一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用的製作方法

2023-10-09 07:27:34

一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用。I型膠原蛋白可應用於生物醫用材料，但未實現大規模產業化生產。本發明從人胎盤組織中提取總RNA，將其反轉錄為cDNA，並以其為模板克隆出I型膠原α1鏈基因；改造I型膠原α1鏈基因後，與表達載體pPIC9K載體連接構建質粒pPIC9K-Col1a1；將構建的質粒pPIC9K-Col1a1酶切線性化後，導入畢赤酵母菌SMD1168；測定人I型膠原α1鏈基因轉化進入畢赤酵母菌SMD1168中，得到轉基因畢赤酵母基因工程菌。本發明的工程菌能在胞外高效安全地分泌人I型膠原α1鏈蛋白，並具有較高的生物活性，該蛋白可與其他無機材料混合，作為生物可降解生物醫用材料，用於組織缺損和修復等。
【專利說明】一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基因工程菌，具體涉及一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]膠原是哺乳動物體內含量最高(約佔體內總蛋白含量的25%)、作用最為廣泛的一類大分子蛋白，膠原作為細胞外基質的主要成分在細胞分化、遷移等生理行為中起重要作用。隨著組織工程科學的不斷發展，以及再生醫學研究的不斷進步，膠原的應用愈加廣泛。重組膠原蛋白由於其產品質量均一、無病毒性隱患和過敏性反應，且易於規模化生產等特點，將逐漸替代天然膠原成為組織工程研究的重要材料。
[0003]目前，國外已經實現三螺旋膠原蛋白的表達，其表達系統有動物表達系統，植物表達系統和微生物表達系統。微生物系統對於生產重組膠原蛋白和重組明膠來說，有著低成本、產品質量均一、高效可放大的優勢。目前用於重組表達人膠原蛋白或明膠的宿主菌有畢赤酵母、釀酒酵母、漢遜酵母、大腸桿菌與短桿菌。但對於膠原和明膠，畢赤酵母是最優的生產系統。畢赤酵母的重組菌可以在胞內產生羥基化的三螺旋重組人膠原可達到1.5g/L。與重組膠原共表達脯氨酸羥化酶可以合成與天然膠原相似的熱穩定性的羥基化膠原。純化得到的羥基化重組膠原纖維在結構上與天然膠原相同。這些質量可以使重組膠原的醫學用途更加有吸引力。國外研究結果表明，畢赤酵母分泌重組膠原或明膠產量達到3_14g/L。早在20世紀90年代，芬蘭大學在酵母中多基因共表達前膠原與脯氨酸羥化酶，獲得了重組三螺旋膠原。美國Fibrogen公司也實現了膠原的三螺旋結構表達並申請了專利，他們通過共表達羥基化酶對膠原肽鏈Pro進行修飾，細胞破碎提取並純化膠原單鏈，在體外創造自組裝環境，進而形成三螺旋膠原。
[0004]天然膠原得重組表達在國內至今沒有相關的研究，但都集中在表達類人膠原和明膠片段的研究上。西北大學範代娣用大腸桿菌表達自行設計的類人膠原，產量穩定且高達20g/L;華澳利康採用畢赤酵母表達膠原蛋白融合肽也取得一定的進展，南京理工大學也在進行相關方面的研究等。
[0005]由於天然三螺旋膠原的重組表達，工藝極其複雜，並且很難實現其規模化生產，因此重組表達天然膠原單鏈和明膠片段不失為理想的選擇。分泌全長膠原單鏈雖然有相關方面的研究，但都不能有效克服其易降解的缺點，且實驗室研究較多，未規模化生產。
[0006]為了充分發揮人I型膠原蛋白在生物醫用材料中的作用，實現該蛋白的大規模產業化應用，首先要實現該蛋白的大量、穩定的表達，並可以分泌到胞外。由於市場上存在的膠原產品，多是從動物中提取的膠原，從而存在病毒性隱患以及產品質量不均一等問題，限制了其在生物醫用材料中的廣泛應用。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用，能高效、安全地進行I型膠原α I鏈蛋白的胞外分泌表達。
[0008]本發明所採用的技術方案是:
一種轉基因畢赤酵母基因工程菌，其特徵在於:
所述的基因工程菌於2013年8月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7981。
[0009]所述的基因工程菌是對從人胎盤組織中克隆出的人I型膠原α I鏈基因Collal進行改造後，與表達載體PPIC9K載體連接，導入畢赤酵母菌SMD1168中構建而成的基因工程菌。
[0010]一種轉基因畢赤酵母基因工程菌的構建方法，其特徵在於:
由以下步驟實現:
步驟一:從人胎盤組織中克隆出I型膠原α I鏈基因Collal ；
步驟二:對I型膠原α I鏈基因Collal涉及XhoI酶切位點的鹼基進行突變改造；步驟三:將改造後的I型膠原α I鏈基因Collal與表達載體pPIC9K載體連接，構建出表達質粒 pPIC9K-Collal ； 步驟四:將構建的表達質粒pPIC9K-Collal酶切線性化後，導入畢赤酵母菌SMD1168
中；
步驟五:測定I型膠原α I鏈基因Collal轉化進入了畢赤酵母菌SMD1168中，從而得到轉基因畢赤酵母工程菌。
[0011]步驟二得到的改造後的Collal基因序列為SEQ ID N0.1。
[0012]所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌在I型膠原α I鏈蛋白高效表達中的應用。
[0013]所表達的I型膠原α I鏈蛋白Collal，其胺基酸序列為SEQ ID N0.2。
[0014]本發明具有以下優點:
本發明成功的構建了轉基因畢赤酵母基因工程菌，實驗證明該工程菌能在胞外分泌人I型膠原α I鏈蛋白，並具有較高的生物活性，本工程菌的成功構建實現了人I型膠原α I鏈大量的胞外分泌表達，該蛋白可與其他無機材料混合，作為生物可降解生物醫用材料，用於組織缺損和修復等，該工程菌的構建成功為上述蛋白的大規模化應用於生物醫用材料中奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是構建的a-factor作為信號肽的Collal基因序列。
[0016]圖2是構建的I型膠原α I鏈蛋白的分泌表達載體圖譜。
[0017]圖3是I型膠原α I鏈基因的PCR擴增結果。
[0018]其中泳道M為DNA MarkerCMarker IV)，I為I型膠原α I鏈基因擴增產物3200bp。
[0019]圖4為I型膠原α I鏈基因重組分泌表達質粒的提取鑑定結果電泳圖。
[0020]其中泳道M為DNA Marker ( λ - hind III)，1-5為不同濃度的表達質粒。
[0021]圖5為重組表達載體pPIC9K_Collal的酶切鑑定結果電泳圖。
[0022]其中泳道M為DNA Marker (λ- hind III ),1為重組表達載體用Sal I酶切結果，2為重組表達載體用BamH I酶切結果，3為重組表達載體用Xho I和EcoR I酶切結果，4為作為對照的Collal基因。
[0023]圖6為在篩選到的重組菌的SDS-PAGE圖。
[0024]其中泳道M為分子量Marker，S1-S3分別為在1.0,2.0,4.0 mg/ml G418抗性YPD平板上篩選的重組菌誘導表達後取上清10 μl的電泳圖。
[0025]圖7為篩選到的重組菌的質譜比對結果。
[0026]使用Mascot 2.0軟體，在SWISS-PROT and NCBI資料庫進行比對。
[0027]圖8為篩選到的重組菌的蛋白免疫印跡實驗。
[0028]M為分子量Marker，1為陰性對照(SMD1168)，2為重組菌上清液免疫印跡(SMDl168/pPIC9K-ColIal)。
【具體實施方式】
[0029]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細的說明。
[0030]下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例的百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。
[0032]畢赤酵母表達系統是近年來發展起來的一種高效的真核表達系統，它表達量高、穩定性好、成本相對較低、能分泌至胞外、便於工業化生產等優點，因而可用於膠原蛋白或明膠的產業化發酵生產。
[0033]本發明所涉及的轉基因畢赤酵母基因工程菌株，是將人I型膠原α I鏈基因改造後，與表達載體連接後導入畢赤酵母菌O0ZcAia sp.)SMD1168中構建而成的轉基因工程菌，於2013年8月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.7981。
[0034]以下為具體構建過程:
1、擴增引物合成:
根據從NCBI (美國國立生物技術信息中心)已獲得的人I型膠原α I鏈和穿梭質粒載體pPIC9K的克隆位點設計PCR擴增引物:
Cl)上遊引物Pl長44個鹼基N-Xho I: CGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGCTGTCTTATGGCTAT (下劃線處為內切酶Xho I位點)；
(2)下遊引物Ρ2長35個鹼基C-EcoR I:
CCGGAATTCTTAAGCCCGGTAGTAGCGGCCACCAT
(下劃線處為內切酶EcoR I位點)。
[0035]引物由上海英駿生物技術有限公司合成，純化方式為PAGE。
[0036]2、目的基因Collal的PCR擴增:
以人胎盤組織為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，然後以cDNA為模板，以N-Xho I和C-EcoR I為引物進行PCR擴增，反應體系為20微升，反應組分為:5XPrime STAR Buffer5 μ l ；dNTP 2 μ l ;1 μl cDNA 模板；N_XhoI1 μl ；C-EcoRI1 μl ；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶1 μ l ;滅菌雙蒸水9 μl。其反應參數為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;65°C退火30s ；72°C延伸3min，30個循環；72°C再延伸lOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，電泳結果如圖3所示，結果表明克隆到目的基因Collal (即人I型膠原α1鏈基因)，測序，其序列與NCBI中公布的序列比對結果為100%。
[0037]3、目的基因Collal的改造:
以上述克隆到的目的基因Collal為模板，以Pl和P3為引物，進行PCR擴增，其擴增產物為Xl ;同樣以目的基因Collal為模板，以P2和P4為引物，進行PCR擴增，其擴增產物為x2 ;然後再以xl，x2為模板，以Pl和P2為引物，進行重疊PCR，得到PCR產物為x3，對其進行切膠回收。
[0038]以上述PCR擴增回收的產物x3為模板，以Pl和P5為引物，進行PCR擴增，其擴增產物為yl ;同樣以產物X3為模板，以Ρ2和Ρ6為引物，進行PCR擴增，其擴增產物為y2 ;然後再以yl，y2為模板，以Pl和P2為引物，進行重疊PCR，得到PCR產物為y3，對其進行切膠回收，得到改造後的基因Collal。
[0039]上述涉及的引物序列如下:
引物 P3:AATCCTCGCGCACCCTGAGGCCCAGGAG
引物 P4:CTCAGGGTGCGCGAGGATTGCCCGGAACAGCT
引物 P5:TTCACCTCGCGCTCCTCGCTTTCCCTCTCCAG
引物 P6:AAAGCGAGGAGCGCGAGGTGAACCCGGACCCACT
(下劃線處為所涉及的突變鹼基)
改造後的Collal基因序列為SEQ ID N0.1，具體序列參見說明書核苷酸和胺基酸序列表中的序列I。其中，第273位與930位為突變鹼基。
[0040]4、PCR產物經膠回收並克隆至T載體:
按照天根生化科技有限公司PCR產物膠回收試劑盒說明書回收改造後的基因Collal，回收的產物克隆於T載體pMD 18-T (TaKaRa公司)載體中得到重組載體pMD 18-T_Co 11 a I，將該重組載體CaCl2法轉化與大腸桿菌DH5a中，篩選重組子，對白斑重組子進行雙酶切電泳，經鑑定表明改造後的基因Collal與pMD18-T載體成功連接，並成功轉化到大腸桿菌DH5a中。
[0041]5、穿梭表達質粒的構建:
提取重組載體pMD18-T_Collal，用Xho I和EcoR I雙酶切得到目的片段Collal，同樣雙酶切表達載體PPIC9K，並將前面兩個雙酶切的片段進行切膠回收，將回收到的Collal基因片段和質粒表達載體PPIC9K在T4DNA連接酶的作用下，16°C下連接過夜，將過夜連接得到的連接產物CaCl2法轉化進入大腸桿菌DH5a，在50mg/ml的卡那黴素抗性的LB平板上篩選陽性重組子，並進行雙酶切驗證，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外成像儀下，結果如圖5所示，表明成功地構建了 Collal基因與pPIC9K的連接產物的表達載體，並命名為pPIC9K-Col Ial，並轉化到了大腸桿菌DH5a中。
[0042]6、電轉化畢赤酵母菌SMDl 168:` Cl)畢赤酵母菌SMDl 168電轉感受態的製備:
挑取畢赤酵母菌SMDl 168單菌落接種於IOml YPD液體培養基(1%酵母提取物，2%蛋白腖，2%葡萄糖，水餘量)中，30°C條件下，在搖床上200rpm，過夜培養；接種過夜培養的0.5ml畢赤酵母菌SMDl 168到新鮮的100ml YPD培養基(1%酵母提取，2%蛋白腖，2%葡萄糖，水餘量)中，30°C，200rpm過夜培養，培養至OD6tltl=L 3-1.5 ;在1500g的離心力作用下，4°C離心酵母細胞6min,然後以100ml 0°C的無菌雙蒸水重懸菌體；相同條件下再次離心酵母菌體,再以50ml無菌雙蒸水重懸酵母細胞；相同條件下再次離心菌體細胞，以25ml預冷的IM的山梨醇重懸細胞；最後在相同的條件下離心菌體細胞，以200 μ I預冷的IM的山梨醇混勻菌體細胞後，置於冰上待用。
[0043](2)表達質粒載體的線性化和電轉化畢赤酵母菌SMDl 168:
大量提取重組表達載體pPIC9K-Collal，用Sal I對其進行酶切線性化，電泳檢測結果如圖5所示。 取100 μ I上述畢赤酵母菌感受態細胞，加入10 μ I線性化的重組表達質粒，並加入到經冰浴的2_電轉杯中；將加入線性化質粒的電轉杯繼續在冰上冰浴5min，之後放入電轉儀 Electro Cell Manipulator 630 (Harvard apparatus),設置電轉條件為 1.5kV、25yF、200Ω，約8.1 ms結束。電轉結束後立即將Iml冰浴的山梨醇加入電轉杯中，將電轉杯中的混合液移出至滅菌的離心管中，30°C下靜置培養Ih ;最後取100μ I的菌液塗布於MD平板上，30°C培養2-5天，直到有單菌落出現。
[0044]7、篩選陽性轉化子:
挑取MD平板上長出的陽性克隆子，以N-XhoI和C-EcoRI為引物進行菌落PCR驗證。其具體操作步驟為:將單菌落挑入50 μ I滅菌雙蒸水中，100°C加熱5min，12000rpm室溫離心5min，將其上清液作為PCR的模板進行PCR驗證。PCR反應體系為50 μ 1，其反應組分為:IOXTaq buffer 5μ I ；dNTP 4μ I ;上下遊引物各1μ I ;模板2 μ 1，Taq聚合酶I μ 1，滅菌雙蒸水36 μ I。PCR擴增條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;65°C退火30s ;72°C延伸3min，30個循環；72°C再延伸lOmin。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小是否與實際相吻合。
[0045]8、基因工程菌C0L1A1蛋白的誘導表達:
(1)挑取陽性克隆的單菌落加入到10mlYPD液體培養基中(1%酵母提取物，2%蛋白腖和2%葡萄糖)，30 0C，200rpm培養過夜進行活化；
(2)以1%的接種量接種於100ml的BMGY液體培養基(1%酵母提取物，2%蛋白腖，100禮磷酸鉀，PH 6.0，1.34%酵母基礎氮源培養基，4X10_5%生物素，1%甘油，水餘量)中，30 0C，200rpm 培養至 0D_=6.0 ；
(3)在1500g離心力作用下，4°C離心6min收集菌體，並將其懸浮於200mlBMMY液體培養基(1%酵母提取物，2%蛋白腖，100 mM磷酸鉀，pH 6.0, 1.34%酵母基礎氮源培養基，4X10_5%生物素，1%甲醇，水餘量)中，使其起始濃度為OD6qq=L 0，在30°C，200rpm條件下培養；
(4)每隔24h加甲醇至終濃度為1%進行誘導表達；
(5)誘導72h，取培養液在12000rpm條件下離心2min，取上清液並於_20°C保存。
[0046]9、基因工程C0L1A1蛋白的鑑定和序列測定:
(I)蛋白免疫印跡(Western blotting),其步驟如下:
A、制膠及上樣:
(a)配製12%SDS-PAGE分離膠，混勻後注入邊條厚度為2mm的兩塊潔淨玻璃板間，其上
加一薄層異丙醇，室溫下靜置至凝固。
[0047](b)待分離膠完全聚合後，傾去其上的水層，以吸水紙吸淨殘餘液體，插入加樣梳，緩緩加入5%濃縮膠，使其充滿加樣梳間的空隙，室溫下靜置。待膠完全聚合。[0048](c)將凝膠固定於電泳裝置上，上、下槽加入電泳緩衝液。
[0049](d)小心拔去加樣梳，使加樣孔豎直，以電泳緩衝液衝洗加樣孔數次。
[0050](e)分別取10 μ I培養上清液蛋白樣品及蛋白質分子量marker,按4:1體積比加Λ5Χ樣品緩衝液，以IX樣品緩衝液配平上樣體積(總體積20 μ I)後，於沸水浴中煮5min使蛋白變性。
[0051](6)將處理好的樣品按照預定的順序加入分離膠的上樣孔中。
[0052]B、電泳:
(a)接通凝膠電泳儀的電源，初始電壓70V。(約30分鐘)
(b)溴酚藍染料的前緣進入分離膠上緣後提高電壓至120V，繼續電泳直至溴酚藍泳出分離膠的下緣。(約60分鐘)
C、轉膜
(a)從玻璃板中取出凝膠，將其浸泡於轉移緩衝液中。
[0053](b)取與膠同樣大小的硝酸纖維素膜，以95%乙醇浸泡5秒鐘後浸泡於轉移緩衝液5分鐘以上待用。
[0054](c)按順序在轉移夾內放置預先經轉移緩衝液浸泡的海綿、三層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、三層濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。
[0055](d)將轉移夾放入轉移槽，膜在正極、膠在負極，接冷卻循環水，90V穩壓轉移2小時。
[0056]D、染色
(a)將硝酸纖維素浸入麗春紅使用液中，振搖染色5-10min。
[0057](b)蛋白質條帶出現後，用去離子水洗去硝酸纖維膜上的麗春紅底色。
[0058](c)按照蛋白質分子量Marker指示的位置剪下目的條帶所在的硝酸纖維素膜。
[0059]
把硝酸纖維素膜浸入5%脫脂奶粉，室溫搖動2小時。
[0060]F、洗膜與雜交
(a)以TBST洗膜，洗3次，每次IOmin0
[0061](b)第一抗體封閉:單抗以TBST 1:200稀釋，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，4 °C振搖過夜。
[0062](c)以 TBST 洗膜，洗 3 次，每次 lOmin。
[0063](d)第二抗體封閉:辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(1:2000)，按
0.1 ml/cm2加入封有硝酸纖維素膜的雜交袋中，去除所有氣泡，室溫下搖60分鐘。
[0064](e)以 TBST 洗膜，洗 3 次，每次 lOmin。
[0065]G、化學發光與曝光
(a)將化學發光試劑盒中的兩種試劑各取0.5ml，按1:1的比例混合，在暗室中與硝酸纖維素膜搖動孵育I分鐘。
[0066](b)用濾紙沾幹膜上的液體，用保鮮膜包好，用感光膠片在壓片盒中曝光約I分鐘。
[0067](c)曝光後的感光膠片在顯影液中顯影約30秒鐘，定影液中定影I分鐘，用水衝洗後晚幹。[0068](d)根據曝光情況調整曝光時間，重複壓片、顯影及定影，選擇滿意的膠片。
[0069](e)重複實驗三次。
[0070](2)質譜分析:
A、SDS-PAGE 分離
將純化蛋白樣品進行SDS-PAGE(考馬斯亮蘭(R-250)染色，脫色，用刀片分別將目的蛋白條帶以Imm3體積切成膠粒，用含50%乙腈的25mmol/L NH4HCO3溶液使之脫色完全，微加熱使膠粒完全乾燥。
[0071]B、酶切前處理
乾燥膠粒中加含1.5mg/ml 二硫蘇糖醇(DTT)的25mmol/L NH4HCO3, 56°C水浴lhr，棄DTT，加含 10mg/ml 碘乙醯胺(IAA)的 25mmol/L NH4HCO3,暗室 37°C，Ihr,棄 IAA, IOOmmoI/LNH4HCO3洗滌數次，過夜乾燥。
[0072]C、胰酶酶切
乾燥膠粒加lg/L的胰蛋白酶溶液5-10 μ L以及200 μ L IOOmmoI/L NH4HCO3，待充分溼潤並覆蓋乾燥膠粒後，再補充200 μ L IOOmmoI/L NH4HCO3, 37 °C保溫24 h，偶爾取出輕搖。
[0073]D、混合肽提取
充分酶解後稍離心收集上清，沉澱膠粒中再加200 μ L 0.2%三氟乙酸，40°〇保溫lhr，稍離心收集上清，合併上清，冷凍乾燥，150yL 0.2%三氟乙酸溶解混勻，用於HPLC-ES1-MS/MS進行鑑定分析。
[0074]基因工程COLlAl蛋白的胺基酸序列為SEQ ID N0.2，具體序列參見說明書核苷酸和胺基酸序列表中的序列2。
[0075]本發明的內容不限於實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發明說明書而對本發明技術方案採取的任何等效的變換，均為本發明的權利要求所涵蓋。
【權利要求】
1.一種轉基因畢赤酵母基因工程菌，其特徵在於: 所述的基因工程菌於2013年8月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7981。
2.根據權利要求1所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌，其特徵在於: 所述的基因工程菌是對從人胎盤組織中克隆出的人I型膠原α I鏈基因Collal進行改造後，與表達載體PPIC9K載體連接，導入畢赤酵母菌SMDl 168中構建而成的基因工程菌。
3.—種轉基因畢赤酵母基因工程菌的構建方法，其特徵在於: 由以下步驟實現: 步驟一:從人胎盤組織中克隆出I型膠原α I鏈基因Collal ； 步驟二:對I型膠原α I鏈基因Collal涉及XhoI酶切位點的鹼基進行突變改造；步驟三:將改造後的I型膠原α I鏈基因Collal與表達載體pPIC9K載體連接，構建出表達質粒 pPIC9K-Col lal ； 步驟四:將構建的表達質粒pPIC9K-Collal酶切線性化後，導入畢赤酵母菌SMD1168中； 步驟五:測定I型膠原α I鏈基因Collal轉化進入了畢赤酵母菌SMD1168中，從而得到轉基因畢赤酵母工程菌。
4.根據權利要求3所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌的構建方法，其特徵在於: 步驟二得到的改造後的Collal基因序列為SEQ ID N0.1。
5.根據權利要求1所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌在I型膠原αI鏈蛋白高效表達中的應用。
6.根據權利要求5所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌在I型膠原αI鏈蛋白高效表達中的應用，其特徵在於: 所表達的I型膠原α I鏈蛋白Collal，其胺基酸序列為SEQ ID N0.2。
【文檔編號】C12N15/12GK103725622SQ201310701767
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】範代娣, 馬曉軒, 李林波, 張鳳龍, 王俊 申請人:西安巨子生物基因技術股份有限公司