兩步免疫測定法診斷癌症的製作方法
2023-10-27 10:53:02
專利名稱：兩步免疫測定法診斷癌症的製作方法
該項目的內容是用抗體檢測癌症具體方法。具體是對NDP-激酶/Nm23和雌激-受激亮氨酸氨太酶(es-LAPase)特異性抗體的研究及其在診斷乳腺癌以及轉移性方面的應用。這兩種抗體也可用於檢測血清，血漿及活組織中NDP-激酶和LAPase水平。
背景技術：
對人類疾病如乳腺癌進行有效檢測及設計治療藥物的關鍵在於能夠鑑別危險因素和病理生理改變。對癌症類別和程度的準確診斷是選擇最佳治療方案的關鍵。而病情的程度取決於腫瘤組織學，血液成分測定及細胞標記物檢測等方面的綜合分析。
廣泛應用的乳腺癌診斷方法有影像技術，如超聲，X射線法。但是這一技術受到影像解析度的限制，只能診斷大到一定程度的腫瘤。此外，難以區分纖維瘤，囊腫與惡性腫瘤。Elmore和Goetz的最新研究明確強調了這一局限性。
活組織的組織學分析是診斷乳腺癌的另一常用方法。這一方法依賴於可見的細胞類型鑑別。雖然這種方法比較客觀，但要靠檢測者的技術水平。
活組織細胞中DNA流動細胞學分析也常被用來測定與腫瘤有關的細胞DNA含量。但是此法需獲得活組織並且需要複雜的樣品處理過程和昂貴的儀器。
在各種與乳腺癌早期形成有關的危險因素中，雌激素及與雌激素有相似活性的雌激素類似物仍是對乳腺癌早期發現和發展的最重要的被檢物。在正常生理條件下，靠雌激素起關鍵作用的器官包括生殖系統和第二性器官如乳腺。此外，雌激素還可以通過促使靶細胞增殖來參與骨生長調節，肝臟，心血管功能及激素代謝周期。這些組織對雌激素的反應能解釋雌激素在不同人類腫瘤特別是乳腺腫瘤的發病和發展方面所起的活性作用。我們認為雌激素是通過參與初期和早期細胞功能來調節各種生理功能。因此，有雌激素參與的細胞早期活動導致細胞增殖，加速細胞由G1期向S期發展的速率，從而縮短細胞周期。最近有報導，在相同濃度下雌激素可以通過共同激活細胞周期蛋白D1-CdK4和E-CdK2這兩個密切相關的關鍵的G1調節太來促進細胞增殖。
以雌激素為基礎的分子診斷測定廣泛應用於活組織細胞中雌激素和孕激素受體檢測，從而確定此種腫瘤是否對激素治療有效。但是，它無法估計腫瘤的發展程度及是否轉移。此外該法還需取活組織，並且需要待腫瘤長到足以能夠觸及或用影像技術檢測的程度。
NDP-激酶活性與多種生理過程有關，包括DNA和RNA合成，AMP循環周期，超氧化物代謝及DNA修復酶活性。一般說來，NDP-激酶的活性與細胞增殖是平行的。例如，測定細胞液NDP-激酶活性是在細胞增殖過程中進行的。另外可以降低具有高度轉移傾向的腫瘤細胞中RNA水平的Nm23基因與NDP-激酶基因非常相似。
NDP-激酶幫助細胞內DNA與RNA轉換成磷酸化形式。多數NDP-激酶活性是在細胞液中。也存在於其它細胞成分中，例如微管蛋白環，人類及兔血小板分離的血漿膜，牛腦微粒物質。NDP-激酶的廣泛分布表明其在核酸，超氧化物代謝，AMP的合成周期等細胞增殖和分化的基本細胞過程中所起的活性作用。
由於NDP-激酶參與細胞增殖和分化，使其成為診斷癌症的一個細胞標記。這一方法是通過腫瘤組織的免疫組織化學分析實現的。然而這一研究並未清楚說明NDP-激酶的存在與腫瘤細胞存在之間的相互關係。
已對與腫瘤特別是乳腺腫瘤有關的細胞標記物進行了研究。其中LAPase與乳腺癌發病有關。血清LAPase水平的變化也與其他癌症或疾病如系統性紅斑狼瘡，心肌梗塞和病毒感染有關。因此以這種血清酶測定為基礎的診斷不具特異性。這種非特異性可能與其它LAPase同工酶存在有關。
顯然，迫切需要一種快速，靈敏，較少侵害性的方法來對乳腺癌進行診斷和分期，特別是能夠反映腫瘤轉移的標記物和指示雌激素活性的標記物。
目前的研究提供了這一方法。這一方法利用對NDP-Kinase和es-LAPase特異性單克隆抗體來檢測血液和組織中的這些標記物。這些標記物的酶活性水平與腫瘤特別是乳腺腫瘤的程度和轉移有關。這一免疫測定用血液或組織樣品。它的另一優點是通過使用兩個標記物使假陽性結果大大降低。如果只使用一個標記物，由於這一標記物的水平可能受其它生理條件影響而增加假陽性結果。
發明概述目前的嘗試是用抗體檢測癌症。具體說是用對NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase特異性抗體診斷原位導管癌及乳腺癌的轉移。也可用於檢測血清，血漿或組織中的NDP-激酶和LAPase水平。
我們可以提供通過測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測乳腺癌的方法。
也可以通過測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測病人的轉移性癌症。還能用NDP-Kinase抗體與模擬雌激素對es-LAPase特異性抗體檢測血清，血漿及組織中的NDP-Kinase和LAPase水平。
圖例說明以下用圖說明試驗特點圖一說明含有未變性NDP-Kinase/Nm23的樣品的Western Blots中MAb4A12的反應性。未變性PAGE之後的原細胞液(lane1)，HL60細胞中NDP-Kinase/Nm23的純製劑(lane2)，重組Nm23-H1(Lane3)與MAb 4A12的反應。用MAb 4A12可鑑別出所有樣品中相同的蛋白組分具有同樣的電泳速度。
圖二說明非變性PAGE之後，抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12單克隆抗體對原始細胞提取物的反應。一個是經染色的原始細胞提取物對NDP-Kinase/Nm23活性(lane1)。另一個是轉移到醋酸纖維素上並和抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab4A12單克隆抗體反應(lane2)。
圖三表明抗CD19/抗-NDP-Kinase/Nm23雙重標記的健康婦女的外周血細胞的雙變量點圖分析。雙點作圖分析是在雙重標記的PBMC1s上用羊抗鼠FITC抗體檢測作為第二標記物的MAb 4A12。對照樣品與預先免疫的控制免疫球蛋白IgG1反應，然後再用羊抗鼠IgG-FITC聯合抗體。Section1全部外周血細胞雙變量作圖分析。Section1ACD19+標記細胞〔LF2〕電控，然後分析它們對抗-NDP-Kinase/Nm23 Mab 4A12單克隆抗體的同時存在的活性。如Section1B所示，〔LF2〕抗-CD19+細胞對〔LF1〕抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12單克隆抗體作圖表明，大約93％雙重標記的B細胞對抗-CD19和抗-NDP-Kinase/Nm23 4A12單克隆抗體都有反應。如Section2所示所有與對照IgG免疫球蛋白反應的淋巴細胞都未起反應，而只有那些與抗-CD19和抗NDP-Kinase都反應的淋巴細胞有選擇性地與標記的B細胞反應。
優選實施方案的描述此項發明是用抗體診斷癌症。具體說，是對NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的特異性抗體的研究及其在診斷乳腺原位導管癌(DCIS)及其轉移。更進一步，這一檢測系統包括用NDP-Kinase/Nm23特異性抗體檢測血清，血漿和組織中的NDP-Kinase水平，與es-LAPase特異性抗體聯用檢測血清，血漿和組織中的NDP-Kinase和LAPase。
早期研究顯示可能存在與NDP-Kinase具有相同等電點和分子量的同功酶。相反，對與細胞膜有關的NDP-Kinase和細胞液NDP-Kinase研究表明，兩種酶是完全一致NDP-Kinase單一酶形式。這一研究發現由HL60細胞提純的活性細胞液NDP-Kinase是一種大約67kDa的寡聚物，由兩個大約17kDa和33kDa的亞單位組成。細胞液NDP-Kinase是單一酶，所表現的同功酶性質是蛋白磷酸化的答7b度不同所致，而不是NDP-Kinase蛋白水解產物。
在目前的發明中，我們從HL60細胞中製備出純細胞液NDP-Kinase單克隆抗體。抗體之一Mab 4A12能選擇性與NDP-Kinase活性寡聚物反應。該酶變性後的單體組分不能被識別。因此，還需確認本身的NDP-Kinase與Mab4A12抗體的結合。NDP-Kinase既存在於細胞質中又存在於與膜有關的複合物中。NDP-kinase在兩種狀態中具有完全相同的動力學和物理化學性質。
更進一步，我們也提供對es-LAPase的特異性抗體。這一抗體的製備方法在同時申請的專利中詳細介紹。
目前單克隆抗體是根據Campbellde和Lietzke，R，Unsicker，K傳統方法製備的。該法將老鼠骨髓瘤細胞經組織培養與抗體結合從免疫老鼠產生雜交細胞，這些細胞產生大量的單一抗體分子。即用抗原免疫動物如小鼠，大鼠，兔，羊，馬或牛製備產生抗體的細胞。免疫步驟及抗原濃度取決於能夠提供足夠量的產生抗體的細胞。這些產生抗體的細胞可以是脾細胞，淋巴細胞，淋巴結細胞或外周血淋巴細胞。
選擇適當的融合啟動子，使這些產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合，細胞系來源於各種動物，如鼠，兔及人類。許多小鼠骨髓瘤細胞系是已知並可從醫學科學團體獲得，如美國分類培養收集機構，Rockville，Maryland所用的這些骨髓瘤細胞對培養基應具有選擇性以使未融合的骨髓瘤細胞在選擇性介質中不能存活，而雜交細胞則能存活。最常用的細胞系是抗8-氮鳥票呤系，它含有較少的次黃票呤-鳥票呤-磷酸核磷d轉移酶，因此不能在HAT培養介質中生長。一般說來，該細胞系應是「非分泌」類，因而不產生抗體。所選的融合啟動子是聚乙二醇，其分子量在1000到4000之間。也可用聚乙烯醇，病毒或電場作為融合啟動子。
這些存活的細胞(雜交物)需經篩選，找出能分泌特異性抗體的細胞。通常用ELASA進行初選。進一步，將這些雜交物培養上清液加到預先加好抗原的微滴定盤中或硝酸纖維膜上，這裡所用的抗原是從HL60細胞提純的NDP-Kinase/Nm23。培養上清液的特異抗體可用第二標記抗體檢測。最常用的第二抗體是用過氧化物酶標記的抗鼠IgG。對NDP-Kinase抗原陽性的培養液用限制稀釋法克隆。第二雜交物培養液用上法進行再篩選。通過測定抗體是否與抗原結合來評估培養液並測定抗體結合的動力學參數。對選擇的培養液再克隆直到培養液穩定並獲得克隆。剛雜交之後的融合產物含有大約80個染色體。克隆過程是選擇那些仍保留抗體生產的染色體密碼的細胞。克隆過程一直重複到100％的亞群呈現特異性抗體的生產，這代表雜交物「穩定」。此外雜交物培養皿可能含有多種克隆，其中有些可能不產生抗體。克隆過程允許選擇從單一細胞衍生的陽性雜交物。
我們的發現之一是用雜交細胞系4A12製備單克隆抗體4A12。這一單克隆抗體對NDP-Kinase/Nm23有特異性。這一細胞系在1994年5月27日存於美國分類培養收集處，序列好為CRL 11634.
4A12抗體是IgG2a亞型，能夠鑑別NDP-Kinase/Nm23膜及細胞液形式。這一抗體能和許多細胞類型結合，包括hemapoietic系。然而該抗體只對B淋巴細胞有特異性並不識別其它淋巴細胞。在這一方面具有轉移性的乳腺癌病人的NDP-Kinase陽性B細胞明顯降低。因此這一抗體在診斷轉移疾病方面的作用是顯而易見的。
另一例子是用雜交細胞系7B6製備7B6抗體。這一單克隆抗體對es-LAPase有特異性。這一雜交細胞於2000年3月23日儲存於加拿大國際存放機構中。
此外，還包括任何具有抗體活性結合區域的片段，如Fab，F(ab)2和Fv片段。這些片段可用已知技術從7B6或4A12抗體獲得。
更具體的還有一些抗體和片段，它們能夠結合相同抗原測定物如7B6或4A12抗體。包括(但並不僅限於)與7A6和4A12抗體有相同抗原性卻來源不同或適於不同環境的或具不同結合親和力的抗體。顯然這一類及其抗體的變種可用重組類轉換和技術製備，這些技術可在「技術」裡找到。
這些單克隆抗體可用生物反應器或從腹水中生產，這兩種方法均來自「技術」裡。
這些單克隆抗體可用於診斷乳腺癌的轉移和程度及其它癌症如glial origin腦癌。這一診斷是用免疫測定系統來測定血液和組織中NDP-Kinase/Nm23及es-LAPase水平。
這一發明的另一方面是免疫沉澱。用類似上皮細胞的母細胞的細胞組分中的MAb 4A12進行免疫沉澱，這些細胞是乳腺腫瘤組織分離的。試驗結果表明基質層中NDP-Kinase活性降低，而細胞cytopholic層活性增強。更進一步，用MAb 4A12進行免疫沉澱表明，患DCIS並轉移的婦女的NDP-Kinase水平增高。
另一方面MAb 4A12可用於檢測與NDP-Kinase/Nm23相關的表面或膜細胞。特別是分析了人外周血中的MAb 4A12反應性和分布。已發現單細胞和顆粒細胞均可與MAb 4A12反應，但是只有淋巴細胞能和抗體反應。進一步分析證實只有B淋巴細胞，更確切地講是CD19+淋巴細胞與抗-NDP-Kinase/Nm23抗體反應。而且，檢測出乳腺及腦腫瘤病人的CD19+B細胞中被MAb4A12所識別的抗原與轉移成負相關並增加腫瘤的侵害性。此外，還用MAb 7B6與MAb 4A12共同檢測細胞表面和膜的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase.
免疫測定是將組織或血液樣品與抗體接觸並測定抗原-抗體加合物。也可將樣品進行免疫沉澱來測定免疫沉澱酶活性和水平。
有些免疫測定使用雙重抗體檢測抗原的存在。這些技術在「抗原-抗體反應基本原理」中有介紹。這些系統稱為快速形式系統，因為它們適用於快速檢測抗原的存在。這一系統要求抗原與抗體有很強的親和力。
目前試驗顯示，用一對抗體檢測NDP-Kinase/Nm23的存在，每個抗體對NDP-Kinase都有特異性。這對抗體之一指的是「檢測抗體」，另一個是指「捕獲抗體」。我們所發明的單克隆抗體既可單獨用作捕獲抗體或檢測抗體，也可以在一個測定中同時用作兩者。另一方面可用雙抗體三明治法測定生物液體樣品中的NDP-Kinase。在此法中，抗原是夾在檢測抗體和捕獲抗體之間的，捕獲抗體被不可逆地固定在固體支持物上。檢測抗體含有可檢測的標記以便測定抗原-抗體複合物從而檢測抗原的存在。根據上述的雙重抗體三明治法，在各自檢測系統中用各自標記的特異抗體測定NDP-Kinase和es-LAPase。
早期使用的固體支持物是在放射免疫學和酶免疫學領域裡常用的盤，試管或聚苯乙烯珠。最近，許多多孔性材料如尼龍，硝酸纖維素，醋酸纖維素，玻璃纖維及其它多孔聚合物被用作固體支持物。
方法之一是使用流通免疫測定設備。Valkirs等發明了一種設備，包括對被檢抗原特異性抗體結合到多孔性膜或過濾器上，將液體樣品加入該膜。當液體流過膜時，被檢物與抗體結合。加完樣品之後，再加標記的抗體。對所標記抗體的檢測能指示樣品中被檢物的存在。
另一使用流通設備的例子是Kromer等所描述的，一個試劑傳送系統包括一個基質，用試劑或分散在水溶性聚合物中的組分來控制放在基質下的傳遞到反應基質中的試劑的溶解速度。
在遷移類型測定中將膜浸在測定所用的試劑中，產生分析物測定帶，該帶結合了標記分析物，因此可讀取檢測標記。例如，見Tom等的專利和Zuk的專利。遷移測定裝置通常將試劑與有色標記接觸，不需再加其他物質就有可見的檢測分析結果。例子見Bernstein。我們所研究的單克隆抗體可用於所有類型的流通設備。這些流通設備也可用於檢測單一樣品中有多個被檢物時的測定。因此，這些流通設備可用於檢測es-LAPase和細胞液NDP-Kinase/Nm23.
根據目前的試驗，直接標記是目前所用的標記方法之一。直接標記被定義為一種實體，其在自然狀態下，可用肉眼或藉助於光學濾片觀察到，或用UV激發產生螢光。在目前這些有色標記例子中，包括金屬溶膠微粒，例如Leuvering所描述的金溶膠微粒；GribnauMay所描述的染料溶膠微粒；May，_supra，Snyde所描述的有色膠乳；或Cambell等提出的包膠的脂質體染料。其它直接標記有放射核甘太，螢光或發光。除了這些直接標記方法外，也可用間接酶標法。各種類型的免疫酶聯測定都是眾所周知的，如礆性磷酸酶，辣根過氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，乳酸脫氫酶，尿激酶等在酶免疫測定ELISA和EMIT文中有詳細介紹。
其它用單克隆抗體測定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase的生物診斷方法在G.Grenner等的專利中有介紹。
在診斷檢測試驗中常用取樣試管從病人身上取血。試管內壁起到單克隆或多克隆抗體載體作用，並且需要試劑或檢測方法產生可測量的信號。這一設計是將捕獲抗體固定在測定試管壁上。血樣從病人體內取出後，只需震搖試管以使內部的檢測抗體與血樣中的NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase反應。這些單克隆抗體或是當作捕獲抗體，或是作為檢測抗體。必需使用除去紅細胞的樣品以使紅細胞不影響分析結果。如果血樣中含有被檢物，就會夾在捕獲抗體和檢測抗體之間，這些抗體含有適當的標記進行直接檢測或和試劑反應後進行間接測定。然後清洗固體支持物(試管)以除去未結合的標記物。許多物質都可用作該法的固體支持物，如試管壁，塑料杯，玻璃珠，塑料球，量桶及微滴定盤，紙和玻璃纖維。
當前有幾種自動分析裝置可對許多樣品同時進行快速分析。這些自動裝置有連續/隨機測定裝置。例如PB診斷系統的OPUS及IMX分析儀。總之，樣品操作的全部過程，從吸取樣品到測定裝置，培養，及所得信號的讀取均是自動控制。自動測定系統一般包括一系列工作站，每一個工作站完成檢測過程的一個步驟。這些檢測裝置可以用各種方式由一個工作站轉到下一個，使檢測步驟能夠按順序進行。測定裝置還包括試劑儲存，液體混合，稀釋樣品槽。還應有一個開口允許加入已知量的液體，如有必要把所需試劑加入多孔膜。還有一個窗口能夠讀取多孔膜中樣品的螢光或有色光變化例如分光光度計或螢光計。
PB診斷系統的自動檢測系統見US專利5051237；5138868；5141871和5147609。
關於IMX分析儀見「Abbott IMX自動操作臺免疫化學分析儀系統」及US專利4956148題為「鎖架(Locking Rack)及一次性樣品盒」，它描述了用與AbbottIMX系統連接攜帶許多反應細胞的演示。此技術的進一步發展指定給Abbott實驗室，在加拿大專利2069531中有說明，這一免疫化學分析儀系統能夠用現有的儀器一次分析三到四個樣品。用這一系統使用者把一組中三批樣品同時測定而不需分三次分析。單克隆抗體可用於自動分析儀。
更進一步，可用於我們發明的單克隆抗體的免疫化學分析儀系統有生物傳感器或光學免疫傳感器。總之，光學生物傳感器是使用光學原理定量把所需的化學和生物化學濃度或活性轉換成電信號。這些系統可分為四類；光纖技術和相應的光學設備；反射技術包括多組成反射光度計，及螢光毛細管填充裝置。光纖技術包括瞬間場螢光，光纖毛細管和光纖螢光敏感器。一體化光學設備包括計劃瞬間場螢光，輸入光珊連接免疫敏感器，Mach-Zehnder幹涉儀，Hartman幹涉儀，示差幹涉儀敏感器。這些光學免疫敏感器在綜述文章中有概述。
另一免疫化學分析法是流動細胞學分析。該法是用含有抗原的樣品與用螢光標記的單克隆抗體反應。樣品經過具有一定波長的雷射束，該波長能激發抗體的發色團。每一個有抗體結合的微粒或細胞會產生螢光因而可以測定。這一技術能夠分析特定的細胞類型尤其是特定的血細胞類型。因此，可用於測定帶有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase抗原的B細胞。
NDP-Kinase和LAPase活性也可以用血漿免疫沉澱法測定，通過MAb4A12和MAb7B6與其共價結合到固體載體上進行免疫沉澱。簡言之，將血漿或其稀釋液加到共價鍵合的MAbs上，恆溫至確保樣品中的標記完全與單克隆抗體結合。即可測定單個酶活性。
另一具體實驗是用單克隆抗體檢測血液，血清，血漿或組織樣品。這一檢測是在具有檢測部分和捕獲部分的濾膜或固體支持物的裝置中進行的。檢測部分含有檢測抗體，它將與NSP-Kinase/Nm23反應。檢測抗體可逆性固定在固體支持物上，使用時將隨樣品一起移動。最好標記檢測抗體。例如用放射核甘太，酶，螢光組分，發光組分或如前所述的有色標記。捕獲部分包括捕獲抗體，將其不可逆地固定在固體支持物上。這些捕獲和檢測抗體及必需試劑用標準技術固定在固體支持物上，如前所述的流通型免疫測定設備。總之，用非極性蛋白亞結構與非極性支持材料之間的相互反應將抗體吸附在固體支持物上。
在兩步測定中使用與NDP-Kinase/Nm23反應的抗體和另一個對人體es-LAPase專屬抗體結合。乳腺癌病人的血清LAPase較高，有轉移的乳腺癌病人的LAPase更高。進一步，曾暴露在雌激素中的乳腺腫瘤細胞培養液的上清液中的es-LAPase更高。因此，在兩步測定中同時應用兩種抗體檢測血樣中NDP-Kinase/Nm23和血清es-LAPase水平。這一測定克服了以前舊技術的限制。在這一舊技術中用兩種對乳腺癌病人轉移都敏感的標記物。因此，可以通過降低假陽性概率而增加對乳腺癌檢測的特異性和準確性。兩步測定法也可用於檢查具有患乳腺癌危險的病人。由於血清es-LAPase和NDP-Kinase/Nm23都受雌激素的影響，因此，危險病人包括服用雌激素類避孕藥者，激素治療病人或具有不正常激素類型的人。在這方面，用雌激素治療的婦女其血清中的這兩種標記可用於測定NDP-Kinase和es-LAPase水平是否增加。NDP-Kinase和es-LAPase水平增加與發展乳腺癌的危險增加有關，這類婦女應減少雌激素的服用量。
可見，NDP-Kinase/Nm23和LAPase的基線水平可由正常病人提供。因此，高於基線水平的NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase可以測定。這一測定既可用與正常結果比較的方法也可用調節免疫測定靈敏度以使高於特定限度的值呈陽性結果的方法。
以上的發明還需改進以便區分細胞液和與膜相關的NDP-Kinase/Nm23。
為更好地理解我們的研究結果，特舉例說明。以下例子只幫助理解，並不說明我們的研究僅限於此。
示例例一從HL60細胞中分離和提純細胞液NDP-Kinase從HL60細胞中提純細胞液NDP-Kinase的方法見Pulido-Cejudo等(FASEB J3608a，1989)。簡言之，這一細胞提取成份來自用15g(溼重)PBS緩衝液洗滌HL60細胞微粒，將其加到磷酸葡萄糖柱上(P11)(1。6cm×28.0cm)，該柱預先用磷酸緩衝液(50mM磷酸鉀pH7.0，2mMMgCl2，1mMPMSF，，1mMDTT和10％glycerol)。平衡過。再用300ml同樣的緩衝液以0.1ml/min.的流速洗滌。未結合的蛋白質經高速離心濃縮成10ml，高速離心濃縮用YM5膜(5000M.W.cutoff，AmiconDiv.，Danvers，MA.，USA)。該濃縮物加到DEAE葡聚糖柱(2.6cm×28.5cm)上，該柱預先用Tris-緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.5；2Mm MgCl2；1mM PMSF；1mM DTT和10％(v/v)glycerol)平衡並洗滌。用線性洗脫劑(含有0到1M NaCl的Tris緩衝液)洗脫NDP-Kinase/Nm23，洗脫速度為0.50ml/min.。用G.Pulido-Cejudo等所描述的方法(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)測定經提純的NDP-Kinase/Nm23的活性。即通過測定以dADP作為磷酸鹽受體的dATP消耗量及一定量的酶來測定NDP-Kinase/Nm23活性。在NDP-Kinase/Nm23調節的磷酸鹽轉移到未標記的dADP上之後，用DEAE離子交換試紙(DE81)從剩餘的3HdADP中分離3HdATP。在使用之前所有的脫氧核甘酸和核甘酸需經離子交換色譜純化。將23mM每一種核甘酸分別加到Partisil 10SAX分析柱上，該柱需用0.4M NH4H2PO4，pH3.9進行平衡。兩個樣品的等度洗脫為1700至1800psi(Waters HPLC system Model 510)。純化後的樣品用氨調pH至7.0，用分光光度法在260nm測定最終濃度。將含有NDP-Kinase/Nm23活性的組分集中並用超速離心濃縮。將NDP-Kinase/Nm23濃縮物加到Sephacryl S-200柱(2.6×51cm)上，該預先柱用Ttris緩衝液平衡。經這一純化步驟後便可得到所需的活性物質。每一步提純後都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法測定其濃度。簡言之，100-200ul樣品用去離子水透析，然後把每個樣品2-20ul放入聚乙烯管中。樣品在110℃乾燥60分鐘。接著用250ul冰醋酸中和。然後使樣品與500ul下列印三酮-還原印三酮溶液反應，該溶液組成為2g印三酮，150mg還原印三酮(Sigma)溶於65ml 2-甲氧基乙醇，然後加入35ml 4M醋酸鈉(pH5.5)。將試管於110℃恆溫15分鐘。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然後在570nm測定其吸收度。蛋白質含量可由吸收曲線得到，該曲線是由1-10ug BSA的樣品得到的。由HL60細胞提純細胞液NDP-Kinase/Nm23的摘要見表1。表1從HL60細胞中提純NDP-Kinase簡介Total SpecificstepProtein1Activity2Activity2Fold Yield(mg) (nmol/min.) (nmol/min.) (％)Homogenate 875 125 0.141 100Supernatant 623 102 0.16 1.1581.60CellulosePhosphate135 100 0.74 5.1280.00CelluloseDEAE 1.18 1411.86 83.52 11.20SephacrylS-2000.006 6 1000 70.42 4.801.蛋白含量是在礆性水解後測定的，對水解產物定量印三酮測定。
2.用first-order測定法檢測。
例2es-LAPase的分離和提純人類腫瘤組織的乳腺癌母細胞用100nm 17-B-Estradiol刺激24小時，或用培養介質作對照。細胞介質為RPMI 1640培養介質+10％FCS+100U/ml青黴素+100ug/ml鏈黴素。經在無縫葡聚糖試管(MV 12,400)中用PBS降解24小時(4℃)後收集上清液。然後用HPLC-凝膠滲透色譜與DEAE-纖維素和Bestatin-瓊脂糖凝膠親和色譜從降解的細胞上清液中純化LAP。簡言之，將細胞上清液倒入Bio-Sil SEC-250柱(600×7.5mm)上，該柱子用含有100mM磷酸鈉(pH6.8)，100mMNa2SO4，1uM ZnCl2，和10％甘油緩衝液預先平衡。然後用300ml同樣的緩衝液以0.5ml/min.的流速洗滌柱子。用YM5膜高速離心將蛋白濃縮至10ml。濃縮液再經DEAE纖維素柱(2.6×28.5cm)，此柱先用50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)；1uMZnCl2；和10％(v/v)甘油平衡並洗滌。Bestatin-親和柱的製備是根據廠家提供的方法，用Ultralink EDC/DADPA Amide結合基質通過用100mg純Bestatin和EDC/DADPA基質反應製備的。在加入含LAP的洗滌液之前，將Bestatin親和柱用10ml Tris-HCl(pH8.0)含1uM ZnCl2緩衝液平衡，再用300ml該結合緩衝液洗滌。LAPase用蠕動pump以0.10ml/min.的流速通過這一系統進行再循環兩小時。再循環後用八倍柱容量的結合緩衝液洗滌柱子。用線性洗脫液(0-0.5M NaCl)(含有1uM ZnCl2的10nM Tris-HCl pH 8.0)洗提Bestatin鍵合的LAPase。在280nm測定洗脫下來的鍵合LAP。提純的LAPase分裝成500ul儲存於50mM Tris-HCl pH 7.8和50uMZnCl2溶液中。每一步提純後都要用Pulido-Cejudo(J.Chromatogr.B 660(1994)37-47)的方法測定其濃度。簡言之，100-200ul樣品用去離子水透析，然後把每個樣品2-20ul放入聚乙烯管中。樣品在110℃乾燥60分鐘。接著用250ul冰醋酸中和。然後使樣品與500ul下列印三酮-還原印三酮溶液反應，該溶液組成為2g印三酮，150mg還原印三酮(Sigma)溶於65ml 2-甲氧基乙醇，然後加入35ml 4M醋酸鈉(pH5.5)。將試管於110℃恆溫15分鐘。加入2.5ml 5％(v/v)乙醇，然後在570nm測定其吸收度。蛋白質含量可由吸收曲線的到，該曲線是由1-10ug BSA的樣品測得的。
例3單克隆抗體MAb 7B6(抗-LAPase)和MAb 4A12(抗-NDP-Kinase)的生產和純化這一方案中的方法如免疫抗原的製備，免疫動物脾細胞的製備，脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，及融合細胞在選擇性HAT介質中的塗鋪均來自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所詳細描述的方法。與標準方法不同，我們用於生產單克隆抗體的方法是用高純度的NDP-Kinase(7000倍純度-見表1)進行第一免疫，而不是粗提物和部分提純的酶製劑。腹水液的製備是在注射3×106骨髓瘤細胞之前一周，通過用500l去甲植烷啟動BALB/C小鼠而獲得的。20天之後收集腹水液。從腹水液中提純IgG免疫球蛋白是根據廠家的說明用3ml蛋白G瓊脂糖凝膠4FT柱上進行親和色譜法。
對NDP-Kinase單克隆抗體的篩選是用在硝酸纖維素上的點圖免疫染色法。即將0.5-1ug NDP-Kinase(5ul)點在硝酸纖維素膜上，在37C與PBS/3％BSA(固定溶液)乾燥，並固定。在固定溶液中製備的鼠單克隆抗體(1/100和1/500倍稀釋)與固定的NDP-Kinase一起於37C恆溫17小時，然後用免疫過氧化物酶法測定。
單克隆抗體MAb 4A12於1994年5月27日存放在American Type CultureCollection，標號為CRL 11634。
製備分泌對17-B-雌二醇-響應物LAPase的鼠單克隆抗體，免疫抗原製備方法，免疫動物脾細胞的製備，脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，及融合細胞在選擇性HAT介質中的塗鋪均來自Campbell所描述的及Lietzke和Unsicker所詳細描述的方法。
總之，基本的免疫反應是用提純的es-LAPase經脫鹽後進行的。在14，35和56天用提純的es-LAPase進行促進。在24和45天篩選BALB/C小鼠。小鼠在第59天殺死，將最好的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。通過在硝酸纖維素上的點圖免疫染色進行篩選。
用限制稀釋單細胞克隆獲得雜交瘤克隆7B6。準備四個系列稀釋試管，其中含有雜交瘤細胞及20％FBS +2X OPI。將每個稀釋液100ul加到96孔的盤中，並在個孔中加入50ul脾餵養細胞，放於37℃ 5％ CO2恆溫箱。第七天，從個孔中取上清液並用在硝酸纖維素上的點圖免疫染色進行篩選。
把雜交瘤克隆7B6細胞由96孔盤中轉移到0.5ml培養液中，該培養液含有20％FBS +1X OPI+ 1X HAT放於24孔的盤中。一旦細胞濃縮，將其5mls轉移至60mm盤，然後再成10ml轉移至100mm盤中。當60mm盤中的細胞被認為沒有次黃票呤，胸腺密定脫氧核甘，氨基票呤，7B6雜交瘤細胞將繼續生長直到成指數級生長。抗-LAPase，MAb 7B6從收集的雜交瘤7B6細胞上清液中用免疫純的IgG親和色譜分離。用在硝酸纖維素上的點圖免疫染色進行篩選。
MAb 4A12與MAb 7B6類型用Sigma的免疫分類試劑測定。即單克隆與預塗分類硝酸纖維膜結合，然後用靈敏的生物素-抗生物素蛋白-酶檢測系統進行免疫測定。MAb 4A12的類型是IgG2a，MAb 7B6為IgG1a。
例4雌激素對細胞液與乳腺癌母細胞系的Stromal細胞部分中NDP-Kinase/Nm23活性作用乳腺腫瘤細胞系母細胞與100nM 17-B-雌二醇一起恆溫24小時。用只與細胞培養液一起恆溫的細胞作對照。細胞液和基質細胞組分用G.Pulido-Cejudo提出的方法分離。每種細胞組分的NDP-Kinase/Nm23活性用例子交換-HPLC測定。
分離的細胞液和stromal細胞及由HL60提純的NDP-KI-inase/Nm23，重組Nm23-H1在不變性條件下進行電泳。將膠電轉移到硝酸纖維膜上。膜與Tris緩衝液(TBS)在37℃反應一小時，然後用1∶100倍稀釋(TBS)的NDP-Kinase/Nm23(MAb4A12)探針測定。用1∶500倍稀釋(TBS)的羊-抗0鼠-礆性磷酸酶反應，則有可見帶出現，然後用BCIP和NBT為底物的礆性磷酸酶底物緩衝液進行比色測定。
含有NDP-Kinase/Nm23的膠在不變性條件下進行電泳，並用Lam和Packham的方法染色測定NDP-Kinase/Nm23活性。含有NDP-Kinase/Nm23的樣品用預先吸收在蛋白-A-瓊脂糖凝膠微珠上的MAb 4A12單克隆抗體進行免疫沉澱。首先蛋白-A-瓊脂糖凝膠-MAb 4A12免疫親和系統用10％FCS-RPMI 1640反應2小時，用10mMTris-HCl(pH8.0)洗滌。已知NDP-Kinase/Nm23活性的樣品(100pl)與未反應的蛋白-A瓊脂糖凝膠-微珠或蛋白-A-瓊脂糖凝膠MAb 4A12系統一起在攪拌下於4℃培養過夜。培養後用Larn和Packham的方法測定上清液中的NDP-Kinase/Nm23活性。
如表2所示，經雌激素刺激後的細胞液組分中的NDP-Kinase/Nm23活性幾乎是空白的40倍。然而，雌激素暴露可以增加細胞液中NDP-Kinase/Nm23活性，在膜結合的NDP-Kinase/Nm23活性則相反。
表2在stromal和細胞液的細胞組分中NDP-Kinase/Nm23活性NDP-Kinase/Nm23活性(umoles dATP/ug)Condition Stromal CytosolicControl 6.5±0.2×10-11.8±0.2Estrogen1.1±0.1×10-244.8±2.1(100nM)NDP-Kinase/Nm23酶活性用G.Pulido-Cejudo等的方法測定。
對未反應的NDP-Kinase/Nm23的細胞表面分布進行分析。如
圖1所示，對原細胞液製劑(lane1)和由HL60細胞提純的NDP-Kinase/Nm23(lane2)和重組Nm23-H1(lane3)在未變性PAGE上進行Western Blots，結果表明用NDP-Kinase/Nm23MAb 4A12單克隆抗體，所有的樣品的電泳結果都有相同帶。
進一步的試驗來鑑別蛋白帶的一致性，用MAb 4A12對未變性PAGE的原細胞提取物進行鑑定並轉移到硝酸纖維素上。如圖2所示，一個樣品對NDP-Kinase/Nm23活性染色(lane1)，第二個與抗-NDP-Kinase/Nm23 MAb 4A12單克隆抗體反應(lane2)。含有NDP-Kinase/Nm23活性的蛋白帶(lane1)，與用MAb4A12單克隆抗體的Western blot(lane2)具有完全相同的位置。總的說來，這些結果證實了單克隆抗體MAb 4A12的專屬性，並提示後一抗體能夠識別活性NDP-Kinase/Nm23細胞液單聚物。最後，這一抗體用於研究NDP-Kinase/Nm23在外周血細胞中的分布，這些外周血細胞是從正常人和患有轉移性癌症(肺和腦)的病人的到的。
例5正常人和患有轉移性乳腺癌婦女病人外周血細胞中NDP-Kinase/Nm23的流動細胞學細胞分布將正常婦女和患病婦女的全血在4℃以1500rmp速度離心10分鐘。吸去上清液，用等體積的PBS稀釋，加到FIcoll-Paque上。繼續以1500rmp速度離心30分鐘，在界面上收集PBMC。用PBS洗滌細胞三次。
用兩種免疫螢光方法將全血細胞染色。即，將20ul MAb 4A12抗體(200ug/ml)或對照IgG1，加到100ul血樣中。恆溫30min.後用100ul冷PBS洗滌並溶解細胞，然後，加入羊-抗-屬IgG-FITC-結合抗體。將混合物恆溫20分鐘，再洗滌，用100ulPBS溶解細胞。血細胞進一步和20ul下列phycoerthrin-結合的鼠抗體之一培養IgG-PE(對照)，Leullc-PE(anti-CD16)，Leu 19-PE(anti-CD56)。在恆溫15分鐘後，在自動Q-prep工作站處理紅細胞，這一工作站能夠連續輸送紅細胞溶解試劑，一種白細胞穩定劑和固定劑。在erythrocyte水解後再用PBS洗滌細胞兩次並用1ml 2％低聚甲醛固定。樣品用帶有空氣冷卻的氬離子雷射(10mwatt)流動細胞學分析儀分析。固定激發波長在488nm同時得到了FITC和PE的激發光。依據在雙波長顯示器上前光束(FAS)和側光束(SS)，淋巴細胞與單細胞和粒細胞有明顯區別。在細胞周圍有一個電子門用於分析，此電子門具有對粒細胞，單細胞，和淋巴細胞有光色散性質。
在細胞周期中，提出膜鍵合的NDP-Kinase/Nm23可能調節腺甘酸循環酶活性，這一調節是通過調節G蛋白(Gs和Gl)活性所需要的GTP水平，而蛋白G又可調節腺甘酸循環酶的激和和抑制。這一觀察為我們提供了測定抗-NDP-Kinase抗體(MAb 4A12)對外周血細胞(PBMC)的反應性。用MAb 4A12抗體，許多藻紅蛋白-結合單克隆抗體進行兩個有色免疫螢光研究，認識到了有不同的淋巴細胞亞種(subset)所表達的特徵性epitopes。發現有健康婦女的PBMS能同時用抗-CD19(圖3，1A)和MAb 4A12單克隆抗體(圖3，1B)標記，這些PSMC中只有淋巴細胞帶有B-細胞(CD19+B細胞)的CD19同一的膜糖蛋白特性。在這一方面，只有93％的CD19+B-淋巴細胞(圖3，1A)表達健康婦女PBMC中被MAb 4A12識別的抗原。相反，觀察到在患病婦女雙標記的CD19+NDP-Kinase-B-淋巴細胞中明顯減少(見表3)。表3外周血循環B-細胞雙標記抗-CD19/抗-NDP-Kinase的百分比％ of anti-CD19/anti-NDP-KinaseDouble labelled B-lymphocytes(B-gate)Normal Subjects 93.30±1.02Women with MetastaticDisease(lung/brain) 2.91±0.82沒有其他淋巴細胞能被對細胞液中NDP-Kinase的單克隆抗體有選擇性標記。基於這一分析，NDP-Kinase/Nm23單克隆抗體只標記B-淋巴細胞，很可能通過與膜相關的NDP-Kinase/Nm23單聚體反應而標記。
例6人類乳腺癌母細胞的ELASA分析人類乳腺癌母細胞進行ELASA分析說明MAb 4A12和7B6對NDP-Kinase和LAPase相應的活性。簡言之，在96孔的盤上，每孔加入在RPMI 1640培養液中的50000母細胞+10％FCS+100U/ml青黴素+100ug/ml鏈黴素，於37℃，5％CO2培養24小時。除去上清液，用PBS洗滌細胞，隨後用1％gluteraldehydrade的PBS溶液室溫下固定1小時。用PBS洗滌，然後用casein在37℃，5％CO2封閉一小時。用PBS洗滌後，在孔裡加入MAb 4A12或MAb 7B6的系列稀釋液並在37℃，5％CO2培養2小時。在加入第二抗體，抗-(IgG+IgM)過氧化物酶結合的羊-抗-鼠IgG+IgM(H+L)和OPD之後，能夠顯示MAb 4A12和MAb7B6反應性。用MAb 7B6對人LAP在490nm測得的讀數總結如下(表4)。表4MAb 7B6對人類乳腺癌母細胞LAP反應性的總結MAb 7B6Cell Line 1 OD 490nm- Cell Line 2 OD 490nm-(ng/well)Blank OD490nm Blank OD490nm200 0.707-0.054＝0.653 0.6-0.005＝0.595100 0.57-0.021＝0.549 0.446-0.003＝0.4350 0.489-0.042＝0.447 0.327-0.003＝0.32425 0.38-0.047＝0.333 0.24-0＝0.2412.5 0.294-0.05＝0.244 0.165-0＝0.1656.25 0.225-0.05＝0.176 0.1-0.003＝0.0973.1250.155-0.044＝0.111 0.068-0.003＝0.0651.56 0.107-0.05＝0.057 0.043-0.002＝0.0410.78 0.094-0.005＝0.039 0.023-0.001＝0.0220.39 0.067-0.073＝0 0.015-0＝0.0150.2 0.061-0.052＝0.009 0.008-0＝0.0080.1 0.053-0.046＝0.007 0-0＝0例7初期乳腺癌婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性初期乳腺癌病人與相同年齡的健康婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性用HPLC測定進行比較，用亮氨酸-B-奈氨作為底物用螢光光度法測定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性。在100℃煮沸10分鐘來終止反應，然後在4℃以780Xg離心10分鐘。所得值代表每一試驗組中16個病人三次測定的平均值。用血漿免疫沉澱法測定NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase活性，免疫沉澱用的是共價MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基質.簡言之，將血漿在4℃，500xg離心10分鐘。吸出血漿，繼續在4℃，500xg離心5分鐘。最後，用PBS將血漿按1∶10稀釋，把800ul血漿稀釋液加到共價MAb 4A12(IgG2a)-蛋白G和LAPaseMAb 7B6(IgG1a)-蛋白基質，其中含有5ug抗體在200ul預先用封閉緩衝液(50mMTris-HCl；0.5％非脂肪牛奶)培養過的珠粒上。樣品放在預塗0.5％BSA的Eppendorf試管中在不斷輕輕旋轉下，室溫下培養15分鐘。
經培養後的樣品於250xg，室溫下用Eppendorf離心機離心，除去上清液。含有NDP-Kinase/Nm23或es-LAPase活性的珠粒用PBS，0.5％NFDM洗滌兩次。最後用無鈣的Hank′s溶液再溶解使最終體積為600ul及182uM 1-亮氨酸-B-奈氨。用MAb4A12(IgG2a)-ProteinG和LAPase MAb 7B6(IgG1a)-PtoteinG-珠粒(塗有0.5％NFDM)作為相應的空白。
用MAb 4A12(抗-NDP-Kinase/Nm23)和MAb 7B6(抗-LAPase)進行血漿免疫沉澱結果顯示，患有非浸潤性導管癌和轉移癌的病人血液中的雌激素依賴性標記水平高於正常健康婦女。實驗結果見表5和表6。
表5患乳腺癌婦女血漿中的es-LAPase水平Patient Population LAPase Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 5-10DCIS(non-invasive)450-600Metastatic(Lung/Brain)1200-3700表6患乳腺癌婦女血漿中的NDP-Kinase/Nm23水平Patient PopulationNDP-Kinase/Nm23 Levels(n＝100per group) (ug/ml)Normal 0.2-0.8DCIS(non-invasive) 15-25Metastatic(Lung/Brain) 500-890例8流動細胞學測定腫瘤組織的乳腺上皮癌母細胞中膜結合的es-LAPase和NDP-Kinase-Nm23腫瘤組織上皮細胞間接免疫螢光染色法是將吸附了MAb 4A12或MAb7B6抗體的人血清與附著細胞一起培養。即，用PBS洗滌融合的細胞，與20ul MAb 4A12或MAb 7B6抗體(200ug/ml)或對照小鼠IgG1於37℃培養，最終體積為2ml。經20分鐘培養後，立即用PBS洗滌細胞。再與鼠-抗-IgG-PE或鼠-抗-IgG-FITC結合物一起培養15分鐘。用PBS洗滌細胞三次，取一部分用夷蛋白酶處理並用流動細胞儀分析，儀器備有氣體冷卻的氬離子雷射，其操作功率為10mwatt。在激發波長為488nm時，可同時測得FITC和PE結合物的激發。
用ELISA法使用單克隆抗體MAb4A12和MAb 7B6測定患早期乳腺癌婦女血漿中NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase水平與相同年齡健康婦女比較。
在將單克隆抗體MAb4A12和MAb7B6提純後，其相應的IgG2a(Anti-NDP-Kinase/Nm23)和IgG1(Anti-es-LAPase)通過DSS交叉連接系統固定，這一系統來自與Pierce(Rockford，IL，USA)。
MAb4A12和MAb 7B6蛋白G基質用於由血漿或細胞膜鍵合組分(預先測定酶活性)中選擇性免疫沉澱NDP-Kinase/Nm23和es-LAPase。結果見表7。
表7乳腺癌婦女腫瘤組織分離的上皮母細胞中NDP-Kinase/Nm23在stromal和細胞液部分的活性與患良性囊腫和纖維瘤病人的比較NDP-Kinase/Nm23活性(umole dATP/ug)Condition Stromal CytosolicFibroadenomas/cysts 80.24±1.22 3.18±DCIS(non-invasive)3.22±0.12 25.34±Metastatic(Ling/Brain) 0.15±0.04 102±2.3這裡所用的參考文獻，專利及專利申請見本文的參考文獻。
我們以例子解釋我們的發明，但是我們的研究並不限制於這些解釋。對我們發明的全面解釋見下列說明。
權利要求
1.通過測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測乳腺癌的方法。
2.根據權利要求1的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測是從一組測定方法中選出的，這一組測定方法包括免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
3.根據權利要求2的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細胞的對細胞液和膜結合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
4.根據權利要求3的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系4A12製備的，並存放在ATCC，序列號為CRL 11634。
5.根據權利要求2的方法，其中es-LAPase的存在是用對es-LAPase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
6.根據權利要求5的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系7B6製備的，並存放在加拿大國際存放機構，序列號為。
7.用測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測轉移癌的方法。
8.根據權利要求7的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測是從一組測定方法中選出的。這一組測定方法包括免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
9.根據權利要求8的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細胞的對細胞液和膜結合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
10.根據權利要求9的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系4A12製備的，並存放在ATCC，序列號為CRL 11634。
11.根據權利要求8的方法，其中es-LAPase的存在是用對es-LAPase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
12.根據權利要求11的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系7B6製備的，並存放在加拿大國際存放機構，序列號為。
13.用測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平來檢測乳腺癌發展的危險性的方法。
14.根據權利要求13的方法，其中NDP-Kinase和es-LAPase水平檢測是從一組測定方法中選出的，這一組測定方法包括免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase水平；免疫測定樣品中NDP-Kinase和es-LAPase的存在。
15.根據權利要求14的方法，其中NDP-Kinase的存在是用人HL60細胞的對細胞液和膜結合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
16.根據權利要求15的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系4A12製備的，並存放在ATCC，序列號為CRL 11634。
17.根據權利要求14的方法，其中es-LAPase的存在是用對es-LAPase有特異性的單克隆抗體進行免疫測定測得的。
18.根據權利要求17的方法，其中單克隆抗體是用雜交瘤細胞系7B6製備的，並存放在加拿大國際存放機構，序列號為。
19.用免疫測定法檢測樣品中NDP-Kinase和-LAPase的診斷系統，其包括用HL60細胞的對細胞液和膜結合的NDP-Kinase有特異性的單克隆抗體作為第一抗體，用es-LAPase特異性單克隆抗體作為第二抗體測定一組分別患有乳腺癌，轉移癌，和具有乳腺癌發病危險病人的狀況。
20.根據權利要求19的診斷系統，其中第一單克隆抗體是用雜交瘤細胞系4A12製備的，並存放在ATCC，序列號為CRL 11634，第二單克隆抗體是用雜交瘤細胞系7B6製備的，並存放在加拿大國際存放機構，序列號為。
全文摘要
對人類疾病如癌症進行有效檢測及設計治療藥物的關鍵在於能夠鑑別危險因素和病理生理改變的分子聯繫。在正常生理條件下,雌激素對多個器官起關鍵性的作用。這些組織對雌激素刺激的反應能夠部分解釋其在各種人類疾病的發生和發展中所起的活性作用,尤其是對乳腺癌。對早期乳腺癌腫瘤組織母細胞中能對雌激素響應的細胞因子的研究,發現了兩種標示物。一種是來自早期乳腺癌腫瘤組織母細胞的假定的LAPase的同功酶,另一種是來自HL60細胞的細胞液NDP－Kinase.Nm23。生產出了對每一種細胞標記物的單克隆抗體。單獨或一起測定這兩種標記物的存在,可用於檢測乳腺癌特別是與轉移有關的癌症。因此,這一發明指的是LAPase和NDP－Kinase/Nm23兩個單克隆抗體在固體基質中一起使用,來確認對乳腺癌的血液測定的免疫測定方法。
文檔編號A61P31/18GK1351714SQ00807917
公開日2002年5月29日 申請日期2000年3月30日 優先權日1999年3月30日
發明者卡布裡耶·普利多－塞胡多 申請人:堪波瑞爾醫療診斷加拿大控股公司, 加拿大衛生部