苯丙氨酸定量檢測試劑盒(酶定量法)的製作方法

2023-10-17 02:53:49

專利名稱：苯丙氨酸定量檢測試劑盒(酶定量法)的製作方法
技術領域：
本發明涉及臨床化學診斷試劑應用設備技術領域，屬於一種基於利用高比活性和 高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)的新技術而進行開發生產的用於新生兒苯丙酮尿症 檢測項目的篩查試劑盒。
背景技術：
目前，公知的現在國內用於檢測新生兒血中苯丙氨酸濃度最廣泛的實驗方法是細 菌抑制法和螢光法、酶法。細菌抑制法存在的不足，該方法是一種半定量方法，主觀性強，靈敏度低，實驗時 間較長等，另外，人工處理檢驗數據，手工登記檢驗記錄，不利於數據的存儲和備查，給新生 兒疾病中心規範化管理帶來潛在風險。而螢光法試劑易受自然物質中存在的螢光幹擾並且 需額外添置昂貴試驗檢測設備的缺點。介於上述兩種方法的不足，我們在國內首次成功開發出用於新生兒苯丙酮尿症篩 查的酶法定量檢測試劑盒，成功的克服了細菌抑制法、螢光法在篩查工作中的諸多缺點，以 利於使用單位更好的、更準確開展新生兒篩查工作。

發明內容
1、將球形芽孢桿菌的pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統並進行表達，通過活性藍 4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)，基於該酶開發的新生兒苯丙 酮尿症篩查試劑的技術指標達到國外先進水平，其(與美國Bio-Rad公司試劑方法學比較 r > 0. 9)。2、篩選出的底物顯色系統，生成的產物可以在波長450nm下進行讀數，適用於所 有醫院常規使用的酶標儀，而無須更換濾光片，改變了國外進口試劑必須使用570nm的濾 光片的局限。此項技術處於國外先進水平。3、利用冷凍真空乾燥技術，將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)和輔酶(NAD+)由液態 轉變為固態，從而大大提高了試劑盒的有效期及穩定性。本發明的目的是提供一種結果準確可靠、無創傷性、安全、靈敏度高、無需添置大 型檢測設備，使用成本低的新生兒篩查試劑盒。該試劑盒實驗機理是採用三氯醋酸(TCA) 從濾紙幹血片中萃取苯丙氨酸。苯丙氨酸被苯丙氨酸脫氫酶轉化成苯丙酮酸。這個反應伴 隨著反應混合物中存在的輔酶NAD+減少，生成NADH，這個氧化還原反應中把添加的黃色四 唑鹽轉化成黃色物質Formazane。Formazane的量與樣本中苯丙氨酸的量成正比。使用酶 標儀檢測其光密度值，即可換算成其對應的苯丙氨酸濃度值，酶標儀波長使用450nm。另外 該試劑盒的成本只是進口試劑盒的四分之三。能夠促進我國新生兒苯丙酮尿症篩查項目的 大規模開展。讓每個新生兒都能接受檢查。減少國家和社會的壓力，為提高全民人口素質 做出我們的貢獻。為實現上述目的，本發明技術方案為一種用於檢測新生兒血中苯丙氨酸濃度的酶定量法檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑盒由酶稀釋液(Triton X-100緩衝液)、底物 (四唑鹽)、中和液(碳酸鹽緩衝液)、三氯醋酸溶液、酶、輔酶、96孔微孔板、標準血片、質控 血片、蓋膜組成。所述酶稀釋液包括=Triton X-100、三乙醇胺、碳酸鈉、無水碳酸氫鈉，其配製方 法UTriton X-100溶液用加樣器吸取Triton X-IOO若干加入少量0. IM碳酸緩衝
液溶解，用0. IM碳酸緩衝液定溶。2 8°C冰箱保存備用。2、三乙醇胺溶液用加樣器取三乙醇胺液若干加0. IM碳酸緩衝液。定溶。3、按規程向試劑瓶中加三乙醇胺溶液，再向瓶內等量加入TritonX-IOO溶液，混 勻，將配製好的酶稀釋液瓶蓋擰死，放入2 8°C冰箱保存備用，可保存18個月。所述底物液其配製方法為1、取四唑鹽純品。按規程向瓶內加入雙蒸水若干，充分溶解待用；2、取出配製好的溶液若干再按規程加入雙蒸水若干，混勻，分裝，擰緊瓶蓋後放入 2 8°C冰箱備用，可保存18個月。溶解後剩餘的四唑鹽溶液放入-20°C保存。i·劑的配,刪去麵脅幹，應■口口口胡
龍底i刪·丨屮,禾口鮮Ph·+禾咖謝Φ越 一·酬秘450nm T傭·，刪銷荊·碰，蔽鮮碰H M^T _卜 舶側570nm白句艦P議限。此_救卜千_示驗終。所述的中和液其配製方法1、用分析天平準確稱取碳酸鈉若干，無水碳酸氫鈉若干；加少量雙蒸水溶解後定 溶，ρΗΙΟ. 6。獲得0. IM碳酸緩衝液；2、用量筒量取0. IM碳酸緩衝液若干毫升，用0. IM氫氧化鈉將pH調至11.7，按照 規定進行中和液分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C，可保存18個月。所述的三氯醋酸溶液配製方法用分析天平準確稱取三氯醋酸若干，一定量雙蒸水溶解後，定溶於1000ml。按照規 定量進行三氯醋酸溶液的分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C冰箱，可保存18個月。所述酶(苯丙氨酸脫氫酶)配製方法1)將球形芽孢桿菌的pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統並進行表達，通過活性藍 4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體。2)取50ml燒杯一隻，將瓶內的苯丙氨酸脫氫酶液全部轉移到燒杯內。向原瓶內 加入25mMPB若干，將瓶子輕輕旋轉後將瓶內液體儘量吸出，轉移到燒杯內，重複以上程序3 次，最後將瓶內液體吸乾淨。3)向燒杯內再加入25mM PB若干，輕輕搖勻，避免泡沫。4)取清洗乾淨的2ml玻璃瓶，用移液器向每隻瓶內加苯丙氨酸脫氫酶溶液0.5ml， 放入冷凍乾燥機預凍(-40 -45°C ) 2小時後冷凍乾燥24小時。乾燥後放_20°C儲存可保 存18個月。該試劑的配製方法與國外試劑不同點在於將球形芽孢桿菌的Pdh基因克隆到大 腸桿菌PET系統並進行表達，通過活性藍4純化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫 酶(PheDH),利用冷凍真空乾燥技術,將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體轉變為固體，從而±対是訂遊丨丨偏捕其刪急對牛。M曰i碰丨丨_碰丨耐日月糊Y R限千運細噺 牛兒篩杳試劑盒中，鑑於其基因表汰的高特異件、高靈敏度、高活件，還可以將其使用到與 少相關的其它產品內。某幹該酶開發的試劑的摶術指標目前汰到國外先講水平。所述輔酶凍乾粉，包括輔酶NAD+和心肌黃酶，其配製方法輔酶NAD+的稀釋方法1)輔酶NAD+純品若干。向瓶內加入25mM PB 1ml，濃度為10g/ml，待充分溶解。2)取200ml燒杯一隻，先將瓶內的輔酶NAD+儘量吸出到燒杯內。向原瓶內加25mM PBlml，將瓶子輕輕旋轉後將瓶內液體儘量吸出到燒杯內，重複以上程序3次，最後將瓶內 液體吸乾淨。3)向燒杯內再加入25mM PB若干，搖勻，避免泡沫。放入2 8°C冰箱備用。心肌黃酶的稀釋1)心肌黃酶純品若干。向瓶內加入25mM PB 1ml，濃度為100IU/ml，待充分溶解。2)取出溶解液若干轉移到200ml燒杯中，再加入25mM PB若干，混勻，放入2 8°C 冰箱備用。輔酶凍乾粉配製取清洗乾淨的2ml玻璃瓶若干，用移液器先向每隻瓶內加輔酶NAD+溶液250ul，再 向瓶內加入心肌黃酶250ul，將全部分裝好的玻璃瓶放入冷凍乾燥機預凍(-40 -45°C )2 小時後冷凍乾燥24小時。乾燥後放_20°C可保存18個月。式齊I丨的配,泡丨方法與國夕卜i式齊I丨不同點在於禾U用7令凍真空幹'燥技術，將輔 (Nad+) mt^m^-km^,從而大大提高了i式齊ι丨盒的有效其月及穩定個牛。所述的標準、質控血片製備方法1、將全血用4 8層紗布過濾，然後離心3000轉20分鐘，棄取血漿；2、再用生理鹽水洗3次，3000轉離心20分鐘，棄取上清，最後一次離心4000轉30 分鐘；3、將血球倒入量筒內量一下體積，記下毫升數；4、用一定濃度的牛血清白蛋白與血球混合調好比例，混勻，測血球壓積，(血球壓 積55-65%為宜)可進行下一步工作；5、分別不同濃度的將配製好TSH標準液與血球混勻，在分析天平上稱取血球重量 並平均分配到標記好的試管中，待滴定；6、60g/LBSA 配製檸檬酸鈉若干濃鹽酸若干牛血清白蛋白若干生理鹽水定容若干7、血片滴定1)將配製混勻好的血滴制在903#濾紙上(每個血斑50ul左右為宜)2)室溫晾乾48小時3)將晾乾的血片收在鋁箔袋內，放乾燥劑，-18 -20°C保存苯丙氨酸測定
1.檢測前所有的試劑、樣本和微孔板條達到室溫(18 25°C )；2.配製酶和輔酶儲存液分別向酶和輔酶凍乾粉瓶內加雙蒸水0.5ml，輕搖，避免產生泡沫，稀釋後可在 2 8°C儲存2天。3.配製酶和輔酶應用液另取2隻乾淨的燒杯，分別加入酶和輔酶儲存液0. 5ml，再各加入酶稀釋液5ml，在 18 25°C可保持穩定8小時。在2 8°C不能延長穩定性。4.用打孔器打下直徑3mm標準品、質控品、樣本血斑放入96微孔板相應微孔中；5.每孔加150 μ 1三氯醋酸溶液，室溫振蕩(300 500U/分)60分鐘；6.力Π 50 μ 1的中和液到另一塊新的微孔板孔中；7.吸取130 μ 1的標準品、質控品、樣本萃取液到另一微孔板相應的微孔中，輕微 振蕩；8.力卩50 μ 1的酶應用液到每個孔中；9.力卩50 μ 1的輔酶應用液到每個孔中；10.在室溫(18 25°C )下振蕩溫育60分鐘(300轉/分)；11.每孔加ΙΟΟμΙ底物，混勻，在3 5分鐘內讀取OD值，酶標儀使用波長 450nm(參考波長 640nm)。12.結果計算a)坐標紙上以標準品的螢光值和與其相對應的標準品濃度繪製標準曲線。OD值 為縱軸或Y軸，濃度為橫軸或χ軸。b)定質控品和每個樣品的苯丙氨酸濃度值首先在Y軸上查找OD值，橫向延伸至 標準曲線，以標準曲線上的點拉垂直線與X軸相交，得出苯丙氨酸濃度值，判斷結果。c)計算公式Y = aX+bd)單位轉換:lmg/dl = 60. 6 μ mol/L產品性能指標1.劑量-反應曲線的線性範圍1. 1 17. 3mg/dl2.批內精密度不大於10%3.批間精密度不大於15%4.準確性回收率為85% 119%5.靈敏度最低可檢出限小於1.55mg/dl6.特異性與酪氨酸、組氨酸和甘氨酸無交叉反應注意事項1、不同批號的試劑不能混用；2、本產品為一次性使用產品；3、超出有效期的試劑不可再用；4、所有的試劑和樣本在使用前要達到室溫(18 26°C )；5、當從標準品、質控品上打孔時，注意從低濃度到高濃度。6、實驗結束所有物品，採用高溫、過氧乙酸或84液等浸泡處理(生物製品應視為 有潛在危害性)。
7、試劑盒中標準、質控品的濃度如有改變，將隨試劑盒送通知單同時電話告知。8、試劑盒於2 8 °C、避光、乾燥貯存，不得凍存。說明書


1、圖1 整體試劑盒外觀圖；2、圖2:試劑盒俯視圖；3、圖3-圖8 試劑溶液承載瓶；4、圖9-圖10 檢測用微孔板；5、圖11:標準血片。
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權利要求
一種用於檢測新生兒血中苯丙氨酸濃度的酶定量法篩查試劑盒，其特徵在於所述試劑盒由酶稀釋液(Triton X 100緩衝液)、底物(四唑鹽)、中和液(碳酸鹽緩衝液)、酶、輔酶、96孔微孔板、標準血片、質控血片、蓋膜組成。
2.如權利要求1所述的苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述酶稀 釋液包括=Triton X-100、三乙醇胺、碳酸鈉、無水碳酸氫鈉配製方法(1)TritonX-100溶液用加樣器吸取Triton X_100若干加入少量0. IM碳酸緩衝液 溶解，用0. IM碳酸緩衝液定溶。2 8°C冰箱保存備用。(2)三乙醇胺溶液用加樣器取三乙醇胺液若干加0.IM碳酸緩衝液。定溶。(3)按規程向試劑瓶中加三乙醇胺溶液，再向瓶內等量加入TritonX-100溶液，混勻， 將配製好的酶稀釋液瓶蓋擰死，放入2 8°C冰箱保存備用，可保存18個月。
3.如權利要求2所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述底物配 制方法(1)取四唑鹽純品。按規程向瓶內加入雙蒸水若干，充分溶解待用；(2)取出配製好的溶液若干再按規程加入雙蒸水若干，混勻，分裝，擰緊瓶蓋後放入 2 8°C冰箱備用，可保存18個月。溶解後剩餘的四唑鹽溶液放入-20°C保存。謝式_概丨碰讓誠〒，應屯口口口胡雙·傭·丨丨體 底i利ffl·丨屮,禾口鮮Ph· +禾咖謝Φ越內勿 胃編帳450nmT傭·，刪刊斤棚_示仏蔽_捕她械 試劑必須使用570nm的濾光片的局限。此項技術處於國際領先水平。
4.如權利要求3所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述中和液， 配製方法為(1)、用分析天平準確稱取碳酸鈉若干，無水碳酸氫鈉若干；加少量雙蒸水溶解後定溶， PH 10. 6。獲得0. IM碳酸緩衝液；(2)、用量筒量取0.IM碳酸緩衝液若干毫升，用0. IM氫氧化鈉將pH調至11.7，按照規 定進行中和液分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C，可保存18個月。
5.如權利要求4所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述三氯醋 酸溶液，其配製方法為用分析天平準確稱取三氯醋酸若干，一定量雙蒸水溶解後，定容於1000ml。按照規定量 進行三氯醋酸溶液的分裝，擰緊瓶蓋放入2 8°C冰箱可保存18個月。
6.如權利要求5所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述酶(苯 丙氨酸脫氫酶)的配製方法為(1)將球形芽孢桿菌的Pdh基因克隆到大腸桿菌pET系統並進行表達，通過活性藍4純 化獲得高比活性和高得率的L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)液體。(2)取50ml燒杯一隻，將瓶內的苯丙氨酸脫氫酶液全部轉移到燒杯內。向原瓶內加入 25mM PB若干，將瓶子輕輕旋轉後將瓶內液體儘量吸出，轉移到燒杯內，重複以上程序3次， 最後將瓶內液體吸乾淨。(3)向燒杯內再加入25mMPB若干，輕輕搖勻，避免泡沫。(4)取清洗乾淨的2ml玻璃瓶，用移液器向每隻瓶內加苯丙氨酸脫氫酶溶液0.5ml，放 入冷凍乾燥機預凍(-40 -45°C ) 2小時後冷凍乾燥24小時。乾燥後放_20°C儲存可保存18個月。謝式_·吿丨碰麵脅〒滅幹麵Ddh··至籠_DET碰 並講行表汰，誦i寸活t牛#4鈍化獲得高比活t牛禾Π高得率的L-苯丙Mif脫梟』_ (PheDH)^lIffl 7令凍直薴幹'燥摶術，將L-苯丙Mif脫梟』_ (PheDH)液體轉奪為固體，從而大大提高了i式布丨 偏捕其刪急對牛。■曰i碰丨丨_碰丨耐日月糊Y R限千運用至耐唸 Φ，軒縣__■亂鮮·、碰性，還適減■至丨丨故 口口口力。軒獻_夕卜餅級
7.如權利要求6所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述輔酶凍 乾粉，包括輔酶NAD+和心肌黃酶的製備方法為輔酶NAD+的稀釋方法1)輔酶NAD+純品若干。向瓶內加入25mMPB 1ml，濃度為10g/ml，待充分溶解。2)取200ml燒杯一隻，先將瓶內的輔酶NAD+儘量吸出到燒杯內。向原瓶內加25mM PBlml，將瓶子輕輕旋轉後將瓶內液體儘量吸出到燒杯內，重複以上程序3次，最後將瓶內 液體吸乾淨。3)向燒杯內再加入25mMPB若干，搖勻，避免泡沫。放入2 8°C冰箱備用。心肌黃酶的稀釋1)心肌黃酶純品若干。向瓶內加入25mMPB 1ml，濃度為100IU/ml，待充分溶解。2)取出溶解液若干轉移到200ml燒杯中，再加入25mMPB若干，混勻，放入2 8°C冰 箱備用。輔酶凍乾粉配製取清洗乾淨的2ml玻璃瓶若干，用移液器先向每隻瓶內加輔酶NAD+溶液250ul，再向瓶 內加入心肌黃酶250ul，將全部分裝好的玻璃瓶放入冷凍乾燥機預凍(-40 -45°C )2小時 後冷凍乾燥24小時。乾燥後放_20°C可保存18個月。式齊I丨的配,泡丨方法與國夕卜i式齊Il不同點在於利用7令凍真空幹'燥技術,將輔 (NAD+)由 液傑轉變為固傑。從而大大提高了試劑盒的有效期及穩牛。
8.如權利要求7所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於所述所述的 標準、質控血片製備方法1)將全血用4 8層紗布過濾，然後離心3000轉20分鐘，棄取血漿；2)再用生理鹽水洗3次，3000轉離心20分鐘，棄取上清，最後一次離心4000轉30分鐘；3)將血球倒入量筒內量一下體積，記下毫升數；4)用一定濃度的牛血清白蛋白與血球混合調好比例，混勻，測血球壓積，(血球壓積 55-65%為宜)可進行下一步工作；5)分別不同濃度的將配製好TSH標準液與血球混勻，在分析天平上稱取血球重量並平 均分配到標記好的試管中，待滴定；6)60g/L BSA 配製檸檬酸鈉若干濃鹽酸若干牛血清白蛋白若干生理鹽水定容若干 7)血片滴定(1)將配製混勻好的血滴制在903#濾紙上(每個血斑50ul左右為宜)(2)室溫晾乾48小時(3)將晾乾的血片收在鋁箔袋內，放乾燥劑，-18 -20°C保存
9.如權利要求1所述的苯丙氨酸定量檢測試劑盒的使用方法，其特徵在於所述使用 方法包括以下步驟 苯丙氨酸測定，1、檢測前所有的試劑、樣本和微孔板條達到室溫(18 25°C)；，2、配製酶和輔酶儲存液分別向酶和輔酶凍乾粉瓶內加雙蒸水0. 5ml，輕搖，避免產生泡沫，稀釋後可在2°C 8°C儲存2天。，3、配製酶和輔酶應用液另取2隻乾淨的燒杯，分別加入酶和輔酶儲存液0. 5ml,再各加入酶稀釋液5ml，在 18°C 25°C可保持穩定8小時，在2°C 8°C不能延長穩定性。(若做1/2板，取0. 25ml儲 存液加酶稀釋液2. 5ml)。，4、用打孔器打下直徑3mm標準品、質控品、樣本血斑放入96微孔板相應微孔中；，5、每孔加150μ 1三氯醋酸溶液，室溫振蕩(300 500轉/分)60分鐘；，6、加50μ 1的中和液到另一塊新的微孔板孔中；，7、吸取130μ1的標準品、質控品、樣本萃取液到另一微孔板相應的微孔中，輕微振蕩；，8、加50μ 1的酶應用液到每個孔中；，9、加50μ 1的輔酶應用液到每個孔中；，10、在室溫(18°C 25°C)下振蕩溫育60分鐘(300轉/分)；，11、每孔加100μ 1底物，混勻，在3 5分鐘內讀取OD值，酶標儀使用波長450nm(參 考波長640nm)。，12、結果計算酶標儀附帶軟體自動計算樣品濃度值。或按照下面方法手工計算a)坐標紙上以標準品的螢光值和與其相對應的標準品濃度繪製標準曲線。OD值為縱 軸或Y軸，濃度為橫軸或X軸。b)確定質控品和每個樣品的苯丙氨酸濃度值首先在Y軸上查找OD值，橫向延伸至標 準曲線，以標準曲線上的點拉垂直線與X軸相交，得出苯丙氨酸濃度值，判斷結果。c)計算公式Y= aX+bd)單位轉換:lmg/dl= 60. 6 μ mol/L，13、產品性能指標(1)試劑盒外觀整潔，文字符號標識清晰(2)血製品經檢測HIV、HbsAg,HCV、梅毒抗體陰性(3)劑量-反應曲線的線性範圍1.lmg/dl 17. 3mg/dl (不同批次有一定誤差)，劑 量_反應曲線經數學公式Y = aX+b擬合，其相關係數R值應不低於0. 99。(4)批內精密度不大於10%(5)批間精密度不大於15%(6)準確性回收率為85% 119%(7)靈敏度最低可檢出限小於1.55mg/dl(8)特異性與酪氨酸、組氨酸和甘氨酸無交叉反應。
全文摘要
本發明涉及一種基於苯丙氨酸脫氫酶檢測新生兒苯丙酮尿症的篩查試劑，該發明所屬技術領域生物、醫藥和醫療器械。本發明的目的1、新生兒苯丙酮尿症篩查的酶定量法檢測試劑盒，克服細菌抑制法半定量、螢光法試劑易受自然物質中螢光素幹擾缺點。2、創新技術a、利用冷凍真空乾燥技術將L-苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)由液態轉變為固態從而提高了試劑盒的有效期。該項技術指標達到國外先進水平。b、利用冷凍真空乾燥技術，將輔酶(NAD+)由液態轉變為固態，從而大大提高了試劑盒的穩定性。c、利用波長450nm下進行讀數，適用於所有的酶標儀，改變了國外進口試劑必須使用570nm的濾光片的局限。此項技術處於國際領先水平。
文檔編號C12Q1/32GK101892290SQ20091014286
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月19日 優先權日2009年5月19日
發明者王曉華 申請人:北京協和洛克生物技術研究開發中心