一種含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定化技術的製作方法
2023-10-09 07:26:44 1
專利名稱：一種含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定化技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及脂肪酶的固定化技術，屬於脂肪酶固定化技術領域。
背景技術：
酶是一種天然的高分子催化劑，催化效率極高、反應專一性強、來源廣泛、無汙染，在食品加工、醫藥等產業中有著極為廣闊的應用。但天然酶穩定性差、易失活、 不能重複使用，並且反應後易混入產品，純化困難，難以在工業中廣泛的應用。此外，分離和提純酶以及它們的一次性使用也大大增加了其作為催化劑的成本。為了克服這些問題，酶的固定化技術於20世紀60年代應運而生並發展起來，成為近幾年酶工程研究的重點。固定化酶(Immobilized Enzyme)是通過物理的或化學的方法，將酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便於與反應液分離，可以重複使用，它是酶製劑中的一種新劑型。過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議採用固定化酶的名稱。而作為固定化酶的一部分，載體材料的結構和性能對固定化酶的各種性能都有著巨大的影響。由於載體材料的重要性，因此自固定化酶技術興起以來，很多學者就一直致力於對載體的研究。迄今為止，隨著科學技術的發展，固定化酶的載體材料已從最初的天然高分子材料發展到合成高分子材料、無機材料，以及現在的複合材料等。複合載體材料是以有機材料和無機材料複合組成的新載體材料。如磁性納米粒子與其它載體材料相比，磁性納米粒子作為固定化載體具有從反應體系中易分離和回收、操作簡便、成本較低等諸多優點，因此引起了國內外許多學者的廣泛關注。脂肪酶是催化動植物油脂進行水解、酯交換反應一大類生物酶。脂肪酶催化反應條件溫和，產物顏色淺，副產物少，且具有專一性，利於生產高質量單甘油酯、脂肪酸、甘油和其它種類油脂產物。但脂肪酶價格較高，且用游離脂肪酶進行反應時，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此造成產物成本較高，且導致後續分離步驟困難，影響利用脂肪酶水解和酯交換進行商業化生產。解決這一問題較好方法是對脂肪酶進行固定化，酶固定化是應用固體材料將酶束縛或限制於一定區域內，仍能進行其特有催化反應、並可回收及重複使用的一類技術。在酶固定化過程中，固定化酶性能取決於固定化酶所使用載體材料性質和固定化方法。如殼聚糖及其衍生物、纖維素及其衍生物、凝膠材料，有機合成聚合物、磁性粒子、無機材料、絲質和甲殼素等在酶固定化領域中應用。磁性納米材料是指具有納米量級超微粒構成固體物質。納米材料具有如下結構特點(1)結構單元或特徵維度尺寸在納米數量級(I-IOOnm) ； (2)存在大量界面或自由表面； (3)各納米單元之間存在一定相互作用；(4)磁性，可方便簡單進行分離和磁性導向。由於納米材料結構上特殊性，使納米材料具有一些獨特效應，主要表現為小尺寸效應和表面或界面效應，因而在性能上與相同組成微米材料有非常顯著差異，體現出許多優異性能和全新功能，在酶固定化領域可望有廣泛應用。與其它載體材料相比，磁性高分子微球作為固定化脂肪酶的載體具有諸多優點提高酶的穩定性，易於將酶與底物和產物分離；提高酶的生物相容性和免疫活性；操作簡便，可降低成本；磁性載體固載酶放入磁場穩定的流動床反應器中，可以減少持續反應體系中的操作，適合於大規模連續化操作；利用外部磁場可以控制磁性材料固定化酶的運動方式和方向，替代傳統的機械攪拌方式，提高固定化酶的催化效率。
本發明的目的就是將含鈰磁性納米粒子用於共價固定脂肪酶，確定脂肪酶固定化的條件，使一定量的載體納米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力達到最大，並對比了固定化酶和游離酶的酶學特性。
發明內容
本發明的目的就是將含鈰磁性納米粒子用於共價固定脂肪酶，確定脂肪酶固定化的條件，使一定量的載體納米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力達到最大，並對比了固定化酶和游離酶的酶學特性。提供了一種新型的固定化脂肪酶，使脂肪酶的PH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性、貯存穩定性均比自由酶明顯提高，固定化脂肪酶具有從反應體系中易分離和回收、操作簡便從而使成本較低。本發明的技術方案一種含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定化技術，將脂肪酶直接加入牛乳中，酶的活性較低、半衰期短，酶只能使用一次，利用率低，導致生產成本較高，限制了半脂肪苷酶在乳製品工業中的應用。為克服這些問題，可通過物理的或化學的方法，將脂肪酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便於與反應液分離，並可以重複使用，即固定化脂肪酶。主要處理方法稱取1. Og無皂乳液聚合製備的P(AM-C0-St)-Ce(III)磁性高分子納米微球粉末於50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩衝液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯率大於95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化脂肪酶。根據固定化脂肪酶磁性粒子的沉降時間，考察納米磁性粒子的磁分離性能。根據固定化酶的偶聯率和活力回收的影響，確定了納米微球粒徑，鈰的質量分數以及給酶量。根據酶的活性確定了固定化脂肪酶的pH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性範圍。所述納米磁性粒子的磁分離性能固定脂肪酶後的磁性納米微球具有優異的磁分離能力，在緩衝液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍。所述納米微球粒徑對偶聯率和活力回收的影響隨著微球直徑的增加，固定化酶的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小。所述鈰的質量分數對偶聯率和活力回收的影響微球表面鈰納米粒子質量分數為 1. 時，固定化酶的偶聯率和活力回收為96%和74%。所述給酶量對偶聯率和活力回收的影響隨著給酶量的增加，固定化酶的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，但在給酶量80mg/g時，酶的活力回收仍高達60%。所述固定化脂肪酶的PH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性範圍固定化脂肪酶在 PH值6-9範圍內均保持較高的活性；最適反應溫度為50°C，比游離酶的最適反應溫度高了 IO0C ；固定化脂肪酶反覆使用7次後，酶活仍保持了 75%以上。本發明的有益效果第一次將含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定化技術，可以提高脂肪酶的活性， 延長半衰期，由於固定化酶可以循環利用，從而提高了酶的利用率，降低了企業的生產成本。固定化後的脂肪酶有了更寬的PH適用範圍，熱穩定性得到明顯提高，最適反應溫度達到50°C，固定化脂肪酶反覆使用7次後，酶活仍保持了 75%以上；同時鈰離子對固定化脂肪酶有明顯的激活作用，當鈰離子質量分數為1. 時，固定化酶的偶聯率和活力回收為 96%和 74%。
附圖為含鈰磁性納米粒子固定化脂肪酶的工藝流程示意圖。
具體實施例方式實施例1 以含鈰磁性納米粒子固定磷脂酶A1採用無皂乳液聚合製備P (AM-co-St)-Ce (III)磁性高分子納米微球，然後通過共價鍵固定磷脂酶A115具體實施方法本發明的主要過程為稱取1. Og含鈰磁性納米粒子粉末於50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩衝液5mL，35°C條件下震蕩(120r/min)反應30h， 離心直到上清液中脂肪酶的偶聯率大於95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌，得到固定化磷脂酶、。其中微球表面鈰納米粒子質量分數為1. 1%，隨著含酶緩衝液中的給酶量的增加， 固定化酶的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，控制給酶量在30mg/g-70mg/g之間。固定磷脂酶A1後的磁性納米微球具有優異的磁分離能力，在緩衝液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍，隨著微球直徑的增加，固定化磷脂酶A1的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，微球直徑在IOOnm時，偶聯率和活力回收達到92%。固定化的磷脂酶A1在？!1值6. 0-8. 0範圍內均保持較高的活性，相對活力均在 70%以上；最適反應溫度為52°C，比游離酶的最適反應溫度高了 7°C;固定化磷脂酶A1反覆使用7次後，酶活仍保持了 75 %以上。實施例2 以含鈰磁性納米粒子固定南極假絲酵母脂肪酶採用無皂乳液聚合製備P (AM-co-St)-Ce (III)磁性高分子納米微球，然後通過共價鍵固定南極假絲酵母脂肪酶。具體實施方法本發明的主要過程為稱取l.Og含鈰磁性納米粒子粉末於50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩衝液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯率大於95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化南極假絲酵母脂肪酶。其中微球表面鈰納米粒子質量分數為1. 1%，隨著含酶緩衝液中的給酶量的增加， 固定化酶的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，控制給酶量在30mg/g-70mg/g之間。固定化南極假絲酵母脂肪酶後的磁性納米微球具有優異的磁分離能力，在緩衝液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍，隨著微球直徑的增加，固定化南極假絲酵母脂肪酶的偶聯率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，微球直徑在 IOOnm時，偶聯率和活力回收達到92%。固定化南極假絲酵母脂肪酶1在pH值6. 5-8. 8範圍內均保持較高的活性，相對活力均在70%以上；最適反應溫度為48°C，比游離酶的最適反應溫度高了 5°C ；固定化南極假絲酵母脂肪酶反覆使用7次後，酶活仍保持了 75%以上。
權利要求
1.一種含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定化技術，主要過程為稱取l.Og含鈰磁性納米粒子粉末於50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩衝液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯率大於95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化脂肪酶，並對納米粒子進行了磁性分析，確定了納米微球粒徑、鈰的質量分數、 給酶量對固定化酶偶聯率和活力回收的影響，和酶活的PH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性範圍。
2.根據權利要求1所述的納米微球粒徑納米微球粒徑在IOOnm時，偶聯率和活力回收均在90%以上。
3.根據權利要求1所述的鈰的質量分數微球表面鈰納米粒子質量分數為1.時，偶聯率達到96 %，活力回收達到74 %。
4.根據權利要求1所述的給酶量給酶量在30mg/g-70mg/g之間，偶聯率和活力回收均在60%以上，當給酶量在30mg/g時，偶聯率和活力回收達到94%。
5.根據權利要求1所述的酶活的PH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性範圍固定化的脂肪酶在PH值6-9範圍內均保持較高的活性，相對活力均在70%以上；最適反應溫度為45°C，比游離酶的最適反應溫度高了 5°C ；固定化脂肪酶反覆使用7次後，酶活仍保持了 75%以上。
全文摘要
本發明採用無皂乳液聚合製備的P(AM-co-St)-Ce(III)磁性高分子納米微球，在此基礎上通過共價鍵固定脂肪酶，屬於脂肪酶固定化技術領域。本發明的優點是①第一次將含鈰磁性納米粒子用於脂肪酶的固定；②固定脂肪酶後的磁性納米微球具有優異的磁分離能力，鈰離子對固定化脂肪酶有明顯的激活作用；③脂肪酶被固定化後其pH值穩定性、熱穩定性、操作穩定性、貯存穩定性均比自由酶明顯提高；④固定化後的脂肪酶的米氏常數比游離酶下降，說明脂肪酶在固定化後其結合底物的能力有所增強；⑤固定化脂肪酶具有從反應體系中易分離和回收，可循環利用，而且操作簡便從而降低企業成本。
文檔編號C12N11/08GK102199591SQ20111008182
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者張暉, 張豔傑, 王立, 郭曉娜, 錢海峰, 齊希光 申請人:江南大學