一種化學發光底物增強劑的製作方法
2023-10-09 06:40:14 2
專利名稱：一種化學發光底物增強劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫檢測技術領域，特別是提供了一種化學發光底物增強劑。
背景技術：
化學發光免疫分析在過去十年來，以其高靈敏度和寬檢測範圍在臨床檢測中發揮了越來越多的作用(尹東光等，幾種主要化學發光物質的發光性能及其化學發光免疫分析體系，標記免疫分析與臨床，2002，9225-230)。在發光免疫分析中，最常用的發光物質包括魯米諾/異魯米諾，丫啶酯和環二氧乙烷衍生物(dioxetanes)等。魯米諾/異魯米諾及丫啶酯化學發光系統均屬於閃光型發光，需要相對複雜的檢測儀器。這些系統具有很多優點，但是與放免相比，它們的系統相對複雜。從技術上講，優化十分困難，許多化學成分的使用都影響信噪比。而環二氧乙烷衍生物如AMPPD、CSPD和CDP-Star等系統的發光屬於輝光型，利用酶的催化反應來引發發光，同時發光底物本身的化學結構具有較好的熱力學穩定性(Stephan Beck等，Perspectiveananlyticalbiotechnology，Anal.Chem.1990，622258-2270.)。因此，其使用受到越來越多的重視。
為了增強發光強度，延遲發光時間，常在底物溶液中使用水溶性大分子如牛血清白蛋白(BSA)和表面活性劑(如CTAB、SDS等)。此外，還發現一些螢光素可以增強發光(1，2-Dioxetanesnovelchemiluminescent enzyme substrate.Applications to immunoassays，Journalof bioluminescence and chemiluminescence，1989，499-111.)。
發明內容
本發明的目的提供一種化學發光底物增強劑，一種新的CSPD底物增強劑溶液的配方，該增強劑可以溶解在底物溶液中起作用，也可以單獨配製，在反應時與CSPD底物分別加入。在化學發光免疫分析中，CSPD底物增強劑溶液可以與鹼性磷酸酶作用而發光，其發光強度與鹼性磷酸酶的量成正比。
本發明的組分包括氯化十六烷三甲基銨(CTAC)，1，2肉蔻醯-Sn-甘油-3-磷酸二鈉鹽(DGPD)，牛血清白蛋白(BSA)，5』-18烷氨基螢光素。
本發明配方中CTAC的工作濃度範圍為4-10mg/L，DGPD的工作濃度範圍為1-30mg/L，BSA的工作濃度範圍為1-50g/L，5』-18烷氨基螢光素的工作濃度範圍為5-100mg/L。
本發明配方溶解的緩衝液為碳酸鹽緩衝液或二乙醇胺緩衝液，pH值範圍為9.0-10.0。
本發明的優點在於提供一種簡單的CSPD發光底物增強劑溶液的配方。此外，在使用本發明的增強劑溶液時，使用較低的CSPD底物的工作濃度可以較好的分析效果。
本發明的另一個優點在於增強劑溶液的配方所有相關的化學試劑均可以從商業途徑採購，價格便宜。
圖1為本發明測量發光反應的時間曲線。其中，橫坐標為時間，縱坐標為相對光強。
圖2為測量發光反應的時間曲線，無增強劑。
圖3為本發明PRL劑量反應曲線，其中，橫坐標為濃度，縱坐標為相對發光強度。
具體實施例方式
實施例1 增強劑溶液的配製1.06g二乙醇胺，溶解在80ml的去離子水中調pH至9.5，加入0.02g MgCl2，0.4mg CTAC，0.2mg DGPD，0.5g BSA和1.2mg 5』-18烷氨基螢光素，攪拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um過濾器過濾溶液，於4℃貯存。使用時，用增強劑溶液稀釋底物至0.10mM。
增強發光反應的時間曲線使用2.96×10-15摩爾的鹼性磷酸酶，加入200ul的底物增強劑工作液，混勻後，室溫反應，使用BPCL發光測定儀(中科院生物物理所研製)測量發光反應的時間曲線(見圖1)。
使用二乙醇胺溶液稀釋的底物溶液作為對照溶液，該溶液與鹼性磷酸酶的發光反應的時間曲線見圖2。
實施例2 人催乳素(PRL)化學發光免疫分析試劑磁分離試劑包被羊抗異硫氰酸螢光素的磁珠，直徑1um，工作濃度6mg/ml；PRL單抗-異硫氰酸螢光素工作液0.75ug/ml；PRL單抗-鹼性磷酸酶工作液1.0ug/ml；PRL標準品0，40，200，500，2000和5000uIU/ml；以上試劑由北京倍愛康生物技術股份有限公司提供。
清洗液氯化鈉(NaCl)2g，磷酸二氫鈉(NaH2PO4.12H2O)2.9g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.2g，氯化鉀(KCl)0.2g，曲拉通X-1000.5ml，吐溫200.2ml，布蘭尼道克斯(Bronidox-L)5g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，於室溫保存。
發光底物增強劑溶液配製0.05mmol/l，pH9.8碳酸鹽緩衝液100ml。取80ml加入0.02g MgCl2，0.5mg CTAC，1.0mg DGPD，1.0g BSA和1.0mg 5』-18烷氨基螢光素，攪拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um過濾器過濾溶液，於4℃貯存。使用時，用增強劑溶液稀釋CSPD底物原液至0.06mM。
操作步驟1、加樣與免疫反應在平底試管中加入15μl標準品，30μl PRL單抗-異硫氰酸螢光素工作液，PRL單抗-鹼性磷酸酶工作液，以及60μl10mg/ml磁分離試劑，混勻後，37℃溫育30分鐘。
2、洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然後用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管中加入清洗液150μl，充分混勻後，將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然後用一大而緩慢的圓周運動倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。重複兩次。
3、加入200μl發光底物增強劑溶液，室溫下震蕩反應15分鐘。
4、在BPCL化學發光測定儀上讀取發光值，並進行曲線擬合。
結果見圖3。
權利要求
1.一種化學發光底物增強劑，其特徵在於組分包括氯化十六烷三甲基銨CTAC，1，2肉蔻醯-Sn-甘油-3-磷酸二鈉鹽DGPD，牛血清白蛋白BSA，5』-18烷氨基螢光素；各組分的工作濃度範圍為CTAC為4-10mg/L，DGPD為1-30mg/L，BSA為1-50g/L，5』-18烷氨基螢光素為5-100mg/L。
2.按照權利要求1所述的化學發光底物增強劑，其特徵在於化學發光底物增強劑溶解的緩衝液為碳酸鹽緩衝液或二乙醇胺緩衝液，pH值範圍為9.0-10.0。
全文摘要
本發明提供了一種化學發光底物增強劑，屬於免疫檢測技術領域。其組分包括氯化十六烷三甲基銨CTAC，1，2肉蔻醯－Sn－甘油－3－磷酸二鈉鹽DGPD，牛血清白蛋白BSA，5』－18烷氨基螢光素；各組分的工作濃度範圍為CTAC為4－10mg/L，DGPD為1－30mg/L，BSA為1－50g/L，5』－18烷氨基螢光素為5－100mg/L。該增強劑可以溶解在底物溶液中起作用，也可以單獨配製，在反應時與CSPD底物分別加入。化學發光底物增強劑溶解的緩衝液為碳酸鹽緩衝液或二乙醇胺緩衝液，pH值範圍為9.0－10.0。本發明的優點在於使用較低的CSPD底物的工作濃度可以較好的分析效果。並且增強劑溶液的配方所有相關的化學試劑均可以從商業途徑採購，價格便宜。
文檔編號C09K11/00GK1719254SQ200510083929
公開日2006年1月11日 申請日期2005年7月15日 優先權日2005年7月15日
發明者劉振世, 王法龍, 周昊, 王東, 張波, 陳海生, 謝晶, 胡曉焱, 張小平, 孫海濤, 黃建梅, 吳丹民, 張玉慶 申請人:武漢賽文生物技術有限公司