酸可作為將修飾糖轉移至底物(例如肽、糖肽、脂類、苷元(aglycone)、糖脂等)上糖基受體的酶的底物。
在一個實施方案中，糖核心為半乳糖或葡萄糖，R5為NHC(O)Y。
在示範的實施方案中，修飾的糖基於6-氨基-N-乙醯基-糖部分。如下所示關於N-乙醯半乳糖胺，6-氨基-糖部分通過標準方法容易製得。
在上圖中，指數n表示從1到2500的整數，優選從10到2500，並更優選從10到1200。符號「A」表示活化基團，例如滷素、活性酯(例如N-羥基琥珀醯亞胺酯)的組分、碳酸酯(對硝基苯基碳酸酯)的組分等。本領域技術人員會理解，其他PEG-醯胺核苷酸糖通過該方法及類似方法可容易製得。
在其他示範的實施方案中，醯胺部分被基團例如氨基甲酸乙酯或尿素代替。
在另一實施方案中，R1為分支PEG，例如上文公開的種類之一。根據本實施方案的說明性化合物包括
其中X4為鍵或O。
另外，如上所討論的，本發明提供用水溶性多聚體修飾的核苷酸糖，其可為直鏈或分支的。例如，有下示式的化合物在本發明範圍內
其中X4為鍵或O。
類似的，本發明提供那些修飾的糖種類的核苷酸糖，其中6-位碳被修飾 其中X4為O或鍵。
還提供了包含本發明組成的肽和糖肽、脂和糖脂的綴合物。例如，本發明提供了有下式的綴合物
水不溶性多聚體在另一實施方案中，與上面所討論的類似，修飾的糖包括水不溶性多聚體而非水溶性多聚體。本發明的綴合物也可以包括一個或多個水不溶性多聚體。本發明的本實施方案通過綴合物作為以受控方式投送治療肽的載體的用途進行說明。多聚體藥物投送系統為本領域已知。參閱如Dunn等編輯，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS》，ACS Symposium Series 469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本領域技術人員會理解，基本上所有已知的藥物投送系統都可應用於本發明的綴合物。
代表性水不溶性多聚體包括但不僅限於polyphosphazines、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、聚亞烷基、聚丙烯醯胺、聚亞烷基二醇、聚環氧烷、聚亞烷基對苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚滷乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚矽氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚異丁烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚異丁烯酸己酯、聚異丁烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚異丁烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對苯二酸乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯苯酚及其共聚物。
可用於本發明綴合物的合成修飾的天然多聚體包括但不僅限於烴基纖維素、羥烴基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。多種合成修飾的天然多聚體中特別優選的成員包括但不僅限於甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽和丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的多聚體。
本文中討論的這些和其他多聚體可以便利地從商業來源如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)獲得，或使用標準技術從這些供應商處獲得的單體合成。
可用於本發明綴合物的代表性可生物降解多聚體包括但不僅限於聚乳酸交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物，聚對苯二酸乙酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己內酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，如含有膠原、pluronics等等的那些。
可用於本發明的多聚體包括含有水不溶性物質的「雜合」多聚體，所述水不溶性物質在其結構的至少一部分中具有可生物再吸收分子。這些多聚體的實例為含有水不溶性共聚物的多聚體，所述共聚物的每條多聚體鏈具有可生物再吸收區、親水區和多個可交聯官能團。
就本發明而言，「水不溶性物質」包括基本不溶於水或含水環境的物質。因此，儘管共聚物的某些區域或片段可能是親水的或甚至是水溶性的，多聚體分子整體在水中無任何顯著程度的溶解。
就本發明而言，術語「可生物再吸收分子」含有能夠代謝或降解並被身體再吸收和/或通過正常排洩途徑排出的區域。該代謝產物或降解產物優選基本上對身體無害的。
只要共聚物組合物整體不是水溶性的，可生物再吸收區可以是疏水的或親水的。因此，基於使多聚體整體保持水不溶性來選擇可生物再吸收區。因此，選擇相對特性(即所含有的官能團種類、可生物再吸收區的相對比例和親水區)以保證有用的可生物再吸收組合物保持為水不溶性。
示範的可再吸收多聚體包括如合成產生的聚α-羥基羧酸/聚氧化烯的可再吸收嵌段共聚物(參閱Cohn等，U.S.專利No.4,826,945)。這些共聚物無交聯且為水溶性，從而身體可以排洩降解的嵌段共聚物組分。參閱Younes等，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)和Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優選的可生物再吸收多聚體包括一個或多個選自以下的組分聚酯、聚羥酸、聚內酯、聚醯胺、聚酯-醯胺、聚胺基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、poly(phosphazines)、聚磷酸酯、聚硫代酯、多糖及其混合物。更優選的可生物再吸收多聚體包括聚羥酸組分。在聚羥酸中，優選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。
除了形成體內可吸收(「生物再吸收」)的片段以外，可用於本發明方法的優選多聚體包衣還可形成可排洩和/或可代謝的片段。
本發明中還可以使用高級共聚物。例如1984年3月20日公布的Casey等，U.S.專利No.4,438,253公開了從聚乙醇酸和羥基末端的聚亞烷基二醇的酯交換作用產生的三嵌段共聚物。這些組合物用於可再吸收的單絲縫合線。通過向共聚物結構中摻入原碳酸芳香酯如原碳酸-4-對甲苯酯來控制這些組合物的柔性。
還可以使用基於乳酸和/或乙醇酸的其他多聚體。例如1993年4月13日公布的Spinu的U.S.專利No.5,202,413公開了具有聚乳酸和/或聚乙醇酸交酯連續嵌段的可生物降解多嵌段共聚物，通過將丙交酯和/或乙交酯開環聚合到二醇寡聚體或二氨殘基、接著用雙功能化合物如二異氰酸酯、二醯氯或二氯矽烷進行鏈延伸來產生所述嵌段共聚物。
可以將可用於本發明的包衣的可生物再吸收區設計成可水解和/或酶切割的。就本發明而言，「可水解切割」指共聚物特別是可生物再吸收區在水或含水環境中對水解的敏感性。類似的，本文所使用的「可酶切割」指共聚物特別是可生物再吸收區對內源或外源酶切割的敏感性。
置於身體中時，親水區可以加工成可排洩和/或可代謝片段。因此，親水區可以包括如聚醚、聚環氧烷、多元醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烴基唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質及其共聚物和混合物。另外，親水區還可以是如聚環氧烷。這些聚環氧烷可以包括如聚環氧乙烷、聚環氧丙烷及其混合物和共聚物。
是水凝膠組分的多聚體也可用於本發明。水凝膠是能夠吸收相對大量水的聚合物質。形成水凝膠的化合物實例包括但不僅限於聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉菜膠和其他多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)及其衍生物等等。可以產生穩定、可生物降解和可生物再吸收的水凝膠。另外，水凝膠組合物可以包含表現一種或多種這些特性的亞基。
可通過交聯控制完整性的生物相容的水凝膠組合物是已知的，並優選用於本發明的方法。例如Hubbell等，1995年4月25日公布的U.S.專利No.5,410,016和1996年6月25日公布的5,529,914公開了為交聯的嵌段共聚物的水溶性系統，所述嵌段共聚物具有夾在兩個易水解延長部分中的水溶性中心嵌段片段。這些共聚物由可光聚合的丙烯酸酯官能團進一步末端加帽。在交聯時，這些系統成為水凝膠。這些共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚乙二醇，而易水解延伸部分可以是聚α-羥酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。參閱Sawhney等，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一優選實施方案中，凝膠為熱可逆凝膠。目前優選包含如pluronics、膠原、明膠、透明質酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝膠、尿素-聚氨基甲酸酯水凝膠及其組合的熱可逆凝膠。
在另一實施方案中，本發明的組合物包含脂質體組分。可以根據本領域技術人員已知的方法製備脂質體，如1985年6月11日公布的Eppstein等，U.S.專利No.4,522,811中所述。例如，脂質體製劑的製備可以通過將合適的脂質(如硬脂醯磷脂醯乙醇胺、硬脂醯磷脂醯膽鹼、花生醯磷脂醯膽鹼和膽固醇)溶於無機溶劑中，隨即蒸發溶劑，在容器表面留下幹脂質的薄膜。然後向容器中引入活性化合物或其可藥用鹽的水溶液。然後用手旋動以從容器表面釋放脂質物質並分散脂質聚集體，從而形成脂質體懸液。
上述微粒和製備微粒的方法用於舉例，並無意用於限定可用於本發明的微粒的範圍。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，用不同方法製備的一系列的微粒都可用於本發明。
在上文水溶性多聚體的上下文中討論的結構形式(直鏈和分支)一般也可用於水不溶性多聚體。因此，例如可以用兩個水不溶性多聚體部分使半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸分支核心官能化。用於產生這些種類的方法一般與用於產生水溶性多聚體的方法非常相似。
可以通過選擇化學劑量、可用糖基化位點的數目、選擇對特定位點具有選擇性的酶等等控制綴合物中PEG取代的程度(圖2F)。糖基PEG化的因子IX種類相對於未標記的因子IX表現出增強的循環半衰期(圖3、圖6)。
方法除了上文討論的綴合物以外，本發明提供製備這些及其他綴合物的方法。另外，本發明提供通過對具有發生疾病的風險的受試者或患病的受試者施用本發明的綴合物來預防、治療或改善疾病狀態的方法。
因此，本發明提供在所選擇部分和因子IX肽之間形成共價綴合物的方法。
在示範的實施方案中，在水溶性多聚體、治療部分、靶向部分或生物分子和糖基化或非糖基化的因子IX肽之間形成綴合物。多聚體、治療部分或生物分子通過糖基連接基團與肽綴合，所述糖基連接基團插入肽和修飾基團(如水溶性多聚體)之間並與二者共價連接。該方法包括將肽與含有修飾的糖和將修飾的糖與底物(如肽、苷元、糖脂)綴合的酶(如糖基轉移酶)的混合物接觸。在適於在修飾的糖和因子IX肽間形成共價鍵的條件下進行反應。
受體因子IX肽一般從新合成，或在原核細胞(如細菌細胞如大腸桿菌)或真核細胞如哺乳動物、酵母、昆蟲、真菌或植物細胞中重組表達。肽可以是全長蛋白質或片段。另外，肽可以是野生型或突變的肽。在示範的實施方案中，肽包含在肽序列中加入或去除一個或多個N-或O-連接糖基化位點的突變。
在示範的實施方案中，按以下方式使因子IX O-糖基化並用水溶性多聚體官能化。將肽產生為具有可用的胺基酸糖基化位點，或者如果肽是糖基化的，切除糖基部分以暴露胺基酸。例如，α-1N-乙醯氨基半乳糖基化(GalNAc)絲氨酸或蘇氨酸，並使用ST6GalNAcT1用唾液酸-修飾基團盒使NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化。或者，用核心-GalT-1使NAc-半乳糖基化的肽半乳糖基化，並使用ST3GalT1用唾液酸-修飾基團盒使產物唾液酸化。本方法的示例綴合物具有以下鍵Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia*，其中Sia*為唾液酸-修飾基團盒。
在使用多種酶和糖基供體的本發明的方法中(如上文所公開)，單獨的糖基化步驟可分別進行，或者在「單釜」反應中組合。例如，在上文公開的三個酶的反應中，GalNAc轉移酶、GalT和SiaT及其供體可以在一個容器中組合。或者，可以單獨進行GalNAc反應，並作為單一的步驟加入GalT和SiaT及適當的糖基供體。進行反應的另一種模式涉及依次加入每種酶及適當的供體，並以「單釜」模式進行反應。上文公開的每種方法的組合也可用於製備本發明的化合物。
在本發明的綴合物中，特別是糖基聚乙二醇化的N-連接聚糖中，唾液酸-修飾基團盒可以以α-2，6或α-2，3鍵與Gal連接。
本發明的方法還提供重組產生的不完全糖基化因子IX肽的修飾。在本發明方法中使用修飾的糖可以使肽同時發生進一步的糖基化和用如水溶性多聚體、治療劑等等進行衍生。修飾的糖的糖部分可以是與完全糖基化的肽中的受體綴合的殘基，或者具有所需特性的其他糖部分。
可用於本發明的修飾肽的示範的方法公開於WO 04/099231、WO03/031464以及其中公開的參考文獻。
在示範的實施方案中，本發明提供產生含有部分 的PEG化因子IX，其中D為-OH或R1-L-HN-。符號G代表R1-L-或-C(O)(C1-C6)烴基。R1是含有直鏈或分支聚乙二醇殘基的部分。符號L代表選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭。通常當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。本發明的方法包含(a)使底物因子IX肽與PEG-唾液酸供體以及能夠將PEG-唾液酸部分從供體轉移到底物因子IX肽的酶相接觸。
示範的PEG-唾液酸供體為例如具有式 的核苷酸糖，以及在適於轉移的條件下將PEG-唾液酸轉移到因子IX肽的胺基酸或糖基殘基上的酶。
在一個實施方案中，在形成本發明的綴合物以前在宿主細胞中表達底物因子IX肽。示範的宿主細胞為哺乳動物細胞。在其他實施方案中，宿主細胞為昆蟲細胞、植物細胞、細菌或真菌。
本文所述方法可用於上文章節公開的每種因子IX綴合物。
通過本發明方法修飾的因子IX肽可以是合成或野生型肽，或者可以是通過本領域已知的方法如定點誘變產生的突變肽。肽的糖基化一般是N-連接或O-連接。示範的N-連接為將修飾的糖附著於天冬醯胺殘基側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X為除脯氨酸以外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促附著於天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中存在的所述其中任一種三肽序列產生可能的糖基化位點。O-連接糖基化指一個糖(如N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)附著於羥基胺基酸的羥基側鏈，所述羥基胺基酸優選絲氨酸或蘇氨酸，儘管也可以使用不常見或非天然胺基酸如5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
可以通過改變胺基酸序列在肽或其他結構中便利地加入糖基化位點，以使其含有一個或多個糖基化位點。可以通過在肽序列內摻入一個或多個含有-OH基團的種類(優選絲氨酸或蘇氨酸殘基)來進行添加(以獲得O-連接糖基化位點)。也可以通過肽的突變或完全化學合成來進行添加。優選通過DNA水平的變化改變肽的胺基酸序列，特別是通過在預選的鹼基處突變編碼肽的DNA，從而產生將翻譯成所需胺基酸的密碼子。優選通過本領域已知的方法進行DNA突變。
在示範的實施方案中，通過改組多核苷酸加入糖基化位點。可以用DNA改組實驗流程調控編碼候選肽的多核苷酸。DNA改組是遞歸重組和突變的方法，通過隨機片段化相關基因庫並接著用與聚合酶鏈式反應類似的方法重新組裝片段來實施。參閱如Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)和U.S.專利No.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
加入或去除糖基化位點和加入或去除糖基結構或亞結構的示範的方法在WO 04/099231、WO 03/031464及相關U.S.和PCT申請中有詳細描述。
本發明還使用在因子IX肽中加入(或去除)一個或多個選定的糖基殘基的方法，其後使修飾的糖與肽中至少一個選定的糖基殘基綴合。例如當需要使修飾的糖與因子IX肽中不存在或不以所需的量存在的糖基殘基綴合時，可以使用該技術。因此，在使修飾的糖與肽偶聯之前通過酶或化學偶聯使選定的糖基殘基與肽綴合。在另一實施方案中，在綴合修飾的糖之前通過從糖肽中去除碳水化合物殘基來改變糖肽的糖基化模式。參閱如WO 98/31826。例如在使用PEG修飾的唾液酸進行糖基PEG化之前，可以從因子IX中去除唾液酸基團以形成無唾液酸的因子IX(圖2E)。
選定的糖基殘基的示範的附著點包括但不僅限於(a)N-連接糖基化的共有位點和O-連接糖基化的位點；(b)是糖基轉移酶受體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬醯胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基，如半胱氨酸中的那些；(f)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或色氨酸中的游離羥基；(g)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳族殘基或(h)穀氨醯胺的醯胺基。可用於本發明的示範的方法描述於1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，259-306頁(1981)。
使PEG修飾的糖與糖基化或非糖基化的肽綴合，使用適當的酶介導綴合。優選地，選擇修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度以使糖基化進行到直至將受體消耗盡。在唾液酸轉移酶上下文中公開的以下考慮的因素通常可用於其他糖基轉移酶反應。
已知大量使用糖基轉移酶合成所需寡糖結構的方法並通常可用於本發明。示例方法描述於例如本文引入作為參考文獻的WO 96/32491、Ito等，Pure Appl.Chem.65753(1993)、U.S.專利No.5,352,670、5,374,541、5,545,553和共同所有的U.S.專利No.6,399,336和6,440,703。
本發明使用單種糖基轉移酶或糖基轉移酶組合實施。例如，可以使用唾液酸轉移酶和半乳糖轉移酶的組合。在使用多於一種酶的實施方案中，優選在起始反應混合物中組合酶和底物，或者在第一個酶反應完成或接近完成時向反應介質中加入第二個酶反應的酶和試劑。通過在一個容器中依次進行兩個酶反應，與分離中間產物的程序相比提高了總產率。另外，清除並處理額外的溶劑和副產品的需求減少了。
在優選的實施方案中，第一種和第二種酶均為糖基轉移酶。在另一優選的實施方案中，一種酶為內切糖苷酶。在另外的優選實施方案中，使用兩種以上的酶裝配本發明的修飾的糖蛋白。在向肽中加入修飾的糖之前或之後任意時刻使用酶改變肽的糖結構。
在另一實施方案中，本方法使用一種或多種糖苷外切酶或內切酶。糖苷酶一般是經設計以形成而非破壞糖基鍵的突變體。突變體聚糖酶一般包含活性位點酸性胺基酸殘基被胺基酸殘基取代。例如當內切聚糖酶為endo-H時，取代的活性位點殘基一般為130位置的天冬氨酸、132位置的穀氨酸或其組合。該胺基酸一般被絲氨酸、丙氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺取代。
突變體酶一般通過與內切聚糖酶水解步驟的逆反應相似的合成步驟催化反應。在這些實施方案中，糖基供體分子(如所需的寡或單糖結構)含有離去基團，通過將供體分子加到蛋白質的GlcNAc殘基上進行反應。例如，離去基團可以是滷素如氟。在其他實施方案中，離去基團為Asn或Asn-肽部分。在其他實施方案中，修飾了糖基供體分子上的GlcNAc殘基。例如GlcNAc殘基可以含有1，2唑啉部分。
在優選的實施方案中，用於產生本發明綴合物的每種酶均以催化量存在。具體酶的催化量根據該酶底物的濃度以及反應條件(如溫度、時間和pH值)而改變。在預選的底物濃度和反應條件下確定給定酶的催化量的方法為本領域技術人員所熟知。
進行上述方法的溫度的範圍可以從剛高於冰點到最敏感的酶變性的溫度。優選的溫度範圍為從約0℃到約55℃，並更優選約20℃到約37℃。在另一示範的實施方案中，使用嗜熱酶在提高的溫度下進行本方法的一個或多個部分。
使反應混合物保持足以使受體糖基化的一段時間，從而形成所需的綴合物。一些綴合物常常可以在若干小時後檢測到，通常在24小時或更短時間內得到可回收的量。本領域技術人員會理解，反應速率取決於可對選定的系統進行優化的多種因素(如酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)。
本發明還提供修飾的肽的工業規模生產。本文使用的工業規模一般產生至少250mg、優選至少500mg並更優選至少1g純化的最終綴合物。
在下文的討論中，通過將修飾的唾液酸部分綴合到糖基化肽來示例本發明。用PEG標記示範的修飾的唾液酸。下文關於PEG修飾的唾液酸和糖基化肽的集中討論是為了說明的清晰性，而不意味著本發明僅限於這兩種配偶體的綴合物。技術人員會理解，本討論可以普遍應用於加入唾液酸以外的修飾的糖基部分。另外，本討論同樣可以應用於用PEG以外的試劑(包括其他PEG部分、治療部分和生物分子)修飾糖基單位。
可以使用酶促方法將PEG化或PPG化碳水化合物選擇性引入肽或糖肽。該方法使用含有PEG、PPG或被屏蔽的反應性官能團的修飾的糖，並與適當的糖基轉移酶或糖合酶組合。通過選擇產生所需碳水化合物鍵並使用修飾的糖作為供體底物的糖基轉移酶，可以將PEG或PPG直接引入肽骨架，引入糖肽中原有的糖殘基或引入加入至肽中的糖殘基。
唾液酸轉移酶的受體以天然存在的結構或重組、酶或化學方法放置的結構存在於待用本發明方法修飾的肽中。合適的受體包括如半乳糖受體如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本領域技術人員已知的其他受體(參閱如Paulson等，J.Bio.Chem.2535617-5624(1978))。
在一個實施方案中，唾液酸轉移酶的受體通過糖肽的體內合成存在於待用本發明方法修飾的糖肽上。可以不預先修飾糖肽的糖基化模式而使用所述的方法將這些糖肽唾液酸化。或者，本發明的方法可以用於唾液酸化不含有適當受體的肽；首先通過本領域技術人員已知的方法修飾肽使其含有受體。在示範的實施方案中，通過GalNAc轉移酶的作用加入GalNAc殘基。
在示範的實施方案中，通過將半乳糖殘基附著於與肽相連的適當受體(如GlcNAc)來裝配半乳糖受體。該方法包括將待修飾的肽與含有適當量的半乳糖基轉移酶(如Galβ1，3或Galβ1，4)和適當的半乳糖供體(如UDP-半乳糖)的反應混合物孵育。使反應基本完成或者在加入預選量的半乳糖殘基時中止反應。裝配選定的糖受體的其他方法對本領域技術人員是顯而易見的。
在另一實施方案中，首先整體或部分「剪切」與糖肽連接的寡糖，以暴露糖基轉移酶受體或可以加入一個或多個適當殘基以得到適當受體的部分。附著和剪切反應中可以使用酶如糖基轉移酶和內切糖苷酶(參閱如U.S.專利No.5,716,812)。
在以下討論中，通過具有附著的PEG部分的修飾的糖示例本發明的方法。討論著眼於說明的清晰性。技術人員會理解，本討論同樣與修飾的糖帶有治療部分、生物分子等等的實施方案相關。
在加入修飾的糖之前預先「剪切」碳水化合物殘基的本發明示例實施方案中，將高級甘露糖「剪回」第一級雙觸角結構。將帶有PEG部分的修飾的糖與通過「剪回」暴露的一個或多個糖殘基綴合。在一個實施例中，通過與PEG部分綴合的GlcNAc部分加入PEG部分。修飾的GlcNAc附著於雙觸角結構末端甘露糖殘基中的一個或兩個。或者，未修飾的GlcNAc可以加入分支種類的一個或兩個末端。
在另一實施方案中，通過具有半乳糖殘基的修飾的糖將PEG部分加至雙觸角結構的一個或兩個末端甘露糖殘基，所述修飾的糖與加至末端甘露糖殘基的GlcNac殘基綴合。或者，可以在一個或兩個末端GlcNAc殘基中加入未修飾的Gal。
在另一實施例中，使用修飾的唾液酸將PEG部分加至Gal殘基。
在另一示範的實施方案中，將高級甘露糖結構「剪回」至雙觸角結構從中所分支出的甘露糖。在一個實施例中，通過用多聚體修飾的GlcNAc加入PEG部分。或者，將未修飾的GlcNAc加至甘露糖，接著加入帶有附著的PEG部分的Gal。在另一實施方案中，依次將未修飾的GlcNAc和Gal加至甘露糖，接著加入用PEG部分修飾的唾液酸部分。
在另一實施方案中，將高級甘露糖「剪回」至附著第一個甘露糖的GlcNAc。將GlcNAc與帶有PEG部分的Gal殘基綴合。或者，將未修飾的Gal加至GlcNAc，接著加入用水溶性糖修飾的唾液酸。在另一實施方案中，末端GlcNAc與Gal綴合，接著用帶有PEG部分的修飾的巖藻糖將GlcNAc藻糖化。
還可以將高級甘露糖(high mannose)剪回至附著於肽的Asn的第一個GlcNAc。在一個實施例中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc與帶有水溶性多聚體的GlcNAc綴合。在另一實施例中，用帶有水溶性多聚體的Gal修飾GlcNAc-(Fuc)a的GlcNAc。在另一實施方案中，用Gal修飾GlcNAc，接著與用PEG部分修飾的唾液酸的Gal綴合。
另一示範的實施方案公開於共同所有的U.S.專利申請出版物20040132640、20040063911、20040137557、U.S.專利申請No10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/410,945和PCT/US02/32263，均在本文中引入作為參考文獻。
上文公開的實施例提供對本文所公開方法能力的說明。使用本文所述的方法可以「剪回」和建立基本任何所需結構的碳水化合物殘基。可以如上文所公開將修飾的糖加至碳水化合物部分的末端，或者可以插入肽核心和碳水化合物的末端之間。
在示範的實施方案中，使用唾液酸酶從因子IX糖肽中去除原有的唾液酸，從而暴露全部或多數下面的半乳糖殘基。或者，用半乳糖殘基或者具有半乳糖單位末端的寡糖殘基標記肽或糖肽。暴露或加入半乳糖殘基之後，使用適當的唾液酸轉移酶加入修飾的唾液酸。本方法概述於方案1。
方案1 在概括於方案2的另一方法中，在唾液酸上存在屏蔽的反應官能團。屏蔽的反應基團優選未被用於將修飾的唾液酸附著到因子IX的條件影響。在將修飾的唾液酸共價附著於肽之後，去除屏蔽並使肽與試劑如PEG綴合。試劑通過其與修飾的糖殘基的未屏蔽反應基團的反應以特異性方式與肽綴合。
方案2
取決於糖肽寡糖側鏈的末端糖(表1)，本文公開的任何修飾的糖可以與其適當的糖基轉移酶一起使用。如上文所討論的，引入PEG化結構所需的糖肽末端糖可以在表達中天然引入，或者可在反應後使用適當的糖苷酶、糖基轉移酶或糖苷酶和糖基轉移酶的混合物產生。
表1
在另一實施方案中，UDP-半乳糖-PRG與牛乳β1，4-半乳糖轉移酶反應，從而將修飾的半乳糖轉移到適當的末端N-乙醯葡糖胺結構。糖肽的末端GlcNAc殘基可以在表達中產生(如在哺乳動物、昆蟲、植物或真菌的表達系統中發生)，也可以如所需通過用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉移酶處理糖肽而產生。
在另一示範的實施方案中，使用GlcNAc轉移酶如GNT1-5將PEG化GlcN轉移到糖肽的末端甘露糖殘基。在另一示範的實施方案中，從糖肽中酶促去除N-和/或O-連接聚糖結構以暴露接著與修飾的糖綴合的胺基酸或末端糖基殘基。例如，使用內切糖苷酶去除糖肽的N-連接結構以暴露糖肽上作為GlcNAc-連接-Asn的末端GlcNAc。使用UDP-Gal-PEG和適當的半乳糖轉移酶在暴露的GlcNAc上引入PEG-半乳糖官能團。
在另一可選實施方案中，使用已知將糖殘基轉移到肽骨架的糖基轉移酶直接將修飾的糖加入肽骨架。該示範的實施方案公開於方案3。在本發明的實用中可以使用的示範的糖基轉移酶包括但不僅限於GalNAc轉移酶(GalNAc T1-14)、GlcNAc轉移酶、巖藻糖轉移酶、葡萄糖轉移酶、木糖轉移酶、甘露糖轉移酶等等。使用本方法可以將修飾的糖直接加到缺少任何碳水化合物的肽或者加到原有糖肽。在這兩種情況下，修飾的糖的加入在以糖基轉移酶的底物特異性定義的肽骨架的特定位置發生，而不以如使用化學方法修飾蛋白質肽骨架中出現的隨機方式發生。可以通過將適當的胺基酸序列設計到多肽鏈中而在缺少糖基轉移酶底物肽序列的蛋白質或糖肽中引入一系列的試劑。
方案3
在上文公開的各個示範的實施方案中，可以在將修飾的糖與肽綴合後使用一個或多個額外的化學或酶修飾步驟。在示例實施方案中，使用酶(如巖藻糖轉移酶)將糖基單位(如巖藻糖)附加到肽上附著的末端修飾糖。在另一實施例中，使用酶反應使修飾的糖不能綴合的位點「加帽」。或者，使用化學反應改變所綴合的修飾的糖的結構。例如，使所綴合的修飾的糖與試劑反應，所述試劑使其與修飾的糖所附著的肽組分之間的鍵穩定或不穩定。在另一實施例中，在與肽綴合後去保護修飾的糖的組分。技術人員會理解，在修飾的糖與肽綴合之後，可以在本發明方法中使用一系列的酶和化學方法。修飾的糖-肽綴合物的進一步加工在本發明的範圍內。
酶除了上文形成醯基-連接綴合物的內容中所討論的酶以外，可以通過使用其他酶的方法加工、剪回或修飾綴合物和起始底物(如肽、脂質)的糖基化模式。使用將糖供體轉移到受體的酶重構肽和脂質的方法在2003年4月17日公布的DeFrees，WO 03/031464 A2中有非常詳細的描述。下文中公開了本發明方法中使用酶的簡要概述。
糖基轉移酶糖基轉移酶催化以分步的方式將活化的糖(供體NDP-或NMP-糖)加到蛋白質、糖肽、脂質或糖脂或正延長的寡糖的非還原末端。通過轉移酶和與脂質連接的寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Man9的模塊(enblock)轉移和接著的剪切核心來合成N-連接糖肽。在這種情況下，「核心」糖的性質與隨後的附著存在某些差異。多種糖基轉移酶為本領域已知。
本發明中可以使用任何糖基轉移酶，只要其能利用修飾的糖作為糖供體。這些酶的實例包括Leloir途徑糖基轉移酶，如半乳糖轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶、N-乙醯半乳糖胺轉移酶、巖藻糖轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖轉移酶、木糖轉移酶、葡糖醛酸轉移酶等等。
對於涉及糖基轉移酶反應的酶促糖合成，可以從任何來源克隆或分離糖基轉移酶。許多克隆的糖基轉移酶以及它們的多核苷酸序列是已知的。參閱如「The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases」(http//www.vei.co.uk/TGN/gt-guide.htm)。也可以在多種公共資料庫(包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等)中發現糖基轉移酶的胺基酸序列和可推導出胺基酸序列的編碼糖基轉移酶的核苷酸序列。
可用於本發明方法中的糖基轉移酶包括但不僅限於半乳糖轉移酶、巖藻糖轉移酶、葡萄糖轉移酶、N-乙醯半乳糖胺轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶、葡糖醛酸基轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖轉移酶、葡糖醛酸轉移酶、半乳糖醛酸轉移酶和寡糖轉移酶。合適的糖基轉移酶包括得自真核細胞和原核細胞的糖基轉移酶。
編碼糖基轉移酶的DNA可以通過化學合成獲得、通過篩選來自適當細胞或細胞系培養物的mRNA逆轉錄本獲得、通過篩選來自適當細胞的基因組文庫獲得、或通過這些方法的組合獲得。可以用產生自糖基轉移酶基因序列的寡核苷酸探針篩選mRNA或基因組DNA。可以根據已知方法用常規雜交試驗中所用的可檢測基團(如螢光基團、放射性原子或化學發光基團)標記探針。另外，可以用產生自糖基轉移酶基因序列的PCR寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法獲得糖基轉移酶基因序列。參閱如Mullis等的U.S.專利No.4,683,195和Mullis的U.S.專利No.4,683,202。
可以在用含有編碼糖基轉移酶的DNA的載體轉化的宿主細胞中合成糖基轉移酶。載體用於擴增編碼糖基轉移酶的DNA和/或表達編碼糖基轉移酶的DNA。表達載體是可複製的DNA構建體，其中編碼糖基轉移酶的DNA序列與能夠使糖基轉移酶在適當宿主中表達的適當的控制序列有效連接。對這些控制序列的需求取決於選擇的宿主細胞和選定的轉化方法而不同。控制序列一般包括轉錄啟動子、任選的控制轉錄的操縱子序列、編碼適當的mRNA核糖體結合位點的序列和控制轉錄和翻譯的終止的序列。擴增載體不需要表達控制結構域。所需的僅為在宿主中複製的能力(通常由複製起點賦予)和便於識別轉化體的選擇標記。
在示範的實施方案中，本發明利用原核酶。這樣的糖基轉移酶包括許多革蘭氏陰性菌產生的脂寡糖(LOS)的合成中所涉及的酶(Preston等，Critical Reviews in Microbiology 23(3)139-180(1996))。這些酶包括但不僅限於如大腸桿菌(E.coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等物種的rfa操縱子蛋白(包括β1，6半乳糖轉移酶和β1，3半乳糖轉移酶(參閱如EMBL登錄號M80599和M86935(大腸桿菌)、EMBL登錄號S56361(鼠傷寒沙門氏菌))、葡萄糖基轉移酶(Swiss-Prot登錄號P25740(大腸桿菌)、β1，2-葡萄糖基轉移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登錄號P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登錄號P19817(鼠傷寒沙門氏菌))和β1，2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶(rfaK)(EMBL登錄號U00039(大腸桿菌))。胺基酸序列已知的其他糖基轉移酶包括已在如肺炎克來伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)、結腸耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprosum)中表徵的操縱子及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子所編碼的。
另外適用於本發明的是產生含有乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙醯-D-葡糖氨-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖和已在黏膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中鑑定出的Pk血型三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的結構中涉及的糖基轉移酶(Scholten等，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的編碼這些結構的生物合成中所涉及的糖基轉移酶的基因鑑定自腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由三個基因lgtA、lgtB和lgE組成的基因座編碼添加乳糖-N-新四糖鏈中最後三個糖所需的糖基轉移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。近年來已證明了lgtB和lgtA基因產物的酶活性，提供了其預計的糖基轉移酶功能的第一個直接證據(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中有兩個額外的基因，即，將β-D-GalNAc加到乳糖-N-新四糖結構末端半乳糖的3位置的lgtD，和將末端α-D-Gal加到截短LOS的乳糖元件，從而產生Pk血型抗原結構(前述Gotshlich(1994))的lgtC。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，分離的抗原型L1也表達Pk血型抗原並顯示帶有lgtC基因(前述Jennings等，(1995))。奈瑟氏球菌糖基轉移酶及相關基因還描述於USPN5,545,553(Gotschlich)。來自幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的α1，2-巖藻糖基轉移酶和α1，3-巖藻糖基轉移酶的基因也已表徵(Martin等，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的糖基轉移酶也可用於本發明(參閱如http//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
巖藻糖基轉移酶在一些實施方案中，本發明方法中所使用的糖基轉移酶為巖藻糖基轉移酶。巖藻糖基轉移酶為本領域技術人員所公知。示範的巖藻糖基轉移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉移到受體糖的羥基位置的酶。將非核苷酸糖轉移至受體的巖藻糖基轉移酶也可用於本發明。
在一些實施方案中，受體糖為例如寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GalNAc β-基團中的GlcNAc。適用於該反應的巖藻糖基轉移酶包括最先從人乳中表徵的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)(參閱如Palcic等，CarbohydrateRes.1901-11(1989)、Prieels等，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)和Nunez等，Can.J.Chem.592086-2095(1981))和發現於人血清的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉移酶(FTIV、FTV、FTVI)。還表徵了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，即唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAc β巖藻糖基轉移酶。還表徵了Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶的重組形式(參閱Dumas等，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)和Kukowska-Latallo等，Genes and Development 41288-1303(1990))。其他示範的巖藻糖基轉移酶包括如α1，2巖藻糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.69)。可以通過Mollicone等Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或U.S.專利No.5,374,655中所述的方法進行酶促巖藻糖基化。用於產生巖藻糖基轉移酶的細胞還包括合成GDP-巖藻糖的酶系統。
半乳糖基轉移酶在另一組實施方案中，糖基轉移酶為半乳糖基轉移酶。示範的半乳糖基轉移酶包括α(1，3)半乳糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.151，參閱如Dabkowski等，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等，Nature 345229-233(1990)、牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))、鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat』1.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))、豬(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一合適的α(1，3)半乳糖基轉移酶為參與合成B血型抗原的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人))。另一示範的半乳糖基轉移酶為核心Gal-T1。
同樣適合本發明方法用途的是β(1，4)半乳糖基轉移酶，其包括如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))、人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))、鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104165-168(1988)))以及E.C.2.4.1.38和神經醯胺半乳糖基轉移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38234-242(1994)))。其他合適的半乳糖基轉移酶包括如α1，2半乳糖基轉移酶(來自如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。
唾液酸轉移酶唾液酸轉移酶是可用於本發明的重組細胞和反應混合物的另一類型的糖基轉移酶。產生重組唾液酸轉移酶的細胞還會產生唾液酸轉移酶的唾液酸供體CMP-唾液酸。適合本發明用途的唾液酸轉移酶的實例包括ST3Gal III(如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3Gal II、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAc III(本文使用的唾液酸轉移酶命名法如Tsuji等，Glycobiology 6V-xiv(1996)中所述)。示範的α(2，3)唾液酸轉移酶指將唾液酸轉移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal的α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)。參閱Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1981)、Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一示範的α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.4)將唾液酸轉移到二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參閱Rearick等，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其他示範的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸轉移酶(參閱Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優選地，對於糖肽類碳水化合物的糖基化，唾液酸轉移酶能夠將唾液酸轉移到序列Galβ1，4GlcNAc-(完全唾液酸化的碳水化合物結構上末端唾液酸後最普遍的次級(penultimate)序列)上(見表2)。
表2使用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸轉移酶
1)Goochee等，Bio/Technology 91347-1335(1991)2)Yamamoto等，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)
本發明中有用的其他唾液酸轉移酶包括上文圖4表格中的那些。該唾液酸轉移酶可用於將PEG化的唾液酸部分從PEG化的唾液酸供體種類轉移到肽的N-連接糖基殘基(圖2C)或IX因子的O-連接糖基殘基(圖2D)上。
可用於所述方法的唾液酸轉移酶實例為ST3Gal III，也稱為α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)。該酶催化將唾液酸轉移到Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GalNAc糖苷的Gal上(參閱如Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)、Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1991))並負責糖肽中與天冬醯胺相連的寡糖的唾液酸化。該唾液酸通過在兩個糖之間形成α鍵與Gal相連。糖之間的成鍵(連接)是在NeuAc的2位置和Gal的3位置之間。這一具體酶可分離自大鼠肝(weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982))；並且人cDNA(Sasaki等，(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787、kitagawa Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等，(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列已知，便於通過重組表達產生該酶。在優選的實施方案中，所述的唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
本發明中有用的其他示範的唾液酸轉移酶包括分離自空腸彎曲桿菌的那些酶，包括α(2，3)。參閱如WO 99/49051。
除了表2中列出之外的唾液酸轉移酶也可用於唾液酸化具有商業重要性的糖肽的經濟高效的大規模方法中。作為找出這些其他酶的可用性的簡單測試，將多種量(1-100mU/mg蛋白質)的每種酶與無唾液酸基-α1AGP(1-10mg/ml)進行反應，以將目的唾液酸轉移酶唾液酸化糖肽的能力與牛ST6Gal I、ST3Gal III或兩者進行比較。另外，在該評估中可以使用其他糖肽或從肽骨架上酶促釋放的糖肽或N-連接寡糖代替無唾液酸基-α1AGP。具有比ST6Gal I更高效的唾液酸化糖肽的N-連接寡糖的能力的唾液酸轉移酶可用於肽唾液酸化的大規模實用方法中。
GalNAc轉移酶
N-乙醯半乳糖氨基轉移酶在本發明的實踐中是有用的，特別是對於將GalNAc部分與肽的O-連接糖基化位點的胺基酸連接。合適的N-乙醯半乳糖氨基轉移酶包括但不僅限於α(1，3)N-乙醯半乳糖氨基轉移酶、β(1，4)-N-乙醯半乳糖氨基轉移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等，J.Biol.Chem.26915162(1994))和多肽N-乙醯半乳糖氨基轉移酶(Homa等，J.Biol.Chem.26812609(1993))。
通過基因操作從克隆的基因產生蛋白質如GalNAc TI-XX酶為本領域所熟知。參閱如U.S.專利No.4,761,371。一種方法涉及收集足夠的樣品，然後通過N端測序確定酶的胺基酸序列。使用該信息分離編碼全長(與膜結合的)轉移酶的cDNA克隆，所述cDNA克隆在昆蟲細胞系Sf9中的表達合成完全活性的酶。然後使用16種不同蛋白質的已知糖基化位點周圍的胺基酸的半定量分析和接著的合成肽體外糖基化研究確定酶的受體特異性。該工作已經證明，糖基化肽片段中的某些胺基酸殘基是過量(overrepresent)的，並且糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍特定位置的殘基可能比其他胺基酸部分對受體效率具有更顯著的影響。
與細胞結合的糖基轉移酶在另一實施方案中，本發明方法所使用的酶為與細胞結合的糖基轉移酶。儘管已知有許多可溶性糖基轉移酶(參閱如U.S.專利No.5,032,519)，糖基轉移酶與細胞結合時一般為與膜結合的形式。迄今已研究的許多與膜結合的酶被認為是膜內蛋白，即它們被聲處理後不從膜中解離，並需要洗滌劑來溶解。已經在脊椎動物和無脊椎動物細胞上鑑定了表面糖基轉移酶，並且已認識到這些表面糖基轉移酶在生理條件下保持了催化活性。然而，細胞表面糖基轉移酶認識更深入的功能是對於細胞間的識別(Roth，《MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA》，1990)。
已經發展了改變細胞所表達的糖基轉移酶的方法。例如，Larson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)報導了分離決定細胞表面寡糖結構及其相關糖基轉移酶表達的克隆序列的遺傳方法。將從已知表達UDP-半乳糖.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙醯-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖轉移酶的鼠細胞系分離的mRNA所產生的cDNA文庫轉染進COS-1細胞中。然後培養轉染的細胞並測試α1-3半乳糖轉移酶活性。
Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)公開了將β-內醯胺酶錨定到大腸桿菌外表面的方法。產生了由(i)外膜蛋白的信號序列、(ii)外膜蛋白跨膜區段和(iii)完整的成熟β-內醯胺酶序列組成的三體融合物，最終產生活性表面結合的β-內醯胺酶分子。然而，Francisco方法僅限於原核細胞系統，並且作者認識到，其發揮正常功能需要完整的三體融合物。
磺基轉移酶本發明還提供產生肽(包括硫酸化分子)的方法，所述硫酸化分子包括如硫酸多糖如肝素、硫酸類肝素、carragenen及相關化合物。合適的磺基轉移酶包括如軟骨素-6-磺基轉移酶(Fukuta等，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)描述的雞cDNA；GenBank登錄號D49915)、糖胺聚糖N-乙醯葡萄糖胺N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶1(Dixon等，Genomics 26239-241(1995)；UL 18918)和糖胺聚糖N-乙醯葡萄糖胺N-脫乙醯酶/N-磺基轉移酶2(Orellana等，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)和Eriksson等，J.Biol.Chem.26910438-10443(1994)中描述的鼠cDNA；GenBank登錄號U2304中描述的人cDNA)。
糖苷酶本發明還包括野生型和突變體糖苷酶的用途。已經證明突變體β-半乳糖苷酶通過α-糖基氟化物與半乳糖受體分子的偶聯催化形成二糖。(Withers，U.S.專利No.6,284,494，2001年9月4日頒發)。本發明有用的的其他糖苷酶包括如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙醯氨基葡萄糖苷酶、β-N-乙醯氨基半乳糖苷酶、β-木糖苷酶、β-巖藻糖苷酶、纖維素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纖維素酶、澱粉酶、葡糖澱粉酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙醯氨基葡糖苷酶、α-N-乙醯氨基半乳糖苷酶、α-木糖苷酶、α-巖藻糖苷酶和神經氨酸酶/唾液酸酶。在示範的實施方案中，在糖基PEG化之前使用唾液酸酶從因子IX(圖2A)的N-聚糖中去除唾液酸。本發明還提供無需預先除去唾液酸的方法。因此，涉及使用修飾的唾液酸部分的和ST3Gal3的唾液酸交換反應的方法可以用於本發明。
固定化的酶本發明還提供固定於固體和/或可溶支持物的酶的用途。在示範的實施方案中，提供了通過本發明方法的完整糖基接頭與PEG綴合的糖基轉移酶。PEG-接頭-酶綴合物任選地附著於固體支持物。在本發明方法中使用固體支持的酶簡化了反應混合物的建立和反應產物的純化，並使酶容易回收。本發明的方法中使用了糖基轉移酶綴合物。酶和支持物的其他組合對於本領域的技術人員而言是顯而易見的。
融合蛋白在另一示範的實施方案中，本發明的方法使用融合蛋白，所述融合蛋白具有一種以上與合成所需糖肽綴合物相關的酶活性。融合多肽可以由例如糖基轉移酶的催化活性結構域與輔助酶的催化活性結構域相連組成。輔助酶催化結構域可以催化例如核苷酸糖(糖基轉移酶的供體)形成中的一個步驟，或催化與糖基轉移酶循環相關的反應。例如，編碼糖基轉移酶的多核苷酸可以與編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸按讀碼框連接。從而得到的融合蛋白不僅可以催化合成核苷酸糖，還可以催化將糖部分轉移到受體分子。融合蛋白可以是連接成一個可表達核苷酸序列的兩個或多個循環酶。在其他實施方案中融合蛋白包括兩個或多個糖基轉移酶的催化活性結構域。參閱如5,641,668。可以使用多種合適的融合蛋白方便地設計和生產本發明的修飾的糖肽(參閱如PCT專利申請PCT/CA98/01180，1999年6月24日作為WO 99/31224公布)。
製備修飾的糖一般通過使用反應基團將糖部分或糖部分-接頭盒或PEG或PEG-接頭盒基團連接在一起，所述反應基團一般通過連接方法轉化成新有機官能團或非活性種類。糖反應性官能團位於糖部分的任何位置。可用於本發明的實踐中的反應基團和反應類型一般為生物綴合化學領域的技術人員所熟知。目前偏好的適於反應性糖部分的反應類型是在相對溫和條件下進行的。它們包括但不僅限於親核取代(如醯基滷化物、活性酯和醇、胺的反應)、親電取代(如烯胺反應)和碳-碳和碳-雜原子多重鍵的加成(如Michael反應、Diels-Alder加成)。這些及其他有用的反應在例如March，《ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY》，第三版，John Wiley Sons，New York，1985；Hermanson，《BIOCONJUGATETECHNIQUES》，Academic Press，San Diego，1996和Feeney等，《MODIFICATION OF PROTEINS》、《Advances in Chemistry Series》，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中有所討論。
側掛於糖核或修飾基團的有用的反應性官能團包括但不僅限於(a)羧基基團及其多種衍生物，包括但不僅限於N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥苄基三唑酯、醯基滷、醯基咪唑、硫脂、對硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯；(b)羥基基團，其可轉化為如酯、醚、醛等；(c)滷烴基基團，其中滷化物可以隨後用親核基團(如胺、羧酸陰離子、硫醇陰離子、碳負離子或醇鹽離子替換，從而引起滷素原子官能團處新基團的共價附著；(d)能夠參與Diels-Alder反應的親雙烯體，例如馬來醯亞胺基團；(e)醛或酮基團，可以通過形成羰基衍生物如亞胺、腙、縮氨基脲或肟，或通過這些機制如Grignard加成或烷基鋰加成進一步衍生；(f)與胺繼發反應例如形成氨磺醯的磺醯滷化物基團；(g)巰基，其可以轉換為如二硫化物或與醯滷反應；
(h)胺或巰基基團，其可以是如醯化的、烴基化的或氧化的；(i)能夠進行環加成、醯化、Michael加成等等的烯烴；和(j)能夠與如胺和羥基化合物反應的環氧化物。
可以選擇反應性官能團使其不參與或不幹擾組裝反應性糖核或修飾基團所必需的反應。另外，可以通過保護基的存在來保護反應性官能團，使其不參與反應。本領域技術人員會了解如何保護特定的官能團以使其不與選定的一組反應條件發生幹擾。有用的保護基的實例參閱如Greene等，《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS》，JohnWiley Sons，New York，1991。
在接下來的討論中，給出了可用於本發明的實用的修飾的糖的大量具體實例。在示範的實施方案中，使用唾液酸衍生物作為修飾基團附著的糖核。唾液酸衍生物的討論著重於使說明更清楚，而不應理解為限制本發明的範圍。本領域技術人員會理解，可以用以唾液酸為示例所述的類似方式活化和衍生多種其他糖部分。例如，大量方法可用於修飾半乳糖、葡萄糖、N-乙醯半乳糖胺和巖藻糖以成為若干糖底物，其可容易地用本領域已知的方法修飾。參閱如Elhalabi等，Curr.Med.Chem.693(1999)和Schafe等，J.Org.Chem.6524(2000)。
在示範的實施方案中，用本發明方法修飾的肽為在哺乳動物細胞(如CHO細胞)或轉基因動物中產生，並因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-連接寡糖鏈的糖肽。缺乏唾液酸並含有末端半乳糖殘基的糖肽的寡糖鏈可以PEG化、PPG化或用修飾的唾液酸進行修飾。
在方案4中，用被保護的胺基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯處理氨基糖苷1，將糖胺殘基轉變為相應的被保護的胺基酸醯胺加合物。用醛縮酶處理加合物以形成α-羥基羧酸鹽2。通過CMP-SA合成酶的作用將化合物2轉變為相應的CMP衍生物，接著通過催化氫化CMP衍生物產生化合物3。使用通過將化合物3與活性PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝基苯)反應形成甘氨酸加合物而引入的胺作為PEG附著的位點，分別產生如4或5的種類。
方案4 表3描述了用PEG部分衍生的單磷酸糖的代表性實例。表3中的某些化合物通過方案4的方法製備。其他衍生物通過本領域已知的方法製備。參閱如Keppler等，《Glycobiology》1111R(2001)和Charter等，《Glycobiology》101049(2000)。其他胺反應性的PEG或PPG類似物是市售的，或者可以通過本領域技術人員容易獲得的方法製備。
表3 在本發明的實踐中有用的修飾的磷酸糖可以在上文所述位置和其他位置進行取代。目前優選的唾液酸取代在下式中公開
其中X為連接基團，優選選自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和-N(R)2，其中各個R分別獨立選自R1-R5。符號Y、Z、A和B各代表選自上文所述X定義的基團。X、Y、Z、A和B各自獨立選擇，因此它們可以相同或不同。符號R1、R2、R3、R4和R5代表H、PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分。另外，這些符號代表與PEG部分、治療部分、生物分子或其他部分結合的接頭。
本發明公開的附著於綴合物的示範的部分包括但不僅限於PEG衍生物(如醯基-PEG、醯基-烴基-PEG、烴基-醯基-PEG、氨基甲醯基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(如醯基-PPG、醯基-烴基-PPG、烴基-醯基-PPG、氨基甲醯基-PPG、芳基-PPG)、治療部分、診斷部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、類肝素、SLeX、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、Sialyl LewisX、FGF、VFGF、蛋白質、軟骨素、角質素、皮膚素、白蛋白、整合素、觸角寡糖、肽等等。將多種修飾基團與糖部分綴合的方法是本領域技術人員容易獲得的(《POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRYBIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris編輯，Plenum Pub.Corp.，1992；《POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICALAND BIOLOGICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris編輯，ACSSymposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，《BIOCONJUGATE TECHNIQUES》，Academic Press，SanDiego，1996和Dunn等編輯，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS》，ACS Symposium Series Vol.469，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991》。
接頭基團(交聯基團)製備可用於本發明方法的修飾的糖包括將PEG部分附著到糖殘基並優選形成穩定的加合物，所述加合物為糖基轉移酶的底物。因此，經常優選使用接頭(例如PEG和糖部分與交聯劑反應綴合PEG和糖)。可用於將修飾基團附著於碳水化合物部分的示範的雙功能化合物包括但不僅限於雙功能聚乙二醇、聚醯胺、聚醚、聚酯等等。將碳水化合物與其它分子連接的一般方法為文獻中已知。參閱如Lee等，《Biochemistry》281856(1989)、Bhatia等，Anal.Biochem.178408(1989)、Janda等，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等，WO 92/18135。在下文的討論中，新生修飾的糖中的糖部分的反應基團進行溫和處理。討論著重於使說明更清楚。本領域技術人員會理解，該討論也適用於修飾基團的反應基團。
多種試劑可用於修飾帶有分子內化學交聯的修飾的糖的成分(交聯試劑和交聯方法的綜述參閱Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972、Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，在《ENZYMES ASDRUGS》(Holcenberg和Roberts編輯)，395-442頁，Wiley，New York，1981中、Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983、Mattson等，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，在本文中全部整體引入作為參考)。優選的交聯試劑來自多種零長度、同雙功能和異雙功能交聯試劑。零長度交聯試劑包括不引入外部材料的兩個內部化學基團直接綴合。催化形成二硫鍵的試劑屬於這一類別。另一實例為誘導羧基和伯氨基縮合形成醯胺鍵的試劑，如碳二亞胺、乙基氯代甲酸酯、Woodward’s試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑-3』-磺酸酯)和羰二咪唑。除了這些化學試劑以外，轉穀氨醯胺酶(穀氨醯-肽γ-穀氨醯轉移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度交聯試劑。該酶在與蛋白質結合的穀氨醯胺殘基的氨甲醯基團處催化醯基轉移反應，通常以伯氨基作為底物。優選的同和異雙功能試劑分別含有兩個相同的或兩個不同的位點，其可以對氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異基團具有反應性。
純化因子IX綴合物通過上述方法產生的產物可以不經純化而使用。然而，通常優選回收產物。可以使用熟知的標準技術回收糖基化的糖，如薄層或厚層層析、柱層析、離子交換層析或膜過濾。如下文以及本文所引用的文獻所討論，優選使用膜過濾(更優選使用反滲透膜)或一種或多種柱層析技術進行回收。例如，可以使用分子量截止值約3000到約10000的膜去除蛋白質如糖基轉移酶。然後可以使用納米過濾或反滲透去除鹽和/或純化產物糖(參閱如WO 98/15581)。納米過濾膜是反滲透膜的一種，其透過一價鹽而截留多價鹽和大於約100到約2000道爾頓的不帶電溶質(取決於所使用的膜)。因此，在一般應用中，通過本發明方法製備的糖將留在膜上而汙染鹽將透過。
如果在細胞內產生修飾的糖蛋白，第一步去除宿主細胞或裂解片段的微粒碎屑(例如通過離心或超濾)，任選地，可以用市售的蛋白濃縮濾器濃縮蛋白質，接著通過一個或多個步驟從其他雜質中分離多肽變體，所述步驟選自免疫親和層析、離子交換柱分級分離(如二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基基團的基質)、Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、lentillectin-Sepharose、WGA-Sepharose、Con A-Sepharose、EtherToyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl或A蛋白Sepharose上的層析、SDS-PAGE層析、矽膠層析、層析聚焦、反相HPLC(如帶有側掛脂肪基團的矽膠)、使用如Sephadex分子篩或大小排阻層析的凝膠過濾、與多肽選擇性結合的柱上的層析以及乙醇或硫酸銨沉澱。
在培養物中產生的修飾糖肽一般通過首先從細胞、酶等中提取和接著的一次或多次濃縮、鹽析、含水離子交換或分子排阻層析步驟進行分離。另外，可以通過親和層析純化修飾的糖蛋白。最後可以使用HPLC進行最後的純化步驟。
可以在任何前述步驟中引入蛋白酶抑制劑(如甲磺醯氟(PMSF))以抑制蛋白酶解，並可以含有抗生素以阻止外來汙染物的生長。
在另一個實施方案中，首先使用市售的蛋白質濃縮濾器(如Amicon或Millipore Pellicon超濾設備)濃縮來自產生本發明修飾糖肽的系統的上清液。在濃縮步驟之後，可以將濃縮液應用於合適的純化基質。例如，合適的親和基質可以含有與合適的支持物結合的肽的配體、凝集素或抗體分子。另外，可以使用陰離子交換樹脂，如含有側掛的DEAE基團的基質或底物。合適的基質包括丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或在蛋白質純化中普遍使用的其他類型。另外，可以應用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基基團的多種不溶基質。特別優選磺丙基基團。
最後，為進一步純化多肽變體組合物，可以應用一個或多個使用疏水RP-HPLC介質(如具有側掛的甲基或其他脂肪基團的矽膠)的RP-HPLC步驟。還可以利用某些或全部上述純化步驟的多種組合來提供同質修飾的糖蛋白。
可以通過與Urdal等，J.Chromatog.296171(1984)中所公開的相類似的方法純化從大規模發酵得到的本發明修飾糖肽。該參考文獻描述了用於純化重組人IL-2的在製備級HPLC柱上進行的兩個連續的RP-HPLC步驟。另外，可以利用如親和層析的技術純化修飾的糖蛋白。
藥物組合物在另一方面中，本發明提供藥物組合物。藥物組合物包含可藥用稀釋劑以及非天然存在的PEG部分、治療部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的因子IX肽的共價綴合物。多聚體、治療部分或生物分子通過完整的糖基連接基團與肽綴合，所述連接基團插入肽和多聚體、治療部分或生物分子之間並與二者共價連接。
本發明的藥物組合物適用於多種藥物投送系統。本發明中有用的合適製劑可見於《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第十七版，(1985)。藥物投送方法的簡單綜述參閱Langer，Science 2491527-1533(1990)。
可以為任何適當的給藥方式配製藥物組合物，包括如局部、口服、鼻、靜脈內、顱內、腹膜內、皮下或肌內給藥。對於腸胃外給藥(如皮下注射)，載體優選含有水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩衝劑。對於口服給藥，可以使用任何上述載體或固體載體如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以使用可生物降解微球(如多聚乳酸、聚乙醇酸)作為本發明藥物組合物的載體。合適的可生物降解微球公開於如U.S.專利No.4,897,268和5,075,109。
藥物組合物一般經腸胃外(如靜脈內)給藥。因此，本發明提供經腸胃外給藥的組合物，其含有溶解於或懸浮於可接受載體(優選水性載體如水、緩衝水、鹽水、PBS等等)的化合物。組合物可以含有接近生理條件所需的可藥用輔助物質，如pH調節劑和緩衝劑、張力調整劑、溼潤劑、洗滌劑等等。
這些組合物可以使用常規滅菌技術滅菌或進行過濾滅菌。得到的水溶液可以原樣包裝待用或凍幹，凍幹的製劑在給藥前與無菌水性載體組合。製劑的pH一般在3和11之間，優選從5到9並最優選從7到8。
在一些實施方案中，本發明的糖肽可以摻入由標準小泡形成性脂質所形成的脂質體中。多種方法可用於製備脂質體，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)、U.S.專利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述。使用多種靶向劑(如本發明的唾液酸半乳糖苷)靶向脂質體為本領域所熟知(參閱如U.S.專利No.4,957,773和4,603,044)。
可以使用將靶向劑與脂質體偶聯的標準方法。這些方法一般涉及將脂質組分(如磷脂醯乙醇胺)摻入脂質體中，所述脂質組分可以被活化用於附著靶向劑，或衍生的親脂化合物，如本發明的脂質衍生的糖肽。
靶向機制一般需要以使靶向部分可與靶標(如細胞表面受體)相互作用的方式將靶向劑置於脂質體的表面。可以使用本領域技術人員已知的方法(如分別用長鏈烷基滷或脂肪酸烷基化或醯化碳水化合物上存在的羥基)在脂質體形成前將本發明的碳水化合物附著於脂質分子。另外，可以按以下方式形成脂質體在形成膜時首先將連接體部分摻入膜中。該連接體部分必須具有能緊密嵌入並錨定在膜中的親脂部分。它還必須具有可在脂質體的水性表面有化學活性的反應性部分。選擇反應性部分，以使其在化學上適合與隨後加入的靶向劑或碳水化合物形成穩定的化學鍵。在一些情況下，可以將靶向劑直接附著於連接體分子，但在多數情況下更適合使用第三個分子作為化學橋，從而將膜中的連接體分子與三維擴張到小泡表面外的靶向劑或碳水化合物連接。
通過本發明方法製備的化合物還可以用作診斷劑。例如，可以使用經標記的化合物在懷疑具有炎症的患者中定位炎症或腫瘤轉移的區域。對於該用途，化合物可以使用125I、14C或氚進行標記。
本發明的藥物組合物中使用的活性成分為糖基聚乙二醇化的因子IX及其具有參與凝血級聯繫統的生物特性的衍生物。本發明的脂質體分散體可作為腸胃外製劑用於治療以低或缺陷型凝血為特徵的凝血障礙，如多種類型的血友病。優選腸胃外施用本發明的因子IX組合物(如IV、IM、SC或IP)。取決於受治疾病和給藥途徑，有效劑量預計將發生可觀的變化，但預計活性物質在約0.1到000μg/kg體重的範圍內。治療凝血障礙優選的劑量為每周三次約50到約3000μg/kg。更優選每周三次約500到約2000μg/kg。更優選每周三次約750到約1500μg/kg，並最優選每周三次約1000μg/kg。由於本發明提供具有增強的體內停留時間的因子IX，在施用本發明的組合物時可以任選地降低所述的劑量。(這些劑量是否合適？)提供以下實施例用於說明本發明的綴合物和方法，而非限制所要求的發明。
實施例實施例1製備UDP-GalNAc-6』-CHO將UDP-GalNAc(200mg，0.30mmole)溶於1mM CuSO4溶液(20mL)和25mM NaH2PO4溶液(pH6.0，20mL)中。接著加入半乳糖氧化酶(240U，240μL)和過氧化氫酶(13000U，130μL)，用充滿氧的氣球裝配反應系統並在室溫下攪拌七天。接著過濾(離心管，MWCO 5K)反應混合物，在4℃儲存濾液(～40mL)待用。TLC(二氧化矽；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.77；茴香醛染色顯影)。
實施例2製備UDP-GaINAc-6』-NH2在0℃下向上述UDP-GalNAc-6』-CHO溶液(2mL或～20mg)中加入乙酸銨(15mg，0.194mmole)和NaBH3CN(1M THF溶液；0.17mL，0.17mmole)並在室溫下溫育過夜。用含水的G-10柱過濾反應物，並收集產物。將合適的級分凍幹並冷凍儲存。TLC(二氧化矽；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.72；茚三酮染色顯影)。
實施例3製備UDP-GaINAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)將半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045mmole)溶於DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接著加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmole)並在70℃將所得的混合物攪拌48小時。在反應混合物中通入氮氣泡除去溶劑並通過反相層析(C-18二氧化矽，不連續梯度在10到80％之間，甲醇/水)純化殘留物。收集所需的級分並減壓乾燥以獲得50mg(70％)白色固體。TLC(二氧化矽，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值1485、1529、1618、1706。
實施例4製備半胱氨酸-PEG2(2) 4.1合成(1)在氬氛中向L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)的無水甲醇溶液(20mL)中加入氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，粉末)。在室溫下將混合物攪拌30分鐘，接著分若干部分在2小時中加入分子量20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸(Ts；1.0g，0.05mmol)。在室溫下將混合物攪拌5天，旋轉蒸發進行濃縮。將殘留物溶於水(30mL)中，並在室溫下攪拌2小時以破壞所有過量的20千道爾頓mPEG-O-甲苯磺酸。用乙酸中和溶液，將pH調整至pH5.0並裝入(C-18矽)反相層析柱。用甲醇/水梯度洗脫柱(產物在約70％甲醇處洗脫)，用蒸發光散射監控產物洗脫液，收集適當的級分並溶於水(500mL)中。層析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氫氧化物型，從水到水/乙酸-0.75N的梯度)該溶液並用乙酸將適當級分的pH調低至6.0。在反相柱(C-18矽)上加載該溶液並用上述甲醇/水梯度洗脫。將產物級分合併、濃縮、重溶於水並凍幹以得到453mg(44％)白色固體(1)。該化合物的結構數據如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。通過SDS PAGE確認產物純度。
4.2合成(2)向1(440mg，22μmol)溶於無水CH2Cl2(30mL)的溶液中逐滴加入三乙胺(～0.5mL)直至溶液呈鹼性。室溫下在1小時中將CH2Cl2(20mL)中的20千道爾頓mPEG-O-對硝基苯碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(3.6mg，30.8μmol)分若干份加入。在室溫下將反應混合物攪拌24小時。旋轉蒸發除去溶劑，將殘留物溶於水(100mL)中，並用1.0N NaOH將pH調整至9.5。在室溫下將鹼性溶液攪拌2小時，接著用乙酸中和至pH7.0。然後將溶液裝入反相層析(C-18矽)柱。用甲醇/水梯度洗脫柱(產物在約70％甲醇處洗脫)，用蒸發光散射監控產物洗脫液，收集適當的級分並溶於水(500mL)中。層析(離子交換，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氫氧化物型，從水到水/乙酸-0.75N的梯度)該溶液並用乙酸將適當級分的pH調低至6.0。在反相柱(C-18矽)上加載該溶液並用上述甲醇/水梯度洗脫。將產物級分合併、濃縮、重溶於水並凍幹以得到575mg(70％)白色固體(2)。該化合物的結構數據如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1HS-CHH-CHN)，3.39(s，3H，CH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。通過SDS PAGE確認產物純度。
實施例5製備UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)將半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1千道爾頓)(58mg，0.045mmole)溶於DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接著加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmole)並在70℃將所得的混合物攪拌48小時。在反應混合物中通入氮氣泡除去溶劑並通過反相層析(C-18矽，不連續梯度在10到80％之間，甲醇/水)純化殘留物。收集所需的級分並減壓乾燥以獲得50mg(70％)白色固體。TLC(矽，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值1485、1529、1618、1706。
實施例6糖PEG化CHO細胞中產生的因子IX本實施例公開製備無唾液酸的因子IX並用CMP-唾液酸-PEG使其唾液酸化。
6.1重組因子IX去唾液酸在CHO細胞中產生重組形式的凝血因子IX(重組因子IX)。將6000IU重組因子IX溶於總體積12mL的USP水中。用另外6mL USP水將該溶液轉移至Centricon Plus20，PL-10離心濾器中。將溶液濃縮至2mL，接著用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2、0.05％NaN3稀釋並重濃縮。重複四次稀釋/濃縮以將緩衝液有效改變為終體積3.0mL。將2.9mL該溶液(約29mg重組因子IX)轉移到小塑料管中並加入530mU α2-3，6，8-神經氨酸酶-瓊脂糖綴合物(霍亂弧菌(Vibrip chlerae)，Calbiochem，450μL)。在32℃將反應混合物柔和旋轉26.5小時。10000rpm將混合物離心2分鐘並收集上清液。用0.5mL 50mM Tris-HCl pH7.12、1M NaCl、0.05％NaN3洗滌(含有神經氨酸酶的)瓊脂糖珠6次。10000rpm下將混合的洗滌液和上清液再次離心2分鐘以除去所有殘留的瓊脂糖樹脂。用同樣的緩衝液將混合的去唾液酸蛋白質溶液稀釋到19mL，並在Centricon Plus 20，PL-10離心濾器中濃縮到～2mL。將該溶液用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋兩倍並濃縮到2mL。用Tris緩衝液將最終的去唾液酸化重組因子IX溶液稀釋到3mL終體積(～10mg/mL)。用IEF-電泳分析天然和去唾液酸化的重組因子IX樣品。先用10μLTris緩衝液稀釋1.5μL(15μg)樣品再與12μL上樣緩衝液混合進行等電聚焦電泳(pH3-7)。使用標準程序上樣、跑膠和固定。凝膠用Colloidal Blue Stain染色(圖154)，顯示去唾液酸化因子IX的條帶。
實施例7製備PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX將去唾液酸化的重組因子IX(29mg，3mL)分成兩份1.5mL(14.5mg)樣品置於兩個15mL離心管中。用12.67mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋每一溶液並加入CMP-SA-PEG-1k或10k(7.25μmol)。將管輕輕顛倒混勻並加入2.9U ST3Gal3(326μL)(總體積14.5mL)。再次將管顛倒並在32℃輕柔旋轉65小時。在-20℃冷凍終止反應。用SDS-PAGE分析10μg反應樣品。在使用Dulbecco’s磷酸緩衝鹽溶液pH7.1(Gibco)，6mL/分鐘的Toso HaasBiosep G3000SW(21.5×30cm，13μm)HPLC柱上純化PEG化的蛋白質。用SDS Page和IEF凝膠監控反應和純化。用2μL 50mM Tris-HClpH 7.4、150mM NaCl、0.05％NaN3緩衝液稀釋10μL(10μg)樣品後與12μL上樣緩衝液和1μL 0.5M DTT混合併在85℃加熱6分鐘，然後上樣至Novex Tris-Glycine 4-20％ 1mm凝膠。凝膠用ColloidalBlue Stain染色(圖155)，顯示PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX條帶。
實施例8直接唾液酸-糖基PEG化因子IX本實施例公開不預先用唾液酸酶處理製備唾液酸-PEG化因子IX。
8.1用CMP-SA-PEG-(10KDa)唾液酸-PEG化因子IX將在CHO細胞中表達並完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶於5mL 20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接著將CMP-SA-PEG-(10KDa)(27mg，2.5μmol)溶於該溶液並加入1U ST3Gal3。在32℃輕柔混合28小時完成反應。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反應物。用磷酸緩衝鹽溶液pH7.0(PBS)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上純化產物蛋白質，1mL/分鐘，Rt＝9.5分鐘。
實施例9用CMP-SA-PEG-(20KDa)唾液酸-PEG化因子IX將在CHO細胞中表達並完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶於5mL 20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接著將CMP-SA-PEG-(20KDa)(50mg，2.3μmol)溶於該溶液並加入CST-II。反應混合物在32℃輕柔混合42小時後結束。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反應物。
用磷酸緩衝鹽溶液pH7.0(Fisher)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上純化產物蛋白質，1mL/分鐘，Rt＝8.6分鐘。
實施例10糖基PEG化因子IX的唾液酸加帽本實施例公開唾液酸-糖基PEG化肽的唾液酸加帽程序。此處因子IX為示範的肽。
10.1因子IX-SA-PEG(10kDa)的N-連接和O-連接聚糖的唾液酸加帽在CentriconPlus 20 PL-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)離心濾器中濃縮純化的重組因子IX-PEG(10kDa)(2.4mg)，並將緩衝液更換為50mM Tris-HCl pH7.2、0.15M NaCl、0.05％NaN3至終體積1.85mL。用372μL同一Tris緩衝液稀釋蛋白質溶液並加入7.4mg固體CMP-SA(12μmol)。輕輕顛倒溶液混勻並加入0.1U ST3Gal 1和0.1U ST3Gal 3。在32℃將反應混合物輕柔旋轉42小時。
用SDS-PAGE分析10μg反應物樣品。使用Novex Tris-Glycine4-12％ 1mm凝膠並如Invitrogen所述用Colloidal Blue染色。簡言之，將10μL(10μg)樣品與12μL上樣緩衝液和1μL 0.5M DTT混合併在85℃加熱6分鐘(圖156，第4道)。
實施例11糖基聚乙二醇化的因子IX的藥代動力學研究在正常小鼠的PK研究中測試了四種糖基聚乙二醇化的因子IX變體(PEG-9變體)。先前已經在體外通過凝血、內源性凝血酶潛力(ETP)和血栓彈性描記法(TEG)測試建立了四種化合物的活性。活性結果概括於表I。
為評估四種PEG-9化合物在循環中的活性延長，設計並進行了PK研究。使用非血友病小鼠，每個時間點2隻動物，每隻動物3個樣品。採樣時間點為施用化合物後0、0.08、0.17、0.33、1、3、5、8、16、24、30、48、64、72和96小時。離心血樣並保存為兩份等分試樣；一份用於凝血分析，一份用於ELISA。由於材料的限制，以不同劑量進行PEG-9給藥BeneFIX 250U/kg；2K(低取代「LS」(每個肽分子1-2個PEG取代)200U/kg；2K(高取代「HS」(每個肽分子3-4個PEG取代)200U/kg；10K 100U/kg；30K 100U/kg。所有劑量基於測試的凝血試驗單位。
結果概括於圖6和表II。
表II
結果證明了所有PEG-9化合物的延長的趨勢。不直接比較AUC和Cmax的值。然而，比較了清除率(CL)，並且PEG-9化合物的CL低於BeneFIX，表示在小鼠中較長的存在時間。儘管BeneFIX以最高劑量給藥，與BeneFIX相比，PEG-9化合物的最後可檢測凝血活性的時間增長了。
實施例12製備LS和HS糖基PEG化因子IX通過ST3Gal-III催化的交換反應從天然因子IX製備低PEG取代程度的糖基PEG化因子IX。在10mM組氨酸、260mM甘氨酸、1％蔗糖和0.02％吐溫80，pH7.2的緩衝液中進行反應。對於使用CMPSA-PEG(2kD和10kD)的PEG化，在32℃下將因子IX(0.5mg/mL)與ST3Gal III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小時。對於使用CMP-SA-PEG 30kD的PEG化，因子IX的濃度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的濃度降低到0.17mM。在這些條件下，超過90％的因子IX分子被至少1個PEG部分取代。
通過酶促去唾液酸化從天然因子IX製備高度PEG取代的糖基PEG化因子IX。用PD10柱將因子IX肽緩衝液更換至50mM mES，pH6.0，將濃度調整至0.66mg/mL並在32℃下用AUS唾液酸酶(5mU/mL)處理16小時。用SDS-PAGE、HPLC和MALDI聚糖分析證實去唾液酸化。在QSepharose FF柱上純化無唾液酸的因子IX以去除唾液酸酶。用Ultra15濃縮器濃縮CaCl2級分，並用PD10柱將緩衝液更換為MES，pH6.0。
通過在32℃下與ST3Gal-III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小時進行無唾液酸的因子IX(0.5mg/mL)的2kD和10kD PEG化。對於使用CMPSA-PEG-30kD的PEG化，因子IX的濃度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的濃度降低到0.17mM。PEG化16小時後，通過加入1mMCMP-SA並在32℃繼續額外孵育8小時用唾液酸使帶有末端半乳糖的聚糖加帽。在這些條件下，超過90％的因子IX分子被至少1個PEG部分取代。在SDS-PAGE中，通過本方法產生的因子IX具有較高的表觀分子量。
實施例13製備O-糖基PEG化因子IX通過在32℃將肽與GalNAcT-II(25mU/mL)和1mM UDP-GalNAc孵育從頭將O-聚糖鏈引入天然因子IX(1mg/mL)中。孵育4小時後，通過加入CMPSA-PEG(0.5mM的2Kd或10Kd或0.17mM的30kD)和ST6GalNAc-I(25mU/mL)起始PEG化反應並額外孵育20小時。
應該理解本文所述的實施例和實施方案僅用於說明性目的，其多種修飾或改變將暗示給本領域技術人員，並包括於本申請的精神和範圍以及附帶的權利要求書的範圍內。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請在所有目的中以其整體引入作為參考文獻。
權利要求
1.含有至少一個具有以下通式的部分的因子IX肽 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇殘基的成員的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。
2.根據權利要求1的因子IX肽，其中L-R1具有下式 其中a為從0到20的整數。
3.根據權利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結構 其中e和f為獨立選自1到2500的整數；且q為從0到20的整數。
4.根據權利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結構 其中e、f和f』為獨立選自1到2500的整數；且q和q』為獨立選自1到20的整數。
5.根據權利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結構 其中e、f和f』為獨立選自1到2500的整數；且q、q』和q」為獨立選自1到20的整數。
6.根據權利要求1的因子IX肽，其中R1具有選自下列的結構 其中e和f為獨立選自1到2500的整數。
7.根據權利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式
8.根據權利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式
9.根據權利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式 其中AA為所述肽的胺基酸殘基。
10.根據權利要求9的因子IX肽，其中所述胺基酸殘基選自絲氨酸或蘇氨酸。
11.根據權利要求1的因子IX肽，其中所述肽具有SEQ.ID.NO1的胺基酸序列。
12.根據權利要求11的因子IX肽，其中所述胺基酸殘基為SEQ.ID.NO1位置61處的絲氨酸。
13.根據權利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式 其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨立選自0和1的整數；q為1；e、f、g和h為獨立選自0到6的整數；j、k、l和m為獨立選自0到100的整數；v、w、x和y獨立選自0和1，且v、w、x和y中至少一個為1；AA為所述因子IX肽的胺基酸殘基；Sia-(R)具有下式 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇殘基的成員的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。
14.根據權利要求7的因子IX肽，其中所述糖基殘基附著於選自Asn157、Asn167及其組合的成員。
15.含有根據權利要求1的因子IX和可藥用載體的藥物製劑。
16.在哺乳動物中刺激凝血的方法，所述方法包含對所述哺乳動物施用根據權利要求1的所述因子IX肽。
17.在受試者中治療血友病的方法，所述方法包含對所述受試者施用根據權利要求1的所述因子IX肽。
18.產生含有下面部分的因子IX肽綴合物的方法 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇殘基的成員的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。所述方法包括(a)在適於轉移的條件下，使底物因子IX肽與具有式 的PEG-唾液酸供體部分以及將所述PEG-唾液酸轉移到所述因子IX肽的胺基酸或糖基殘基上的酶相接觸。
19.根據權利要求18的方法，其中L-R1具有下式 其中a為從0到20的整數。
20.根據權利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結構 其中e和f為獨立選自1到2500的整數；且q為從0到20的整數。
21.根據權利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結構 其中e、f和f』為獨立選自1到2500的整數；且q和q』為獨立選自1到20的整數。
22.根據權利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結構 其中e、f和f』為獨立選自1到2500的整數；且q、q』和q」為獨立選自1到20的整數。
23.根據權利要求18的方法，其中R1具有選自下列的結構 其中e和f為獨立選自1到2500的整數。
24.根據權利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有下式的部分
25.根據權利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有式下式的部分
26.根據權利要求18的方法，其中所述因子IX肽綴合物含有具有下式的部分 其中AA為所述因子IX肽的胺基酸殘基。
27.根據權利要求26的方法，其中所述胺基酸殘基選自絲氨酸或蘇氨酸。
28.根據權利要求18的方法，其中所述因子IX底物肽具有SEQ.ID.NO1的胺基酸序列。
29.根據權利要求28的因子IX肽，其中所述胺基酸殘基為SEQ.ID.NO1位置61處的絲氨酸。
30.根據權利要求18的方法，其中所述因子IX綴合物含有具有通式 的糖基殘基，其中a、b、c、d、i、r、s、t和u為獨立選自0和1的整數；q為1；e、f、g和h為獨立選自0到6的整數；j、k、l和m為獨立選自0到100的整數；v、w、x和y獨立選自0和1，且v、w、x和y中至少一個為1；AA為所述因子IX肽的胺基酸殘基；Sia-(R)具有下式 其中D選自-OH和R1-L-HN-；G選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烴基；R1為含有選自直鏈或分支聚乙二醇殘基的成員的部分；且L為選自鍵、取代或非取代烴基和取代或非取代雜烴基的接頭，從而當D為OH時，G為R1-L-，且當G為-C(O)(C1-C6)烴基時，D為R1-L-NH-。
31.根據權利要求30的方法，其中所述糖基殘基附著於選自Asn157、Asn167及其組合的成員。
32.權利要求18的方法，所述方法在步驟(a)之前還包含(b)在合適的宿主細胞中表達所述底物因子IX肽。
33.權利要求32的方法，其中所述宿主選自昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
全文摘要
本發明提供因子IX和PEG部分之間的綴合物。該綴合物通過介於並共價附著於肽和修飾基團間的完整糖基連接基團連接。該綴合物由糖基化的肽通過糖基轉移酶作用形成。糖基轉移酶將修飾的糖部分連接在肽的糖基殘基上。還提供了製備該綴合物的方法、用該綴合物治療多種病症的方法和包含該綴合物的藥物製劑。
文檔編號C07K1/00GK1889937SQ200480035951
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月3日 優先權日2003年12月3日
發明者S·德弗利斯, R·J·拜爾, C·鮑, K·潘尼爾瑟瓦姆 申請人:尼奧斯技術有限公司