一種β-雌二醇模擬抗體的製備方法及其用途的製作方法

2023-10-16 23:12:04 1

專利名稱：一種β-雌二醇模擬抗體的製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種β-雌二醇模擬抗體的篩選方法，屬於生物技術領域，用於製備特異識別β-雌二醇的高效模擬抗體與研製可以快速檢測β-雌二醇殘留的免疫速測試劑盒的用途。
背景技術：
β-雌二醇(β-estradiol，β-E2，以下簡稱E2)為白色或乳白色晶體粉末，無臭，易溶於二氧六環或丙酮，微溶於乙醇，不溶於水。其分子式為C18H24O2，摩爾質量為272.39g/mol，熔點為173 179°C，E2在動物和人體內合成，具有內源性激素的活性，對人類和動物的影響是通過模擬、幹擾或對抗機體內生荷爾蒙原有的正常合成、運輸、釋放和作用，使其無法維持自身的平衡和調節來實現E2對生物的危害，以水生生物居多，主要表現在對生殖系統的影響，可導致生物體中卵黃蛋白原的合成加速，性器官變異，出現動物雌性化現象。這是因為E2能夠對與生殖有關的類固醇合成過程中的酶起到抑制作用，使類固醇的合成受到阻礙。Irwin等發現，受E2影響的雌性海龜體內的卵黃蛋白原水平明顯提高，並且認為可通過改變能量分配、生理或產卵以導致海龜生殖某種程度上的損害。Colucci等認為E2造成了野生魚類的生殖畸形，Purdom等認為魚類的雌雄同體也是與E2相關聯的。此外，E2可通過飲食、空氣吸入和皮膚接觸等途徑侵入人體，對人類的直接危害是幹擾內分泌生殖系統的正常功能，造成男性生育能力 的下降甚至喪失。Peterson等認為，男性精子數量的下降，睪丸癌、前列腺癌和乳腺癌發病率的增加以及男性生殖障礙都與E2有直接聯繫。Rajapakse等也認為男性精子數量的減少是受E2的影響。可見E2來源廣泛、危害極大，因此需要建立一套快速簡便、科學靈敏的檢測及篩檢方法。核糖體展示技術(ribosome display, RD)是一種體外展示技術,基因型(DNA序列)和表型(蛋白質)可以聯繫起來，即將可擴增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的突變體蛋白質聯繫在一起。RD技術中mRNA缺乏終止密碼子並經過適當修飾，在體外翻譯過程中核糖體會停留在mRNA的3'末端，形成十分穩定的「mRNA-核糖體-蛋白質」三元複合物，這種三元複合體形式將蛋白質和mRNA信息連接到一起，應用RD可進行特殊功能的肽和蛋白質篩選。Lipocalin是從細菌到人都含有的一組胞外親脂蛋白的總稱，作為受體較強的結合小分子具有重要的生物學功能。儘管Iipocalin在一級結構上存在多樣性，但其二級結構與四級結構卻驚人的相似:由8條反相平行的β摺疊片與一個α螺旋扭曲形成一個桶狀結構，形成了 「Lipocalin支架」結構，含有一個配體結合位點，桶的開口端由連接β條帶的多個Loop組成，是整個分子比較柔韌的部分，且胺基酸成員為極性胺基酸，LoopULoop2,Loop3,Loop4是其隨機突變的區域，最近研究表明，通過改造Lipocalin骨架作為特異性配體可以結合特定祀標，亦即通過設計lipocalin的支架可模擬抗體與小分子結合，這些設計的lipocalin突變體稱為Anticalin,具有配體特異性。

發明內容
本發明的主要目的是提供一種潛在的檢測用雌二醇模擬抗體。本發明的第二個目的提供一種雌二醇模擬抗體的製備方法。本發明的技術方案概述如下:本發明提供的抗雌二醇模擬抗體是從核糖體展示anticalin模擬抗體庫中篩選獲得的並進行了可溶性功能表達。本發明提供的抗雌二醇模擬抗體的製備方法為:1.核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構建選擇膽汁三烯結合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為anticalin庫的模板，設計隨機突變位點，以合成的BBP基因序列為模板，由設計的引物進行重疊引物延伸PCR擴增來合成Anticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環結構等核糖體展示所需要的元件，最終構建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫，該庫轉錄後的RNA分子包括一個5』 -loop和3』 -loop莖環結構，一個核糖體結合位點，隨機突變的anticalin庫，C末端間隔序列等,全長約950bp。其中突變庫的模板可以是其他lipocalin分子,優選bbp。2.抗雌二醇模擬抗體的篩選將構建的核糖體展示anticalin模擬抗體庫進行體外轉錄翻譯後,用E2-BSA和E2-磁珠作為抗原固液相交替篩選雌二醇的模擬抗體，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯體解離，得到相應的mRNA，經過RT-PCR得到篩選後的DNA文庫。然後重複體外轉錄-體外翻譯-親 和篩選-RT-PCR擴增過程，得到反覆篩選幾輪的模擬抗體DNA文庫。經過八輪核糖體展示篩選後，模擬抗體文庫中抗原陽性的模擬抗體序列明顯富集。3.雌二醇模擬抗體的可溶性功能表達將八輪篩選後對模擬抗體文庫進行序列鑑定，隨機挑選20個克隆子，將該基因與pTIG-TRX連接成表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，經SDS-PAGE和Western Blot鑑定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產物存在於破碎菌體後的上清液中，以空質粒宿主菌為對照，E2-BSA為包被原，E2為競爭小分子，競爭ELSIA檢測誘導上清的競爭結合活性，有競爭結合活性的進一步大規模誘導表達並純化。4.雌二醇模擬抗體的純化與鑑定利用Ant1-His tag親和層析柱對表達的特異結合物進行了純化,使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，競爭ELISA分析純化後產物的競爭結合活性。SPR法檢測所獲模擬抗體的親和力。本發明還可以提供一種測定環境和食品中雌二醇殘留的檢測試劑盒中的最關鍵檢測試劑——特異結合模擬抗體，儘管E2殘留嚴重威脅著人體健康，但它在畜牧業上的應用仍能帶來一定的經濟價值，這使得非法使用現象屢禁不止，本發明製備的雌二醇模擬抗體可以部分取代測定食品和環境樣品中雌二醇殘留測定所需試劑，該模擬抗體還可以進一步應用於臨床上血清或尿液中雌二醇的檢測。本發明所製備的抗雌二醇模擬抗體的優勢在於:(1)利用雌二醇-BSA和雌二醇-磁珠作為抗原固相和液相交替篩選，可以克服BSA造成的幹擾，從而獲得E2高特異性的抗體；(2)所獲得的ancalin-E2序列清楚，便於基因工程操作，易於在大腸桿菌中可以大量功能表達；(3)分子量小，免疫原性弱，為將來的進一步臨床應用奠定了基礎。


圖1核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構建，A為建庫的過程示意圖，B為模擬抗體庫框架示意圖.
圖2構建核糖體展示anticalin模擬抗體庫的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNAmarker, I為核糖體展示anticalin模擬抗體庫DNA圖3八輪篩選後每輪RT-PCR產物的產量分析。圖4anticalin_E2誘導表達產物的鑑定，其中A圖誘導破碎後上清的SDS-PAGE電泳圖，B圖為相應的Western-blotting圖，1-4分別為四種anticalin_E2,M為蛋白Marker。圖5 直接 ELISA 分析 anticalin_E2 的結合活性.其中 E2-A、E2-B、E2-C 和 E2-D分別為四種anticalin_E2.
圖6間接競爭ELISA分析anticalin_E2的競爭結合活性，四種anticalin_E2檢測 E2 的 IC50 分別為 0.05,0.92,2.52,0.41 μ g/ml。圖7SPR分析anticalin_E2A的結合動力學常數
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可從常規試劑公司購買得到。實施例1核糖體展示anticalin模擬抗體的構建一.引物合成根據bbp 序列及構建Anticalin抗體庫需要改變的突變位點來設計合成引物，隨機核酸編碼區設計成NNK (N為G、C、A、T ;K為G和T)，同時設計與核糖體展示元件相連的引物，主要引物如下表所示。表I寡核苷酸引物
權利要求
1.一種雌二醇模擬抗體的製備方法，主要由以下步驟組成: (1)核糖體展示anticalin模擬抗體庫的構建 選擇膽汁三烯結合蛋白(bilin binding protein, bbp)作為anticalin庫的模板,設計隨機突變位點，以合成的BBP基因序列為模板，由設計的引物進行重疊引物延伸PCR擴增來合成Anticalin模擬抗體庫片段，約522bp，再通過PCR方法添加啟動子、間隔序列、莖環結構等核糖體展示所需要的元件，最終構建成功的核糖體展示anticalin模擬抗體庫,該庫轉錄後的RNA分子包括一個5』 -loop和3』 -loop莖環結構，一個核糖體結合位點，隨機突變的anticalin庫，C末端間隔序列等,全長約950bp ； (2)抗雌二醇模擬抗體的篩選 將構建的核糖體展示anticalin模擬抗體庫進行體外轉錄翻譯後,用E2-BSA和E2-磁珠作為抗原固液相交替篩選雌二醇的模擬抗體，通過改變Mg2+濃度將篩選得到的模擬抗體-核糖體-mRNA三聯體解離，得到相應的mRNA，經過RT-PCR得到篩選後的DNA文庫；然後重複體外轉錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴增過程，得到反覆篩選幾輪的模擬抗體DNA文庫；經過八輪核糖體展示篩選後，模擬抗體文庫中抗原陽性的模擬抗體序列明顯富集； (3)雌二醇模擬抗體的可溶性功能表達 將八輪篩選後對模擬抗體文庫進行序列鑑定，隨機挑選20個克隆子，將該基因與pTIG-TRX連接成表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，經SDS-PAGE和Western Blot鑑定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產物存在於破碎菌體後的上清液中，以空質粒宿主菌為對照，E2-BSA為包被原，E2為競爭小分子，競爭ELSIA檢測誘導上清的競爭結合活性，有競爭結合活性的進一步大規模誘導表達並純化； (4)雌二醇模擬抗體的純化與鑑定 利用Ant1-His tag親和層析柱對表達的特異結合物進行了純化，使目的條帶得到了明顯的濃縮和分離，競爭ELISA分析純化後產物的競爭結合活性；SPR法檢測所獲模擬抗體的親和力。
2.權利要求1所述隨機突變庫的模板可以是其他Iipocalin分子,優選bbp。
3.權利要求1所述篩選方法中的包被原可以選用E2-BSA，還可以選用E2-磁珠進行篩選，優選交叉篩選。
全文摘要
本發明涉及一種β-雌二醇模擬抗體的篩選方法及其應用，屬於生物技術領域，該模擬抗體是由核糖體展示anticalin模擬抗體庫中篩選出來的並進行了可溶性功能表達。本發明還涉及應用核糖體展示技術篩選雌二醇模擬抗體的方法。本發明篩選出的雌二醇模擬抗體可以應用於雌二醇非法添加及濫用檢測與研製快速檢測雌二醇殘留的免疫速測試劑盒。
文檔編號G01N33/74GK103172740SQ20111044066
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者寧保安, 劉建青, 彭媛, 孫亞楠, 白家磊, 柳明, 高志賢, 孫思明 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所