狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)減毒活疫苗候選株的構建與篩選的製作方法

2023-10-09 08:36:24

專利名稱：狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)減毒活疫苗候選株的構建與篩選的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組病毒疫苗領域，更具體地，本發明涉及一種狂犬病毒減毒疫苗突 變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點由精氨酸突變為穀氨酸。本發明還涉及該狂犬病 毒減毒疫苗突變株的製備方法和應用。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種死亡率極高的人獸共患傳染病[1]。近兩年我國 人狂犬病的發病和死亡數均超過3000人/年，疫情呈明顯上升態勢，對人類健康和社會安 定構成極大威脅[2』3]。流行病學調查表明，幾乎所有的溫血動物對狂犬病病毒都易感。野生 動物是狂犬病病毒的自然儲存宿主，犬、貓等家養動物是狂犬病的主要傳播者。因此，防控 人狂犬病的關鍵應從源頭上控制動物狂犬病M。疫苗接種是控制狂犬病的有效手段。目前，世界上預防狂犬病最廣泛使用的是滅 活的狂犬病疫苗。這類疫苗儘管有效，但需要接種多針才能誘導足夠的免疫保護，而且價格 昂貴。與細胞培養疫苗相比，用感染動物的神經組織製備的滅活疫苗成本較低，但是，這類 疫苗會產生嚴重的副反應，因此，目前滅活的狂犬病疫苗在發展中國家的應用受到極大限 制。然而，僅含少量病毒的減毒活疫苗就能有效誘導保護性免疫反應，因為這種疫苗中的活 病毒能在接種的動物體內繁殖併合成病毒抗原。這類疫苗的生產成本通常比滅活疫苗顯著 降低，而且可以通過非注射的方式進行接種。但減毒活疫苗毒株有時可由於自身殘留的毒 力或者病毒在體內繁殖期間產生致病性變異而在接種的動物中引發狂犬病。這就是通常不 使用減毒的活疫苗的主要原因。另一個原因是用傳統的方法開發減毒活疫苗周期長不可預 測性多b』6]。因此，應用反向遺傳技術通過體外對狂犬病病毒關鍵基因進行突變、基因間置 換和基因重排等操作構建與篩選重組毒株，則是獲得比現有疫苗更安全、更有效、更廉價的 狂犬病減毒活疫苗的有效手段[7』8]。狂犬病毒為彈狀病毒科狂犬病毒屬單股負鏈RNA病毒。基因組約121Λ，編碼核蛋 白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白或依賴RNA的RNA聚合酶(L)五個 結構蛋白。由於狂犬病毒無DNA複製中間體，不能發生病毒基因組與宿主細胞基因組的整 合；彈狀病毒中的大部分都具很高病毒滴度，具有容納和高水平表達外源多肽和蛋白的能 力；用所構建的負鏈RNA病毒免疫動物，能夠誘導很強的體液免疫和細胞免疫反應，為此狂 犬病毒等負鏈RNA病毒成為極具潛力的疫苗載體候選者[9a°』11]。1994年khnell等首次建立了狂犬病毒的反向遺傳操作技術，從感染性質粒中成 功拯救狂犬病毒SAD-B19株[12]，這是狂犬病毒研究的裡程碑。研究者們隨後陸續建立了 其他株病毒的反向遺傳系統[13』14]。簡要地說，表達全長反義基因組RNA的質粒(基因組質 粒)和三種分別表達病毒N、P、L蛋白的質粒(輔助質粒)共轉染到細胞中。然後，反義基 因組RNA和這些蛋白組成一種反義基因組核糖核蛋白體(RNP)複合物。由於反義基因組 RNP複合物與在狂犬病病毒感染細胞中所產生的RNP複合物具有相同的生物活性，因此，用反義基因組RNP作為模板即可合成基因組RNA，隨後從基因組RNP中合成mRNA並表達病毒 蛋白。基因組RNP、其他病毒蛋白、M和G蛋白組裝後即產生了感染性重組狂犬病病毒。在 基因水平上操作狂犬病病毒，僅僅需要通過常規的分子克隆方法改變基因組質粒上的病毒 cDNA序列，然後，將改造過的基因組質粒同輔助質粒一起用上述的方法轉染進細胞中。在這 個系統中，為了提高疫苗毒株的安全性和免疫原性，可以有意地改變它的某些生物學性狀， 而經典的方法則依賴於減毒相關性突變在傳代過程中隨機、偶然地發生。在狂犬疫苗的研究中，針對糖蛋白(G)的研究最為活躍。糖蛋白(G)為狂犬病病 毒跨膜蛋白，是狂犬病毒致病性的主要成分，也是誘導機體保護性免疫的主要抗原[15]。Ito 等利用親代強毒Nishigahara株的G基因取代子代弱毒RC-HL株全基因組中的G基因，獲 得拯救的病毒，研究病毒對大鼠的致病力，研究發現原先弱毒的RC-HL株毒力增強[16』17]。由 此說明了糖蛋白對於病毒致病性的重要性。糖蛋白的結構與毒力密切相關[18]。在與編碼 糖蛋白的基因(G基因)有關的狂犬病毒毒力致弱性研究中，除進行G基因突變研究外，近 十幾年來國外學者還進行了 G基因的刪除[19]、基因重排_、插入額外的G基因[21]等研究； 在國內，目前郭霄峰等已有狂犬病毒拯救成功的報導[22』&。ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)株是在獲得了 SAD株後，又經地鼠腎細胞傳 了 35 40代後，再於BHK-21細胞上傳了 6代，獲得的SAD株的派生株，為紀念Evelyn、 Rokitnicky 禾口 Abelseth 三人而命名。

發明內容
本發明人所用狂犬病毒疫苗株為一株進口 ERA株疫苗的克隆株， ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。為消除其毒力返強的隱患，本研究通過反向遺 傳操作構建其感染性克隆，採用PCR突變技術將狂犬病毒糖蛋白(G或GP)的333位精氨酸 突變為穀氨酸，構建出一免疫原性好、無致病性的狂犬病病毒基因突變疫苗候選株。更具體地，本發明提供以下各項1. 一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點由精氨酸 (R)突變為穀氨酸(E)。在本發明中，這種狂犬病毒減毒疫苗也稱為狂犬病毒GP333位R —E 突變株。2.根據以上1所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位 點的密碼子由AGA突變為GAA。3.根據以上1或2所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中所述狂犬病毒為ERA株。 在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明的狂犬病毒減毒疫苗突變株其基因組序列如 SEQ ID No. 1 所示。4.根據以上1-3中任一項的狂犬病毒減毒疫苗突變株在製備用於預防狂犬病的 藥物中的應用。5. 一種製備狂犬病毒減毒疫苗突變株的方法，其特徵在於將狂犬病毒的糖蛋白的 333位點由精氨酸突變為穀氨酸。6.根據以上5的所述方法，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點的密碼子由AGA突 變為GAA。7.根據以上5或6所述的方法，其中所述狂犬病毒為ERA株。
8.根據以上5-7中任一項所述的方法，其包括以下步驟(1)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括狂犬病毒的全長基因組cDNA序列；(2)將步驟(1)的轉錄質粒中狂犬病毒的全長基因組cDNA序列中編碼糖蛋白的 333位點的精氨酸的密碼子突變為編碼穀氨酸的密碼子；(3)構建一個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒分別包括編碼所述狂犬病毒的核 蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述狂犬病毒的磷蛋白(P)的cDNA序列、和編碼所述狂犬病 毒的依賴RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；(4)將步驟O)中構建的轉錄質粒和步驟(3)中構建的轉錄輔助質粒共轉染所述 狂犬病毒複製許可的宿主細胞，培養轉染後的宿主細胞，救獲重組狂犬病毒減毒疫苗突變 株。9.根據以上8所述的方法，其中所述宿主細胞是BHK-21細胞。10.根據以上8所述的方法，其中所述轉錄輔助質粒分別是pCI-N、pCI-P和 PCI-L0在本發明的一個優選實施方案中，根據以上8所述的方法的步驟O)中構建的轉錄 質粒是PCI-RV G333R/E(其中編碼糖蛋白的333位點的精氨酸的密碼子(AGA)已經突變為 編碼穀氨酸的密碼子(GAA))。狂犬病病毒的反向遺傳操作技術由Schnell等於1994年首先建立，該系統應用T7 啟動子系統，拯救病毒的效率較低，且需要痘苗病毒的參與影響了對所拯救病毒的篩選鑑 定。我們已成功建立了狂犬病毒ERA株反向遺傳作業系統，該系統在以往的作業系統上進 行了改進，使用了 CMV啟動子，無需痘苗病毒的輔助，將ERA株全基因組表達質粒以及輔助 質粒共轉染細胞，就能使病毒獲得拯救，從而節省了操作時間，提高了病毒的拯救效率，該 系統的建立為狂犬病毒致病性的研究提出了新思路，也為新疫苗候選毒株的開發提供了良 好的技術平臺。


圖1.狂犬病病毒ERA株全長cDNA的構建；圖2. GP333位R — E突變株全長cDNA的構建；圖3A和3B. GP333位R — E突變株的鑑定(間接免疫螢光結果)；圖4. GP333位R — E突變株的鑑定(電子顯微鏡負染觀察)；圖5. GP333位R — E突變株的鑑定(RT-PCR電泳結果)；圖6. GP333位R — E突變株的鑑定(已純化PCR產物的測序分析)；圖7. GP333位R — E突變株的生長動力學特性；圖8和圖9. GP333位R — E突變株的遺傳穩定性；圖10. GP333位R — E突變株的致病性(乳鼠)；圖11. GP333位R — E突變株的致病性(成年鼠)。
具體實施例方式下文將參考實施例詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不 是意圖限制本發明的範圍。本發明的範圍由後附的權利要求具體限定。實施例1狂犬病毒GP333位R — E突變株的構建和生物學活性鑑定
1材料和方法1. 1細胞與病毒Vero細胞(非洲綠猴腎細胞，ATCC No. CCL-81)培養基為含10%胎牛血清的 DMEM ；NA細胞(神經瘤細胞，購自長春軍事醫學科學院)培養基為含10%胎牛血清的MEM ； BHK-21細胞(乳倉鼠腎細胞，ATCC No. CCL-10)培養基為含5%胎牛血清的DMEM ；試驗所 用狂犬病毒疫苗株為ERA株疫苗(購自中國獸醫藥品監察所，AV61)，病毒中和實驗所用狂 犬病毒標準毒株CVS購自長春軍事醫學科學院。1. 2主要試劑和儀器PrimerSTAR HS DNA Polymerase, T4 DNA連接酶，及限制性內切酶均購自 TaKaRa公司。RNA提取試劑Trizol，鼠源反轉錄酶(MLV)試劑盒，磷酸鈣轉染試劑盒 (Calciumphosphate Transfection Kit)均購自 Invitrogen 公司，膠回收(Gel Extraction Mini Kit)及質粒小量提取試劑盒(Plasmid Mini Kit)均購自上海華舜。質粒中量提取試 劑盒購自QIAGEN公司。普通顯微鏡與螢光顯微鏡分別購自Leica公司。不同型號離心機 均購自BECKMAN公司。P2級生物安全櫃購自LABC0NC0公司。1.3 引物1. 3. 1 ERA全長cDNA克隆引物序列及酶切位點參照GeneBank中提供的狂犬病毒ERA株基因序列(GenBank Accession No. EF206707)，設計RT-PCR引物將全序列分為7段(Rl至R7，所用引物分別為R1F/R1R，R2F/ R2R, R3F/R3R, R4F/R4R, R5F/R5R, R6F/R6R 和 R7F/R7R)，引物序列見表 1。表1 ERA全長cDNA克隆引物
引物名稱引物序列RlFGTCACTGCTAGCTGGTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG CMidHam)RlRACTCGGCGAATGAGTTTGGAC (含 Sail)R2FTCGAATCATGATGAATGGAGGR2RCAGCCCACTGGAAGATAAAGG (含 Bst 11071)R3FCTGAGGGCATGAACTGGGTATR3RTCCCTGTCCCTCTGAGATTGT (含 SphI)R4FAAGAGTCAATCGATCAGAACCR4RCACAGGGACCGAACGTCTCTT (含 StuI)R5FAGAGAGCAGAAAAGTTTAGGCR5RTTGCCTCTCGAAACTCTGAAT (含 EcoRI)R6FGACGAGGTGGACAAGGTGGAGR6RCCCACTGAACCACTCTCAAGC (含 ApaI)R7FGTCTCGGAGCTTGACATAAGGR7RCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACGCTTAACA A ATA AACA AC A (CpoM HdvRz 序列)1. 3. 2狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)333位分子修飾用引物ERA株GP333位R — E引物P1F、PlR及突變鑑定引物P2F、P2R見表2。表2 ERA GP333位R — E突變引物對，斜體加粗部分為突變鹼基引物名稱引物序列PlFGCTCACTACAAGTCAGTCG/4AACTTGGAATGAGATCCTPlRAGGATCTCATTCCAAGTT7TGACTGACTTGTAGTGAGCP2FAGCATTTCCGCCCAACACCAGP2RCCGAGGATTCCAACAACT1.4全長cDNA克隆的構建1. 4. 1狂犬病病毒ERA株全長cDNA的構建利用表1所示的引物，通過一系列RT-PCR反應，構建了覆蓋整個基因組的7個片 段(R1-R7)，利用各個片段間重疊部分的酶切位點，在pCI載體(購自promega)上連接組裝 獲得了 11932nt的完整cDNA克隆，序列拼接結果已經登錄GenBank，登錄號為FJ913470 (其 全序列與SEQ ID No. 1的區別僅在於編碼糖蛋白的333位點的密碼子沒有由AGA突變為 GAA)。在全長cDNA片段兩端分別連有具有自我催化功能的錘頭狀核酶(Ham)和丁型肝炎核 酶(HdvRz)，構建完成的質粒命名為pCI-RV(其全序列見SEQ ID No. 5)(具體克隆過程見圖 1)。將表達核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)cDNA 分別緊接著克隆在PCI空載體T7/CMV啟動子下遊，分別構成轉錄輔助質粒pCI-N，pCI-P, pCI-L (質粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分別如SEQ ID Nos. 2，3和4所示)。1. 4. 2 GP333位R — E突變株全長cDNA的構建使用TaKaRa MutanBEST kit (Code No. D401)試劑盒，將 GP333 位(原鹼基序列為 AGA,利用PCR方法突變為GAA)，使原來的精氨酸(R)突變為穀氨酸(E)，構建完成的質粒命 名為pCI-RVG333R/E。具體實驗步驟如下以構建完成的狂犬病病毒ERA株全長cDNA克隆pCI_RV為模板，以RVGF 5'-GGCC GTTTAAACAACATCCCTCAAAAGACTCA-3』和 RVGR :5，-GGCCGTTTAAACTTTTTTTCTCGACTGAAAAGCTTA GATGAC-3』為引物進行PCR擴增，目的片段克隆至pBluescript的EcoRV位點並經序列測定 分析，確定正確後命名為pblue-RVG。使用TaKaRa MutanBEST kit (Code NO. D401)試劑盒，以試驗室已構建保存的 pblue-RVG 質粒為模板進行 PCR 擴增，反應體系為Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa) (5U/y L)0. 5μ L,上下遊引物(P1F、PlR)各 1 μ L, IOXPyrobest BufferII 5 μ L, dNTP Mixture (各2. 5mM) 4 μ L，模板1 μ L，補加滅菌蒸餾水至50 μ L ；反應條件94°C 30S, 55 °C 30S，72°C 5min，共30個循環。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。切膠回收目的DNA片 段，加1 μ L DpnI酶於回收產物中混勻，37°C孵育lh，將4 10 μ L DpnI消化產物轉化至 100 μ L的大腸桿菌感受態細胞中，挑取4-5個克隆進行序列的測定及分析。測序正確的質 粒命名為 pblue-RVG333R/E。將pblue-RVG333R/E突變部分組裝連入pCI_RV質粒中，替換未突變部分，即將 pblue-RVG333R/E通過xhol消化後與同樣處理過的pblue空質粒連接，篩選正向連接質粒， 再用 SpeI 和 HindIII 雙切，連接於 pblue_RV(XhoI/XhoI)的 SpeI 和 HindIII 之間，篩選 出的陽性質粒命名為pblue-RV(xhoI/xhoI)G333R/E。將pCI空載體Nhel、MluI雙切後與 pCI-RV全長質粒NheI、MluI酶切回收產物連接，鑑定出的陽性克隆命名為pCI-RV(N/M)。將 pbIue-RV(xhol/xhol)G333R/E 經 XhoI、MluI 雙切後連接 pCI-RV(N/M)Xhol,MluI 酶切回收 產物，鑑定陽性克隆命名為 pCI-RV (N/M) G333R/E。將 pCI-RV (N/M) G333R/E 經 NheI、MluI 消化後與PCI-RV全長質粒NheI、MluI消化產物連接，鑑定出的陽性克隆即為pCI-RV G333R/ E(其全序列見SEQ ID No. 6)(具體過程見圖2)。1. 5 GP333位R — E突變株的拯救BHK-21細胞接種於35mm六孔板中，待生長至50% 80%單層時，採用CaPO4轉染 試劑將轉錄質粒pCI-RV G333R/E及輔助質粒pCI-N、pCI_P和pCI-L分別以5 μ g、2. 5 μ g、 1. 25 μ g和1. 25 μ g的量共轉染BHK-21細胞，37 V 5% CO2培養，具體操作按磷酸鈣轉染試 劑盒(Calcium phosphate Transfection Kit)說明書進行。轉染後8 12h，棄去轉染混 合物，用含10% DMSO的PBS液休克細胞2. 5min,加入完全DMEM培養液，37°C 5% CO2培養； 4 5d後將細胞刮下來，取500 μ L細胞懸液接種於生長過夜、密度約80%的單層Vero細 胞，感作Ih後加入含5%胎牛血清的DMEM，37°C 5% CO2培養3 5d，將細胞懸液繼續在單 層Vero細胞上傳代三次以上，收穫鑑定。1. 6 GP333位R — E突變株的鑑定1. 6. 1間接免疫螢光(IFA)鑑定Vero細胞接種於M孔板中，待生長至80% 90%單層時，按MOI約為1感染收穫 的病毒液，37°C感作Ih後加入完全培養液繼續培養，3d後棄培養上清，PBS洗滌細胞2次， 用冷3%多聚甲醛室溫固定30min，PBST(PBS+Tween)洗滌細胞3次後用BSA封閉，分別 以1 100稀釋的鼠抗ERA全病毒高免血清(高免血清是用ERA多次接種小鼠製備的)和 相應稀釋倍數的陰性血清作為一抗，作用30min。PBST洗滌細胞3次後加入適當倍數稀釋 的稀螢光素(FITC)標記的兔抗鼠二抗(Sigma)，作用30min，PBST洗滌後螢光顯微鏡觀察 結果。1.6.2電鏡觀察及RT-PCR鑑定收集感染細胞上清懸液，採用磷鎢酸負染法製備樣本，常規透射電鏡觀察病毒粒 子形態；取拯救病毒250 μ L，提取RNA (Trizol法)。用1. 3. 2中的P2F和P2R作為引物進行 RT-PCR，對擴增的產物進行序列分析，以確定救獲的病毒是否為GP333位R(AGA) — E(GAA)
突變株。1. 7 GP333位R — E突變株的傳代、滴定與生長動力學已鑑定正確的病毒按1. 5的方法繼續進行擴增至F7代，病毒細胞培養物經反覆凍 融3次，-70°C凍存作為種毒，用於對救獲病毒的生物學特性分析。種毒作10倍連續梯度稀 釋，以100 μ L接種於NA細胞(神經瘤細胞)，37°C感作Ih後加入完全培養液繼續培養，3d 後棄培養上清，PBS洗滌細胞2次，用冷3%多聚甲醛室溫固定30min，PBST洗滌細胞3次後 用1%BSA封閉，分別以1 100稀釋的鼠抗ERA全病毒高免血清和相應稀釋倍數的陰性血 清作為一抗，作用30min。PBST洗滌細胞3次後加入適當倍數稀釋的螢光素(FITC)標記的 兔抗鼠二抗，作用30min，PBST洗滌後螢光顯微鏡觀察結果，從而測得病毒滴度，滴度用PFU 表示；按0. 01M0I接種單層Vero細胞，分別於感染後Id (天)、2d、3d、4d、5d和6d按時間順 序分別收穫取樣，取樣結束後把收穫的病毒做10倍系列稀釋，以100 μ L接種於NA細胞，按 照上述方法固定染色，螢光顯微鏡下觀察結果，繪製病毒生長動力曲線。1. 8 GP333位R — E突變株遺傳穩定性檢測1. 8. 1乳鼠腦內接種(MIT)傳代具體步驟為用酒精棉球對1 3d乳鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)頭部進行局部消毒後，用ImL滅菌注射器分別吸取處理過的接種用病毒液(GP333位 R — E突變株)，在接種部位垂直進針深約0. 25cm,顱內接種0. 03mL,通常一種病毒注射5 6隻乳鼠，注射後的乳鼠應在有高效濾過裝置的負壓飼養籠內飼養，可用燒熱的鑷子迅速對 乳鼠斷尾或斷耳區分。接種乳鼠歸窩前需先用酒精棉球塗抹母鼠鼻部，以免母鼠因嗅到異 味而吃掉接種乳鼠。7 IOd後，如發現乳鼠哺乳力減弱、步樣失調、麻痺，剖取鼠腦用生理 鹽水或PBS研磨，製成10% 30%的勻漿液(W/V)，2000r/min離心30min，取上清，將青黴 素/鏈黴素雙抗(Gibco) (1000IU/mL)等抗菌素按1 4量加入離心上清中，混勻後置4°C 感作過夜，接種前7000r/min離心lOmin，無菌取出上清，如上方法繼續傳代。將傳至不同代 次的病毒(SN-1 (SN是鼠腦的拼音縮寫，字母後面的數字表示傳代的代數，以下同)、SN-3和 SN-5)，分別提取RNA，以1. 3. 2中的P2F和P2R為引物進行RT-PCR，對擴增的產物進行序列 分析，以確定傳代多次後修飾的減毒株糖蛋白序列的穩定性、GP333位是否仍為E、是否發 生回復突變。1. 8. 2 NA細胞(神經瘤細胞)傳代為了檢測修飾後的減毒株的遺傳穩定性，將突變株病毒在NA細胞上進行連續多 次傳代。具體步驟為NA細胞接種於6孔板中，待生長至80% 90%單層時，按MOI約為 0.01感染病毒(GP333位R —E突變株)，37°C 5% CO2培養，逐日觀察應無CPE，至第4天 將病毒細胞培養物經_20°C /37°C反覆凍融3次，-70°C保存；將收穫的病毒進行滴定後，按 MOI約為0. 01感染新鮮的NA細胞，至第4天凍融收毒，按如上方法繼續傳代。將傳至不同 代次的病毒(NA-1、NA-5、NA-IO, NA-15 和 NA-20)，分別提取 RNA,以 1. 3. 2 中的 P2F 和 P2R 為引物進行RT-PCR，對擴增的產物進行序列分析，以確定傳代多次後修飾的減毒株糖蛋白 序列的穩定性、GP333位是否仍為E、是否發生回復突變。2 結果2. 1GP333位R — E突變株的鑑定間接免疫螢光結果顯示病毒感染的細胞培養物可見綠色螢光，陰性對照沒有螢光 信號(圖3A和;3B)；經電子顯微鏡負染觀察，觀察到了呈彈狀的病毒粒子，如圖4所示，符合 狂犬病毒電鏡下的形態特徵；RT-PCR電泳結果可見一條大小約為980bp的特異性條帶(圖 5)；已純化PCR產物的測序分析表明，GP333位R(AGA)已突變為E(GAA)(圖6)；擴增至F7 代的GP333位R — E突變株病毒IFA滴定結果為107PFU/mL ；生長動力學結果表明病毒與 24h後開始複製，在第5d達到最高峰，表現類似狂犬病毒野生型對照株的生長動力學特性 (圖7)。由此可見，救獲的病毒為GP333位R(AGA) — E (GAA)突變株，且具有較高的生長滴 度。命名為 rRV-G333R/E。2. 2 rRV-G333R/E突變株的遺傳穩定性以傳至不同代次的鼠腦毒(SN-1、SN-3和SN_5)和傳至不同代次的NA細胞毒 (NA-1、NA-5、NA-10、NA-15和NA-20)反轉錄產物為模板，用P2F和P^為引物作PCR擴增， 均擴增出了 980bp的特異性條帶，與理論值大小相同。進一步測定其序列並分析，結果與傳 代前毒種的核苷酸及胺基酸序列相同，GP333位均為E(GAA)(圖8和圖9)，均未發生回復突變。實施例2狂犬病毒rRV_G333R/E突變株的致病性除非另外特別指出，本實施例的材料和方法同實施例1。
rRV-G333R/E突變株致病性檢測將狂犬病毒ERA野生型對照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別以50 μ L/只腦內接種乳鼠及成年Balb/c小鼠(3周齡，10 13g，購自北京維通利 華實驗動物技術有限公司)，各病毒株分別接種10隻，接種後的小鼠置於高效濾過裝置的 負壓飼養籠內飼養，逐日觀察至接種後觀天，記錄存活數，接種後4天內死亡的鼠為非特異 性死亡，不作統計。結果狂犬病毒ERA野生型對照株、rRV_G333R/E突變株腦內接種乳鼠均致死。野 生型對照株攻毒後第6天乳鼠已全部死亡，而突變株攻毒後第7天引起乳鼠死亡，至第10 天時才全部死亡，與野生型對照株相比病程較緩慢(圖10)；腦內接種成年鼠後，突變株完 全不致病，接種後的小鼠均健康存活(圖11)，體重無明顯減輕，說明突變株比野生型對照 株毒力弱，對成年鼠是安全的。實施例3狂犬病毒rRV_G333R/E突變株的免疫原性除非另外特別指出，本實施例的材料和方法同實施例1。rRV-G333R/E突變株免疫原性檢測1. rRV-G333R/E突變株對鼠的免疫原性將狂犬病毒ERA野生型對照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別稀釋至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以100 μ L/只經肌肉注射途徑人工免疫5周齡成 年Balb/c小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，各病毒株分別免疫5隻小鼠， 另設非免疫對照組，免疫後21d用同代次病毒，以相同劑量經肌肉注射加強免疫，加強免疫 三周後採血測定血清中和抗體滴度。2. rRV-G333R/E突變株對犬的免疫原性將狂犬病毒ERA野生型對照株(106PFU/mL)、rRV_G333R/E突變株(107PFU/mL)原 液分別稀釋至106PFU/mL和2*106PFU/mL，以ImL/只經肌肉注射途徑人工免疫3月齡比格 犬(購自軍事醫學科學院實驗動物中心，經RFFIT檢測狂犬病中和抗體陰性)，各病毒株分 別免疫5隻比格犬，另設非免疫對照組，免疫後21d用同代次病毒，以相同劑量經肌肉注射 加強免疫，分別與一次免疫21d和加強免疫14d後採血並分離血清。血清經56°C 30min滅 活後，按常規快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)以狂犬病毒標準攻擊毒CVS作為攻擊毒株(購 自長春軍事醫學科學院)檢測中和抗體。具體過程為血清樣品連續20倍至1280倍倍比 稀釋，同時設陰、陽性血清對照。將稀釋好的血清與含1000個LD50 CVS病毒等體積混合， 37°C孵育lh，取100 μ L加到過夜生長的M孔Vero細胞，感染後4 經間接免疫螢光法觀 察CVS在細胞的感染情況。記錄100%攻毒接種物被中和的最高血清稀釋倍數，觀察視野中 無感染細胞，作為被檢血清的中和抗體滴度。結果以CVS作為攻擊病毒株，檢測所採集的小鼠及犬免疫血清中和抗體，在 接毒後48h時進行間接免疫螢光檢測，並在螢光顯微鏡下觀察結果。經野生型疫苗株和 rRV-G333R/E突變株免疫所採集的小鼠及犬免疫血清都具有較高的中和抗體水平；犬一次 免疫後21d採血，同時以相同劑量、相同途徑進行加強免疫，免疫14d後再採血，結果顯示突 變株一次免疫21d血清的中和抗體水平比野生型疫苗株誘導產生的抗體水平稍低，而經過 二次加強免疫兩毒株血清抗體水平均有顯著提高，且突變株加強效果更為明顯。具體數據 見表3和表4。
表3免疫小鼠血清RFFIT試驗結果
權利要求
1.一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點由精氨酸突變為 穀氨酸，優選其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點的密碼子由AGA突變為Gkk0
2.根據權利要求1所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中所述狂犬病毒為 ERA(Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)克隆株。
3.根據權利要求2的狂犬病毒減毒疫苗突變株，其基因組序列如SEQID No. 1所示。
4.一種製備狂犬病毒減毒疫苗突變株的方法，其特徵在於將狂犬病毒的糖蛋白的333 位點由精氨酸突變為穀氨酸，優選將狂犬病毒的糖蛋白的333位點的密碼子由AGA突變為 GAA。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述狂犬病毒為ERA克隆株。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其包括以下步驟(1)構建轉錄質粒，該轉錄質粒包括狂犬病毒的全長基因組cDNA序列；(2)將步驟⑴的轉錄質粒中狂犬病毒的全長基因組cDNA序列中編碼糖蛋白的333位 點的精氨酸的密碼子突變為編碼穀氨酸的密碼子，優選突變後的全長基因組cDNA序列如 SEQ ID No. 1 所示；(3)構建一個或多個轉錄輔助質粒，該輔助質粒分別包括編碼所述狂犬病毒的核蛋白 (NP)的cDNA序列、編碼所述狂犬病毒的磷蛋白⑵的cDNA序列、和編碼所述狂犬病毒的依 賴RNA的RNA聚合酶(大聚合酶蛋白)(L)的cDNA序列；和(4)將步驟中構建的轉錄質粒和步驟(3)中構建的轉錄輔助質粒共轉染所述狂犬 病毒複製許可的宿主細胞，培養轉染後的宿主細胞，救獲重組狂犬病毒減毒疫苗突變株。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述宿主細胞是BHK-21細胞。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述轉錄輔助質粒分別是質粒pCI-N、pCI-P和 pCI-L，其中質粒pCI-N、pCI-P和pCI-L的核苷酸序列分別如SEQ ID Nos. 2，3和4所示。
9.通過權利要求4-8中任一項所述的方法製備的狂犬病毒減毒疫苗突變株。
10.試劑盒，其包括根據權利要求1-3任一項所述的狂犬病毒減毒疫苗突變株或通過 權利要求4-8中任一項所述的方法製備的狂犬病毒減毒疫苗突變株。
全文摘要
本發明涉及一種狂犬病毒減毒疫苗突變株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位點由精氨酸突變為穀氨酸。本發明還涉及該狂犬病毒減毒疫苗突變株的製備方法和應用。
文檔編號A61P31/14GK102134562SQ20101010915
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者馮娜, 夏鹹柱, 楊松濤, 步志高, 王喜軍, 葛金英 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所