異源α澱粉酶在麴黴中的表達的製作方法

2023-10-09 19:33:24 3

專利名稱：異源α澱粉酶在麴黴中的表達的製作方法
技術領域：
0002本發明涉及α澱粉酶，其來源於河內麴黴(Aspergillus kawachi)菌株。進一步地，本發明涉及α澱粉酶在絲狀真菌宿主細胞諸如麴黴細胞(例如黑麴黴(Aspergillus niger))中的異源表達，並且涉及包含該α澱粉酶的酶組合物。
背景技術：
0003葡糖澱粉酶(glucoamylases)，包括具有顆粒澱粉水解(GSH)活性的葡糖澱粉酶，是重要的工業用酶，其被用於生產產品諸如有機酸(例如乳酸)、胺基酸(例如穀氨酸)、糖類增甜劑產品(例如葡萄糖和高果糖玉米糖漿)、醇類(例如乙醇)和其它來自於源於穀物(grains)和穀類(cereals)的澱粉底物的化合物。此外，在微生物發酵過程中，特別是在同步糖化發酵(SSF)過程中，當使用顆粒澱粉底物作為碳源時，減少在發酵中的殘留澱粉量將是有利的。本發明通過提供α澱粉酶例如具有顆粒澱粉水解(GSH)活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)而滿足了這一需求，所述的α澱粉酶可以與葡糖澱粉酶組合使用以增強澱粉水解作用並提高醇類產量。
0004本發明優於現有技術組合物和方法的一些優點包括下列一項或多項a)減少在澱粉水解和/或終產物生產過程中的熱能使用；b)減少對高酶劑量的需求；c)利用從澱粉連續釋放的葡萄糖來飼餵酵母；d)保持發酵罐中相對低的葡萄糖水平，這可以降低微生物汙染的高風險，並可以排除由於高濃度游離葡萄糖而造成的對酵母的分解代謝產物抑制作用；e)減少褐變反應產物的形成；f)降低或排除了鈣的添加，而鈣的添加在現有技術的噴射蒸煮工藝中可能是必需的；g)減少發酵過程中水的使用；h)在發酵過程中使用更高含量的固體，這可以導致更高水平的終產物形成並降低能源成本；i)減少了某些副產品諸如甘油的生產水平；和/或j)減少了殘留澱粉含量並增加了蒸餾器幹穀物和可溶物的蛋白質含量。
發明概述0005在一個方面，本發明涉及包含異源多核苷酸的真菌宿主細胞，所述異源多核苷酸編碼具有顆粒澱粉水解(GSH)活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)，所述α澱粉酶與SEQ ID NO3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些實施方式中，該異源多核苷酸將編碼與SEQ ID NO3的序列具有至少95％序列同一性的、具有GSH活性的asAA。在一些實施方式中，真菌宿主細胞是木黴(Trichoderma)細胞，諸如裡氏木黴(T.reesei)細胞。在其它實施方式中，真菌宿主細胞是麴黴(Aspergillus)細胞，諸如黑麴黴(A.niger)。
0006在第二個方面，本發明涉及具有GSH活性的asAA，其包括與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的胺基酸序列。在此方面的一些實施方式中，具有GSH活性的asAA將是截短的asAA。在一些實施方式中，該截短的asAA包括序列SEQID NO9或者與該序列具有至少97％序列同一性的序列。
0007在第三個方面，本發明涉及酶組合物，其包含具有顆粒澱粉水解(GSH)活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)，其中該asAA具有與序列SEQ ID NO3至少90％的序列同一性。在一些實施方式中，所述酶組合物包含截短的asAA酶，所述酶與SEQ ID NO9具有至少97％的序列同一性。在一些實施方式中，所述asAA將從真菌宿主細胞中異源多核苷酸的表達中獲得。在進一步的實施方式中，該真菌宿主細胞將是木黴或麴黴宿主細胞。在其它實施方式中，組合物將進一步包括葡糖澱粉酶。在一些實施方式中，所述葡糖澱粉酶將從麴黴或根黴(Rhizopus)菌株中獲得。在其它實施方式中，所述葡糖澱粉酶將是具有GSH活性的葡糖澱粉酶並將從麴黴、木黴、根黴或腐質黴(Humicola)菌株中獲得。在其它實施方式中，asAA和葡糖澱粉酶兩者將在含有異源多核苷酸的同一真菌宿主中表達，所述異源多核苷酸表達具有GSH活性的asAA和葡糖澱粉酶。在其它實施方式中，本發明涉及使用此方面所述的酶組合物來水解澱粉諸如顆粒澱粉的方法。
0008在第四個方面，本發明涉及重組的麴黴菌株，其包含編碼葡糖澱粉酶的DNA和編碼異源α澱粉酶的DNA，所述α澱粉酶具有與SEQ ID NO3或SEQ IDNO4至少90％的序列同一性，其中所述葡糖澱粉酶和異源α澱粉酶由該麴黴菌株表達並分泌。
0009在第五個方面，本發明涉及在絲狀真菌宿主細胞中生產α澱粉酶和葡糖澱粉酶的方法，包括用DNA構建物轉化生產葡糖澱粉酶的麴黴宿主細胞，所述DNA構建物包括在該麴黴宿主細胞中具有轉錄活性的啟動子，該啟動子被可操縱地連接於編碼α澱粉酶的多核苷酸，該α澱粉酶具有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少85％的序列同一性；將該轉化的麴黴宿主細胞培養於合適的培養基中以使其能夠表達所述α澱粉酶和葡糖澱粉酶；並生產α澱粉酶和葡糖澱粉酶。在一種實施方式中，該方法進一步包括回收所生產的α澱粉酶和葡糖澱粉酶。
0010在第六個方面，本發明涉及在麴黴細胞中生產α澱粉酶的方法，其包括在適於表達和生產異源α澱粉酶的條件下培養能夠表達異源α澱粉酶多肽的麴黴細胞，該異源α澱粉酶多肽具有與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少90％的序列同一性，並生產該異源α澱粉酶。
0011在第七個方面，本發明涉及在絲狀真菌宿主細胞中生產異源酸穩定性α澱粉酶和葡糖澱粉酶的方法，包括在絲狀宿主中共表達葡糖澱粉酶和α澱粉酶，這是通過下面的步驟完成的用DNA構建物轉化絲狀真菌細胞，所述DNA構建物包括在該宿主細胞中具有轉錄活性的啟動子，該啟動子被可操縱地連接於編碼α澱粉酶的多核苷酸，該α澱粉酶具有與SEQ ID NO3至少90％的序列同一性，其中所述宿主細胞進一步表達並生產葡糖澱粉酶，將該轉化的宿主細胞培養於合適的培養基中以使其能夠表達所述α澱粉酶和葡糖澱粉酶，並生產α澱粉酶和葡糖澱粉酶。
0012在第八個方面，本發明涉及水解澱粉諸如顆粒澱粉的方法，其包括將含有澱粉的底物與包含α澱粉酶和葡糖澱粉酶的酶組合物相接觸，所述酶組合物按照本發明所包括的方法生產。在一種實施方式中，接觸包括將底物與包含麴黴細胞的培養基相接觸，該麴黴細胞產生葡糖澱粉酶和α澱粉酶。在另一實施方式中，接觸包括將底物與葡糖澱粉酶和α澱粉酶相接觸，所述葡糖澱粉酶和α澱粉酶已從產生葡糖澱粉酶和α澱粉酶的麴黴細胞的培養物中回收。在進一步的實施方式中，所述α澱粉酶具有與序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4至少85％的序列同一性。


0013圖1提供了編碼天然河內麴黴酸穩定性α澱粉酶的基因組DNA序列(SEQID NO1)。八個推定的內含子用下劃線標示。
0014圖2說明了由圖1的多核苷酸編碼的蛋白(SEQ ID NO4)。推定的信號序列(胺基酸1-21)用下劃線和黑體表示(SEQ ID NO2)。推定的接頭(linker)是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSS SCTATSTT(SEQ ID NO8)。該接頭上遊的胺基酸，未加下劃線，包括催化結構域(SEQ ID NO9)，該接頭下遊的胺基酸包括澱粉結合結構域(SBD)(SEQ ID NO10)。所述SBD包括圖2中所述多肽的最後102個胺基酸。成熟蛋白缺少信號序列，用催化結構域、接頭和SBD的胺基酸序列(SEQ ID NO3)來表示。
0015圖3A-D提供了質粒pTrex3g_Akalpha(圖4)完整的核苷酸序列(SEQ IDNO5)，10990bp。
0016圖4提供了pTrex3g_Akalpha質粒圖，該質粒被用來表達編碼AsaA(河內麴黴asAA)的核酸，且其含有位於真菌表達載體側翼的EcoRI位點，在所述的真菌表達載體中，a)cbhl啟動子是裡氏木黴的纖維二糖水解酶啟動子；b)asaA是編碼SEQ ID NO.4的酸穩定性α澱粉酶的河內麴黴多核苷酸；c)cbhl終止子是裡氏木黴的纖維二糖水解酶終止子；d)amdS是構巢麴黴(Aspergillus nidulans)乙醯胺酶營養標記基因；和e)attB是用於重組的Gateway克隆系統(Invitrogen)λ噬菌體位點。
0017圖5提供了pSL898_Muni質粒圖(8951bp)(參見A)和pSL902質粒(10782bp)(參見B)，它們被用來在黑麴黴宿主中表達編碼AsaA的核酸。
0018圖6的A和B提供了SDS-PAGE凝膠圖，其顯示了在如實施例5所述的裡氏木黴克隆的代表性發酵過程中裡氏木黴的asaA表達情況。在圖6A中，泳道1表示標準See Blue+2標記物；泳道2表示80小時后里氏木黴表達的AsaA；泳道3表示162小時后里氏木黴表達的AsaA，泳道4表示162小時的裡氏木黴宿主細胞對照，其中所述宿主細胞並未用asaA轉化。在大約90kDa清楚地觀察到AsaA蛋白帶，此條帶在宿主菌株對照中不存在。在圖6B中，泳道1表示210小時后里氏木黴表達的完整AsaA，泳道2表示200小時后里氏木黴表達的完整形式和截短形式的AsaA的三個條帶，泳道3表示分子量標記對照。
0019圖7說明了在裡氏木黴宿主中天然的河內麴黴(nAk-AsaA)和表達的河內麴黴(rAk-AsaA)(SEQ ID NO3)的pH穩定性，表示為％殘留活性，如實施例6所述。
發明詳述0020在一些方面，本發明依賴於在遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法。下列資源包括了對本發明有用的一般方法學的描述Sambrook et al.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(2nd Ed.，1989)；Kreigler.GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)andAusubel etal.，Eds.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這並不意味著將本發明限定於所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
0021除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。Singleton，et al.，DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性釋義。
0022儘管任何與本文中所述的方法和材料相似或等價的方法和材料都可以被應用於本發明的實踐或檢驗，但優選的方法和材料被描述。
0023現在將使用以下定義和實例僅以作為參考的方式詳細描述本發明。本文中所引用的全部專利和出版物，包括在這些專利和出版物中所公開的所有序列，被明確地併入本文作為參考。
0024數字範圍包括定義該範圍的數字。
0025除非另作說明，核酸是按5′至3′方向從左至右書寫；胺基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
0026本文中提供的標題並非是對本發明的各個方面或實施方式的限定，本發明的各個方面和實施方式可以通過參考整個說明書來理解。
定義0027如本文所用，術語「澱粉」指植物的複雜多糖碳水化合物構成的任何物質，包括具有式(C6H10O5)X的直鏈澱粉和支鏈澱粉，其中X可以是任何數字。具體而言，該術語指任何基於植物的物質，包括但不限於穀物、草、塊莖和根，更具體而言，小麥、燕麥、玉米、黑麥、稻、高粱、糠、木薯、粟、馬鈴薯、甘薯和木薯。
0028如本文所用，術語「顆粒澱粉」指生(未煮熟的)澱粉，例如尚未經過糊化處理的澱粉。
0029如本文所用，術語「顆粒澱粉水解(GSH)酶」和「具有顆粒澱粉水解(GSH)活性」指具有水解顆粒形式的澱粉的能力的酶。
0030如本文所用，術語「α澱粉酶(例如E.C.類3.2.1.1)」指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述為在含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單位的多糖中完成1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內切水解的酶。另一個用於描述這些酶的術語是「糖原酶(glycogenase)」。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶(α-1，4-glucan-4-glucanohydrase glucanohydrolase)。
0031如本文所用，術語「酸穩定性α澱粉酶(″asAA″)」指在pH 3.0至7.0的pH範圍內以及在pH 3.5至6.5的pH範圍內具有活性的α澱粉酶。
0032如本文所用，術語「截短的」，諸如「截短的α澱粉酶」，指酶，其中至少一部分的澱粉結合結構域已被去除，但功能性部分保留了生物學功能，諸如催化功能。
0033如本文所用，術語「澱粉結合結構域(SBD)」指優先地結合於澱粉(多糖)底物的胺基酸序列。
0034如本文所用，術語「接頭」指短的胺基酸序列，一般具有3至40個胺基酸殘基，其共價地將包含澱粉結合結構域的胺基酸序列連接於包含催化結構域的胺基酸序列。
0035如本文所用，術語「催化結構域」指多肽的結構區，其不同於SBD並含有用於底物水解的活性位點。
0036如本文所用，術語「葡糖澱粉酶」指澱粉葡萄糖苷酶類的酶(例如EC.3.2.1.3，葡糖澱粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些是外切作用酶，其從直鏈澱粉和支鏈澱粉分子的非還原性末端釋放出葡糖基殘基。該酶也水解α-1，6和α-1，3鍵，儘管水解速度大大慢於α-1，4鍵。
0037如本文所用，術語「糖基化作用」指通過加入碳水化合物部分對蛋白質進行的轉錄後修飾，其中所述碳水化合物是N-連接或O-連接的，由此形成糖蛋白。糖蛋白的N-連接碳水化合物部分通過糖苷鍵被連接於天冬醯胺殘基的β-醯胺氮上。O-連接碳水化合物通過糖苷鍵經絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基被連接於蛋白質上。
0038如本文所用，術語「重組」當被用於指代細胞、核酸、蛋白或載體時，表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾，或者所述細胞來自於如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的該細胞中不曾發現的基因，或者表達天然基因，但這些基因異常表達、表達不足(under expressed)或者完全不表達。
0039如本文所用，術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可以互換使用。本文使用胺基酸殘基的傳統的單字母或三字母代碼。
0040如本文所用，術語「信號序列」表示結合於蛋白質N-末端部分的胺基酸序列，其促進成熟形式的蛋白質分泌至細胞外。信號序列的定義是一種功能性定義。成熟形式的胞外蛋白缺少信號序列，其在分泌過程中被切除。
0041如本文所用，術語「天然的酸穩定性α澱粉酶(n-asAA)」指由asAA的內源性表達而產生的酸穩定性α澱粉酶(asAA)。例如，術語「n-asaA」表示來自河內麴黴的內源性表達的酸穩定性α澱粉酶(例如SEQ ID NO3)。
0042如本文所用，術語「重組的酸穩定性α澱粉酶(r-asAA)」、「重組表達的asAA」和「重組生產的asAA」指由宿主細胞表達異源多核苷酸而產生的成熟asAA蛋白序列。例如，術語「r-asaA」表示在宿主中表達並產生的河內麴黴酸穩定性α澱粉酶(例如SEQ ID NO3)，在所述宿主中已導入編碼asaA的多核苷酸。
0043如本文所用，術語「基因」指參與生產多肽的DNA片段，包括編碼區之前和之後的區域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
0044如本文所用，術語「核酸」包括DNA、RNA，單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
0045術語「核酸」和「多核苷酸」在本文中可以互換使用。
0046如本文所用，術語「載體」指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
0047如本文所用，術語「表達載體」表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱地連接於能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉錄的啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼mRNA上的合適的核糖體結合位點的序列、增強子以及控制轉錄和翻譯的終止的序列。
0048如本文所用，術語「啟動子」表示參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的調控序列。啟動子可以是誘導型啟動子或者組成型啟動子。
0049如本文所用，短語「在轉錄控制下」是指多核苷酸序列——通常是DNA序列——的轉錄決定於其被可操縱地連接於一種元件，該元件有助於啟動轉錄或者促進轉錄。
0050如本文所用，短語「在翻譯控制下」是本領域所熟知的術語，其是指在mRNA形成之後發生的調控過程。
0051如本文所用，當描述蛋白或編碼它們的基因時，用於該基因的術語一般用斜體表示(例如，編碼asaA(河內麴黴asAA)的基因可以被表示為asaA)。用於蛋白的術語一般不用斜體表示，且首字母一般大寫(例如，由asaA基因編碼的蛋白可以表示為AsaA或者asaA)。
0052如本文所用，術語「來源(derived)」涵蓋了術語「源自(originated from)」、「獲得(obtained)」或「可獲得自(obtainable from)」以及「分離自(isolated from)」，且如本文所用，其表示由核苷酸序列編碼的多肽由天然存在該核苷酸的細胞或者已被插入該核苷酸序列的細胞產生。
0053如本文所用，術語「可操縱地連接(operably linked)」指並列關係，其中元件以允許它們在功能上相互關聯的方式排布。例如，如果啟動子控制某序列的轉錄，則該啟動子被可操縱地連接於該編碼序列。
0054如本文所用，術語「選擇性標記(selective marker)」指能夠在宿主中表達的基因，其使得能夠方便地選擇那些含導入的核酸或載體的宿主。
0055與另一序列具有某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，當被聯配時，在比較這兩個序列時所述百分比的鹼基或胺基酸殘基是相同的。所述聯配以及同源性或同一性百分比可以用本領域已知的任何合適的軟體程序確定，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY (F.M.Ausubel et al.(eds)1987，增刊30，7.7.18節)中描述的那些軟體程序。優選的程序包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson et al.(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 852444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul et al.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，MD，and Altschul et al.，(1997)NAR 253389-3402)。另一個優選的聯配程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，PA)，優選地使用默認參數。另一個有用的序列軟體程序是TFASTA數據檢索程序，其可在序列軟體套裝版6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，W1)中獲得。由於遺傳密碼是簡併的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定的胺基酸，本發明包括編碼特定的胺基酸序列的多核苷酸。
0056本領域的技術人員將認識到，本發明所包含的序列也通過在嚴緊雜交條件下與示例性asaA序列(例如SEQ ID NO1)進行雜交的能力來定義。當單鏈形式的核酸可以與另一核酸在適當的溫度和溶液離子強度條件下進行退火時，該核酸可與該另一核酸序列雜交。雜交和洗滌條件是本領域所熟知的(參見例如Sambrook(1989)見上，具體地第9章和第11章)。在一些實施方式中，嚴緊條件對應於65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。
0057如本文所用，「宿主菌株」或「宿主細胞」是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表達載體或DNA構建物包含本發明的編碼α澱粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。術語宿主細胞或宿主菌株指由絲狀真菌菌株細胞所產生的細胞和原生質體。
0058術語「絲狀真菌」指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見Alexopoulos，C.J.(1962).INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York and AINSWORTH ANDBISBY DICTIONARY OF THE FUNGI，9thEd.(2001)Kirk et al.，Eds.，CABInternational University Press，Cambridge UK)。這些真菌的特徵是帶有由幾丁質、纖維素和其它複雜多糖組成的細胞壁的營養菌絲體。本發明所述的絲狀真菌在形態學、生理學和遺傳學上不同於酵母。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲的延伸來完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發明中，絲狀真菌親代細胞可以是，但不限於，木黴(例如裡氏木黴(以前被分類為長枝木黴(T.longibrachiatum)，目前也被稱為Hypocrea jecorina)、綠色木黴(Trichoderma viride)、康寧木黴(Trichoderma koningii)、哈茨木黴(Trichoderma harzianum))、青黴屬某種(Penicillium sp.)、腐質黴屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質黴(Humicola insolens)和灰腐質黴(Humicola grisea))；Chrysosporiumsp.(例如C.lucknowense)、粘帚黴屬某種(Gliocladium sp.)、麴黴屬某種(Aspergillus sp.)(例如米麴黴(A.oryzae)、黑麴黴(A.niger)、河內麴黴(A.kawachi)、泡盛麴黴(A.awamori))、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢黴屬某種(Neurosporasp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細胞(也參見Innis等，(1985)Sci.22821-26)。
0059如本文所用，術語「木黴」或「木黴屬某種」指以前或目前被分類為木黴屬的任何真菌屬。
0060如本文所用，術語「培養」指使一群微生物細胞在適當條件下在液體或固體培養基中生長。在一種實施方式中，培養指將澱粉底物諸如包含顆粒澱粉的底物發酵生物轉化為終產物(一般在容器和反應器中)。發酵是通過微生物將有機物質酶促厭氧降解以產生更簡單的有機化合物。當發酵在厭氧條件下進行時，並不意味著將該術語唯一地限定在嚴格的厭氧條件，因為發酵也在存在氧的條件下進行。
0061如本文所用，短語「同步糖化發酵(simultaneous saccharification andfermentation)(SSF)」指在生產終產物中的一種工藝，其中微生物諸如產乙醇的微生物和至少一種酶諸如α澱粉酶存在於同一加工步驟中。在本發明的一種實施方式中，SSF指在同一反應容器中同時將顆粒澱粉底物水解為包括葡萄糖在內的糖並將糖發酵成為醇。
0062如本文所用，術語「接觸」指將各酶(一種或多種)放置於足夠地接近各底物以使所述酶(一種或多種)能夠將底物轉變成為終產物。本領域的技術人員將認識到，酶與各底物的混合溶液可以實現接觸。
0063如本文所用，術語「酶促轉化」一般指通過酶作用對底物進行修飾。如本文所用，該術語也指通過酶的作用對顆粒澱粉底物進行的修飾。
0064如本文所用，術語「糖化」指將澱粉酶促轉化成為葡萄糖。
0065如本文所用，術語「糊化」表示通過蒸煮將澱粉分子溶解以形成粘性懸浮液。
0066如本文所用，術語「糊化溫度」指澱粉開始糊化時的溫度。精確的糊化溫度決定於具體的澱粉並且可能根據多種因素諸如植物種類以及環境和生長條件而有所變化。
0067如本文所用，短語「低於糊化溫度」指低於糊化開始發生時的溫度的溫度。
0068如本文所用，術語「液化」指澱粉轉化中的某階段，其間糊化的澱粉被水解，從而得到低分子量的可溶性糊精。
0069如本文所用，術語「聚合度(DP)」指在給定的糖中無水吡喃型葡萄糖單元的數目(n)。DP1的實例為單糖，諸如葡萄糖和果糖。DP2的實例為二糖，諸如麥芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大於3的聚合物。
0070如本文所用，術語「終產物」或「所需的終產物」指任何碳源來源的分子產物，其是由澱粉底物諸如包含顆粒澱粉的澱粉底物的酶促轉化而來的。
0071如本文所用，術語「幹固體含量(dry solids content(ds))」指基於乾重計算的以％表示的漿液總固體。
0072如本文所用，術語「漿液」指含不溶性固體的含水混合物。
0073如本文所用，術語「可溶性澱粉水解產物」指由澱粉水解產生的可溶性產物，其可以包含單糖、二糖和寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和更高級的糖)。
0074如本文所用，術語「殘留澱粉」指在含澱粉的底物發酵後組合物中所剩下的殘留澱粉(可溶的或不可溶的)。
0075如本文所用，術語「蒸餾器幹穀物(distillers dried grain，DDG)」和「含可溶物的蒸餾器幹穀物(distillers dried grain with solubles，DDGS)」指穀物發酵中有用的副產物(co-products)。
0076如本文所用，術語「醪(mash)」指用於生產發酵產物例如酒精的可發酵碳源(碳水化合物)的水混合物。在一些實施方式中，術語「啤酒」、「醪」和「發酵肉湯」可以被互換使用。
0077如本文所用，術語「產乙醇微生物(ethanologenic microorganism)」指具有將糖或寡糖轉變成乙醇的能力的微生物。產乙醇微生物依靠其表達一種或多種單獨或一起將糖轉化為乙醇的酶的能力來產乙醇。
0078如本文所用，術語「乙醇生產者」或「產乙醇微生物」指能夠由己糖或戊糖生產乙醇的任何生物或細胞。一般而言，產乙醇細胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產乙醇微生物的實例包括真菌微生物諸如酵母。優選的酵母包括酵母屬的菌株，特別是釀酒酵母(S.cerevisiae)。
0079如本文所用，有關多核苷酸或蛋白質的術語「異源」指在宿主細胞中並非天然存在的多核苷酸或蛋白質。該術語意圖包含由天然發生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質。
0080如本文所用，有關多核苷酸或蛋白質的術語「內源」指在宿主細胞中天然存在的多核苷酸或蛋白質。
0081如本文所用，術語「回收的(recovered)」、「分離的(isolated)」和「分離的(separated)」如本文所用，指化合物、蛋白質、細胞、核酸或胺基酸，它們是從與之天然相關的至少一種組分中移出的。
0082如本文所用，有關細胞所用的術語「轉化的」、「穩定轉化的」和「轉基因的」表示該細胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因組或者作為被保持多代的附加體質粒。
0083如本文所用，術語「表達」指根據基因的核苷酸序列而產生多肽的過程。該過程包括轉錄和翻譯。
0084如本文所用，術語「過量產生葡糖澱粉酶的菌株」指絲狀真菌宿主細胞，其表達並生產葡糖澱粉酶並且進一步從該細胞中分泌該葡糖澱粉酶，以致所分泌的葡糖澱粉酶佔所分泌的蛋白的總量的至少40％。
0085在關於將核酸序列中插入細胞中的上下文中，術語「導入」表示「轉染」或「轉化」或「轉導」，包括表示將核酸序列整合入真核或原核細胞，其中該核酸序列可以被整合入該細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中、轉變成自發複製子或者被瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
0086如本文所用，術語「比活」表示酶單位，其被定義為在特定條件下通過酶製劑每單位時間轉化為產物的底物的摩爾數。比活被表示為單位(U)/mg蛋白。
0087如本文所用，術語「酶單位(enzyme unit)」指在試驗條件下每給定的時間量內產生給定量的產物的酶量。在一些實施方式中，酶單位指在特定試驗條件下每分鐘產生1微摩爾產物的酶量。例如，在一種實施方式中，術語「葡糖澱粉酶活性單位」(GAU)被定義為在60℃和pH 4.2的試驗條件下每小時由可溶性澱粉底物(4％ds)產生1g葡萄糖所需的酶量。
0088在另一實施方式中，顆粒澱粉水解酶單位(GSHE U)被定義為在試驗條件下，例如在25℃和pH 5.0，每分鐘由顆粒澱粉產生1mg葡萄糖所需的GSHE量。在優選的實施方式中，GSHE U被定義為在50℃和pH 4.5下每分鐘由顆粒澱粉底物產生1mg葡萄糖所需的GSHE量。
0089如本文所用，術語「產量(yield)」指使用本發明的方法所生產的終產物或所需終產物的量。在一些優選的實施方式中，產量高於使用本領域已知的方法所生產的量。在一些實施方式中，該術語指終產物的體積，而在其它實施方式中，該術語指終產物的濃度。
0090「ATCC」指美國典型培養物保藏中心，位於Manassas，VA 20108 (ATCC；www.atcc.org)。
0091「NRRL」指the Agricultural Research Service Culture Collection，NationalCenter for Agricultural Utilization Research(以前被稱為USDA Northern RegionalResearch Laboratory，Peoria，ILL)。
0092除非上下文中另作清楚地說明，「一個(a)」、「一個(an)」和「該(the)」均包含表示複數。如本文所用，當短語「至少」與一系列數值和術語組合使用時，其意味著可應用該系列中的每一數值和術語。例如，短語「至少85％、90％、95％和99％的序列同一性」被用來表示至少85％、至少90％、至少95％和/或至少99％的序列同一性。
0093如本文所用，術語「包括(comprising)」和它的同源詞被使用時具有包含它們在內的含義；即，相當於術語「包括(including)」和它相應的同源詞。
α澱粉酶0094在本發明的一種實施方式中，α澱粉酶，諸如具有GSH活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)，是從麴黴屬菌株，例如米麴黴、河內麴黴、黑麴黴和泡盛麴黴中獲得的。在某些實施方式中，α澱粉酶是從河內麴黴菌株獲得的酸穩定性α澱粉酶。
0095在一些實施方式中，α澱粉酶(例如具有GSH活性的asAA)包括與SEQ IDNO3中所闡明的胺基酸序列具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的胺基酸序列。在另一實施方式中，asAA包括與SEQID NO3具有至少90％序列同一性的胺基酸序列。在進一步的實施方式中，asAA包括與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的胺基酸序列。asAA也可以包括與SEQ ID NO3具有至少98％序列同一性的胺基酸序列。在進一步的實施方式中，asAA包括SEQ ID NO3的胺基酸序列。在一些實施方式中，SEQ ID NO3或者與其具有至少85％同一性的序列被認為是完整的asAA。更一般地，完整的α澱粉酶是包括催化結構域、接頭區和澱粉結合結構域的α澱粉酶。
0096在一些實施方式中，α澱粉酶將包括與SEQ ID NO9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化結構域。在其它實施方式中，α澱粉酶將包括與SEQID NO10的SBD具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的SBD。
0097在進一步的實施方式中，α澱粉酶將包括與SEQ ID NO9至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQ ID NO8至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQ ID NO10至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在某些實施方式中，催化結構域和SBD是從河內麴黴菌株的α澱粉酶獲得的。
0098在其它實施方式中，α澱粉酶是截短的酶。在一些實施方式中，截短的α澱粉酶將包括SEQ ID NO3胺基酸序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％，在其它實施方式中，截短的α澱粉酶將包括與SEQ ID NO3具有至少90％、95％、98％和99％序列同一性的序列的至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％。該酶可以在多肽的羧基末端被截短。在一些實施方式中，截短的α澱粉酶包括SEQ ID NO3或者與其具有至少90％序列同一性的序列的至少430、440、450、460和470個胺基酸。
0099在一些實施方式中，截短的α澱粉酶將包括SEQ ID NO9的催化結構域或者與其具有至少97％、98％和99％序列同一性的序列的至少90％、95％、96％、97％、98％和99％。
0100在一些實施方式中，截短的α澱粉酶將包括SEQ ID NO9或者與其具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的序列的催化結構域以及與SEQ ID NO8具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的接頭。在一些實施方式中，截短的酶將包括與SEQ ID NO9具有至少97％序列同一性的催化結構域和與SEQ ID NO8具有至少95％序列同一性的接頭。在一些實施方式中，截短的酶將包括與SEQ ID NO9具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的催化結構域和位於該催化結構域下遊的至少大約5、10、20、25、30和35個胺基酸。在其它實施方式中，截短的酶將包括如上所定義的催化結構域和接頭，並進一步包括與SEQ ID NO10的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的部分SBD。該部分SBD將包括位於接頭下遊的至少大約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100個胺基酸。
0101在其它實施方式中，包含SEQ ID NO3的胺基酸序列或者與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的胺基酸序列的asAA是由與SEQ ID NO1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性的多核苷酸編碼。在一種實施方式中，編碼SEQ ID NO3(AsaA)的asAA的核酸序列是SEQ ID NO1的核酸序列。
重組表達的酶和宿主細胞0102在本發明的一些實施方式中，微生物被遺傳改造以表達異源α澱粉酶，諸如與SEQ ID NO3具有至少80％、85％、90％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性的α澱粉酶(例如具有GSH活性的asAA)。微生物也可以被改造以表達異源葡糖澱粉酶。優選的宿主細胞是絲狀真菌細胞。在一些實施方式中，絲狀真菌宿主是麴黴屬、木黴屬、鐮刀菌屬和青黴屬某種的菌株。
0103一些優選的真菌宿主細胞包括構巢麴黴、泡盛麴黴、米麴黴、棘孢麴黴(A.aculeatus)、黑麴黴、日本麴黴(A.japonicus)、裡氏木黴、綠色木黴、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和茄腐鐮刀菌(F.solani)。麴黴菌株在Ward等，(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuur等，(2002)Curr Gene 4189-98中公開。在一些優選的實施方式中，宿主是木黴菌株，特別是裡氏木黴菌株。裡氏木黴的菌株是已知的，非限制性實例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL 15709。在一些優選的實施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生株。RL-P37在Sheir-Neiss等，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 2046-53中公開。
0104在其它優選的實施方式中，宿主是麴黴菌株。有用的麴黴宿主菌株包括但不限於構巢麴黴(Yelton等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Mullaney等，(1985)MoI.Gen.Genet.19937-45和Johnston等，(1985)EMBO J.41307-1311)；黑麴黴(Kelly等，(1985)EMBO J.4475-479)、泡盛麴黴(NRRL 3112、UVK143f(美國專利號5,364,770)、ATCC No.22342、ATCC No.44733、ATCC No.14331和ATCC No.11490)和米麴黴(ATCC No.11490)以及它們的衍生株。在一些實施方式中，麴黴菌株是pyrG突變株並因而需要尿苷用於生長。一些實施方式中，麴黴宿主菌株表達並產生內源性α澱粉酶。一些實施方式中，麴黴宿主菌株是正常表達並產生內源性葡糖澱粉酶的菌株。
0105術語共表達指表達已導入宿主細胞的多核苷酸，該多核苷酸編碼與SEQ IDNO3具有至少80％序列同一性的α澱粉酶，其中該宿主細胞或菌株也表達並產生葡糖澱粉酶，諸如內源性葡糖澱粉酶。
0106在一些實施方式中，麴黴菌株包含野生型葡糖澱粉酶，儘管該菌株可能已被遺傳改造。大量的麴黴菌株表達並產生葡糖澱粉酶。具體而言，編碼葡糖澱粉酶的基因在許多黑麴黴和泡盛麴黴的菌株中高度表達。葡糖澱粉酶是分泌性酶，因此成熟形式的葡糖澱粉酶被釋放到外部培養基中。已經在培養基中鑑別出兩種形式的成熟葡糖澱粉酶。這些包括包含616個胺基酸的全長形式的葡糖澱粉酶GAI和包含512個胺基酸的天然蛋白裂解片段GAII。GAII缺少澱粉結合結構域。詳見Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381和WO 00/04136，它們在此被專門併入本文作為參考。WO 05/045018的SEQ ID NO24以及USP 6,352,851的SEQ ID NO2和SEQ ID NO13也作為參考，它們在此被併入本文作為參考。葡糖澱粉酶結構的詳情已在Libby等，(1994)Protein Engineering 71109-114中進行了綜述。
0107在一些實施方式中，木黴宿主細胞或麴黴宿主細胞被遺傳改造以表達一種具有GSH活性的asAA，其特徵是與SEQ ID NO3具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一性的胺基酸序列。在進一步的實施方式中，具有GSH活性的asAA將包括與SEQ ID NO9至少97％、98％和99％的序列同一性；與SEQ ID NO8至少96％、97％、98％和99％的序列同一性；以及與SEQ ID NO10至少95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。在某些實施方式中，asAA是從河內麴黴菌株的α澱粉酶獲得。
0108在其它實施方式中，本發明包括編碼SEQ ID NO3多肽、SEQ ID NO9多肽或者如本文所定義的截短的酶的核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼asAA的多核苷酸將具有SEQ ID NO1的核酸序列或者與SEQ ID NO1具有至少70％序列同一性的核酸序列。
0109在一些實施方式中，由經過改造而包含編碼asAA的異源多核苷酸的宿主細胞產生的α澱粉酶，相比於通過在天然宿主中內源性表達asAA而產生的asAA，將具有不同的特性，例如改進的特性。這些特性可以包括例如，提高的酶活性、在較低pH水平下的提高的酶穩定性或者提高的比活。在一些實施方式中，根據本發明的異源產生的asAA可以在3.0至6.0的pH範圍內表現出最大pH活性；還可在3.0至5.0的pH範圍內；在3.5至5.0的pH範圍內以及還可在3.5至4.5的pH範圍內。在其它實施方式中，異源產生的asAA，相比於在基本相同的條件下由天然宿主內源產生的相應asAA，可以在3.0、3.5、4.0、4.5和/或5.0的pH水平具有更大的穩定性或殘留活性。在一些實施方式中，相對於在特定pH水平的內源表達的asAA，異源產生的asAA的酶穩定性水平在相同的pH水平下將是至少0.5、1.0、2.0或2.5倍。在一些實施方式中，異源表達的asAA的這些改進的或者不同的特性在木黴宿主細胞中尤為明顯。在一些實施方式中，異源表達的asAA將以具有GSH活性的完整asAA的形式被產生，其包括催化結構域、接頭和SBD，例如在圖2中說明的成熟多肽(SEQ ID NO3)。在其它實施方式中，異源表達的asAA將以截短的asAA的形式被產生，例如，其中SBD從催化結構域部分地或者完全地切除。
0110在其它實施方式中，經遺傳改造以表達asAA的宿主菌株也可以被遺傳改造為表達異源葡糖澱粉酶。
0111在本發明中有用的宿主菌株可以是以前已經通過遺傳工程被操作過的。在一些實施中，遺傳改造的宿主細胞或菌株可以是蛋白酶缺陷型菌株。在其它實施方式中，真菌宿主細胞的各種天然基因的表達將是已被削弱或失活的。這些基因包括，例如編碼蛋白酶和纖維素水解酶諸如內切葡聚糖酶(EG)和外切纖維二糖水解酶(CBH)(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)的基因。USP 5,650,322公開了cbh1基因和cbh2基因缺失的RL-P37衍生菌株。也參考USP 5,472,864和WO 05001036。
載體0112當下面的描述特別提及α澱粉酶諸如asAA時，本領域的技術人員將容易理解，相同或相似的方法適用於可用於將編碼GA的多核苷酸導入宿主細胞的DNA構建物和載體。
0113根據本發明，包含編碼本發明所包括的asAA的核酸的DNA構建物被構建以便將asAA導入宿主細胞。在一種實施方式中，通過表達載體將DNA構建物導入宿主細胞，所述表達載體包括可操縱地連接於asAA編碼序列的調控序列。
0114載體可以是當被導入真菌宿主細胞時被整合進宿主細胞基因組並被複製的任何載體。參考Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，www.fgsc.net)的載體列表。合適的表達和/或整合載體的其它實例在Sambrook等，(1989)supra、Ausubel(1987)supra、van den Hondel等，(1991)Bennett and Lasure(Eds.)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press pp.396-428和美國專利號5,874,276中提供。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。
0115在一些實施方式中，編碼本發明所包括的asAA的核酸被可操縱地連接於合適的啟動子，該啟動子在真菌宿主細胞中表現出轉錄活性。該啟動子可以來源於編碼與宿主細胞同源或者異源的蛋白的基因。優選地，啟動子是在木黴宿主或麴黴宿主中有用的。啟動子的合適的非限制性實例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一種實施方式中，啟動子對宿主細胞而言是天然啟動子。例如，當裡氏木黴為宿主時，啟動子是天然的裡氏木黴啟動子。在優選的實施方式中，啟動子是裡氏木黴cbh1，其為誘導型啟動子並已以登記號D86235存儲於GenBank中。「誘導型啟動子」是在環境調控或發育調控下具有活性的啟動子。在另一實施方式中，啟動子對真菌宿主細胞而言是異源的啟動子。
0116有用的啟動子的其它實例是那些來源於編碼泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶(glaA)(Nunberg等，(1984)Mol.Cell Biol.42306-2315、USP 5,364,770、USP6,590,078(例如實施例3)；Gwynne D等，(1987)BioTechnol.5713-710和Boel等，(1984)EMBO J.31581-1585)、黑麴黴α澱粉酶、米麴黴TAKA澱粉酶、裡氏木黴xln1、裡氏木黴纖維素二糖水解酶1(EPA 137280A1)、米黑根黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶和黑麴黴中性α澱粉酶基因的啟動子。
0117在一些實施方式中，asAA編碼序列可操縱地連接於信號序列。編碼信號序列的DNA優選地與將被表達的asAA基因天然相關。優選地，信號序列由編碼Ak-asaA的河內麴黴asaA基因編碼。更優選地，該信號序列與SEQ ID NO2的信號序列具有至少90％、95％、97％和99％序列同一性。在其它實施方式中，信號序列和包括在將被導入真菌宿主細胞的DNA構建物或載體中的啟動子是來自於相同來源。例如，在一些實施方式中，信號序列是cdh1信號序列，其被可操縱地連接於cdh1啟動子。
0118在一些實施方式中，表達載體也包括終止序列。在一種實施方式中，終止序列和啟動子序列來自於相同來源。在另一實施方式中，終止序列對於宿主細胞而言是同源的。特別合適的終止子序列是來源於木黴菌株，尤其是裡氏木黴的cbh1。其它有用的真菌終止子包括來自黑麴黴、塔賓麴黴(A.tubingensis)或者泡盛麴黴葡糖澱粉酶基因的終止子(Nunberg等，(1984)supra和Boel等，(1984)supra)。
0119在一些實施方式中，表達載體包括選擇性標記。優選的選擇性標記的實例包括但不限於賦予抗微生物劑耐性的標記(例如潮黴素、博來黴素、氯黴素和腐草黴素)。賦予代謝優勢的基因，諸如營養選擇性標記，也可用於本發明，包括本領域已知的那些標記如amdS、argB和pyr4。在用於轉化木黴的載體系統中有用的標記是本領域已知的(參見例如Finkelstein，第6章，BIOTECHNOLOGY OFFILAMENTOUS FUNGI、Finkelstein等Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；和Kinghorn等，(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London)。在某些實施方式中，選擇性標記是amdS基因，其編碼乙醯胺酶，使被轉化的細胞能夠以乙醯胺為氮源進行生長。構巢麴黴amdS基因作為選擇性標記的應用在Kelley等，(1985)EMBO J.4475-479和Penttila等，(1987)Gene 61155-164中被描述。在一些實施方式中，載體將包括黑麴黴pyrG基因作為選擇性標記，用pyrG標記轉化後的麴黴菌株將是pyrG突變型菌株。
0120包含帶有編碼α澱粉酶的多核苷酸的DNA構建物的表達載體可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自我複製或整合進宿主DNA中的任何載體。在一些實施方式中，該表達載體是質粒。在優選的實施方式中，考慮了兩種類型的用於獲得基因的表達的表達載體。
0121第一種表達載體包括DNA序列，其中啟動子、asAA編碼區和終止子均來源於將被表達的基因。在一些實施方式中，基因截短是通過刪除不需要的DNA序列(例如編碼不想要的結構域的DNA)以留下將在其自身的轉錄和翻譯調控序列的控制下進行表達的結構域而獲得的。第二種表達載體是預組裝的並且包含高水平轉錄所需的序列和選擇性標記。
0122在一些實施方式中，asAA基因或者其中一部分的編碼區被插入這種通用型表達載體，這樣，它就處於該表達構建物啟動子和終止子序列的轉錄控制之下。在一些實施方式中，基因或其中的一部分被插入cbh1強啟動子的下遊。
0123用於將包含編碼asAA的多核苷酸、啟動子、終止子和其它序列的DNA構建物連接並將它們插入合適載體的方法是本領域熟知的。連接一般是通過在方便的限制性位點進行連接反應來完成的。如果此類位點不存在，則可以根據常規的實踐使用合成的寡核苷酸接頭。(參見Sambrook(1989)supra和Bennett and Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，San Diego(1991)pp70-76)。此外，可以使用已知的重組技術構建載體(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。
0124在期望獲得含有一個或多個失活基因的真菌宿主細胞的情況下，可以使用已知的方法(例如在美國專利號5,246,853、美國專利號5,475,101和WO92/06209中公開的方法)。基因失活可以通過完全或部分缺失、通過插入失活或者通過為預期目標而使基因非功能化(如此防止該基因表達功能性蛋白)的任何其它手段來完成。已被克隆的木黴屬某種或其它絲狀真菌宿主諸如麴黴宿主的任何基因均可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些實施方式中，基因缺失可以通過將將被失活的某形式的期望基因用本領域已知的方法插入質粒來完成。然後將此缺失質粒在適當的限制性酶位點(一個或多個)切開，所述限制性酶位點位於期望的基因編碼區的內部，並將此基因編碼序列或其中一部分用選擇性標記替換。將被缺失的基因的位置的側翼DNA序列(優選地大約0.5至2.0kb)保留在標記基因的兩側。合適的缺失質粒一般在其中將具有獨特的限制性酶位點以使得含缺失基因的片段，包括側翼DNA序列和選擇性標記，能夠以單個線性片段的形式被去除。
宿主細胞的轉化、表達和培養0125將DNA構建物或載體導入宿主細胞包括各種技術諸如轉化；電穿孔；核微注射；轉導；轉染(例如脂轉染法介導的轉染和DEAE-Dextrin介導的轉染)；與磷酸鈣溫育沉澱DNA；用DNA包被的微射彈進行高速轟擊；和原生質體融合。一般的轉化技術是本領域已知的(參見例如Ausubel等，(1987)，supra，第9章和Sambrook(1989)supra以及Campbell等，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在木黴中異源蛋白的表達在美國專利6,022,725；美國專利號6,268,328；Harkki等，(1991)；Enzyme Microb.Technol.13227-233；Harkki等，(1989)Bio Technol.7596-603；歐洲專利244,234；歐洲專利215,594和Nevalainen等，「The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes」，MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，Eds.Leong andBerka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)pp.129-148中被描述。對於轉化麴黴菌株，也參考Cao等，(2000)Sci.9991-1001、歐洲專利238023和Yelton等，(1984)Proceedings.Natl.A cad.Sci.USA 811470-1474。
0126優選地，遺傳穩定的轉化子用載體系統構建，由此編碼α澱粉酶(例如，與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的asAA)的核酸被穩定整合進宿主菌株染色體中。然後可以通過已知的技術純化轉化子。
0127在一種非限制性實例中，包含amdS標記的穩定轉化子通過其在含乙醯胺的固體培養基上更快的生長速度以及形成光滑的而非邊緣粗糙的圓形克隆而與非穩定轉化子相區別。此外，在一些情況下，進一步的穩定性測試可以通過使轉化子在固體的非選擇性培養基(即，缺乏乙醯胺的培養基)上生長，從該培養基收穫孢子，以及確定隨後發芽並在含乙醯胺的選擇性培養基上生長的這些孢子的百分比來進行。可選地，本領域已知的其它方法可以被用於選擇轉化子。
0128在一種實施方式中，用於轉化的木黴屬某種或麴黴屬某種的製備包括來自真菌菌絲體的原生質體的製備。(參見Campbell等(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些實施方式中，菌絲體是從萌發的營養孢子獲得的。將菌絲體用消化細胞壁的酶處理，產生原生質體。然後通過懸浮培養基中存在的滲透壓穩定劑對原生質體加以保護。這些穩定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常這些穩定劑的濃度在大約0.8M至大約1.2M之間變化。在一些實施方式中，可以優選使用山梨醇，在其它實施方式中，可以優選使用硫酸鎂(例如在懸浮培養基中大約1.2M的山梨醇溶液或者在懸浮培養基中大約0.8M的硫酸鎂溶液)。
0129宿主菌株對DNA的攝入可以由鈣離子濃度決定。一般而言，大約10mMCaCl2至50mM CaCl2可以被用在攝取溶液中。在攝取溶液中除了對鈣離子的需求，一般被包括的其它化合物是緩衝體系諸如TE緩衝液(10Mm Tris，pH 7.4；1mMEDTA)或10mM MOPS，pH 6.0緩衝液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。
0130通常在轉化中使用含有宿主細胞或原生質體諸如木黴屬某種或麴黴屬某種的原生質體或細胞的懸浮液，所述原生質體或細胞已經以約105至約107個/mL，優選地大約2×106個/mL，以及大約1×107的密度經過滲透性處理。在一些實施方式中，將大約100μL體積的這些原生質體或細胞的適當溶液(例如1.2M山梨醇；50mM CaCl2)與期望的DNA混合。在一些實施方式中，將高濃度的PEG加入攝取溶液中。可以向原生質體懸浮液中加入0.1至1體積的25％PEG 4000。然而，優選地向原生質體懸浮液中加入大約0.25體積。添加劑諸如二甲亞碸、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到攝取溶液中並幫助轉化。類似的方法可用於其它真菌宿主細胞。(參見例如美國專利號6,022,725和6,268,328，兩者被併入本文作為參考)。
0131一般地，然後將混合物在大約0℃溫育10至30分鐘。向混合物中加入額外的PEG以進一步加強對所需基因或DNA序列的攝取。在一些實施方式中，加入轉化混合物體積的5至15倍體積的25％PEG 4000；但是，更多或更少的體積都可能是合適的。25％PEG 4000優選地是轉化混合物體積的大約10倍。加入PEG後，可以將轉化混合物在室溫或者在冰上溫育，然後加入山梨醇和CaCl2溶液。然後將原生質體懸浮液進一步加入到熔化的小量等份生長培養基中。當生長培養基包括生長選擇條件(例如乙醯胺或抗生素)時，其僅允許轉化子生長。
0132一般而言，細胞被培養在含生理鹽和營養劑的標準培養基中(參見，例如，Pourquie，J.等，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.等，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen，M.等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。普通的商業配製培養基(例如Yeast Malt Extract(YM)肉湯、Luria Bertani(LB)肉湯和Sabouraud Dextrose(SD)肉湯)也可以用於本發明。
0133培養條件也是標準的(例如將培養物在搖床培養器或發酵罐中在合適的培養基中大約28℃下溫育直至達到所需的asAA表達水平)。給定的絲狀真菌的培養條件是本領域已知的並且可以在科學文獻中和/或從該真菌的來源諸如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)和真菌遺傳學保存中心(FungalGenetics Stock Center)找到。
0134在建立了真菌生長之後，將細胞暴露於可有效引起或者允許表達和分泌α澱粉酶以及如本文所定義的α澱粉酶(例如asAA)和葡糖澱粉酶的條件下。當具有GSH活性的asAA的編碼序列處於誘導型啟動子的控制下時，向培養基中加入有效濃度的誘導劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以誘導asAA表達。
酶活性的鑑定0135為了評價α澱粉酶(例如具有GSH活性的asAA)的表達，可以在蛋白水平、RNA水平或通過使用特別地針對α澱粉酶活性和/或產生的功能性生物分析進行分析，所述α澱粉酶是由用編碼本發明所包括的α澱粉酶的異源多核苷酸轉化的細胞系表達的。一般而言，所應用的分析包括Northern印跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈式反應)，或使用適當標記的探針(基於核酸編碼序列)進行的原位雜交以及常規的Southern印跡和放射自顯影。
0136此外，本發明所包括的酶的產生和/或表達可以在樣品中直接測量，例如，通過直接測量培養基中的還原糖諸如葡萄糖的試驗，以及通過測量葡糖澱粉酶的活性、表達和/或產生的試驗。對分析GSH活性有用的底物包括顆粒澱粉底物。例如，葡萄糖濃度可以通過任何簡便的方法諸如通過使用葡萄糖試劑盒No 15-UV(Sigma Chemical Co.)或儀器諸如Technicon Autoanalyzer來確定。也參考葡萄糖氧化酶試劑盒和葡萄糖己糖試劑盒，它們可從Instrumentation Lab.(Lexington，MA)商業獲得。
0137此外，基因表達可以通過免疫學方法，諸如細胞、組織切片的免疫組織化學染色或者組織培養基的免疫試驗，例如通過Western印跡或ELISA來評估。這樣的免疫試驗可以用於定性地和定量地評價asaA的表達。此類方法的細節是本領域技術人員已知的，並且用於實施此類方法的許多試劑是可商業獲得的。
0138α澱粉酶活性可以例如，通過使用在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所述的DNS法來測量。葡糖澱粉酶活性可以例如通過3，5-二硝基唾液酸(DNS)法來分析(參見Goto等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)。
0139在本發明的一些實施方式中，由木黴或麴黴宿主產生的asAA(例如，與SEQ ID NO3具有至少80％序列同一性的α澱粉酶)將是每升培養基1克以上的蛋白(g/L)、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，以及100g/L培養基以上。
0140在一些實施方式中，分泌的葡糖澱粉酶的量將是宿主菌株的總的分泌蛋白的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％和95％。在其它實施方式中，分泌的葡糖澱粉酶的量將是總的分泌蛋白的50％以上。在一些實施方式中，分泌的葡糖澱粉酶的量將是總的分泌蛋白的50％以下。在一些實施方式中，分泌的葡糖澱粉酶的量將大於由麴黴菌株分泌的asAA的量。在一些實施方式中，來自麴黴菌株的分泌的葡糖澱粉酶與分泌的asAA之比(GA/asAA)將是至少1/1、至少2/1、至少4/1、至少6/1和至少8/1。在一些實施方式中，該比率將是8/1以上。
0141在具體的實施方式中，宿主是過量產生葡糖澱粉酶的宿主菌株。在一些實施方式中，過量表達的宿主菌株將是麴黴屬某種菌株，諸如黑麴黴菌株。在一些實施方式中，過量產生葡糖澱粉酶的麴黴屬菌株是表達野生型葡糖澱粉酶的菌株。過量產生葡糖澱粉酶的宿主菌株的一種實施方式是重組的黑麴黴菌株，其包含編碼內源性葡糖澱粉酶的多核苷酸和編碼異源性α澱粉酶的多核苷酸，所述α澱粉酶與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4具有至少90％的序列同一性。在一些實施方式中，產生的葡糖澱粉酶是全長的黑麴黴葡糖澱粉酶，在其它實施方式中，該葡糖澱粉酶是截短的黑麴黴葡糖澱粉酶，諸如美國專利6,352,851的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13。
純化酶的方法0142一般而言，在細胞培養物中產生的根據本發明的酶(諸如α澱粉酶或葡糖澱粉酶)，被分泌進培養基並可以通過例如從細胞培養基中除去不想要的組分而加以分離或純化。在一些情況下，酶可以以細胞內的形式產生，這使得從細胞裂解液中進行回收成為必要。在此類情況下，酶從細胞中純化，其中使用本領域技術人員常規使用的技術進行生產。實例包括，但不限於，親合層析法(Tilbeurgh等，(1984)FEBS Lett.16215)；離子交換層析法(Goyal等，(1991)Biores.Technol.3637；Fliess等，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhai等，(1984)J.Appl.Biochem.6336和Ellouz等，(1987)Chromatography 396307)，包括使用具有高分辨力的物質進行的離子交換(Medve等，(1998)J.Chromatography A 808153；疏水相互作用層析法(Tomaz和Queiroz，(1999)J.Chromatography A 865123；二相分配法(two-phase partitioning)(Brumbauer等，(1999)Bioseparation 7287)；乙醇沉澱法；反相HPLC；矽膠層析法或陽離子交換樹脂層析法諸如DEAE；聚焦層析法(chromatofocusing)；SDS-PAGE；硫酸胺沉澱法；和使用例如Sephadex G-75進行的凝膠過濾。
發酵0143在本發明的一些實施方式中，表達異源α澱粉酶的真菌細胞在分批或連續發酵條件下生長。典型的分批發酵是一個密閉的系統，其中培養基的組成在發酵開始時即被設定，並且在發酵過程中不被人為改變。因此，在發酵開始時，培養基用所需的生物(一種或多種)接種。在此方法中，允許發酵在不向系統中添加任何組分的條件下發生。一般地，分批發酵由於涉及碳源的添加而被稱為「分批」，並且通常嘗試控制諸如pH和氧濃度的因子。分批系統的代謝產物和生物材料(biomass)的組成不斷變化直至發酵終止。在分批培養物中，細胞經延滯期發展到快速生長的指數期並最終到達生長速率降低或停止的靜止期。如果不加處理，靜止期的細胞最終會死亡。一般而言，指數期的細胞負責大量生產終產物。
0144對標準的分批系統的一種改動是「補料分批發酵(fed-batch fermentation)」系統，其也可用於本發明。在對典型的分批系統的此種改動中，隨發酵過程的進行，底物被逐步加入。當降解物阻遏容易抑制細胞的代謝時，以及在期望在培養基中具有有限量的底物的情況下，補料分批系統是有用的。在補料分批系統中實際底物濃度的測量是困難的，因此根據可測量的因素諸如pH、溶解氧和廢氣諸如CO2的分壓來進行評估。分批和補料分批發酵是本領域常見和熟知的。
0145連續發酵是一個開放的系統，其中成分確定的發酵培養基被連續地加入生物反應器中，並且同時移去等量的條件培養基用於加工。連續發酵一般將培養物保持在固定的高密度，其中細胞主要處於指數期生長。
0146連續發酵使得能夠對影響細胞生長和/或終產物濃度的一種因素或任何數量的因素進行調節。例如，在一種實施方式中，限制性營養物諸如碳源或氮源被保持在固定的比率，而所有其它參數能夠保持適度。在其它系統中，影響生長的大量因素可以被連續改變，而通過培養基濁度來測量的細胞濃度被保持恆定。連續系統努力保持穩定狀態的生長條件。因此，由於排出的培養基而造成的細胞損失必須與發酵中的細胞生長速度相平衡。連續發酵過程的營養物和生長因素的調節方法以及使產物形成速率最大化的技術是工業微生物領域熟知的。
組合物0147根據本發明的特別有用的酶組合物是澱粉水解酶組合物(例如顆粒澱粉水解組合物)，其包括與SEQ ID NO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的α澱粉酶。在一些實施方式中，α澱粉酶(例如asAA)是通過異源表達asAA，諸如在木黴或麴黴宿主中異源表達河內麴黴的酸穩定性α澱粉酶而獲得的。在一些實施方式中，麴黴宿主是過量產生葡糖澱粉酶的宿主。
0148本發明的另一種有用的酶組合物是澱粉水解酶組合物(例如顆粒澱粉水解組合物)，其包括與SEQ ID NO9的序列具有至少97％、98％和99％序列同一性的截短的α澱粉酶(例如asAA)。
0149在進一步的實施方式中，根據本發明的酶組合物將包括α澱粉酶的組合，其包括a)具有GSH活性的完整asAA，其包含與SEQ ID NO3具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％同一性的序列，和b)截短的α澱粉酶。在一些實施方式中，截短的α澱粉酶將是與SEQ ID NO9的序列具有至少96％、97％、98％和99％序列同一性的序列。
0150在一些實施方式中，與酶組合物中具有GSH活性的asAA(完整型+截短型)的總量相比，具有GSH活性的完整asAA的量將是至少大約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和98％。在其它實施方式中，在根據本發明的酶組合物中，具有GSH活性的完整asAA與具有GSH活性的截短的asAA之比將是大約10％比90％、20％比80％、30％比70％、35％比65％、40％比60％、45％比55％、50％比50％、55％比45％、60％比40％、65％比35％、70％比30％、80％比20％和90％比10％(完整型/截短型)。在一些實施方式中，完整型與截短型之比將是在大約40％比60％和大約60％比40％之間。
0151在一些實施方式中，α澱粉酶以及可選地通過在宿主中共表達而產生的葡糖澱粉酶將以無細胞濾液的形式被利用(例如，其中asAA從培養基中分離)，在其它實施方式中，α澱粉酶是在含有真菌宿主細胞的培養基中被利用，所述真菌宿主細胞表達並分泌該α澱粉酶(例如具有GSH活性的asAA)。在進一步的方面，本發明包括包含具有顆粒澱粉水解活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)的發酵介質或培養基，所述酸穩定性α澱粉酶由木黴細胞的培養物產生，所述木黴細胞包含編碼該asAA的異源多核苷酸，所述asAA與SEQ ID NO3具有至少90％的序列同一性。
0152在另一實施方式中，本發明包括包含具有顆粒澱粉水解活性的酸穩定性α澱粉酶(asAA)的發酵介質或培養基，所述asAA由麴黴細胞的培養物產生，所述麴黴細胞包含編碼asAA的異源多核苷酸，所述asAA與SEQ ID NO3具有至少90％的序列同一性。
0153在另一實施方式中，本發明包括包含酸穩定性α澱粉酶(asAA)和葡糖澱粉酶的發酵介質或培養基，其中所述α澱粉酶和葡糖澱粉酶兩者是由麴黴細胞的培養物共表達的，所述細胞包含編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的α澱粉酶的異源多核苷酸和編碼葡糖澱粉酶的內源多核苷酸。
0154在一些實施方式中，培養基中的α澱粉酶和葡糖澱粉酶被進一步回收。這些酶可以被配製為用於許多種應用的酶組合物。這些應用和組合物中的一些包括但不限於例如澱粉水解與糖化組合物、清潔和去汙劑組合物(例如洗衣去汙劑、洗碟去汙劑和硬表面清潔組合物)、動物飼料組合物、烘焙用途，諸如麵包和蛋糕的生產、釀造用途、保健用途、紡織用途、環境廢棄物的轉化過程、生物製漿加工過程和生物材料(biomass)轉化用途。
0155具體而言，本發明所包含的組合物被應用於澱粉轉化，諸如在用於果糖糖漿的葡萄糖、專用糖(specialty sugars)的生產中，以及在醇類和其它終產物(例如有機酸、抗壞血酸)的生產中。
0156如本領域技術人員所理解的，本發明的組合物和方法中所使用的α澱粉酶(例如具有GSH活性的asAA)的量將取決於該α澱粉酶的酶促活性。在一些實施方式中，存在於酶組合物中的本發明所包含的α澱粉酶的範圍是每克ds 0.001至80 SSU、0.001至60 SSU、以及0.01至40 SSU；以及0.01至30 SSU；以及0.01至20 SSU；以及0.01至15 SSU；以及0.05至15 SSU，以及0.01至10 SSU。
0157根據本發明的有用的酶組合物為如上所述的酶組合物，其進一步包括第二葡糖澱粉酶(secondary glucoamylase)。第二葡糖澱粉酶是從不同於包含編碼本發明所包括的α澱粉酶的異源多核苷酸(例如，編碼與SEQ IDNO3具有至少90％序列同一性的α澱粉酶的多核苷酸)的麴黴宿主的來源獲得的葡糖澱粉酶。
0158在根據本發明的組合物中可以有用的葡糖澱粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3)，可以是野生型葡糖澱粉酶或經遺傳修飾的澱粉酶，包括變體和雜交體葡糖澱粉酶。一般而言，葡糖澱粉酶可以來自細菌、植物和真菌來源。可用在本發明的組合物和方法中的優選葡糖澱粉酶是由絲狀真菌和酵母的若干菌株產生的。具體而言，由麴黴和木黴的菌株分泌的葡糖澱粉酶在商業上是重要的。這些葡糖澱粉酶的來源包括黑麴黴G1和G2葡糖澱粉酶及其變體(Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136，WO 05/045018，參見SEQ ID NO25和美國專利6,352,851)；泡盛麴黴葡糖澱粉酶(WO 84/02921和WO 05/052148，參見SEQ ID NO5)；米麴黴葡糖澱粉酶及其變體(Hata等，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和Aspergillus shirousami(參見Chen等，(1996)Prof.Eng.9499-505；Chen等，(1995)Prot.Eng.8575-582和Chen等，(1994)Biochem J.302275-281)。葡糖澱粉酶也從Talaromyces菌株，諸如來自於T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和T.thermophilus的菌株(WO 99/28488；USP No.RE32,153和USP No.4,587,215)及其變體；根黴屬菌株，諸如雪白根黴(R.niveus)和米根黴(R.oryzae)菌株及其變體；毛黴屬菌株；木黴屬菌株，諸如裡氏木黴和綠色木黴菌株；以及腐質黴菌株，諸如灰腐質黴菌株獲得。(參見Boel等，(1984)EMBO J.31097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等，(1996)Prot.Eng.9499-505；Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；美國專利號4,514,496；美國專利號4,092,434；WO 05/052148，參見SEQ ID NO2和3，以及Jensen等，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。在本發明中有用的其它葡糖澱粉酶包括從羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)獲得的葡糖澱粉酶及其變體(USP 4,727,026；WO 04/111218和WO 05/045028的SEQ ID NO26)。
0159商業上使用的具有葡糖澱粉酶活性的酶例如由黑麴黴(商品名DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X，來自Genencor InternationalInc)或者根黴屬某種(商品名CU.CONC，來自Shin Nihon Chemicals，Japan)生產。也可以是商用的消化酶，商品名GLUCZYME，來自Amano Pharmaceuticals，Japan(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98663-671)。其它酶包括根黴屬某種的三種形式的葡糖澱粉酶(E.C.3.2.1.3)，即，「Gluc1」(MW 74,000)、「Gluc2」(MW 58,600)和「Gluc3」(MW 61,400)。Gluc1在本發明中尤其有用。
0160一些GA酶也是顆粒澱粉水解酶(GSHE)(參見例如Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。這些GA-GSHEs不僅具有葡糖澱粉酶活性，而且能夠水解顆粒(生)澱粉。GA-GSHEs已從真菌細胞，尤其絲狀真菌細胞諸如腐質黴屬某種、麴黴屬某種、木黴屬某種和根黴屬某種回收。米根黴GA-GSHE已在Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP 4,863,864中描述。也參考雪白根黴。灰腐質黴GA-GSHE被Allison等，(1992)Curr.Genet.21225-229、Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39846-852、Campos等，(1995)App.And Environ.Microbiol.612436-2438以及歐洲專利號171218描述。泡盛麴黴河內變種GA-GSHE被Hayashida等，(1989)Agric.Biol.Chem 53923-929描述。Aspergillus shirousami的GA-GSHE被Shibuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用於本發明的一種具體GA-GSHE製劑包括可從Biocon India，Ltd，India獲得的以名稱「M1」銷售的酶製劑。
0161在一種實施方式中，GA-GSHE酶可以來自於灰腐質黴菌株，具體地是灰腐質黴嗜熱變種菌株(參見美國專利號4,618,579)。在一些優選的實施方式中，灰腐質黴GA-GSHE酶是從真菌中回收的，所述真菌包括ATCC 16453、NRRL(USDANorthern Regional Research Laboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL 15220、NRRL15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224和NRRL 15225，以及它們的遺傳改變菌株。這些種生產出免疫學上相同的酶促葡糖澱粉酶製劑(參見EP 0 171218)。
0162在酶組合物中有用的葡糖澱粉酶量可以在下列範圍內0.001至30.0GAU/g ds、以及0.001至25.0 GAU/g ds、以及0.01至25.0 GAU/g ds、以及0.1至25.0 GAU/g ds、以及0.01至20 GAU/g ds、以及0.01至15 GAU/g ds、以及0.01至10 GAU/g ds、以及0.1至10 GAU/g ds，以及0.05至5.0 GAU/g ds。GA-GSHE製劑的活性可以按葡糖澱粉酶的活性定義。
0163一些有用的酶促組合物包括α澱粉酶諸如與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性的asAA和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖澱粉酶的混合物。另一種有用的酶促組合物包括與SEQ ID NO3具有至少98％序列同一性的asAA和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖澱粉酶的混合物。另一種有用的酶促組合物包括與SEQ IDNO9具有至少98％序列同一性的α澱粉酶和具有0.1至10 GAU/g ds的葡糖澱粉酶的混合物。
0164在一些實施方式中，本發明所包含的α澱粉酶的活性(SSU)與GA活性(GAU)之比將在範圍40∶1至1∶40、以及30∶1至1∶30、以及20∶1至1∶20、以及15∶1至1∶15之內。在進一步的實施方式中，該比率(SSU/GAU)將在大約20∶1至1∶10；大約10∶1至1∶10；大約10∶1至1∶5；大約5∶1至1∶5、大約4∶1至1∶4；大約3∶1至1∶3；大約2∶1至1∶4以及大約2∶1至1∶2的範圍內。在一些實施方式中，SSU與GAU之比將是在大約4∶1至2∶1之間。
0165在一些實施方式中，α澱粉酶，諸如與SEQ ID NO3具有至少80％序列同一性的具有GSH活性的asAA，將以每克幹固體大約0.001至30 SSU的量或者以每克漿液幹固體內容物0.01至15.0 SSU的量與顆粒澱粉底物漿液混合。在一些實施方式中，本發明所包含的asAA以每克漿液幹固體內容物大約0.01至10.0SSU、大約0.01至5.0 SSU；大約0.05至10.0 SSU；大約0.05至5.0 SSU；大約0.1至10.0 SSU；大約0.1至5.0 SSU；大約0.1至2.0 SSU；大約0.25至2.5 SSU；大約0.5至5.0 SSU；大約0.5至2.5 SSU；以及大約0.5至1.5 SSU的量加入。
0166如本領域技術人員所理解，本發明的方法和組合物中使用的葡糖澱粉酶的量決定於該葡糖澱粉酶的酶促活性。在一些實施方式中，可以按每克(ds)漿液加入0.001至15.0 GAU量的葡糖澱粉酶，該漿液被調至含20-45％幹固體。在一些實施方式中，葡糖澱粉酶按每克(ds)漿液0.001至10 GAU；0.01至10.0 GAU；0.01至5.0 GAU；0.05至5.0 GAU；0.1至10.0 GAU；0.1至5.0 GAU；0.1至2.0 GAU；0.25至1.5 GAU葡糖澱粉酶的量加入。在一種實施方式中，葡糖澱粉酶的劑量範圍將是每克(ds)漿液0.1至2.0 GAU。
0167其它的酶可以被包括在本發明所包括的組合物和方法中。這些可用於本發明的其它的酶包括脫枝酶(debranching enzymes)諸如支鏈澱粉酶(E.C.3.2.1.41)和異澱粉酶(E.C.3.2.1.68)。此類酶水解α-1，6-糖苷鍵。因此，在澱粉水解過程中，脫枝酶從澱粉的非還原性端去除連續的葡萄糖單位。另一種可以被用於本發明組合物中的酶是β-澱粉酶(E.C.3.2.1.2)。這些是外切作用型產麥芽糖澱粉酶，其催化直鏈澱粉、支鏈澱粉以及相關葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷鍵的水解。這些酶中的一些的特徵為具有4.5至7.0的最適pH範圍和40℃至65℃的最適溫度範圍。商用的β-澱粉酶可以獲得，例如來自Genencor International Inc.的SPEZYME BBA和OPTIMALT。
0168其它酶可以包括第二α澱粉酶，即由本發明所包括的α澱粉酶(即，與SEQID NO3具有至少80％序列同一性的α澱粉酶)的異源表達之外的來源所提供的α澱粉酶。α澱粉酶的實例包括細菌和真菌的α澱粉酶及其變體。特定的非限制性實例包括來自解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)及其變體或雜交體的α澱粉酶(USP 5,093,257、USP 6,093,562、USP 5,736,499、USP 5,958,739、USP6,436,888、USP 6,867,031、WO 96/39528、WO 96/23874和WO 05/001064)。商業上可用的α澱粉酶是SPEZYME FRED和SPEZYME ETHYL(Genencor InternationalInc.)。環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTases)(例如E.C.2.4.1.19)及其變體也可以用於本發明(USP 5,278,059、USP 5,545,587和WO 05/003337)。
0169可以使用的進一步其它的酶是蛋白酶，諸如真菌或細菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如，從麴黴、木黴、毛黴和根黴，諸如黑麴黴、泡盛麴黴、米麴黴和米黑毛黴(M.miehei)獲得的蛋白酶。其它的酶包括但不限於纖維素酶，諸如內切葡聚糖酶；半纖維素酶，諸如甘露聚糖酶；脂酶(例如E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶、果膠酶、木聚糖酶、轉葡萄糖苷酶、α1，6葡萄糖苷酶(例如E.C.3.2.1.20)和角質酶(例如E.C.3.1.1.74)。
0170將被包括在本發明方法中的這些酶的有效量可以由本領域技術人員容易地確定。
0171在一些實施方式中，可以將抗微生物劑加入本發明的組合物和發酵培養基中。抗微生物劑是殺死微生物或者抑制微生物生長的化合物。
0172在一種實施方式中，包含本發明所包括的asaA以及與之相組合的葡糖澱粉酶的酶組合物將被用於生產乙醇。在一些實施方式中，至少8％、10％、12％、14％、16％和18％的乙醇將使用本發明的組合物來生產。在一些實施方式中，乙醇將在同步糖化發酵過程中產生。在一些實施方式中，包含由同一麴黴菌株產生的α澱粉酶和葡糖澱粉酶的酶組合物將與顆粒澱粉底物漿液和產乙醇微生物同時混合，該混合物將在單一的步驟中發酵。該漿液可以含有大約10-50％ds；大約10-45％；大約15-40％；大約20-40％；大約25-40％；或者大約25-35％ds。
0173顆粒澱粉底物可以從包括莖、穀粒、根和塊莖的任何植物部分獲得。特別優選的植物來源包括玉米；小麥；黑麥；高梁；稻米；粟；燕麥；木薯(cassava)；豆類，諸如大豆和豌豆；馬鈴薯；甘薯；香蕉；甘蔗和木薯粉(tapioca)。
0174特別考慮的澱粉底物是玉米澱粉和小麥澱粉。來自穀物的澱粉可以是碾磨的或完整的，包括玉米固體，諸如玉米仁、玉米麩和/或玉米碎塊(cobs)。此外，穀物可以被分離(fractionated)(例如，玉米中的胚乳、纖維或胚芽或者麩質，小麥中的澱粉A或澱粉B)。澱粉可以是高度精製的生澱粉或來自澱粉精製工藝的給料(feedstock)。本領域的普通技術人員熟知可利用的方法，它們可被用來製備在本發明所包括的方法中使用的顆粒澱粉底物。這些方法中的一些包括完整穀類顆粒的幹磨法，其使用錘磨和輥磨，以及溼磨法。
0175各種澱粉可商業獲得。例如，玉米澱粉可從Cerestar、Sigma和KatayamaChemical Industry Co.(日本)獲得；小麥澱粉可從Sigma獲得；甘薯澱粉可從WakoPure Chemical Industry Co.(日本)獲得；以及馬鈴薯澱粉可從Nakaari ChemicalPharmaceutical Co.(日本)獲得。
0176各種文獻已報導了在穀類穀物中存在的澱粉量，參考The Alcohol Textbook，3rdEd.K.Jacques et al.，Eds.1999，Nottingham University Press。例如，玉米含大約60-68％的澱粉；燕麥含大約55-65％的澱粉；粟含大約75-80％的澱粉；小麥含大約60-65％的澱粉；以及精米含大約70-72％的澱粉。
0177在一些實施方式中，將顆粒澱粉底物製漿(一般用水)，所述漿液包含i)大約10％至大約55％的幹固體內容物(ds)；ii)大約15％至大約50％的幹固體內容物；iii)大約20％至大約45％的幹固體內容物；iv)大約25％至大約45％的幹固體內容物；v)大約30％至大約45％的幹固體內容物；vi)大約30％至大約40％的幹固體內容物；以及vii)大約30％至大約35％的幹固體內容物。在一些實施方式中，顆粒澱粉漿液與本發明的酶組合物在低於顆粒澱粉底物中澱粉的糊化溫度的溫度下接觸以產生葡萄糖。
0178本發明的方法所使用的精確溫度取決於所使用的具體澱粉底物。一般的澱粉糊化溫度範圍在Swinkels 32-38頁STARCH CONVERSION TECHNOLOGY，eds Van Beynum等，(1985)Marcel Dekker Inc.，NY和THE ALCOHOL TEXTBOOK，A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，eds Jacques等，1999，Nottingham University Press，UK中公開。在一些實施方式中，本發明包括的方法將在至少大約10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的溫度進行。在其它實施方式中，該溫度將是在大約25-65℃之間、在大約30-65℃之間、在大約35-65℃之間、在大約40-65℃之間和在大約45-65℃之間。在其它實施方式中，該溫度將是在大約25-45℃之間、在大約25-40℃之間和在大約30-35℃之間。在優選的實施方式中，澱粉底物與本發明的組合物在低於該底物中的澱粉的糊化溫度的溫度下接觸，在一些實施方式中，含澱粉的底物從未經歷用於液化的熱條件。
0179在一些實施方式中，本發明所包括的方法將在pH 3.0至7.0之間；在pH3.0至6.0之間；在pH 3.0至5.0之間；在pH 3.5至6.0之間；在pH 3.5至5.0之間；和在pH 3.5至4.5的pH範圍內進行。
0180在一些實施方式中，本方法的停留時間(residence time)是大約2至300小時，但更典型地是2至120小時。在一些實施方案中，該過程進行大約5至100小時。在其它實施方式中，該過程進行大約5至80小時。仍在其它實施方式中，該過程進行至少5小時但在100小時以下。在其它實施方式中，該過程進行至少10小時但在100小時以下。
0181在一些實施方式中，顆粒澱粉的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的幹固體被水解。在一些實施方式中。顆粒澱粉底物被徹底水解。在一些實施方式中，至少90％的顆粒澱粉在100小時內被水解。在某些實施方式中，至少90％的顆粒澱粉底物在24小時的時間段內被水解。在其它實施方式中，至少95％的顆粒澱粉底物在24小時的時間段內被水解。
0182葡萄糖的產率(總的溶解幹固體的百分比)可以是至少大約85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。在一些實施方式中，葡萄糖可以被用於生產高果糖糖漿。在優選的實施方式中，持續產生葡萄糖，並且基本上所有的葡萄糖都被用在生產終產物諸如乙醇和聯產物(co-products)諸如DDGS的過程中。(參考MOLECULAR STRUCTURE AND FUNCTION OF FOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCH ET AL，APPLIED SCIENCE PUBLISHERS，LONDON)。葡萄糖也可以被用於生產其它終產物的發酵過程中，所述終產物包括但不限於有機酸、酶、丙三醇、胺基酸、抗壞血酸中間產物和其它複雜化合物諸如激素和抗生素。
實驗0183提供以下實施例是為了顯示和進一步舉例說明本發明的某些優選實施方式和方面，而不應被解釋為對本發明範圍的限定。實際上，應考慮為這些教導對於進一步優化本文描述的工藝體系是有用的。
0184在以下的公開內容和實驗部分中，應用下列縮略語0185具有GSH活性的asAA(具有顆粒澱粉水解活性的酸穩定性α澱粉酶)；AkAA(具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的酸穩定性α澱粉酶，有時可與asaA互換使用)；GA(葡糖澱粉酶)；wt％(重量百分比)；℃(攝氏度)；rpm(每分鐘的轉數)；H2O(水)；dH2O(去離子水)；dlH2O(去離子水，Milli-Q過濾)；aa(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(千鹼基對)；kD(千道爾頓)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)；DO(溶解氧)；鄰苯二甲酸鹽緩衝液(鄰苯二甲酸鈉水溶液，20mM，pH 5.0)；PBS(磷酸緩衝鹽溶液[150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩衝液，pH7.2])；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)；w/v(重量與體積之比)；w/w(重量比)；v/v(體積比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，Palo Alto，CA)；DDGS(蒸餾間幹穀物及固體(Distilleries DryGrain plus Solids))；MT(公噸)；和EtOH(乙醇)。
0186下列試驗和方法被用於下面提供的實施例葡糖澱粉酶試驗0187使用熟知的、基於葡糖澱粉酶催化對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解為葡萄糖和對硝基苯酚的能力的試驗測量葡糖澱粉酶活性。在鹼性pH下，硝基苯酚形成黃色，該顏色與葡糖澱粉酶活性成比例，在400nm進行監測，並與酶標準品進行比較，測量結果表示為GAU。
0188酸穩定性α澱粉酶活性的測量是基於在pH 4.5，50℃一小等份的酶樣品對可溶性馬鈴薯澱粉底物(4％ds)的水解程度進行的。還原糖的含量是使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所述的DNS法進行測量的。一個單位的酶活(SSU，可溶性澱粉單位)相當於在特定溫育條件下每分鐘釋放1mg葡萄糖的還原力。
總澱粉含量的測定0189酶-酶澱粉液化和糖化法(雙酶法(dual enzyme method))被用來確定總澱粉含量。在典型的分析中，將2g幹樣品放入100ml Kohlraucsh燒瓶中並加入45mlpH 7.0的MOPS緩衝液。將此漿液充分攪拌30分鐘。加入1.0ml SPEZYME FRED(1∶50稀釋於水中)並加熱至沸騰3-5分鐘。將燒瓶放入高壓滅菌鍋內，121℃保持15分鐘。高壓滅菌後，將燒瓶放入95℃水浴中，並加入1ml 1∶50稀釋的SPEZYMEFRED，溫育45分鐘。將pH調至pH 4.2並將溫度降至60℃。隨後加入20ml乙酸鹽緩衝液，pH 4.2。通過加入1.0ml 1∶100稀釋OPTIDEX L-400(葡糖澱粉酶，來自Genencor International Inc.)進行糖化，並繼續在60℃溫育18小時。通過在95℃加熱10分鐘終止酶反應。使用葡萄糖作為標準品，通過HPLC分析確定總糖組成。室溫下未經酶處理的樣品水提取物中的可溶性澱粉水解產物被從總糖中扣除。
殘留澱粉的碘檢測0190將啤酒(發酵肉湯)樣品在2ml塑料離心管中離心。倒盡上清液，將含沉澱的離心管放進冰浴中。向此沉澱中加入若干滴0.025N碘溶液(0.1N碘，來自VWR目錄號VW3207-1，4×稀釋)並混合。陽性(+)澱粉表現為由藍到紫的顏色範圍，且顏色的強度直接與澱粉濃度成正比。陰性結果(-)保持淡黃色。
總蛋白的分析0191樣品製備物中的總氮(N)使用Kjeldhal法(American Assoc.Cereal Chemists(AACC)，(1983)，Methods 22B60 8th Ed.St Paul，MN)確定。蛋白含量按6.25×總N計算。
乙醇和碳水化合物的測定0192樣品的乙醇和碳水化合物(carbohydrate)組成是使用在此所述的HPLC法確定的a)將1.5mL Eppendorf離心管裝入發酵罐啤酒並在冰上冷卻10分鐘；b)將樣品管在Eppendorf桌面離心機中離心1分鐘；c)將0.5mL上清液樣品轉移至含0.05mL Kill溶液(1.1N H2SO4)的測試管中，靜置5分鐘；d)向測試管樣品中加入5.0mL水，然後經0.45μm尼龍注射式過濾器濾入HPLC管中；然後運行HPLC。
0193HPLC條件a)乙醇系統柱Phenomenex Rezex有機酸柱(RHM-單糖)#00H-0132-KO(相當於Bio-Rad 87H)；柱溫60℃；流動相0.01 N H2SO4；流速0.6mL/分鐘；檢測器RI；注入體積20μLb)碳水化合物系統柱Phenomenex Rezex碳水化合物(RCM-單糖)#00H-0130-KO (相當於Bio-Rad 87H)；柱溫70℃；流動相納米純DI H2O；流速0.8mL/分鐘；檢測器RI；注入體積10μL(3％DS物質)。
0194該柱根據糖的分子量進行分離，所述糖被命名為DP1(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(具有大於3的聚合度的寡糖)。
實施例中所用的在裡氏木黴中異源表達的asaA的製備
0195在表達asaA的裡氏木黴(按照實施例2和3製備)發酵結束時，將生物材料(biomass)離心分離，並將清澈的培養物濾液用截留分子量為10,000的超濾膜進行濃縮。使用該具有90SSU/g的超濾濃縮液。
實施例中使用的黑麴黴葡糖澱粉酶的製備如下0196經挑選的如美國專利3,249,514中所述的黑麴黴菌株被使用。發酵後，使用包括過濾和離心的傳統分離方法分離真菌菌絲體。將清澈的濾液在5℃通過超濾濃縮至特定活性。
實施例0197克隆河內麴黴酸穩定性α澱粉酶基因。
0198從河內麴黴菌絲體的過夜培養物中提取基因組DNA。按照製造商的真菌說明書使用FastDNA Kit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM實驗方案。為了均質化，將樣品在FastPrep設備上以速度4.0處理30秒。根據A.Kaneko等(Kaneko等，(1996)，J.Ferm Bioeng 81292-298)的asaA序列，設計PCR引物。
0199(A).為了構建裡氏木黴表達載體，正向克隆引物alph 6的序列為CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQ ID NO.6)，反向克隆引物Akaa3的序列為CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQ ID NO.7)。正向引物中含有用於定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。將該基因用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)從基因組DNA中擴增出來。
0200通過凝膠抽提(凝膠純化試劑盒，Qiagen)，將2.36 kb PCR產物純化，並按Invitrogen Gateway系統方案將其克隆進pENTR/D。然後將該載體轉化進化學感受態Top10大腸桿菌(Invitrogen)中，用卡那黴素進行選擇。將來自若干克隆的質粒DNA用限制性酶進行消化以確認正確大小的插入片段。將來自若干克隆的α澱粉酶基因插入片段進行測序(Sequetech，Mountain View，CA)(SEQ ID NO1)。將來自一個克隆pENTR/D_Akaa#11的質粒DNA與pTrex3g/amdS目的載體DNA一起加入到LR克隆酶(clonase)反應(Invitrogen Gateway系統)中。在LR克隆酶反應中進行的重組，用pENTR/D載體中的河內麴黴asaA替換目的載體中的CmR和ccdB基因。此重組在目的載體的cbhl啟動子和終止子之間定向插入asaA。48bp和50bp的重組位點序列分別保留在α澱粉酶的上遊和下遊。將LR克隆酶反應的等份樣品轉化進化學感受態Top10大腸桿菌中，並過夜生長，用羧苄青黴素進行選擇。將來自若干克隆的質粒DNA進行限制性消化以確認正確的插入片段大小。為了從該細菌質粒中移走真菌序列盒，按照Stratagene QuickChange方案將EcoRI位點加入到amdS基因的3′。整個真菌盒的序列被確證。將來自克隆pTrex3g_Akalpha#1的質粒DNA(圖4)用EcoRI消化以釋放出包括cbhI啟動子asaAcbhI終止子amdS的表達盒。使用標準技術，通過瓊脂糖抽提純化此7.8kb的序列盒，並將其轉化進衍生自可公開獲得的菌株QM6a的裡氏木黴菌株，如下面進一步描述的。
0201(B).為了構建黑麴黴表達載體，正向克隆引物alpha7的序列為5′-GCGCGCTACGTAATGAGAGTGTCGACTTC(SEQ ID NO11)，反向克隆引物rsh46r的序列為5′GCGCGCTACGTACTACCTCCACGTATC(SEQ ID NO12)。將該基因用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)從基因組DNA中擴增出來。
0202通過凝膠抽提(凝膠純化試劑盒，Qiagen)，將2.36 kb PCR產物純化，並按照製造商的方案將其克隆進pCR-BluntII-TOPO(Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒，Invitrogen)。將該載體轉化進One ShotTop10 E.coli(Invitrogen)，用卡那黴素進行選擇。將來自若干克隆的質粒DNA用限制性酶進行消化以確證正確大小的插入片段。將來自若干克隆的α澱粉酶插入片段(SEQ ID NO1)進行測序(Sequetech，Mountain View，CA)。將已測序的2.36 kb asaA基因用限制性酶SnaBI從載體(克隆TOPO-SnaBaa23)中切下，並通過凝膠抽提進行純化。將含黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子、多克隆位點以及塔賓麴黴葡糖澱粉酶終止子的載體pSL898-MunI(圖5A)用SnaBI消化，該酶在葡糖澱粉酶的啟動子和終止子之間打開質粒。載體pSL898-MunI還包括用於檢測真菌轉化子的構巢麴黴乙醯胺(amdS)選擇標記，這是通過用乙醯胺作為唯一氮源進行生長來檢測的。載體消化之後用蝦鹼性磷酸酶(Roche Diagnostics Corp.)將載體去磷酸化。然後將分離的2.36kb的、側翼為SnaBI的asaA用T4DNA連接酶(Roche Diagnostics Corp.)連接進該載體，均按照製造商的說明書進行。將連接混合物轉化進One Shot Top 10大腸桿菌(Invitrogen)，用卡那黴素進行選擇。用XhoI消化克隆以確認插入片段的方向。SnaBI位點在該平末端連接中被改變。然後用PCR(Pfu Turbo DNA聚合酶)將ApaI位點增加到真菌表達盒的5′和3′端。正向引物a17序列為GGGCCCATTTTGAATAGCTCGCCCGCTG(SEQ ID NO13)，反向引物a18r序列為GGGCCCCAATTGCCTAATGCTATGTGCAAG(SEQ ID NO14)。將PCR產物按照製造商的說明書克隆進pCR-BluntII-TOPO(溫育過程增加至室溫下1小時)並轉化進One ShotTop 10大腸桿菌，用卡那黴素進行選擇。為確保準確，對若干克隆進行測序(Sequetech，Mountain View，CA)。
0203大腸桿菌克隆#31，pSL902_AkAA(圖5B)被用來生成用於轉化的質粒DNA。用限制性酶ApaI消化該質粒以使表達盒線性化，其包括構巢麴黴amdS、黑麴黴glaA啟動子、河內麴黴α澱粉酶(SEQ ID NO1)以及黑麴黴glaA終止子。使用標準技術通過瓊脂糖抽提法將此7.2kb序列盒純化，並將其轉化進黑麴黴菌株，該菌株包含來自於ATCC 14916的內源性葡糖澱粉酶。
實施例2基因槍(biolistic)轉化裡氏木黴
0204將裡氏木黴孢子懸液塗布到MABA轉化培養板的～6cm直徑中心(150μl的5×107-5×108個孢子/ml懸液)。然後，將培養板在生物學通風櫥(biological hood)中風乾。將stopping screen(BioRad 165-2336)和macrocarrier holder(BioRad 1652322)浸入到70％乙醇中，並風乾。將DriRite乾燥劑放置到小培養皿中(6cm Pyrex)，用Whatman濾紙覆蓋。將含有macrocarrier(BioRad 165-2335)的macrocarrier holder平放在濾紙上面，代替培養皿的蓋子。
0205通過向Eppendorf管中加入60mg鎢M-10顆粒(microcarrier，0.7微米，Biorad#1652266)，製備鎢顆粒懸液。加入1ml乙醇(100％)。將鎢在乙醇溶液中渦旋振蕩，並讓其浸泡15分鐘。以最大速度將Eppendorf管進行短暫微量離心，以使鎢發生沉澱。倒空乙醇，用無菌蒸餾水洗滌三次。在第三次將洗滌水倒空之後，將鎢重新懸浮在1ml的無菌50％甘油中。鎢被新鮮製備，至少每兩周一次。
0206對於每次轉化，通過將25μl的懸浮鎢加入到1.5ml Eppendorf管中，製備轉化反應物。隨後，按次序加入0.5-5μl DNA(XbaI-消化的表達盒)、25μl 2.5MCaCl2、10μl 0.1M亞精胺。將反應連續地渦旋振蕩5-10分鐘，使鎢保持懸浮。然後，短暫地微量離心Eppendorf管，並倒空液體。用200μl的70％乙醇洗滌鎢沉澱，短暫地微量離心，以形成沉澱，並倒空液體。用200μl的100％乙醇洗滌沉澱，短暫微量離心以形成沉澱，並倒空液體。將鎢沉澱重懸於24μl 100％乙醇中。將該Eppendorf管放置到超聲水浴中15秒，將8μl等份試樣轉移到乾燥的macrocarriers的中心。讓macrocarriers在乾燥的培養皿中乾燥。
0207將氦罐(He tank)打開到1500psi。1100psi rupture discs(BioRad 165-2329)被用於PDS-1000/He型基因槍微粒傳送系統(Model PDS-1000/He Biolistic ParticleDelivery System(BioRad))中。當鎢溶液乾燥時，將stopping screen和macrocarrierholder插入到PDS-1000中。MABA平板，其含有靶裡氏木黴孢子，被放置到stoppingscreen下面6cm處。在該腔上被抽至29英寸Hg柱的真空，並維持。啟動該氦基因槍微粒傳送系統。該腔被排氣，取出MABA平板，在28℃溫育直至出現克隆(5天)。
0208關於此實施例2，下列溶液被製備。
0209每升改良型amdS基因槍瓊脂(MABA)包括部分I，1000×鹽，1.0ml；Noble瓊脂，20g，在500ml dH2O中製成。將pH調至6.0並高壓滅菌。部分II，乙醯胺，0.6g；CsCl，1.68g；葡萄糖，20g；KH2PO4，15g；MgSO4·7H2O，0.6g；和CaCl2·2H2O，0.6g，在500ml dH2O中製成。將pH調至4.5並用0.2微米濾器過濾除菌；放入50℃爐加熱，加入瓊脂，混合併倒入板中，室溫保存。
02101000×鹽/升＝FeSO4·7H2O，5g；MnSO4·H2O，1.6g；ZnSO4·7H2O，1.4g；CoCl2·6H2O，1g，用dH2O加至1L，並用0.2微米濾器過濾除菌。
實施例3
PEG介導的原生質體融合轉化裡氏木黴0211將形成孢子的菌絲體(生長於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上，Difco，30℃，5天)的1-2cm2瓊脂塊接種於250ml的4-擋板搖瓶中的50ml YEG(5g/L酵母提取物+20g/L葡萄糖)肉湯中，在30-37℃於200rpm溫育16-20小時。通過將搖瓶內容物轉移至50ml錐形管中，並在2500rpm旋轉離心10分鐘，回收菌絲體。棄去上清液並將菌絲體沉澱轉入250ml、0.22m CA或PES Coming過濾瓶中，該過濾瓶裝有40ml經過濾的β-D-葡聚糖酶溶液。將該溶液在30℃、200rpm溫育2小時以生成原生質體。經無菌Miracloth(CalBiochem，La Jolla，CA)，將原生質體過濾收集至50ml錐形管中。2000rpm離心5分鐘，沉澱原生質體，棄去上清液。將原生質體沉澱用50ml 1.2M山梨醇清洗一次；離心(2000rpm，5分鐘)並棄去上清液。用25ml山梨醇/CaCl2清洗沉澱。使用血球計數器對原生質體進行計數，然後通過2000rpm離心5分鐘使其沉澱。棄去上清液，將原生質體沉澱重懸於一定體積的山梨醇/CaCl2中，其體積足以產生原生質體濃度為1.25×108/ml的原生質體溶液。
0212對於每次轉化，將20μg表達載體DNA的等份樣品(體積不大於20μl)轉移到15ml錐形管中，置於冰上。在每個管中加入原生質體懸浮液(200μl)和50μl PEG溶液。將其溫和混勻並在冰上溫育20分鐘。向每支轉化管中加入PEG(2ml)溶液並在室溫下溫育5分鐘。向每支離心管中加入4ml山梨醇/CaCl2溶液(總體積6.2ml)並溫和混勻。然後向3支熔化的(50℃)頂部瓊脂管中的每支中加入2ml的轉化混合物。將各份頂層瓊脂混合物倒入單獨的轉化培養板上並在30℃溫育四至七天。
0213對於使用amdS選擇的轉化，使用了乙醯胺/山梨醇培養板和頂層瓊脂。選擇培養板與轉化培養板相同，但沒有山梨醇。通過將分離的集落轉移至含乙醯胺的新鮮的選擇培養基，將推定的轉化子純化。
0214培養基和溶液製備如下。40ml β-D-葡聚糖酶溶液-將600mg β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，San Mateo，CA)和400mg MgSO4·7H2O溶解於40ml1.2M山梨醇。200ml PEG混合物-將50g PEG 4000(BDH Laboratory SuppliesPoole，England)和1.47g CaCl2·2H2O溶解於200ml dlH2O。PEG混合物被新鮮製備，至少每月一次。山梨醇/CaCl2溶液-將50mM CaCl2溶解於1.2M山梨醇。乙醯胺/山梨醇瓊脂-部分I將0.6g乙醯胺(Aldrich，99％純度)、1.68g CsCl、20g葡萄糖、20g KH2PO4、0.6g MgSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、1ml 1000×鹽(見下)溶解於200ml dlH2O中，調至pH 5.5，用dH2O定容至體積達300ml，將其過濾除菌。部分II將20g Noble瓊脂和218g山梨醇加入1L量筒，用dlH2O定容至體積(700ml)，並高壓滅菌。將部分II加入部分I，達到終體積1L。(1000×鹽-將5gFeSO4·7H2O、1.6g MnSO4·H2O、1.4g ZnSO4·7H2O和1g CoCl2·6H2O合併，用dlH2O將體積定容至1L。然後過濾滅菌。
實施例4PEG-介導的原生質體融合轉化黑麴黴0215將裝有100ml WCWM或WCWM+CD肉湯的250ml 4-擋板搖瓶用-80℃儲存的黑麴黴菌株菌絲體接種，其過量表達野生型的內源性葡糖澱粉酶並衍生自ATCC 14916。在30℃，300rpm使培養物生長48-72小時。將10％轉移至新WCWM或WCWM+CD搖瓶中。使此第二階段培養物在30℃、300rpm生長24至72小時。經無菌Miracloth濾器收集菌絲體，並用溶液A清洗，或者在IEC擺桶式離心機中將菌絲體離心下來(2000rpm)。在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40ml原生質體溶液中並在30℃、200rpm溫育1-2小時，顯微鏡觀察監測原生質體化進展。經無菌Miracloth將原生質體化反應濾入兩個50ml無菌的一次性離心管中，並將每管的體積用溶液B定容至45ml。將原生質體在2500rpm離心5分鐘以獲得沉澱並棄去上清。用20ml體積的溶液B再清洗沉澱兩次。將沉澱重懸於10ml溶液B中，並用血球計數器對原生質體計數。將原生質體再次離心並棄去上清。在溶液B中重懸原生質體以產生～1×107/100μl。在冰上，將100μl原生質體溶液加入預冷的15ml管中，每個轉化反應一管。以不超過10μl的體積加入10μgDNA。加入溶液C(12.5μl)，溫和混勻並在冰上溫育20分鐘。
0216將MMSA頂層瓊脂(每個轉化反應3管，每管10ml)熔化並保持在55℃。從冰中移出原生質體，並向每管中加入溶液C(1ml)和溶液B(2ml)，溫和混勻各管。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入1ml原生質體混合物，並將頂層瓊脂倒在MMSA板上。為每個轉化反應重複此過程，並將板在30℃溫育4-7天。
0217溶液A(每500ml)-0.44g K2HPO4；0.34g KH2PO4；48.156g無水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至終體積500ml，pH 5.5。將溶液過濾滅菌並在室溫下保存。
0218原生質體化溶液-將180單位的β-D-葡聚糖酶(InterSpex Products，Inc.，CA)或者450mg β-D-葡聚糖酶和150mg Driselase(InterSpex Products，Inc.)溶解於40ml溶液A中，並將溶液過濾滅菌，0.2微米。
0219溶液B(每500ml)-5ml 1M Tris，pH 7.5；2.77gCaCl2(FW 110.99)；109.32g山梨醇(FW 182.2；1.2M)；加入dlH2O至終體積500ml。將此溶液過濾滅菌並在室溫下保存。
0220溶液C(每500ml)-250g PEG 4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH 7.5；加入dlH2O至終體積500ml。將此溶液過濾滅菌。
0221MMS瓊脂-將6g/LNaNO3；0.52g/L KCl；1.52g/L KH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素(見下)；10g/L瓊脂(頂層瓊脂中的低熔點瓊脂糖)溶解於1L dlH2O。高壓滅菌。滅菌後，在無菌條件下加入10ml 50％葡萄糖和1.25ml 20％MgSO4·7H2O。
0222MMSA瓊脂，MMS中的硝酸鹽用0.59g/L乙醯胺和3.4g/L CsCl代替。
0223痕量元素溶液-將1g/L FeSO4·7H2O；8.8g/L ZnSO4·7H2O；0.4g/LCuSO4·5H2O；0.15g/L MnSO4·4H2O；g/L Na2B4O7·10H2O；50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O溶解於250ml dlH2O中。混勻並加入0.2ml濃HCl，溶解並用dlH2O定容至1L，過濾滅菌。
0224WCWM肉湯(1升)＝(NH4)2SO4，3.5g；DIFCO酵母提取物，4g；馬鈴薯葡萄糖澱粉(Potato Dextrose Starch)，6g；Mazu，1ml和Cerelose，2.2g。
0225WCWM+CD(1升)＝(NH4)2SO4，3.5g；Tastone 210酵母提取物，4g；馬鈴薯葡萄糖肉湯，20g；和DIFCO Czapek Dox，20g。
實施例5用編碼AkAA的asaA基因轉化的裡氏木黴和黑麴黴的發酵和轉化細胞中酶的表達(A).木黴克隆0226一般而言，遵循如在Foreman等(Foreman等，(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的發酵方案。更具體而言，對於每個菌株進行兩組發酵，如圖6A所示。將含5％葡萄糖的0.8 L Vogels基本培養基(Davis等，(1970)METHODS IN ENZYMOLOGY 17A1，pg 79-143和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM，Oxford University Press，(2000))用1.5ml冷凍孢子懸浮液進行接種。48小時後，將每一培養物轉移至14L Biolafitte發酵罐中的6.2L相同培養基中。發酵罐在25℃、750 RPM以及每分鐘8標準升氣流的條件下運行。在最初的葡萄糖被耗盡後一小時，開始給予25％(w/w)的乳糖給料並以碳限制的方式給料以防止乳糖積累。用葡萄糖氧化酶分析試劑盒或者帶有β-半乳糖苷酶的葡萄糖己糖激酶分析試劑盒分別對葡萄糖和乳糖的濃度進行監測，所述β-半乳糖苷酶被添加用於切割乳糖(Instrumentation Laboratory Co.，Lexington，MA)。
0227以規律的時間間隔取樣以監測發酵的進程。在International EquipmentCompany(Needham Heights，MA)臨床用離心機上，將採集的樣品在50ml離心管中以3/4速度旋轉離心。在還原性條件下，用MOPS(嗎啉丙磺酸)SDS電泳緩衝液和LDS樣品緩衝液對樣品上清液在4-12％BIS-TRIS SDS-PAGE膠上進行電泳(圖6A)。
0228在其它發酵中，對樣品上清液進行的處理基本如上所述。但是，不同比例的完整型和截短型Tr-asaA被獲得。圖6B，泳道2示出50至90kD之間的三條主要條帶。用本領域已知的改進方法將膠中的這三條主要條帶消化(Hellman等，(1995)Anal.Biochem.224451-455)。肽被抽提，用反向HPLC分離，並測定肽質量和ms/ms碎裂方式。所獲得的肽圖證實了兩條較低分子量的條帶為截短型。一個條帶代表截短型asAA，其中剪切是發生在SEQ ID NO3的434位胺基酸和580位胺基酸之間，第二條帶代表截短型asAA，其中剪切是發生在SEQ ID NO3的大約581位胺基酸。每一條帶都表現出α澱粉酶和顆粒澱粉水解活性。
(B).麴黴克隆0229葡糖澱粉酶和河內麴黴α澱粉酶兩者的表達在黑麴黴轉化子(按如上所述獲得)中被分析。葡糖澱粉酶活性和α澱粉酶活性通過HPLC用來自轉化子的樣品上清液來測量。在被分析的27個轉化子中，至少22個轉化子產生0.5mg/ml以上的AkAA。此外，至少22個轉化子產生至少25％的親本對照的葡糖澱粉酶(根據活性)。這些轉化子中的至少6個產生1.5mg/ml以上的AkAA。這些結果中的一些在下面的表1中示出。
表1葡糖澱粉酶和河內麴黴α澱粉酶在黑麴黴中的共表達

實施例6從天然麴黴宿主和裡氏木黴宿主獲得的AkAA的pH穩定性的比較0230將如上所述在裡氏木黴中重組產生的AkAA樣品(Tr-asaA)和天然asaA的樣品用pH 4.5的20mM乙酸鹽緩衝液稀釋至相等的蛋白濃度。反應在50℃，3至7的pH水平，在100mM檸檬酸鹽/NaOH緩衝液中進行30分鐘。將1.0mL反應物加入到樣品管中的5mL含10％的玉米澱粉(Cargill Foods，MN)的pH 4.5的100mM乙酸鹽中。將管在50℃搖蕩20分鐘。然後加入0.5mL 2.0％NaOH。將管旋轉離心，並用二硝基水楊酸(DNS)試驗對0.5mL上清液中的還原糖進行分析(Goto等，(1994)supra)。結果在圖7中描述。r-asaA在pH 3.9表現出100％的殘留活性。相比之下，n-asaA在pH 4.5表現出100％的殘留活性。
實施例7在SSF中用表達AkAA的裡氏木黴由非熟化的碾碎的全玉米底物(non-cookedwhole ground corn substrate)生產乙醇0231對裡氏木黴產生的AkAA在無細胞培養物濾液所含的兩個葡糖澱粉酶水平(0.5和1.0 GAU/g)進行評價。葡糖澱粉酶從黑麴黴組合物獲得。百分之三十六的玉米粉漿液被製備，含幹玉米漿(2.5％的玉米粉)。將漿液的pH用稀硫酸調至4.8。漿液的總幹固體為33.85％。在含100gm醪(漿液)的125ml燒瓶中進行發酵。加入所需水平的酶，然後加入3ml增殖的酵母的漿體以開始發酵。該酵母接種物是通過將0.26gm幹Fali酵母加入到100gm含GA活性的醪中而製備的，所述GA活性為每克原材料固體0.9 GAU。將此漿液放入32℃水浴中，溫和混合大約17小時。在各時間間隔，取出發酵樣品(啤酒)用於HPLC分析。72小時後，終止發酵，並將啤酒在60℃乾燥以獲得蒸餾器幹穀物和可溶物(the distillers dry grains plussolubles，DDGS)。
0232測定DDGS的澱粉含量，並辨認出終止發酵之後啤酒中的不溶性固體，通過加入碘對其中的澱粉進行檢測。表2總結了乙醇水平、醪固體的碘染色以及DDGS的澱粉百分比(％)。
表2在酵母發酵條件下將顆粒玉米澱粉轉變為乙醇的過程中asaA的作用


實施例8通過葡糖澱粉酶和α澱粉酶對顆粒澱粉底物的轉化0233將不同來源的商業上的α澱粉酶與Tr-asaA在同步糖化發酵條件下進行比較，其中存在商業GA來源的葡糖澱粉酶，量為0.5GAU/g ds。使用如前面所述的可溶性澱粉底物(SSU)分析法，測定商業上的α澱粉酶的活性。
0234如實施例7中所述，使用碾碎的全玉米進行乙醇發酵。以每克碾碎玉米1.0 SSU的量加入各種來源的α澱粉酶，以每克0.5GAU的量加入葡糖澱粉酶。
0235α澱粉酶包括裡氏木黴表達和產生的AkAA，具有SSU/ml，90；SPEZYMELTAA(解澱粉芽孢桿菌)，具有SSU/ml，2,759；SPEZYME FRED(地衣芽孢桿菌)，具有SSU/ml，4,842；SPEZYME Ethyl(嗜熱脂肪芽胞桿菌)，具有SSU/ml，22,082；以及CLARASE L(米麴黴)，具有SSU/ml，23,087。
0236在發酵過程中取樣並分析乙醇含量。發酵後，分離不溶性固體(DDGS)，並測定在pH 5.0時玉米醪中的殘留澱粉含量。結果在表3中被概括。
表3平均％v/v EtOH

實施例9
底物處理對乙醇產量和蒸餾器幹酒糟固體(DDGS)的影響0237碾碎的全玉米底物經過傳統的幹磨工藝處理以便用於燃料酒精發酵，其中使用錘磨機來減小顆粒尺寸。製備出三種不同的醪。
0238處理1(Trt1)是高溫處理，其涉及用3.5U/g SPEZYME ETHYL在pH 5.6，按照現有工藝程序通過噴射蒸煮將含0.9％幹玉米漿(dry corn steep，DCS)的36％ds玉米粉漿液分批液化。將漿液放入90℃浴中1.5小時，混合，然後冷卻至30℃，用稀硫酸將pH調至5.0。進一步用水將漿液稀釋至32.71％ds。
0239處理2 (Trt2)是低溫處理。醪是通過將用稀硫酸將pH調至5.0的含0.9％DCS的36％玉米粉漿液在60℃溫育3小時而製成的。溫育前，加入0.05 GAU/g的葡糖澱粉酶。
0240處理3(Trt3)是室溫處理(未加熱處理)-玉米漿液是在室溫下獲得，然後被用於發酵，所述發酵使用每克玉米0.5 GAU的葡糖澱粉酶以及每克玉米1.0 SSU的由裡氏木黴產生的AkAA。
0241然後對每組處理進行酵母發酵，如實施例7中所述。
0242發酵後，測定乙醇產量，並通過離心分離出每一處理組的不溶性同體，將其在60℃乾燥，並測定總碳水化合物含量和氮含量。結果在表4中示出。
表4在使用酵母進行的乙醇發酵條件下碾碎的全玉米底物的不同處理組的乙醇產量和DDGS組成的比較

實施例10用黑麴黴α澱粉酶和葡糖澱粉酶的共表達轉化子進行發酵來生產乙醇0243乙醇的產生(％v/v)被評價，其中葡糖澱粉酶劑量水平為0.75 GAU/g ds，並且對於轉化子#10，α澱粉酶劑量水平為9.90 SSU/g ds，對於轉化子#26，α澱粉酶劑量水平為4.29 SSU/g ds(參見實施例5B，轉化子#10和轉化子#26)。含33％DS的100g玉米漿是由Azure玉米粉(8.95％含水量)製成的。將漿液的pH調至pH 4.5，並在125ml燒瓶中添加1mL的20％Fali酵母(400ppm)，在32℃進行發酵。在24、48和70小時，測量上清液中的乙醇(％v/v)表5

權利要求
1.一種麴黴真菌菌株，包含編碼葡糖澱粉酶的DNA和編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的異源α澱粉酶的DNA，其中所述葡糖澱粉酶和所述異源α澱粉酶均由所述麴黴真菌菌株表達並分泌。
2.權利要求1所述的麴黴菌株，其中所述異源α澱粉酶與SEQ ID NO3具有至少95％序列同一性。
3.權利要求1所述的麴黴菌株，其中所述菌株是黑麴黴(A.niger)、構巢麴黴(A.nidulans)、米麴黴(A.oryzae)或者泡盛麴黴(A.awamori)菌株。
4.權利要求3所述的麴黴菌株，其中所述麴黴菌株是黑麴黴菌株。
5.權利要求3所述的麴黴菌株，其中所述菌株是過量產生葡糖澱粉酶的菌株。
6.一種培養基，包含權利要求1所述的麴黴菌株。
7.一種酶組合物，包含權利要求1所述的麴黴菌株。
8.一種酶組合物，包含權利要求6所述的培養基。
9.一種麴黴菌株，包含a)編碼內源葡糖澱粉酶的DNA和b)編碼與SEQ IDNO3具有至少95％序列同一性的異源α澱粉酶的DNA，其中所述麴黴菌株表達所述葡糖澱粉酶和所述異源α澱粉酶，並且過量產生所述葡糖澱粉酶。
10.一種培養基，包含權利要求9所述的麴黴菌株。
11.一種用麴黴細胞生產α澱粉酶的方法，包括將能夠表達與SEQ ID NO3或者SEQ ID NO4具有至少90％序列同一性的異源α澱粉酶多肽的麴黴細胞在適於表達和生產所述異源α澱粉酶的條件下進行培養，並生產所述異源α澱粉酶。
12.權利要求11所述的方法，其中所述麴黴細胞進一步包含編碼內源葡糖澱粉酶的多核苷酸，並且其中所述葡糖澱粉酶被表達和生產。
13.權利要求12所述的方法，其中所述麴黴是黑麴黴菌株。
14.權利要求12所述的方法，進一步包括回收所生產的α澱粉酶和葡糖澱粉酶。
15.權利要求12所述的方法，其中所述麴黴菌株是過量產生葡糖澱粉酶的菌株。
16.一種用絲狀真菌宿主細胞生產酸穩定性α澱粉酶和葡糖澱粉酶的方法，包括a)通過用DNA構建物轉化絲狀真菌細胞，在絲狀宿主中共表達葡糖澱粉酶和α澱粉酶，所述DNA構建物包含在所述宿主細胞中具有轉錄活性的啟動子，該啟動子被可操縱地連接於編碼與SEQ ID NO3具有至少90％序列同一性的α澱粉酶的多核苷酸，其中所述宿主細胞還表達和產生葡糖澱粉酶；b)將所述轉化的宿主細胞培養於合適的培養基中，以使所述α澱粉酶和所述葡糖澱粉酶被表達，和c)生產所述α澱粉酶和所述葡糖澱粉酶。
17.權利要求16所述的方法，進一步包括回收所述生產的葡糖澱粉酶和α澱粉酶。
18.權利要求16所述的方法，其中所述的絲狀宿主細胞是麴黴菌株。
19.權利要求18所述的方法，其中所述的麴黴菌株是黑麴黴菌株。
20.權利要求18所述的方法，其中所述的麴黴菌株是過量產生葡糖澱粉酶的菌株。
21.一種水解澱粉的方法，包括將含澱粉底物與權利要求7所述的酶組合物在用於澱粉水解的合適條件下接觸並獲得水解的澱粉。
22.權利要求21所述的方法，其中所述的澱粉是顆粒澱粉。
23.權利要求22所述的方法，其中所述的接觸是在低於所述的底物中的顆粒澱粉的糊化溫度的溫度下進行的。
24.權利要求21所述的方法，其中所述的底物是穀物或其分離的部分。
全文摘要
本發明涉及異源α澱粉酶和內源葡糖澱粉酶在麴黴菌株中的共表達和生產以及包含它們的酶組合物。
文檔編號C12N1/15GK101084308SQ200580040659
公開日2007年12月5日 申請日期2005年11月8日 優先權日2004年11月30日
發明者T·L·鮑德溫, K·A·克萊森, N·頓－科爾曼, S·E·蘭茲 申請人:金克克國際有限公司