Serpine2基因的用途的製作方法

2023-10-09 07:17:19

專利名稱：Serpine2基因的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種與胃癌轉移相關的SERPINE2基因 的用途。
背景技術：
胃癌是世界上高發的惡性腫瘤之一，在1990-1992年的中國惡性腫瘤死亡抽樣 調查顯示，胃癌的死亡率接近25. 2/10萬人(男性32. 8/10萬人，女性17. 0/10萬人)，佔 1990-1992年死亡的腫瘤病人的23. 2%，居各類惡性腫瘤之首。雖然近年來胃癌的死亡率 有明顯下降，但是依然很高，多數胃癌患者是發現了臨床症狀如腹部不適、隱痛、泛酸、曖氣 或消瘦、黑便等症狀後進行胃鏡和活檢確診，一經確診，多為晚期，錯過了治療的最佳時期。胃癌的篩查手段包括影像學檢查、胃鏡加活檢、血清學檢測如胃蛋白酶元、CEA、 CA系列抗原等。傳統的影像學檢測能夠有效檢出大的淋巴結轉移，但是至少有25%的轉移 淋巴結小於5mm且MRI、PET等影像學手段無法檢出。血清學檢測普遍存在靈敏度低、特異 性差，尤其是對早期胃癌的檢出率、有效性都很低。目前最有效的手段就是胃鏡加活檢，胃 鏡檢查和病理學診斷均基於形態學的判斷，對於操作人員的經驗技術有較高的要求，這種 非客觀、非標準化的檢測存在較大的誤診/漏診率，而且對有不典型增生、早期胃癌、胃癌 進展期等組織學特徵進行的區分，目前尚難以有明確的界限。絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)是最大且分布最廣泛的蛋白酶抑制劑超家族，通 過構象變化抑制酶的活性，它們控制許多重要的蛋白級聯水解，部分絲氨酸蛋白酶抑制劑 的突變會導致蛋白錯誤摺疊或者產生致病的失活蛋白多聚物。SERPINE2是分子量為44kDa的分泌蛋白，是胰蛋白酶(trypsin)、凝血酶 (thrombin)、纖溶酶(plasmin)、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纖溶酶原激活物 (uPA)和前列腺蛋白(prostasin)的抑制劑，能增強腫瘤的侵襲能力，SERPINE2在腦組 織、神經膠質細胞和神經元中高表達，但是在正常胰腺以及慢性胰腺炎組織中幾乎不表達。 SERPINE2在腫瘤中的研究很少，目前尚無關於SERPINE2與胃癌轉移相關的研究或產品應 用報導。

發明內容
本發明要解決缺乏客觀準確的腫瘤轉移早期診斷方法的技術問題，提供一種與胃 癌轉移相關的SERPINE2基因的用途，可作為腫瘤轉移的早期分子診斷標誌物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種SERPINE2基因的用途，用於製備早期診斷腫瘤 轉移的產品。優選的，所述早期診斷腫瘤轉移的產品包括用實時定量PCR、基因晶片檢測、或 免疫檢測診斷腫瘤轉移的產品。所述用實時定量PCR診斷腫瘤轉移的產品至少包括一對特異擴增SERPINE2基因的引物。所述用基因晶片檢測診斷腫瘤轉移的產品包括至少一個與SERPINE2基因的核酸序列雜交的探針，該探針序列與SERPINE2基因序列的任意連續9個核苷酸序列相同或互 補。所述用免疫檢測診斷腫瘤轉移的產品包括與SERPINE2蛋白特異性結合的抗體。在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對SERPINE2蛋白特 異的抗體。例如，將提純的人SERPINE2基因產物或它的抗原片段或人工合成的含有與 SERPINE2蛋白有連續5個相同的胺基酸的多肽片段注射入動物體內以產生多抗體。同樣， 表達人SERPINE2蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據 本發明製備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術製備。在本發明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述 探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可 以。在本發明的另一方面，還提供了一種用於早期診斷腫瘤轉移的試劑盒，所述試劑 盒包含特異性針對SERPINE2基因的引物或探針，或包含特異性結合SERPINE2蛋白的抗體。利用本發明的試劑盒，可以檢測腫瘤病人SERPINE2基因的表達情況，從而判斷腫 瘤病人是否會發生腫瘤轉移，進而制定個性化的治療方案。在本發明的另一方面，還提供了一種SERPINE2基因的用途，用於製備治療腫瘤轉 移的藥物。優選的，所述治療腫瘤轉移的藥物包括抑制SERPINE2基因表達或抑制SERPINE2 蛋白活性的物質。更優選的，所述治療腫瘤轉移的藥物包括通過RNA幹擾抑制SERPINE2 基因表達的核糖核酸，或用於抑制SERPINE2蛋白活性的蛋白質。在本發明的另一方面，還提供了一種SERPINE2基因的用途，用於篩選治療腫瘤轉 移的藥物。在本發明的另一方面，還提供了一種SERPINE2基因編碼或表達的蛋白質的用途， 用於篩選治療腫瘤轉移的藥物。上述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗 狀細胞癌、或白血病腫瘤，優選為胃癌。上述SERPINE2基因編碼SEQ ID NO 1所示的胺基酸序列。優選的，該SERPINE2 基因為SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本發明與胃癌轉移相關的SERPINE2基因，可作為早期診斷腫瘤轉移的標誌物，輔 助醫生制定個性化的治療方案、改善患者預後，同時也可作為控制腫瘤轉移的藥物治療靶 標，為設計和篩選抗腫瘤轉移藥物提供新的靶點。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明實施例1胃癌組織樣本中提取的總RNA的2100峰圖；圖2是本發明實施例1的SERPINE2基因在轉移和非轉移胃癌中差異表達的表達 譜晶片結果圖3是本發明實施例2的SERPINE2基因在胃癌樣本中差異表達的實時定量PCR 結果圖；圖4是本發明實施例2的SERPINE2基因在胃癌樣本中差異表達的晶片與定量PCR 結果比較圖；圖5是本發明實施例3的SERPINE2蛋白在胃癌轉移和未轉移樣本中差異表達圖。
具體實施例方式下列實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《精編分子生物 學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京 科學出版社， 2004)中所述的方法進行。實施例1表達譜晶片實驗檢測SERPINE2基因在胃癌組織中的表達情況1.臨床樣品的準備胃癌手術切除標本，經病理學診斷確診胃癌，配對留取25例胃癌病灶及其5cm以 上的癌旁組織，-80°C凍存，液氮運輸。臨床病理診斷包含有轉移和非轉移的信息。胃癌的 診斷標準參照全國胃癌病理協作組擬定的胃黏膜活檢病理診斷的統一標準。2.總RNA的提取、質量檢測和純化(1)雷射顯微切割(Laser capture microdissection, LCM)獲取高純度細胞25對胃癌及其癌旁正常組織冰凍切片連續4 6片8 μ m貼附於顯微切割儀專用 膜(瑞士匪I公司)上，固定染色步驟均按Ambion LCM染色試劑盒說明書室溫操作。貼 有切片的膜浸入95%乙醇30 40s ；75%乙醇30 40s ；50%乙醇25 30s固定；滴加 150 μ 1甲酚紫染色8 IOs ；50%乙醇25 30s ；75%乙醇25 30s ；95%乙醇30 40s ； 100%乙醇30 40s，2次；二甲苯淋洗3 4次；二甲苯放置5min ；通風櫥斜置，晾乾5min。 在MMI雷射顯微切割系統的視野中選取目的細胞約5000個左右進行切割收集。(2)總RNA的提取LCM取得的細胞置入1. 5ml離心管，加入100 μ 1 TRIzol (Invitrogen)，上下顛倒 混勻。加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置10分鐘。4°C， 13200rpm離心15分鐘後小心取出上清，轉入新的1. 5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕 輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，13200rpm離心15分鐘後，小心吸去上清，向沉澱中加 入2/5體積的70%乙醇，輕輕混勻洗滌，4°C，13200rpm離心15分鐘。小心吸去上清，打開 管蓋室溫晾乾後加入適量無RNA酶的水充分溶解沉澱，採用無RNA酶的DNA酶I處理去除 基因組DNA的汙染。(3)總RNA的質量檢測用Agilent 210000 bioanalyzer分析提取的RNA，清晰的峰形和最低的背景螢光 顯示完整、未降解的RNA(見圖1)。(4)總RNA的純化對通過質量檢測的25對總RNA使用QIAGEN RNeasy Kit純化，詳細方法見說明書。3.表達譜晶片實驗(1)實驗過程採用Affymetrix exon表達譜晶片，實驗過程嚴格按照AfTymetrix表達譜晶片操作手冊進行。(2)數據預處理和差異篩選晶片所得到的原始數據經過均一化、背景質量檢測，得到基因表達值，利用MeV4. 5的SAM模塊結合臨床資料的轉移分型進行分析。(3)結果應用SAM軟體篩選在25對轉移和非轉移胃癌中差異表達的基因(取FDR = 0.01)， 找到了 SERPINE2基因(圖2)，其中，圖2的上方是樣本編號，樣本編號下面是表達圖譜，紅 色表示基因上調(相對於該基因的平均數)，綠色表示下調，黑色表示未變化。SERPINE2基 因編碼SEQID NO 1所示的胺基酸序列。優選的，該SERPINE2基因為SEQ ID NO 2所示的 核苷酸序列。實施例2 實時定量PCR檢測SERPINE2基因表達的改變(1)內參設定及引物設計、合成內參選用β -actin，引物設計採用PrimerExpresS 3. 0軟體以序列長 度為19-22bp，且Tm值59 °C 60 V為優化條件，SERPINE2基因的正向引物為 TTCCATCTGCTCCCACTTCAA (SEQ IDNO :3)，反向引物為GTCATGAGGCCTCGACTTCAC (SEQ ID NO: 4)，設計的引物由生工合成。(2) RNA提取和逆轉錄cDNA合成RNA的提取、質量檢測和純化步驟同實施例1所述。在PCR管中加入總RNA、引物、DEPC水，65°C溫浴5分鐘，稍微離心，立即放置冰上 5分鐘。然後在PCR管中繼續添加5 X反應緩衝液、RNase抑制劑、IOmM dNTP混合液、逆轉 錄酶，42°C溫浴60分鐘之後70V 5分鐘終止反應，保存於-20°C備用。(3)實時定量PCR反應採用ABI 73OO 定量 PCR 儀，試劑採用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo)，逆轉錄產物1 10稀釋，取Iul進行實時PCR反應，反應程序為50°C 2分鐘； 再95°C 10分鐘；然後95°C 15秒及60°C 1分鐘，進行40個循環；最後95°C 15秒，60°C 1分 鍾，95°C 15 秒。反應結束，得本發明SERPINE2基因在胃癌和癌旁正常樣本中的差異表達。 SERPINE2在11個胃癌樣本中表達情況的定量PCR結果見圖3，在圖3中，橫坐標為樣本號； MO表示未轉移，Ml表示有轉移；縱坐標為以β-actin為內參基因的Δ Ct值(Ct中C代表 Cycle, t代表threshold，Ct值的含義是每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經 歷的循環數，Ct越小說明其表達量越高；ACt值為同一樣本中SERPINE2目的基因的Ct值 與內參基因的Ct值相減所得的值)。圖3表明SERPINE2基因在轉移胃癌樣本中的表達量 高於未轉移胃癌樣本。SERPINE2在11對胃癌樣本中表達情況的晶片與定量PCR結果比較見圖4，在圖4 中，橫坐標為樣本號；MO表示未轉移，Ml表示有轉移；縱坐標為Log Ratio值，即癌(T)和癌 旁(N)比值取Log值；qPCR內參基因為β-actin。由圖4可知，外顯子晶片實驗和實時定量 PCR實驗的結果都表明SERPINE2基因在發生轉移的胃癌樣本中表達明顯升高，而在未轉移 的胃癌樣本中表達正常或下降。因此，可通過實時定量PCR或基因晶片診斷胃癌是否發生轉移設計SERPINE2基因的PCR引物或探針，檢測胃癌組織中SERPINE2基因的表達量，如 果SERPINE2基因的表達量顯著升高，則說明胃癌轉移的可能性高，如果SERPINE2基因的表 達量正常，則說明胃癌轉移的可能性低。由於有研究表明SERPINE2基因在胰腺癌、結腸癌、 乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌和睪丸癌中的表達均升高，且對睪丸癌的研究發現，在小鼠皮下注 射SERPINE2過表達細胞的培養基能夠促進淋巴結轉移，而注射被RNA沉默SERPINE2表達 細胞的培養基能抑制淋巴結轉移，因此，可通過實時定量PCR或基因晶片，檢測腫瘤組織中 SERPINE2基因的表達量，從而早期診斷腫瘤是否發生轉移。
實施例3 Western Blot檢測SERPINE2蛋白的表達情況(1)組織中總蛋白的提取視胃癌和癌旁組織樣本的多少加入100-200 μ 1 RIPA(中)裂解液，冰上裂解30 分鐘後，然後在4°C下13200rpm離心15分鐘，取上清分裝於0. 5ml離心管中並置於_20°C保存。(2)蛋白含量的測定lowry法測蛋白含量。(3) SDS-PAGE電泳12%膠10孔板，每孔上樣40 μ g蛋白，80V恆壓電泳濃縮膠 15min，至分離膠時加壓至120V電泳至槽底。(4)轉膜切去多餘的膠，每塊膠剪1張PVDF膜和6張濾紙，按照濾紙+PVDF膜+ 膠+濾紙順序置於電轉夾中，膠的一側靠近電泳電源的負極，恆流200A，2小時，取出PVDF膜。(5)封閉將膜置於適量5%奶粉的TBST，室溫下搖床上搖動封閉2小時。(6) 一抗將SERPINE2 —抗用TBST以1 400稀釋，將膜室溫下孵育2小時後， 用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5分鐘。(7) 二抗同上方法準備二抗(抗鼠)稀釋液並將膜室溫下孵育2小時後，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5分鐘。(8)化學發光、顯影、定影將A 和 B 兩種試劑(ECL Western blotting detection reagents, GE)在保鮮膜 上等體積混合，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸，2分鐘後，去盡殘液，包好，放入X-光 片夾中。在暗室中根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為Imin或5min，多次壓片，得圖 5。在圖5中，「T」指胃癌組織，「N」指癌旁組織。由圖5可知，SERPINE2在發生了淋巴結轉 移的胃癌組織中高表達，而在沒有出現淋巴結轉移的胃癌組織中正常表達。實施例4抗腫瘤轉移藥物的篩選以SERPINE2基因作為靶點，設計和篩選抗腫瘤轉移藥物。具體方法如下。用候選藥物處理高表達SERPINE2基因的腫瘤轉移體系，該SERPINE2基因為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，然後檢測上述體系中SERPINE2基因的表達水平或檢測上述體 系中表達的SERPINE2蛋白的活性。若候選物質可降低SERPINE2基因的表達或降低過表達 SERPINE2蛋白的活性，則表明該候選藥物是能控制腫瘤轉移的潛在物質。以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範 圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種SERPINE2基因的用途，其特徵在於，用於製備早期診斷腫瘤轉移的產品。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述早期診斷腫瘤轉移的產品包括用實 時定量PCR、基因晶片檢測或免疫檢測診斷腫瘤轉移的產品。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述用實時定量PCR診斷腫瘤轉移的產 品至少包括一對特異擴增SERPINE2基因的引物；所述用基因晶片檢測診斷腫瘤轉移的產 品包括與SERPINE2基因的核酸序列雜交的探針；所述用免疫檢測診斷腫瘤轉移的產品包 括與SERPINE2蛋白特異性結合的抗體。
4. 一種用於早期診斷腫瘤轉移的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包含特異性針對 SERPINE2基因的引物或探針，或包含特異性結合SERPINE2蛋白的抗體。
5. 一種SERPINE2基因的用途，其特徵在於，用於製備治療腫瘤轉移的藥物。
6.根據權利要求5所述的用途，其特徵在於，所述治療腫瘤轉移的藥物包括抑制 SERPINE2基因表達或抑制SERPINE2蛋白活性的物質。
7. —種SERPINE2基因的用途，其特徵在於，用於篩選治療腫瘤轉移的藥物。
8. —種SERPINE2基因編碼或表達的蛋白質的用途，其特徵在於，用於篩選治療腫瘤轉 移的藥物。
9.根據權利要求1、5、或7所述的用途，其特徵在於，所述SERPINE2基因編碼SEQID NO :1所示的胺基酸序列。
10.根據權利要求1、5、或7所述的用途，其特徵在於，所述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺 癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗狀細胞癌、或白血病腫瘤。
全文摘要
本發明公開一種SERPINE2基因的用途，用於製備早期診斷腫瘤轉移的產品。本發明還公開了SERPINE2基因在製備或篩選治療腫瘤的藥物中的用途。本發明與胃癌轉移相關的SERPINE2基因，可作為早期診斷腫瘤轉移的標誌物，輔助醫生制定個性化的治療方案，同時可作為控制腫瘤轉移的藥物治療靶標。
文檔編號A61P35/04GK101798600SQ20101013903
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月2日 優先權日2010年4月2日
發明者張慶華, 張雯, 楊燕青, 陽聖 申請人:上海生物晶片有限公司