癌症治療的製作方法

2023-10-17 06:35:39

專利名稱：癌症治療的製作方法
技術領域：
本發明大體上涉及癌症治療，特別是涉及抗藥物誘導的細胞程序性死亡的癌症。
背景技術：
1.引言本申請要求下列各美國臨時專利申請的利益和優先權序列號60/625，193，2004 年11月提交，題為「癌症治療」；和60/660, 266,2005年3月提交，題為「癌症治療」。這些 申請各自在此以其全文合併作為參考，包括附圖、表格和權利要求。下面的描述包括可用於理解本發明的信息。並非承認任何所述信息對於本發明而 言是現有技術或相關技術，或者任何明確或隱含引用的公布是現有技術。2.背景在美國，癌症現在是死亡的第二位主要原因，美國有超過8，000，000人被診斷 為癌症。1995年，癌症佔美國所有死亡的23.3%。參見美國衛生和人類服務部，國家健 康統計中心(U. S. Dept. of Health and HumanServices, National Center for Health Statistics)的 Health United Statesl996_97 和Injury Chartbook 117(1997)。癌症尚未在分子學水平被完全了解。已知把細胞暴露於致癌物如某些病毒、某些 化學物質或輻射能導致滅活「抑制性」基因或活化「致癌基因」的DNA的改變。抑制基因是 生長調節基因，其一旦突變就不能再控制細胞生長。致癌基因起初是正常基因(稱為原癌 基因)，通過突變或改變表達內容成為轉化基因。轉化基因的產物導致細胞的不當生長。超 過20個不同的正常細胞基因可通過基因改變成為致癌基因。轉化細胞在很多方面與正常 細胞不同，包括細胞形態、細胞-細胞間相互作用、膜的成分、細胞骨架的結構、蛋白分泌、 基因表達和死亡率(轉化的細胞可以無限生長)。瘤，或腫瘤，是細胞生長異常的、不受調節的和無組織的增殖，通常稱為癌症。如果 瘤具有破壞性生長、浸潤和轉移的性質，就是惡性或癌。浸潤是指瘤通過滲透或破壞周圍組 織的局部擴散，通常破壞性穿過限定組織邊界的基底層，因此常常進入體循環系統。轉移通 常指腫瘤細胞通過漿膜腔、蛛網膜下腔或其它腔隙，以直接擴散的方式遷移。通過轉移過 程，腫瘤細胞遷移到身體的其它部位，在遠離其最初出現位置的部位生成瘤。癌症現在主要用三種類型的治療方法之一或聯合治療手術，放療和化療。手術涉 及大量清除病變組織。雖然手術對於清除位於某些位置的腫瘤(例如乳房、結腸和皮膚) 有時有效，但它不能用於治療位於其它部位的腫瘤，如脊椎，也不能治療散在的腫瘤病症如 白血病。放療涉及把活組織暴露在能導致暴露的細胞死亡或破壞的電離輻射中。放療的副 作用可能是急性和短暫的，但有些可能不可逆轉。化療涉及破壞細胞複製或細胞代謝。在 乳房、肺和睪丸癌的治療中最常用。
用全身化療治療腫瘤疾病的不良作用是接受癌症治療的患者最害怕的。在這些 不良作用中，惡性和嘔吐最常見。其它不良副作用包括接受高劑量化療與骨髓救療(bone marrow rescue)或放療的患者中血細胞減少、感染、惡病質、黏膜炎；禿頭症(脫髮)；皮膚 併發症如瘙癢、蕁麻疹和血管性水腫；神經併發症；肺部和心臟併發症；以及生殖和內分 泌併發症。化療導致的副作用嚴重影響患者的生命質量，並可能強烈影響患者對治療的依 從性。因此，需要改進的治療方法。3.定義「烷化劑」指化學修飾DNA並破壞其功能的化療化合物。一些烷化劑導致雙 鏈DNA分子的同一條鏈或互補鏈的核苷酸之間形成交聯，但另外一些導致DNA鏈之間 的鹼基對錯配。烷化劑的實例包括苯達莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、 卡鉬(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、順鉬(cisplatin)、苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、環磷酉先胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、六甲啼胺 (hexamethylmelamine)、異環磷醯胺(ifosphamide)、洛莫司汀(Iomustine)、雙氯乙基甲 胺(mechlorethamine)、美法倉(melphalan)、米託坦(mitotane)、絲裂黴素(mytomycin) > 哌泊溴烷(pipobroman)、丙卡巴胼(procarbazine)、鏈脲菌素(str印tozocin)、噻替哌 (thiotepa)禾口三亞乙基密胺(triethylenemelamine)。「抗代謝藥」指幹擾生物分子合成的化療藥，所述生物分子包括DNA合成必需(如 核苷酸和核苷)的需要合成DNA者。抗代謝藥的實例包括卡培他濱(capecitabine)、 氯脫氧腺苷(chlorodeoxyadenosine)、阿糖胞苷(cytarabine)(及其活性形式， ara-CMP) > H H1^f (cytosinearabinoside) > dacabazine> M J^ Ρ (f loxuridine) > M 拉賓(fludarabine)、5-氟脲嘧啶(5_fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲 (hydroxyurea) >6- Jft基口票吟(6-mercaptopurine)、甲氛蝶吟(methotrexate)、噴司他丁 (pentostatin)、三甲曲沙(trimetrexate)禾口 6-JlE基鳥曙吟(6—thioguanine)。「抗有絲分裂」指幹擾有絲分裂的化療藥，通常是通過破壞微管形成。抗有絲分 裂化合物的實例包括諾維本(navelbine)、紫杉醇(paclitaxel)、泰素帝(taxotere), 長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)和長春瑞賓 (vinorelbine)。在本發明範圍內，「化療藥」指目的在於破壞惡性細胞和組織的化學藥品。化療藥 包括小分子、核酸(如反義分子、核酶、小幹擾RNA分子等)和蛋白質(如抗體、抗體片段、 細胞因子、酶和肽類激素)，當為了預防或治療癌症或其它惡性腫瘤施用給患者時，其具有 抗腫瘤效應。化療藥經常基於作用機制分類，如烷化劑、抗代謝類和抗有絲分裂劑。術語「聯合治療」指治療方案涉及至少施用兩種不同的療法，以達到需要的治療效 果。例如，聯合治療可包括施用兩種或多種化學活性不同的成分，如快速起作用的化療劑 和骨髓保護劑。或者，聯合治療可包括施用一種或多種化療劑以及給予放療和/或手術或 其它手段，改善患者的生活質量或治療癌症。在施用兩種或多種化學活性不同的成分的情 況下，應理解活性成分可以作為同一組合物的部分或作為不同組合物施用。當作為分開的 組合物施用時，包含不同活性成分的組合物可以通過相同或不同的途徑、採用相同的不同 劑量方案，同時或不同時施用，均根據特定情況的需要並依照主治醫師的決定。同樣，當一 種或多種化療藥與例如放療和/或手術聯合時，藥物可以在手術或放射治療之前或之後給
5予。「嵌入劑」指將自身插入雙鏈DNA分子中相鄰鹼基對間的化療劑，其破壞DNA結構 並幹擾DNA複製、基因轉錄、和/或DNA結合蛋白與DNA的結合。「單一療法」指治療方案基於給予一種治療有效的化合物，不管是單劑施用或在一 段時間內多次施用。在藥品商業化的背景下，術語「促進」等指由參與所關注的具體藥物化合物、組合 物或治療方案的發現、研究、開發和/或商業化的製造商、經銷商或其它實體所進行或發 起的任何和所有的信息性的、說服性和科學性的活動，直接或間接地導致化合物、組合物或 治療方案的處方、供應、購買和/或應用。這樣的活動可以直接面向供應和經銷鏈中的任何 人，包括但不限於醫學專業人員(如醫生和護士)、藥劑師、保健管理員、保險公司或政府代 表、以及患者(包括潛在的患者)。換句話說，促進的首要目的是刺激特定藥物化合物、組合 物或治療方案的銷售或使用和/或興趣，並因此為該目的服務的任何活動構成了特定藥物 化合物、組合物或治療方案的「促進」。根據本發明的「可獲得專利」的組合物、方法、機器或製造的物品是指在進行研究 的時候，該主題滿足了關於專利性的所有法定條件。例如，關於新穎性、非顯而易見性等，如 果後來的研究表明，一個或多個權利要求包括了一種或多種將破壞新穎性、非顯而易見性 等的實施方案，則被定義限制到「可獲得專利」的實施方案上的權利要求明確排除不能得到 專利的實施方案。同樣所附的權利要求還要解釋為提供最寬的合理範圍以及保持其有效 性。此外，從本申請提交或專利授權的時間到一條或多條所附權利要求的有效性被質疑的 時間，如果關於專利性的一條或多條法定條件被修訂，或者如果評價關於專利性的特定條 件是否滿足的標準改變，本權利要求應該以下述方式解釋(1)保持其有效性和(2)在這種 情況下提供最寬的合理解釋。術語「藥物可接受的鹽」指保持本發明化合物的生物效力和特性的鹽類，並且其不 是生物或其它方面不合乎需要的。很多情況下，本發明的化合物在存在氨基和/或羧基或 與此相似的基團的條件下，能形成酸和/或鹼鹽。藥物可接受的酸式鹽可以從無機和有機 酸製備，而藥物可接受的鹼加成鹽可從無機和有機鹼製備。關於藥物可接受的鹽的綜述見 Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sd，vol. 66，1)。「藥物可接受的無毒鹽」指用無毒的藥物可 接受的無機或有機酸或者無機或有機鹼形成的無毒鹽。例如，鹽包括從無機酸如鹽酸、氫溴 酸、硫酸、磺醯胺酸、磷酸、硝酸等衍生的鹽，以及從有機酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、 硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸(pamoicacid)、馬來酸、羥基馬來酸、 苯基乙酸、穀氨酸、安息香酸、水楊酸、磺胺酸、富馬酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等。鹽還包括來 自無機鹼，如氨水、羥乙胺和胼的鹽。適用的有機鹼包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、 三甲胺、三乙胺、乙二胺、羥乙胺、嗎啉、哌嗪和胍。「多個」指超過一個。術語「利妥昔單抗(rituximab)難以治療的」意思是之前用利妥昔單抗治療，但是 根據醫生或治療專家的決定，由於單一藥劑或者聯合治療施用的利妥昔單抗療法難以治療 的疾病(定義為在全部利妥昔單抗治療的6個月內沒有反應或病情發展)，不適合進一步治 療，和/或對之前的利妥昔單抗治療有不良反應，使得進一步治療得不到保證。術語「抗-⑶20難以治療的」意思是之前用與⑶20抗原相互作用的藥劑治療，但是根據醫生或治療專家的決定，由於單一藥劑或者聯合治療施用的抗CD20劑的難以治療 的疾病(定義為在全部抗CD20治療的6個月內沒有反應或病情發展)，不適合進一步治療， 和/或對之前的利妥昔單抗治療有不良反應，使得進一步治療得不到保證。細胞周期的「S期」指染色體複製的時期。術語「種類」在不同條件下用於本文，如化療藥的具體種類。在每個條件中，術語 指在該特定條件下所指的這類化學區分不明顯的分子類群。「對象」或「患者」是指需要可由本發明的分子有效治療的治療的動物。可以治療 的動物依照本發明包括脊椎動物，哺乳動物如牛、犬、馬、貓、羊、豬和靈長類(包括人和非 人靈長類)動物是特別優選的實例。「治療有效量」指施用到需要這種治療的對象中時，活性成分足以產生治療作用的 量。在癌症治療的條件下，「治療有效量」是在與癌細胞存活或代謝有關的一個或多個參數 中，產生有客觀量度的改變的量，包括與特定癌症相關的一個或多個基因表達的增加或減 少、腫瘤負荷降低、癌細胞裂解、在生物樣本中(如活檢和體液如全血、血漿、血清、尿等的 等分試樣)檢測到一個或多個癌細胞死亡標記、對誘導細胞程序性死亡或其它的細胞死亡 途徑的誘導等。當然，治療有效量根據具體對象和要治療的病症、對象的體重和年齡、病情 嚴重度、所選的特定化合物、要依照的施用方案、施用時間、施用方式等而變化，所有這些可 以由本領域的普通技術人員很容易地確定。應當領會，在聯合治療的情況下，構成特定活性 成分的治療有效量可以與單一療法(即治療方案只採用一種實體化學藥品作為活性成分) 施用時構成的活性成分的治療有效量不同。術語「治療」意思是對疾病或病症的任何處理，包括預防或保護免患疾病或病症 (即致使臨床症狀不再發展)；抑制疾病或病症(即阻止或抑制臨床症狀的發展)；和/或 減輕疾病或病症(即致使臨床症狀消退)。應當領會，不是總可能區別「預防」和「抑制」疾 病或病症，因為最終的誘導事件可以是未知的或潛在的。因此，術語「預防」應理解為構成 了一類「治療」，既包括「預防」又包括「抑制」。術語「保護」因而包括「預防」。

發明內容
本發明的一個目的是，通過施用在癌細胞中引起有絲分裂災變(catastrophe)的 化合物(如苯達莫司汀)，單獨施用或者與其它化合物和/或治療相結合，為治療特徵在於 癌細胞抗死亡的癌症提供了可獲得專利的方法。在優選實施方案中，這些方法包括確定患 者是否患有特徵在於癌細胞抗死亡的癌症，如果是，給患者施用治療有效量的苯達莫司汀。 發明的另一個目的涉及在癌症治療的施用期間或之後的一個或多個時段，在採集的患者 生物樣本中檢測癌細胞死亡標記的基礎上，評價癌症治療的有效性。因此，本發明的一個方面涉及治療癌症患者的可獲得專利的方法，所述癌症患 者的癌症特徵在於癌細胞抗死亡，即癌細胞對抗細胞程序性死亡或其它程序細胞死亡途 徑，以及細胞表現出多藥抗性(MDR)，這是可以被施用一種或多種烷化劑，單獨施用或與抗 CD20如利妥昔單抗結合所誘導的。這些方法包括給患者施用治療有效量的、在抗死亡癌 細胞中引起有絲分裂災變的化合物。這樣的細胞包括對抗藥物引起的細胞程序性死亡的 細胞。所述細胞的實例包括P53缺陷的細胞，通常是包括編碼p53的基因中有缺失或該基 因缺失的突變的結果。這樣的癌症代表性的實例包括非何杰金氏(Hodgkin' s)淋巴瘤
7(「NHL")和慢性淋巴細胞白血病(「CLL")。誘導有絲分裂災變特別優選的化合物是 烷化劑苯達莫司汀。因此，相關方面涉及包括鑑定特定癌症細胞為抗死亡癌細胞，之後用在 所述細胞中誘導有絲分裂災變的化合物單獨或與其它化療藥、佐劑、手術和/或放療結合 治療的治療方法。另外，可以監測所述治療方案的有效性，評價特定的單一療法或聯合療法 治療能否達到所需的效果。本發明的另一個方面涉及治療癌症的某些相關的可獲得專利的方法，特別是特徵 在於癌細胞抗死亡的癌症。這些方法包括當包含癌症的至少一部分細胞處於細胞周期的S 期時，給患者施用治療有效量的化合物。在一些實施方案中，給患者施用驅使癌細胞進入S 期的化合物的結果是，患者癌細胞的至少一部分被驅進S期。苯達莫司汀是特別優選的驅 使癌細胞進入S期的化合物。由於苯達莫司汀適用於把細胞驅入S期，另外的優選實施方 案包括隨後施用一種或多種其它當細胞在細胞周期的S期時更具活性(即發揮更大的治療 作用，例如細胞毒性)的化療劑，。在所述方法中，隨後施用一種或多種其他化療藥優選發 生在苯達莫司汀施用後至少約10分鐘，優選至少約30-約60分鐘或更長，雖然優選施用所 述其它藥發生在苯達莫司汀施用後約72小時之內，優選約48小時或更短。在一部分這些 優選實施方案中，其它化療藥在施用苯達莫司汀後約30分鐘至約36小時內施用，優選在施 用苯達莫司汀後的大約30分鐘至24小時內，某些情況下，在施用苯達莫司汀後大約30分 鍾至6至大約12小時內。相關的方法包括減少與癌症治療有關的毒性。這樣的方法包括 給癌症患者施用多個劑量的治療有效量的苯達莫司汀。首劑就足以導致不需要的毒性。在 這樣的事件中，可延遲第二次施用(或後續劑量)，直至不需要的毒性減退。在一些情況下， 苯達莫司汀在不同時間的施用劑量也可以變化。本發明的另一個方面因此涉及在施用烷化劑(如苯達莫司汀)的基礎上，評價癌 症治療療效的可獲得專利的方法，該方法在整個治療過程期間或之後，可以是單一療法或 聯合療法。當在施用包括施用烷化劑(如苯達莫司汀)的治療方案之後進行評價時，優選 先經過足夠的時間，使烷化劑能發揮其應有的或需要的治療作用。在這樣的方法中，從來自 患者的生物樣品中檢測與療效有關的癌細胞死亡標記(即，由瀕死或死亡的癌細胞產生或 釋放的分子(例如蛋白質、碳氫化合物、脂質、核酸或其它分子)以及如喪失細胞生存能力、 不能增殖、衰老等表型)來確定所用的治療是否有效。。優選的細胞死亡標記包括腺苷酸激 酶活性水平、PARP切割產物的水平、和細胞生存能力降低。根據標記，這樣的檢測可以是定 性、半定量或定量的。檢測的標記的存在或水平表明治療是否有、或曾經有效。本發明的另外一個方面，發明涉及在對患有對一種或多種烷化劑和抗CD20劑(例 如利妥昔單抗)具有抗性或難以治療的癌症的患者施用苯達莫司汀的基礎上，對癌症的治 療。優選這些方法用於對抗以癌細胞抗死亡為特徵的癌症。本發明相關的方面涉及在所述 癌症的治療中處理事務的方法，包括促進苯達莫司汀用於處理難以治療的癌症或特徵在於 癌細胞抗死亡的癌症，特別是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑如利妥昔單抗的聯合治療 難治的癌症。還有一個方面涉及患者的癌症是否對苯達莫司汀治療敏感。應當領會，可以 採用任何適用於苯達莫司汀敏感性的評價。在這些方法的一些優選實施方案中，從患者採 集的癌組織細胞樣本的部分或全部在沒有對癌細胞有毒性的化合物存在、使得癌細胞增殖 的生長條件下暴露於苯達莫司汀。然後基於分析結果進行敏感性評價。例如，與對照比較， 增殖減低表明細胞，即患者的癌症，對苯達莫司汀為基礎的治療敏感。反之，沒有作用(或提高增殖)顯示缺少敏感性。發明的另外一個方面涉及苯達莫司汀在製備治療癌症的藥物中的應用，所述癌症 是特徵在於癌細胞抗死亡的癌症或治療難治性癌症，特別是用一種或多種烷化劑和抗CD20 劑如利妥昔單抗的聯合治療難治的癌症。優選所述藥物包括治療有效量的苯達莫司汀。附圖簡述本專利申請包含至少一個彩色製圖。帶有彩色附圖的本專利申請的複製件在請求 並付必要的費用後提供。

圖1有兩個試驗組，A和B，各顯示基因表達分布圖，A顯示苯達莫司汀基因表達 圖譜簇前100個受調節基因，B顯示受三種受試藥物上調節水平水平最高的基因。這兩 個試驗組顯示在非何杰金氏淋巴瘤細胞系SU-DHL-I中，用含有超過12，000已知基因的 Affymetrix基因晶片(U133A)測定的基因表達。苯達莫司汀在IC50 (25 μ M ；條帶1)和 IC90(35yM;條帶2)下測試。苯丁酸氮芥(5 μ M ；條帶3)和環磷醯胺代謝物磷醯胺氮芥 (50 μ M ；條帶4)在IC90下測試。暴露後8h分離mRNA。Α.顯示的簇圖(clustergram)代 表與對照(稀釋劑，DMS0)比較，前100個受調節水平最高的基因。紅色代表上調的基因， 藍色代表下調的基因。B.該簇圖表現出同時被全部三種被測藥物誘導的基因。圖2有三個柱狀圖，2A、2B和2C，2A顯示Q-PCR驗證選擇的p53_依賴性和促細胞 程序性死亡基因，2B顯示Q-PCR驗證選擇的有絲分裂關卡基因，2C顯示Q-PCR驗證選擇的 DNA修復基因。按照下文方法部分的敘述，在暴露於等毒性濃度的苯達莫司汀、磷醯胺氮芥 和苯丁酸氮芥的SU-DHL-I中進行Q-PCR分析。用對18s RNA的分析對輸入cDNA (input cDNA)的水平標準化，未處理樣本中的轉錄水平設定為1。圖2A顯示兩種代表性p53-依賴 基因p21和NOXA的相對RNA水平。圖2B顯示參與M期細胞周期關卡的四種基因polo-類 激酶(PLK-I)、aurora激酶A和B、以及細胞周期蛋白Bl的RNA水平。圖2C顯示涉及DNA 修復機制的基因EXOl和Fenl的RNA水平。柱代表相對於DMSO-處理的對照的倍數改變均 值 +/-SE。圖3顯示了數個免疫印跡，證明了在NHL細胞(SU-DHL-I)中，苯達莫司汀(50 μ M) 與環磷醯胺(50 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4μΜ)比較，細胞程序性死亡作用提高。為了產生這些 免疫印跡，在如下文方法部分所述暴露20小時後製備細胞裂解產物。用β-肌動蛋白作為 點樣對照對膜進行探查，並顯示在受調節的蛋白質下方。左上端長方圖代表Serl5-磷酸化 P53的表達，用磷特異性抗體檢測。中間左邊的方圖顯示總p53和p21的表達。左下方圖代 表Bax的表達。右方圖顯示全長PARP (最上方)和用識別特異的半胱天冬酶斷裂位點的抗 體的PARP半胱天冬酶斷裂片段。圖4由兩個圖組成，A和B，表示所選的DNA修復機制的功能分析，A顯示MX (Ape-I 抑制劑)對苯達莫司汀活性的作用與對環磷醯胺活性的作用比較，B顯示06-苄基鳥嘌呤 對苯達莫司汀、環磷醯胺和卡莫司汀的作用。圖4A顯示是苯達莫司汀而不是環磷醯胺，通 過鹼基切除修復(BER)導致DNA損傷修復。修復酶Ape-Ι，一種無嘌呤內切酶，在BER途徑 中，在苯達莫司汀和環磷醯胺代謝物磷醯胺氮芥(PM)的細胞毒活性中發揮著至關重要的 作用，用Ape-I抑制劑甲氧胺(MX)對其作用進行評價。用苯達莫司汀和MX觀察到曲線的 左移，顯示苯達莫司汀產生的DNA損傷被BER修復。圖4B顯示抑制MGMT修復活性不影響 苯達莫司汀的細胞毒性。修復酶MGMT (O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶)在苯達莫司汀細胞毒活性中的作用，用MGMT抑制劑O6-苄基鳥嘌呤(O6-BG)評價。加入O6-苄基鳥嘌呤不顯 著改變苯達莫司汀的IC5tl，因此苯達莫司汀不可能誘導O6-烷基鳥嘌呤DNA加成物。反之， O6-苄基鳥嘌呤明顯使細胞對其它氮芥如卡莫司汀和磷醯胺氮芥(PM)敏感化。圖5圖解了苯達莫司汀有效進入腫瘤細胞，引起長時間和大範圍的DNA損傷，其導 致了至少三個信號途徑的啟動1)可能通過促細胞程序性死亡的BCL-2家族成員如NOXA 和Bax激活「經典的」p53-依賴性應激途徑，導致內在細胞程序性死亡的強烈激活；2)激活 DNA修復機制，如鹼基切除修復工具，其不能通過通常用在NHL或CLL患者中的其它烷化劑 激活；和3)抑制數個有絲分裂關卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。雖然不希望被局限 於具體理論中，但據估計，同時誘導DNA損傷和抑制有絲分裂關卡阻止了暴露於苯達莫司 汀的腫瘤細胞在經歷有絲分裂之前就有效修復DNA損傷。從而細胞以受損的DNA進入有絲 分裂，或者不能繼續進行「常規的」P53-依賴性細胞程序性死亡的細胞將通過有絲分裂災變 而死亡。這個替代的程序化細胞死亡途徑，連同傳統的細胞程序性死亡的強烈激活，據相信 是苯達莫司汀為何在體外以及在化學藥品難以治療的腫瘤患者中，非常有效地殺死抗藥癌 細胞的理由。圖6是直方圖，顯示了在下文的實施例3描述的數個「洗脫」實驗期間，進行的腺苷 酸激酶分析的結果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的藥物處理指定的時間，洗脫，並使細胞 在新鮮培養基上生長48小時(SU-DHL-I)後進行。在這些實驗中，SU-DHL-I細胞用50 μ M 苯達莫司汀、20 μ M磷醯胺氮芥或2 μ M苯丁酸氮芥處理30、60或90分鐘。定時藥物培養之 後，細胞在IX PBS中清洗，「洗脫」特定化療劑，然後加入新鮮的培養基。之後培養細胞48 小時，這段時間過後在細胞上清液中進行腺苷酸激酶的分析。粉紅色柱代表藥物(或無藥) 培養的零分鐘。綠色柱代表培養30分鐘，橙色柱代表培養60分鐘，紫色柱代表培養120分 鍾。結果繪製了三種藥物和「無藥」對照相比較的上清液中腺苷酸激酶活性的水平。標準 偏差在圖上每個柱子的頂部顯示。圖7與和圖6類似是直方圖，顯示了在下文的實施例3描述的數個「洗脫」實驗期 間，進行的腺苷酸激酶分析的結果，所述腺苷酸激酶分析在用指定的藥物處理指定的時間， 洗脫，並使細胞在新鮮培養基上生長72小時(SU-DHL-I)後進行。圖6和7之間描繪的結 果之間的差異在於圖6表現的數據涉及到從培養基「洗脫」各種藥物之後，細胞培養48小 時，而圖7的數據涉及到「洗脫」特定藥物後細胞培養72小時。本領域人員應當領會，下面的說明具體敘述了本發明的某些優選實施方案，因而 只是代表性的，不是描述發明的實際範圍。在詳細敘述本發明之前，應當理解，本發明並不 局限於所述的具體分子、系統和方法，這些可以變化。還要理解，這裡所用的術語只是為了 描述具體實施方案，並非意在限制本發明由所附的權利要求限定的範圍。
具體實施例方式本發明是基於意外的發現，即烷化劑苯達莫司汀對多種癌細胞類型發揮出非常迅 速的細胞毒作用，包括傳統化療方案難治的癌細胞。還已經發現，如下文具體所述，與其它 抗癌藥相比，苯達莫司汀通過獨特的作用模式發揮其毒性作用。苯達莫司汀，4- {5-[雙(2-氯乙基)氨基]-1-甲基-2-苯並咪唑基}，是一種氮芥 類化療劑。苯達莫司汀主要表現烷基化活性，即它是DNA損傷劑。當施用於人(通常通過
10靜脈推注)時，苯達莫司汀血清半衰期短，大約2小時。因此，它從患者身體系統迅速清除。 出人意料的是，已經發現，被細胞攝取後，苯達莫司汀迅速發揮其持久的細胞毒作用。實際 上，如下面的實施例3所報告，化合物的大部分毒性作用要在癌細胞暴露於藥劑下至少大 約30分鐘後發揮。當前典型的苯達莫司汀治療方案包括分開給予三次靜脈推注，各次含有等量的苯 達莫司汀。通常在第一次輸注後一天給以第二次輸注，之後在第一次輸注後三周是第三次 輸注。採用這種方案是由於苯達莫司汀的相關毒性，包括骨髓抑制。得到了苯達莫司汀血清 半衰期短和其快速作用的性質，則可以通過延遲第二次和後續施用降低藥物的相關毒性。 實際上，因為在與苯達莫司汀治療非何杰金氏淋巴瘤有關的報告中，偶見大範圍的並可能 是致死的腫瘤溶解，所以可以增加藥物多次施用的間隔，降低腫瘤溶解的發生率。除了降低 有害的毒性之外，在特定治療方案中加大苯達莫司汀施用間隔也會加大治療窗(window)， 即在此時間段內藥物發揮其所需的治療效益。實行本發明所用的組合物依照藥物配方技術的傳統方法加工，產生施用於對象 的醫用藥劑(即藥物或治療組合物)，所述對象包括人類和其它哺乳動物，即分別是「藥 物」和「獸醫」用藥。參見，例如最新版 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA) 0通常，化合物如苯達莫司汀與藥學可接受的載體組合成組 合物。該組合物還可包括下列的一種或多種防腐劑；增溶劑；穩定劑；潤溼劑；乳化劑；甜 味劑；著色劑；芳香劑；鹽；緩衝劑；塗層劑；和抗氧化劑。實行本發明所用的藥物可製備成游離酸或鹼，然後優選與適當的化合物組合，產 生藥物可接受的鹽。「藥物可接受的鹽」的表述指用無毒的、藥物可接受的無機或有機酸或 者無機或有機鹼形成的無毒鹽。例如，所述鹽包括從無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺醯胺 酸、磷酸、硝酸等衍生的鹽，以及從有機酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果 酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、撲酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯基乙酸、穀氨酸、安息香酸、水 楊酸、磺胺酸、富馬酸、甲磺酸、和甲苯磺酸等製備的鹽。鹽還包括來自無機鹼，如氨水、羥乙 胺和胼的鹽。適用的有機鹼包括甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、 羥乙胺、嗎啉、哌嗪和胍。在任何情況下，藥物組合物優選製成含有給定量所需治療藥(如苯達莫司汀)和 載體(即生理可接受的賦形劑)的劑量單位的形式。任何這樣的分子對人類或其它哺乳動 物(或其它動物)的治療有效量的構成，將取決於各種因素，其中包括疾病或病症的類型、 年齡、體重、性別、對象的醫療狀況、病情嚴重度、施用途徑、採用的具體化合物。因此，劑量 方案可以變化很大，但用標準方法可以常規確定。任何情況下，化療藥的「有效量」是引起 想要的細胞毒性的量。為達到想要的作用，所述治療分子的需要量將取決於眾多的考慮事 項，包括特定分子本身、要治療的疾病或病症、對象的癌症響應分子的能力，給藥途徑等。為 達到想要的作用，所需的該分子的精確量取決於執業醫師的判斷，並對每個單獨的對象是 特定的。但是，適用劑量可以從每天每千克體重約數納克(ng)活性成分至約數毫克(mg)。治療組合物的製備是本領域公知的。通常，這樣的組合物製成注射劑，或為液體 溶液或為懸液，但是，也能製成注射前適合溶解在或懸浮在液體中的固體形式。製劑也能被 乳化。活性治療成分經常同生理可接受並與活性成分可兼容的賦形劑混合。適用的賦形劑 是，例如注射用水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其組合。另外，如果需要，組合物可以含有少量提高活性成分的有效性的助劑如潤溼或乳化劑、退熱劑、穩定劑、增稠劑、懸浮劑、麻醉 劑、防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑、止痛劑、PH緩衝劑等。所述成分能提供附加的治療效益，或 作用於預防施用藥物組合物可能造成的任何潛在的副作用。本發明的組合物以含有常規載體、助劑和介質的劑量單位製劑，可以口服施用、通 過吸入噴霧劑胃腸外施用、直腸施用、結內施用(intranodally)、鞘內施用、或局部施用。在 治療組合物是為了人類施用的情況下，應用藥物可接受的載體。術語「藥物可接受的載體」 和「生理可接受的載體」指施用於對象時，生理可耐受並且通常不產生不想要的過敏或類似 不當反應的分子實體和組合物，所述不當反應如胃不適、頭暈等。對於口服施用，組合物可以是任何適當的形式，其中包括例如膠囊、片齊IJ、錠齊U、軟 錠劑、粉劑、懸液劑或液體。液體可以作為帶有適當載體包括鹽水、葡萄糖或水的組合物注 射施用。術語「胃腸外」包括經皮下、靜脈內、肌內、胸骨內或腹腔內途徑輸注(包括持續或 間斷輸注)和注射。直腸施用的栓劑可以通過將活性成分與適當的無刺激賦形劑如常溫下 為固體但生理溫度下為液體的可可脂和/或聚乙二醇混合而製備。組合物也可以製備成固體形式(包括顆粒、粉末或栓劑)。組合物可以經過傳統的 藥物操作如殺菌和/或可含有傳統的助劑如防腐劑、穩定劑、潤溼劑、乳化劑、緩衝劑等。口 服施用的固體劑型可包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在所述固體劑型中，活性化合物 可以與至少一種惰性賦形劑如蔗糖、乳糖或澱粉混合。所述劑型也可包含除了惰性稀釋劑 以外的附加物質，如潤滑劑例如硬脂酸鎂。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，劑型也可包含緩 衝劑。片劑和丸劑也可另外製備成帶有腸衣。口服施用的液體劑型也可包括藥物可接受的 乳液、溶液、懸液、糖漿和酏劑，其含有通常用於本領域的惰性稀釋劑如水。所述組合物也可 包含助劑，如潤溼劑、甜味劑、調味劑和芳香劑。注射製劑如無菌注射含水或含油懸液，可以根據已知方法用適當的分散劑或潤溼 劑和懸浮劑製備。注射製劑也可以是在胃腸外可接受的無毒稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶 液或懸液。可以用的適用介質和溶劑是注射用水，Rimger溶液和等滲的氯化鈉溶液等。另 外，無菌固定油可以用作溶劑或懸浮介質。為此，可以用任何溫和的固定油，包括合成的甘 油一酯或甘油二酯。另外，發現了脂肪酸如油酸在製備注射劑中的用途。作為局部用藥，組合物的適當的局部劑量可以每天施用一至四次，優選兩或 三次。該劑量的施用也可以有期間不用藥的居間日。局部施用的適用組合物常包含 0. 001% -10% w/w的活性成分，例如製劑的1-2重量％，儘管它可包含多達10% w/w，但優 選不超過5 % w/w,更優選為製劑的0. 1 % -1 %。適於局部施用的製劑包括適於透過皮膚的 液體或半液體的製劑(如擦劑、洗劑、膏劑、霜劑或糊劑)，滴劑適合對眼睛、耳朵或鼻子施 用。施用本發明的組合物的示例性方法(如使其達到消毒或無菌條件)，對於技術人 員是顯見的。適合該目的的某些方法在Goodman和GiIman的The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed. (1985)中提出。對患者的施用可以是間斷的；或者是以逐步的、 持續的、恆定的、或控制的速度施用。苯達莫司汀治療非何杰金氏淋巴瘤的典型治療有效劑量可以約60-120mg/m2，連 續兩天單劑施用，或在劑量之間間隔數日。可以大約每三至四周為周期重複。為了治療慢 性淋巴細胞白血病(CLL)，可以在第1和2天給予苯達莫司汀約80-100mg/m2。可以在大約4周後重複該周期。為了治療何杰金氏病(II-IV期)，在"DBVBe方案"中可以給予苯達 莫司汀伴第1和15天用柔紅黴素25mg/m2，第1和15天用博來黴素10mg/m2，第1和15天 用長春新鹼1. 4mg/m2,以及第1-5天苯達莫司汀50mg/m2，大約每四周為周期重複。對於乳 腺癌，可以在第1和8天給予苯達莫司汀(120mg/m2)聯合第1和8天氨甲蝶呤40mg/m2，以 及第1和8天5-氟脲嘧啶600mg/m2，大約每四周為周期重複。作為乳腺癌的二線治療，苯 達莫司汀可以在第1和2天給予大約100-150mg/m2，大約每四周為周期重複。本發明的方法包括單一療法和聯合治療。在聯合治療的情況下，本發明預想了施 用兩種或多種化療劑。各種各樣的化療劑是本領域已知的。這些化合物中一些已經被許 可用於治療一種或多種癌症適應症。另一些在不同階段的臨床前和臨床開發中。適合實 行本發明的聯合治療的化療劑實例包括烷化劑白消安、卡鉬、卡莫司汀、順鉬、苯丁酸氮芥、 環磷醯胺、達卡巴嗪、六甲嘧胺、異環磷醯胺、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、米託坦、絲 裂黴素、哌泊溴烷、丙卡巴胼、鏈脲菌素、噻替哌和三亞乙基密胺。優選的與苯達莫司汀合用 的抗代謝物類包括卡培他濱、氯脫氧腺苷、阿糖胞苷(及其活性形式，ara-CMP)、阿糖胞苷、 dacabazine、氟尿苷、氟達拉賓、5-氟脲嘧啶、吉西他濱、羥基脲、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、噴 司他丁、三甲曲沙和6-巰基鳥嘌呤。優選的與苯達莫司汀合用的抗有絲分裂的化合物包括 諾維本、紫杉醇、泰素帝、長春鹼、長春新鹼、長春地辛和長春瑞賓。其它類的化療劑包括拓撲異構酶I抑制劑(如喜樹鹼(camptothecin)，伊 立替康(irinotecan)，拓撲替康(topotecan)等)；拓撲異構酶II抑制劑如柔紅黴素 (daunorubicin)、阿霄素(doxorubicin)、依託泊昔(etoposide)、伊達比星(idarubicin)、 米託蒽醌(mitoxantrone)和替尼泊甙(teniposide)；血管生成抑制劑(如達肝素 (dalteparin)，蘇拉明(suramin)等)；抗體，包括阿侖單抗(alemtuzumab)、貝伐
Jtl (bevacizumab)、胃 # 羅了 (bexarotene)、epratuzumab> pf ^ Jfl (gemtuzumab ozogamicin)、伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、甲石黃酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、 雷替曲噻(raltitrexed)、revlimid、利妥昔單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)；酪氨酸激 酶抑制劑；插入劑；和激素，如阿那曲唑(anastrozole)、雌激素、抗雌激素(如氟維司群 (fulvestrant)和他莫昔芬(tamoxifen))、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、 戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(Ieuprolide)、尼魯米特(nilutamide) > levimasole、 來曲唑(Ietrozole)、潑尼松(prednisone)和託瑞米芬(toremifene)。其它化療劑包 括蛋白質如血管生成抑制素、天冬醯胺酶、deniluekin diftitox、血管內皮抑素、咪喹 莫特(imiquimod)、幹擾素、白細胞介素-11和培加帕酶(pegaspargase)。還有其它 的化療劑包括分子，如9-順式視黃酸(alitretinoin)、六甲嘧胺(altretamine)、氨 磷汀(amifostine)、安丫啶(amsacrine)、三氧化砷、博來黴素(bleomycin)、卡培他濱 (capecitabine)、羧醯胺三唑、塞來考昔(celecoxib)、更生黴素(dactinomycin)、表柔比 星(印irubicin)、geldanmycin、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德黴素(17AAG)、伊 立替康、2-甲氧雌二醇、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素C(mytomycin C)、奧沙利鉬 (oxaliplatin)、鯊胺(squalamine)、替莫唑胺(temozolamide)、沙利度胺(thalidomide)、 tretinoin triapine和valrubicin。本領域人員應體會，這些和其它現在已知或之後開發 的化療劑可以與苯達莫司汀合用，治療各種腫瘤，包括癌症。實施例
提供下列實施例用於說明本發明的某些方面，並幫助本領域技術人員實施本發 明。這些實施例決不能認為是以任何方式限制了發明的範圍。實施例1苯達莫司汀作用機制的分子學分析A.引言苯達莫司汀(Treanda ，Salmedix,Inc. CA ；Ribomustin (Ribosepharm GmbH, Munich Germany))是一種抗腫瘤劑，已被臨床前和臨床證明對抗各種人類腫瘤的活性，如 非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴細胞白血病、實體瘤、乳腺癌和小細胞肺癌，以及多種骨 髓瘤，包括傳統DNA損傷劑難治性腫瘤。苯達莫司汀，4-{5_[雙(2-氯乙基)氨基]-1-甲 基-2-苯並咪唑基}鹽酸丁酸，最初的合成是為了產生具有低毒以及兼具烷基化和抗代謝 物性質的藥劑。它具有三個亞結構元件2_氯乙基氨烷基化基團；苯並咪唑環；和丁酸側 鏈。2-氯乙基氨烷基化基團與其它氮芥類，如環磷醯胺、苯丁酸氮芥和美法侖共用。雖然苯 丁酸氮芥中也有丁酸側鏈，但苯並咪唑中央環體系是苯達莫司汀的獨有特點。其獨特的抗 腫瘤活性特點可能歸功於這種多層面結構，並使其與傳統的烷化劑區別開來。DNA烷化劑在化療物質中極為有用。這些藥物具有預料不到的作用機制，如這些化 合物中的一些誘導程序化壞死的能力，和另一些(如鉬類(platins))甚至在缺少核的細胞 中誘導細胞程序性死亡的能力。在「氮芥」的情況下，主要的差異存在於各種適應症中它們 的區別使用所反映的活性圖譜環磷醯胺，主要用於治療NHL ；苯丁酸氮芥，用於治療慢性 淋巴細胞白血病；美法侖，治療多發性骨髓瘤。苯達莫司汀主要的抗腫瘤作用，與其它烷化劑相同，來自DNA配對鏈之間形成交 聯，雖然也可包括其它作用方式。因此，苯達莫司汀的抗腫瘤作用可以源於比簡單的經典 烷基化活性更為複雜的機制，因為苯達莫司汀導致的DNA鏈斷裂比環磷醯胺或BNCU導致 的明顯更持久，苯達莫司汀表現出對在體外和離體抗其它烷化劑的細胞系的對抗活性，並 已證明苯達莫司汀作為單一藥劑以及與其它抗癌劑合用，在數個體外腫瘤模型中具有獨特 的促細胞程序性死亡活性。對苯達莫司汀作用確切機制的詳細分子研究還很少。為此， 運用現有的分子工具充分詳細分析苯達莫司汀的作用機制。本實施例介紹了來自藥物基 因組學分析的結果來分析苯達莫司汀在NHL細胞系中引起的基因表達圖譜的改變。這些 藥物基因組學分析通過處理細胞程序性死亡信號的啟動、DNA修復機制和有絲分裂關卡的 調節的功能分析來驗證。最終，苯達莫司汀在體外篩選中，以國家癌症研究所(National CancerInstitute)的人類腫瘤60個細胞系表徵，並且研究了其相對於烷化劑庫(即苯丁酸 氮芥和磷醯胺氮芥(環磷醯胺的代謝物))的比較活性。利用藥物基因組分析進行苯達莫 司汀在NHL細胞系中引起的基因表達圖譜改變的分析，也產生了結果。這些藥物基因組學 分析通過Q-PCR和處理細胞程序性死亡信號的啟動、DNA修復機制和有絲分裂關卡的調節 的功能分析來驗證。總之，這些結果表明苯達莫司汀具有與其它烷基化藥物不同的多種作 用機制，解釋了苯達莫司汀在患有傳統療法難治性腫瘤的患者中的活性。B.材料與方法a.細胞SU-DHL-I 細胞從加利福尼亞聖地牙哥大學(University CaliforniaSan Diego) 得到。細胞在補充有10% FBS(Invitrogen)和100單位/ml青黴素/鏈黴素的RPMI
141640 (Hyclone)上生長。b.試劑鹽酸苯達莫司汀得自Fujisawa Deutschland(Munich，德國)。磷醯胺氮芥環己 胺鹽(PM，NSC69945)，環磷醯胺的活性代謝物，得自國家癌症研究所(NCI)發展治療計劃 (Developmental Therapeutics Program, DTP)的合成物貯藏庫。其它所有的試劑得自商 業來源，如 Sigma-Aldrich。c.藥物處理對於本實施例的多數分析，選擇使用的苯達莫司汀、磷醯胺氮芥(環磷醯胺的活 性代謝物)和苯丁酸氮芥濃度，基於用MTT分析經三天時間測定的它們的細胞毒活性。在 DMSO中製備藥物，然後在培養基中稀釋。d.製備RNA樣品和分析表達數據細胞(5xIO6 細胞)收集在 ImL TRIZOL 液(Invitrogen，San Diego, CA)中， 然後按照製造商的說明書分離總RNA。生物素標記的cDNA(15 μ g)與每個基因晶片陣列 (Affymetrix, Santa Clara)雜交。簡言之，製備雜交到晶片上的材料的程序包括多個步驟。 分離總RNA並通過光密度定量。⑶NA的產生用特定的能識別與T7啟動子(dT7-(T)24)結 合的PolyA尾的特定引物，與dNTP、DTT和Superscript II產生cDNA第一條鏈。這種方法 減少了對分離的poly-A(+)mRNA的需要。第二條鏈通過加入dNTP，用DNA連接酶、DNA poll 和RNAse H合成，並在加入T4DNA聚合酶再培養5分鐘之前，在16°C培養2小時。進行cDNA 柱純化和定量。在與高密度寡核苷酸陣列雜交之前，進行體外轉錄(IVT)。該反應的啟始 材料是ι μ g cDNA，其中加入NTP，該NTP少於25%的CTP和UTP是通過加入IOmM生物素 化-Il-CTP和IOmM生物素化-16-UTP來代替。最後在37°C下加入在適當的緩衝液中的T7 酶6h，產生生物素化的IVT RNA，然後將其進行柱純化(RNeasy，Qiagen)。化學片段的IVT RNA (15 μ g)與對照寡核苷酸、標準(包括管家基因)和鮭魚精子DNA在適當的緩衝液中混 合，加熱到95°C 5分鐘，與晶片在42°C下雜交16h。未雜交的材料用2XSSPE洗掉，然後在反 應中加入藻紅素標記的抗生物素蛋白。洗掉過量的螢光染料，然後掃描晶片每個合成部件 的螢光強度(合成部件為7. 5平方微米)。e.生物信息分析開發了分析基因表達數據的策略和方法，其涉及運用C0RG0N法分析Affymetrix 基因晶片的掃描圖像。C0RG0N是免費使用的軟體，其核心統計方法已知(Sasik，et al. (2002)，Bioinformatics, vol. 18，no. 12 1633-40) 只有在至少一種情況下呈現 ρ < 0. 05 (95%置信水平)的基因要考慮作進一步分析。C0RG0N與Affymetrix Microarray Suite (AMS) 5. 0軟體的比較表明，C0RG0N的假陽性誤差率為4. 4%，比較之下，AMS 5. 0為 29%。所選的基因根據調節的平均值或峰寬來分選。基於表達模式的相似性，選擇前100 個受調節水平最高的基因進行聚類。採用分級聚類法。這種最初分類在確定研究中什麼是 主要基因和該方法的調節途徑中極為有用。表現出共調節的基因簇接受啟動子分析。下一 步是G03分析，是在Gene Ontology資料庫(網址www. geneontology. org)中發現與該過 程有關的統計學顯著性條件的無偏和無監督工具。G03易化了識別被顯著調節的系統關鍵 成分的過程。在資料庫中有三種本體(ontology)分子功能；生物過程；和細胞成分。該分 l/fi aids Research Genomics Core Facility ^ UCSD Center 巾 it if。
f.定量PCR分析特定轉錄的表達水平用定量PCR (Q-PCR)確定。用RNeasymini-pr印試劑 盒(Qiagen，Valencia, CA)分離每個處理過的SU-DHL-1細胞沉澱的總RNA。cDNA用 ThermoScript逆轉錄試劑盒(Invitrogen)和寡_dT引物根據製造商的方案製作。Q-PCR 擴增和定量用iCycler機(Bio-RAD，Hercules, CA)進行。樣品擴增在25 μ L含有2x IQSybrGreen Mix (Bio-Rad) 12. 5 μ L、各引物 1 μ M 和對應於 80ng 總 RNA 的 cDNA 體積的容 量中進行。循環條件為95°C 5秒；每個引物的適當退火溫度下30秒；以及72°C 30秒。分 析的靶特異性通過熔融曲線分析來驗證。各個基因的表達相對於每個樣品18s表達水平進 行標準化。然後通過 Livak and Schmittgen ((2001), Methods, vol. 25 402-408)的方法 計算各個基因相對於未處理的對照的表達。用BeaconDesigner (Premier Biosoft, Palo Alto,CA)設計引物或根據文獻設計。引物序列和退火溫度如下(各引物按5』至3』書寫， 後面是其SEQ IDN0)基因ID正向引物反向引物退火溫度
18sCGCCGCTAGAGGTGAAATTC(1)TTGGCAAATGCTTTCGCT (2)55 0C
p21CCTCATCCCGTGTTCTCCTTT(3)GTACCACCCAGCGGACAAGT(4)57 0C
NoxaATTTCTTCGGTCACTACACAA(5)AACGCCCAACAGGAACAC(6)55 0C
PLK-ICTCAACACGCCTCATCCT(7)GTGCTCGCTCATGTAATTGC(8)57 0C
Aurora ATCCTTGTCAGAATCCATTACCTGT(9)GAATGCGCTGGGAAGAATTTG (10)55 0C
Aurora BAGAGTGCATCACACAACGAGA(11)CTGAGCAGTTTGGAGATGAGGTC (12)56 0C
Cyclin BlAGTGTGACCCAGACTGCCTC(13)CAAGCCAGGTCCACCTCCTC (14)57 0C
ExolTTGGTCTGGAGGTCTTGGAGA(15)GAATCGCTCTTTCTTCGGAACTG (16)57 0C
g.比較分析
苯達莫司汀在NCI的由60個人類腫瘤細胞系組成的體外抗腫瘤篩查中進行實驗。
實驗包括10倍稀釋液中最少5個濃度，每個篩查重複兩次。採用48小時持續藥物暴露方 案。磺醯羅丹明(Sulforhodamine)B蛋白分析評價細胞的存活能力或生長。比較法和相關 數據可由發展治療計劃(DTP)的網站(網址dtp. nci.nih.gov)免費獲得。NCI指定的苯 達莫司汀號NSC138783。h. Western 印跡分析SU-DHL-I細胞用50 μ M苯達莫司汀、2 μ M苯丁酸氮芥或20 μ M磷醯胺氮芥培 養20小時。細胞用Ix PBS清洗兩次並用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解緩衝液(1Μ Tris-HCl (ρΗ7. 4)，IM KCl,5mMEDTA, 1 % NP-40,0. 5 % 脫氧膽鹼鈉，帶有 ImM 原釩酸鈉 (sodiumorthovanidate)、lmM氟化鈉、蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Nut ley, NJ)和磷酸酶 抑制劑混合物(Sigma，St. Louis, MO))進行裂解。沉澱不溶的膜、DNA和其它沉澱物，得到 蛋白上清。蛋白質濃度用Bradford分析(Pierce，Rockford，IL)測定。20 μ g裂解產物用 凝膠電泳在4-12%的聚丙烯醯胺凝膠上分離，轉移到硝化纖維素膜(Invitrogen)上，用下 列單克隆一抗通過免疫印跡法檢測抗-P53、抗-磷酸化p53 (Serospecific)、抗-21、抗裂 解的PARP (半胱天冬酶特異性切割位點)，均購自Cell Signaling (Beverly, ΜΑ)；抗-Bax 和抗PARP，購自BD Pharmingen(San Diego, CA)；以及抗-β肌動蛋白，用作點樣對照，購自Sigma (St. Louis，M0)。一抗在輕柔振動下，4°C培養過夜。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour680 山羊抗小鼠的二抗(1 4000) (Molecular Probes,Eugene,OR)在室溫下輕柔振 動培養2小時。印跡用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey掃描器上掃描。i.基於細胞的體外Ape-I和AGT分析細胞或用6mM甲氧胺(Sigma)或用50 μ M O6-苄基鳥嘌呤(Sigma)預先培養30 分鐘，二者分別是Ape-I鹼基切除修復酶和烷基脒基轉移酶(AGT)的抑制劑。然後將細胞 暴露在各種濃度的指示劑下72小時。用MTT分析(13)評價細胞毒性，測定IC5tl作為未處 理的對照數值被抑制了 50%時的藥物濃度。用GraphPad Prism 3. 00版GraphPad軟體 (SanDiego, CA)進行分析。j.細胞周期分析SU-DHL-I細胞用等毒濃度(IC5tl)的苯達莫司汀(50μΜ)、苯丁酸氮芥(4 μ Μ) 或磷醯胺氮芥(50μΜ)培養8小時。細胞用PBS清洗，並固定在20°C的70%乙醇 中至少1小時。固定的細胞通過PBS清洗重新水合。細胞重新懸浮在由IOyg/ ml 鵬化丙 Pg (Calbiochem, La Jolla, CA)、10 μ g/mlRNAse A(DNase free, Novagen, Madison, WI)和10 μ 1/ml Triton-X (Sigma)在PBS中組成的碘化丙啶染色液中。樣 品用 FACSCalibur(BDBiosciences，San Jose, CA)分析。用 DNA ModFit LT(Verity HouseSoftware, Inc. Sunnyvale, CA)模型軟體分析細胞周期分布。LH2AX轉化灶形成細胞在 Lab-Tek 室玻片(chamber slides) (NaIge Nunc Intl.，Naperville, IL) 上，於補充有10% FBS的RPMI 1640培養基中生長。讓細胞附著至少一天後，細胞在培養 基中用DMSO或50 μ M苯達莫司汀處理。細胞在37°C培養30分鐘，然後用PBS洗兩次。在 37°C再培養4小時。然後細胞用Ix PBS洗兩次，並在-20°C的100%乙醇中培養10分鐘 固定細胞。然後清洗三次，每次用Ix PBS洗5分鐘。室溫下在封阻緩衝液(10% FBS的 Ix PBS, 1% BSA)中培養1小時。玻片在4°C下用一級多克隆抗-H2AX抗體(R&D Systems, Minneapolis，MN)振搖過夜培養。抗體在封阻緩衝液中以1 10，000的比例稀釋。玻片 用 Ix PBS 洗三次，並用 Alexa Flour 488 山羊抗兔二抗(1 4000) (Molecular Probes, Eugene, OR)室溫下輕柔振搖培養45分鐘。玻片用Ix PBS洗三次，然後取下艙室，細胞中 加入帶有 DAPI (Molecular Probes)的退色防止劑(SlowFade Light Antifade)，並用蓋玻 片封閉玻片。用具有DIC光學和螢光、Zeiss AxioCam HRm照相機和Zeiss Axiovision軟 件4. 2版的電控Zeiss AxioPlan 2e成像顯微鏡進行分析。1.免疫印跡中H2AX在Ser 139殘基的磷酸化細胞系生長，鋪滿補充有10% FBS的RPMI 1640培養基。然後細胞用Ix PBS洗 兩次，並用在裂解之前直接加入的冰冷的裂解緩衝液(1M Tris-HCl (pH7. 4)，IM KCl, 5mM EDTA，NP-40，0. 5%脫氧膽鹼鈉，帶有 ImM 原釩酸鈉(sodium orthovanidate) UmM NaF、 蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Nut ley，NJ)和磷酸酶抑制劑混合物(Sigma，St. Louis, MO)) 進行裂解。沉澱不溶的膜、DNA和其它沉澱物，得到蛋白上清。蛋白質濃度用Bradford分 析(Pierce，Rockford, IL)測定。20微克裂解產物用凝膠電泳在4-12%的聚丙烯醯胺凝 膠上分離，轉移到硝化纖維素膜(Invitrogen，Carlsbad, CA)上，用多克隆抗-H2AX抗體 (R&DSystems，Minneapolis，MN)通過免疫印跡法檢測。抗體在封阻緩衝液中以1 2000的比例稀釋，膜在室溫下輕柔振動培養2小時。膜用Ix PBS洗三次，用Alexa Flour 680 山羊抗兔的二抗(1 5000) (Molecular Probes, Eugene, OR)在室溫下輕柔振動培養2小 時。印跡用Ix PBS洗三次，在LiCor Odyssey掃描器上掃描。C.結果a.基因表達圖譜鑑定了受不同於苯丁酸氮芥或環磷醯胺的苯達莫司汀調節的特 徵基因通過測定細胞暴露在藥物下三天後的存活率，測定苯達莫司汀、苯丁酸氮芥和磷 醯胺氮芥(環磷醯胺活性代謝物)的等毒濃度。對於本研究出現的分析，選用的苯達莫司 汀、磷醯胺氮芥和苯丁酸氮芥的濃度以該數據為基礎(下面的表1)。這些濃度也反映了各 藥的臨床可實現水平。AffymetriX基因晶片分析用於比較在藥物處理過的SU-DHL-I (非 何杰金氏淋巴瘤細胞系)中超過12，000個基因的表達水平，細胞與對照細胞比較。 SU-DHL-I細胞用IC5tl濃度(25 μ M)和IC9tl濃度(35 μ Μ)的苯達莫司汀培養。苯丁酸氮芥 和環磷醯胺代謝物磷醯胺氮芥在IC9tl，即分別為5 μ M和50 μ M下，進行測試。藥物處理後8 小時監測基因表達，鑑定該早期應激反應的最接近事件。基因組分析揭示，在三個受試藥物之間，多數基因的調節相似，如前100個受調節 的基因的簇圖所示(圖1Α)。大多數基因暴露於藥物後被上調(紅色)。基因的亞群在藥 物處理後被抑制轉錄(藍色)。重要的是，鑑定了一組基因，其表現出被苯達莫司汀的調節 較之其它兩個受試藥有差異。已知很多被誘導的基因(圖1Β)在其啟動子區具有ρ53-反應元件，被認為是ρ53 依賴性的。這些基因的實例有Ρ21(ρ53-誘導的細胞分裂激酶抑制劑)；wipl(p53-誘 導的蛋白磷酸酶1) ；N0XA(p53-誘導的促細胞程序性死亡Bcl-2家族成員)；DR5/ KILLER( P 53-調節的DNA損傷-可誘導的細胞死亡受體)；和BTG2。有趣的是，在前100個 受調節的基因中，鑑定了腫瘤壞死因子受體超家族的四個成員(成員6、9、10和10b)。這些 基因中數個已表現出在調節外在細胞程序性死亡途徑(REF，TRAIL/TNF細胞程序性死亡) 中有關鍵作用。另外幾個基因在苯達莫司汀和另兩個化合物之間表現出相反的趨勢(數據 未顯示)。這些基因受苯達莫司汀兩種濃度的上調，但均被苯丁酸氮芥和磷醯胺氮芥下調。為了評價苯達莫司汀、苯丁酸氮芥和磷醯胺氮芥之間的藥物基因組學差異，基因 圖譜的結果用G03軟體重新分析，該軟體是無偏和無監督工具，用於在Gene Ontology(GO) 資料庫中(網址WWW，gene0nt0l0gv. org)發現與該過程有關的有統計學顯著性的條件。在 苯達莫司汀處理的細胞中明顯上調或下調的基因和超過或低於對照處理的細胞表達至少 1.5倍的基因與Gene Ontology(GO)聯盟提供的生物過程註解關聯。基於GO註解的分級結 構，每個緊接著的子項目與所選基因數目關聯的可能性(P值)用概率進行計算。DMSO處理 的對照和苯達莫司汀處理的細胞(在IC9tl劑量)相比較的GO分析結果報告在下文表2中。 在下面的表2中，第一列說明一般類別，第二和第三列是特定生物過程的編號和名稱，最後 一列是每個過程的P值。P值用G03軟體計算。發現四個主要的功能組被苯達莫司汀統計 水平調節=(I)DNA損傷，應激反應，細胞程序性死亡；(2) DNA代謝，DNA修復，轉錄；(3)細胞 增殖，細胞周期，有絲分裂關卡；和(4)細胞調節。這些組每個都包括數個被發現受到苯達 莫司汀明顯調節的生物過程。P值最低且因此最具統計顯著性的生物過程是對DNA損傷 應激的反應(G06974) ；DNA代謝(G06259)；和細胞增殖(G08283)。
用苯丁酸氮芥和磷醯胺氮芥進行類似的分析提示，用苯達莫司汀和苯丁酸氮芥得 到的圖譜之間很少有重疊。苯達莫司汀和磷醯胺氮芥之間觀察到基因調節的一些相似性， 雖然只限於「DNA代謝，DNA修復，和轉錄」組。這些結果為選擇特定基因產物進行定量驗證 苯達莫司汀的基因陣列結果和更確定的區別提供了基礎。b.用實時定量Q-PCR分析進行基因組分析的驗證陣列數據的證實和驗證通過實時定量PCR分析(Q-PCR)進行。當將苯達莫司汀與 其他檢驗的烷化劑相比較時，數個參與P53-信號轉導、細胞程序性死亡、DNA修復和細胞周 期/有絲分裂關卡的基因均被差異調節。為Q-PCR驗證選擇的「經典的」p53-依賴性基因的兩個實例是，p21 (Cipl/ffafl)， 細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，和促細胞程序性死亡BH3-only Bcl_2家族成員， Ν0ΧΑ。暴露於苯達莫司汀8小時後，發現兩個基因均在SU-DHL-I細胞中被誘導。兩個基因 也被等毒濃度的磷醯胺氮芥和苯丁酸氮芥誘導，但程度低得多(圖2A)。從驗證分析中顯現的最驚人的結果之一是，數個有絲分裂-相關基因的差異化調 節，包括polo-類激酶I(PLK-I)、Aurora激酶A和B、以及細胞周期蛋白B 1。這些基因被 認為在有絲分裂關卡的調節中發揮了重要作用。用苯達莫司汀處理導致所有這些基因的 mRNA表達下調了 60-80%。相比之下，磷醯胺氮芥和苯丁酸氮芥對這些基因的轉錄本僅僅 發揮了很小的效應，可能除了 Aurora激酶(圖2B)。在分析DNA-修復基因核酸外切酶-I(EXOl)的mRNA表達中也顯現出不同。苯達 莫司汀誘導的Exol表達上調(2.5倍)(圖20較之磷醯胺氮芥(1.5-倍)或苯丁酸氮芥 (1.8-倍)稍微強一些。Fenl (flap核酸內切酶1)也被苯達莫司汀上調，用等毒濃度的磷 醯胺氮芥時，該基因也被上調同樣水平(圖2C)。c. NHL細胞中苯達莫司汀的細胞程序性死亡信號轉導為了仔細研究NHL細胞中參與苯達莫司汀-誘導的程序化細胞死亡的分子事件， 用免疫印跡分析監測關鍵的細胞程序性死亡蛋白的表達。結果清楚表明，苯達莫司汀能有 效和迅速地觸發典型的p53-依賴性細胞程序性死亡途徑。正如用特異識別絲氨酸-15殘 基磷酸化的抗體所檢測，起始和頂端事件之一是誘導P53磷酸化。在暴露於苯達莫司汀的 SU-DHL-I細胞中觀察到絲氨酸-15磷酸化p53上調了 8倍，而在磷醯胺氮芥處理的細胞中， 僅見到輕微上調，苯丁酸氮芥處理的細胞沒有發現變化(圖3，左上圖)。與磷酸化p53平行，在苯達莫司汀處理的細胞中，總p53的表達強烈上升。苯丁酸 氮芥處理的細胞表現出總P53的少量增加，而暴露於磷醯胺氮芥沒有誘導p53水平改變。 與P53蛋白表達水平的改變相比較，在p21蛋白表達中觀察到的變化，對於各藥是輕微的。 僅在苯達莫司汀處理的SU-DHL-I細胞中，觀察到Bax (關鍵的BH3-only促細胞程序性死亡 Bcl-2家族成員)的蛋白表達增加(圖3，左下板)。在比較苯達莫司汀與磷醯胺氮芥和苯丁酸氮芥的作用中，觀察到的最驚人的差異 是在比較PARP(聚ADP核糖聚合酶-1)的表達時發現的。PARP是關鍵的NAD需要的酶，在 DNA修復機制中很重要。PARP也是促細胞程序性死亡的蛋白水解半胱天冬酶(caspase)的 「早期」底物。用苯達莫司汀處理的SU-DHL-I細胞表現出PARP蛋白表達的急劇減少(圖 3，右上圖)。PARP表達減少的原因是它被半胱天冬酶切割，這被「切割_特異性」抗體識別 的蛋白水解切割產物的出現所證實(圖3，中右圖)。值得注意的是，在以等毒濃度的磷醯
19胺氮芥或苯丁酸氮芥處理的NHL細胞中，沒有檢測到PARP表達的改變。當用雙倍等毒劑量 的磷醯胺氮芥(40 μ Μ)和苯丁酸氮芥(4 μ Μ)，而保持苯達莫司汀(50 μ Μ)的劑量時，結果是 相似的(數據未顯示)。因此，評價PARP表達水平可以用於各種目的。例如，PARP分析可 以提供具體治療方案有效性的指示，其中PARP表達減少(優選在蛋白水平測定，例如通過 PARP活性，PARP切割產物的存在，等等)指示施用的藥物具有所需的作用。另外，PARP分 析可以用於前瞻性地確定，例如，組織的細胞(例如，來自活檢或其它生物樣品的細胞)是 否可能對特定治療起反應(如，苯達莫司汀單一治療或其中療法之一利用了苯達莫司汀的 組合治療)。d.抑制鹼基切除修復，但不是O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶修復，阻斷了苯達 莫司汀的活性用Ape-I抑制劑甲氧胺評價修復酶Ape-I的作用，它是一種無嘌呤核酸內切酶，在 苯達莫司汀和環磷醯胺代謝物磷醯胺氮芥的細胞毒活性中，在鹼基切除修復(BER)中起到 關鍵的作用。加入甲氧胺，苯達莫司汀的IC5tl降低了約四倍(從大約50μΜ至大約12μΜ) (圖4Α)。反之，加入甲氧胺時，磷醯胺氮芥的ICstl只有輕微改變。結果提示BER可能在修 復苯達莫司汀誘導的DNA損傷中起了重要作用，而不是在修復環磷醯胺誘導的損傷中。O6-苄基鳥嘌呤，一種已知的O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)，對苯達莫司 汀的抗腫瘤活性的作用也在SU-DHL-I細胞中進行了測試。結果表明，加入O6-苄基鳥嘌呤 不提高苯達莫司汀細胞毒效力。環磷醯胺得到了相反的結果，提示與環磷醯胺不同，苯達莫 司汀對O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶DNA修復機制並不特別依賴(圖4Β)。e.鹽酸苯達莫司汀迅速引起導致獨有的細胞周期改變的雙鏈斷裂形成為了研究鹽酸苯達莫司汀引起雙鏈斷裂(DSBs)的能力，分析了兩個生化標記以 免疫螢光法進行H2AX組蛋白的核定位；和用免疫印跡分析H2AX Serl39殘基的磷酸化。結 果證實，鹽酸苯達莫司汀在各種腫瘤細胞中有力和迅速地誘導DSBs，包括多藥抗性和p53 缺陷的細胞系。用50 μ M鹽酸苯達莫司汀培養，導致在短至30分鐘的時間內，可檢測到核 內轉化灶的形成。時程分析顯示，在持續暴露在鹽酸苯達莫司汀24小時後以及在很短時間 暴露於藥物(30分鐘)，隨後藥物被清除(洗脫後)，可檢測到Y -Η2ΑΧ的Serl39磷酸化。 鹽酸苯達莫司汀誘導的H2AX磷酸化發生得早於其它2-氯乙基胺DNA烷化劑如環磷醯胺。 SU-DHL-I淋巴瘤細胞暴露於50 μ M鹽酸苯達莫司汀8小時的細胞周期分析顯示，平均S-期 分布增加了超過40%，而沒有伴隨的G2M停滯。暴露於等毒濃度的苯丁酸氮芥和環磷醯胺， 分別增加了 S-期分布大約20%和15%。這些發現說明，鹽酸苯達莫司汀能誘導DNA雙鏈 斷裂，即便是在短暫的30分鐘暴露後。f.用NCI比較分析，苯達莫司汀表現出獨特的活性圖譜在國家癌症研究所(National Cancer Institute)的臨床前抗腫瘤藥物發現篩選 (NCI篩選)的60個人類細胞系中，評價苯達莫司汀的細胞毒性。NCI篩選適用於從超過 45，000個化合物和天然產物的大範圍資料庫中，比較潛在的抗腫瘤劑與已知治療劑的相對 效力。COMPARE分析用苯達莫司汀作為「種子」產生的GI50結果運行。具有高Pearson相 關係數(PCC)的化合物經常具有相似的作用機制。在NCI篩選中，沒有表明苯達莫司汀與 任何藥有強相關(> 0. 8)(下面的表3)。在與苯達莫司汀匹配的前六個之外，只有甲基化 劑DTIC(達卡巴嗪)表現出大約80%的相關一致性(r值)。反之，鑑別出了 25個與美法
20侖、苯丁酸氮芥或環磷醯胺的活性代謝物相關係數超過0. 83的化合物。另外，在此篩選中， 美法侖、苯丁酸氮芥和環磷醯胺敏感性模式的直接比較表明這三個藥物之間有高相關係數 (0. 762-0. 934，數據未顯示)。這些數據顯示了藥劑的敏感性圖譜的統計學一致性和作用機 制共用的高似然率。苯達莫司汀和氮芥類其它成員之間缺少相關性是引人注目的，並揭示 苯達莫司汀具有獨特的抗腫瘤活性模式。D.討論用各種生物和分析工具得到的這些實驗的結果表明，與其它共享相同「氮芥」活 性部分的臨床應用的化合物如環磷醯胺和苯丁酸氮芥相比，苯達莫司汀擁有獨特的作用機 制。本研究採用的工具之一是藥物基因組方法，其在靶細胞系與所選的藥物培養後， 可以同時分析和監測數千個完全表徵的基因的表達水平，已經成功地用於闡明其它抗癌藥 物的作用機制。其主要優勢在於產生無偏信息，導致苯達莫司汀獨特作用機制的鑑定，並將 其與其它DNA烷化劑區分開來。用這種方法，檢測到苯達莫司汀強烈的經典p53-依賴性應激反應「特徵」，在磷醯 胺氮芥和苯丁酸氮芥處理的細胞中也存在，但強度低得多。Q-PCR分析證實了基因陣列分 析，確認了含有P53-效應元件的基因的上調，如p21(Waf/Cipl)和NOXA。作為細胞周期 蛋白_依賴性激酶的抑制劑，特別是那些在細胞周期的G1期起作用的抑制劑，據相信p21/ Wafl/Cipl是介導，至少部分介導，p53-誘導的G1停滯。導致p53_誘導的細胞周期停滯和 細胞程序性死亡的機制已被廣泛研究和報告。Noxa編碼Bcl-2蛋白家族的Bcl-2同源體 3(BH3)-only成員。NOXA顯示出是p53-介導的反式激活的標靶，並且通過線粒體功能異常 起到P53-依賴性細胞程序性死亡的介導體的作用。小鼠胚胎成纖維細胞中Noxa缺陷表現 出對DNA損傷起反應的原癌基因依賴性細胞程序性死亡的顯著抗性。然後通過免疫印跡分析，檢測磷酸化的p53(Serl5)，以及Bax的上調，證實了 p53 促細胞程序性死亡途徑的激活。雖然對其它氮芥類誘導P53-介導的應激反應之前已經有 報告，但與等毒劑量的環磷醯胺代謝物(PM)或苯丁酸氮芥比較，苯達莫司汀提供了更強和 更快速的誘導信號。還發現苯達莫司汀誘導快速和廣泛的PARP切割，PARP是催化各種蛋白 的聚(ADP-核糖基化)的酶。雖然苯達莫司汀誘導PARP切割，但在SU-DHL-I細胞中，三種 藥物之間導致PARP切割的能力差異是顯著的。快速誘導PARP切割在苯達莫司汀的作用機 制中可能發揮至關重要的作用，給予了 PARP對DNA修復機制的重要性。事實上，對DNA損 傷發生反應，細胞最初激活PARP，導致DNA與DNA修復酶和轉錄因子的接近度增加。另外， PARP通過細胞程序性死亡或壞死參與啟動細胞死亡。從藥物基因組學圖譜顯現出的苯達莫司汀和其它受試氮芥的另一個主要差別在 於對polo-類激酶1 (PLK-I)、Aurora激酶(A和B)和細胞周期蛋白Bl表達水平的作用。 有絲分裂關卡激酶PLK-I和Aurora參與了細胞周期調節的很多方面，如激活和滅活CDK/ 細胞周期蛋白複合體、中心體的裝配和成熟、以及在中期-後期轉變期間活化後期促進復 合體(APC)、還有胞質分裂。有趣的是，當用siRNA或用目標小分子抑制這些關卡調節物時， 觀察到了 DNA-損傷藥物作用的增強，連同出現有絲分裂災變。有絲分裂災變是細胞死亡的 一種形式，發生在中期，形態上與細胞程序性死亡截然不同。有絲分裂災變能發生在沒有功 能性P53的情況下或在常規的半胱天冬酶依賴性細胞程序性死亡被抑制的細胞中。因此，有絲分裂災變是腫瘤細胞死亡的誘人機制，因為它在用常規化療藥進行數輪化療後選擇出 的腫瘤細胞中也可能起作用。苯達莫司汀引發的廣泛和持久的DNA-損傷以及苯達莫司汀 對M-期特異性關卡的協同抑制，可能在受處理的細胞中觸發有絲分裂災變。這可以解釋 臨床資料中苯達莫司汀在包括環磷醯胺和苯丁酸氮芥的方案中對難治的患者的活性。已經證實，有效的DNA修復機制在DNA-烷化藥物的作用機制中發揮著關鍵作用。 對於共有相似的化學特徵的藥物而言，激活離散的DNA藥物修復機制也可賦予獨特的活性 圖譜。本文所述的藥物基因組學分析鑑定了被苯達莫司汀較之磷醯胺氮芥和苯丁酸氮芥有 區別調節的DNA修復基因。一個這樣的基因，內切核酸酶1 (Exol)，是與MutS和MutL同源 物相互作用的5' -3'內切核酸酶，並牽涉DNA錯配修復的切除步驟以及雙鏈斷裂的加工 和修復。Exol參與體細胞超突變和類別轉換重組，並因此在B細胞功能和抗體產生中非常 重要。為了進一步研究苯達莫司汀、環磷醯胺和苯丁酸氮芥之間修復機制的差異，進行 功能分析。研究了兩個主要機制DNA修復蛋白，O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)；和 無嘌呤/無嘧啶的內切核酸酶Ape-1。AGT，一種泛素酶，清除由數個烷化劑(包括硝脲類和 三氮烯類)導致的O6-烷基鳥嘌呤-DNA加合物。臨床證據提示，腦腫瘤表達高水平AGT，可 因此對某些DNA烷化劑如替莫唑胺更具抗性。核苷O6-苄基鳥嘌呤(O6-BG)提供了有效滅 活AGT蛋白的方法。在一些細胞系中，苄基鳥嘌呤明確提高了環磷醯胺活化態的毒性。如 本文所示，添加O6-苄基鳥嘌呤，提高了環磷醯胺而不是苯達莫司汀的細胞毒效力，表明苯 達莫司汀不誘導能被AGT修復的O6-烷基鳥嘌呤DNA加成物。Ape-1/Ref-l是無嘌呤/無嘧啶的內切核酸酶，在鹼基切除修復(BER)途徑中發 揮極為重要的作用。BER被各種DNA-損傷藥物，包括DNA烷化劑和DNA甲基化劑如替莫唑 胺誘導的損傷所激活。Ape-I的作用以化合物甲氧胺(MX)，該酶活性的特異抑制劑-測試。 用MX抑制Ape-Ι，提高了苯達莫司汀的細胞毒活性，表明了對BER的作用。用環磷醯胺代 謝物沒有觀察到改變，隱示了在這些藥物活化的DNA修復機制之間的主要差異。對可能的抗腫瘤劑和其它已知的治療劑進行比較，適用NCI人類腫瘤60細胞系 體外篩查。還已經證明，在許多情況下，當發現配對化合物在用該系列的篩選結果之間有 高相關係數，則如COMPARE統計分析程序所評價，這些藥物通常有相似的作用機制。氮芥 類美法侖、苯丁酸氮芥和環磷醯胺觀察到的高相關性在已知的烷化劑中都如此，證實了 COMPARE分析發現共同作用機制的能力。除了與苯達莫司汀相配的前6名之外，只有甲基化 劑DTIC(達卡巴嗪)表現出大約80%的相關一致性(r值)。這些結果揭示，苯達莫司汀在 與其它已知烷化劑的關係中，表現出獨特的作用機制。基於本實施例呈現的結果，苯達莫司汀的推導作用機制顯示在圖5中。苯達莫司 汀可有效進入腫瘤細胞，並誘導長時間和廣泛的DNA烷基化和斷裂，可能是由於苯達莫司 汀的苯並咪唑環體系賦予的吖丙啶轉換態環的高化學穩定性。苯達莫司汀處理啟動了三個 主要的信號途徑1) 「經典的」P53依賴性應激途徑的激活，導致內在細胞程序性死亡的強 烈激活，其由促細胞程序性死亡BCL-2家族成員如NOXA和Bax介導；2)DNA修復機制的激 活，如鹼基切除修復元件(machinery)，其不由常用於NHL或CLL患者的其它氮芥類激活； 和3)抑制數個有絲分裂關卡，如激酶PLK-I以及Aurora A和B。協同誘導DNA損傷和抑制 有絲分裂關卡可使暴露於苯達莫司汀的腫瘤細胞在經歷有絲分裂之前，不能充分修復DNA損傷。帶著廣泛損傷的DNA進入有絲分裂的細胞，或者不能繼續進行「常規」 P53依賴性細 胞程序性死亡的細胞，將通過有絲分裂災變經受死亡。這種替代的程序化細胞死亡途徑，連 同傳統細胞程序性死亡的強烈激活，表明了為何苯達莫司汀在體外的藥物抗性細胞中以及 在患有化療難治性腫瘤的患者中有效。因此，在其它作用中，對於臨床醫生治療患有慢性的 非何杰金氏淋巴瘤和其它血癌的患者的全部治療方法(armamentarium)中，苯達莫司汀治 療將表現出是重要的添補。實施例2苯達莫司汀在NHL細胞中的活性誘導了有絲分裂災變死亡途徑如上文實施例1所述，苯達莫司汀是具有獨特作用機制的烷化劑，並在傳統DNA損 傷劑難治的NHL和CLL患者中進行了臨床試驗。苯達莫司汀在NHL細胞的基因表達中誘導 了獨有的改變，並表現於與其它2-氯乙胺烷化劑缺少交叉抗性。定量PCR分析證實，NHL細 胞系SU-DHL-I在暴露於藥物的臨床相關濃度8小時後，細胞中G 2/M關卡調節劑Polo-類 激酶I(PLK-I)和Aurora A激酶(AurkA)下調。當細胞暴露在等毒劑量的苯丁酸氮芥或環 磷醯胺的活性代謝物時，在同樣這些基因中沒有改變。對苯達莫司汀在不能經受經典的caspase介導的細胞程序性死亡的細胞中誘導 細胞毒性的能力進行了調查。多藥抗性的MCF-7/ADR和p53缺陷的RK0-E6結腸腺癌細胞， 在只有50 μ M苯達莫司汀或者50 μ M苯達莫司汀和20 μ M泛半胱天冬酶抑制劑zVAD-fmk 下暴露二或三天。雖然zVAD-fmk能抑制苯達莫司汀誘導的Armexin-V陽性細胞增加，但在 苯達莫司汀單獨或與zVAD-fmk聯合處理的細胞中，用DNA染色劑DAPI進行核形態的顯微 分析表明，微核發生率增加。多核/微核以及異常的染色質凝聚二者是有絲分裂災變的標 記，並在暴露於微管結合藥物如長春生物鹼類和紫杉類的腫瘤細胞中已經觀察到。有絲分 裂災變的激活可擴大苯達莫司汀的細胞毒性以及其在經典細胞程序性死亡途徑受抑制的 腫瘤細胞中的活性。實施例3在淋巴瘤和白血病細胞中，快速起效的苯達莫司汀激活有效的細胞程序性死亡和 細胞死亡如上所述，在其它作用中，烷化劑苯達莫司汀表現出對抗有藥物抗性的癌症的化 療活性，並在與其它相關抗腫瘤劑比較時，具有獨特的作用機制。與其它抗腫瘤氮芥類的 情況一致，苯達莫司汀在人類中的血清半衰期相對短(大約2小時)，並且臨床通過靜脈推 注施用。本實施例報告的工作目的是，評價苯達莫司汀短期暴露於體外癌細胞時，誘導細胞 死亡和細胞程序性死亡的能力。在該實驗模型中苯達莫司汀的活性與其它結構相關的藥物 相比較。得到的結果表明，苯達莫司汀短時(30分鐘)暴露於細胞中後，發揮最大的抗腫瘤 活性。為得到這些結果，NHL細胞系SU-DHL-I短期(30分鐘至4小時)暴露在50 μ M苯達 莫司汀下，清洗，在無藥培養基中恢復20小時。細胞暴露在苯達莫司汀中短達30分鐘即表 現出廣泛的生存能力喪失，這用各種生物分析測定，包括在藥物暴露後48和72小時，測定 細胞內ATP和釋放到上清液中的腺苷酸激酶(圖6和7)。相反，細胞用這類烷化劑的其它 成員處理(這裡是苯丁酸氮芥、美法侖和環磷醯胺的代謝物磷醯胺氮芥；顯示的數據是苯 丁酸氮芥和磷醯胺氮芥)，當暴露於這些藥劑30、60和120分鐘時，存活率有極輕微的損失。 在這些分析中，其它這些氮芥需要長得多的暴露時段(至少4小時)誘導與苯達莫司汀相當的細胞毒性。用MTT為基礎的分析證實了這些結果，其中在暴露於藥物30分鐘、4小時 或72小時後72小時的SU-DHL-I和HL-60細胞中，苯達莫司汀的IC5tl相似。相比之下，苯 丁酸氮芥、美法侖和磷醯胺氮芥用同樣這些細胞系培養30分鐘，與持續(72小時)暴露比 較，顯示出IC50要高10-20倍。細胞內ATP水平用下面的螢光素酶為基礎的ATP分析進行分析。IOmL CellTiter-Glo 試劑與適當量的CellTiter-Glo底物(根據製造商的說明書；Promega Corp.)混合， 混合物平衡10分鐘。然後該溶液100 μ L與100 μ L含有細胞的培養基結合，讓混合物培養 10分鐘。用CCD為基礎的平板讀數器檢測發光。選擇腺苷酸激酶(ADK)分析是因為處理過的細胞完整性松解，ADK釋放到培養基 中，或者在生物樣品的條件下，釋放到細胞間隙、血液等。為了在96孔板中進行ADK分析， 每個測試孔中，短時離心沉澱細胞的培養基等分試樣的上清20 μ L，與100 μ L新鮮製備 的ADK試劑(根據製造商說明書，20mL Cambrex ToxiLight試劑加上適當量的Cambrex ToxiLight底物；Cambrex Corp.，NJ)混合，並使其平衡15分鐘。然後培養反應混合物兩分 鍾，使激酶反應發生。然後在平板讀數器上立即讀出樣品的發光。還通過20 μ L特定細胞培養物的等分試樣與180 μ L GuavaViaCount試劑(Guava Technologies，Hayward，CA)混合，使用前即刻稀釋的1 10稀釋液，評價細胞存活率。之 後各混合物培養5分鐘。然後用Guava PC流式細胞計數器進行ViaCoimt細胞計數，測定 每1，000個總細胞中的活細胞數。存活和死亡的細胞用染料7AAD區別，其能通過損壞的細 胞膜擴散進死亡或瀕死的細胞中。如實施例1所述，快速誘導PARP(聚[ADP-核糖]聚合酶)斷裂是苯達莫司汀在 NHL細胞中誘導死亡的標誌。SU-DHL-I細胞暴露於50 μ M SDX-105短達30分鐘，之後洗 去藥物，進一步培養8小時，觀察到PARP最大斷裂。在以相似方式用40 μ M磷醯胺氮芥、 4 μ M苯丁酸氮芥或2 μ M美法侖處理30分鐘的細胞中，沒有觀察到PARP斷裂。所用的各藥 物濃度代表了與50 μ M苯達莫司汀相比較的等毒濃度，這是在暴露在藥物下72小時後，用 MTT [3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5_溴化二苯基四唑]為基礎的分析測定的。MTT分析用各種藥物的遞增劑量進行，測定殺死50%受處理細胞所需的有效濃 度。這些分析在96孔板中進行。濃度範圍最高可達500 μ Μ。在各分析中，對照包括未處理 細胞和殺死對照。對於在「洗脫」實驗中用於檢驗細胞的平板，離心平板5分鐘，沉澱細胞。 然後除去培養基，細胞沉澱用IX PBS洗一次，然後重新懸浮在新鮮培養基中。細胞用特定 劑量的藥物在含有5.0% CO2的氣氛中，37°C培養3天。三天後，各孔加入IOyL MTT(12mM) 試劑(5mg/mL MTT(Promega)溶解於新鮮培養基中，過濾消毒，保存在2_8°C )。培養四小時 後，各孔加入100 μ L裂解緩衝液(20% SDS, 0. 015Μ HCl)。混合物在含有5. 0% CO2的氣 氛中，37°C放置過夜。第二天早晨，用多孔掃描分光光度計在595nm下測定細胞裂解水平。用100 μ M苯達莫司汀或12 μ M苯丁酸氮芥處理人類癌細胞系HL-60，得到可比擬 的結果。暴露在藥物下的時間是30分鐘、1小時或2. 5小時，其中在所提到的時間後，除去 含有藥物的培養基，用不含藥物的新鮮培養基取代。匯總起來，這些結果表明了苯達莫司汀即便與癌細胞短暫培養之後，即可激活不 可逆的細胞死亡途徑的獨特能力，這種能力有別於其它相關的烷化劑。所述的快速起效的 細胞毒性證實了苯達莫司汀有效的臨床活性，並表明它將適用於治療各種癌症，包括傳統
24化療難治的癌症。實施例4臨床數據本研究評價了苯達莫司汀在患有復發的或之前化療方案難治的NHL患者中的有 效性和毒性。利妥昔單抗難治的患者在治療的6個月內病情發展。方法該II期多中心試驗在美國和加拿大的17個地點，募集患有復發的慢性或轉 化的利妥昔單抗難治的B-細胞NHL患者。在84%患者中發現了慢性的組織學表型，而16% 有轉化的疾病。患者的中位年齡為63歲(38-84歲)，88%有III/IV期疾病。患者在第1 和2天，經30-60分鐘接受苯達莫司汀120mg/m2，21天為1周期，直至6個周期。用國際工
(International Working Group) t示}i^flJ胃β@。結果意向治療(ITT)人群由之前化療中位數為2的75名難治性患者組成。ITT 人群的總體目標反應率(ORR)為74% ；25%有完全的反應，49%有部分反應，12%病情穩 定，14%病情發展。在以前的烷化劑治療難控制的15名患者中(患者在至少一次以前的 含烷化劑治療後病情發展)，10人(67%)經歷了對苯達莫司汀的目標反應。所有患者的反 應中位時期為6. 6月，慢性患者為9. 3個月，轉化患者為2. 4個月。結論在預治療的利妥昔單抗難治的慢性和轉化NHL患者中，包括之前的烷化劑 治療難治的患者，苯達莫司汀單藥能產生持久的目標反應，毒性可接受，雖然有不樂觀的預 後特徵。雖然本發明參考上述實施例進行描述，但應當理解對其的修改和變化也包括在本 發明的精神和範圍內。因此，本發明僅受所附的權利要求的限制。根據本公開，本文公開和要求的所有組合物和方法無需過多的實驗即能製備和實 行。雖然本發明的組合物和方法根據其優選的實施方案進行了描述，但是顯然對於本領域 技術人員各種變化可以應用於本組合物和方法，並按照這裡描述的方法的步驟或步驟的順 序，而不背離本發明以所附的權利要求限定的精神和範圍。說明書中提到的所有發明、申請和公開表示本發明所屬的領域的普通技術人員的 水平。所有發明、申請和公開，包括要求優先權或其它利益者，在此以其全文作為參考引入， 如同各單獨公開被具體和單獨表明作為參考引入。本文適當地說明性描述的發明，在缺少任何沒有在此公開的具體元素的情況下可 以實施。因此，例如，在本文的每個例子中，任何術語「包含」、「基本由...組成」和「組成」 可以用其它兩個術語之一代替。採用的術語和表達用作說明的術語而非限制，並且沒有意 向在所述術語的使用和表達中，排除了表現和描述的任何等效特徵或其部分，需要認識在 本發明要求的範圍內，各種修改都是可能的。因此，應當理解，雖然本發明被優選的實施方 案和任選的特徵所具體公開，但是本領域技術人員可以採取這裡公開的理念的各種修改和 變化，這樣的修改和變化被認為是在所附的權利要求限定的本發明範圍內。
序列表
賽福倫公司(C印halon，INC.) 癌症治療(Cancer Treatments) SPI095027-41 16
PatentIn version 3.51
20
DNA
人工序列

18s正向引物 1
cgccgctaga ggtgaaattc20
2
18
DNA
人工序列

18s反向引物 2
ttggcaaatg ctttcgct18
3
21
DNA
人工序列

p21正向引物 3
cctcatcccg tgttctcctt t21
4
20
DNA
人工序列

p21反向引物 4
gtaccaccca gcggacaagt20
5
21
DNA
人工序列

Noxa正向引物 5atttcttcgg tcactacaca a21
6 18 DNA 人工序列
Noxa反向引物 6
aacgcccaac aggaacac18
7
18
DNA
人工序列

PLK-1正向引物 7
ctcaacacgc ctcatcct18
8
20
DNA
人工序列

PLK-1反向引物 8
gtgctcgctc atgtaattgc20
9
24
DNA
人工序列

Aurora A正向引物 9
tccttgtcag aatccattac ctgt24
10
21
DNA
人工序列

Aurora A反向引物10
gaatgcgctg ggaagaattt g21
11
21
DNA
人工序列

Aurora B正向引物 11
agagtgcatc acacaacgag a21
12 23 DNA 人工序列
Aurora B反向引物 12
ctgagcagtt tggagatgag gtc23
13
20
DNA
人工序列

Cyclin Bl 正向引物 13
agtgtgaccc agactgcctc20
14
20
DNA
人工序列

Cyclin Bl 反向引物 14
caagccaggt ccacctcctc20
15
21
DNA
人工序列

28Exo 1正向引物 15
ttggtctgga ggtcttggag a21
16
23
DNA
人工序列

Exo 1反向引物 16
gaatcgctct ttcttcggaa ctg23[0163權利要求
治療癌症的方法，包括確定患者患有特徵在於癌細胞抗死亡的癌症，然後給所述患者施用治療有效量的苯達莫司汀。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的癌症抗細胞程序性死亡。
3.根據權利要求1的方法，其中抗死亡的癌細胞包含p53缺陷。
4.根據權利要求1的方法，其中的癌症選自非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。
5.治療癌症患者的方法，包括施用苯達莫司汀，等至少約30分鐘但不長於約48小時， 以及施用另一種化療劑或當細胞在細胞周期的S期時更有效的藥劑。
6.根據權利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達莫司汀後約30分鐘至約36小時 施用。
7.根據權利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達莫司汀後約30分鐘至24小時施用。
8.根據權利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達莫司汀後約30分鐘至12小時施用。
9.根據權利要求5的方法，其中的化療劑在施用苯達莫司汀後約30分鐘至6小時施用。
10.根據權利要求5的方法，其中的患者患有特徵在於癌細胞抗死亡的癌症。
11.評價癌症治療有效性的方法，包括確定從癌症患者採集的生物樣品中癌細胞死亡 標記的水平是否與治療有效性相關，其中所述確定在施用目的在於治療癌症的治療方案期 間或之後進行，其中的治療方案包括施用烷化劑。
12.根據權利要求11的方法，其中的烷化劑是苯達莫司汀。
13.評價癌症治療的有效性的方法，包括a.用治療有效量的苯達莫司汀治療癌症；b.等待足夠長的時間使苯達莫司汀發揮所需的治療作用；以及c.測定癌細胞死亡標記的水平，以確定用苯達莫司汀治療是否有效。
14.減少與包括給癌症患者施用多個劑量的苯達莫司汀的癌症治療有關的毒性的方 法，包括給患者施用第一劑量的治療有效量的苯達莫司汀，所述第一個苯達莫司汀的劑量 導致不需要的毒性，並延遲給患者施用第二劑治療有效量的苯達莫司汀，直至不需要的毒 性開始消退。
15.評價患者的癌症是否對苯達莫司汀敏感的方法，包括a.在不存在對癌細胞有毒性的化合物的生長條件下，將患者癌組織的細胞樣品的至少 一部分暴露於苯達莫司汀，使癌細胞增殖；以及b.評價癌症是否對暴露於苯達莫司汀敏感。
16.根據權利要求15的方法，其中評價癌症是否對暴露於苯達莫司汀敏感包括測定癌 細胞死亡標記的水平。
17.根據權利要求16的方法，其中的癌細胞死亡標記選自腺苷酸激酶活性水平、細胞 存活率和PARP切割產物的水平。
18.治療癌症的方法，包括確定患者患有特徵在於抗一種或多種烷化劑和抗CD20劑的 癌症，包括給所述患者施用治療有效量的苯達莫司汀。
19.根據權利要求18的方法，其中所述癌症為非何杰金氏淋巴瘤。
20.根據權利要求18的方法，其中的抗CD20劑為利妥昔單抗。
21.與治療特徵在於癌細胞抗死亡的癌症有關的工作方法，包括促進苯達莫司汀用於 治療特徵在於癌細胞抗死亡的癌症。
22.根據權利要求21的方法，其中的癌症是用包括一種或多種烷化劑和抗CD20劑的組 合難以治療的癌症。
23.與難以治療的癌症的治療有關的工作方法，包括促進苯達莫司汀用於治療難以治療的癌症。
24.根據權利要求23的方法，其中難以治療的癌症是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑 的組合難以治療的癌症。
25.苯達莫司汀在製備用於治療特徵在於癌細胞抗死亡的癌症藥物中的應用。
26.苯達莫司汀在製備用於治療難以治療的癌症藥物中的應用。
27.根據權利要求26的應用，其中難以治性的癌症是用一種或多種烷化劑和抗CD20劑 的組合難以治療的癌症。全文摘要
本發明描述了用於治療特徵在於癌細胞抗死亡的癌症的方法和組合物。大體上，這樣的方法包括施用治療有效量的誘導一些，並且優選大多數或者所有癌細胞的有絲分裂災變的化合物。本發明還提供了評價這種治療的有效性的方法。
文檔編號G01N33/574GK101933923SQ20101000151
公開日2011年1月5日 申請日期2005年11月4日 優先權日2004年11月5日
發明者克裡斯蒂娜·卡洛爾·尼邁爾, 加裡·T·埃利奧特, 希瑟·海倫妮·賓德爾, 普拉提克·S·穆爾塔尼, 洛倫佐·M·萊奧尼 申請人:賽福倫公司