一種植物耐鎘蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-10-09 12:36:44 2

專利名稱：一種植物耐鎘蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一個植物耐鎘相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及利 用該基因增強植物對鎘毒害耐受的方法。二、 背景技術重金屬汙染問題是當今世界所面臨的重要難題之一。由於人類對重金屬的開採、冶煉、 加工及商業製造活動日益增多，造成不少重金屬如鎘、鉛、汞、鈷等進入大氣、水、土壤中， 引起嚴重的環境汙染。重金屬，特別是鎘、鉛、汞、鉻等具有顯著的生物毒性。它們在水體 中不能被微生物降解，而只能發生各種形態相互轉化和分散、富集過程(即遷移)，並經過食 物鏈為人體攝取和積累。進入人體的重金屬，尤其是有害的重金屬，有的會在人體內積累和 濃縮，如果超過人體所能耐受的限度，可造成人體急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒等危害。 所以提高作物對重金屬的耐受和降低對重金屬的吸收已經成為關係民生的大事，已成為農業 生產和食品安全進一步研究的重點，倍受世界各國政治界和學術界的關注，也是當前生命科 學研究的熱點。擬南芥是一種模式植物，廣泛用於植物遺傳學、發育生物學和分子生物學等研究領域。 擬南芥的大多數基因在其它植物中都能找到，有關擬南芥的任何發現都能應用於其它植物 研究。因此，對擬南芥抗重金屬毒害分子生物學機制的研究對特定區域提高作物的產量和增 加食品安全性具有重要的理論與經濟意義。擬南芥基因組已完全測序，根據擬南芥測序數據 庫(www.arabidopsis.org)尋找和發現新的具有自主智慧財產權的功能基因是國際植物學研 究領域的熱點之一，也是不同國家之間科技競爭的焦點。擬南芥共有約l. 3億個鹼基對,2. 9 萬個基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術研究基因功能己成為一種有效的 方法。通過對突變體的研究，發現了一些與植物相關的耐受重金屬基因的功能，如力"7FJ， 濃屍'/Jt/W,^綴/縛。面對日益嚴重的環境汙染問題，尋找耐受重金屬並且能降低作物中重金屬含量的功能 基因並闡明其功能具有重要的理論及實踐意義。根據擬南芥資料庫公布的基因組序列， 爿"忍(16:0Delta9 Arabid叩sis desaturase 2; At2g31360)是一個低溫誘導表達增加的基因， 與藍細菌中的S —9醯基類脂去飽和酶和酵母和哺乳動物中的醯基輔酶A去飽和酶同源。申 請人發現鎘處理//"6^基因敲除植株表現為對鎘耐受，這表明該^A^基因涉及鎘耐受性的調 控。為此，我們研究了該基因功能，基因表達分析顯示，鎘處理可誘導鎘離子轉運蛋白Jt屍"/^基因轉錄水平顯著提高，這說明基因^^激失可以激活擬南芥中鎘離子轉運蛋白力^^/ 湖碼 基因的表達從而使擬南芥體內的鎘含量下降，進而表現為對鎘耐受。 三、發明內容本發明的目的是提供一種新的植物耐鎘及降低植物鎘吸收相關蛋白及其編碼基因。本發 明所提供的植物耐鎘及降低植物鎘吸收相關蛋白的編碼基因，名為^ 5^ (AT2G31360)，來源 於哥倫比亞野生型的擬南芥，其蛋白是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質(1) 序列表中的SEQ ID No: 2;(2) 將序列表中SEQ ID No: 2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物耐鎘相關的蛋白質。序列表中的序列2由307胺基酸殘基組成。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個胺基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加。^^i的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。 ZZ 5^的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(1) 序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列；(2) 編碼序列表中SEQ ID No: 2蛋白質序列的多核苷酸；(3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；(4) 與序列表中SEQ ID No: 1限定的DNA序列具有9(F。以上同源性、且編碼相同功能蛋 白質的DNA序列。序列表中的序列1由1440個鹼基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'端第58位至978位 鹼基，編碼序列SEQ ID No: 2的蛋白質。含有本發明力Z 5^的表達載體，細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。擴增^ 5"沖任 一片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。本發明的第二個目的是提供一種利用該基因增強植物耐鎘及降低植物中鎘含量的方法。本發明所提供的增強植物耐鎘及降低植物中鎘含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐 鎘及降低植物中鎘含量相關蛋白編碼基因的表達。抑制植物中的上述植物耐鎘相關蛋白編碼基因力"5^的表達可通過多種方法實現，如植物病 毒載體介導基因沉默的方法，反義核酸技術沉默基因的方法，siRNA介導的基因沉默方法 等。本發明抑制基因表達的方法並不限於上述幾種方法，只要能抑制^ 5^表達均可。利用任何一種植物基因敲除技術,將此基因敲除(或沉默)後，植物表現為耐鎘。 本發明的^^邀因或其反義核酸在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可 加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩 選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等) 或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉 植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜 宿等。攜帶有本發明^^邀因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直 接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將 轉化的植物經組織培育成植株。本發明的植物耐鎘相關蛋白及其編碼基可為農作物耐鎘育種和降低農作物中的鎘積 累提供基因與技術的支持(保障)。四

圖1為aofei1-厶野生型植株豎立培養，直接點種於含有或不含有鎘的培養基上在正常 光照培養條件下豎直20天的比較照片(A 1/2MS;B 50 CdCl2;C 75 hM CdCl2;D根長；E鮮重)。圖2為"A2-7、野生型植株豎立培養，直接點種於含有或不含有鎘的培養基上在正常光 照培養條件下豎直30天的比較照片(A 1/2MS; B 50 ^MCdCl2)。圖3為^/W-7、野生型植株在50pM鎘處理條件下鎘含量的比較。 圖4為a必2-7、野生型植株在MS和5(HiM鎘處理條件下相關基因的表達水平。五具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。 下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。 實施例1、 ADS2及其編碼基因的獲得以野生型哥倫比亞生態型擬南芥的幼苗約50-100mg為材料，用Trizol提取其總RNA，用紫 外分光光度計檢測RNA濃度。按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas 公司)試劑盒說明書，以提取的總RNA為模板，合成cDNA第一條鏈。以提取出來的第一條 鏈cDNA為模板，進行如下PCR反應20 ul反應體系，內含10XPCR緩衝液2 ul， dNTPs (lOmM)混合物0.4 ul，引物1和引物2各2 yl， Tag酶(5U/ixl) 0.2 ul，其餘加雙蒸水至20 ul。其中，引物l: F5' AACAAAAAAGAGAGAGAGAACCTA 3';引物2: 5' TCTTTTGTAATTTTCTTTTTCATC 3'。在Life Express基因擴增儀上擴增先94。C預變性3min，再94°C 30sec， 54。C30sec， 72°C60 sec,共計30個循環，最後72 。C延伸10min, 將獲得的PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳。將PCR得到的cDNA片段連接於pGEM-T載體， 得到含有目的片段的載體pT-AOS^進行測序鑑定，結果表明PCR得到的cDNA片段具有序列 表中序列SEQ ID No: 1的DNA序列，為力"5^的cDNA基因，由1440個鹼基組成，其編碼 序列為自5'端第58位鹼基到第978位鹼基，編碼具有序列表中序列SEQ ID No: 2的氨基 酸殘基序列的蛋白質。實施例2、培育耐鎘的擬南芥1、 //Z^iS因被敲除的純合突變體^ 5^的獲得從美國擬南芥種質資源中心獲得了 T-DNA插入突變體種子(SALK—079963; http:〃www. arabidopsis. org/servlets/Tair0bject" type二germplasm&id二4626493 ) 為 鑑定力Z 5^基因被敲除的純合突變體，播種SALK一079963種子並提取單株植株DNA，以此為 模板，用3對引物對其進行PCR擴增。其中，引物1 LBbl: 5' -GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3, 引物 2 : ADS2-LP 5， -TCATTCTCTTGCTCTCTTGGC -3，， 引物 3 : ADS2-RP 5， -GAGCTGTCTCCAATTCATGTG -3，。根據PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果，獲得^ 5^基因 被敲除的純合突變體a&2-厶從表型來看，該突變體與野生型(WT)植株在正常生長條件下 沒有顯著差異(圖1A)，用該基因的cDNA序列構建35S強動子的過表達載體並轉化突變體， 該轉基因植株形態上恢復了野生型表型，在鎘脅迫條件下也恢復了野生型植株症狀，證實了 該基因確實控制鎘耐受性。2、 3C^iS 與野生型植株的耐鎘性比較將野生型(町)與3血^-/同時播種於直徑為90111111的培養皿中，培養基為加鎘和不加鎘的固體培養基，豎立培養或者水平培養置於22'C恆溫光照(光周期為16小時光照，8小時黑暗) 培養。培養30天後，可以觀察到在正常培養基上生長的WT和aAiS 在表型、鮮重、根長方面均無顯著差異。在植株直接點種或者移栽後在含有鎘的培養基上培養，3C/Si^7都表現出明顯的鎘耐受的性狀。在50uMCdCU 75uMCdCl2脅迫下，ao^-/的鮮重和根長明顯比WT高。 上述結果表明，3^/^-7較WT明顯耐受鎘毒害。3、 <30^^-/與野生型植株的鎘積累比較對鎘處理的WT和ao^W植株體內的鎘含量進行測定，發現a^^-4直株體內鎘積累明顯低 於WT，表明3血2-4直株對鎘積累明顯低於WT植株。4、 鎘脅迫下ac/^-7與野生型植株相關基因表達比較對鎘處理的WT和a血2-7植株體內的相關基因表達水平進行測定，發現a^2-7植株體內A屍D/W基因明顯高於WT，而其他基因^rM 和A屍Ci 7表達沒有明顯差異，表明ac/s2-/ 植株對鎘積累可能與^PZ)i^基因的激活有關。_序列表序列表1 SEQ ID No:l (Nucleotide Sequence, Sequence Length (bp) - 1440)1 ATTAACAAAA AAGAGAGAGA GAACCTAAAA AGAAGAGAAG AGAAAGAGAG51ATCCGAAATGTCGGTGACATCAACGGTGGAGGAGAACCACCAGAAAAATC101CATCAACGCCGGCGGCGGTGGAGGAGAAGAAGAAGAGGAGATGGGTGTTT151TGGGATAGAAGGTGGAGGAGATTAGATTATGTGAAATTCTCAGCTTCTTT201CACTGTTCATTCTCTTGCTCTCTTGGCTCCGTTTTATTTCACTTGGTCGG251CTCTTTGGGTTACGTTTTTGTTTTACACCATCGGTGGTCTTGGTATCACC301GTCTCTTATCATCGCAACTTGGCTCACCGGAGTTTCAAAGTCCCTAAATG351GCTTGAGTATCTCTTAGCCTATTGTGCCCTTCTCGCTATTCAGGGAGATC401CGATTGATTGGGTGAGTACACATCGTTACCATCACCAGTTCACGGATTCA451GAACGTGATCCACATAGTCCTAAGGAAGGTTTTTGGTTTAGTCATCTTCT501TTGGATCTATGACTCTGCCTATCTTGTTTCAAAGTGTGGAAGAAGAGCAA551ACGTGGAGGATTTGAAGAGGCAATGGTTTTATAGGTTTCTTCAGAAAACA601GTGCTATTTCACATTTTAGGATTGGGTTTCTTTCTCTTCTACCTTGGTGG651CATGTCCTTCGTTACTTGGGGAATGGGGGTAGGAGCAGCATTGGAAGTGC701ACGTGACTTGCCTCATAAATTCACTCTGCCATATTTGGGGCACTCGAACT751TGGAAGACCAATGACACTTCTCGTAATGTTTGGTGGTTATCGGTATTTTC801ATTTGGAGAGAGTTGGCACAACAATCATCATGCGTTCGAGTCATCGGCTA851GACAAGGACTTGAATGGTGGCAAATAGACATTTCGTGGTACATTGTTCGG901TTTTTCGAAATTATCGGTTTAGCGACCGATGTGAAAGTGCCAACGGAGGC951TCAACGACGTCGTATGGCTATAGTTCGTTGATGGAAATTGCGGGAAGAGC1001ATAGAAAAAGGGATCTATTCTATGTAATTAGAATAATTTCTAATCCTAAA1051AGAGAGTTATTGTTTTATTTTCTTTATTACTACTTTTGAAGTTTTGGGTT1101AACGCAAAGGACGTTTCCGATGTGTTTTGGTGTTGGACCAAGTTGATTAA1151GATATTTGTCGTAATTGGTACTTATATATAAAATCTTAGTGGGGACAATT1201AATACGTTAATTACGGTCTCTATGTGAGACTTATTTTAATATATAGACTT1251CTCTAAAATATCTAATCGTCGTTTACGATAAAAGAAGAAAAGCAAAAAGA1301 CATAAGACTT GTTCAAAAGG AGATGATATT GGTTGGTTGT TGGAGTTTAT 1351 AGCCACATAT AAAATTACCT TTTTTATGTG ATTTTTTGTG ATCATTTCAA 1401 TAGATATATA TAAAGATGAA AAAGAAAATT ACAAAAGAAG序列表2 SEQ ID No: 2MetSerValThrSerThrValGluGluAsnHisGinLysAsnPro15SerThrProAlaAlaValGluGluLysLysLysArgArgTrpVal30PheT;cpAspArgArgTrpArgArgEeuAspTyrValLysPheSer45AlaSerPheThrValHisSerLeuAlaLeuLeuAlaProPheTyr60PheThrTrpSerAlaLeuTrpValThrPheLeuPheTyrThrlie75GlyGlyLeuGlylieThrValSerTyrHisArgAsnLeuAlaHis90ArgSerPheLysValProLysT;rpLeuGluTyrLeuLeuAlaTyr105CysAlaLeuLeuAlalieGinGlyAspProlieAspTrpValSer120ThrHisArgTyrHisHisGinPheThrAspSerGluArgAspPro135HisSerProLysGluGlyPheTrpPheSerHis!LeuLeuTrplie150TyrAspSerAlaTyr!LeuValSerLysCysGlyArgArgAlaAsn165ValGluAspLeuLysArgGinTrpPheTyrArgPheLeuGinLys180ThrVallieuPheHis工leEeuGlyI euGlyPhePheLeuPheTyr195LeuGlyGlyMetSerPheValThrTrpGlyMetGlyValGlyAla210AlaLeuGluValHisValThrCysLeulieAsnSerLeuCysHis225lieTrpGlyThrArgThrTrpLysThrAsnAspThrSerArgAsn240ValTrpTrpLeuSerValPheSerPheGlyGluSerTrpHisAsn255AsnHisHisAlaPheGluSerSerAlaArgGinGlyLeuGluTrp270TrpGinlieAsplieSerTrpTyrlieValArgPhePheGlulie285lieGlyLeuAlaThrAspValLysValProThrGluAlaGinArg雄ArgArgMetAlalieValArg
權利要求
1、一種植物耐鎘蛋白，其特徵在於胺基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No2所示。
2、 根據權利要求l所述的蛋白，其特徵在於SEQ ID No: 2的胺基酸殘基序列包括不 超過10個胺基酸殘基的取代和/或缺少和/或添加。
3、 由權利要求1所述的植物耐寒與抗旱蛋白的編碼基因，其特徵在於選自下列核苷 酸下列之一(1) 序列表中SEQ ID No: 1的DNA序列;(2) 編碼序列表中SEQ ID No: 2蛋白質序列的多核苷酸。
4、 根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於在高嚴謹條件下與SEQ ID No: l限定 的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、 根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於與SEQ ID No: l限定的DNA序列具有 90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
6、 由權利要求3所述的編碼基因增強植物耐鎘與降低鎘積累的方法，其特徵在於是抑 制植物中耐鎘與降低鎘積累相關蛋白編碼基因的表達。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於抑制植物中耐鎘與降低鎘積累相關蛋白 編碼基因表達的方法包括植物病毒載體介導基因沉默的方法，或者反義核酸技術沉默基因的 方法，或者siRNA介導的基因沉默方法。
全文摘要
本發明公開了一種植物耐鎘蛋白及其編碼基因與應用。植物耐鎘蛋白是序列表中SEQ ID No2，其編碼基因是序列表中SEQ ID No1DNA序列。本發明利用該耐鎘蛋白的編碼基因增強植物對鎘的耐受性，為農作物耐鎘育種和降低農作物的鎘積累提供基因與技術支持。
文檔編號C12N15/82GK101555276SQ20091011684
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月25日 優先權日2009年5月25日 公開號200910116845.發明者孫澤華, 辰 文, 曹樹青, 力 江, 洋 汪, 簡紅勇, 袁懷波, 邊小會, 陳正義 申請人:合肥工業大學 被以下專利引用 (1),