水稻凝集素樣受體激酶1(OsLRK1)，一個參與植物發育的基因的製作方法

2023-10-09 12:59:44 5

專利名稱：：水稻凝集素樣受體激酶1(OsLRK1)，一個參與植物發育的基因的製作方法
技術領域：
：本發明一般性地涉及植物基因工程，特別涉及在轉化的植物和植物細胞中調節根系擴張(rootexpansion)。
背景技術：
：在本文全文中，各種公開出版物均在括號中引用。這些出版物公開內容通過引用以其全文併入本文作參考，以更加全面地描述涉及本發明的
技術領域：
的現狀。所述參考的詳細信息列於所附權利要求書之前。已經有提示植物絲氨酸/蘇氨酸受體樣激酶(receptor-likekinase，RLK)在細胞表面的信號傳導事件中起到關鍵作用(Hardieetal.，1998；Morris，etal.，2003；Shiu，etal.，2004)。細胞對各種外部因素進行應答的分子基礎是當前的一個研究熱點(MorrisandWalker，2003)。RLK是一類跨膜蛋白，其包含一個單一跨膜結構域、一個胞外配體結合結構域以及一個胞質內的催化激酶結構域(ShiuandBleecker，2001)。在已經被闡明的擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中，RLK有超過600個代表基因，而在水稻中已經確定了至少1132個成員(Shiuetal.，2004)。植物RLK的激酶結構域具有單譜系起源(monophyleticorigin)並與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)Pelle和哺乳動物白細胞介素受體相關性激酶屬於相同的基因家族(Becraft，2002)。有兩種方法可以對RLK進行分類，第一種是基於被認為是配體結合位點的胞外結構域的結構特徵進行分類(McCartyandChory，2000)，第二種是基於RLK在控制植物生長和發育或植物-微生物相互作用及防禦應答中的生物學功能和作用進行分類(Shiuetal.，2004)。鼠耳芥屬(Arabidopsis)RLK胞外結構域有超過21個不同類別(Becraft，2002)。一類已被描述並被部分研究的RLK是凝集素樣受體激酶(lectin-likereceptorkinases，LRK)(Herveetal.，1996；1999；Nishiguchi，etal.，2002，Navarro-Gochicoa，2003；Riouetal.，2002；Heetal.，2004；Shiuetal.，2004)。LRK具有與豆科樣凝集素(legume-likelectins)具有顯著同源性的凝集素樣胞外結構域。凝集素已知為碳水化合物結合蛋白，但是對於被識別的糖不具有酶活性(Loris，2002)。這是一組在結構上和進化上多樣性的蛋白質。凝集素可以在所有生物界發現(VanDamme，1998)。豆科凝集素(legumelectins)是指特別在豆科植物中發現的植物凝集素。這些迄今為止分離的凝集素中的大部分是從成熟種子中被鑑別的(VanDammeetal.，1998)，並且其濃度在其他植物器官中非常低。豆科凝集素在它們的一級、二級和三級結構中令人驚訝地相似，但是儘管有這些相似性，其在四級關聯和單體組織模式方面顯示很大的不同(RudigerandGabius，2001)。有趣的是，一級序列中的改變導致的三級結構中的微小改變會導致四級結構中的顯著不同(VijayanandChandra，1999)。典型地，已經證明了針對葡萄糖、N-乙醯-D-葡糖胺、甘露糖、半乳糖或N-乙醯-D-半乳糖胺、L-巖藻糖及複合物類型的寡糖的特異性(RudigerandGabius，2001)。豆科凝集素的生理學作用仍不清楚，儘管其已經被猜想是參與植物防禦的儲備蛋白質。凝集素樣受體激酶(LRK)是RLK的亞類，首先在擬南芥中被描述(Herveetal.，1996)。目前，在水稻基因組中已經闡明了103個成員(Shiuetal.，2004)，在鼠耳芥屬中鑑別了42個LRK(Barreetal.，2002)，在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中鑑別了9個成員(Navarro-Gochicoaetal，2003)，以及在鑽天楊(Lombardypoplar)中鑑別了一些成員(Nishiguchietal，2002)。在酵母和人類的完整基因組序列中未發現具有豆科樣凝集素結構域的RLK(Navarro-Gochicoaetal.，2003)。其可能是植物特異性的。已經表面LRK在不同器官中表達，包括根、成熟葉、莖、花和長角果。這些蛋白質的生理學作用仍在研究中。在LRK中存在豆科樣凝集素作為受體提示其在感知寡糖介導的信號中具有一定作用，但是目前仍沒有證據表明LRK具有活性受體結構域並且糖分子可能與其結合，但是發現激酶結構域能夠進行自身磷酸化(Nishiguchietal.，2002；Heetal.，2004)。本領域現在需要進一步了解植物發育包括根系擴張的機制，以用於調節所述發育的方法及用於在其中可以調節這種發育的植物和植物細胞。發明概述本發明涉及新的凝集素樣受體激酶基因，稱為水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)，其在植物發育中起作用。試驗結果提示Oslrk1對於來自糖和/或植物激素的信號產生應答，並且其是包括根系擴張在內的植物發育某些方面的負調節物。特別地，本發明提供了一種分離的核酸，其包含(a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列，(b)編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列，或(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。本發明還提供了載體，其包含與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的上述核酸。本發明還提供了用於在植物中負調節發育的方法，包括用本文所述的核酸轉化植物細胞並將所述細胞培養為植物。在一方面，本發明提供了一種用於促進在植物中增強的根生長的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)相應於SEQIDNO1所示的核苷酸序列的反義核苷酸序列，或(b)相應於編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的反義核苷酸序列，並將所述細胞培養為植物。另外，本發明提供了一種Oslrk1Ds插入突變體，其在根和地上部分具有獨特表型。另外，本發明提供了一種轉基因植物，其基因組包含具有一個破壞(disruption)的Oslrk1基因，其中所述破壞包含Ds插入，並且其中所述破壞引起所述轉基因植物與野生型植物相比顯示增強的根生長。本發明進一步提供了具有摻入到其基因組中的本發明的核酸的轉化的植物細胞和轉基因植物。以及所述轉基因植物的種子。本發明另外提供了與本文所述序列同源的核苷酸序列，並且所述序列保留本發明描述的序列的生物學活性，本發明還提供了使用或涉及這些同源序列的方法、轉化的細胞、轉基因植物和種子。圖1.Oslrk1突變體顯示的表型。A.在MS培養基上生長五天的WT(左)和突變體(右)秧苗。B.和C.在MS培養基上分別生長兩周的WT和突變體幼苗的根。在土壤中分別生長兩月的WT植株(D)和突變體植株(E)的根。F.生長兩月的WT植株(左)和突變體植株(右)的葉形態。生長45天的WT植株(G)和突變體植株(H)的形態，其中突變體顯示開花推遲(I)。生長三個月的突變體植株(右)與WT相比，其地上部分顯示整體較強壯的表型。成熟WT植株(J)和突變體植株(K)的圓錐花序在突變體中顯示更多分枝。圖2Oslrk1基因的表達水平。圖中顯示Oslrk1在WT和純合Oslrk1突變體中的基因表達的Northern雜交分析。從生長兩周的wt或突變體幼苗的根組織提取總RNA(10μg)。膜與相應於Oslrk1基因的3』UTR的DIG標記的探針雜交。在WT植株中檢測到大小為2.7Kb的轉錄物，其在突變體根組織中不存在(上組)。下組顯示上樣的總RNA的量(通過與用相應於水稻肌動蛋白基因(RAct1)的探針進行條帶印跡(strippedblot)的雜交獲得條帶)。圖3Oslrk1的cDNA序列(SEQIDNO1)。圖4OsLRK1蛋白質(SEQIDNO2)的結構域和基序組織。豆科樣凝集素結構域處於框中並示於圖5以進行凝集素結構域胺基酸序列的排列對比。凝集素結構域的β鏈和α鏈在所述框中分別以粗體示出。可能的N-糖基化位點以下劃線示出。信號肽和跨膜結構域以斜體示出。絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域以陰影示出，12個亞結構域的最保守胺基酸以黑粗體示出。可能參與亮氨酸拉鏈結構的亞結構域X中的亮氨酸殘基(L599-L605-L619-L626)被框出。激酶結構域中的ATP結合區(Leu387-Lys413)以下劃線示出。圖5.OsLRK1相關序列的凝集素樣結構域的排列的胺基酸序列的對比。排列使用TCoffee程序(Notredame，C.etal.，2000)進行。相同胺基酸用陰影表示並且同源序列被框出。星號表示Ca2+結合胺基酸，十字表示Mn2+結合胺基酸。β鏈和α鏈之間的可能的切割位點(NDT)被框出並以陰影表示。OsLRK2是OsLRK1的最接近的同系物；P.nigra，來自黑楊(Populusnigra)(DDBJ中的AB030083)的凝集素受體激酶；MtLeRK1，來自蒺藜苜蓿(Medicagotrunculata)(AY358030)的表達在根部的凝集素受體激酶；F.bean，來自蠶豆(Fieldbean)(P38662)的甘露糖/葡萄糖特異性凝集素；B.purpurea，來自羊蹄甲(Bauhiniapurpurea)(P16030)的N-乙醯-D-半乳糖特異性凝集素；L.sphaericus，來自Lathyrussphaericus(P16349)的凝集素；P.sativum，來自豌豆(Pisumsativum)(P02867)的種子的甘露糖特異性凝集素；M.hemaglutinin和M.hemaglutinin，來自懷槐(Maackiaamurensis)(1DBN_B(PDB)和210523A)的凝集素；P.angolensis，來自安哥拉紫檀(Pterocarpusangolensis)(PDB中的Q8Q-A)的凝集素；R.pseudoacacia，來自刺槐(Robiniapseudoacacia)(BBA04604)的樹皮凝集素；AthLecRK1，來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AAB58725)的凝集素樣受體激酶。NCBIGeneBank登錄號和PBDID示於括號內。圖6.通過RT-PCR(A)和Northern印跡雜交(B)進行的Oslrk1基因的表達研究。對於RT-PCR，大約2μg總RNA加入到PCR混和物中，並加入相應於Oslrk1特異的5』UTR和3』UTR序列的引物。Oslrk1的擴增的轉錄物的預期長度(2.7kb)用箭頭示出(左側)。同時擴增水稻Actin1基因的500bp轉錄物作為內部對照。對於Northern印跡，使用分離自不同組織(在上面示出)的總RNA(10μg)作為模板並使用DIG標記的Oslrk1的3』UTR作為探針。2.7kb轉錄物相應於Oslrk1基因(如在左側示出的)。18SrRNA用作總RNA的定量對照。圖7.攜帶具有GusA或Eyfp基因的Oslrk1啟動子的轉基因植物的表達分析。A-D.Oslrk1啟動子::gusA在轉基因植物中的表達；E，G.EYFP在Oslrk1啟動子::eyfp轉基因植物中的表達；(A).GUS在生長四天的轉基因幼苗的不定根中的表達以及在生長兩周的幼苗的不定根和側根中的表達。(B)；GUS染色的根的橫切片顯示在遠端伸長區的表達(C)和在示出發生中的側根的芽體的成熟區的表達(D)。在(C)中，Ep-表皮；Cx-皮質；En-內皮層；Pc-Pericuycle細胞。(E，G)EYFP在轉基因植物的根中的表達的顯微圖像；(E，G).EYFP在根維管細胞中的表達的共焦成像；(F).根的可見光成像；(G).E和F的融合圖像。圖8.用不同激素SA(A)和糖(B)對Oslrk1轉錄物的調節。在全部實驗中，在Northern印跡雜交中均使用DIG標記的相應於Oslrk1基因的3』UTR的探針。作為上樣的總RNA的定量對照，清洗使用Oslrk1探針進行Northern雜交的濾膜並用相應於水稻Actin1基因的DIG標記的探針進行再雜交。在Northern印跡的頂端的比值示出Oslrk1在樣品中的實際表達水平，其根據用Oslrk1特異性探針獲得的雜交信號的強度與用Act1探針獲得的信號強度的比值計算得出。圖9.用MeJA處理WT和突變體幼苗。WT和突變體的種子在含有各種濃度的MeJa(1μM，5μM和10μM)或對照的MS(含有1％Suc)中發芽並生長(A)。條形圖顯示不定根的長度和數目以及側根的數目(B)。每一個數據點測量大約30-50株幼苗。p-Value針對不定根的數目(0.005)、不定根的長度(0.00)和側根的數目(0.19)計算。圖10.Oslrk1突變體對Man(A和B)以及Gal(C和D)的不同應答。WT和突變體植物的種子在MS培養基中在不同濃度的Gal/Man中發芽一周。A和C分別顯示在Man和Gal中發芽的幼苗的應答。條形圖示出苗長度、不定根的長度和數目以及WT和Oslrk1突變體幼苗對施用Man(B)和Gal(D)的發芽率。B和D顯示三次獨立實驗的平均值。對於每一次實驗，使至少50株幼苗在合適的單糖中發芽，並測量數據點。p-Value針對用甘露糖處理(C)的苗長度(0.453)、不定根的數目(0.509)和長度(0.527)測量。對於半乳糖處理(D)，p-Value對於不定根的數目及長度和苗長度分別為0.00、0.01和0.00。圖11.OsLRK1作為水稻根生長的負調節物的作用的假設的模型。圖12.Oslrk的表達研究-Northern印跡。YL-幼葉；ML-成熟葉。顯示使用不同lrk作為探針的Northern印跡得到的mRNA表達結果。圖13.糖處理下的Oslrk的表達分析。圖14.激素處理下的Oslrk的表達分析。圖15.非生物脅迫處理下的Oslrk的表達研究。發明詳述本發明描述了一個新的參與植物發育的基因Oslrk1。克隆的cDNA長度為2701bp(圖3)(SEQIDNO1)。推斷的OSLRK1蛋白質(SEQIDNO2)示於圖4。另外，從對幾百個Ds插入品系的可見表型篩選中分離得到一個水稻凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)突變體並進行了研究。突變體植株顯示擴張的根系，所述根系具有更多的不定根和更長的側根。所述植株與野生型相比，其地上部分顯示更大的葉、開花推遲、以及更高的種子產量。所述突變體將表型與Basta抗性及bar基因型分離提示該表型與Ds插入相關。所述Oslrk1Ds插入品系是無效突變，因為在純合突變體中沒有檢測到轉錄物。Ac/Ds轉座子系統的一個優點是能夠通過將存在於轉座酶來源中的Ds元件進行再移動(remobilization)而獲得由於Ds插入而導致的突變體表型的回覆體(RamachandranandSundaresan，2001)。獲得了Oslrk1突變體的純合回復體，其將所述突變體表型拯救為野生型。回復體的產生證明了觀察到的突變體表型是由於通過Ds插入而敲除Oslrk1基因導致的。所述Ds插入位於第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處，其導致Oslrk1轉錄物的缺失，這已由Northern分析確認。所述Oslrk1基因屬於一個多基因家族，該家族包括已闡明的水稻基因組的至少64個成員。通過將純合突變品系與攜帶Ac轉座酶的植株雜交獲得回復體。分別攜帶Oslrk1啟動子::gusA和eyfp構建體的轉基因植物的Northern印跡雜交、組織化學和螢光分析顯示Oslrk1基因主要在不定根和側根的維管結構中表達，而不是在根冠中。在對甲基茉莉酸(MeJA)的應答中，Oslrk1的轉錄物被誘導，但是其被赤黴酸(GA)和水楊酸(SA)抑制。除此之外，Oslrk1基因被測試的一些糖所負調節。另外，所述突變體植物顯示對半乳糖的超敏感性和對MeJA處理的降低的敏感性。這些結果提示OsLRK1在植物發育尤其是根系擴張的某些方面中起到負調節物的作用，並且對來自糖和植物激素的信號產生應答。因此本發明的一個實施方案提供了一種分離的核酸，其包含(a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列，(b)編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列，和/或(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。所述核酸可以是DNA或RNA，並且可以是cDNA、基因組DNA、或mRNA。在一個實施方案中，所述核酸是融合基因，如Oslrk1-GUS融合基因或Oslrk1-EYFP融合基因。所述核酸可以是可轉錄的融合體如Oslrk1啟動子::gusA或Oslrk1啟動子::eyfp。本發明還提供了一種包含與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的上述核酸的載體。所述載體可以是植物表達載體或用於植物轉化的載體。本領域技術人員熟知的任何合適的載體均可應用。所述啟動子可以是用於在植物中表達基因的任何啟動子。合適的載體是本領域技術人員所熟知的。優選的啟動子包括玉米遍在蛋白(ubiquitin)啟動子和CaMV35S啟動子。如本領域所已知的，啟動子可以包括可誘導的和/或可阻遏的啟動子以及增強子，由此核酸和被編碼的多肽的表達可以基於各種生理學條件和信號被調節。本發明的核酸可以使用本領域已知的各種技術在體內和體外表達所描述的多肽，所述技術例如包括將所述核酸或載體轉導、轉染或轉化進細胞，以及體外轉錄和翻譯。本發明還提供了一種用於在植物中負調節發育的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸，或(b)包含編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸，並將所述細胞培養為植物。將所述細胞培養為植物可涉及任何用於將植物細胞生長為或繼續生長為成熟植物的技術，包括本文所描述的技術和本領域已知的其他技術。所述啟動子可以是任何合適的啟動子，所述植物可以是任何植物物種，優選單子葉植物，如本文所述。優選的啟動子例如包括玉米遍在蛋白啟動子和CaMV35S啟動子。植物物種例如包括玉米、小麥、大麥、黑麥等等。在本文所述的方法中，植物發育包括形態發生的發育控制的所有方面，包括細胞生長、細胞分裂和細胞分化的協調，以及這種協調的反映，如觀察到的器官生長和/或產生的整體植物生長。本發明的序列可以通過使用本領域技術人員熟知的技術而導入到任何植物中，並且可通過使用本領域技術人員熟知的技術而用於轉化任何植物物種。所述被導入的序列可被包含在用於在特定的感興趣的植物中表達的表達盒中。在優選的實施方案中，所述發育是根系擴張。所述調節可包括傳遞來自糖和/或植物激素的信號。本發明進一步提供了一種用於在植物中促進增強的根生長的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)相應於SEQIDNO1所示的核苷酸序列的反義核苷酸序列，或(b)相應於編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的反義核苷酸序列，並將所述細胞培養為植物。所述啟動子可以是任何合適的植物啟動子，優選玉米遍在蛋白或CaMV35S啟動子。所述植物可以是任何物種，優選單子葉植物。合適的植物物種例如包括玉米、小麥、大麥、黑麥等等。在一個優選的實施方案中，所述增強的根生長包括擴張的根系。在優選的實施方案中，所述擴張的根系包括更多的不定根和/或更長的側根。本發明還提供了一種轉化的植物細胞，所述細胞具有穩定整合進其基因組的至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸，(b)包含編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)包含相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸。所述啟動子可以是任何合適的啟動子。所述細胞可以是任何植物類型和任何物種的，並且優選來自單子葉植物。本發明還提供了一種轉基因植物，所述植物具有穩定整合進其基因組的至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸，(b)具有編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)具有相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸。所述啟動子可以是任何合適的啟動子。所述植物可以是任何植物物種，並且優選是單子葉植物。本發明還提供了本文描述的轉基因植物的種子。本發明還提供了一種用於在植物中調節發育的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸，(b)包含編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸，或(c)包含相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸，並將所述細胞培養為植物。所述啟動子可以是任何合適的啟動子。所述植物可以是任何植物物種，並且優選是單子葉植物。在一個優選的實施方案中，所述發育包括根生長。在另一個優選的實施方案中，所述調節包括在所述植物的一個地上部分導入修飾。本發明還提供了一種核苷酸序列，其與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，所述生物學活性即本文描述的調節發育活性。所述核苷酸序列的同源性優選地是大約80％，更優選地是大約95％。本發明還提供了一種用於在植物中負調節根系擴張的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，或(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，並將所述細胞培養為植物。所述核苷酸序列的同源性優選地是大約80％，更優選地是大約95％。本發明還提供了一種用於在植物中促進根系擴張的方法，所述方法包括用至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列是(a)相應於與SEQIDNO1所示的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列的反義核苷酸序列，或(b)相應於與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列的反義核苷酸序列，並將所述細胞培養為植物。所述核苷酸序列的同源性優選地是大約80％，更優選地是大約95％。本發明還提供了一種轉化的植物細胞，所述細胞具有穩定整合進其基因組的至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，或(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。所述核苷酸序列的同源性優選地是大約80％，更優選地是大約95％。本發明還提供了一種轉基因植物，所述植物具有穩定整合進其基因組的至少一種與啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列是(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽，或(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。所述核苷酸序列的同源性優選地是大約80％，更優選地是大約95％。本發明還提供了這種植物的種子。本發明還提供了一種轉基因植物，其基因組包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包括一個Ds插入，並且所述破壞導致該轉基因植物與野生型植物相比顯示增強的根生長。在一個優選的實施方案中，所述破壞是純合破壞。在一個優選的實施方案中，所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。在另一個優選的實施方案中，所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。在另一個優選的實施方案中，所述增強的根生長是擴張的根系。在另一個優選的實施方案中，所述擴張的根系包括更多的不定根或更長的側根。在一個實施方案中，所述轉基因植物在其地上部分顯示修飾，所述修飾可以是與野生型植物相比更大的葉、開花推遲、或更高的種子產量。在一個實施方案中，所述更高的種子產量是比野生型植物產量高大約20％。在另一個實施方案中，所述轉基因植物與野生型植物相比顯示對D-半乳糖的超敏感性。在另一個實施方案中，所述開花與野生型植物相比推遲大約五天至大約七天。本發明的轉基因植物當成熟時可以比在相似條件下生長的野生型植物高大約30％。所述轉基因植物當成熟時可以比在相似條件下生長的野生型植物在圓錐花序中顯示大約多70％的分枝。所述轉基因植物在幼苗期可以比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約2倍的苗長度(shootlength)。在另一個實施方案中，所述轉基因植物在幼苗期可以比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約多56％的不定側根。在另一個實施方案中，所述轉基因植物在幼苗期可以比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約長74％的側根。所述轉基因植物可以是任何植物物種，優選單子葉植物。優選的物種包括包括玉米、小麥、大麥、黑麥等等。本發明進一步提供所述轉基因植物的種子。本發明還提供了包含Oslrk1基因的分離的核酸，其中所述基因包含位於第一個外顯子中的ATG密碼子下遊大約117bp處的Ds插入。本發明還提供了一種在植物中增強根生長的方法，所述方法包括使所述植物細胞的基因組包含Oslrk1基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入，並將所述細胞培養為植物。在一個優選的實施方案中，所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。在一個優選的實施方案中，所述破壞是純合破壞。在一個實施方案中，所述增強的根生長包括擴張的根系。在一個實施方案中，所述擴張的根系包括更多的不定根和/或更長的側根。在一個優選的實施方案中，所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。本發明還提供了一種修飾植物地上部分的方法，所述方法包括使所述植物細胞的基因組包含Oslrk1基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入，並將所述細胞培養為植物。在一個優選的實施方案中，所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。在一個優選的實施方案中，所述破壞是純合破壞。在一個實施方案中，所述植物地上部分的修飾是與野生型植物相比更大的葉、開花推遲、或更高的種子產量。所述更高的種子產量可以是與野生型植物相比大約高21％。本發明還提供了一種增加植物對D-半乳糖的敏感性的方法，所述方法包括使所述植物細胞的基因組包含Oslrk1基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入，並將所述細胞培養為植物。在一個優選的實施方案中，所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處，。在另一個優選的實施方案中，所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。在一個優選的實施方案中，所述破壞是純合破壞。本發明還提供了一種分離的Oslrk1基因的Ds插入突變體，其中所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。如本文所用，分離的或純化的核酸或蛋白質，或其生物學活性部分，當通過重組技術產生時基本上不含有其他細胞物質或培養基，或當化學合成時基本上不含有化學前體或其他化學物質。優選地，分離的核酸不含有在衍生該核酸的生物體的基因組DNA中天然處於所述核酸側翼的序列(優選地蛋白編碼序列)(即位於所述核酸的5′和3′末端的序列)。本發明的多核苷酸或核酸組合物包括有義鏈和反義鏈的RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式、以及混和的多聚體，並可以是化學或生物化學修飾的或可以含有非天然的或衍生化的核苷酸鹼基，這是本領域技術人員容易得知的。這些修飾例如包括標記、甲基化、一或多個天然發生的核苷酸用類似物的取代、核苷酸間的修飾例如不帶電荷的鍵(例如甲基膦酸酯(methylphosphonate)、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等等)、帶電荷的鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)、側基成分(pendentmoieties)(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等等)、螯和劑、烷化劑、以及修飾的鍵(例如α異頭核酸(anomericnucleicacid)等等)。還包括模擬多核苷酸與指定的序列通過氫鍵和其他化學相互作用結合的能力的合成分子。這些分子是本領域所熟知的，包括例如其中在分子骨架中肽鍵置換磷酸鍵的分子。本發明的多核苷酸可以是分離的或基本純的。包含OsLRK1基因或其Ds插入突變體的重組構建體可以能夠在宿主細胞中自主複製。或者，所述重組構建體可以整合進所述宿主細胞的染色體DNA中。這種重組多核苷酸包含基因組來源的多核苷酸、cDNA來源的多核苷酸、半合成來源的多核苷酸、或合成來源的多核苷酸，其中根據其來源或操作，所述多核苷酸1)不與其在天然狀態下相聯繫的全部多核苷酸或其一部分相聯繫；2)與其在天然狀態下相聯繫的多核苷酸之外的其他多核苷酸相聯繫；或3)天然不發生。因此，本發明還提供了包含不是天然發生的序列的重組核酸。儘管所描述的序列可以應用，但是它們通常被例如通過缺失、置換或插入而改變。本發明提供了野生型和突變的OsLRK1多肽或其片段的蛋白質修飾或片段，其與一級結構序列基本同源，但包括例如體內或體外化學和生物化學修飾，或摻入了不常見的胺基酸。這些修飾包括例如乙醯化、羧化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化(ubiquitination)、標記例如用放射性核素標記、以及各種酶修飾，這些均可很容易地為本領域普通技術人員所知。為此目的的標記多肽的各種方法以及各種取代基或標記為本領域普通技術人員所知，包括放射性同位素如32P、與標記的抗配體(例如抗體)結合的配體、螢光團、化學發光劑、酶、以及對於標記的配體可作為特異結合對的成員的抗配體。標記的選擇依賴於需要的靈敏度、與引物綴合的容易程度、穩定性需求、以及可得到的儀器。如本文所描述的，除了基本全長的蛋白質外，本發明還提供了所述多肽的生物學活性片段和同系物。如本文所用，術語「多肽」是指全長蛋白和作為多肽片段的所述蛋白的一部分。本發明還提供了融合多肽，其包括OsLRK1多肽及其片段，以及本領域已知的其他多肽或蛋白的片段。同源多肽可以是兩或多個多肽序列的融合體或OsLRK1和一個相關蛋白的序列的融合體。類似的，異源融合體可以構建為顯示衍生蛋白的性質或活性的組合的融合體。例如，配體結合結構域或其他結構域可以在不同的新融合多肽或片段之間「交換(swapped)」。這些同源或異源融合多肽可例如顯示改變的結合強度或結合特異性，並可包括例如配偶體如免疫球蛋白、細菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-內醯胺酶、α澱粉酶、醇脫氫酶和酵母α交配因子。融合蛋白可以典型地通過重組核酸方法(如下面所介紹的)製備或通過化學合成製備。合成多肽的技術是本領域普通技術人員所熟知的。其他蛋白質修飾包括胺基酸取代。取代的變體典型地包含在蛋白質內部的一或多個位點將一個胺基酸交換為另一個，並且可被設計為調節所述多肽的一或多種性質(例如針對蛋白酶剪切的穩定性)而不喪失其他功能或性質。胺基酸取代可以基於所涉及的殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性、和/或兩親性性質的相似性產生。優選的取代是保守取代，即一個胺基酸被另一個相似形狀和電荷的胺基酸取代。保守取代是本領域普通技術人員所熟知的，典型地包括但不限於在下列組中列出的取代甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬氨酸/穀氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；絲氨酸/蘇氨酸；賴氨酸/精氨酸；酪氨酸/苯丙氨酸。蛋白質結構中的某些胺基酸可以被其他胺基酸取代而不顯著喪失與一些結構的相互作用的結合能力，所述結構例如抗體的抗原結合區或底物分子上的結合位點或與多肽相互作用的蛋白質上的結合位點。由於定義蛋白質的生物學功能活性的是蛋白質的相互作用能力和性質，因此可以在蛋白質序列及其DNA編碼序列中產生某些胺基酸取代，並且獲得具有相似性質的蛋白質。在產生這些改變時，可以考慮胺基酸的親水指數。本領域一般明白疏水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用的生物學功能中的重要性。或者，相似胺基酸的取代可以基於親水性而有效的進行。本領域一般明白親水性在賦予蛋白質相互作用的生物學功能中的重要性(參見例如美國專利4,554,101)。美國專利5,691,198中進一步討論了疏水指數或親水性在設計多肽中的應用。這些專利通過引用以其全文併入本文。重組核酸是非天然發生的核酸，或是通過人工組合兩個分離的序列片段而產生的核酸。這種人工組合通常通過化學合成手段或通過對分離的核酸片段進行人工操作例如通過進行遺傳工程技術而實現。這個短語還包括被從其正常的調節表達限制中移走的基因，所述情形例如一種基因產物由於存在該基因的多個拷貝或存在被增量調節的啟動子或增強子信號、增加的mRNA或蛋白質半衰期等等而被過表達。「調節序列」是指影響基因表達的序列，所述基因表達包括所述基因的轉錄以及信使RNA的翻譯、剪接、穩定性等等。大量的本發明的多核苷酸可以由用本文所描述的核苷酸序列轉化的合適的宿主細胞產生。編碼多肽或所希望的片段的天然或合成的多核苷酸片段可以摻入重組多核苷酸構建體(載體)中，所述構建體通常是DNA構建體，能夠導入至原核或真核細胞中並在其中複製。典型地，所述載體要適於在單細胞宿主如酵母或細菌中複製，但也可適於導入培養的哺乳動物或植物或其他真核細胞系中(整合或不整合進基因組中)。最常用的原核宿主是大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株，儘管也可以使用其他原核生物如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或假單胞菌(Pseudomonas)。哺乳動物細胞或其他真核宿主細胞(例如酵母細胞、絲狀真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、或兩棲動物或禽類物種的細胞)也可用於產生本發明的蛋白質。如本領域所熟知的，調節多核苷酸表達可導致由所述多核苷酸編碼的多肽的調節。表達和克隆載體優選地包含可選擇的標記基因。典型的標記基因編碼a)賦予抗生素抗性或其他有毒物質例如氨苄青黴素、新黴素、氨甲蝶呤等等抗性的蛋白質；b)互補營養缺陷型缺陷的蛋白質；或c)提供不能得自複合培養基的關鍵營養物質的蛋白質(例如編碼用於芽孢桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因)。選擇合適的可選擇的標記依賴於宿主細胞，本領域普通技術人員熟知用於不同宿主的合適的標記。包含感興趣的核酸的載體可以在體外轉錄，得到的RNA通過已知的方法例如注射被導入宿主細胞中，或者所述載體可以通過本領域普通技術人員所熟知的方法被直接導入宿主細胞中，所述方法根據細胞宿主的類型而改變，包括電穿孔、利用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、或其他物質的轉染、基因槍法(microprojectilebombardment)、脂轉染法、感染(如果所述載體是感染劑例如逆轉錄病毒基因組)、以及其他方法。在本文中將所述多核苷酸通過本領域已知的任何方法例如包括上述方法導入宿主細胞稱為「轉化」。上述已經被導入核酸的細胞也包括這些細胞的後代。根據載體構建的模式，克隆通過使用標記而選擇。所述標記可以位於相同的或不同的DNA分子，優選相同的DNA分子。在原核宿主中，轉化子可以例如通過對氨苄青黴素、四環素或其他抗生素的抗性而選擇。基於溫度敏感性產生特定產物也可以作為一種合適的標記。用本發明的多核苷酸轉化的原核或真核細胞不僅可用於產生本發明的核酸和多肽，還可以例如用於研究OsLRK多肽的特徵。用本發明的多核苷酸轉化的植物細胞也可用於生長表達本發明的多核苷酸和多肽的植物。本發明的核苷酸也可轉化進已經進行了一些生長的植物中。本發明的多核苷酸可以根據需要以有義或反義方向表達。應理解控制基因以有義或反義方向表達可以直接影響可觀察的植物特徵。本領域已知的反義技術可以方便地用於植物中的基因表達。為了實現所述反義表達，克隆得自所希望的基因的核酸片段並將其與啟動子可操縱地連接，從而可以轉錄RNA的反義鏈。接下來將所述構建體轉化進植物中並產生RNA的反義鏈。在植物細胞中，已經示出反義RNA通過阻止編碼感興趣的酶的mRNA積聚而抑制基因表達。用T-DNA和轉座子(例如AC/Ds，Spm/En)進行的插入誘變(insertionalmutagenesis)在功能性基因組學中是一種有力的工具，其介導基因敲除並可導致突變體表型(Ramachandran，S.，andSundaresan，V.(2001))。除了使用T-DNA誘變的簡便性之外，可轉座元件還有一些其他優點，例如在基因組中的單一插入和通過所述可轉座元件的再移動拯救失活基因的可能性。本領域已知的其他技術例如miRNA、RNAi和sRNA通過降解其轉錄物而引起基因失活(Mallory，A.，andVaucheret，H.(2004)；Dawnward，J.(2004)；Finnegan，E.andMatzke，M.(2003))。本領域普通技術人員可以從本文的教導中容易地認識到這些技術適於抑制本發明的Oslrk1基因產物的表達。因此本發明進一步提供了各種失活、破壞、或其他阻斷Oslrk1基因或其產物的活性或表達以得到本文描述的轉基因植物和轉化的細胞的特徵的方法。基於前面的描述，本領域普通技術人員可以最大限度地實現本發明。因此下面的實施例僅僅是示例性的，不應將其理解為以任何方式限定如後面所附的權利要求書所闡述的本發明。實施例1突變體分離及表型鑑定。對我們課題組之前生產的幾百個F3/F4基因陷阱(genetrap)水稻Ds插入品系(KolesnikT.et.al.，2004)進行可見表型篩選。在這些轉座株(transposant)中，選擇一個具有明顯表型的Basta抗性(BarR)品系進行進一步分析。該突變體植物與野生型(WT)植物相比顯示更長和更寬的葉、更多的圓錐花序分枝、以及由此產生的更高的種子產量(圖1，表1)。所述突變體表型在連續後代中是穩定的。在MS培養基上生長6天(圖1A)和14天(表1)的突變體幼苗與在相似條件下生長的WT幼苗相比顯示長兩倍的苗長度(圖1，表1)。在幼苗期，突變體植物具有多56％的不定根和長74％的側根(圖1B，表1)。表1.Oslrk1突變體的表型鑑定葉寬度和長度測量自成熟的生長2個月的植物。苗長度、不定根數目、以及側根長度由在生長室中的MS瓊脂培養基中在25℃生長兩周的幼苗確定。每一時間點使用大約50株植物。標準偏差值(SDV)在括號中給出。上述全部參數用t-test處理並給出p-Value。所有均為p＜0.05，因此是顯著不同的。突變體植物在其全部發育階段持續顯示相似的差異。生長兩個月的WT植物的旗葉平均長度為37cm，而突變體旗葉顯示平均值為47cm(長27％)。在突變體植物的旗葉寬度中也觀察到相似的差異(比WT旗葉寬30％)(圖1C和表1)。除了這些特徵之外，Ds插入品系與WT植物相比顯示推遲5至7天開花的表型(圖1D)。成熟突變體植物比在相似條件下生長的WT植物高大約30％(數據未顯示)(圖1E)。在成熟階段，突變體植物顯示在圓錐花序中大約多70％的分枝(圖1F，表1)，導致高21％的種子產量(表1)。突變體植物的高度、圓錐花序分枝、以及種子產量與WT特徵相比是統計學顯著的。在成熟階段，突變體植物比WT具有更多的不定根和更長的側根，這與在幼苗期觀察到的差異相似(圖1B)。為了將Ds插入引起的突變和突變體表型聯繫起來，進行了選擇標記bar基因(賦予Basta除草劑抗性)的分離分析。向衍生自雜合F2植株的大約200株F3幼苗噴灑Basta除草劑。在F3後代中獲得3∶1比例的Basta抗性(BarR)與敏感(BarS)幼苗，這提示突變體可能具有單一Ds插入。為了確認這些Basta抗性植株確實含有所述bar基因，分離得自這些植株的葉的基因組DNA，並用作PCR分析的模板與針對bar基因設計的引物組合使用。在將表型和由Ds插入引起的突變聯繫起來的分析中，分析分離比是重要的(但並非是充分的)一步。表型可能是由於初級Ds轉座導致的在相同的基因座中其他基因的足跡產生的(Chinetal.，1999)。為了顯示Ds與突變體表型共分離，在另一系列實驗中不噴灑Basta除草劑，對提取自衍生自雜合F3植株的200株F4幼苗的基因組DNA進行PCR分析以檢查是否存在bar基因。PCR分析中bar陰性的植株顯示WT特徵，而具有基因的植株表現突變體的生長參數，這確認了表型和由Ds插入引起的突變之間的聯繫。突變體的分子特徵研究實施例2Ds插入標記的基因編碼凝集素受體激酶(OsLRK1)。為了確定Ds插入側翼的序列，對分離自突變體植物的葉的基因組DNA進行TAIL-PCR(LiuandWhittier，1995)，之後進行測序。獲得5』和3』Ds側翼序列以及基於整合通過Ds元件引入的8個核苷酸的靶複製位點(5』TTCACCAG3』)。對所述側翼序列在TIGR(TheInstituteforGenomeResearch)、RGP(RiceGenomeResearchProgram)和NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公共資料庫中使用BLASTN和BLASTX排列對比算法進行序列相似性檢索。結果顯示Ds標記的基因編碼與凝集素受體蛋白激酶同源的蛋白質，並且該基因被命名為水稻凝集素受體激酶1，或「Oslrk1」。實施例3Oslrk1突變體具有Ds元件的單一拷貝。分離比(BarR∶BarS)3∶1提示在基因組中存在單一拷貝的Ds元件或在同一基因座內存在多拷貝。存在兩或多個Ds元件會使突變體表型及其特徵鑑定複雜化。為了確定Ds元件的拷貝數，使用提取自突變體植物的葉的基因組DNA用bar或gusA基因作為探針進行Southern印跡雜交(方法)。在兩種情況中，用每一種限制酶均獲得單一條帶，這些結果確認了在突變體品系中存在單一Ds元件(數據未示出)。實施例4通過Ds插入進行的Oslrk1的完全敲除。Oslrk1基因位於2號染色體，BAC克隆OJ1038A06(在遺傳圖譜125.6cM處)。Oslrk1的基因區預測為3,257bp長，具有一個內含子(1kb)，其中開放讀框(ORF)為2,224bp。5』和3』非翻譯區(UTR)分別為至少107bp和392bp，如我們使用基於推測的5』UTR和3』UTR序列設計的不同引物組合通過RT-PCR所示出的那樣。為了研究Ds插入在Oslrk1基因內部的精確位置，使用分離自突變體葉的基因組DNA和針對Oslrk1基因的5』UTR和gusA基因的5』端設計的特異性引物進行PCR。對PCR產物進行測序，該測序分析揭示了Ds插入位於第一個外顯子內ATG密碼子下遊117bp處。通過使用純化自WT和純合突變體植物的總RNA進行的Northern印跡雜交進行的進一步分析使用Oslrk1基因的3』UTR作為探針進行。Oslrk1基因轉錄物僅在WT中而不再純合突變體植物中檢測到，這提示該基因可能的敲除。實施例5Ds元件從Oslrk1基因的再移動拯救突變體表型。為了拯救Ds插入導致的突變體表型，將25株純合Oslrkl突變體植物與攜帶Ac轉座酶(Acl或Ac5；Kolesniketal.，2004)的純合植物雜交以使所述Ds元件再移動。R1和大部分R2植物顯示突變體的生長特徵。提取得自轉基因植物和WT(作為對照)的基因組DNA並用作PCR模板，針對Ds元件側翼的5′和3′序列設計引物。對擴增的片段進行測序並使用CLUSTALW程序(Thompsonetal.，1994)進行排列對比，之後分析由於Ds切除而存在的足跡。對於22株R2植物，我們已經獲得了含有不同足跡的PCR產物，這顯示Ds元件的再移動。足跡的長度(空的供體位點)從8個核苷酸(提示完美的Ds元件切除)至2個核苷酸(刪除幾個中心核苷酸的結果；Schiefelbeinetal.，1988)不等。由於Ds元件插入在第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp(編碼39胺基酸)處，因此3bp(或3的倍數)足跡會產生Ds元件切除後獲得的mRNA的適當的翻譯。僅獲得了一株具有3bp足跡的植物，其顯示WT植物的生長參數。然而，具有不同於3bp的足跡的植物不能拯救突變體表型。實施例6水稻中的凝集素樣激酶由一個多基因家族編碼。已經示出凝集素樣激酶在鼠耳芥(Herveetal.，1996，1999；Barreetal.，2002)、黑楊，(Poplusnigera)(Nishiguchiet.al.，2002)和蒺藜苜蓿(Navarro-Gochcoaetal.，2003)中由多基因家族編碼。在水稻基因組中(O.sativa，indica)已闡明有103個推斷的LRK(Shiuetal.，2004)。我們已經獲得了99個非冗餘的胺基酸序列(Shiu，personalcommunication)並使用了組合方法對它們進行分析，所述組合方法是使用ClustalW程序(Thompsonetal.，1994)的多序列排列對比和BLASTP程序(NCBI)的預測模式。一些推斷的LRK由於長度上的顯著差異(從171到1311aa)、α和β鏈的位置或在豆科凝集素結構域中缺乏一條鏈而不能僅使用ClustalW進行排列對比。我們發現35個推斷的LRK僅具有Ser/Thr激酶結構域，它們中的4個具有兩個激酶結構域，而沒有確定任何豆科樣結構域。剩餘的64個LRK包含至少一個豆科樣結構域(α，β，或兩條鏈)、Ser/Thr激酶結構域、以及在一些情況中其他結構域(例如Chase或DUF26結構域)。蛋白質長度從349aa至1055aa不等。LRK之間的同源性在21％至75％之間變化。得自水稻O.sativa，japonica的OsLRK1和OsLRK2的相同序列在indica基因組中具有其對應序列。Oslrk1的最接近的同系物Oslrk2在蛋白質水平具有75％的相同性，在cDNA水平具有85％相似性，並且與Oslrkl位於同一個BAC克隆，在Oslrk1的polyA信號的下遊1kb處。另一個同系物Oslrk3具有59％序列相似性，在cDNA水平是70％，並且其位於6號染色體，PACP0019A05。我們進行了Southern印跡雜交分析以選擇Oslrk1基因特異性探針。分離自WT植物的葉的基因組DNA用合適的酶消化、印跡、並與相應於Oslrk1基因的凝集素結構域或3′UTR的探針雜交。當凝集素結構域被用作探針時，在低嚴格條件下暴露時間為2至3小時獲得了幾條條帶(數據未示出)。當所述印跡暴露過夜時，出現了較強的模糊(smear)。另一方面，當使用相應於Oslrk1基因的3′UTR的探針時，在相似雜交和檢測條件下進行的Southern印跡檢測到單一條帶(數據未示出)。由於Oslrk1基因特異性條帶用3′UTR探針在Southern印跡雜交中獲得，這個探針被用於在Northern印跡雜交中分析Oslrk1基因表達模式。我們分析了15個選擇的Oslrk，包括Oslrk1，其被詳細分析並在本文中被詳細描述。特別地，分析了Oslrk在水稻基因組中的位置、PAC和BAC克隆信息、基因大小和其他特徵，詳細情況適於表2。另外，圖12示出了通過使用不同lrk作為探針進行的northern印跡的mRNA表達結果。在被測試的組織(根、幼葉和成熟葉、圓錐花序)中，只有Oslrk1，7，8，11和14是表達的。所述表達模式如圖所示。對於分離自生長兩周的幼苗的RNA樣品進行RT-PCR，所述幼苗用各種糖(圖13)、激素(圖14)和非生物脅迫(圖15)處理，所述RT-PCR使用針對表2中列出的15個Oslrk的3』或5』非翻譯區(UTR)設計的引物進行。對於每一個Oslrk在膠中設置兩條泳道，第一條泳道是對照，第二條是處理的樣品。這些結果總結於表3。表3提供了有關Oslrk的所有上述提到的數據的概述，顯示各種處理的RT-PCR結果，所述處理包括糖、激素和非生物脅迫，以及在正常條件下生長的水稻植物的各種組織的northern印跡結果，以及EST或cDNA在資料庫中是否可得到。在表中，「I」表示誘導的表達，「R」表示抑制的表達。表2.在已知的水稻基因組中凝集素受體激酶家族成員實施例7OsLRK1結構域組織及其在其他物種中的同源序列。推斷的OsLRK1蛋白包含與在其他凝集素受體激酶中發現的結構域相似的兩個截然不同的結構域(HerveC.，etal.，1996，1999；NishiguchM.，etal，2002；HeX.-J.etal，2004，Navarro-GochicoaM.-T.etal，2003)N末端豆科樣凝集素受體結構域和C末端信號轉導絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域(圖4)。在N256D257T258位置有一個糖基化位點(共有序列Asn-X-Ser/Thr)(圖4)(RudigerH.，andGabiusH.J.，2001)。在凝集素結構域中發現11個推斷的糖基化位點。四個殘基E147、-D149、-D156和-H161與Mn2+結合胺基酸相同，其中兩個D149和D156還結合Ca2+。需要這些陽離子以保持凝集素的三級結構，使得所述單糖結合位點被暴露。一個信號肽(20個胺基酸長度)和一個跨膜結構域(23個胺基酸長度)分別位於凝集素結構域的N末端和凝集素與激酶結構域之間。絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域長度為282胺基酸並且由12個典型蛋白激酶亞結構域組成，如圖4所示。OsLRK1的豆科樣凝集素結構域的胺基酸序列揭示了與其他凝集素樣蛋白激酶的凝集素結構域和來自不同物種的豆科凝集素很強的同源性(圖5)。對於胺基酸序列排列對比(Notredame，etal.，2000)，選擇非推斷的和已經研究清楚(通過解析的3D結構或已確立的功能/作用確定)的蛋白序列。初始我們基於相應於LRK的凝集素或凝集素結構域的原始長度進行排列對比，然後將選擇的序列的長度進行優化以得到更好的排列對比。在這些蛋白質中，OsLRK1凝集素樣結構域的最接近的同系物是黑楊(Populusnigra)的LRK中的凝集素(PnLRK)，其具有51％相同性和68％相似性，這在其他凝集素中是最高的分值。擬南芥凝集素受體蛋白激酶的凝集素結構域與OsLRK1凝集素結構域具有37％相同性和55％同源性，而得自蒺藜苜蓿(Medicagotranculata)的凝集素樣蛋白激酶的凝集素結構域僅具有27％相同性和39％同源性。豆科凝集素的胺基酸序列與OsLRK1具有在24％和27％之間的低相同性和大約40％的同源性。在凝集素樣蛋白激酶(除了MtLECRK1)的凝集素的推斷的序列中的天冬氨酸殘基(D88，圖5或D135，圖4)被穀氨酸殘基(如在OsLRK1，2和PnLRK中)或組氨酸殘基(如在AthlecRK1中)取代。這個殘基顯示在凝集素與碳水化合物的結合中是必需的，其取代在得自刺槐(Robiniapseudoacacia)的樹皮凝集素(RBL)中導致喪失血細胞凝集活性(Nishiguchiet.al.，1997)。實施例8Oslrk1基因主要在根中表達。為了確定Oslrk1基因的表達模式，使用了幾種方法。最初進行兩組實驗使用從胼胝體、生長24天的整株幼苗及其根、幼葉和成熟葉提取的總RNA進行的RT-PCR(圖6A)，和使用從根、幼苗和圓錐花序構建的cDNA文庫作為模板進行的PCR(材料和方法)。RT-PCR結果顯示該基因主要在幼苗的根中表達；然而，在圓錐花序和胼胝體中也觀察到了Oslrk1轉錄物的低表達水平(圖6A)。在使用cDNA的PCR中，擴增產物在根、幼苗和圓錐花序文庫中均檢測到(數據未示出)；這些結果與RT-PCR數據一致。除了cDNA文庫PCR，還用用於RT-PCR的總RNA樣品進行了Northern印跡分析。使用相應於Oslrk1的3′UTR和凝集素結構域的探針進行雜交。用3′UTR探查的Northern印跡顯示Oslrk1基因在根和幼苗中的強表達、在圓錐花序中的低表達和在胼胝體中僅痕量表達，這確認了RT-PCR結果(圖6B)。當使用凝集素結構域探針時，Oslrk1轉錄物在與用3′UTR探針在Northern分析中檢測到的器官相同的器官中被檢測到(圖6B)。實施例9Oslrk1基因在根的維管結構和中柱鞘細胞中表達。為了確定Oslrk1基因表達的組織特異性，設計了兩個構建體Oslrk1基因的啟動子與gus或eyfp基因融合(材料和方法)。這些構建體被導入到水稻中，產生轉基因品系。對T0和T1轉基因植物進行組織化學染色和螢光研究。對生長四天的轉基因幼苗在GUS染色溶液中溫育20分鐘，在不定根的遠端伸長區中觀察到了GUS表達(圖7A)。在溫育1至2小時後，根的近端伸長區和成熟區也被染色(數據未示出)。生長七天的幼苗在不定根和側根的伸長區和成熟區顯示GUS染色(圖7B)。在根的成熟區，維管結構被強烈染色。然而，在根冠未檢測到表達。為了研究表達Oslrk1啟動子::gus融合轉錄物的根細胞類型，進行GUS染色的根的橫切片分析。特別是根的維管束和中柱鞘細胞顯示GUS染色，提示在這些細胞中Oslrk1基因的內源性表達(圖7C和D)。當轉基因植物的根攜帶Oslrk1啟動子::eyfp基因構建體時觀察到了相似的表達模式(圖7E和G)。當對這些轉基因植物進行共焦顯微觀察時，在根的維管結構(中心部分)中觀察到了EYFP螢光(圖7E和G)。在成熟階段的根中也檢測到了EYFP螢光的相似模式。將GUS表達和EYFP螢光數據綜合到一起，證明Oslrk1基因主要在水稻不定根和側根的維管結構和中柱鞘細胞中表達，然而，不能排除在皮層和表皮細胞中的非常低的表達。Oslrk1基因的生理學研究實施例10激素對Oslrk1基因表達的差異調節。受體樣激酶被假定參與信號傳導事件，因為它們通過配體結合胞外結構域感知一個信號並將其通過絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域傳遞進入胞漿(ShiuandBleecker，2001)。為了得知可能的影響Oslrk1基因調節的因子，我們使用PlantCARE程序分析了Oslrk1的啟動子(1.5kb)中存在的順式作用元件(Lescotetal.，2002)。在Oslrkl的啟動子中位置-186、-657和-1190發現了在MeJA可誘導的基因中觀察到的三個TGAGC基序。除此之外，三個GA3可誘導的基序(P-box-CCTTxt)位於Oslrk1ORF的上遊-101、-206和-740bp處。另外，在位置-321、-601、-604、-855和-1135檢測到五個水楊酸可誘導的基序(TCA-elementcAGAAa/ga)。在Oslrk1啟動子中存在MeJA、GA和SA應答順式元件提示這些因子可能的調節作用。所述啟動子分析使得我們研究不同激素和化合物對Oslrk1轉錄的作用。將WT種子發芽七天，之後將幼苗轉入含有濃度為100μM的NAA、MeJA、GA3或ABA之一和SA(5mM)的培養基中培養24小時(材料和方法)。在用Oslrk1基因3′UTR作為探針的Northern印跡雜交中使用分離自未處理的和處理的幼苗的總RNA。用GA3和SA處理分別抑制Oslrk1基因表達2.5和3.3倍(圖8A)。另一方面，MeJA誘導Oslrk1轉錄物；當與對照對比時，雜交信號的強度增加3.2倍，而當幼苗用IAA和ABA處理時，未觀察到對轉錄的顯著作用。為了確認Oslrk1基因被MeJA隨時間誘導的水平，在另一系列實驗中，在激素處理後研究一個時程。生長七天的幼苗上噴灑100μM的MeJA溶液，並在1、2、4、6、8和12小時收穫。在整個時程中，Oslrk1表達被逐漸誘導，在8小時達到最大值，這是未處理的樣品的大約3倍，並在處理後穩定長達12小時(數據未示出)。實施例11在對糖的應答中Oslrk1基因轉錄物顯示差異表達。已知凝集素為特異性識別各種糖結構的碳水化合物結合蛋白(VijayanandChandra，1999)。由於OsLRK1具有一個豆科樣凝集素結構域，我們希望測試Oslrk1表達對不同糖的應答。在此研究中使用五種不同的糖葡萄糖(Glu)、蔗糖(Suc)、果糖(Fm)、Gal和Man，同時使用甘露醇作為滲透性對照(方法)。在分離自處理後的幼苗的總RNA上進行Northern印跡雜交。圖8C顯示在對這些單糖和Suc的應答中Oslrk1表達，其中所有測試的糖除Man之外均抑制該基因表達。Oslrk1的轉錄物水平在應答甘露醇中未改變提示這個基因不是通過滲透性調節的。實施例12Oslrk1突變體顯示對植物激素改變的應答。為了研究植物激素對Oslrk1突變體的作用，使種子在含有不同濃度的MeJA(1，5，and1011m)(圖9A)或GA3(0.5，1，5and10μm)的培養基中生長(數據未示出)，WT作為對照。測量不定根的數目和長度、側根的數目和苗長度。基於MeJA處理，在WT和突變體中苗長度均下降，但是在增加的濃度它們之間沒有顯著差異。然而，在WT幼苗和突變體中不定根的數目逐漸增加至5μM，而在10μM，MeJA的作用與在5μM時觀察到的作用相反(圖9B)。相反，在WT中不定根的長度基於增加的MeJA濃度(高至10μM)逐漸下降，在10μM長度減少大約75％，然而，Oslrk1突變體的不定根的長度不顯著降低。在WT幼苗中，側根的數目在5μM增加，在10μM減少。相反，在突變體中沒有觀察到側根數目顯著改變(圖9A和B)。這些結果提示Oslrk1突變體對於MeJA的應用較不敏感。另一方面，當幼苗在含有GA3的MS瓊脂中生長兩周時，與WT相比在突變體的行為方面除了不定根的長度之外沒有觀察到顯著差異。WT的不定根長度在濃度為10μM的GA3時增加50％，但是在突變體中沒有改變。實施例13Oslrk1突變體證明對半乳糖的超敏感性。上述不同的糖引起Oslrk1改變的表達使我們希望研究突變體對於這些單糖和蔗糖的應答。在含有不同濃度(從0.1％至1％)的Gal、Man、Glu、Fm與Suc的培養基中使WT和突變體種子發芽並生長，只含有Suc的培養基作為對照。在觀察中考慮下列參數苗長度、不定根的數目和長度、以及發芽率。用各種濃度的Glu、Fm和Man處理幼苗後在突變體和WT的行為方面沒有顯示顯著差異，但是當種子在含有Gal的培養基中發芽並生長時觀察到差異應答。除了這三種測試的糖之外，選擇Man作為一個示例，因為其抑制作用在WT和突變體的種子和幼苗中是相似的，如圖10A和B中所示。種子發芽受到Man的嚴重影響。在甘露糖濃度為0.5％時，WT和突變體植物的種子均不發芽。在甘露糖濃度為0.1％時，沒有觀察到任何測試的參數的明顯作用，但是在濃度為0.2％時，種子發芽率在WT和突變體中均降低至35％。另一方面，當在含有Gal的培養基上生長時，WT和突變體幼苗顯示統計學顯著的差異應答(圖10C和D)。與WT相比，不定根數目，以及特別是長度，在突變體中被Gal強烈抑制(圖10B和C)。在1.0％的Gal，在突變體中苗長度降低一半，而在WT幼苗中僅降低15％。在WT中不定根的數目或多或少是一樣的，但是在突變體中，它們急劇降低85％。除此之外，在WT和突變體中，不定根長度在1.0％Gal中均下降，而在突變體中有嚴重下降。另外，WT種子的發芽率降低至85％，而在突變體中其降低至30％。基於獲得的結果，我們的結論是突變體顯示對Gal的超敏感性。方法基因組DNA分離和Southern印跡雜交。從葉中分離5μg基因組DNA(Dellaportaetal.，1983)，用合適的限制酶(EcoRI，Pstl，PvuII)消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上進行分級分離並轉移到Hybond-N+膜(AmershamBiosciences，LittleChalfont，Bucks，UK)上。用地高辛(DIG)標記的探針在DIGeasyHyb溶液(RocheAppliedScience，Mannheim，Germany)中於42℃雜交DNA印跡。雜交後，將膜用2XSSC和0.1％SDS清洗兩次15min，然後用0.5XSSC和0.1％SDS在68℃清洗兩次15min。根據生產商說明用DIGWashandblockBuffer組以及化學發光底物CDP-Star(Roche)進行檢測。DIG標記的探針使用PCRDIGProbeSynthesisKit(Roche)和下列引物進行合成GUS探針GusF5』-CATTTGAAGCCGATGTACC-3』和GusRTATCGGTGTGAGCGTCGCAG-3』；BAR探針BarF5』-CATCAGATCTCGGTGACG』-3和BarR5』-TCGTCAACCACTACATCG-3』；OsLRk1的3UTRLRPK1F25』-GTCGCTGTTCG-TACTACG-3』和3UTRR55』-AGGATCGAACGCAAAGAG-3』；凝集素探針FRT15』-CAACCCCCACCCTTTTCTCCA-3』和RRT25』-GGCCCGCCGAAGAGGTG-3』RNA分離和Northern印跡分析。RNA從處於不同發育階段的水稻植株的不同器官(10-14天的幼苗和生長2個月的植物的根、10-14天的幼苗、幼葉及成熟的葉、在開花階段和胼胝體的圓錐花序)中使用RNeasyPlantminikit(Qiagen，)分離。在1.2％變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離RNA(10μg)並轉移至Hybond-N+膜(Amersham)上。用地高辛(DIG)標記的探針在DIGEasyHyb溶液(Roche)中於50℃雜交膜。雜交後，將膜用2XSSC和0.1％SDS清洗兩次15min，然後用0.5XSSC和0.1％SDS在68℃清洗兩次15min。根據生產商說明用DIGWashandBlockBuffer組以及化學發光底物CDPStarTM(Roche)進行檢測。使用DIG標記的相應於Oslrk1的3』UTR和凝集素結構域的探針。為了控制RNA的量，相應於水稻Actin1基因的DIG探針使用下列引物進行合成414F5』-CTCTCAACCCCAAGGCCAATC-3』和1113R5』-AGGGCAGCGGAAACGCTCAG-3』重複RT-PCR和Northern印跡至少三次，獲得相似的結果。使用QuantityONE4.5.0軟體在GeldocXR文件管理系統(Bio-RadLaboratories，Inc.，USA)中對雜交信號強度進行定量。將實際表達水平計算為特異信號(Oslrk13′UTR探針)的強度與陽性對照信號(水稻Actl)強度的比值。RT-PCR分析通過使用提取自生長14天的幼苗的根的總RNA用OnestepRT-PCR試劑盒(Qiagen)進行的RT-PCR擴增長度為2701bp的Oslrk1cDNA(GenBank登錄號AY663848)。所述PCR反應在PTC-100HB-96熱循環儀(MJResearchInc.，Watertown，MA，USA)上在以下條件下進行50℃30min，95℃15min，之後94℃40sec、58℃40sec、72℃3min，共35個循環，使用下列引物5UTR-F75』-TTTCGTGGCCAACTCCT-3』，5UTR-F65』-CCCCTTGCTACATCACC-3』和3UTR-R55』-AGGATCGAACGCAAAGAG-3』。對於表達研究，使用Northern雜交中使用的總RNA進行RT-PCR。使用上述相應於水稻Actin1的引物(414F和113R)作為內部對照。對於使用cDNA文庫的PCR，使用特異於Oslrk1的3』UTR的引物以獲得長度為500bp的擴增產物。Oslrk1突變體的生理學研究植物生長條件。在細胞培養容器(PhytatrayIISigmacellculture，USA)中，表面消毒的水稻種子在含有1％Suc的0.8％瓊脂MS培養基(MurashigeandSkoogmedium，Sigma.，St.LouisMO，USA)上發芽並生長2周，光照周期為16/8小時。用於各種處理的所有化學物質均購於Sigma。用激素和糖處理WT幼苗。將生長兩周的WT幼苗轉移至含有100μM不同激素和5mM水楊酸的MS培養基上，所述激素如吲哚3-乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)、或赤黴酸(GA3)，在正常日/光條件下生長24小時。從幼苗的根和完整幼苗提取總RNA。用生長兩周的幼苗在噴灑100μMMeJA後進行對MeJA作用的時程表達研究，並純化得自在不同時間間隔(0h、1h、2hrs、4hrs、6hrs、8hrs和12hrs)收穫的幼苗的總RNA。為了研究不同糖對Oslrk1轉錄物的作用，將表面消毒的WT種子在含有0.8％瓊脂但不含有蔗糖的MS培養基上在黑暗條件下發芽1周。之後，將幼苗轉移至含有175mM不同糖(包括蔗糖、D(+)葡萄糖、β-D(-)果糖、D(+/-異構體混和物)甘露糖、D(+)半乳糖)的MS培養基並在正常日/光條件下溫育48小時。WT和突變體種子在含有半乳糖/甘露糖的培養基中的萌發。WT和突變體種子分別在含有0.8％瓊脂和1％蔗糖的MS培養基上發芽。另外，以不同濃度(0.1、0.2、0.5、和1.0％)加入D(+)半乳糖/D(+/-)甘露糖和對照(含有1％蔗糖的MS)。在發芽後14天，記錄觀察到的不定根數目和長度(cm)、苗長度(cm)和發芽率(％)。WT和突變體幼苗在含有MeJA的培養基中的生長WT和突變體幼苗在含有不同濃度的MeJA(1μM、5μM、和10μM)的MS培養基(1％Suc)中發芽並生長兩周。對照中不加入MeJA。測量不定根的數目和長度(cm)以及側根數目。啟動子Oslrk1::gusA和啟動子Oslrk1::eyfp構建體。產生含有與gusA或eyfp基因融合的Oslrk1啟動子(1.5Kb)的兩個構建體。首先基於在Oslrk1的ATG上遊大約2kb處發現的另一個基因的終止密碼子而選擇一段1.5kb長的上遊區域。其次，我們使用PlantCARE程序(Lescot，etal.，2002)和用於檢索順式調節元件的資料庫在Oslrk1的ATG密碼子上遊的不同區域檢索了順式調節元件，並且發現在1.5kb和2kb的序列長度上存在相同一組元件，但是元件的數目是不同的。由於所述1.5kb區域包含至少在資料庫中是可用的全部調節元件，我們擴增了這個區域並將其用於啟動子-報導基因融合構建體。相應於Oslrk1啟動子的一個片段(1kb)在PCR中使用提取和純化自WT幼苗的葉的基因組DNA(100ng)和下列引物擴增相應於Oslrk1基因的啟動子序列的PromOslrk1F(CATTGCTTGGTCATTGG)和PromOslrk1R(AGGTCTGCGAGGAGTT)。PCR在50μl含有1XPCR緩衝液、1.5mMMgCl、200μM每一種dNTP和1.5UHotStarTaq-聚合酶(5U/μl)(Qiagen，)的體系中進行。循環程序包括95℃15min，94℃40sec.，58℃40sec.，72℃1min，30個循環。擴增的片段從1％瓊脂糖凝膠中純化並使用pGEM-TEasyVectorSystemI(Promega，Madison，WI，USA，Cat.NA1360)亞克隆進pGEM-TEasy載體中。pGEM-TEasy載體中的啟動子Oslrk1用NcoI和SalI限制酶切割，然後，相應於Oslrk1啟動子的1.4kb片段從凝膠中純化並直接用於使用同樣的限制酶消化而克隆進pCAMBIA1301載體(CAMBIA)中(啟動子Oslrk1::gusA)。連接使用RapidDNALigationKit(Roche)在4℃過夜進行。pCAMBIA1301中的PromOslrk1::gusA構建體用XbaI和NcoI限制酶消化，相應於1.4kb的片段用相同的限制酶切割而克隆進含有eyfp的構建體pSSZ32(Kolesniket.al.，2004)中(Oslrk1啟動子::eyfp)。兩個構建體均通過農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化而轉化進水稻胼胝體中(Hieietal.，1994)；選擇並再生轉基因胼胝體。GUS染色分析和共焦顯微術。對於GUS表達研究，將在不同發育階段的水稻植株的不同器官收集於GUS染色液中並在37℃溫育。然後用70％乙醇置換染色液以除去葉綠素成分，之後在LEICAMZ12顯微鏡(LiecaMicrosystems，NuBlochGmbH，Heidelberger)下對染色的組織進行顯微觀察。為了了解解剖學細節，將染色的根浸潤、包埋、並用LEICAHISTORESINEmbeddingKit，(LeicaMicrosystems)根據生產商手冊進行封片。封片的樣品使用三角玻璃刀(后角4°-7°)在可收縮的機動切片機LEICARM2165(Leicamicrosystems)上進行切片，並在NikonEclipse80i顯微鏡下觀察。使用LSMZiess共焦顯微鏡(Model510META)在488nm波長分析攜帶啟動子Oslrk1::eYFP構建體的轉基因植物中的EYFP表達。用ZeissLSMImageBrowser3，2，0，70版本成像。統計學分析對列於表2的參數進行t-檢驗並計算概率值(pValue)。通過雙向方差分析(two-wayAnalysisofVariance，ANOVA)進行WT和突變體行為特徵對於升高的MeJA(圖9)和甘露糖和半乳糖(圖10)的濃度產生的應答的統計學測試。這個測試用於研究對於兩種處理(突變體和野生型)，模式的改變中的差異，其中我們分析並計算了相互作用效應的pValue。我們還進行了GeneralLinearModelANOVA以研究對於兩種處理，模式改變的類型。討論一些報導已經顯示了凝集素樣受體激酶由多基因家族編碼。在擬南芥中已經描述了10個凝集素樣激酶(Herveetal.，1999)並預測了42個基因(Barreetal.，2002；Navarro-Gochicoaetal.，2003)；在蒺藜苜蓿中報導了至少9個LRK(Navarro-Gochicoaetal.，2003)；在黑楊中通過Southern雜交證實了在基因組中存在幾個LRK同系物(Nishiguchietal，2002)。我們還通過在NCBI資料庫中進行的ClustalW和BLASTNP同源性檢索顯示了Oslrk1基因屬於一個包括至少64個成員的多基因家族。它們分布於不同的染色體上，形成兩至三個基因的簇(cluster)。RLK的成簇事件在水稻中被描述，其中超過42％的基因被發現於串聯重複中(Shiuetal.，2004)。鼠耳芥屬中公開了相似的RLK的串聯組織(34％；Shiuetal.，2001)，但是特別地在水稻中，RLK串聯重複的程度高於在鼠耳芥屬中。水稻LRK在蛋白質水平具有23-75％之間的同源性。我們鑑別了一個在Oslrk1最接近的同系物Oslrk2中具有Ds插入的突變體品系。仔細觀察Oslrk2突變體表型沒有顯示與WT相比在根和地上部分的特徵中有任何變化，儘管其是一個無效突變(因為所述插入位於該基因的第一個外顯子內)。我們沒有能夠證實存在Oslrk2的表達，儘管在KOME資料庫中發現得自未成熟的種子的相應cDNA在序列中99％匹配。在純合突變體中詳細分析了種子產量，但是與WT相比沒有觀察到差異(數據未示出)。在Oslrk2突變體中缺少明顯表型可能提示這個基因在正常條件下是功能上冗餘的。凝集素樣受體激酶屬於具有N末端配體結合凝集素樣胞外結構域、跨膜結構域和胞質激酶結構域的一類受體激酶。這一類受體激酶在擬南芥、蒺藜苜蓿和黑楊中被報導(Herveetal.，1996，1999；Nishiguchietal.，2002；Navarro-Gochicoaetal.，2003)。在RLK中，通過被識別的配體的特異性確定了胞外結構域。OsLRK1具有豆科樣凝集素作為識別結構域，如在其他豆科植物中所示出的那樣(VanDammeetal.，1998)。豆科凝集素是凝集素中獨特的一組，因為其含有二價陽離子結合位點。OsLRK1具有用於在其凝集素結構域內結合Mn2+和Ca2+的保守殘基(圖5)。這些陽離子對於凝集素的碳水化合物結合活性是必需的(SharonandLis，2002)。在所有豆科凝集素中均發現參與單糖結合的天冬氨酸。這個殘基在OsLRK1中被穀氨酸取代，其在完整胺基酸序列中相應於Glu135(圖4)，在排列對比的胺基酸序列中相應於Glu88(圖5)。除了蒺藜苜蓿凝集素激酶(MtLecRK1；1)外，在所有凝集素樣激酶中均觀察到相似的由穀氨酸(OsLRK1，PnLRK)或組氨酸(AthLecRK1)殘基進行的取代。在OsLRK1蛋白中也發現了相應於凝集素結構域的推斷的序列中的Gly112、Asn124、Gly227、Ala230、參與糖識別的其他保守殘基。除了凝集素結構域之外，OsLRK1還在OsLRK1的C末端具有很保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。鑽天楊(PnLRK；Nishiguchietal.，2002)和鼠耳芥屬(AtLecRK2；Heet.al.，2004)的凝集素受體激酶示出能夠在激酶結構域的保守絲氨酸/蘇氨酸殘基處進行自身磷酸化。在OsLRK1的激酶結構域中也發現了相似的磷酸化基序(DIKPS和GTLGYIAPE)。通過RT-PCR、cDNA文庫篩選和Northern印跡進行的Oslrk1的表達分析證明Oslrk1主要在根中表達，與得自蒺藜苜蓿的MtLecl；l、MtLec7；2和MtLec7；3(Navarro-Gochicoaetal.，2003)、得自鑽天楊的PnLRK1(Nishiguchietal.，2002)以及得自鼠耳芥屬的AtlecRK2(Heetal.，2004)相似。我們已經通過RT-PCR和Northern印跡雜交證明了Oslrk1主要在幼苗和成熟植物的根中表達。在NCBIEST資料庫中進行的BLASTN同源性檢索揭示了衍生自生長一周的幼苗的水稻根(AccessionNBE039888)和衍生自麵包麥的根(AccessionNCD87254)的EST序列和Oslrk1的5′相同，這提供了這個基因在根中表達的另外的證據。另外，對攜帶Oslrk1啟動子::gusA或eyfp的轉基因植物的分析證實了Oslrk1主要在根的維管結構中表達。OsLRK1在維管結構中表達可能提示這個基因參與維管結構發育或參與碳或養料從源器官向根的運輸。WT和突變體的根的橫切未顯示維管組織結構中的差異，這提示OsLRK1可能不是在維管結構發育中具有作用。另一方面，突變體植物顯示擴張的根系，這提示碳(養料)從源器官向根細胞的積累可能通過敲除OsLRK1而增加，這導致根系擴張。作為一個推定的跨膜蛋白，OsLRK1可能感受來自質外體的信號並將其傳送至細胞質中。RLK由各種生物因子和生物脅迫因子調節，其可能參與信號轉導途徑(McCarthyandChory，2000)。鼠耳芥屬AtlecRK-al和鑽天楊PnLRK被受傷所誘導(Riouetal.，2002；Nishiguchietal.，2002)，而AtlecRK2被鹽誘導(Heetal.，2004)。然而，用不同激素如ABA和JA和SA處理黑楊的葉對於PnLRK基因的表達沒有影響(Nishiguchietal.，2002)。這些報導和在Oslrk1啟動子中存在的幾種MeJA、GA3和SA應答性順式作用元件使我們想要研究不同激素(IAA、GA3、MeJA和ABA)和SA對Oslrk1基因的調節。Oslrk1基因差異調節在對激素和SA的應答中得到證明。在對MeJA的應答中表達水平升高，在對GA3和SA的應答中被抑制。儘管在根中MeJA的水平相對較低(Bergeretal.，1996)，但是在鼠耳芥屬中顯示MeJA強烈抑制根生長(Staswicketal.，1992，Bergeretal.，1996，Uedaetal.，1995)。相似地，在水稻中，不定根的發育也被MeJA在高於3μM的濃度所抑制(Moonsetal.，1997)；然而，所述根抑制的分子基礎仍不清楚。Oslrk1轉錄物被MeJA誘導和突變體對於MeJA處理較不敏感的事實提示在調節根生長中OsLRK1應答或介導MeJA信號傳導。與MeJA相反，GA3抑制Oslrk1轉錄物。GA3已知為根生長促進因子，其通過抑制RGA和GAI的轉錄而介導植物生長素在促進根生長中的作用(FuandHarberd，2003)。Oslrk1轉錄物被MeJA上調(根生長抑制劑)而被GA3抑制(根生長促進劑)的事實與設想的Oslrk1作為根生長抑制劑的功能相一致。另外，GA3處理時，與WT相比突變體中的不定根的長度改變較小，這可能提示OsLRK1在調節根長度時在介導來自GA3的信號中的作用。植物中激素和脅迫信號之間的聯繫(crosstalk)是當前了解植物對非生物刺激的應答和了解發育過程中的調節的一個問題。在鼠耳芥中，鹽誘導的AtlecRK2示出被乙烯正調節(Heetal.，2004)，而在水稻根中鹽誘導性SalT基因在對JA的應答中累積(Moonsetal.，1997)。LRK的生理學作用仍不清楚。LRK中的豆科樣凝集素結構域可能參與碳水化合物結合的假設仍未得到證明，另外，大多數LRK中的參與糖結合的關鍵胺基酸的取代引起這樣的假設凝集素結構域幾乎不能識別單糖(Herveetal.，1996，1999)。在Oslrk1中，在其他豆科凝集素中參與糖結合的關鍵胺基酸中的大多數是保守的，除了Asp88之外。在鼠耳芥屬中報導了寡聚糖對Athlecrk-al轉錄物的激活(Riouetal.，2002)。我們也已經示出Oslrk1轉錄物被各種糖除Man之外所抑制。甘露醇不能提高Oslrk1的轉錄物水平的事實提示這個基因不是滲透調節的。儘管Oslrk1表達被不同的碳水化合物差異調節，但是突變體僅在對Gal的應答中顯示改變的應答。在植物特別是單子葉植物中，Gal是半乳糖脂、細胞壁聚糖和糖蛋白的一種重要組分(Dormannnetal.，1998)。Gal在鼠耳芥屬(DormannandBenning，1998)、大麥(Farraretal.，1994)、燕麥(CheungandCleland，1991)、番茄(Hugesetal.，1974)、小麥(Knudson，1917)、玉米和其他物種(Yamamotoetal.，1988)中顯示是根系擴張的一種非常強的抑制劑。在大麥中，證實了Gal對根細胞擴展的抑制作用是由於碳進入生長中的器官的輸入降低(Thorpeetal.，1999)。與WT相比，Oslrk1突變體在對Gal的應答中顯示超敏感性(圖10)，這提示OsLRK1在Gal信號傳導中具有一定作用以使其在根生長抑制中的作用最小化。基於我們在Oslrk1表達分析和突變體生理學研究上的結果，我們提出了OsLRK1在水稻中的一個模型，如圖11所示。Oslrk1作用為根生長的一種負調節物，因為這個基因功能的喪失導致擴張的根系。GA3已經被示出促進根生長，並且另一方面，MeJA、鹽脅迫和Gal已經被示出抑制根生長。GA3抑制Oslrk1基因表達提示這個基因可能參與根生長抑制。在WT中Oslrk1轉錄物的誘導和突變體對MeJA的降低的敏感性顯示OsLRK1直接或間接感知來自MeJA的信號並抑制根生長。如表達研究示出的Gal對Oslrk1轉錄物的抑制和突變體對Gal的超敏感性提示OsLRK1參與對半乳糖的應答並抑制根系擴張。簡而言之，基於我們的結果，我們設想了OsLRK1在根生長的調節中作為根系擴張的負調節物和植物激素與糖信號傳導的介導物的功能。參考文獻Barre，A.，Herve，C.，Lescure，B.，andRouge，P.(2002).lectin-receptorkinasesinplants.Crit.Rev.plantSci.24，379-399.Becraft，P.W.(2002).Receptorkinasesignallinginplantdevelopment.Annu.Rev.CellDev.Biol.18，163-192.Berger，S.，Bell，E.，andMullet，J.E.(1996).Twomethyljasmonate-insensitivemutantsshowalteredexpressionofAtVspinresponsetomethyljasmonateandwounding.plantPhysiol.111，525-31.CheungS.P.，andCleland，R.E.(1991).galactoseinhibitsauxin-inducedgrowthofAvenacoleoptilesbytwomechanisms.plantCellPhysiol.32，1015-1019.Chin，H.G.，Choe，M.S.，Lee，andS.H.etal.(1999).MolecularanalysisofriceplantsharboringAc/Dstransposableelement-mediatedgenetrappingsystem.plantJ.19.615-623.Dellaporta，S.L.，Wood，J.，andHicks，J.B.(1983).AplantDNAminipreparationversion2.plantMol.Biol.Rep.14，713-726.Dormann，P.，andBenning，C.(1998).TheroleofUDP-glucoseepimeraseincarbohydratemetabolismofArabidopsis.plantJ.13，641-52.Farrar，J.F.，Minchin，P.E.H.，andThorpe，M.R.(1994).Carbonimportinbarleyrootsstimulationbygalactose.JournalExper.Bot.45，17-22.Fu，X.，andHarberd，N.P.(2003).AuxinpromotesArabidopsisrootgrowthbymodulatinggibberellinresponse.Nature421，740-743.Hardie，G.D.，Carling，D.，andCarlson，M.(1998).TheAMP-activated/SNF1proteinkinasesubfamilyMetabolicSensorsoftheeukarioticcell？Annu.Rev.Biochem.67，821-855.He，X.-J.，Zhang，Z.-G.，Yan，D.-Q.，andChen.，S.-Y.(2004).Asaltresponsivereceptor-likekinasegeneregulatedbytheethylenesignalingpathwayencodesaplasmamembraneserine/threoninekinase.Theor.Appl.Genet.Apr6(online)Herve，C.，Dabos，P.，Galaud，J.P.，Rouge，P.，andLescureB.(1996)CharacterizationofanArabidopsisthalianagenethatdefinesanewclassofputativeplantreceptorkinaseswithanextracellularlectin-likedomain.J.Mol.Biol.258，778-788.Herve，C.，Serres，J.，Dabos，P.，Canut，H.，Barre，A.，Rouge，P.，andLescureB.(1999)CharacterizationoftheArabidopsislecRK-agenesmembersofasuperfamilyencodingputativereceptorswithanextracellulardomainhomologoustolegumelectin.plantMolBiol.39，671-82.Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.，andKumas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中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)相應於SEQIDNO1所示的核苷酸序列的反義核苷酸序列；和(b)相應於編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的反義核苷酸序列；以及將所述細胞培養為植物。14.權利要求13的方法，其中所述植物是單子葉植物。15.權利要求13的方法，其中所述增強的根生長包括擴張的根系。16.權利要求15的方法，其中所述擴張的根系包括更多的不定根和/或更長的側根。17.一種轉化的植物細胞，所述細胞具有穩定整合進其基因組的至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸；(b)包含編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸；和(c)包含相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸。18.一種轉基因植物，所述植物具有穩定整合進其基因組的至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸；(b)具有編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸；和(c)具有相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸。19.權利要求18的植物，其中所述植物是單子葉植物。20.權利要求19的植物的種子。21.一種用於在植物中調節發育的方法，所述方法包括用至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列的核酸；(b)包含編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸；和(c)包含相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列的核酸；以及將所述細胞培養為植物。22.權利要求21的方法，其中所述植物是單子葉植物。23.權利要求21的方法，其中所述發育包括根生長。24.權利要求21的方法，其中所述調節包括在所述植物的一個地上部分導入修飾。25.一種核苷酸序列，其與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽。26.一種用於在植物中負調節根系擴張的方法，所述方法包括用至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；和(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；以及將所述細胞培養為植物。27.一種用於在植物中促進根系擴張的方法，所述方法包括用至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列轉化植物細胞，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)相應於與SEQIDNO1所示的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列的反義核苷酸序列；和(b)相應於與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列的反義核苷酸序列；以及將所述細胞培養為植物。28.一種轉化的植物細胞，所述細胞具有穩定整合進其基因組的至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；和(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。29.一種轉基因植物，所述植物具有穩定整合進其基因組的至少一種與在植物細胞中控制表達的啟動子可操縱地連接的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自如下一組(a)與SEQIDNO1所示的全長核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述同源核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；(b)與編碼SEQIDNO2的胺基酸序列的核苷酸序列具有大於50％的同源性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼保留該全長序列的生物學活性的多肽；和(c)相應於(a)或(b)的核苷酸序列的反義核苷酸序列。30.權利要求29的植物的種子。31.一種轉基因植物，其基因組包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包括一個Ds插入，並且所述破壞導致該轉基因植物與野生型植物相比顯示增強的根生長。32.權利要求31的轉基因植物，其中所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。33.權利要求31的轉基因植物，其中所述增強的根生長包括擴張的根系。34.權利要求33的轉基因植物，其中所述擴張的根系包括更多的不定根或更長的側根。35.權利要求31的轉基因植物，其中所述轉基因植物在其地上部分顯示修飾，所述修飾選自由與野生型植物相比更大的葉、開花推遲、和更高的種子產量組成的一組。36.權利要求35的轉基因植物，其中所述更高的種子產量是與野生型植物相比大約高21％。37.權利要求31的轉基因植物，其中所述轉基因植物與野生型植物相比顯示對D-半乳糖的超敏感性。38.權利要求31的轉基因植物，其中所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。39.權利要求35的轉基因植物，其中所述開花與野生型植物相比推遲大約五天至大約七天。40.權利要求31的轉基因植物，其中所述轉基因植物當成熟時比在相似條件下生長的野生型植物高大約30％。41.權利要求31的轉基因植物，其中所述轉基因植物當成熟時比在相似條件下生長的野生型植物在圓錐花序中顯示大約多70％的分枝。42.權利要求31的轉基因植物，其中所述轉基因植物在幼苗期比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約2倍的苗長度。43.權利要求31的轉基因植物，其中所述植物在幼苗期比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約多56％的不定側根。44.權利要求31的轉基因植物，其中所述植物在幼苗期比在相似條件下生長的野生型植物顯示大約長74％的側根。45.包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的分離的核酸，其中所述基因包含位於第一個外顯子中的ATG密碼子下遊大約117bp處的Ds插入。46.權利要求31的植物的種子。47.一種在植物中增強根生長的方法，所述方法包括操作所述植物細胞的基因組使之包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入；以及將所述細胞培養為植物。48.權利要求47的方法，其中所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。49.權利要求47的方法，其中所述增強的根生長包括擴張的根系。50.權利要求49的方法，其中所述擴張的根系包括更多的不定根或更長的側根。51.權利要求47的方法，其中所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。52.一種修飾植物地上部分的方法，所述方法包括操作所述植物細胞的基因組使之包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入；以及將所述細胞培養為植物。53.權利要求52的方法，其中所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。54.權利要求52的方法，其中所述植物地上部分的修飾選自由與野生型植物相比更大的葉、開花推遲和更高的種子產量組成的一組。55.權利要求54的方法，其中所述更高的種子產量是與野生型植物相比大約高21％。56.一種增加植物對D-半乳糖的敏感性的方法，所述方法包括操作所述植物細胞的基因組使之包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包含Ds插入；以及將所述細胞培養為植物。57.權利要求56的方法，其中所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。58.權利要求56的方法，其中所述破壞是Oslrk1基因的完全敲除。59.權利要求31的轉基因植物，其中所述植物是單子葉植物。60.水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的分離的Ds插入突變體。61.權利要求60的Ds插入突變體，其中所述Ds插入位於Oslrk1基因第一個外顯子中的ATG密碼子下遊117bp處。62.一種在植物中增強根生長的方法，所述方法包括操作所述植物細胞的基因組使之包含水稻(Oryzasativa)凝集素樣受體激酶1(Oslrk1)基因的一個破壞，其中所述破壞包括Oslrk1基因的失活；以及將所述細胞培養為植物。63.權利要求62的方法，其中失活是由於基因轉錄物的降解所致。64.權利要求63的方法，其中所述降解通過miRNA、RNAi、或sRNA技術實現。全文摘要本發明涉及新基因Oslrk1，其參與植物發育，包括根系擴張。本發明還描述了影響該發育的方法，及包含所描述的序列的轉化的細胞及轉基因植物。文檔編號C12N9/00GK101031649SQ200580033415公開日2007年9月5日申請日期2005年10月1日優先權日2004年10月1日發明者塔季揚娜·科列斯尼克,瑞圖·巴拉,雷恩賈薩彌·拉馬莫奧提,拉馬錢德蘭·斯裡尼瓦桑申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司