一種澤瀉三萜類化合物提取純化工藝的製作方法

2023-10-11 22:43:49

專利名稱：：一種澤瀉三萜類化合物提取純化工藝的製作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥，特別涉及中藥有效成分提取純化工藝，具體涉及澤瀉三萜類化合物提取純化。
背景技術：
：澤瀉為澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientalis(Sam.)Juz印.)的乾燥塊莖，性寒，味甘、淡，入腎、膀胱經，味甘、淡，可滲溼，性寒能瀉腎及膀胱之熱，為常用的利水、滲熱、瀉熱藥物，臨床上常用於小便不利、水腫脹滿、洩瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛、高血脂症等的治療。對澤瀉的化學成分研究表明澤瀉中含有揮髮油、生物鹼、天門冬素、脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸)、樹脂、蛋白質、澱粉和系列三萜類[澤瀉醇A、B、C，24-乙醯澤瀉醇A、23-乙醯澤瀉醇B、24-乙醯澤瀉醇C等]以及系列倍半萜類(orientalolA、B、C、D等)等成分，其中澤瀉醇A、B、C和24-乙醯澤瀉醇A、23-乙醯澤瀉醇B、24_乙醯澤瀉醇C具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝作用，為澤瀉的主要活性成分。前期的藥理試驗中，已經篩選出澤瀉防治泌尿系統結石的有效部位，並經結構鑑定，初步確定其為三萜類化合物。本文旨在以澤瀉中總三萜的含量以及23-乙醯澤瀉醇B的含量為指標，考察以大孔吸附樹脂富集澤瀉中三萜類化學成分的工藝。
發明內容本發明的任務是提供一種澤瀉三萜類化合物提取純化工藝。本發明通過對5種大孔吸附樹脂的吸附和解吸特性的比較，篩選出吸附澤瀉中三萜化合物的最佳樹脂，即HPD-100型大孔吸附樹脂，其他文獻未見相關報導。該樹脂屬於非極性樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯縮合而成，故又稱芳香族吸附樹脂，因具有比較大的孔，適用於大分子物質的吸附，且洗脫性良好，被吸附物可以容易地被洗脫下來，因此適用範圍廣泛，在醫藥食品領域評價很好。且經本實驗證明該樹脂對於澤瀉有效部位的純化作用優於其它樹脂。在應用大孔吸附樹脂分離純化中藥有效部位的傳統實驗中，上樣前的供試品多用蒸餾水溶解，本實驗採用50%乙醇溶解是因為澤瀉中所含三萜類化合物極性較小，不能用蒸餾水溶解上樣，若用濃度高的乙醇溶解，雖然三萜類化合物在濃度高的醇溶液中溶解度較好，但樹脂的吸附量又會降低，所以選擇50%乙醇溶解。洗脫溶液濃度選擇80%乙醇是因為80%乙醇溶液基本能把總三萜和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全，而綜合考慮澤瀉三萜類化合物含量和23-乙醯澤瀉醇B的含量兩個指標使該方法更加科學合理。實現本發明的技術方案本發明提供的澤瀉三萜類化合物提取純化工藝的步驟是(1)稱取澤瀉粗粉加入50%的甲醇，回流提取過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，即得澤瀉粗浸膏；(2)將製得的澤瀉粗浸膏加入水分散，用水飽和的乙酸乙酯萃取，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥，得到澤瀉精製浸膏；(3)將製得的澤瀉精製浸膏用50%乙醇溶解，製得到濃度為0.2g生藥/ml的上柱液，分別以1.0ml/min的流速上樣於67ml體積的HPD-100樹脂柱，後以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類、多糖和苷類，再用30%乙醇洗脫，然後用80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得總固物，即為澤瀉三萜類化合物。本發明通過對5種大孔吸附樹脂的吸附和解吸特性的比較，篩選出吸附澤瀉中三萜化合物的最佳樹脂，即HPD-100型大孔吸附樹脂，其他文獻未見相關報導。該樹脂屬於非極性樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯縮合而成，故又稱芳香族吸附樹脂，因具有比較大的孔，適用於大分子物質的吸附，且洗脫性良好，被吸附物可以容易地被洗脫下來，因此適用範圍廣泛，在醫藥食品領域評價很好。且經本發明實驗證明該樹脂對於澤瀉有效部位的純化作用優於其它樹脂。在應用大孔吸附樹脂分離純化中藥有效部位的傳統工藝中，上樣前的供試品多用蒸餾水溶解，本實驗採用50%乙醇溶解是因為澤瀉中所含三萜類化合物極性較小，不能用蒸餾水溶解上樣，若用濃度高的乙醇溶解，雖然三萜類化合物在濃度高的醇溶液中溶解度較好，但樹脂的吸附量又會降低，而本發明選擇50%乙醇溶解，使樹脂的吸附量不降低。本發明披露了80%乙醇溶液基本能把澤瀉三萜類化合物和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全的結果，本發明工藝中的洗脫溶液濃度選擇80%乙醇，因而本發明工藝基本能把澤瀉三萜類化合物和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全。本發明工藝綜合考慮澤瀉三萜類化合物含量和23-乙醯澤瀉醇B的含量兩個指標使本發明工藝更加合理，更加科學。實驗資料1儀器和試藥1.1儀器紫外-可見光分光光度計(UV-cary);精密電子分析天平(精確到十萬分之一AG285，METTLERTOLEDO)1.2試藥澤瀉購於武漢市漢口國藥有限公司，產於福建毫州，批號為071001。經華中科技大學同濟醫學院藥學院生藥教研室尹春萍教授鑑定為澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientalis(Sam.)Juz印.)的乾燥塊莖。乙醇、乙酸乙酯、高氯酸、冰醋酸、香草醛等試劑為分析純，乙腈為色譜純。對照品23-乙醯澤瀉醇B:由南京中醫藥大學提供，23-乙醯澤瀉醇B的製備方法參見[彭國平，潘林梅，文紅梅等.澤瀉的對照品研究[J].南京中醫藥大學學報.2001;17(3):154-156.]。經HPLC峰面積歸一法確認其純度大於98X，可供含量測定用。2方法和結果2.1樹脂的預處理樹脂先用乙醇充分浸泡，然後用乙醇洗至加適量水無白色混濁，再用純淨水洗至洗脫液無醇味，去醇後再進行酸鹼處理先用5%HC1(V/V)溶液浸泡3h，然後用去離子水洗至中性，接著用5%Na0H溶液浸泡3h，最後用去離子水洗至中性，最後用水浸泡備用。2.2三萜類成分的含量測定供試品溶液的製備稱取澤瀉粗粉80g，加入8倍量(V/V)50X的甲醇，回流提取三次，每次為1.5h。過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，加入100ml水分散，分別用100ml水飽和的乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥。將浸膏用50X乙醇400ml溶解，製備成上柱前的澤瀉供試品溶液，濃度相當於0.2g生藥/ml。對照品溶液的製備再精密稱取2.58mg乾燥至恆重的23-乙醯澤瀉醇B對照品，加色譜純乙腈溶解並定容至5ml，作為對照品溶液，濃度為0.516mg/ml。含量測定方法採用紫外-可見光分光光度計法進行測定。取3支具塞試管，一支試管作為空白管，另兩支分別精密加入對照品溶液和供試品溶液，水浴揮去溶劑，冷卻，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸，混勻，密塞。置60°C恆溫水浴中加熱20min，取出，冰水浴冷卻，分別加乙酸乙酯5ml，搖勻，室溫放置10min後，在554nm處測定吸光度。加入試劑的量如表1:表1加入試劑的量tableseeoriginaldocumentpage52.3靜態吸附實驗2.3.1大孔吸附樹脂的篩選精確稱取約1.0g抽濾至幹的預處理過的下列樹脂，置於250mL具塞磨口錐形瓶中，加lOOmL上述澤瀉供試品溶液，置於恆溫搖床上震蕩吸附24h，充分吸附後過濾，測定剩餘總三萜乙醇溶液中總三萜的濃度，計算各樹脂對總三萜的吸附容量(mg/g幹樹脂)。過濾後的樹脂精密加入80%乙醇100ml進行解吸附，解吸完過濾，紫外_可見光分光光度計法測定各濾液濃度，並計算解吸率。結果如表2:表25種大孔吸附樹脂對於澤瀉總三萜的靜態吸附效果tableseeoriginaldocumentpage5結論選擇HPD-100型，滿足Q最大，而且解吸率達到85%以上。2.4上樣流速對HPD-100型樹脂吸附的影響以相同濃度(0.2g/ml)及體積(150ml)的澤瀉供試品溶液，控制流速分別為0.5ml/min、1.0ml/min、1.5ml/min進行動態吸附，柱床體積(BV)為10ml。結果見圖1。從圖1可得，流速為2ml/min時，第1BV過柱液就發生洩漏，上樣11BV附近吸附速度明顯減緩；而流速為0.5ml/min，1.Oml/min時，第2BV過柱液開始檢測到總三萜，兩者均在上樣12BV時吸附緩慢，為使上樣液在樹脂間充分擴散，吸附，流速不宜過快，故選擇以1.0ml/min的流速上樣。2.5動態吸附曲線的考察取HPD-100型樹脂，溼法裝柱，柱床體積為10ml，取上述澤瀉供試品溶液以lml/min的速度上柱吸附，10ml樹脂共計吸附15BV的澤瀉供試溶液，每處理1BV收集過柱液，每次1BV，紫外法分別測定以上過柱液中總三萜的含量，動態吸附曲線結果見圖2。由圖2可見，HPD-100型樹脂吸附此濃度的供試品溶液，過柱洩漏點在第6BV，從第7BV開始洩漏已達30%以上。即10ml的HPD-100型樹脂達到過柱洩漏點對於總三萜的吸附量為108.48mg。2.6HPD-100型樹脂洗脫液的選擇按照上述實驗確定的最大上樣量，另取20g澤瀉，按供試品溶液的製備項下方法製備，所得澤瀉供試品溶液上樣於已處理的樹脂柱，以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類。再依次用濃度為10%，30%，50%，70%，80%，95%的乙醇溶液各150ml以2ml/min流速洗脫，分別用試管收集各乙醇洗脫液，收集溶液體積分別為(50ml，50ml，25ml，25ml)，各取1ml揮幹溶劑後作為樣品，測定澤瀉總三萜的含量，把剩下的各濃度洗脫液分別合併，減壓蒸餾並定容至10ml，進行HPLC-ELSD測定其23-乙醯澤瀉醇B的含量，結果見圖3和圖4。結果表明80%乙醇洗脫液對澤瀉三萜類化合物的洗脫效果最好，而且80%乙醇可將澤瀉中大約90%的三鵬類化合物洗脫下來，因此確定HPD-100型樹脂分離純化澤瀉總三萜的最佳洗脫溶劑為80%乙醇。操作步驟為上樣後，先以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類。再用濃度為30%的乙醇溶液洗脫水溶性雜質，然後用80%乙醇溶液以2ml/min流速洗脫，收集80%乙醇洗脫液。2.7洗脫溶劑用量的考察按照上述實驗確定的最大上樣量，將20g澤瀉所得供試品溶液上樣於已處理的樹脂柱，以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類。再以400ml30X乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，每100ml為一份，分別揮幹溶劑，乾燥稱重。然後以500ml80X乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，每100ml為一份，適當濃縮後，取適量分別用紫外和HPLC方法測定其中澤瀉總三萜和23-乙醯澤瀉醇B的含量，結果見表3，表4。表330%乙醇用量的考察tableseeoriginaldocumentpage6結果表明，採用HPD-100型樹脂，用300ml的30%乙醇溶液可以將20g澤瀉所得供試品溶液中的雜質基本洗脫乾淨，再用300ml的80%乙醇溶液可將澤瀉供試品溶液中總三萜成分包括23-乙醯澤瀉醇B基本洗脫完全。累積洗脫率達90%以上。3.澤瀉三萜類化合物提取純化工藝的驗證試驗稱取澤瀉粗粉80g，加入8倍量50%的甲醇，回流提取三次，每次為1.5h。過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，加入100ml水分散，分別用100ml水飽和的乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥。將浸膏用400ml50X乙醇溶解。得到濃度為0.2g生藥/ml的上柱液，分別以1.Oml/min的流速上樣於67ml體積的HPD-100樹脂柱，後以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類，再用1200ml的30%乙醇洗脫，然後用1200ml80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，紫外法和HPLC-ELSD法分別測定總三萜和23-乙醯澤瀉醇B含量，餘下溶液回收乙醇，得總固物，平行操作3份，計算總固物中三萜類化合物和23-乙醯澤瀉醇B的含量，結果見表5。表5澤瀉三萜類化合物提取純化工藝的驗證tableseeoriginaldocumentpage74.澤瀉總三萜提取純化工藝的概述步驟1:澤瀉粗浸膏的製備稱取澤瀉粗粉80g，加入8倍量50%的甲醇，回流提取三次，每次為1.5h。過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，即得澤瀉粗浸膏。步驟2:澤瀉浸膏精製澤瀉粗浸膏加入100ml水分散，分別用100ml水飽和的乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥，得到澤瀉精製浸膏。步驟3:澤瀉總三萜部位的製備將澤瀉精製浸膏用400ml50%乙醇溶解。得到濃度為0.2g生藥/ml的上柱液，分別以1.Oml/min的流速上樣於67ml體積的HPD-100樹脂柱，後以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類，再用1200ml的30%乙醇洗脫，然後用1200ml80X乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，紫外法和HPLC-ELSD法分別測定總三萜和23-乙醯澤瀉醇B含量，餘下溶液回收乙醇，得總固物，即為澤瀉總三萜部位。5.以下將採用大孔吸附樹脂分離中藥有效部位的傳統方法和本實驗所用方法作比較tableseeoriginaldocumentpage7本實驗通過對5種大孔吸附樹脂的吸附和解吸特性的比較，篩選出吸附澤瀉中三萜化合物的最佳樹脂，即HPD-100型大孔吸附樹脂，其他文獻未見相關報導。該樹脂屬於非極性樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯縮合而成，故又稱芳香族吸附樹脂，因具有比較大的孔，適用於大分子物質的吸附，且洗脫性良好，被吸附物可以容易地被洗脫下來，因此適用範圍廣泛，在醫藥食品領域評價很好。且經本實驗證明該樹脂對於澤瀉有效部位的純化作用優於其它樹脂。在應用大孔吸附樹脂分離純化中藥有效部位的傳統實驗中，上樣前的供試品多用蒸餾水溶解，本實驗採用50%乙醇溶解是因為澤瀉中所含三萜類化合物極性較小，不能用蒸餾水溶解上樣，若用濃度高的乙醇溶解，雖然三萜類化合物在濃度高的醇溶液中溶解度較好，但樹脂的吸附量又會降低，所以選擇50%乙醇溶解。洗脫溶液濃度選擇80%乙醇是因為80%乙醇溶液基本能把總三萜和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全，而綜合考慮總三萜含量和23-乙醯澤瀉醇B的含量兩個指標使該方法更加合理，更加科學。HPD-100型大孔吸附樹脂適合分離純化澤瀉中極性較小的三萜類成分。圖1為吸附流速與吸附量關係圖，從圖l可得，流速為2ml/min時，第1BV過柱液就發生洩漏，上樣11BV附近吸附速度明顯減緩；而流速為0.5ml/min，1.0ml/min時，第2BVB過柱液開始檢測到總三萜，兩者均在上樣12BV時吸附緩慢，為使上樣液在樹脂間充分擴散，吸附，流速不宜過快，故選擇以1.Oml/min的流速上樣。圖2為HPD-100型樹脂對澤瀉總三鵬的動態吸附曲線，由圖2可見，HPD-100型樹脂吸附此濃度的供試品溶液，過柱洩漏點在第6BV，從第7BV開始洩漏已達30%以上。即10ml的HPD-100型樹脂達到過柱洩漏點對於總三萜的吸附量為108.48mg。圖3為不同濃度乙醇中總三萜洗脫曲線，圖中14為10%乙醇洗脫液；58為30%乙醇洗脫液；912為50%乙醇洗脫液；1316為70%乙醇洗脫液；1720為80%乙醇洗脫液；2124為95%乙醇洗脫液。圖4為不同濃度乙醇洗脫液中23-乙醯澤瀉醇B洗脫曲線，圖中1為10%乙醇洗脫液；2為30%乙醇洗脫液；3為50%乙醇洗脫液；4為70%乙醇洗脫液；5為80%乙醇洗脫液；6為95%乙醇洗脫液。結果表明80%乙醇洗脫液對澤瀉三萜類化合物的洗脫效果最好，而且80%乙醇可將澤瀉中大約90%的三鵬類化合物洗脫下來，因此確定HPD-100型樹脂分離純化澤瀉總三萜的最佳洗脫溶劑為80%乙醇。操作步驟為上樣後，先以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類。再用濃度為30%的乙醇溶液洗脫水溶性雜質，然後用80%乙醇溶液以2ml/min流速洗脫，收集80%乙醇洗脫液。具體實施方式實施例1澤瀉總三萜提取純化工藝(1)製備澤瀉粗浸膏稱取澤瀉粗粉80g，加入8倍量50X的甲醇，回流提取三次，每次為1.5小時，過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，即得澤瀉粗浸膏；(2)精製澤瀉浸膏將製得的澤瀉粗浸膏加入100ml水分散，用100ml水飽和的乙酸乙酯萃取，萃取3次，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥，得到澤瀉精製浸膏；(3)澤瀉總三萜部位的製備將製得的澤瀉精製浸膏用50%乙醇400ml溶解，得到濃度為0.2g生藥/ml的上柱液，分別以1.Oml/min的流速上樣於67ml體積的HPD-IOO樹脂柱，後以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類，多糖和苷類，再用1200ml的30%乙醇洗脫，然後用80%乙醇1200ml洗脫，收集80%乙醇洗脫液，回收乙醇，得總固物，即為澤瀉三萜類化合物。實施例2應用大孔吸附樹脂對中藥澤瀉中三萜類化合物成分進行富集方法80g澤瀉所得浸膏用400ml50%乙醇溶解後，上樣於HPD-lOO型大孔吸附樹脂，充分吸附後，再用蒸餾水洗脫至molish反應呈陰性，然後用1200ml30X乙醇，1200ml80%乙醇依次洗脫，收集80%乙醇洗脫液，蒸乾溶劑，乾燥，即為所得。結果以23-乙醯澤瀉醇B為對照品計算，富集產物中總三萜類含量可達50%以上，23-乙醯澤瀉醇B含量可達1.29%以上。權利要求一種澤瀉三萜類化合物提取純化工藝，其步驟是(1)稱取澤瀉粗粉加入50％的甲醇，回流提取過濾，合併濾液，回收溶劑至浸膏狀，即得澤瀉粗浸膏；(2)將製得的澤瀉粗浸膏加入水分散，用水飽和的乙酸乙酯萃取，合併萃取液，回收溶劑得浸膏，乾燥，得到澤瀉精製浸膏；(3)將製得的澤瀉精製浸膏用50％乙醇溶解，製得到濃度為0.2g生藥/ml的上柱液，分別以1.0ml/min的流速上樣於67ml體積的HPD-100樹脂柱，後以蒸餾水洗至molish反應呈陰性，除去糖類、多糖和苷類，再用30％乙醇洗脫，然後用80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，回收乙醇，得總固物，即為澤瀉三萜類化合物。全文摘要本發明提供了一種澤瀉三萜類化合物的提取純化工藝，本發明通過對5種大孔吸附樹脂的吸附和解吸特性的比較，篩選出吸附澤瀉中三萜化合物的最佳樹脂，即HPD-100型大孔吸附樹脂。本發明分離純化工藝上樣前採用50％乙醇溶解，使樹脂的吸附量不降低，本發明披露了80％乙醇溶液基本能把澤瀉三萜類化合物和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全的結果，本發明工藝中的洗脫溶液濃度選擇80％乙醇，因而本發明工藝基本能把澤瀉三萜類化合物和23-乙醯澤瀉醇B洗脫完全。本發明工藝綜合考慮了澤瀉三萜類化合物含量和23-乙醯澤瀉醇B的含量兩個指標，使提取純化工藝更加合理，更加科學。文檔編號C07J75/00GK101724009SQ20081019731公開日2010年6月9日申請日期2008年10月23日優先權日2008年10月23日發明者尹春萍申請人:華中科技大學