一種丙二醯單醯輔酶a∶acp轉醯基酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-10-29 22:07:42

專利名稱：：一種丙二醯單醯輔酶a∶acp轉醯基酶及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物領域，具體涉及一種酶。
背景技術：
：雞球蟲病是嚴重危害集約化養雞業生產的最主耍疫病，每年因此而造成的經濟損失高達25億英鎊以上，其病原是頂復門原蟲類的艾美耳球蟲(￡/7'"，其中危害最大的是柔嫩艾美耳球蟲(&wen'atene&)。我國對此雖然至今無準確統計，伹最保守的估計其損失應不小於25億元RMB。化學藥物治療是控制雞球蟲病的重要措施之一，但目前雞球蟲廣泛而嚴重的抗藥性迫切需要新的抗球蟲藥物面市。目前，國內外已有部分實驗室開始進行抗球蟲藥物的研究，但尚無理想的二線候選藥物的報導。有多種原因限制了新型抗球蟲藥物的研製，首先是現有的藥物作用機理不清楚，故而當抗藥性出現的時候人們束手無策，無法象抗生素一樣根據其藥靶分子的結構特徵進行藥物的結構改造來延續藥物使用；其次，傳統的抗球蟲藥物篩選方法是化學篩選法，該方法費時、費力，並li帶有很大的盲目性，不適合高通量的新型藥物篩選等。閃此，專家認為抗球蟲藥物的研製需要技術創新，新的藥物靶點的發掘將有助T抗球蟲藥物的開發。脂肪酸對於所有生物的生存都是必需的。現有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲(五^en》te恥//。)典型細菌樣的II型脂肪酸合成酶在其脊椎動物宿主中並不存在，這一巨大的差異是將這一代謝途徑中的關鍵酶作為藥物靶標的重要前提。一些細菌及W柔嫩艾美耳球蟲進化關係密切的剛地弓形蟲(7bxop/。^^go"&'0、惡性瘧原蟲(屍toswo力ww/a/c^flraw)的研究結果證實，丙二醯單醯輔酶A:ACP(醯基載體蛋白)轉醯基酶(malonyl-CoA:ACPtransacylase,MCAT)在II型脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用，負責在起始步驟把丙二醯基團從丙二醯單醯輔酶上CoA基團的硫酯連接部位轉移到ACP的磷酸泛醯巰基乙胺臂h形成丙二醯單醯ACP，為脂肪酸的延伸提供底物，是II型脂肪酸合成途徑中的關鍵酶，成為開發藥物的理想靶位。但目前尚無柔嫩艾美耳球蟲MCAT的相關研究報導，更未見到用其進行新型抗球蟲藥物的篩選報導。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種新的丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶。本發明解決上述問題的技術方案是一種丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶，該酶的胺基酸序列為SEQNO.1。本發明所述丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶由312個胺基酸構成，是柔嫩艾美耳球蟲(￡!>"""""/0)特有的醯基轉移酶，負責在II型脂肪酸合成途徑的起始步驟把丙二醯基團從丙二醯單醯輔酶上CoA基團的硫酯連接部位轉移到ACP的磷酸泛醯巰基乙胺臂上形j^丙二醯單醯ACP，為脂肪酸的延伸提供底物，是柔嫩艾美耳球蟲II型脂肪酸合成途徑中的關鍵酶。3本發明所述丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶的完整基因的cDNA序列如SEQNO.2所示，編碼的379個胺基酸，其中第121個胺基酸所構成的區域具有典型的信號肽特徵，第2267個胺基酸所構成的區域可能是轉導肽，第68397個胺基酸所構成區域即是本發明丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶。該酶的完整基因所編碼的379個胺基酸肽鏈上沒有糖基化位點，可知該酶不需要經過糖基化即可正確摺疊，因此通過原核表達來生產該酶是完全可以實現的。編碼本發明所述轉醯基酶的核酸序列為SEQNO.3,將具有該序列的DNA片段克隆到原核表達載體中進行表達即可獲得本發明酶，具體方法如下將核酸序列為SEQNO.3的DNA片段克隆到帶有融合標籤的原核表達載體中，然後轉化到原核宿主內獲得重組菌；將所得重組菌在1637TT卜—用異丙基-e-D-硫代半乳糖苷誘導培養36小時，使其表達本發明酶和融合標籤的融合蛋白；最後將誘導培養後的重組菌裂解，取上清液，利用融合蛋白所帶的融合標籤分離純化出本發明所述的酶即可。通過原核表達獲得的本發明轉醯基酶通常以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在，以可溶性蛋白形式表達的酶具有較高的酶活，但是以包涵體形式表達的酶在復性後則有可能喪失大部分甚至全部的活性。本發明人發現，有的重組菌產生的本發明轉醯基酶同時以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在，有的僅以包涵體的形式存在，這勾所選的表達載體有關，如pMAL-c2x和pET-32a(+)兩種表達載體在重組了核酸SEQNO.3後轉入大腸桿菌Rosseta(DE3)中，經誘導表達所得的發明所述轉醯基酶同時存在包涵體和可溶性蛋白兩種形式；但重組了核酸SEQNO.3的pProExHTa轉入大腸桿菌Rosseta(DE3)後誘導表達的本發明酶僅以包涵體形式存在。本發明酶的可溶性表達量則與培養溫度有很大關係，在低溫卜誘導表達可獲得較高產量的本發明酶的可溶性蛋白，如重組了片段SEQNO.3的pMAL-c2x轉入大腸桿菌Rosseta(DE3)在16。C下誘導表達所得的可溶性蛋A佔總酶^的百分比可高達90%以上，溫度越低可溶性表達所佔的比率越高。由於本發明所述酶為柔嫩艾美耳球蟲II型脂肪酸合成途徑中的關鍵酶，抑制該酶的活性可導致柔嫩艾美耳球蟲脂肪酸代謝的紊亂，引起球蟲死亡，但對其宿主——雞的脂肪酸代謝沒有影響，從而達到抑制柔嫩艾美耳球蟲入侵雞腸道細胞目的，因此本發明所述酶可作為抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的作用靶標，用於篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物，具體方法如下(1)將本發明所述的酶與待篩選藥物在28'C孵育1小時；(2)測定經步驟(I)處理的本發明所述酶的酶活，如果酶活有明顯下降，說明該藥物具有抗柔嫩艾美耳球蟲活性。圖1為誘導前和誘導後Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT、Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT禾口Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT菌體的SDS-PAGE電泳圖，其中，泳道M為標準蛋白，kDa欄下的數字表示標準蛋白的分子量，泳道O為未經誘導的菌體對照，泳道l.11.3分別為在37'C、30'C和16'C下誘導培養Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT的表達產物，泳道2.12.3分別為在37°C、30'C和16。C下誘導培養Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT的表達產物，泳道3.13.3分別為在37°C、30'C和16。C下誘導培養Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT的表達產物。圖2是本發明酶對丙二醯單醯輔酶A的反應速率曲線圖。圖3是本發明酶對ACP的反應速率曲線圖。圖4是本發明酶濃度與酶促反應速率的關係曲線圖。圖5是Corytuberine的濃度與酶活抑制率的關係曲線圖。圖6是子孢於數目與AACTn值的標準曲線圖。圖7是Corytuberine的濃度與子孢子入侵雞細胞抑制率的曲線圖。具體實施方式例1製備例1.本發明酶的獲得].1柔嫩艾美耳球蟲總RM的提取按Invitrogen公司的TRIZ0LLSReagent試劑盒操作如下(1)將純化的裂殖子置於Free-Rnase印pendorf管內，加入1mLTRIZOLLSReagent,在1530'C孵育15min，使核酸蛋白完全降解。(2)加入0.2mL氯仿，劇烈振搖15s，置於153(TC孵育10min。在28°C(4°C)12000g離心15min，取上層水相寸一新Free-Rnaseeppendorf管中。(3)每lmLTRLZ0LLSReagent處理樣品加0.5mL異丙醇沉澱RNA，先在1530。C孵育lOmin，後在28'C(4°C)12000g離心10min。(4)棄上清，用75%乙醇(1%。DEPC水配製)洗滌沉澱，每1mLTRLZOLLSReagent處理樣品加至少1mL75%乙醇，在28°C(4°C)8000g離心5min。(5)棄上清，室溫乾燥沉澱lOmin。(6)用無RNase酶水(50A)溶解沉澱，取用瓊脂糖凝膠進行快速電泳，並用分光光度計測定RNA濃度，然後置T—70'C保存備用。1.2重組表達載體的構建通過RT-PCR方法從總RNA中擴增出編碼本發明所述酶功能區域的基因片段，分別克隆到pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa三種原核表達載體中，然後將重組載體分別轉化到大腸杆齒Rosseta(DE3)，具體方法如卜.(I)根據序列表中的SEQNo.3的序列設計特異性引物，在引物的上遊序列中引入S謹HI酶切位點，在下遊引物引入Sa/I酶切位點；並分別加"CGC"3個鹼基以保證內切酶發揮作用。EtMCAT3F:5'CGCGGATCCCCAATGAAGCGAGTGGCGCTGTTCT3'(SEQNO,4)EtMCAT3R:5'CGCGTCGACTCACTCGACTCTGACGGTGCGGAC3'(SEQN0.5)以步驟1所得總RNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得EtMCAT的功能片段。用Promega公司的RT-PCR試劑盒按照表1所示的反應體系進行。表ltableseeoriginaldocumentpage6RT-PCR反應程序如下:反轉錄合成48°C45min反轉錄合成48°C45min94'C變性30s，57.6。C退火45s卜30cycles72'C延伸lminJ72'C延伸7min4°C(2)將擴增的片段進行SawHl和&/I雙酶切後，分別與預先用SawHl和&/I雙酶切過的pMAL-c2x、pET-32a(+)和pProExHTa用T4連接酶進行連接，得到重組載體pMAL-c2x-MCAT、pET-32a(+)-MCAT和pProExHTa-MCAT。(3)將重組載體pMAL-c2x-MCAT、pET-32a(+)-MCAT和pProExHTa-MCAT分別轉到大腸桿菌JM109進行亞克隆，使重組質粒進行複製增值，然後分別按以下方法篩選和鑑定陽性克隆經藍A斑和A即篩選，挑單菌落搖菌，進行菌液PCR和酶切鑑定出陽性克隆；最後抽提各重組載體的陽性克隆質粒分別用CaCl2法轉化大腸桿菌Rosseta(DE3)感受態細胞(轉化子的篩選和鑑定方法同上)，得重組菌Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT、Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT和Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT。1.3本發明酶的誘導表達(1)挑取Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT和Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT重組菌的單菌落分別接種於10ml含Arap的LB培養液；挑取Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT重組菌的單菌接種於10ml含Arap和0.2%的葡萄糖的LB培養液，37'C搖菌過夜。(2)取Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT和Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT過夜培養物，分別按1:100接種丁'1.5L含有Amp的LB培養液，Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT過夜培養的菌液按1:100接種於1,5L含有A即和0.2%的葡萄糖的LB培養液，然後將每種重組菌的接種液均分為3組，分別在37°C、30'C和16'C下培養至A,=0.4，再分別加入IPTG至終濃度ImM進行誘導；其中，37'C培養組誘導3小時；30'C培養組誘導6小時；iei;培養組過夜誘導培養。在誘導前每組各取lml菌液，離心後4t:保存備用；誘導結束後，根據各組Ae。。的值，分別取與誘導前相同細齒數的菌液，離心後4t:保存備用。G)將誘導結束的各組培養液分別按以下方法處理4500r,/min離心20分鐘，棄上清夜；菌體用20mL，0.1MTris-HCL(pH7.4)的緩衝液(含50U1100mM的PSMF)重懸,加溶菌酶至終濃度lmg/L，2(TC凍存過夜;凍存過夜的裂解液，冰浴解凍後用超盧波裂解破碎；9000r/min離心20分鐘，分離上清液和沉澱物。(4)所述上清液中可能包含本發明酶的可溶性蛋白，Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT和Rosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT誘導表達菌的上潔液經NTAAgarose柱提取純化，Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT誘導表達菌的上清液經AmyloseResin柱提取純化。所述沉澱物中可能含有本發明酶的包涵體，用20mL0.1MTris-HCL(pH7.4)緩衝液(含50U1lOOmM的PSMF)重懸，經尿素變性和復性後，按與可溶性蛋白純化方法相同的方法純化。2.各重組菌目的蛋白表達呈的測呈2.1方法誘導前、各種溫度誘導後的菌體經A,值換算後等量加樣進行SDS-PAGE電泳，結果如圖1所示；由BandScan軟體分析目的蛋白的表達量。2.2結果通過DNAStar預測可知Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mat表達的蛋白為73kDa(載體蛋AMBP42.5kDa+本發明轉醯基酶32.5kDa),Rosseta(DE3)/pProExHTa-mat表達的蛋白為33.5kDa(載體His標籤1.0kDa+本發明轉醯基酶32.5kDa),Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-mat表達的蛋白為52.5kDa(載體TrxA蛋白+His標籤20kDa+本發明轉醯基酶32.5kDa)。誘導前、各種溫度誘導後的齒體的SDS-PAGE電泳結果如圖1所示，誘導表達後的Rosseta(DE3),/pMAL-c2x-MCAT、Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT禾I'JRosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT分別表達大小為73kDa、52.5kDa和33.5kDa的目的蛋白，與DNAStar預測結果相符，說明各菌體在16'C、3(TC和37-C下誘導培養均表達了本發明酶。通過BandScan軟竹分析圖1各泳道目的蛋O的表達量，結果顯示Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT、Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT有較好的產率，且溫度越低本發明酶佔總菌體蛋白的百分比越高(見表2)。表2tableseeoriginaldocumentpage8綜合上述因素,誘導表達本發明酶的溫度應控制在較低溫度下，其中16'C下誘導培養為最佳。3.酶活測定3.1方法利ffl酮戊:.:酸脫氫酶(KDH)偶連繫統測定表達產物酶活性。在這個測定系統中，所述表達產物催化底物丙二醯單醯輔酶A(Malonyl-CoA)和醯基載體蛋白(holo-ACP)生成產物輔酶A(coASH)和醯基載體蛋白，如反應式①，而生成的輔酶A又可作為酮戊二酸脫氫酶(KDH)的底物，在酮戊二酸脫氫酶的催化下，與底物NAD和a酮戊二酸生成終產物NADH,醯基輔酶A和C02,如反應式②；NADH可在340nm激發波長和465nm發射波長的條件下，發射螢光，通過檢測螢光值的變化，參照此條件下NADH的標準曲線來測定EtMAT的酶活性。本試驗用PerkinElmer公司Victor31420-524型多功能讀板儀動態檢測螢光數值。Malonyl-GoA+holo-ACPmalonyl-ACP+CoASH①CoASH+NAD+a-ketoglutarateAcetyl-CoA+NADH+C02②具體測定方法如下(1)配製以下3種反應液A液將待測酶活的樣品加到含50mMPBbuffer(pH6.8)，lmMEDTA,lmMDTT和0.1mg/mlBSA的溶液中。B液將Malonyl"CoA溶於含50mMPBbuffer(pH6.8)'lmMEDTA和lmMDTT的溶液中。C液將ACP和KDH共溶於含8mMa-ketoglutaricacid,lmMNAD和0.8mMTPP的溶液中。(2)將上述3種反應液及圓底黑色96孔板放入已設定為28'C的讀板儀中預加熱5分鐘。(3)依次將A液、C液和B液加入到圓底黑色96孔板中，並在同一板上設定無EtMCAT而用Tag、無KDH、無malonyl-CoA、無五.co//holo-ACP的對照。(4)混勻後立即開始用ViCtorTM31420-524型多功能讀板儀在激發波長340nm和發射波K465nm在28'C測定相對螢光值(RFU)，設定儀器30秒一個循環動態讀取螢光值共15分鐘，每一反應進行3次重複。3.2結果對各重組菌所產表達產物的酶活檢測結果顯示，Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT和Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT所表達的可溶性蛋白具有較高的酶活性，可催化底物丙二醯單醯輔酶A(Malonyl-CoA)和醯基載體蛋白(holo-ACP)生成產物輔酶A(coASH)和醯基載體蛋白，但Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-MCAT、Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT禾lRosseta(DE3)/pProExHTa-MCAT所產生的包涵體在復性後兒乎完全失去酶活(見表4)。表4菌體酶活(,1/mg/min)可溶性蛋白包涵體Rosseta(DE3)/pMAL-c2x-mat74.05±6.%5.12±1.98Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-mat73,25±4.860Rosseta(DE3)/pProExHTa彌t——0通過對Rosseta(DE3)/pET-32a(+)-MCAT所產的酶的反應速率的測定，發現該酶最大反應速率Vmax=549.76±6.96nmol/min,根據公式得出KmMal。ny|-CoA=22.8±4.04uM，KmACP=20.7±4.62uM(如圖2和3所示)，與其它物種的米氏常數相近。綜合上述因素，誘導表達本發明酶的原核載體應選擇pMAL-c2x禾『l,/pET-32a(+)，其中pMAL-e2x為最佳。例2應用例本實施例將介紹如何利用本發明酶構建篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的模型，並利用該模型篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物。1.抗柔嫩艾美耳球蟲藥物篩選方法的構建(1)將本發明酶(以下簡稱EtMCAT)與待篩選藥物在28'C孵育1小時；(2)測定經步驟(1)處理的EtMCAT的酶活，如果EtMCAT的酶活下降，說明該藥物具有抗柔嫩艾美耳球蟲活性。2.抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的篩選2.]最適酶量的確定2.1.1方法按照例1第3.1節的酶活測定方法，測定EtMCAT在濃度分別為0.125，0.25，0.5,0.75,1和L25ug/反應下的反應速率(RUF)，然後以RUF為縱坐標、EtMCAT的濃度為橫坐標作圖，如附圖4所示。92.1.2結果如圖4所示，EtMCAT在濃度為0.125lug/反應時，濃度與RUF成線性關係，本例取在線性範圍內的濃度0.75ug/反應作為篩選濃度。2.2抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的篩選2.2.1待篩選藥物紫堇塊莖鹼(Corytuberine)2.2.2方法2.2.2.1Corytuberine對EtMCAT酶活的影響將紫事:塊S鹼(Corytuberine)溶於1%的二甲基亞碸(DMSO)配製成以下濃度的溶液1、]0、50和250uM。將不同濃度的Corytuberine與EtMCAT在28。C預孵育]小時，同時設DMSO對照(即用等體積不含Corytuberine的DMSO同方法處理EtMCAT)。按照例1第3.1節測定酶活的方法測定不同濃度Corytuberine處理後的EtMCAT的RFU動態值，建立RFU/時間的動態曲線。2.2.2.2Corytuberine對KDH酶活的影響首先配製以下反應液A反應液的配製CoA加到含50mMPBbuffer(pH6.8)，lmMEDTA,lmMDTT配製成60uM的存儲液；B反應液的配製KDH加入到75nL含有50mMPBbuffer(p.H6.8)，lmMEDTA，lmMDTT，2.67mMa-ketoglutaricacid，0.33mMNAD，0.267mMTPP;然後按反應方程CoASH+NAD+a-ketoglutarate<KDH:Acetyl-CoA+NADH+C02建立反應體系反應體系為100ixL,其中所含各物質終濃度分別為PBbuffer(pH6.8)50mM，EDTAlmM,DTTlmM，a-ketoglutaricacid2mM，NAD0.25mM,TPP0.2mM，CoA15uM，KDH3.75mU/100^L:最後設4個反應體系，按順序加入A反應液21.5nL、B溶液75nL和經不同濃度的Corytuberine處理過的EtMCAT3,5^L，混勻後立即開始用VictorTM31420-524型多功能讀板儀在激發波長340nm和發射波長465nm在28'C測定NADH的相對螢光值(RFU)，設定儀器30秒一個循環動態讀取螢光值共15分鐘，每一反應進行3次重複；另外，同一板上設定無KDH、無CoA、無NAD、無a-ketoglutamte以及DMSO的對照。2.2.3結果Corytuberine對EtMCAT酶活的影響如表5所示，DMSO對照對EtMCAT的酶活性沒有影響，各陰性對照均不能催化反應。反應體系的速率隨著Corytuberine濃度的增加而降低，可見Corytuberine可有效地抑制EtMCAT的酶活。10表5tableseeoriginaldocumentpage11Corytuberine對KDH酶活的影響如表6所示，Corytuberine對KDH酶活無影響。表6tableseeoriginaldocumentpage11以Coiytuberine濃度值的對數作為X值用方程y-min+(max-min)/卩+(x/EC50;THillslope]進行標準曲線分析；結果如圖5所示，Corytuberine對EtMCAT的105為16.47土2.38uM'進一步說明Corytuberine能夠有效的抑制EtMCAT活性。根據本發明所建立的抗柔嫩艾美耳球蟲藥物篩選模型，認為Corytuberine具有抗柔嫩艾美耳球蟲活性。2.2.3Corytuberine抗柔嫩艾美耳球蟲活性的驗證2.2.3.1雞球蟲細胞培養採用常規的細胞培養技術製備雞腎原代細胞，參見1970年Doran報導的方法。試驗球蟲為柔嫩艾美耳球蟲(及wer/aHoton株)，子孢子製備方法參照1994年Xie報導的方法。將Corytuberine溶於0.1%的二甲基亞碸(DMSO)配製成1000ug/mL的母液。取細胞培養液，分裝為4瓶，先分別加入製備好10000個的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，然後加入Corytuberine母液使Corytuberine的最終濃度為1、10、20、50禾(l100ug/mL，混勻後分別加入到已培養至覆蓋培養板面積>70%的貼壁雞腎細胞上同時，在製備的細胞培養板上，只加入數量梯度為100個、1000個、10000個和100000個的子孢子，為藥物評價時製備標準曲線所用。培養8小時後，用新鮮的細胞培養液洗去沒有入侵的子孢子和加入的Corytuberine,繼續培養16小時。上述方法中，所述的細胞培養液的製備方法為取pH值為7.4的完全培養基RPM1-1640,每毫升加青黴素00IU、鏈黴素00嗎和10%滅活胎牛血清。上述各樣品均進行3次重複試驗。2.2.3.2藥物作用效果的檢測(1)將上述培養物分別ffl0.05%EDTA和0.25%胰酶洗脫，離心收集洗脫的腎細胞和入佼的子孢子，用高通量的RNA抽提試劑盒同時提取各樣品的總RNA。立即fflReal-time專用的反轉錄試劑盒將提取的不同樣品RNA進行反轉錄，得各樣品的cDNA，4'C保存待用。(2)根據已報導的雞18SrRNA基因序列和雞柔嫩艾美耳球蟲的卩-actin基因序列設計Real-timeRT-PCR引物用於擴增雞18SrRNA基因長為170個核苷酸的序列片段的引物上遊C18F:AGAAACGGCTACCACATCC(SEQNO.6)下遊C18R:GCACCAGACTTGCTC(SEQNO.7)用於擴增雞柔嫩艾美耳球蟲的p-actin基因長為305個核苷酸的序列片段的引物上遊PactinF:CACACCGCCGAGAAGA(SEQNO.8)下遊PactinR:GAACAACATTGCCGTAGAGG(SEQNO.9)分別以步驟(1)所得的各樣品的cDNA為模板在螢光定量PCR儀中進行檢測。(3)將利用引物對PactinF十PactinR檢測的各樣品&值表示為CT[Pactml，引物對C18F+C18R檢測的相同樣品CT值表示為CT[,ssj。將同一樣品中二者的差值表示為act,如下△CT=CT|pactinJ-CT[ci8sj然後將各樣品的aCt但(ACh)與最低的aCt但(Act,灘減得到aact值表示為AActn:△△CTn=ACTn-ACTI將只加入100個、1000個、10000個和100000個的子孢子的樣品和AACT。值進行分析，發現子孢子數目和AACTn成如線性關係，Log[子孢子劑量]=-0.5630厶^(:丁11+2.9787，如圖6所述。從而推導不同處理對於子孢子入侵細胞的抑制率如下%Ihibition(n)=[1-1cr05630aactjx100根據本發明的方法測定不同濃度Corytuberine處理所得到的AOr如表7所示，Corytuberine的助溶劑DMSO對照與不加藥物和DMSO樣品的ACr—致，可知DMSO對是試驗的結果沒有影響。以Corytuberine濃度值的對數作為X值用方程。/olhibition(n)=min+(max-min)/[l+(x/EC50)"Hillslope]進行標準曲線分析，結果圖7所示，Corytuberine對抑制子孢子入侵細胞的效果隨其濃度增大而提高，其半數抑制濃度為212.33ug/mL,證明Corytuberine具有抗球蟲的作用，同時也驗證了本發明柔嫩艾美耳球蟲藥物篩選方法的可靠性。表7tableseeoriginaldocumentpage13此外，本實驗還分析了Corytuberine對雞細胞的影響，不同濃度藥物處理的雞細胞的Ci[,w表示樣品中活細胞的水平，如表8所示，Corytuberine對雞細胞沒有影響。表8tableseeoriginaldocumentpage13序列表廣東省農業科學院獸醫研究所—種丙二醯單醯輔酶A:ACP轉醯基酶及其製備方法和應用10Patentlnversion3.31311PRTEimeriatenella1ProMetLysArgValAlaLeuPheSerGlyGinGlyAlaGinCyslie151015GlyMetGlyValGluCysAlaArgArgAspAlaAlaAlaArgLeuLeu202530PheGluGluAlaSerSerlieLeuAsnPheAspLeuPheAsnLeuLeu354045LeuLysGlyProGinGluLysLeuAsnGluThrGinlieAlaGinPro505560AlaLeuLeuThrAlaSerValAlaLeuPheThrSerT卬LysArgAla65707580HisAsnValGlulieAspCysCysAlaGlyLeuSerLeuGlyGluTyr859095SerAlaLeuCysCysSerGlyValLeuSerPheAlaAlaAlaValGlu100105110formulaseeoriginaldocumentpage15ValArgThrValArgValGlu30531021886DNAEimeriatenellaCDS(269).,(1408)2ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtacaacgcagagtacgcggggagacgaag60cagttggggtttattagggtttgttatggtgtcttagggtttatttggatttagggttta120gggtttagggtttagggtttgtgtggggttctgccgcagccagaaatcccgctctgcggt180ctcgtgtctcacgagggtttgacgctcgagctctagggtctagggtctagagtctagggt240ttagggtttagggtttaaggtttggagaatgaagggtttggcgctgctgctgMetLysGlyLeuAlaLeuLeuLeu15ctgggtLeuGly10etcLeucttLeutctSercttLeutgtCys15cccProgtcValtgcCyscttLeutctgtcSerVal20tecSercttLeuttaLeuaggacccctgcctttcagggcccccctgetgetgetgetgcagcagcaArgThrProAlaPheGtnGlyProProAlaAlaAlaAlaAlaAlaAla25gcaaaaAlaLysccagcaProAla柳ArggcaAlagcaAlagcaAla60gcaAla45gcaAla30gtaVal3C3ThrgcgAlagcaAlagcaAla3C3Thr3CtThrgcaAla65gcaAla50gcaAla35gcaAlaggaGlygcagcaAlaAla33gCC3LysProgacAspatgMet70acgThr55aagLys40CC3ProcgaArg292340388436484gtggcgctgttctecggccagggggcccagtgtateggaatgggggtg53216imageseeoriginaldocumentpage17gcagcagcagcagcaaaacgctgcgtgeggctgcaggtctecggggcc1108AlaAlaAlaAlaAlaLysArgCysValArgLeuGinValSerGlyAla265270275280ttccactecccaetcatggetcctgetgcagcaggactagcagcagca1156PheHisSerProLeuMetAlaProAlaAlaAlaGlyLeuAlaAlaAla285290295attgetgetgetgatttccaaaccccacaaacccccgtgctgctgaat1204lieAlaAlaAlaAspPheGinThrProGinThrProValLeuLeuAsn300305310gtggacgcgcagatecacacaaacValAspAlaGinlieHisThrAsn315320ccccaagccateaagProGinAlalieLys325C3333gCtCGinLysLeu1252attcagcagctaaccagecccacglieGinGinLeuThrSerProThr330335cagtggcaacagtegGinTrpGinGinSer340atggagctgMetGluLeu1300ctggggcgtttgggaatggaggaaagtttcgagtttggccctggagga1348LeuGlyArgLeuGlyMetGluGluSerPheGluPheGlyProGlyGly345350355360attCtCtCC333CtC33C3gC333lieLeuSerLysLeuAsnSerLys3653tC3aCCCCC3CgtclieAsnProHisVal370cgcaccgtcArgThrVal3751396agagtcgagtgaacagctagctgcagctaggtgtggctagctacagctagct1448ArgValGluaeggctagegacagctagccacagctagctggggctccagctggctccagetagegaget1508caagccagcagcagctagctgcagtggactcgaactagctgcagctagctgcagctagct1568gcagctactagetgeagctagetagctgeagctagtagctgcagacagccagcagcagct1628agcggcgcccagctgtagacagctgaggcgctagcagcaagtcggcagggcctgctgtgg1688ctagctgcagctagccagctgetgeageggctagccagctgcagcagctagccagctgct1748gcagctagctagccactcggctagctagctgcgaatttgaagcgccatctgccgcaaacg1808gaaaccagctagecgagaatacaaagaatttcttttgacagattctcttcaaaaaaaaaa1868.formulaseeoriginaldocumentpage19TrpLysArgAlaHisAsnValGlulieAspCysCysAlaGlyLeuSer145150155160LeuGlyGluTyrSerAlaLeuCysCysSerGlyValLeuSerPheAla165170175AlaAlaValGluLeuThrAlaLysArgGlyAlaLeuMetGinGinAla180185190AlaAlaAlaAsnProGlyGluMetTyrAlalieLeuGlyLeuSerGin195200205GinGinThrGluAlaValCysAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaArgSer210215220SerSerSerSerSerSerSerGlyGluAspValTyrCysGlyValAla225230235240AsnTyrLeuCysProGlyAsnTyrAlaValSerValSerArgSerAla245250255AlaAlaAlaLeuGinGinAlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaLysArgCys260265270ValArgLeuGinValSerGlyAlaPheHisSerProLeuMetAlaPro275280285AlaAlaAlaGlyLeuAlaAlaAlalieAlaAlaAlaAspPheGinThr290295300ProGinThrProValLeuLeuAsnValAspAlaGinlieHisThrAsn305310315320ProGinAlalieLysGinLysLeulieGinGinLeuThrSerProThr20325330335GinT卬GinGinSerMetGluLeuLeuGlyArgLeuGlyMetGluGlu340345350SerPheGluPheGlyProGlyGlylieLeuSerLysLeuAsnSerLys355360365lieAsnProHisValArgThrValArgValGlu3703754935腿Eimeriatenella4ccaatgaagcgagtggcgctgttctccggccagggggcccagtgtatcggaatgggggtg60gagtgcgcgcgtcgagacgcagcagcacgtttgctgttcgaagaagcttcttcaattttg120aatttcgatttatttaatttgctgctgaagggccctcaagaaaaactcaacgagacccaa180attgcgcagcccgcgctgct'cacggcctccgtggccctcttcaccagctggaaacgcgca240cacaacgtgg柳tagactgctgcgcggggctttccctgggggagtactcggcgctttgc300tgcagcggggttUgtcttttgctgctgctgttgagctgacagcaaaaaggggagctttg360atgcagcaagcagcagcagcaaaccctggggaaatgtacgccattctgggcctcagccag420cagcaaaccgaggccgtctgtgctgctgctgctgctgctgcccgcagcagcagcagcagc480agcagcagcggggaggatgtgtactgtggggtggcgaactacttgtgtccggggaactac540gccgtgtctgtgtcgcggtctgctgctgctgcgctgcagcaagcagcagcagcagcagca600gcaaaacgctgcgtgcggctgcaggtctccggggccttccactccccactcatggctcct660gctgcagcaggactagcagcagcaattgctgctgctgatttccaaaccccacaaaccccc720gtgctgctgaatgtggacgcgcagatccacacaaacccccagccatcaagcaaaagctca780ttcagcagctaaccagccccacgcagtggcaacagtcgatggagctgctggggcgtttgg840gaatggaggaaagtttcgagtttggccctggaggaattctctccaaactcaacagcaaaa900tcaacccccacgtccgcaccgtcagagtcgagtga935534DNA<213〉人工序列5cgcggatccccaatgaagcgagtggcgctgttct34633腿人工序列6cgcgtcgactcactcgactctgacggtgcggac33719腿人工序列7卿aacggctaccacatcc19815DNA人工序列8gcaccagacttgctc15916廳人工序列9cacaccgccgagaaga161020醒人工序列10gaacaacattkccgtagagg20權利要求1、一種丙二醯單醯輔酶AACP轉醯基酶，該酶的胺基酸序列為SEQNO.1。2、一種編碼權利要求1所述酶的DNA片段，該片段的核酸序列為SEQNO.3。3、權利要求1所述酶的製備方法，該方法是首先將權利要求2所述的DNA片段克隆到帶有融合標籤的原核表達載體中，然後轉化到原核宿主內獲得重組菌；將所得重組菌在1637'C下用異丙基-e-D-硫代半乳糖苷誘導培養36小時，使其表達融合標籤和權利要求1所述的酶的融合蛋A:最後將誘導培養後的重組菌裂解，取上清液，利W融合蛋A所帶的融合標籤分離純化出權利要求1所述的酶即可。4、如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的原核表達載體為pMAL-c2x或pET-32a(+)。5、如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述重組菌的誘導培養溫度為16°C。6、權利要求l所述的酶在篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物中的應用。7、一種篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的方法，該方法由以下步驟組成(1)將權利要求1所述酶與待篩選藥物在28'C孵育1小時；(2)測定經步驟(1)處理的權利要求1所述酶的酶活，當酶活有明顯下降時，說明該藥物具有抗柔嫩艾美耳球蟲活性。全文摘要本發明提供了一種新的丙二醯單醯輔酶A∶ACP轉醯基酶，其胺基酸序列為SEQNO.1。由於該酶沒有糖基化位點，因此可通過原核表達的方法獲得，具體方法是將編碼該酶的DNA片段SEQNO.3克隆到原核表達載體中，然後轉化到原核宿主內最後用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達。本發明所述的酶是柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)II型脂肪酸代謝中特有的醯基轉移酶，可作為抗柔嫩艾美耳球蟲藥物的作用靶標，用於篩選抗柔嫩艾美耳球蟲藥物。文檔編號C12N9/10GK101486999SQ200910037238公開日2009年7月22日申請日期2009年2月18日優先權日2009年2月18日發明者餘勁術,呂敏娜,吳彩豔,孫銘飛,蔡建平,袁建豐,覃宗華申請人:廣東省農業科學院獸醫研究所