臍帶間充質幹細胞的製備方法
2023-10-10 00:15:04 1
專利名稱：臍帶間充質幹細胞的製備方法
技術領域：
本發明涉及臍帶間充質幹細胞的獲取方法，更具體地涉及一種酶消化法來製備臍 帶間充質幹細胞的製備方法。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)最早是從骨髓分離出的成體幹細 胞。MSC具有較強的粘附性，低密度培養時能夠迅速貼壁，且具有快速增殖的能力。MSC體外 培養能保持核型的穩定及端粒酶的活性。目前主要是根據其形態、抗原表型及分化潛能來 鑑定MSC。傳代後骨髓MSC的形態呈單一類成纖維細胞的長梭形。迄今尚未發現MSC的特異 性表面標誌，MSC均勻穩定的抗原標記包括:SH2 (+)、SH3 (+)、CD29 (+)、CD44 (+)、CD71 (+)、 CD90 (+)、CD106(+)、CD120a(+)、CD124(+)，不表達造血細胞表面標誌 CD34、CD45、CD14、 CDl 17和與移植免疫排斥發生密切相關的表面標誌HLA-DR、B7-1 (CD80)、B7_2 (CD86)、CD40 等。MSC在體外不同的微環境誘導下可向不同的組織分化，用地塞米松，β-磷酸甘油和抗 壞血酸等聯合誘導，MSC可以分化為成骨細胞；在3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，吲哚美辛作用 下，MSC可分化為成脂細胞；用β-巰基乙醇，全反式視黃酸為誘導劑，MSC可分化為神經細 胞等。1991年，McElreavey等首次報導，從人臍帶的Wharton，s jelly組織中分離並培 養到了一種成纖維樣細胞，具有較強的分化潛能，可向多個方向進行分化。隨後，數位研究 者也分別報導臍帶中含有豐富的MSC。臍帶MSC具有骨髓MSC相類似的特點形態似長梭 形，表達以上骨髓MSC的一組抗原標記以及多向分化潛能。但其還具有自身獨特的優勢臍 帶MSCs不表達主要組織相容性複合物(MHC) II類抗原，表達MHC-I類抗原，但不表達或低 表達移植免疫排斥相關的共刺激因子⑶80、⑶86、⑶40和⑶40 L等，因此是一類免疫缺陷 細胞，可用來與造血幹細胞共移植，預防和治療急性移植物抗宿主反應(GVHD)。臍帶是分娩 後的廢物，取材方便，易於收集、保存、冷凍，不受倫理道德及法律方面的限制，且細胞較為 原始，分化能力強，生物性能穩定，可以為實驗和臨床提供充足的細胞來源，因此在細胞治 療方面具有廣闊的臨床前景。目前國內外各家實驗室存在多種分離臍帶MSCs的方法，歸納起來主要是利用流 式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法，以及酶消化法進行分離純化臍帶MSCs。流式細胞儀分 選與免疫磁珠分選間充質幹細胞的方法成本高，操作繁瑣，大量細胞的分離純化受到限制， 且目前仍未找到MSCs特有的特異性抗原標記，因此大多數實驗室使用酶消化法。然而，不 同實驗室的酶消化方法也各不相同，首先是消化的臍帶組織不同，大多數實驗室消化的是 從臍帶中刮出的Wharton膠狀物或是將臍帶組織整個剪碎為l_2mm3大小的組織塊進行消 化，操作較為複雜，且容易汙染；另外，所用的酶的種類不同，如Sachiko使用膠原酶與透明 質酸酶消化，而Wangs則單獨使用膠原酶消化，這些均能得到臍帶MSCs，但是細胞得率各不 相同，且細胞能傳代的次數各不相同。
發明內容
本發明旨在建立一種簡單有效且得率高的臍帶MSCs分離方法，為新生兒儲存臍 帶間充質幹細胞以及今後大規模臨床應用臍帶間充質幹細胞奠定基礎。本發明提供一種簡單高效的臍帶間充質幹細胞分離方法，包括(1)臍帶剔除血管的處理；(2)酶消化步驟，(3)收集消化後的細胞；(4)對收集獲得的細胞進行培養；其特點是所用的酶為2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml膠原酶I+2U/ml透明質酸酶。根據本發明的實施例，優選的消化時間為16小時。消化後，將未消化的組織用鑷子夾出，收集消化的細胞懸液，加入生理鹽水後離 心，2000r, 20min,小心棄除上清液，用生理鹽水洗滌，離心，棄上清。細胞冰醋酸稀釋後計 數，細胞培養在含10% FBS+10ng/mlbFGF的DMEM/F12培養基中，37°C、5% C02培養箱內培 養。細胞貼壁後，每隔2 3d更換培養基，約過7-10天，細胞即可80%匯合後，以胰酶/ EDTA消化即可得到原代的臍帶間充質幹細胞。根據本發明的實施例，證實1用本發明的方法製備得到的細胞為臍帶MSC。原代培養時大多數細胞呈成纖維樣的長梭形，折光性強，胞核為圓形或橢圓形， 位於胞體的中央，胞質較豐富，少部分細胞呈上皮樣結構，為扁平的多角形，緊密相連(圖 1A)。細胞生長達80%匯合時，用胰酶消化並按1 3的比例傳代，傳至第二代時，細胞形態 為均一的成纖維樣的長梭形(
圖1B)。應用流式細胞技術我們分析了傳代培養後類成纖維 樣細胞的表面標誌，類成纖維樣細胞高表達間質細胞表面標誌CD29，CD90和多能幹細胞標 志0CT-4，SSEA4 ；不表達造血和內皮細胞標誌⑶34，⑶45，⑶31，KDR (圖2)。應用細胞免疫 化學方法，細胞質中可檢測到高表達的細胞骨架蛋白Vimentin，SMA, Desmin (圖3)。上述 結果表明傳代培養後類成纖維樣細胞表達間質細胞的表面標誌，不表達造血和內皮細胞標 志。類成纖維樣細胞在含有地塞米松、維生素C、磷酸甘油鈉的成骨誘導培養體系中培 養，細胞胞體逐漸變大，由單一的類成纖維樣細胞的梭形變成三角形或多邊形。局部細胞可 呈多層生長，細胞聚集區可見細胞外基質分泌增多，形成大小不一的顆粒狀沉澱。成骨誘導 30d後，鹼性磷酸酶染色呈紅色(圖4A)，Von Kossa染色有黑色的礦物沉澱(圖4B)。傳代 培養後類成纖維樣細胞在含有吲哚美辛、3_異丁基-1-甲基黃嘌呤和胰島素的成脂誘導分 化體系中培養，隨著誘導時間延長，細胞內呈空泡樣的脂滴逐漸增多並相互融合，細胞由長 梭形變為圓形或多邊形，誘導14天後油紅0染色呈紅色(圖5)，表明有大量脂質沉積。根 據以上的細胞成纖維樣形態、表達間質細胞的表面標誌及向成骨成脂分化潛能證實了我們 所得的細胞為臍帶MSC.2.同時，根據本發明的實施例，還證實新的方法比其餘方法簡單高效。實驗中我們比較了不同的酶混合液消化5cm去除血管後的臍帶組織的結果。結果 顯示，單獨使用胰酶消化或先用中性蛋白酶再用胰酶消化，細胞得率均非常低，分離得到的 單個核細胞很難貼壁，即使將臍帶組織剪碎後再消化，得到的結果也類似。因此我們主要比 較了應用中性蛋白酶與膠原酶I兩種酶混合液和中性蛋白酶、膠原酶I與透明質酸酶三種酶混合液進行消化後的結果。如表1所示，應用兩種酶的混合液消化單位長度去血管臍帶 組織，消化後的細胞得率及培養一定時間後細胞得率與用三種酶的混合液消化結果類似， 但是前者消化後得到的細胞懸液非常粘稠，需要大量的生理鹽水反覆稀釋洗滌後，細胞才 能接種，而後者消化後按常規方法洗滌細胞即可，可能由於臍帶組織富含透明質酸，消化液 中加入了透明質酸酶後，將透明質酸消化，從而去除了消化後細胞懸液的粘稠性，使後續的 處理更容易。文獻報導臍帶Wharton膠和間質組織均含有間充質幹細胞，本研究中我們應用不 同的方法分別分離了 Wharton膠狀物和包含Wharton膠的去除血管後臍帶組織的間質幹 細胞。我們使用三種酶混合消化Wharton膠狀物和去除血管後臍帶組織，細胞得率如表2 所示，含Wharton膠的臍帶組織消化後，細胞得率、培養10天後得到的細胞數均明顯高於 Wharton膠組織。因此，我們認為應用三種酶混合液消化去除血管後的臍帶間質組織不需要刮膠， 也不需將臍帶組織剪碎，操作簡便，減少了汙染的機會，細胞得率更高，不失為臍帶間質幹 細胞分離較好的方法。表1 不同酶混合液消化5cm去血管臍帶組織結果
權利要求
臍帶間充質幹細胞分離方法，包括(1)臍帶剔除血管的處理；(2)酶消化步驟，(3)收集消化後的細胞；(4)對收集獲得的細胞進行培養；其特點是所用的酶為2U/ml中性蛋白酶+2mg/ml膠原酶I+2U/ml透明質酸酶。
2.根據權利要求1所述的臍帶間充質幹細胞分離方法，其特徵在於消化時間為16小
全文摘要
本發明公開了一種人臍帶間充質幹細胞的製備方法，本發明的步驟包括(1)取人臍帶用酒精消毒，生理鹽水洗滌後剔除血管；(2)加入膠原酶、透明質酸酶、蛋白中性酶消化；(3)收集細胞懸液，離心，棄去上清液，培養，即可獲得間充質幹細胞。本發明為新生兒儲存臍帶間充質幹細胞以及今後大規模臨床應用間充質幹細胞提供了一種較為簡單、高效的分離方法。
文檔編號C12N5/0775GK101948804SQ20101051771
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月25日 優先權日2010年10月25日
發明者盧光琇, 程臘梅, 肖娜 申請人:湖南光琇高新生命科技有限公司