不依賴vegf的腫瘤的診斷和治療的製作方法

2023-10-09 18:26:39 1

專利名稱：不依賴vegf的腫瘤的診斷和治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤生長和腫瘤類型的領域。本發明涉及腫瘤的抑制劑和診斷標誌， 並且涉及其用於診斷和治療癌症和腫瘤生長的應用。
背景技術：
惡性腫瘤(癌症)是美國僅次於心臟病的主要死亡原因(見，例如Boring等，CA Cancel J. Clin.(加拿大癌症臨床雜誌)43 :7 (1993))。癌症的特徵在於來自正常組織的 異常、或贅生性細胞的數量增加(所述細胞增殖形成腫瘤塊)，這些贅生性腫瘤細胞對鄰近 組織的侵入，和產生最終通過血液或淋巴系統擴散到局部淋巴結和通過被稱為轉移的過程 擴散到遠端位點的惡性細胞。在癌性狀態中，細胞在其中正常細胞不會生長的條件下增殖。 癌症的表現形式多種多樣，特徵在於不同程度的侵襲力和侵佔性。根據癌症類型，患者一般可獲得一些治療選擇，包括化學療法、輻射和基於抗體的 藥物。用於預測不同治療方案的臨床效果的診斷方法將極大地有利於這些患者的臨床管 理。一些研究已經研究了基因表達與特定癌症類型的鑑定之間的關聯，例如通過突變-特 異性測定法，微陣列分析，qPCR等。這些方法可以用於對患者表現的癌症進行鑑定和分類。目前充分了解的是，血管發生涉及多種疾病的發病機理。這些包括實體瘤和轉移
(atherosclerosis)(retrolental fibroplasias) >
血管瘤(hemangiomas)、慢性炎症、眼內新血管疾病如增殖性視網膜病(pro 1 iferative retinopathies)，例如糖尿病性視網膜病(diabetic retinopathy)，年齡相關的黃斑 ^ (age-related macular (1686116:1^^11::1011,^10)),1^^1,1^,^011 (neovascular glaucoma)，移植的角膜組織和其它組織的免疫排斥，類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)和銀屑病(psoriasis)。Folkman 等，生物化學雜誌(J.Biol. Chem.), 267 10931-10934(1992) ；Klagsbrun 等，生理學年評(Annu. Rev. Physiol). 53 :217-239 (1991)； 和 Garner Α.，「血管疾病(Vascular diseases)「，在眼病的病理生物學(Pathobiology of Ocular Disease)中.A Dynamic Approach, Garner A. , Klintworth GK,編輯，第 2 版 (Marcel Dekker, NY, 1994)，第 1625-1710 頁。在腫瘤生長的情形中，血管發生看來對於由過度增生向瘤形成的轉變和給腫瘤 的生長和轉移提供營養是關鍵的。Folkman等，自然(Nature) 339 :58 (1989)。與正常細 胞相比，新血管形成使腫瘤細胞獲得生長益處和增殖自主性。腫瘤開始時通常是單一的 異常細胞，其可以由於與可及的毛細血管床的距離而僅增殖為幾個立方毫米的大小，並 且其可以「以靜止狀態」存在，而在較長的時間內不進一步生長和擴散。一些腫瘤細胞接 著轉化為生血管表型以激活內皮細胞，所述內皮細胞增殖並且成熟為新的毛細血管。這 些新形成的血管不僅允許原發性腫瘤的持續生長，還允許轉移性腫瘤細胞的擴散和再建群(recolonization)。因此，已經觀察到在腫瘤切片的微血管密度和乳腺癌以及數種 其它腫瘤患者的存活之間的關聯。Weidner等，新英格蘭醫學雜誌(N. Engl. J. Med) 324 1-6(1991) ；Horak 等柳葉刀(Lancet) 340 :1120-1124(1992) ；Macchiarini 等，柳葉刀 (Lancet) 340 :145-146 (199 。控制血管生成開關的精確機制尚未被充分了解，但是認為 腫瘤塊的新血管形成由多種血管發生刺激劑和抑制劑之間的淨平衡導致(Folkman，1995， (自然醫學)Nat Med 1(1) :27_31)。識別在病理條件下作為血管發生的主要調節劑的血管內皮細胞生長因子(VEGF) 促進了阻斷VEGF活性的許多嘗試。VEGF是一種血管發生的最佳表徵和最有效的正向調 節劑。見，例如Ferrara，N. & Kerbel, R. S.血管發牛作為治療劑靶標(Angiogenesis as a therapeutic target).自然(Nature)438 :967-74Q005)。除了在血管發生和血管生 成中作為生血管因子之外，VEGF還作為多效生長因子在其它生理過程中顯示了多種生物 學效應，如內皮細胞存活，血管滲透性和血管舒張，單核細胞趨化作用和鈣流入。i^errara 和Davis-Smyth (1997)內分泌學綜述(Endocrine Rev). 18 :4_25。而且，研究已經報導了 VEGF對於數種非內皮細胞類型，如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞和許旺細胞的促有絲分 裂作用。見，例如，Guerrin 等.細胞生理學雜誌(J. Cell Physiol.) 164 :385-394(1995)； Oberg-Welsh 等.分子細胞內分泌學(Mol. Cell. Endocrinol). 126 125-132 (1997)；和， Sondell 等·神經科學雜誌(J. Neurosci.) 19 :5731-5740(1999)。存在許多試圖阻斷VEGF活性的嘗試。還提議將抑制性抗-VEGF受體抗體、 可溶性受體構建體、反義策略、針對VEGF的RNA適配體和低分子量的VEGF受體酪氨 酸激酶(RTK)抑制劑用於幹擾VEGF信號傳導。見，例如，Siemeister等.癌症轉移綜 述(Cancer Metastasis Rev). 17 :241-248 (1998)。已經在裸鼠中證明抗-VEGF 中和抗 體抑制多種人腫瘤細胞系的生長(Kim等.自然(Nature) 362 :841-844(1993) ；Warren 等· J. Clin. Invest. 95 :1789-1797(1995) ；BorgStr5m等.癌症研究(Cancer Res). 56 4032-4039(1996)；和 Melnyk 等·癌症研究(Cancer Res). 56 :921-924(1996))並且 還在缺血性視網膜疾病模型中抑制眼內血管發生(Adami s等.Arch. Ophthalmo 1. 114 66-71(1996))。事實上，一種人源化的抗-VEGF抗體，貝伐珠單抗(AVASTIN ，Genentech, South San Francisco, CA)是首個被設計用於抑制血管發生的U. S. FDA-批准的治療方 法。見，例如，Ferrara等·，天然藥物開發綜述(Nature Reviews Drug Discovery), 3 391-400(2004)。其適應於與靜脈內基於5-氟尿嘧啶-的化學療法組合用於患有轉移結腸 直腸癌的患者的一線或二線治療；與卡鉬和紫杉醇化學療法組合用於患有不能切除的、局 部晚期、復發或轉移性非鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌(NSCLC)的一線治療；和與紫杉醇化學 療法組合，用於治療對於其轉移性HER2-陰性乳腺癌沒有接受化學療法的患者的應用。然而，治療化合物幹擾腫瘤生長的長期能力有時受到藥物抗性發展的限制。對於 各種細胞毒性化合物的一些抗性機制主要在單細胞腫瘤模型中得到鑑定和功能性表徵。 見，例如，Longley，D. B. & Johnston, P. G.藥物抗性的分子機制(Molecular mechanisms of druR resistance).病理學雜誌(JPathol) 205 :275-92 (2005)。此外，宿主基質-腫瘤 細胞相互作用可能涉及藥物抗性表型。基質細胞分泌多種促-生血管因子並且不傾向於相 同的遺傳不穩定性，增加突變率，與腫瘤細胞一樣(Kerbel，R. S.抑制腫瘤血管發生作為阻 止獲得對抗癌治療劑的抗性的策略inhibition of tumor angiogenesis as a strategyto circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents).生物測 定法(Bioessays)13 :31-6 (1991). Ferrara&Kerbel 禾口 Hazlehurst 等，在 Ferrara, N. & Kerbel, R. S.血管發牛.作為治療革F1 標(Angiogenesis as a therapeutic target).自然 (Nature) 438 :967-74(2005)；和，Hazlehurst，L. Α. , Landowski, Τ. H. &Dalton,ff. S.腫瘤微 環境在調節對藥物和細胞死亡的牛理調節劑的重新的抗件中的作用(Role of the tumor microenvironment in mediatinR de novo resistance to druRs and physioloRical mediators of cell death).致癌基因(Oncogene) 22 :7396-402(2003)進行綜述。在臨床前 模型中，用人源化的單克隆抗體貝伐珠單抗(AVASTIN ，Genentech，South San Francisco, CA)或貝伐珠單抗的鼠前體(A4. 6. 1(在3Λ9/91保藏的產生A4. 6. 1的雜交瘤細胞系，ATCC HB-10709))阻斷VEGF信號傳導在測試的大多數異種移植模型中顯著抑制腫瘤生長並且減 少腫瘤血管發生(Gerber&Ferrara在Gerber，H. P. & Ferrara，N.貝伐珠單抗在臨床前樽 型中作為單一療法或與細胞,毒t牛療法_合的藥理學和藥物代i射動力學(Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies).癌症研究(Cancer Res)65 :671-80(2005)中綜述)。 當治療在腫瘤生長的早期階段開始時，單一藥劑抗-VEGF治療的藥理學效應是最顯著的。 如果治療延遲到腫瘤已經充分建立才開始，抑制效應典型地是暫時的，並且腫瘤最終會發 展抗性。見，例如，Klement，G.等.組合節律(metronomic)化學療法和抗-VEGFR-2抗 體在多藥物杭件人I腺癌異種移棺中治療指數的差異(Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidruR-resistant human breast cancer xenoRrafts.) 1^ - 石開胃(Clin Cancer Res) 8 :221-32(2002)。關於抗-VEGF治療的所述抗性潛在的細胞和分子事件是複雜的。見， 例如，Casanovas, 0.，Hicklin, D. J.，Bergers, G. & Hanahan，D.在晚期郎格罕氏島腫瘤中 通過逃避VEGF信號傳導的抗牛血管靶向發展的藥物抗件(Drug resistance by evasion of antianRioRenic tarRetinR of VEGF siRnalinR in late-staRe pancreatic islet tumors).癌症細胞(Cancer Cell) 8 :299-309(2005)；和，Kerbel，R. S.等.獲得對抗-牛 血管藥物的抗件的可能機制渉及使用組合療法塗徑(Possible mechanisms of acquired resistance to anti-anRioRenic druRs -implications for the use of combination therapy approaches)。癌症轉移綜述(Cancer Metastasis Rev) 20 :79-86 (2001)。因此，開發可以用於鑑定和治療對抗VEGF治療具有抗性的受試者的基於分子的 診斷方法是高度有利的。本發明解決了這些和其它需要，在回顧了下面的公開內容後這是 顯而易見的。發明概述本發明的方法可以用於多種設定，包括，例如鑑定、診斷和治療不依賴VEGF的腫 瘤。在某些實施方案中，本發明提供用於鑑定不依賴VEGF的腫瘤的標誌組(marker sets)。本文提供在受試者中檢測不依賴VEGF的腫瘤的方法。例如，方法包括確定一種或 多種基因在獲自受試者的測試樣品中的表達水平，其中與參照樣品比較在測試樣品中的一 種或多種基因的表達水平的變化指示在受試者中存在不依賴VEGF的腫瘤，其中至少一種 基因選自由 S100A8, S100A9, Tie-I，Tie-2, PDGFC，禾口 HGF 組成的組。在某些實施方案中，表達水平是mRNA表達水平。在某些實施方案中，mRNA表達水平使用微陣列或qRT-PCR進行測量。在某些實施方案中，mRNA表達水平的變化是增加。在 一個實施方案中，具有增加的mRNA表達水平的一個基因是S100A8或S100A9。在某些實施 方案中，mRNA表達水平的改變是減少。在一個實施方案中，具有減少的mRNA表達水平的一 個基因是PDGFC、Tie-l或Tie-2。在某些實施方案中，具有減少的mRNA表達水平的一個基 因是Tie-I或Tie-2，並且所述方法還包括確定第二基因在測試樣品中的mRNA表達水平，其 中所述第二基因是CD31，CD;34，VEGFRl，或VEGFR2。在某些實施方案中，CD31，CDiM，VEGFRl 或VEGFR2在測試樣品中的mRNA表達水平與參照樣品比較被減少。在某些實施方案中，表達水平是蛋白表達水平。在某些實施方案中。蛋白表達水 平使用免疫測定法進行測量。在某些實施方案中，所述免疫測定法是ELISA。在某些實施方 案中，蛋白表達水平的變化是增加。在一個實施方案中，具有增加的蛋白表達水平的一個基 因是HGF。在某些實施方案中，檢測不依賴VEGF的腫瘤的方法包括確定獲自受試者的測試 樣品中的兩種以上基因的表達水平，其中與參照樣品比較測試樣品中兩種以上基因的表 達水平的變化指示在受試者中存在不依賴VEGF的腫瘤，其中所述至少兩種基因選自由 S100A8，S100A9，CD31，Tie-I，Tie-2，IL-I β，P1GF，PDGFC，和 HGF 組成的組中。在某些實施 方案中，檢測不依賴VEGF的腫瘤的方法包括確定在獲自受試者的測試樣品中的五種以上 基因的表達水平，其中與參照樣品比較在測試樣品中5種以上基因的表達水平變化指示在 受試者中存在不依賴VEGF的腫瘤，其中至少5種基因選自由S100A8，S100A9, Tie-1, Tie-2, CD31, CD34, VEGFRl, VEGFR2, IL-I β，PlGF, PDGFC，和 HGF 組成的組中。在某些實施方案中，表達水平是mRNA表達水平。在某些實施方案中，mRNA表達 水平的變化是增加。在一個實施方案中，具有增加的mRNA表達水平的一個基因是S100A8， S100A9, PlGF或IL-I β。在某些實施方案中，mRNA表達水平的變化是減少。在一個實施 方案中，具有減少的mRNA表達水平的基因中的一個、二個、三個、四個、五個、六個或七個是 PDGFC, Tie-1, Tie-2, CD31, CD34, VEGFRl 和 / 或 VEGFR2。在某些實施方案中，所述表達水平是蛋白表達水平。在某些實施方案中，蛋白表達 水平的變化是增加。在一個實施方案中，具有增加的蛋白表達水平的一個基因是IL-I β， PlGF或HGF。在另一個實施方案中，具有增加的蛋白表達水平的兩個基因是IL-I β和P1GF。在某些實施方案中，上述方法還包括治療具有不依賴VEGF的腫瘤的受試者，所述 方法包括向所述受試者施用有效量的下列中的任一種IL_li3拮抗劑、IL-6拮抗劑、LIF拮 抗劑、PlGF拮抗劑、S100A8拮抗劑、S100A9拮抗劑，HGF拮抗劑或c-Met拮抗劑。在一個實 施方案中，將有效量的c-Met拮抗劑施用於具有不依賴VEGF的腫瘤的受試者。在一個實施 方案中，將有效量的HGF拮抗劑施用於具有不依賴VEGF的腫瘤的受試者。在某些實施方 案中，上述方法還包括治療具有不依賴VEGF的腫瘤的受試者，所述方法包括向受試者施用 組合第二藥劑的有效量的VEGF拮抗劑，其中所述第二藥劑是下列中的任一種IL-li3拮抗 劑，IL-6拮抗劑，LIF拮抗劑，PlGF拮抗劑，S100A8拮抗劑，S100A9拮抗劑，HGF拮抗劑或 c-Met拮抗劑。在一個實施方案中，所述第二藥劑是c-Met拮抗劑。在一個實施方案中，所 述第二藥劑是HGF拮抗劑。在某些實施方案中，所述VEGF拮抗劑是抗-VEGF抗體。在某些 實施方案中，所述抗-VEGF抗體是單克隆抗體。在一個實施方案中，所述抗-VEGF抗體是貝 伐珠單抗。在某些實施方案中，c-Met拮抗劑是抗-c-Met抗體。在某些實施方案中，HGF拮抗劑是抗-HGF抗體。在某些實施方案中，方法還包括向受試者施用有效量的化療劑。本文還提供治療受試者中不依賴VEGF的腫瘤的方法。在某些實施方案中，方法 包括治療受試者中不依賴VEGF的腫瘤，所述方法包括向受試者施用有效量的下列中的任 一種=IL-I β拮抗劑，IL-6拮抗劑，LIF拮抗劑，PlGF拮抗劑，S100A8拮抗劑，S100A9拮抗 劑，HGF拮抗劑或c-Met拮抗劑。在一個實施方案中，將有效量的c_Met拮抗劑施用於具有 不依賴VEGF的腫瘤的受試者。在一個實施方案中，將有效量的HGF拮抗劑施用於具有不依 賴VEGF的腫瘤的受試者。在另一個實施方案中，將有效量的IL-I β拮抗劑施用於具有不 依賴VEGF的腫瘤的受試者。在某些實施方案中，方法包括治療受試者中不依賴VEGF的腫 瘤，所述方法包括向受試者施用組合第二藥劑的有效量的VEGF拮抗劑，其中所述第二藥劑 是下列中的任一種IL-1 β拮抗劑，IL-6拮抗劑，LIF拮抗劑，PlGF拮抗劑，S100A8拮抗劑， S100A9拮抗劑，HGF拮抗劑或c-Met拮抗劑。在一個實施方案中，所述第二藥劑是c_Met拮 抗劑。在某些實施方案中，所述第二藥劑是HGF拮抗劑。在某些實施方案中，所述第二藥劑 是IL-I β拮抗劑。在一個實施方案中，IL-I β拮抗劑是抗-IL-I β抗體。在另一個實施 方案中，c-Met拮抗劑是抗-c-Met抗體。在另一個實施方案中，HGF拮抗劑是抗-HGF抗體。 在某些實施方案中，所述抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。在某些實施方案中，方法還包括向具 有不依賴VEGF的腫瘤的受試者施用有效量的化療劑。在某些實施方案中，受試者是人。在某些實施方案中，受試者被診斷患有癌症。在 某些實施方案中，受試者被診斷具有不依賴VEGF的腫瘤。在一個實施方案中，癌症選自由 下列各項組成的組中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、腎細胞癌(renal cell carcinoma)、成膠質細胞瘤(glioblastoma)、乳腺癌(breast cancer)和結腸直腸癌 (colorectal cancer)。在某些實施方案中，本發明提供預測受試者中的腫瘤是否將對不同於或除了 抗-生血管療法之外的抗-癌療法有效反應的方法，所述方法包括確定來自受試者的測試 樣品是否包括這樣的細胞，所述細胞在測試樣品中表達的一種或多種基因的表達水平比其 在參照樣品中表達所述基因的水平更高，其中至少一種基因選自由下列各項組成的組中 S100A8, S100A9, IL-I β，PlGF和HGF。在某些實施方案中，所述方法還包括向受試者施用 有效量的IL-I β拮抗劑，PlGF拮抗劑，S100A8拮抗劑，S100A9拮抗劑，HGF拮抗劑，c-Met 拮抗劑，LIF拮抗劑或其任何組合。在某些實施方案中，本發明提供預測受試者中的腫瘤是 否將對不同於或除了抗-生血管療法之外的抗-癌療法有效反應的方法，所述方法包括確 定來自受試者的測試樣品中是否包括這樣的細胞，所述細胞在測試樣品中表達的一種或多 種基因的水平比其在參照樣品中的表達水平低，其中至少一種基因選自由下列各項組成的 組中Tie-l，Tie-2，CD31，CD;34，PDGFC，VEGFRl和VEGFR2。在某些實施方案中，表達水平是 mRNA表達水平。在某些實施方案中，所述表達水平是蛋白表達水平。在某些實施方案中， 抗-生血管療法包括VEGF拮抗劑。在某些實施方案中，VEGF拮抗劑是抗-VEGF抗體。在 某些實施方案中，抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。在某些實施方案中，本發明提供預測癌症患者對於抗-VEGF療法的反應性的方 法，所述方法包括在獲自癌症患者的測試樣品中確定上述一種或多種基因的表達水平，其 中與參照樣品比較，所述一種或多種基因在測試樣品中的表達水平的顯著變化指示癌症患 者對抗-VEGF療法減少的反應性或完全缺乏反應性。
在某些實施方案中，本發明提供用於監測癌症患者中抗-VEGF療法的功效的方 法，所述方法包括在抗-VEGF療法的進程中確定上述一種或多種基因在獲自癌症患者的測 試樣品中的表達水平，其中與參照樣品比較，在測試樣品中一種或多種基因的表達水平的 顯著變化指示抗-VEGF療法的減少的功效或完全缺乏功效。在某些實施方案中，本發明提供鑑定對抗-VEGF療法具有抗性的癌症患者亞群體 (subpopulation)的方法，所述方法包括在獲自每個癌症患者的測試樣品中確定如上所述 的一種或多種基因的表達水平，其中與參照樣品比較，一種或多種基因在測試樣品中的表 達水平的顯著變化指示癌症患者屬於對抗-VEGF療法具有抗性的亞群體。本文所述的任何實施方案或其任何組合應用於本文所述的本發明的任一種和所 有的方法。附圖簡述

圖1組A-B舉例說明乳腺發育。㈧來自8周齡未交配動物(virgin) VEGF+/+和 (B)印iVEGF-/-乳腺的代表性乳腺完整載片。棒代表1000 μ m。圖2組A-D舉例說明腫瘤發展和進展。(A)在PyMT. VEGF+/+(n = 24)和PyMT. epiVEGF-/"(n = 20)小鼠中，第一個可觸知的腫瘤的時間。(B)累積腫瘤計數/來自8_16 周齡的 PyMT. VEGF+/+ (n = 20)和 PyMT.印iVEGF-/-(η = 15)小鼠的小鼠。(C)在 PyMT. VEGF+/+(n = 20)和PyMT.印iVEGF-/-(η = 15)小鼠中的平均累積腫瘤體積。(D)在16周 齡的小鼠的平均腫瘤重量。*指示組之間的統計學顯著(P < 0. 05)差異。圖3組A-F舉例說明腫瘤血管密度。(A)來自PyMT. VEGF+/+小鼠和(B) PyMT. epiVEGF-/"小鼠，(C)用對照 IgG (GP120)處理的 PyMT. VEGF+/+ 小鼠或(D)用 抗-VEGF(G6. 3ImAb)處理的PyMT. VEGF+/+小鼠的腫瘤血管網絡的代表性最大強度投影圖 象(E)在PyMT. VEGF+/+腫瘤和PyMT. epiVEGF-/-腫瘤中血管體積相對於血管直徑。(F) PyMT. VEGF+/+腫瘤中對比在PyMT. epiVEGF-/-腫瘤中的相對於血管直徑的％血管體積(該 半徑的血管體積/總的血管體積)。圖4組A-C舉例說明腫瘤微血管血流。(A)相對微血管血液流速。將數據表示為 平均值士SEM。*表示在組之間的顯著(P <0.05)差異。對比增強的超聲灌注分析的代表 性圖象，描述了在大小-匹配的(B)PyMT. VEGF+/+腫瘤和(C)PyMT.印iVEGF-/-腫瘤中的微 血管血流。圖5組A-H舉例說明VEGFRl和VEGFR2mRNA在腫瘤中的定位。(A)原位雜交 顯示VEGFRlmRNA在PyMT. VEGF+/+腫瘤中與血管內皮強相關。(B) VEGFRlmRNA在PyMT. epiVEGF-/-腫瘤中還與血管內皮相關(箭頭)，儘管信號通常比在PyMT. VEGF+/+腫瘤 中更弱。用蘇木精和曙紅對來自(C)PyMT. VEGF+/+腫瘤和(D)PyMT.印iVEGF-/-腫瘤的 平行圖象的載玻片進行染色。(E)原位雜交顯示VEGFR2mRNA與分離的細胞簇相關，所述 分離的細胞簇與PyMT. VEGF+/+腫瘤中的血管內皮細胞一致。(F) VEGFR2 mRNA與PyMT. 印iVEGF-/-腫瘤中沿血管內皮的點簇(punctate clusters)相關(箭頭)，儘管信號通常 比其在PyMT. VEGF+/+腫瘤中更弱。用蘇木精和曙紅對來自(G)PyMT. VEGF+/+腫瘤和(H) PyMT. epiVEGF-/-腫瘤的平行圖象的載玻片進行染色。取具有蘇木精和曙紅染色的載玻片 的暗視野(A，B, E，F)或亮視野(C，D，G，H)強度的平行圖象。比例尺是100 μ m。有意義
9的對照載玻片缺乏顯著的信號(數據未顯示)。圖6組A-B舉例說明通過Taqman分析的VEGFRl和VEGFR2 mRNA在腫瘤中的相對 水平。在 PyMT. VEGF+/+ 和 PyMT.印iVEGF-/-腫瘤中相對(A) VEGFRl 和(B) VEGFR2 轉錄體 水平。將數據表示為相對於PyMT. VEGF+/+的倍數變化(n = 9個腫瘤/組，在組之間具有 絕對水平的顯著差異(P < 0. 05))。圖7組A-E舉例說明在PyMT. epiVEGF-/"腫瘤裂解物中減少的VEGF水平。(A)在 來自PyMT. VEGF+/+或PyMT. ep iVEGF-/"腫瘤的裂解物中的VEGF蛋白水平。(B-E)在下列 各項中進行的關於VEGF的原位雜交(使用關於外顯子3的核糖核酸探針檢測缺失)⑶ PyMT. VEGF+/+腫瘤，其中在緊鄰壞死區域的有生存力，但是可能是低氧的腫瘤組織中存在 過度表達(箭頭)或(C)PyMT.印iVEGF-/-腫瘤，其中表達主要在壞死腫瘤周圍的低氧區域 中缺乏。取具有蘇木精和曙紅染色的載玻片的暗視野(B，C)或亮視野(D，E)亮度的平行圖 象。比例尺是100 μ m。有義對照載玻片缺乏顯著的信號(數據未顯示)。圖8組A-B舉例說明抗-VEGF治療對攜帶PyMT. VEGF+/+腫瘤或PyMT. 印iVEGF-/-腫瘤的小鼠的作用。每周用5mg/kg抗-VEGF(B204. 1)或同種型對照抗體(IgG) 處理小鼠2次並且(A)確定每隻小鼠的腫瘤的平均累積數量或(B)平均累積腫瘤負擔。將 數據表示為平均值士SEM(n = 10-15隻動物/組)。*表示在用Β20或對照抗體處理的 PyMT. VEGF+/+小鼠之間的顯著差異(P < 0. 05)。圖9組A-E舉例說明在腫瘤中生血管和炎性相對mRNA水平。在PyMT. VEGF+/+對 比 PyMT.印iVEGF-/-腫瘤中的鼠(A)PlGF, (B) IL-1 β，(C)S100A8, (D)S100A9 禾口 (E)PDGFC mRNA表達水平的定量RT-PCR分析。將數據表示為相對於PyMT. VEGF+/+的倍數變化(n = 5-9腫瘤/組)，在組之間的絕對水平中具有顯著差異(P < 0. 05)。圖10組A-C舉例說明在腫瘤中生血管和炎性因子的蛋白水平。在PyMT. VEGF+/+ 腫瘤中對比在PyMT. ep iVEGF-/"腫瘤中(A) PlGF (B) IL-I β (C) HGF蛋白水平的ELISA或 Luminex分析。將數據表示為平均值士SEM.。*表示組之間的顯著差異(P < 0. 05)。圖11組A-D舉例說明在腫瘤中⑶31，⑶34，Tie-I和Tie_2的相對mRNA表達水 平。在 PyMT. VEGF+/+和 PyMT.印iVEGF-/-腫瘤中(A)CD31, (B)CD34, (C)Tie-I 禾口 (D)Tie_2 轉錄體水平。將數據表示為相對於PyMT. VEGF+/+的倍數變化(n = 5-7隻腫瘤/組)，在組 之間的絕對水平上具有顯著差異(P < 0. 05)。圖12 來自PyMT. ep iVEGF-/"腫瘤的原代上皮細胞與來自PyMT. ep iVEGF+/+腫瘤 的原代上皮細胞比較，具有增加的體外對HGF的遷移反應。誤差條表示SEM。發明詳述本文所述或參考的技術和方法通常是充分了解的，並且由本領域技術人員使用 常規方法一般應用，如例如，在下述參考文獻中所述廣泛使用的方法=Sambrook等.，分 子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning =ALaboratory Manual)，第 3 版 Q001)冷泉 港實驗室出版社，冷泉港，N. Y.在分子生物學中目前使用的方法(⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY) (F. Μ. Ausubel,等.編輯，(2003))；酶學方法(Methods IN ENZYM0L0GY)系列(學術出版社公司)=PCR 2 實用方法(PCR 2 :A PRACTICAL APPROACH) (Μ. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 編輯(1995))，Harlow 和 Lane,編輯(1988)抗體，實驗室手冊，和動物細胞培養(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE) (R. I. Freshney，編輯(1987))；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) (Μ. J. Gait，編輯，1984)；分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)，Humana 出 版社；細胞生物學實驗室筆記(Cell Biology =A Laboratory Notebook) (J. Ε. Cellis, 編輯，1998)學術出版社；動物細胞培養(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney)，編輯， 1987)；細胞和組織培養介紹 Gntroduction to Cell and Tissue Culture) (J. P. Mather 和P. E.Roberts，1998) Plenum出版社；細胞和組織培養實驗室方法(Cell and Tissue Culture :Laboratory Procedures) (A. Doyle, J. B. Griffiths,禾口 D. G. Newell,編輯， 1993-8) J. Wiley 和 Sons ；實驗室免疫學手冊(Handbook of Experimental Immunology) (D. M. Weir和C. C. Blackwel 1，編輯)；哺乳動物細胞基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (J. Μ· Miller 和 Μ· P. Calos，編輯，1987) ；PCR :聚合酶鏈 式反應(PCR :The Polymerase Chain Reaction), (Mullis 等·，編輯，1994)；免疫學目前 使用的方法(Current Protocols in Immunology) (J. Ε· Coligan 等·，編輯，1991)；分子 生物學中的簡便方法(Short Protocols in Molecular Biology) (Wiley 和 Sons，1999)； 免疫生物學(Immunobiology) (C. A. Janeway 禾口 P. Travers, 1997)；抗體(Antibodies) (P. Finch, 1997) -MW(Antibodies :A Practical Approach) (D. Catty. ,'ΦΜ,
IRL 出版社，1988-1989)；單克隆抗體實用方法(Monoclonal Antibodies :A Practical Approach (P. Si印herd和C. Dean，編輯，牛津大學出版社，2000)；使用抗體實驗室手冊 (Using Antibodies :A Laboratory Manual) (Ε. Harlow 和 D. Lane ( 7令泉港實驗室出版 社，1999)；抗體(The Antibodies) (Μ. Zanetti 和 J. D. Capra，編輯，Harwood 學術出版社， 1995)；和癌症腫瘤學的原理和實踐(Cancer principles and Practice of Oncology) (V. T. DeVita 等.，編輯，J. B. Lippincott 公司，1993)。除非另有說明，本文所用的技術和科技術語具有與本發明所屬領域技術人員通常 所知相同的含義。Singleton等.，微生物和分子生物學字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第 2 版，J. ffiley&Sons (紐約，N. Y. 1994)，和 March，高級有 機化學反應、機制禾口結構(Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Mructure)，第 4 版，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)，向技術人員提供了本申請所 用的許多術語的一般指導。在本文提及的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，完整結合 在本文作為參考。定義出於解釋本說明書的目的，應用下面的定義，並且只要適合，以單數使用的術語也 包括複數形式，並且反之亦然。要理解的是，本文所用的術語僅是出於描述特定實施方案的 目的，並不意欲有任何限制。當在下面提出的任何定義與作為參考結合在本文中的任何文 獻衝突時，以下面的定義為準。「測試樣品」或「樣品」在本文指從目標受試者獲得或得到的組合物，其包含意欲例 如基於物理、生化、化學和/或生理特徵表徵和/或鑑定的細胞和/或其它分子實體。在一 個實施方案中，該定義包括血液和生物起源的其它液體樣品，和組織樣品如活組織檢查樣 本或組織培養物或來自其中的細胞。組織樣品的來源可以是來自新鮮、冷凍和/或保存的 器官或組織樣品的實體組織或活組織檢查樣品或抽吸物；血液或任何血液成分；體液；和來自受試者妊娠或發育的任何時候的細胞，或血漿。在另一個實施方案中，該定義包括在獲得它們後已經以任何方式進行處理的生物 學樣品，所述方式如通過用試劑處理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在 半固體或固體基質中用於切片目的。在本文中目的，組織樣品的「切片」意為組織樣品的單 一部分或塊，例如自組織樣品切下的組織或細胞的薄切片。樣品包括，但不限於，原代或培養的細胞或細胞系，細胞上清液，細胞裂解物，血小 板，血清，血漿，玻璃體液(vitreous fluid)，淋巴液，滑液，濾泡液，精液，羊膜液，乳，全血， 尿液，腦脊液，口水(saliva)，痰(sputum)，淚液，汗液，粘液，腫瘤裂解物，和組織培養基， 以及組織提取物如勻化的組織，腫瘤組織，和細胞提取物。在一個實施方案中，所述測試樣品是臨床樣品。在另一個實施方案中，所述測試樣 品用在診斷測定中。在一些實施方案中，所述測試樣品獲自原代或轉移腫瘤。組織活組織 檢查通常用於獲得腫瘤組織的代表塊。備選地，腫瘤細胞可以以已知或被認為包含目的腫 瘤細胞的組織或流體形式間接獲得。例如，肺癌病灶的生物學樣品可以通過切除術、支氣管 鏡檢、細針抽吸活檢(fine needle aspiration)、支氣管刷檢(bronchial brushings)獲 得，或來自痰、胸膜液或血液。在一個實施方案中，測試樣品獲自抗生血管療法之前的受試者或患者。在另一個 實施方案中，測試樣品獲自在VEGF拮抗劑療法之前的受試者或患者。在另一個實施方案 中，測試樣品獲自抗-VEGF抗體療法之前的受試者或患者。在某個實施方案中，測試樣品在 抗生血管、VEGF拮抗劑或抗-VEGF抗體療法過程中或之後獲得。在某些實施方案中，測試 樣品在癌症已經轉移後獲得。「參照樣品」用於本文時，指用於比較目的的參照的任何樣品、標準或水平。在一個 實施方案中，參照樣品獲自相同受試者或患者的身體的健康和/或非患病部分。在另一個 實施方案中，參照樣品獲自相同受試者或患者的身體的未處理的組織和/或細胞。在某些實施方案中，參照樣品包含對VEGF拮抗劑療法有反應的腫瘤。在某些實施 方案中，VEGF療法包含抗-VEGF抗體。在某些實施方案中，抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。在 某些實施方案中，參照樣品包含腫瘤，其是不依賴VEGF的腫瘤。在某些實施方案中，參照樣品是在與獲得測試樣品的時間不同的一個或多個時間 點獲得的來自相同受試者或患者的單一樣品或組合的多個樣品。例如，參照樣品在比獲得 測試樣品時更早的時間點從相同的受試者或患者獲得。如果參照樣品在開始診斷癌症時獲 得，並且測試樣品隨後在癌症已經轉移時獲得，所述參照樣品可以是有用的。在一個實施方案中，參照樣品獲自非-受試者或患者的個體的身體的健康和/或 非患病部分。在另一個實施方案中，參照樣品獲自非-受試者或患者的個體的身體未處理 的組織和/或細胞部分。在某些實施方案中，參照樣品包括獲自非-受試者或患者的一個或多個個體， 在上述術語「樣品」下定義的所有類型的生物學樣品。在某些實施方案中，參照樣品獲自 非-受試者或患者的患有癌症的一個或多個個體。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個健康個體的 合併的多個樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個患 有癌症的個體的合併的多個樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個個體的正常組織的合併的RNA樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自 非-受試者或患者的一個或多個患有癌症的個體腫瘤組織的合併的RNA樣品。「不依賴VEGF的腫瘤」，用於本文時，指在包括至少一種VEGF拮抗劑的癌症治療過 程中完全不反應，或失去反應或顯示減少的反應的癌症、癌性細胞或腫瘤。在某些實施方 案中，不依賴VEGF的腫瘤是對抗-VEGF抗體療法有抗性的腫瘤。在一個實施方案中，所述 抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。在某些實施方案中，不依賴VEGF的腫瘤是不可能對包含至少 一種VEGF拮抗劑的癌症療法有反應的腫瘤。在某些實施方案中，對癌症療法的反應性是患 者對如本文定義的癌症療法的反應性。基因或生物標誌的表達水平/量可以基於本領域已知的任何適合的標準定性和/ 或定量地確定，包括但不限於mRNA，cDNA，蛋白，蛋白質片段和/或基因拷貝數。在某些實 施方案中，與在第二樣品中的表達/量比較，在第一樣品中的基因或生物標誌的表達/量增 加。在某些實施方案中，與在第二樣品中的表達/量比較，在第一樣品中的基因或生物標誌 的表達/量減少。在某些實施方案中，所述第二樣品是參照樣品。在某些實施方案中，術語「增加」指與參照樣品比較，通過標準本領域已知方法 如本文提及的那些檢測的在蛋白水平或核酸水平上的5 %，10 %，15 %，20 %，25 %，30 %， 40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，99% 以上的總的增加。在 某些實施方案中，術語增加指基因或生物標誌的表達水平/量在樣品中的增加，其中增加 是參照樣品中各個基因或生物標誌的表達水平/量的至少約1. 25X，1. 5X，1. 75X，2X，3X， 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X,或 IOOX0在某些實施方案中，術語「減少」在本文指與參照樣品比較，通過標準的本領域 已知方法如本文所述的那些檢測的，在蛋白或核酸水平上的5 %，10 %，15 %，20 %，25 %， 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97^,98^,99%以上的總的減少。在某些實施方案中，術語減少指樣品中基因或生物標誌 的表達水平/量的減少，其中減少是參照樣品中各個基因或生物標誌的表達水平/量的至 少約 0. 9X, 0. 8X, 0. 7X, 0. 6X, 0. 5X, 0. 4X, 0. 3X, 0. 2X, 0. IX，0. 05X,或 0. 01X。用於確定基因的表達水平/量的另外的公開內容在本文中本發明的方法下描述。「檢測」包括任何檢測方式，包括直接或間接檢測。術語「標記」當用於本文時，指直接或間接與試劑如核酸探針或抗體綴合或融合併 且有利於檢測與其綴合或融合的試劑的化合物或組合物。所述標記本身可以是可檢測的 (例如放射性同位素標記或螢光標記)，或在酶促標記的情形中，可以催化可檢測的底物化 合物或組合物的化學變化。在某些實施方案中，所謂「相關(correlate) 」或「相關(correlating) 」意味著以 任何方式比較第一分析或流程的性能和/或結果與第二分析或流程的性能和/或結果。例 如，可以使用第一分析或流程的結果進行第二流程和/或可以使用第一分析或流程的結果 來確定是否應該進行第二分析或流程。關於基因表達分析或流程的實施方案，可以使用基 因表達分析或流程的結果來確定是否應該進行具體的治療方案。術語「生物標誌」用於本文時一般指，這樣的分子，其包括，基因、蛋白、碳水化合物 結構或糖脂，所述分子在哺乳動物組織或細胞中或在其上的表達可以通過標準方法(或本 文公開的方法)檢測，並且是對哺乳動物細胞或組織對基於抑制血管發生的治療方案的敏感性的預測、診斷和/或預後，所述基於抑制血管發生的治療方案，例如抗-血管發生藥劑 如VEGF-特異性抑制劑。「小分子」在本文被定義為具有低於約500道爾頓的分子量。「多核苷酸」或「核酸」可以在本文互換使用，指任何長度的核苷酸的聚合物，並包 括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基，和/ 或它們的類似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應結合到聚合物中的任何底 物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它們的類似物。「寡核苷酸，」用於本文時，一般指短的、一般為單鏈的，一般為合成的多核苷酸，其 一般，但不是必需地少於約200個核苷酸的長度。術語「寡核苷酸」和「多核苷酸」不相互 排斥。上面關於多核苷酸的描述等同地並且充分地可應用於寡核苷酸。「分離的」核酸分子是這樣的核酸分子，其從至少一種汙染核酸分子中鑑定和分 離，核酸分子與所述汙染核酸分子一般在多肽核酸的天然來源中締合。分離的核酸分子不 同於其中其以天然發現的形式或設置。因此，分離的核酸分子與存在於天然細胞中的核酸 分子區分開來。然而，分離的核酸分子包括包含在正常表達多肽的細胞中的核酸分子，其中 例如，核酸分子以不同於天然細胞的染色體定位定位在染色體上。「引物」通常為短的單鏈多核苷酸，一般具有游離的3' -OH基團，其通過與靶序列 雜交結合於可能存在於目的樣品中的靶標，並且隨後促進與靶標互補的多核苷酸的聚合。術語「持家基因」指編碼其活性對於維持細胞功能是必要的蛋白的一組基因。這 些基因典型地在所有的細胞類型中類似地表達。術語「陣列」或「微陣列」，用於本文時，指可雜交的陣列元件，優選地多核苷酸探針 (例如，寡核苷酸)在基底上的有序排列。基底可以是固體基底，如玻璃載玻片，或半固體基 底，如硝化纖維素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何變換。「天然序列」多肽包含與來自自然的多肽具有相同的胺基酸序列的多肽。因此，天 然序列多肽可以具有來自任何哺乳動物的天然存在的多肽的胺基酸序列。所述天然序列多 肽可以從自然分離或可以通過重組或合成方式產生。術語「天然序列」多肽具體地包括多 肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，細胞外結構域序列)，天然存在的變體形式(例如， 可變剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因變體。「分離的」多肽或「分離的」抗體指已經鑑定且與其天然環境的成分分離和/或從其 回收的多肽或抗體。多肽的天然環境的汙染性成分指將會干擾其診斷或治療用途的物質， 可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在某些實施方案中，將多肽純 化至(1)根據Lowry法的測定，多肽重量超過95%或重量超過99%，(2)足以通過使用轉 杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或C3)根據使用考馬 斯藍或銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達到同質。既然多肽的天然環境的 至少一種成分不會存在，那麼分離的多肽包括重組細胞內的原位多肽。然而，分離的多肽通 常通過至少一個純化步驟來製備。「多肽鏈」指其中其每個結構域通過肽鍵(不同於非共價相互作用或二硫鍵)與其 它結構域相連的多肽。多肽「變體」指與相應的天然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列同一性的生物 學活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N末端和/或C末端添加或刪除一個或多個胺基酸(天然存在胺基酸和/或非天然存在胺基酸)殘基的多肽。通常，變體將會與天 然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列同一性，或至少約90%胺基酸序列同一性，或至少 約95%或更多胺基酸序列同一性。變體還包括天然序列的多肽片段(例如亞序列、截短物 等)，典型地是有生物學活性的。術語「蛋白質變體」在用於本文時指上文所述變體和/或在天然蛋白質序列中包 含一個或多個胺基酸突變的蛋白質。任選的是，所述一個或多個胺基酸突變包括胺基酸置 換。用於本發明的蛋白質及其變體可通過本領域眾所周知的多種方法來製備。蛋白質的氨 基酸序列變體可通過蛋白質DNA中的突變來製備。此類變體包括例如，蛋白質胺基酸序列 內的殘基缺失、插入或置換。可以進行缺失、插入和置換的任何組合以獲得具有期望活性的 最終構建體。在編碼變體的DNA中進行的突變絕不能將序列置於讀碼框之外，而且優選不 會產生能產生二級mRNA結構的互補區。EP 75，444A。術語「抗體」以最廣義使用，具體地涵蓋單克隆抗體(包括全長的或完整的單克隆 抗體)、多克隆抗體、多價抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性 抗體)、及抗體片段(見下文)，只要它們展現出期望的生物學活性。除非另有說明，表述「多價抗體」貫穿本說明書用於指包含三個或更多抗原結合位 點的抗體。多價抗體典型地被改造成具有三個或更多抗原結合位點，而且一般不是天然序 列IgM或IgA抗體。「抗體片段」只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，並因 此保留了與抗原結合的能力。此定義所涵蓋的抗體片段的實例包括(i)Fab片段，其具有 VL、CL、VH和CHl結構域；(ii)Fab'片段，其是在CHl結構域的C-末端具有一個或多個半 胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHl結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH 和CHl結構域及CHl結構域C-末端的一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有抗體 單臂的 VL 和 VH 結構域；(vi) dAb 片段(Ward 等，自然(Nature) 341 :544-546 (1989))，其 由VH結構域組成；(vii)分離的⑶R區；(viii)F(ab' )2片段，即包含通過鉸鏈區的二硫 橋鍵(disulphide bridge)相連的兩個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如 單鏈 Fv;scFv) (Bird 等，科學(Science) 242 :423-似6 (1988)和 Huston 等，PNAS (USA) 85 5879-5883(1988)) ； (χ) 「雙抗體」，其具有兩個抗原結合位點，包含在同一條多肽鏈中相連 的重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)(參見例如ΕΡ404，097 ；WO 93/11161 ；和 Hollinger 等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci.USA)90 :6444-6448(1993))； (xi) 「線性抗體」，其包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補的輕鏈多肽一 起形成一對抗原結合區(Zapata等，Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)和美國專利 5，641，870)。術語「單克隆抗體」在用於本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成 群體的各個抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能突變(例如天然存在突變)外。因 此，修飾語「單克隆」表明抗體不是不同抗體混合物的特徵。單克隆抗體是針對單一抗原高 度特異性的。在某些實施方案中，單克隆抗體典型地包括包含結合靶標的多肽序列的抗體， 其中靶標結合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶標結合多肽序列在內的 過程得到的。例如，選擇方法可以是從眾多克隆(諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA 克隆的集合)中選擇獨特克隆。應當理解，所選擇的靶標結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶標的親和性、將靶標結合序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體 內的免疫原性、創建多特異性抗體等，而且包含改變後的靶標結合序列的抗體也是本發明 的單克隆抗體。與典型地包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不 同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除它們的特異性之外，單克隆抗體製備物的 優點在於它們典型地未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語「單克隆」表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特徵，不應解釋為要求 通過任何特定方法來生產抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來 生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler和Milstein，自然(Nature) 256 :495-97 (1975)； Hongo 等，雜交瘤(Hybridoma)，14 (3) =253-260 (1995) ； Har low 等，抗體實驗室手冊 (Antibodies :A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，第 2 版.1988 ；Hammer ling 等，於單克隆抗體和 T-細胞雜交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas), 563-681，Elsevier, N. Y.，1981)、重組 DNA 法(參見例如美國專利 No. 4，816，567)、 噬菌體展示技術(參見例如Clackson等，自然(Nature) 352 :624-628 (1991) ；Marks 等，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 222 :581-597 (1991) ；Sidhu等，分子生物學雜誌 (J. Mol. Biol. )338(2) :299-310(2004) ；Lee 等，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 340 (5) 1073-1093(2004) ；Fellouse，美國國家科學院學報(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 101 (34) 12467-12472(2004)；及 Lee 等，免疫學方法雜誌(J. Immunol. Methods) 284 (1-2) 119-132 Q004))、及用於在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序 列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ；W01991/10741 Jakobovits 等，美國國家科學院學報(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 90 :2551(1993) Jakobovits 等，自然(Nature) 362 :255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 :33(1993)；美國專利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ； 5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ;Marks 等，生物 / 技術(Bio/technology) 10 779-783(1992) ;Lonberg 等，自然(Nature) 368 :856-859(1994) ;Morrison，自然 (Nature) 368 :812-813(1994) ；Fishwild 等，自然生物技術(Nature Biotechnol.) 14 845-851(1996) ；Neuberger,自然生物技術(Nature Biotechnol.) 14 :826(1996)；及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995))。單克隆抗體在本文中具體地包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍 生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部 分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此 類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567和Morrison 等，美國國家科學院學報(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) USA 81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受 體的高變區殘基用具有期望特異性、親和性和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大 鼠、兔或非人靈長類動物)的高變區殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的構架區 (FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中 沒有發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將 包含基本上全部的至少一個、典型地兩個可變結構域，其中所有或基本上所有高變環對應於非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗 體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恆定區。更多 細節參見 Jones 等，自然(Nature) 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，自然(Nature) 332 323-329(1988)；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。還可參見例 如 Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115(1998) ；Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038(1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 428-433(1994)；及美國專利號 6，982，321 和 7，087，409。還可參見 van Dijk 和 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. , 5 :368-74 (2001)。人抗體可以如下製備，即將抗原施用於 轉基因動物，其經修飾而應答抗原激發生成此類抗體，但是其內源基因座已經失去能力，例 如經免疫的異種移植小鼠0 31101^(^)(參見例如美國專利號6，075，181和6，150，584，關 於XEN0M0USE 技術)。還可參見例如Li等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，103 :3557-3562 (2006)，關於經人B細胞雜交瘤技術產生的人抗體。「人抗體」指這樣的抗體，其具有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸 序列和/或使用本文所公開的用於生成人抗體的任何技術產生。人抗體的這種定義明確 排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來生 成。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan 等，自然生物技術(Nature Biotechnology) 14 :309-314(1996) ；Sheets 等，PNAS(USA)95 6157-6162(1998) ；Hoogenboom和 Winter，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 227 :381 (1991)； Marks等，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol. )222 :581 (1991))。人抗體還可通過將人免疫 球蛋白基因座引入轉基因動物來產生，所述轉基因動物例如是其中內源免疫球蛋白基因 已經部分或完全滅活的小鼠。在受到激發時，觀察到人抗體產生，它在所有方面與在人中 看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分。這種方法記載於例如美國專 利號 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，及以下科學 出版物中:Marks 等，生物 / 技術(Bio/Technology) 10 :779-783 (1992) ；Lonberg 等，自 然(Nature)368 :856-859(1994) ；Morrison,自然(Nature)368 :812-13(1994) ；Fishwild 等，自然生物技術(Nature Biotechnology) 14 :845-51 (1996) ；Neuberger,自然生物技術 (Nature Biotechnology)14 826(1996) ；Lonberg 禾口 Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13 65-93(1995)。或者，人抗體可通過產生針對靶抗原的抗體的人B淋巴細胞的永生化來制 備(此類B淋巴細胞可從個體回收，或者可在體外免疫)。參見例如Cole等，單克隆抗體 禾口癌症治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, p. 77(1985)； Boerner 等，免疫學雜誌(J. Immunol.) 147 (1) :86-95(1991)；及美國專利號 5，750，373。術語「可變的」指可變結構域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用於每種特 定抗體對其特定抗原的結合和特異性的事實。然而，變異性並非均勻分布於抗體的整個可 變結構域。它集中於輕鏈和重鏈可變結構域中稱作高變區的三個區段。可變結構域中更加 高度保守的部分被稱作構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR，它們 大多採取摺疊構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成摺疊結構一部分的三 個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近的保持在一起，並與另一條鏈的高變區 一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，免疫目的蛋白序列Gequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，Public Health Service,國家健康石if究所(National Institute of Health), Bethesda, MD. (1991))。恆定結構域不直接參與抗 體與抗原的結合，但展現出多種效應子功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性中的參與。術語「高變區」、「 HVR」或「HV」在用於本文時指抗體中負責抗原結合的胺基酸殘基。 例如，術語高變區指抗體可變結構域中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區 域。通常，抗體包含六個HVR:三個在VH中(H1、H2、H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗 體中，H3和L3展示這六個HVR的最大多樣性，而且認為特別是H3在賦予抗體以精細特異性 中發揮獨特作用。參見例如Xu等免疫性(Immunity) 13 =37-45(2000) Johnson和Wu於 分子生物學中的方法(Methods in Molecular Biology) 248 1-25 (Lo，編輯，Human 出版社， "TotowhNJdOO； )。事實上，僅由重鏈組成的天然存在駱駝科動物抗體(camelid antibody) 在缺乏輕鏈時是有功能的且穩定的。參見例如Hamers-Casterman等自然(Nature) 363 446-448(1993) ；Sheriff 等自然結構生物學(Nature Struct. Biol.) 3 :733-736 (1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補性決定區(OTR)是以序列變異 性為基礎的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列Gequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版· Public Health Service,國家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD. (1991))。Chothia 改為指結構環的位置(Chothia 和 Lesk 分子生物學雜誌(J. Mol. Biol. ) 196 :901-917(1987))。AbM HVR 代表 Kabat HVR 與Chothia結構環之間的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。「接 觸」HVR是以對可獲得的複合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些HVR中每一個 的殘基。
Loop KabatAbMChothiaContactLlL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96
HlH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B (Kabat 編號)HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35 (Chothia 編號)H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101
HVR可包括如下「延伸的HVR」:VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50—56 (L2)
和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。對於這些定義中的每一個，可變結構域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。「構架區」或「FR」殘基指除本文中所定義的高變區殘基之外的那些可變結構域殘基。術語「依照Kabat的可變結構域殘基編號方式」或「依照Kabat的胺基酸位置編號方式」及其變化形式指Kabat等，見上文中的用於抗體重鏈可變結構域或輕鏈可變結構 域編輯的編號系統。使用此編號系統，實際的線性胺基酸序列可包含較少或另外的胺基酸， 對應於可變結構域FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變結構域可包含H2殘基52後 的單一胺基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82後的插入殘基(例如依照 Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號方式可通過將抗體序列與 「標準」 Kabat編號序列對比同源區來確定。貫穿本說明書和權利要求書，Kabat編號系統一般在提及可變結構域中的殘 基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基1-113)時使用(例如Kabat等，免疫目的序列 (Sequences of Immunological Interest).第 5版·公眾健康月艮務(Public Health Service)，國家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, Md. (1991))。 "EU編號系統」或「EU索引」 一般在提及免疫球蛋白重鏈恆定區中的殘基時使用(例如 Kabat 等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版.公眾健康服務(Public Health Service)，國家健康研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中報導的EU索引，明確收入本文作為參考)。除非本文中另 有說明，提及抗體可變結構域中的殘基編號指根據Kabat編號系統的殘基編號方式。除非 本文中另有說明，提及抗體恆定結構域中的殘基編號指根據EU編號系統的殘基編號方式 (例如參見美國臨時申請號60/640, 323，EU編號方式的圖)。根據其重鏈恆定結構域的胺基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免 疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例 如IgG1 (包括非A和A同種異型)、Ig(i2、IgG3、IgG4, IgA1和IgA2。將與不同類的免疫球蛋 白對應的重鏈恆定結構域分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構 和三維構型是眾所周知的，一般性記載於例如Abbas等，細胞和分子免疫學(Cellular and Mol. Immunology)，第4版.(W. B. Saunders, Co. ,2000)。抗體可以是抗體與一種或多種其 它蛋白質或肽共價或非共價結合而形成的更大融合分子的一部分。根據其恆定結構域的胺基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白) 的「輕鏈」可歸入兩種截然不同的型，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)中的一種。術語「Fe區」用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區，其可以是通過用木瓜蛋白酶消化 完整抗體生成的。Fc區可以是天然序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的 邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定義為Fc區自大約Cys2^位置或大約ftx)230 位置的胺基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統的殘基 447)可以例如在生產或純化抗體的過程中去除，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組 工程改造而去除。因而，完整抗體的組合物可包括所有K447殘基都被去除的抗體群、無一 K447殘基被去除的抗體群、以及具有有和無K447殘基的抗體混合物的抗體群。免疫球蛋白 的Fc區一般包含兩個恆定結構域，即CH2結構域和CH3結構域，任選包含CH4結構域。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabat等，見上文中的 EU索引的編號方式。「如Kabat中的EU索引」指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。"Fe區鏈」在本文中指Fc區兩條多肽鏈之一。人IgG Fc區的「CH2結構域」(也稱為「Cg2」結構域)通常自約第231位胺基酸殘 基延伸至約第340位胺基酸殘基。CH2結構域的獨特之處在於它沒有與另一結構域緊密配對。而是，有兩個N-連接的分支的碳水化合物鏈介於完整天然IgG分子的兩個CH2結構域 之間。推測碳水化合物可能提供結構域-結構域配對的替代物且有助於穩定CH2結構域。 Burton，分子免疫學(Molec. Immunol.) 22 :161-206 (1985)。CH2結構域在本文中可以是天 然序列CH2結構域或變異CH2結構域。"CH3結構域」包含Fc區中CH2結構域C端的一段殘基(即自IgG的約第341位氨 基酸殘基至約第447位胺基酸殘基)。CH3區在本文中可以是天然序列CH3結構域或變異 CH3結構域(例如在其一條鏈中具有引入的「突出」(protroberance)而在其另一條鏈中具 有相應引入的「空腔」 (cavity)的CH3結構域；參見美國專利號5，821，333，明確收入本文 作為參考)。此類變異CH3結構域可用於生成本文所述多特異性(例如雙特異性)抗體。「鉸鏈區」通常定義為自人IgGl的約Glu216或約Cys2^至約ftx)230的區段 (Burton，分子免疫學(Molec. Immunol.) 22 161-206 (1985))。其它IgG同種型的鉸鏈區可 以通過將第一個和最後一個形成重鏈間S-S鍵的半胱氨酸殘基置於相同位置而與IgGl序 列對比。鉸鏈區在本文中可以是天然序列鉸鏈區或變異鉸鏈區。變異鉸鏈區的兩條多肽鏈 通常每條多肽鏈保留至少一個半胱氨酸殘基，使得變異鉸鏈區的兩條多肽鏈可在兩條鏈之 間形成二硫鍵。本文中優選的鉸鏈區是天然序列人鉸鏈區，例如天然序列人IgGl鉸鏈區。「功能性Fc區」具有天然序列Fc區的至少一種「效應子功能」。例示性的「效應子 功能」包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細 胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應子功能 一般要求Fc區與結合域(例如抗體可變結構域)結合，而且可使用本領域已知的用於評估 此類抗體效應子功能的多種測定法來評估。「天然序列Fc區」包含與自然界中發現的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。 天然序列人Fc區包括天然序列人IgGl Fc區(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2 Fc 區、天然序列人IgG3 Fc區、及天然序列人IgG4 Fc區，及其天然存在變體。「變異Fc區」包含由於至少一處胺基酸修飾而與天然序列Fc區有所不同的胺基酸 序列。在某些實施方案中，變異Fc區具有與天然序列Fc區或與母體多肽的Fc區相比至少 一處胺基酸置換，例如在天然序列Fc區中或在母體多肽的Fc區中具有約1處至約10處氨 基酸置換，優選約1處至約5處胺基酸置換，例如在天然序列Fc區中或在母體多肽的Fc區 中具有約1處至約10處胺基酸置換，優選約1處至約5處胺基酸替代。典型的是，變異Fc 區在本文中將與天然序列Fc區和/或母體多肽的Fc區例如具有至少約80%序列同一性， 或至少約90%序列同一性，或至少約95%或更多序列同一性。抗體「效應子功能」指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體 Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括Clq結合和補 體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作 用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」或「ADCC」指其中結合到某些細胞毒性細胞 (例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型 Ig使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶 細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞即NK細胞只表達Fc y RIII，而單核細胞表 達 FcyRI、Fc y RII 禾口 FcyRIII。Ravetch 禾口 Kinet，免疫學年評(Annu. Rev. Immunol.) 9 457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估感興趣分子的ADCC 活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利號5，500, 362或5，821，337中所記載的。可 用於此類測定法的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。備選 地/另外地，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等， PNAS (USA) 95 :652-656(1998)中所披露的。「人效應細胞」指表達一種或多種FcR並行使效應子功能的白細胞。在某些實施方 案中，該細胞至少表達Fc YRIII並行使ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包 括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細 胞，一般優選PBMC和NK細胞。效應細胞可以從其天然來源(例如從血液或PBMC)分離，如 本文所述。「Fe受體」或「FcR」描述結合抗體Fc區的受體。在有些實施方案中，FcR是天然 人FcR。在有些實施方案中，FcR是結合IgG抗體的FcR (γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII 和Fc γ RIII亞類的受體，包括那些受體的等位基因變體和可變剪接形式。Fc γ RII受體 包括FcyRIIA( 「活化受體」)和Fc y RIIB ( 「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列， 區別主要在於其胞質結構域。活化受體Fc y RIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基於 酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基於酪
氨酸的抑制基序(ITIM)(參見例如，DaSron ,免疫學年評(Armu. Rev. Immunol). 15
203-234(1997)) ο FcR 的綜述參見例如 Ravetch 和 Kinet,免疫學年評(Annu. Rev. Immunol.) 9 :457-492(1991) ；Capel 等，免疫方法(Immunomethods) 4 :25-34 (1994)；及 de Haas等，實驗室臨床醫學雜誌(J. Lab. Clin. Med. 126) :330-41 (1995)。術語「FcR」在本文 中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑑定的。術語「Fe受體」或「FcR」還包括新生兒受體，FcRn,它負責將母體IgG轉移 給胎兒(Guyer等，免疫學雜誌(J. Immunol. ) 117 =587(1976)和Kim等，免疫學雜誌 (J. Immunol.) 24 :249(1994))並調節免疫球蛋白的體內穩態。測量對Fcfoi的結合的方法是 已知的(參見例如 Ghetie 和 Ward.，今日免疫學(Immunol. Today) 18(12) :592-598(1997)； Ghetie 等，自然生物技術(Nature Biotechnology), 15(7) :637-640(1997) ；Hinton 等，生 物化學雜誌(J. Biol. Chem. )279(8) :6213-6216(2004) ；WO 2004/92219 (Hinton 等))。可測定人Fcfoi高親和性結合多肽與人Fcfoi的體內結合和血清半衰期，例如在表 達人Fcfoi的轉基因小鼠或經轉染人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長 類動物中。W000/42072 (Presta)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體變體。還可參見例 如 Shields 等，生物化學雜誌(J. Biol. Chem.) 9 (2) :6591-6604(2001) 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」指存在補體時對靶細胞的溶解。經典補體途徑 的激活是由補體系統第一組分(Clq)結合抗體(適宜亞類的)起始的，該抗體已結合至其 關聯抗原。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如如(iazzano-SantOTo等，免疫方法 雜誌(J. Immunol. Methods) 202 163 (1996)中所記載的。具有更改的Fc區胺基酸序列(具 有變異Fc區的多肽)及提高或降低的Clq結合能力的多肽變體記載於例如美國專利號 6，194，551B1 和 W01999/51642。還可參見例如 Idusogie 等，免疫學雜誌(J. Immunol.) 164 4178-4184(2000)。「親和力成熟的」抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改變、導致該抗體對抗原的親和性與沒有這些改變的母體抗體相比有所提高的抗體。在一個實施方 案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和性。親和力成 熟的抗體可通過本領域已知方法來生成。Marks等，生物/技術(Bio/Technology) 10 779-783(1992)記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和性成熟。以下文獻記載了 CDR和/或構架殘基的隨機誘變=Barbas等，美國國家科學院學報(Proc. Nat. Acad. Sci. USA) 91 :3809-3813(1994) jchier 等，基因(Gene) 169 147-155 (1995) ；Yelton 等，免疫學 雜誌(J. Immunol.) 155 :1994-2004(1995) Jackson 等，免疫學雜誌(J. Immunol.) 154(7) 3310-9 (1995)；及 Hawkins 等，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 226 :889-896 (1992)。抗體的「功能性抗原結合位點，，指能夠結合靶抗原的位點。抗原結合位點的抗原 結合親和性不必像衍生該抗原結合位點的母體抗體那樣強，但是結合抗原的能力必須是使 用已知用於評估抗體對抗原結合的多種方法之任一可測量到的。此外，本文中多價抗體的 每個抗原結合位點的抗原結合親和性不必定量相同。對於本文中的多聚體抗體，功能性抗 原結合位點的數目可以使用超速離心分析來評估。依照這種分析方法，將靶抗原與多聚體 抗體以不同比例混合，並計算複合物的平均分子量，其中假設不同數目的功能性結合位點。 將這些理論值與得到的實際實驗值進行比較以評估功能性結合位點的數目。具有指定抗體的「生物學特徵」的抗體指具有該指定抗體區別於其它結合相同抗 原的抗體的一項或多項生物學特徵的抗體。為了篩選這樣的抗體，其結合由目的抗體結合的抗原的表位，可以實施常規交叉 阻斷測定法，諸如抗體，實驗室手冊(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室， Ed Harlow 和 David Lane (1988)中所記載的。術語「拮抗劑」在用於本文時指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾本發明蛋 白質的活性(包括其與一種或多種受體的結合(在配體的情況中)或與一種或多種配體的 結合(在受體的情況中)的分子。拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、 糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥用藥劑及其代謝物、轉錄和翻譯 控制序列等。拮抗劑還包括本發明蛋白質的小分子抑制劑、和融合蛋白、特異性結合蛋白質 由此使其隔絕(sequester)與其靶標結合的受體分子及衍生物、蛋白質的拮抗性變體、針 對本發明蛋白質的反義分子、RNA適配體、和針對本發明蛋白質的核酶。「阻斷性」抗體或「拮抗性」抗體指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗 體。某些阻斷性抗體或拮抗性抗體實質或完全抑制抗原的生物學活性。術語「VEGF」和「VEGF-A」可互換使用，指165個胺基酸的血管內皮細胞生長因 子及相關的121個、145個、183個、189個和206個胺基酸的血管內皮細胞生長因子，如 Leung 等科學(Science)，M6 :1306(1989) ；Houck 等分子內分泌學(Mol. Endocrin.)，5 1806(1991)；及 Robinson齕tringer，細胞科學雜誌(Journal of Cell Science)，144 (5) 853-865(2001)所記載的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、 VEGF-C, VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要結合兩種高親 和性受體酪氨酸激酶，即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk_l/KDR)，後者是VEGF-A血管內皮 細胞有絲分裂信號的主要遞質。術語「VEGF」或「VEGF-A」還指來自非人物種(諸如小鼠、 大鼠或靈長類動物)的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF用如下術語表示，諸如hVEGF表 示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。術語「VEGF」還用於指包含165個胺基酸的人血管內皮細胞生長因子的胺基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。「截短的」天然VEGF 的胺基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位胺基酸 (甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF 相當的對KDR和Flt-I受體的結合親和性。"VEGF拮抗齊『指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或幹擾VEGF活性(包括其與一 種或多種VEGF受體的結合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其 抗原結合片段、特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結合的受體分子及衍生 物(例如可溶性VEGF受體蛋白質或其VEGF結合片段、或嵌合VEGF受體蛋白質)、抗VEGF 受體抗體和VEGF受體拮抗劑(諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑)、及融合蛋白(例 如 VEGF-Trap (Regeneron) ,VEGF121-多花白樹毒蛋白(Peregine))。VEGF拮抗劑還包括VEGF 的拮抗性變體、針對VEGF的反義分子、RNA適配體、和針對VEGF或VEGF受體的核酶。可用 於本發明方法的VEGF拮抗劑進一步包括特異性結合VEGF的肽基或非肽基化合物，諸如抗 VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF的多肽或其片段；至少與編碼VEGF多肽的 核酸分子的片段互補的反義核鹼基(nucleobase)寡聚物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分 子的片段互補的小RNA ；靶向VEGF的核酶；針對VEGF的肽體(ρ印tibody)；及VEGF適配體。 在一個實施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達水平或生物學活性降低或抑制至少10%、 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在另一個實施方案中，受到VEGF拮 抗劑抑制的 VEGF 是 VEGF (8-109)、VEGF (1-109)或 VEGF165。術語「抗VEGF抗體」或「結合VEGF的抗體」指能夠以足夠親和性和特異性結 合VEGF的抗體，該抗體在靶向VEGF中可用作診斷劑和/或治療劑。例如，本發明的抗 VEGF抗體可在靶向和幹預其中牽涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治療劑。參見例如美 國專利 6，582，959，6，703，020 ；W098/45332 ；W096/30046 ；W094/10202 ；W02005/044853 ； EP0666868B1 ；美國專利申請 20030206899,20030190317,20030203409,20050112126, 20050186208 和 20050112126 ;Popkov 等，免疫學方法雜誌(Journal of Immunological Methods) 288 :149-164(2004)；及W02005012359。所選擇的抗體通常具有針對VEGF的足夠 強的結合親和性，例如所述抗體可以以介於IOOnM-IpM之間的Kd值結合hVEGF。抗體親和 性可以通過例如基於表面等離振子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開 號TO2005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法(ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來 測定。所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此 類測定法是本領域已知的，而且依賴於所述抗體的靶抗原和預期用途。實例包括HUVEC抑 制測定法；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如W089/06692所記載的)；抗體依賴性細胞的 細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500，36 ；及激動性 活性或造血測定法(參見W095/27062)。抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同源物，諸 如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不結合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在 一個實施方案中，抗VEGF抗體包括與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體 A4. 6. 1結合相同表位的單克隆抗體；重組人源化抗-VEGF單克隆抗體(見I^esta等(1997) 癌症研究(CancerRes.) 57 :4593-4599)，包括但不限於稱為「貝伐珠單抗(BV) 」、也稱為 "rhuMAb VEGF」或「AVASTIN 」的抗體。貝伐珠單抗包含突變的人IgGl構架區和來自鼠抗體 A. 4. 6.1(其阻斷人VEGF結合其受體)的抗原結合互補性決定區。貝伐珠單抗大約93%的胺基酸序列(包括大部分構架區)衍生自人IgGl，而大約7 %的序列衍生自A4. 6. 1。貝伐珠 單抗具有約149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐珠單抗和其它人源化抗VEGF 抗體進一步記載於2005年2月沈日授權的美國專利號6，884，879。其它抗-VEGF抗體包 括G6或B20系列抗體(例如G6-23、G6-31、B20-4. 1)，如PCT申請
發明者埃倫·菲爾瓦羅夫, 布朗東·威利斯, 納波萊奧內·費瑞拉 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司