一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法
2023-10-09 11:35:14 2
專利名稱：一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法
技術領域：
本發明涉及一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法。
背景技術：
世界貿易的全球化同時也帶來了食品安全風險。近年來，世界範圍內屢屢發生食品安全事件，如美國爆發感染大腸的「菠菜中毒事件」，感染沙門菌的花生醬「沙門事件」，日本上萬人葡萄球菌腸毒素導致的雪印牛奶中毒、英國的狂牛症、法國的李斯特氏菌感染、泰國的禽流感等等。全球每年發生食源性疾病高達數十億例，發達國家發生食源性疾病的概率也相當高。每年由數十億例食源性疾病而導致的醫療費增加、不安全食品的召回、以及產品的銷毀帶來的經濟損失不可估量！更有甚者，由於抗生素的濫用，全球頻頻出現食源性致病菌的耐藥菌株，其迅速增加與擴散，對相關感染的治療與救治帶來極大挑戰。食品中微生物汙染，尤其是耐藥微生物汙染，是導致食源性疾病發生和發展的主要原因。實時快速準確地監測食品中的微生物特徵，並獲得其菌落總數及其耐藥性，對預防和控制食源性微·生物感染，保證人類健康、防止經濟損失具有重要意義。目前，食源性致病菌的檢測方法主要有培養鑑定、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、多聚酶鏈式反應(PCR)、電阻抗技術以及全自動微生物分析系統等。培養鑑定法是將經過前處理的樣本接種於營養肉湯，然後肉眼觀察細菌的菌落生長，進行陰陽判定。對於陽性樣本，再通過藥敏實驗鑑定。該方法大多要耗費6名天時間，而且程序複雜，所用試劑繁多，費時費力，等結果出來，疫情可能已經發生；ELISA是把抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機地結合起來的一種檢測技術，它既可測抗原，也可測抗體。該方法靈敏度和特異性較強，但所需試劑昂貴，且需多次洗滌及培養過程；PCR技術採用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過擴增產物來識別細菌。PCR具有靈敏度高、特異性強、快速等特點，但假陽性和假陰性率過高是影響其應用的關鍵問題。電阻抗技術原理是細菌在培養基內生長繁殖的過程中，將會使培養基的阻抗發生變化，通過檢測培養基的電阻抗變化情況，判定細菌在培養基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。該法具有檢測速度快、靈敏度高等優點，但由於電路的穩定性問題，導致假陽性率過高；法國生物梅裡埃集團公司出品的Vitek-AMS自動微生物檢測系統屬當今世界上最為先進、自動化程度最高的細菌鑑定儀器之一。它無須經過微生物分離培養和純化過程，就能直接從樣品檢出特殊的微生物種類和菌群來。但該系統和配套試劑價格昂貴且需依賴進口，嚴重製約了我國食源性致病菌研究水平的提高。因此，靈敏、快速、準確而且價格便宜的食源性致病菌實時監測設備的研究迫在眉睫。
發明內容
本發明的目的是要克服現有方法不足之處而提供一種自動、快速、準確和可視化的食品中微生物生長曲線實時測繪方法。為了實現上述技術目的，本發明的技術方案是，一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，包括以下步驟步驟一取25g食品樣品置於盛有225mL磷酸鹽緩衝液的無菌均質杯內，以8000r/min的速度進行均質2min,製成I :10的樣品勻液；步驟二 設立微生物生長曲線自動測繪裝置，包括傳感系統、讀數系統和顯示系統三部分，其中傳感系統包括帶有密封蓋的檢測管、控溫裝置、二電極、壓電體聲波傳感器和自激勵電路，所述的檢測管設於控溫裝置內，所述的二電極由底部插入檢測管內，其中一電極連接自激勵電路的輸入端，另一電極連接壓電體聲波傳感器的輸入端，壓電體聲波傳感器的輸出端連接至自激勵電路，所述的讀數系統包括分頻計、驅動電路和單片機，所述的分頻計的輸入端連接至自激勵電路，自激勵電路的輸出端連接至驅動電路，所述的單片機分別連接至自激勵電路和驅動電路，所述的顯示系統包括顯示器，所述的顯示器通過MAX232串口連接至單片機；步驟三取9mL培養基和ImL由步驟一所得到的樣品勻液加入至微生物生長曲線自動測繪裝置的檢測管中，擰緊密封蓋；
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步驟四將檢測管插入控溫裝置中，調節控溫裝置溫度為(37±0. 2) V ；步驟五啟動微生物生長曲線自動測繪裝置；步驟六傳感系統中壓電體聲波傳感器對與其串接對象檢測管中培養體系的電參數變化有靈敏的頻率響應，讀數系統將檢測到的培養體系的頻率信號轉換成計算機可識別的數位訊號發送給單片機，單片機以頻移-時間方式通過顯示器實時輸出培養體系響應曲線，當檢測管中有微生物生長時，微生物可將培養基中電惰性的大分子物質分解為電活性的小分子物質，當微生物濃度達到106cfu/mL左右時，檢測管中培養體系的電參數發生較顯著變化，導致壓電體聲波傳感器的頻移發生顯著改變，獲得食品中微生物實時生長曲線，實時數據自動以TXT格式保存。所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，培養基為液體培養基，所述的液體培養基為廣譜液體培養基，所述的廣譜液體培養基成分為牛肉粉3g，酵母浸膏
I.5g,葡萄糖IOg,生長因子，蒸懼水IOOOmL, pH值為7. 0 7. 2。所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，所述的生長因子包括L-脯氨酸20mg，L-絲氨酸20mg，L-丙氨酸40mg，L-異亮氨酸70mg，L-亮氨酸98mg，L-門冬氨酸50mg, L-酪氨酸5mg, L-穀氨酸15mg, L-苯丙氨酸IOOmg, L-精氨酸鹽酸鹽IOOmg, L-賴氨酸鹽酸鹽80mg, L-糹顏氨酸70mg, L-蘇氨酸50mg, L-組氨酸鹽酸鹽50mg, L-色氨酸15mg,L-甲硫氨酸45mg, L-胱氨酸2mg,甘氨酸150mg。所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，電極為一對經鈍化處理的不鏽鋼棒直接封入聚碳酸酯中，並將端面磨平，得到位於同一平面的一對圓形平面電極，電極的電極常數為0. 58cnTl. OOcm,電極常數=平面電極面積/圓形平面電極之間的距離，距離指兩圓心之間的距離。所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，控溫裝置是使用電阻絲繞在一個用紫銅材料做成的套筒上。所述的一種食品中微生物生長曲線實時自動測繪的方法，平面電極與壓電體聲波傳感器通過導線串聯。本發明對比已有技術來說，從食品中微生物生長規律出發，提出了用測繪微生物生長曲線來進行微生物分析的新方法，是對傳統分析方法的技術創新；通過實驗研究發現壓電體聲波傳感器可將微生物生長信息轉化為可測的頻率信息，從而為設計快速、高效的新型繪製裝置提供了設計原理。在新的檢測方法和設計原理的指導下設計製作出食品中微生物生長曲線自動測繪裝置。本發明的技術效果在於I、壓電體聲波傳感器的使用避免了雙電層電容的影響，提高了電信號的穩定性，增強了信噪比；2、壓電體聲波傳感器與平面電極結合後顯著提高了檢測的精確度。3、傳感系統、讀數系統以及顯示系統的組合可實現裝置的自動化處理，能實時、快速地獲取食品中微生物的頻移-時間測繪曲線，為食品中微生物的深入研究提供理論依據。
·圖I本發明裝置的結構示意圖；其中I -傳感系統、II -讀數系統、III -顯示系統I為檢測裝置(1-1為密封蓋,1-2為檢測管，1-3為微生物，1-4為培養基,1-5為控溫裝置，1-6為電極)，2為壓電體聲波傳感器，3為自激勵電路，4為分頻計，5為驅動電路，6為單片機，7為MAX232串口 ；圖2為本裝置的工作流程圖；圖3為食品中微生物生長過程電導(A)和電容(B)的變化率；圖4為食品中微生物實時測繪生長曲線(A)，空白曲線(B)和平板計數法所得生長曲線(C)；圖5為鮮奶中不同初始濃度(cfu/mL)微生物生長曲線A-1. I X IO6, B-7. 9 X IO4, C—9. 8 X IO3, D-1. 3 X IO3, E—97, F—12圖6為米粉中微生物實時生長曲線A-米粉經過121° C，IOmin處理；B，C-米粉經過80° C，2min處理；D，E，F-未經處理的米粉。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。本發明的基本思想是結合壓電體聲波傳感器、平面電極及外圍數據處理裝置實現食品中微生物生長曲線的實時測繪，為食品中微生物的深入研究奠定理論基礎。食品中微生物生長曲線實時測繪裝置見圖1，包括傳感系統、讀數系統和顯示系統三部分，其中傳感系統由壓電體聲波傳感器、檢測探頭、檢測管、控溫裝置及自激勵電路構成；讀數系統由分頻計、驅動電路、單片機及MAX232數據接口構成；顯示器由顯示界面及配套軟體構成；其中檢測探頭為自製的平面電極，材料為鈍化處理的316不鏽鋼棒嵌入聚碳酸酯中，磨平，拋光；壓電體聲波傳感器(9MHz AT-切型，兩面鍍銀)購至北京707廠，平面電極與壓電體聲波傳感器通過導線串聯。壓電體聲波傳感器對檢測管中微生物的生長有靈敏的頻率響應，為消除外界因素影響，通過差分法統一用頻移值表示(A F=F0-Fi,其中Ftl為起始頻率,Fi為i時測得的頻率值)，獲得頻移響應信號。而信號的採集由計算機控制，首先由計算機通過MAX232數據接口發指令給單片機，採集檢測管中的信號，計算機控制採集信號通道，採集的信號輸入頻率計，將其分為段信號和位信號傳給單片機，單片機通過數據接口傳給顯示系統，以頻移-時間形式自動繪製出實時的響應曲線。所有的頻移和時間數據，以TXT格式自動保存。工作條件環境溫度10° C 30° C ;相對溼度< 85% ;大氣壓力86. OkPa 106. OkPa ；使用電源AV (220 ± 22) V，50Hz ± IHz。由於微生物在代謝過程中會分解電惰性的葡萄糖、胺基酸等大分子物質為電活性的小分子，那麼培養基體系的性質，如電導率和介電常數會隨時間發生變化，這種變化恰恰反應了微生物的生長信息。圖3給出了 4192A LF阻抗分析儀測定的IO5CfuAiL的大腸杆 菌在培養基中生長過程的電參數變化情況，其縱坐標以電參數的變化相對於初始電參數值的變化率來表示，橫坐標為微生物的生長時間，曲線A和B分別表示食品中微生物生長過程的電導和電容的變化率。由圖可知,微生物在生長過程中，電導增加大約16%，而電容變化為10%左右。結果表明，微生物菌落數量的測定問題可以轉化為電學測量的問題。電磁振蕩理論表明，LC電路的頻率f與自感係數L、電容C的關係是
/ = ^Olc0)由公式可知，線圈自感係數、電容變化可改變振蕩頻率，用相應的測頻電路可以記錄這種頻率的變化。由於微生物在生長過程中液體培養體系電參數會發生變化，進而可以解決食品中微生物生長信息轉換為可測信息的技術問題。實際電路中使用的振蕩器是壓電體聲波傳感器，其工作原理與LC振蕩電路的原理基本相同，但頻穩性更好，可以減少檢測過程中的噪音，所以，在檢測系統中採用壓電體聲波傳感器。實施例I利用食品中微生物生長曲線自動測繪裝置及如圖2所示方法對IO5CfuAiL的大腸桿菌的生長過程曲線(參見圖4曲線A，圖4曲線B為空白參比)進行實時測繪並與平板計數法所獲得的生長曲線(參見圖4曲線C)進行對照。從圖4可知，在ab段，大腸桿菌處於遲緩期，在一段時間裡並不馬上分裂，大腸桿菌的數量維持恆定，或增加很少，培養基的性質變化也不明顯，所以頻移沒有明顯變化；在be階段，為大腸桿菌指數生長期，大腸桿菌生理代謝作用使培養基中的碳水化合物、類脂及蛋白質轉化為電活性物質，顯著地改變了培養基性質，壓電體聲波傳感器對這一變化有靈敏的頻移響應，頻移開始顯著變化的點所對應的時間定義為微生物檢出時間(MDT)，可為是否有微生物生長提供理論依據。從平板計數法獲取的生長曲線則需要人為從靜態培養裝置中無菌操作吸取菌液至平板中培養24h，繪製一條曲線需要接種數次，時間至少要滯後48h，費時耗力，需要大量培養裝置，且無法實時獲得動態曲線。實施例2利用食品中微生物生長曲線自動測繪裝置測定了不同細菌初始濃度的鮮奶樣品的典型生長曲線，其結果如圖5所示。由圖可知，細菌初始濃度越大，MDT越小，反之，細菌初始濃度越小，MDT越大。在細菌初始濃度約為10-106Cfu/mL時，細菌初始濃度的對數與MDT之間存在線性關係，具體關係式如下LgC=I. 216-0. 432MDT(4)式中C是鮮奶樣品中的微生物的初始濃度，MDT是微生物檢出時間，其相關係數大約0. 96，說明MDT和被測樣品中細菌初始濃度對數呈線性關係。根據檢測所得MDT就可推算出樣品中的細菌數量，進而可以進行微生物的定量分析。實施例3利用食品中微生物生長曲線自動測繪裝置對米粉中的微生物生長曲線進行實時測繪，其結果參見圖6，曲線A為米粉經過121° C，IOmin處理後的生長曲線，曲線B和C為 米粉經過80° C，2min處理後的生長曲線，曲線D、E和F為未經處理的米粉中微生物的生長曲線。從圖6可知，曲線A無明顯的頻移變化，無微生物檢出時間，可推斷米粉經121° C，IOmin處理後，其中的微生物可被完全抑制；曲線B和C大概在10小時後才出現顯者的頻移變化，表明經80° C，2min處理後米粉中微生物的生長受到抑制，大部分微生物被殺死；曲線D、E和F在3小時之內就出現了顯著的頻移，表明未經處理的米粉中微生物的數量較多，會對米粉的品質造成一定的影響。從以上結果可知，通過對食品中微生物實時生長曲線的分析可判定食品對象的微生物活性狀態，為食品的加工方式提供理論依據。
權利要求
1.一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其特徵在於，包括以下步驟 步驟一取25g食品樣品置於盛有225mL磷酸鹽緩衝液的無菌均質杯內，以8000r/min的速度進行均質2min，製成I :10的樣品勻液； 步驟二 設立微生物生長曲線自動測繪裝置，包括傳感系統、讀數系統和顯示系統三部分，其中傳感系統包括帶有密封蓋的檢測管、控溫裝置、二電極、壓電體聲波傳感器和自激勵電路，所述的檢測管設於控溫裝置內，所述的二電極由底部插入檢測管內，其中一電極連接自激勵電路的輸入端，另一電極連接壓電體聲波傳感器的輸入端，壓電體聲波傳感器的輸出端連接至自激勵電路，所述的讀數系統包括分頻計、驅動電路和單片機，所述的分頻計的輸入端連接至自激勵電路，自激勵電路的輸出端連接至驅動電路，所述的單片機分別連接至自激勵電路和驅動電路，所述的顯示系統包括顯示器，所述的顯示器通過MAX232串口連接至單片機； 步驟三取9mL培養基和ImL由步驟一所得到的樣品勻液加入至微生物生長曲線自動·測繪裝置的檢測管中，擰緊密封蓋； 步驟四將檢測管插入控溫裝置中，調節控溫裝置溫度為(37±0.2)°C ； 步驟五啟動微生物生長曲線自動測繪裝置； 步驟六傳感系統中壓電體聲波傳感器對與其串接對象檢測管中培養體系的電參數變化有靈敏的頻率響應，讀數系統將檢測到的培養體系的頻率信號轉換成計算機可識別的數位訊號發送給單片機，單片機以頻移-時間方式通過顯示器實時輸出培養體系響應曲線，當檢測管中有微生物生長時，微生物可將培養基中電惰性的大分子物質分解為電活性的小分子物質，當微生物濃度達到IO6CfuAiL左右時，檢測管中培養體系的電參數發生較顯著變化，導致壓電體聲波傳感器的頻移發生顯著改變，獲得食品中微生物實時生長曲線。
2.根據權利要求I所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其特徵在於，培養基為液體培養基，所述的液體培養基為廣譜液體培養基，所述的廣譜液體培養基成分為牛肉粉3g，酵母浸膏1.5g，葡萄糖10g，生長因子，蒸餾水1000mL，pH值為7. 0 7. 2。
3.根據權利要求2所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其特徵在於，所述的生長因子包括L-脯氨酸20mg，L-絲氨酸20mg，L-丙氨酸40mg，L-異亮氨酸70mg，L-亮氨酸98mg,L-門冬氨酸50mg,L-酪氨酸5mg,L-穀氨酸15mg,L_苯丙氨酸IOOmg, L-精氨酸鹽酸鹽lOOmg，L-賴氨酸鹽酸鹽80mg，L-纈氨酸70mg，L-蘇氨酸50mg，L-組氨酸鹽酸鹽50mg, L-色氨酸15mg, L-甲硫氨酸45mg, L-胱氨酸2mg,甘氨酸150mg。
4.根據權利要求I所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其特徵在於，電極為一對經鈍化處理的不鏽鋼棒直接封入聚碳酸酯中，並將端面磨平，得到位於同一平面的一對圓形平面電極，電極的電極常數為0. 58cnTl. 00cm。
5.根據權利要求I所述的一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其特徵在於，控溫裝置是使用電阻絲繞在一個用紫銅材料做成的套筒上。
6.根據權利要求I所述的一種食品中微生物生長曲線實時自動測繪的方法，其特徵在於，平面電極與壓電體聲波傳感器通過導線串聯。
全文摘要
本發明公開了一種食品中微生物生長曲線自動測繪的方法，其主要貢獻在於1)從食品中微生物生長規律出發，提出了用測繪微生物生長曲線來進行微生物分析的新方法，是對傳統分析方法的技術創新；2)通過實驗研究發現壓電體聲波傳感器可將微生物生長信息轉化為可測的頻率信息，從而為設計快速、高效的新型測繪裝置提供了設計原理。3)在新的檢測方法和設計原理的指導下設計製作出食品中微生物生長曲線自動測繪裝置。本發明所構建的裝置可實現食品中微生物生長曲線的實時、自動測繪，依據所獲得的生長曲線可進行食品中微生物的深入研究，如食品加工方法、食品貨架期、微生物抑菌性研究等等，由於該裝置具有操作簡便、結果準確等特點，有望在食品加工、儲存以及經營中的微生物相關研究中推廣應用。
文檔編號G01N27/07GK102749516SQ20121023044
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者任佳麗, 周逸陽, 張慧, 李忠海, 林親錄, 馬麗娜 申請人:中南林業科技大學