一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒的製作方法
2023-10-31 00:47:07 3
專利名稱：一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種診斷疾病的試劑盒，具體地，涉及一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒。
背景技術：
系統性血管炎(systemic vasculitis)是一組以血管壞死和炎症為主要病理改變的疾病，常見的血管炎有魏格納氏肉芽腫、顯微鏡下血管炎、肺出血-腎炎症候群和結節性多動脈炎等。這些疾病都有共同的特點疾病累計全身各個部位的大小動脈和靜脈，可因受累血管的類型、大小、部位、病程及病理改變導致複雜多變的臨床表現；但他們都可檢出特徵性的抗中性粒細胞胞質抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA),是系統性血管炎診斷重要依據。同時，ANCA常在疾病活動或復發前數周即出現濃度的快速升高，而當疾病緩解時，抗體水平迅速下降甚至消失，是檢測病情、判斷治療效果、評價疾病轉歸 的重要指標。ANCA是一種以中性粒細胞和單核細胞胞質成分為靶抗原的自身抗體，包括了大量的自身抗體，其中抗蛋白酶3 (PR3)抗體和抗髓過氧化物酶(MPO)抗體具有明確的臨床診斷意義，是最重要的ANCA抗體。本發明涵蓋了最重要的ANCA抗體PR3和MPO抗體，同時加入了腎小球基底膜抗體(GBM)——與血管炎相關的急進性腎小球腎炎的標誌性抗體，能夠更全面的診斷系統性血管炎。對於自身免疫疾病診斷方法多採用間接免疫螢光分析法(IFA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡，但各有其不足。間接免疫螢光分析法是檢測自身抗體的常用技術。其實驗基質為Hep-2細胞，含有完整的抗原譜，適合篩查試驗。但是有如下缺點不能作為確診依據；結果的判斷需要有豐富的經驗；滴度的意義大於核型，但滴度的判定主觀性強 』靈敏度較低，特異性也不高。酶聯免疫吸附法(ELISA)具有靈敏度高，可作為篩選實驗，也可作為確診依據，還可定量測定，檢測病情和治療效果。但一次試驗只能檢測單一指標，通量低，檢測成本較高，在自身免疫疾病的診斷應用推廣方面存在著極大的局限性。Western blot (WB)是在凝膠電泳和免疫分析技術基礎上發展起來的一種免疫檢測技術，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性的優點，比較適合發現未知的抗體。而對於檢測已知的抗體，由於使用了天然的混合抗原，實驗過程中經常出現找不到目標條帶和條帶偏移的問題，給結果的判讀造成了不少困難，極易誤判和漏判。同時WB使用時間長，也不適合在臨床檢驗中推廣。有人將WB改進，直接將純化抗原包被於硝酸纖維素膜上，然後進行免疫反應檢測抗體，形成了改良的免疫印跡方法，但目前還沒有將該方法用於檢測血管炎的3種自身抗體的應用。對於現有的試劑盒，存在下述缺點
I、WB使用時間長，操作複雜。2、WB使用了天然的混合抗原，實驗過程中經常出現找不到目標條帶和條帶偏移的問題，給結果的判讀造成了不少困難，極易誤判和漏判。3、ELISA方法一次只能檢測一個項目，效率不高。4、IFA方法僅能進行篩查，不具有輔助診斷的意義。5、目前還沒有能同時檢測血管炎相關的3種自身抗體的改良免疫印跡方法。6、目前的試劑盒中，一般沒有對照線或者一個對照線只能作為一個檢測結果對照，沒有能夠同時至少作為2個檢測結果對照的質控帶。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，該試劑盒的質控帶可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶起到判讀的作用。
本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，包括膜條，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由PR3、MPO和GBM中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成。該方法中，功能質控線屬於現有技術，其目的是用於判斷該膜條的一次反應是否有效。步驟I)的陰性和步驟4)的陽性是指當具有這些抗原所能檢測的抗體時為陽性，不具有這些抗原所能檢測的抗體為陰性。本方案的膜條的每個抗原都彼此獨立地劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成一個獨立的抗原檢測線，這些所有的抗原檢測線統稱為抗原條帶，步驟I中的「取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值」，這裡的灰度值為每一個抗原檢測線檢測樣品後掃描得到的灰度值。步驟5)中根據確定的膜條的臨界質控值，技術人員通過本領域的常規技術手段，可以得到合適的人IgG的濃度，採用現有的包被工藝，即可製備臨界質控帶，或者採用本發明下述的專用確定方式來確定。本方案的發明點可同時檢測血管炎相關的3種自身抗體，而且設置了一個可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的臨界質控帶。隨著檢測條帶的增多，每增加一條被檢測條帶，都要對重新進行完整的臨界質控值確定實驗，同時實驗難度顯著加大。通常，確定一個臨界質控值需要許多次實驗，才能最終確定。該檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒還包括酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液。酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液的選擇和範圍都屬於現有技術，對於酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液而言，選用現有技術的產品也可以實現本發明的技術方案。所述臨界質控帶的成分為50ng 25y g/mL的人IgG。現有技術中有選用抗羊IgG作為對照線的記載，如CN200810132304. 8中，但是該專利中的每一個抗原條帶上都需要劃一個抗羊IgG的對照線，這樣製作工藝比較比較繁瑣，而且成本較高，在CN200810132304. 8中，沒有關於同一對照線可以用於2個或者2個以上的抗原條帶判讀的記載。本發明通過創造性實驗發現，選擇一定濃度範圍的人IgG作為臨界質控帶，可以清楚、準確的對2個或者2個以上的抗原條帶進行判讀。作為進一步的優選,所述臨界質控帶的成分為300ng、y g/mL的人IgG。所述臨界質控帶的臨界質控值確定方法包括下述步驟1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp，其中COp= (MP+2XSDP)，m、η、ρ均為自然數且m彡120，n^2,n^p^l ;2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值M、標準差SD、變異係數CV ;3)如CV ( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中C0=(M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV ( 10% ；4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小於CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小於CO，需 再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小於CO，則調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO。根據確定的膜條的臨界質控值確定臨界質控帶包被人IgG的濃度，具體方法為將一定濃度的人IgG溶於Tris或Ifepes緩衝液中，然後劃線於硝酸纖維素膜上製備成成品膜條，且膜條上僅包被臨界質控帶；隨機選取30個膜條檢測步驟I)的隨機陰性樣本，並掃描灰度，計算30次測定的均值Ms、標準差SDs和變異係數CVs，其中CVs=Ms/SDs。臨界質控帶合格的標準為1)0. 97XC0 ^ Ms ^ I. 03XCO ；2)CVs < 5% ;如果不符合其中的任意一個，則需重新調整濃度重複本步驟所有實驗，直至得到合格的臨界質控帶，此時的人IgG包被濃度即為臨界質控帶的包被濃度。根據確定的膜條的臨界質控值，技術人員通過本領域的常規技術手段，可以確定合適的人IgG的濃度，採用現有的包被工藝，即可製備臨界質控帶。也可以才本方案的專用確定方式進行確定。所述酶標液為辣根過氧化物酶標記的羊/鼠/兔抗人IgG抗體。 所述底物為質量百分比濃度為O. 02%-2%的魯米諾或質量百分比濃度為
O.002%-0. 2%的過氧化氫構成的單一試劑。採用該改良單試劑底物，加入底物後不需終止。所述抗原條帶相互平行並且每個抗原條帶寬度均一，各相鄰抗原條帶之間間隔等寬。具體地，抗原條帶寬度為O.相鄰抗原條帶之間間隔為2mm-20mm。所述血管炎疾病包括魏格納氏肉芽腫、顯微鏡下血管炎、肺出血-腎炎症候群、急進性腎小球腎炎和結節性多動脈炎等。所述PR3、MPO和GBM是由昆蟲細胞sf9表達並純化製得。與現有技術相比較，本發明的有益效果是
I、可同時檢測血管炎相關的3種自身抗體，並可作為輔助診斷的依據。2、本發明具有獨創性的臨界質控帶，一個臨界質控帶可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的作用，將顯色條帶與臨界質控帶的顏色的深淺比較即可判斷結果陽性顏色比臨界質控帶相同或深；陰性顏色比臨界質控帶淺。3、本發明還改良了單試劑底物，加入底物後不需終止。4、每個抗原條帶寬度均一，條帶間隔等寬，膜條背景乾淨，使結果判定更加簡單可
O
圖I是本發明膜條的結構示意 圖2是臨界質控值確定流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但本發明的實施方式不僅限於下述實施例。實施例I :
參見圖I至圖2所示，圖2中的CO質控線即為臨界質控帶；本實施例的檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒包括膜條、酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液，其中酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液的選擇和範圍都屬於現有技術，對於酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液而言，選用現有技術的產品也可以實現本發明的技術方案。膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由PR3、MPO和GMB中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成，本實施例的臨界質控帶的成分為50ng 25y g/mL的人IgG。 本試劑盒創造性的加入了能同時最多對3個被檢抗體(抗原條帶)進行陰陽性判定的臨界質控帶。具體的流程見圖2的流程圖所示。臨界質控帶的臨界質控值確定方法包括下述步驟
1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、η、P均為自然數且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ;
2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值Μ、標準差SD、變異係數CV ；
3)如CV( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV ^ 10% ；
4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小於CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小於CO，需再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小於CO，則調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO。總的來說，臨界質控值的確定有兩個關鍵點，第一是3個條帶的灰度上限的CV不能超過10%，否則需要重新調整相應抗原的印跡濃度後再進行實驗。第二是用陽性樣本來驗證臨界質控帶，如果兩次實驗某個樣本的灰度都小於臨界質控值，那麼需要重新做整個實驗。並且隨著檢測條帶的增多，每增加一條被檢測條帶，都要對重新進行完整的臨界質控值確定實驗，同時實驗難度顯著加大。通常，確定一個臨界質控值需要許多次實驗，才能最終確定。實施例2
本實施例是對由PR3、MP0和GMB這3個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成的抗原條帶進行試驗測定。在實施例I的基礎上，為了使結果判定更加簡單可靠，將每個抗原條帶寬度均一設置，條帶間隔等寬，抗原條帶寬度為O.相鄰抗原條帶之間間隔為2mm-20mm，膜條背景乾淨，並且採用改良的單試劑底物，加入底物後不需終止，底物為魯米諾O. 02%-2%或過氧化氫O. 002%-0. 2%構成的單一試劑；所有的印跡抗原都是高度純化的，且採用了國際最新的包被工藝，具體包被方法見後述。臨界質控值的確定
I)確定各抗體的臨界質控值
隨機選取臨床確診為陰性的新鮮血清、血漿標本123份，用本實施例的試劑盒檢測。測定其抗原條帶所檢測的相應抗體的灰度值，計算125份標本中各相同抗體的灰度值均值Mp和標準差SDp，可得到每個抗體95%的置信上限(MP+2XSDP)，即為各抗體的臨界質控值，記作C0P。結果見下表,本實施例m=123, n=p=3。
Mp叫co I PR310 5r 9i
MPO9S￡154.............................................I & 4
_GBM__IC-S 』__15J__HO.I[2)確定膜條的臨界質控值
將上述各抗體的COp進行處理計算它們的平均值M和標準差SD和變異係數CV(CV =M/SD)，若CV > 10%，應調整相應印跡抗原的濃度，重做步驟I)、步驟2);若CV ( 10%，則可得到膜條的臨界質控值，記作CO = (M+2XSD)。結果見下表
PRJI159 J:
_I_I
MPOI129.4I
GBM -ic'tjM j 136JSD j 6 _CV_j 4 4-0 ο
_CO_j_14S _
本次實驗CV = 4. 4%，CO有效，為148. 2。3)驗證膜條的臨界質控值的有效性。隨機選取臨床確診為陽性的新鮮血清、血漿標本95份，測定其相應抗體灰度值，與CO比較。經試驗確定，本次實驗所有陽性樣本的灰度值均超過臨界質控值，該臨界質控值有效。實施例3
本實施例是根據實施例2確定的膜條的臨界質控值(在圖2及本發明的所有實施例中，COp為單個抗體的臨界質控值，CO為整個膜條的臨界質控值)，來調節臨界質控帶包被人IgG的濃度，最終確定臨界質控帶的包被濃度和包被工藝。具體操作為將一定濃度的人IgG溶於Tris或Hepes緩衝液中，然後用全自動點樣儀劃線於硝酸纖維素膜上，並經過封閉、乾燥、切割等工藝製備成成品膜條，且膜條上僅包被臨界質控帶。隨機選取30個膜條檢測步驟I)的隨機陰性樣本，並掃描灰度，計算30次測定的均值(Ms)、標準差(SDs)和變異係數(CVS)，其中CVs=Ms/SDs。臨界質控帶合格的標準為1)0. 97XCO(膜條的臨界質控值)(Ms(I. 03 X CO ；2)CVS < 5%。如果不符合其中的任意一個，則需重新調整濃度或包被工藝進行本實施例所述的所有實驗，直至得到合格的臨界質控帶，此時的人IgG包被濃度即為臨界質控帶的包被濃度。結果見下表
權利要求
1.一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，包括膜條，其特徵在於，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由PR3、MPO和GBM中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成。
2.根據權利要求I所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒,其特徵在於,還包括酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液。
3.根據權利要求I所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，其特徵在於，所述臨界質控帶的成分為50ng 25y g/mL的人IgG。
4.根據權利要求3所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，其特徵在於，所述臨界質控帶的成分為300ng、y g/mL的人IgG。
5.根據權利要求I至4任一項所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒,其特徵在於，所述臨界質控帶的臨界質控值確定方法包括下述步驟 1)選擇m個確診為陰性的新鮮血液標本作為樣本，膜條的抗原條帶中具有η個抗原，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將m個樣本中相同的抗原所檢測抗體的灰度值作為一組數值得到η組數值，分別計算這η組數值的平均值Mp、標準差SDp和各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp，其中COp= (MP+2XSDP), m、η、P均為自然數且m彡120，η彡2，η彡ρ彡I ; 2)將各個抗原所檢測抗體的臨界質控值COp進行處理，計算其平均值Μ、標準差SD、變異係數CV ； 3)如CV( 10%，則可得到膜條的臨界質控值CO，其中CO= (M+2XSD);如CV > 10%，調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)重新測定，直至CV ^ 10% ； 4)選擇確診為陽性的新鮮血液標本作為樣本，取膜條對每一個樣本進行檢測，掃描得到膜條中每一個抗原所檢測抗體的灰度值，將其與膜條的臨界質控值CO比較，如所有的樣本灰度值均不小於CO，則CO有效；如有一個或以上的樣本灰度值小於CO，需再次測定驗證；如仍有一個或以上的樣本灰度值小於CO，則調整印跡抗原量重複步驟I)、步驟2)、步驟3)重新確定膜條的臨界質控值CO。
6.根據權利要求5所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒,其特徵在於,根據確定的膜條的臨界質控值確定臨界質控帶包被人IgG的濃度，具體方法為將一定濃度的人IgG溶於Tris或Hepes緩衝液中，然後劃線於硝酸纖維素膜上製備成成品膜條，且膜條上僅包被臨界質控帶；隨機選取30個膜條檢測步驟I)的隨機陰性樣本，並掃描灰度，計算30次測定的均值Ms、標準差SDs和變異係數CVs，其中CVs=MsZSDs,臨界質控帶合格的標準為1)0.97XC0 ^ Ms ^ 1.03XC0；2)CVS < 5% ;如果不符合其中的任意一個，則需重新調整濃度重複本步驟所有實驗，直至得到合格的臨界質控帶，此時的人IgG包被濃度即為臨界質控帶的包被濃度。
7.根據權利要求I至4任一項所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，其特徵在於，所述底物為質量百分比濃度為O. 02%-2%的魯米諾或質量百分比濃度為O.002%-0. 2%的過氧化氫構成的單一試劑。
8.根據權利要求I至4任一項所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒,其特徵在於，所述抗原條帶相互平行並且每個抗原條帶寬度均一，各相鄰抗原條帶之間間隔等寬。
9.根據權利要求I至4任一項所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒，其特徵在於，所述血管炎疾病包括魏格納氏肉芽腫、顯微鏡下血管炎、肺出血-腎炎症候群、急進性腎小球腎炎和結節性多動脈炎。
10.根據權利要求I至4任一項所述的一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒,其特徵在於，所述PR3、MPO和GBM是由昆蟲細胞sf9表達並純化製得。
全文摘要
本發明涉及一種檢測血管炎相關自身抗體譜的試劑盒。該試劑盒包括膜條、酶標液、底物和濃縮洗滌孵育液，膜條由載片和依次固定在載片上的抗原條帶、臨界質控帶、功能質控線構成，抗原條帶由PR3、MPO和GMB中的至少兩個彼此獨立的劃線到硝酸纖維素膜或尼龍膜上形成。本發明具有獨創性的臨界質控帶，一個臨界質控帶可以同時對兩個乃至更多的檢測條帶(抗原條帶)起到判讀的作用，結果判定更加簡單可靠。
文檔編號G01N33/564GK102944676SQ201210456400
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者李想, 周帥, 何濤濤, 陳洪, 鄭麗, 陳衛, 陳川 申請人:四川省新成生物科技有限責任公司