新的黃病毒抗原的製作方法

2023-06-13 13:09:21 1

專利名稱：新的黃病毒抗原的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及能誘導對一種或多種登革病毒和/或其它黃病毒(flaviviruse)的免疫應答的多肽，編碼多肽的多核苷酸，製造和使用該多肽、多核苷酸的方法，以及應用該多肽和多核苷酸的診斷化驗。
背景技術：
黃病毒屬的病毒是黃病毒科家族中的正義、單鏈RNA病毒，其中許多與人類和其它哺乳動物的疾病有關。黃病毒的例子包括有蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒、聖·路易腦炎病毒、C型肝炎病毒和西羅尼病毒。黃病毒屬的黃病毒一般由三個主要的成熟結構蛋白構成包膜(E)蛋白、衣殼(C)蛋白和膜(M)蛋白。M蛋白通常為前膜(prM)(pre-memberane)蛋白的水解片段。參見例如FIELDS VIROLOGY 997-998，Raven Press，Ltd.，NewYork(D.M.Knipe等人編，2001年第4版)，996(下文中簡稱為「FIELDSVIROLOGY」)，和ENCYCLOPEDIA OF VIROLOGY(R.G.Webster等人編，Academic Press，1999年第2版)，在此以各種目的來引述它們作參考。
登革(dengue viruse)(DEN)病毒是黃病毒中已知的人類疾病的病因。登革病毒包含4種已知不同但抗原性相關的血清型登革-1(DEN-1或Den-1)，登革-2(DEN-2或Den-2)，登革-3(DEN-3或Den-3)和登革-4(DEN-4或Den-4)。登革病毒顆粒為典型的球形並且含有一個由脂雙層包裹的緻密核心(FIELDSVIROLOGY，同上)。
與其它黃病毒一樣，登革病毒的基因組典型地包括一段單鏈正義RNA多核苷酸(FIELDS VIROLOGY，同上，第997頁)。基因組RNA作為信使RNA將一段長開放讀碼框(ORF)翻譯為一個大的多聚蛋白，該多聚蛋白被細胞內蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶的共同作用下翻譯，並且在翻譯後加工為許多蛋白產物(同上)。這些產物包括結構蛋白和非結構蛋白。基因組N端部分編碼結構蛋白-C蛋白、prM(前膜)蛋白和E蛋白-是按以下順序進行C-prM-E(同上第998頁)。C蛋白的C端含有一個疏水區，該疏水區在prM蛋白轉移到內質網腔的過程中起到信號序列的作用(同上第998-999頁)。隨後prM蛋白被剪切為結構M蛋白，來自prM蛋白C末端的小結構蛋白，和極親水的N端「pr」片段，該部分將被分泌到細胞外間質中(同上第999頁)。E蛋白是膜蛋白，其C端部分含有跨膜區，該區域將E蛋白錨定在細胞膜上且作為信號序列轉移非結構蛋白(同上)。E蛋白是主要的病毒顆粒表面蛋白並且被認為是病毒顆粒中最具有免疫原性的成分。E蛋白可能與病毒受體互相作用，中和病毒感染性的抗體通常識別E蛋白(同上第996頁)。M蛋白和E蛋白的C端有跨膜片段，該片段能將蛋白錨定在膜上(同上第998頁)。
登革病毒主要通過埃及伊蚊(Aedes aegypti)傳染給人類的。登革熱感染對在熱帶區域居住或到訪熱帶區域的人造成了很大的威脅。事實上，大約有25億人居住在具有感染風險的區域並且每年有超過1億人受到感染。每年估計有大約20-25,000名兒童死於登革病毒的感染。
初次登革病毒感染在多數病例中臨床表現為登革熱(DF)，這是一種自限性的原纖維疾病。雖然很少致命，但是DF表現為經常性的嚴重的瀰漫的身體疼痛、頭疼、發熱、皮疹、淋巴結病和白細胞減少。隨後異種登革病毒的感染將導致更加嚴重甚至致命的疾病登革出血熱(DHF)或登革休克綜合症(DSS)。有假說認為初次感染的血清型病毒的抗體將在第二次感染中增強異種血清型病毒的感染。這種現象被稱為疾病的抗體依賴性增強(ADE)。
如何有效的診斷登革病毒通常是成問題的。全部四種登革病毒能夠在同一個地方流行，因此同時將患者的血清樣品對全部四種登革病毒血清型進行測試是很重要的。
現在對於登革病毒的感染沒有特效的治療方法。雖然過去50年內登革病毒疫苗的研製一直都在進行，但是還沒有生產出成功的登革病毒疫苗而且也無法獲得任何得到許可的登革病毒疫苗。主要的挑戰在於需要獲得一種能夠同時誘導產生針對全部四型登革病毒的中和抗體的四價疫苗，以避免當個體在遇到兩種或更多種不同的血清型時出現ADE。使用混合的DEN 1-4減毒病毒的疫苗策略是非常不成功的，因為一種類型的抗原將傾向於支配或「掩蓋」其它的抗原，所以產生針對四種類型而言不完全的免疫應答。
現在依然需要分子、組合物和方法來有效的診斷一種或更多登革病毒，誘導、增強或促進對黃病毒的免疫應答，尤其是對登革病毒，優選對所有四種血清型的登革病毒，並且預防性的或治療性的治療與一種或多種上述病毒相關的紊亂或疾病。本發明提供了這種分子、方法和組合物。本發明上述和其它的優點以及另外的發明特徵均能顯而易見的從本發明提供的描述中得出。
發明概述本發明提供了如下所述的新的重組、合成、突變和/或分離的多肽，含有這種多肽的融合蛋白以及編碼這種多肽和/或蛋白的核酸，這些用於促進(例如誘導和/或增強)對一種或更多黃病毒，尤其是一種或多種登革病毒的免疫應答，以及檢測或診斷一個生物樣品中是否存在至少對一種屬於黃病毒科家族的病毒(如黃病毒屬的成員)有抗性的抗黃病毒科病毒的抗體(如抗黃病毒抗體)，和/或至少對一種登革病毒具有抗性的抗登革病毒的抗體。
一方面，例如，本發明提供了重組、合成、突變和/或分離的多肽，其胺基酸序列中至少有大約80％，83％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的胺基酸序列與本發明的截短的重組、合成或突變登革病毒包膜(E)蛋白多肽，比如至少SEQ IDNOS1-49和153-155中的任意一個的胺基酸序列同一性。部分上述多肽能在體外或回體(ex vivo)細胞和/或在受試者體內或細胞或其組織內誘導受試者，如哺乳動物或哺乳動物細胞群對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少一種血清型的至少一種登革病毒或登革病毒抗原產生免疫應答。上述重組登革E蛋白多肽是「截短的」，這是因為與野生型(WT)登革病毒E蛋白的全長序列相比，其缺少全長E蛋白序列C端的一個或多個胺基酸殘基。通常截短的E蛋白缺少大約3％，5％，10％，15％或20％到大約25％的全長E蛋白C端胺基酸殘基。每個上述多肽含有具有免疫原性或抗原性的胺基酸序列，其能夠誘導對一種或多種血清型，優選多種(如2，3，4)血清型的一種或多種登革病毒或類病毒顆粒(virus-like particle)(VLP)或其抗原的免疫應答。一些上述多肽在表達到或傳輸到動物或動物細胞時能夠誘導對全部4種登革病毒血清型(四價免疫應答)或抗原的免疫應答。具有該特性的特殊多肽在表達到或傳輸到動物或動物細胞後能夠誘導出多種登革病毒血清型的登革病毒的中和抗體，優選的，能在受試者，比如哺乳動物如靈長類或人類中誘導對四種登革病毒血清型中至少一種的保護性免疫應答。更優選的，重組多肽能在受試者如哺乳動物中誘導對全部四種登革病毒血清型的保護性免疫應答。
本發明上述截短的E蛋白多肽誘導受試者產生的對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒或VLP或其抗原的免疫應答等於或強於分別在至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒中所說的野生型截短E蛋白誘導受試者產生的對至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒或VLP或其抗原的免疫應答，所說的野生型截短的E蛋白的胺基酸序列長度與本發明的重組、合成或變體多肽的長度基本相等。
上述每一重組、合成或變體多肽誘導產生與至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒結合的一種或多種類型的抗體。在本發明的一個方面，部分上述多肽誘導產生與至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒結合的抗體，其數量大致等於或大於相應的由至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的野生型截短的E蛋白所分別誘導產生的抗體數量。
本發明上述每一重組、合成或變體多肽誘導或產生了至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體效價。更進一步的，部分上述多肽誘導或產生的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體效價大致等於或大於相應的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的野生型截短的E蛋白所分別誘導產生的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體效價，其中上述每一野生型截短的E蛋白均選自SEQ ID NOS338-341。
部分上述重組、合成或變體多肽進一步包含(a)連接到重組或合成多肽的胺基酸序列N端上的至少約150個胺基酸殘基的胺基酸序列，其與SEQ IDNOS117-126中至少一個序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性；(b)連接到重組或合成多肽的胺基酸序列C端上的至少約40個胺基酸殘基的胺基酸序列，其與SEQ ID NOS127-136中至少一個序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性；或(c)胺基酸序列(a)和胺基酸序列(b)。
本發明還提供了一種重組、合成或突變的截短的或未截短的登革包膜蛋白，其中重組或合成多肽的編碼核酸所含有的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ ID NOS285-330的至少一個多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS285-330的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列有至少約70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的核苷酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下(under at least stringent condition)與基本上全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，能至少在嚴格條件下與基本上全長的(a)-(d)中多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意組合的(a)-(e)中多核苷酸序列特徵的多核苷酸序列；或其互補序列。
在另一方面，本發明提供分離的、重組的、合成的或突變的多肽，其包含的胺基酸序列與選自SEQ ID NOS65-116的至少一個序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性。每一上述多肽一般包含一個重組的、合成的或突變的登革病毒抗原，該抗原含有PRM15/截短的E多肽。上述PRM15/截短的E蛋白多肽包含第一個胺基酸序列，其在N端有一個蛋氨酸連接到重組、突變或合成的第二個胺基酸序列上，第二個胺基酸序列含有對應於重組、合成或突變的登革病毒prM蛋白C端大約最後15個胺基酸的大約15個胺基酸殘基。第二個胺基酸序列的C端依序連接到第三個序列的N端，該序列包含重組、突變或合成的截短的登革病毒(dengue virus)E蛋白。截短的E蛋白被認為是「截短的」，因為與WT全長登革病毒E蛋白相比，其在E蛋白C端缺少一個或多個胺基酸。截短的E蛋白包含大約75，80，85或90％的E蛋白，所述75，80，85或90％的E蛋白分別表示含有從N端第1個胺基酸開始約75，80，85或90％的蛋白長度的E蛋白部分。上述重組或合成的PRM15/截短的E多肽能誘導對至少一種血清型的至少一種登革病毒或VLP或抗原的免疫應答。
一些上述PRM15/截短的E多肽誘導受試者對一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或強於由從該登革病毒血清型中獲得的PRM15/截短的E多肽在哺乳動物中所誘導的對同一種血清型的同一種登革病毒的免疫應答。一些上述PRM15/截短的E多肽誘導的受試者對屬於兩種不同血清型的至少兩種登革病毒中每種的免疫應答大約等於或強於由從所述兩種登革病毒血清型中任一個獲得的PRM15/截短的E多肽所誘導的受試者對上述屬於不同血清型的兩種登革病毒中每種的免疫應答。一些上述PRM15/截短的E多肽誘導的對屬於三種不同血清型的至少三種登革病毒中每種的免疫應答大約等於或強於由從所述三種登革病毒血清型中任一個獲得的PRM15/截短的E多肽所誘導的該細胞對上述屬於三種不同血清型的三種登革病毒的免疫應答。一些上述PRM15/截短的E多肽誘導的對屬於四種不同血清型的至少四種登革病毒中每種免疫應答大約等於或強於由從所述四種登革病毒血清型中任一個獲得的PRM15/截短的E多肽所誘導的該細胞對上述屬於四種不同血清型的四種登革病毒的免疫應答。在一方面，WTPRM15/截短的E蛋白多肽選自於SEQ ID NOS149-152。
PRM15/截短的E多肽能夠誘導產生大量的抗體，包括一種或多種類型的抗體，其與至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒結合。部分上述多肽所誘導產生的與至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒結合的抗體的數量，大約等於或超過了至少1，2，3或4種血清型中每種野生型PRM15/截短的E蛋白多肽所能誘導的抗體的數量。
進一步的，重組、合成或突變的PRM15/截短的E多肽所誘導產生抗體與相應的至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的野生型PRM15/截短的E多肽所分別誘導的抗體相比，其能夠更加特異性的與至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒結合，其中每種野生型PRM15/截短的E多肽均選自SEQ ID NOS149-152。
在一方面，重組、合成或突變的PRM15/截短的E多肽誘導對至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒有抗性的中和抗體的效價的產生。在特定的方面，部分該重組、合成或突變的PRM15/截短的E多肽所誘導產生的對至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒有抗性的中和抗體的效價大約等於或超過了相應的至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的野生型PRM15/截短的E蛋白多肽(「WT PRM15/截短的E融合蛋白」)所分別誘導受試者產生的對相應的至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒有抗性的中和抗體的效價，其中所述WT PRM15/截短的E多肽均選自SEQ ID NOS149-152。例如，SEQ ID NO149的序列包含以下胺基酸序列蛋氨酸作為首個胺基酸殘基，來自WT DEN-1的prM序列的C端的最後15個胺基酸，以及DEN-1包膜蛋白的截短的胺基酸序列，其被稱為「截短的」是由於其從DEN-1包膜蛋白C端除去了許多胺基酸殘基。例如，在一個實施方案中，Den-1的E蛋白C端胺基酸殘基中有大約11-14％(優選大約13％)被去除了。
本發明還提供重組、合成或突變的PRM15/截短的E多肽，其中編碼每個多肽的核酸所含有的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ ID NOS156-200，235，342和344的至少一個多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS156-200，235，342和344的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，能至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(d)中的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意組合的(a)-(e)中多核苷酸序列特徵的多核苷酸序列。
在另一方面，本發明提供重組、合成、突變和/或分離的多肽，其包含的胺基酸序列與選自SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345的至少一個序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性。每一上述多肽一般包含一個重組的、合成的或突變的登革病毒抗原，該抗原包含的的融合多肽含有C15/全長prM蛋白/全長E蛋白。C15/全長prM蛋白/全長E蛋白多肽誘導受試者對至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答。進一步，對部分上述多肽，對至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過相應的至少1，2，3或4種血清型中每種的野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽所分別誘導的上述細胞對至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答，其中相應的野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白選自SEQ ID NOS227-230。
對於上述一些C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白，免疫應答包括產生能結合至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的抗體。此外，部分上述多肽所誘導產生的能結合至少1，2，3或4種血清型中每種至少一種登革病毒的抗體大約等於或超過相應的至少1，2，3或4種血清型中每種的野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽所分別誘導的抗體，其中野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白選自SEQ ID NOS227-230。
在另一方面，本發明部分上述C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽誘導或產生至少一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體效價。更進一步的，部分上述多肽在受試者中誘導或產生的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體效價大約等於或超過了相應的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽所分別誘導或產生的至少一種、兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的中和抗體的效價，其中上述每一野生型C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽均選自SEQ ID NOS227-230中。
發明還提供重組、合成或突變的C15/全長prM蛋白/全長E融合蛋白多肽，其中編碼每個多肽的核酸所含有的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ IDNOS201-210，254-271，342和344的至少一個多核苷酸序列有至少約80％，85％，90％，93％，95％，98％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS201-210，254-271，342和344的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，能至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(d)中的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意組合的(a)-(e)中多核苷酸序列特徵的多核苷酸序列。
在另一方面，本發明提供的組合物含有至少一種本發明所述的重組、突變、合成和/或分離的多肽或核酸以及賦形劑或載體，包括藥學藥學上可接受的載體或賦形劑。
在一方面，本發明提供的組合物含有至少一種重組、突變、合成和/或分離的多肽，該多肽包含選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的胺基酸序列，或相應的抗原性或免疫原性多肽片段，其誘導的受試者對至少一種病毒血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗原性或免疫原性多肽所誘導的免疫應答；以及賦形劑或載體。
在另一方面，本發明提供分離、重組、突變或合成的核酸所含有的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ ID NOS211-218的序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)與所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS211-218的DNA序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；與(c)至少在嚴格條件下與基本全長的(a)或(b)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列，或其互補序列。
在另一方面，本發明包括的分離、重組、突變或合成的核酸序列包含的多核苷酸序列選自(a)核苷酸序列與選自SEQ ID NOS285-330的序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NOS1-49和153-155的多肽的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(c)與所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS285-330的DNA序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下與基本全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(d)中的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)與選自SEQ ID NOS285-330的至少一個多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列編碼的多肽所誘導的受試者對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型截短的包膜(E)蛋白所誘導的受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，其中所述野生型截短的E蛋白選自SEQ IDNOS338-341；以及(g)具有任意組合的(a)-(f)中多核苷酸序列特徵的多核苷酸序列。發明提供的組合物包含賦形劑或載體和至少一種本發明的核酸，包括例如至少一個符合上述(a)-(g)中任一規定的多核苷酸序列。
還提供分離、重組、突變和/或合成的核酸，其包含的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ ID NOS156-200，235，342和344的序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NOS65-116的多肽的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(c)與所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS156-200，235，342和344的DNA序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下與基本全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(d)中的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)與選自SEQ ID NOS156-200，235，342和344的至少一個多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段，或其互補多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列或相應片段編碼的多肽所誘導的受試者對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型截短的包膜(E)蛋白所誘導的受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，其中所述野生型截短的E蛋白選自SEQ ID NOS149-152；以及(g)具有任意組合的(a)-(f)中序列特徵的多核苷酸序列。
在另一方面，本發明提供分離、重組、突變和/或合成的核酸，其包含的多核苷酸序列選自(a)與選自SEQ ID NOS201-210，254-271，342和344的序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ IDNOS139-148，236-253，343和345的多肽的多核苷酸序列或其互補多核苷酸序列；(c)與所有的胸腺嘧啶核苷酸殘基均被替換為尿嘧啶核苷酸殘基的選自SEQ ID NOS201-210，254-271，342和344的DNA序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互補RNA多核苷酸序列；(d)至少在嚴格條件下與基本全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)排除遺傳密碼的簡併性，至少在嚴格條件下與基本上全長的選自(a)-(e)中的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)與選自SEQ ID NOS201-210，254-271，342和344的至少一個多核苷酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段，或其互補多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列或相應片段編碼的多肽所誘導的受試者對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過至少一種血清型的至少一種登革病毒的WT截短的包膜(E)蛋白所誘導的受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，其中所述WT截短的E蛋白選自SEQ ID NOS227-230；以及(g)具有任意組合的(a)-(f)中多核苷酸序列特徵的多核苷酸序列。
上述多肽和編碼該多肽的多核苷酸的其它優點包括能夠誘導受試者，如包括哺乳動物在內的動物或相應的細胞對一種或多種登革病毒，優選對多病毒血清型的登革病毒的保護性免疫應答。上述多肽令人滿意的特性包括如本文所述的對比於野生型登革病毒蛋白，包括例如C15/全長prM/全長E融合蛋白、全長prM/全長E融合蛋白、PRM15/截短的E蛋白多肽、PRM15/全長E融合蛋白、全長E或截短E蛋白和/或上述多肽的一個或多個片斷，該多肽顯示出更高的表達、更高的分泌和/或更多或更具特異性的抗體。
本發明進一步提供包含本發明前述多核苷酸的融合蛋白；包含一個或更多條本發明多核苷酸的載體；包含上述多肽、載體、多核苷酸和融合蛋白的細胞；以及包含上述多肽、多核苷酸、載體、融合蛋白和/或細胞的藥學組合物。本發明提供的示範載體包括病毒載體，包括例如黃病毒載體(包括例如用本發明的多核苷酸替代至少一部分編碼C15/全長prM/全長E融合蛋白、全長prM/全長E融合蛋白、PRM15/截短的E蛋白多肽、PRM15/全長E融合蛋白、全長E或截短E蛋白和/或相應片斷的黃病毒(flaviviruse)載體基因組的減毒黃病毒載體)和核酸載體，例如質粒載體pMaxVax10.1(描述於實施例1中並且顯示於圖1和2中)，發明人構建的該載體是一種在哺乳動物宿主中有效的基因傳輸載體。
關於多核苷酸，例如，本發明進一步提供的多核苷酸，其含有至少約1200個核苷酸的核酸序列，該序列與SEQ ID NOS285-330中的至少一個有至少約65％，75％，80％，85％或90％的核酸序列同一性，以及與上述多核苷酸雜交的多核苷酸和含有該核酸序列互補序列的多核苷酸。在另一方面，本發明提供核酸，其含有至少約1200個核苷酸的序列，該序列與SEQ IDNOS211-214中的至少一個有至少約65％，75％，80％或90％的核酸序列同一性。
本發明還提供通過給予本發明所述多肽、融合蛋白、多核苷酸、載體或細胞從而促進(誘導和/或增強)受試者(例如動物，如哺乳動物)對登革病毒的免疫應答的方法。在部分上述方法中，給予本發明的免疫原性或抗原性多肽(優選的，例如誘導對多病毒血清型的一種或多種登革病毒的中和抗體應答的多肽)到受試者中後，在一定的時間間隔下繼續重複給藥，從而導致加強的免疫應答。這種「加強式(boosting)」的給藥策略有效的適用於本發明多核苷酸(例如預防或治療性的應用編碼免疫原的多核苷酸(例如DNA疫苗))的給藥，優選隨後進行附加的本發明所述的編碼免疫原或抗原的多核苷酸和/或本發明的免疫原性或抗原性多肽的繼續給藥。
在另一方面，本發明提供包含至少含有兩個重組或合成核酸的庫所構成的組合物，該庫是通過重組至少一個含有選自SEQ ID NOS211-214序列的第一核酸和至少一個第二核酸以構建重組或合成核酸庫的方法所獲得的，其中第一和第二核酸相互間有兩個或更多的核苷酸不同。
本發明還包括包含核酸庫的組合物，該庫是通過重組至少一個含有選自SEQ ID NOS215-218的序列的第一核酸和至少一個第二核酸以構建重組或合成核酸庫的方法所獲得的，其中第一和第二核酸相互間有兩個或更多的核苷酸不同。
在另一方面，發明提供能特異性結合由針對至少一種抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一種抗原包含選自SEQ ID NOS1-49和153-155的胺基酸序列或相應的抗原性或免疫原性片斷，其中所述相應的抗原性或免疫原性多肽片段所誘導的受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗原性或免疫原性多肽片斷誘導受試者所產生的免疫應答，其中多克隆抗血清被消減至少一個選自SEQ ID NOS338-341的截短的包膜蛋白和含有已知的野生型截短登革病蛋白序列的截短的包膜蛋白，或對應於已知野生型登革病毒E蛋白的多肽序列的胺基酸序列片斷，其中所述胺基酸序列片斷具有長度基本等同於(例如至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％或94％，和更加優選至少約95％(如約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)SEQ ID NOS338-341中任一個的截短包膜蛋白。
本發明還提供能特異性結合由針對至少一種抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一種抗原包含選自SEQ ID NOS65-116中的胺基酸序列，其中多克隆抗血清被消減至少一個選自SEQ ID NOS149-152的PRM15/截短的包膜蛋白和其它含有已知登革病毒PRM15/截短的包膜蛋白的胺基酸序列。
本發明還提供能特異性結合由針對至少一種抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一種抗原包含選自SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345中的胺基酸序列，其中多克隆抗血清被消減至少一個含有選自SEQ IDNOS227-230的C15/全長prM蛋白/全長E蛋白的融合蛋白和其它包含已知登革病毒C15/全長prM蛋白/全長E蛋白PRM15/截短的包膜蛋白的胺基酸序列。
本發明還包括通過給予本發明截短的E多肽到受試者所產生的抗體或抗血清，該抗體或抗血清特異性結合至少一種抗原，所述至少一種抗原包含含有選自SEQ ID NOS1-49和153-155中的至少一個胺基酸序列的多肽，該抗體或抗血清不能特異性結合以下一種或多種多肽SEQ ID NOS338-341的多肽和含有已知野生型截短登革病毒蛋白序列的截短的包膜蛋白，或對應於已知野生型登革病毒E蛋白的多肽序列的胺基酸序列片斷，其中所述胺基酸序列片斷具有長度基本等同於(例如至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％或94％，和更加優選至少約95％(如約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)SEQ ID NOS338-341中任一個的截短包膜蛋白。
在另一方面，本發明提供通過給予本發明截短的E多肽到受試者所產生的抗體或抗血清，該抗體或抗血清特異性結合至少一種抗原，所述至少一種抗原包含含有選自SEQ ID NOS65-116中的至少一個胺基酸序列的多肽，該抗體或抗血清不能特異性結合以下一種或多種多肽選自SEQ IDNOS149-152的PRM15/截短的包膜蛋白和其它含有已知登革病毒PRM15/截短的包膜蛋白的胺基酸序列。在又另一方面，本發明提供通過給予本發明截短的E多肽到受試者所產生的抗體或抗血清，該抗體或抗血清特異性結合至少一種抗原，所述至少一種抗原包含含有選自SEQ ID NOS139-148，235-253，343和345的至少序列的多肽，該抗體或抗血清不能特異性結合以下一種或多種多肽含有選自SEQ ID NOS227-230的C15/全長prM蛋白/全長E蛋白的融合蛋白和其它含有已知登革病毒C15/全長prM蛋白/全長E蛋白PRM15/截短的包膜蛋白的胺基酸序列。
本發明還包括藥物組合物，其包含至少一種本發明的多肽(或至少一種本發明的多核苷酸)，以及藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，其中該至少一種多肽(或多核苷酸)在數量上足以有效的提供受試者對至少1、2、3或4登革血清型的至少一種登革病毒的保護性免疫。
本發明還包括藥物組合物，其包含至少一種本發明的多肽(或至少一種本發明的多核苷酸)，以及藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，其中該至少一種多肽(或多核苷酸)在數量上足以有效的誘導對至少一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型的至少一種登革病毒的免疫應答(例如特異性的免疫應答)和/或提供受試者對至少一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型的至少一種登革病毒的保護性免疫。
在另一方面，本發明提供疫苗，其包含在數量上足以有效的提供受試者對至少一種、兩種、三種或四種病毒血清型的至少一種登革病毒的保護性免疫的至少一種本發明的多肽(或本發明的多核苷酸)，以及以及藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
還提供在受試者中產生針對至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的方法，其包括給予受試者至少一種本發明的核酸或多肽或兩者的組合。也包括產生一種或多種能結合至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的方法，其包括給予細胞群有效量的本發明的多肽和/或核酸，或任一的或兩者的組合物，從而導致細胞產生一種或多種結合至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體。
本發明進一步提供在受試者中產生針對至少一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型中每種至少一種登革病毒的保護性免疫應答的方法，其中方法包括給予受試者足夠有效量的至少一種本發明的核酸以產生保護性免疫應答來抵抗相應的至少一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型中每種至少一種登革病毒的侵襲。對於部分上述方法，免疫應答是保護性抗體應答，即當所述至少一種核酸表達的時候，在受試者中產生足夠水平的至少一種、兩種、三種或四種血清型中每種至少一種登革病毒的抗體從而產生保護性免疫應答以抵抗相應的至少一種、兩種、三種的四種登革病毒血清型中每種至少一種登革病毒的侵襲在另一方面，本發明提供誘導受試者，如哺乳動物，對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答的方法，該方法包括給予受試者有效劑量的至少一種本發明的多肽，或有效劑量的相應組合物，或同時包括兩者。本發明還提供誘導受試者對至少一種血清型的至少一種病毒的免疫應答的方法，該方法包括給予受試者有效劑量的至少一種本發明的核酸，或有效劑量的相應組合物，或同時包括兩者。所述有效劑量通常指免疫原或抗原的劑量能夠方便的誘導出保護性免疫應答或進行治療性或預防性的處理。
另外，本發明提供促進受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答的方法，該方法包括引入至少一種本發明核酸或多肽到細胞群並且傳輸(例如植入)該細胞到受試者中。在引入核酸或多肽前，細胞群最初可以從受試者中獲得。
在另一方面，本發明提供靶核酸，排除遺傳密碼的簡併性，該核酸能至少在嚴格條件下與唯一的編碼寡核苷酸雜交，該寡核苷酸能夠編碼選自SEQID NOS65-116的多肽的唯一亞序列，其中唯一亞序列是指與已知的登革病毒抗原包膜多肽、選自SEQ ID NOS149-150的任一多肽或由任一SEQ IDNOS231-234編碼的多肽比較而言是唯一的。
在另一方面，本發明提供重組或合成的多肽，其包含有與含有選自SEQID NOS236-253的至少一個多肽序列的多肽片斷的胺基酸序列至少有約90％的胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中該多肽片斷不包含從SEQIDS236-253中選出的多肽的前16個胺基酸殘基，並且其中重組或合成的多肽所誘導的受試者或受試者細胞對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了相應的選自SEQ ID NO338，339，340和341的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的野生型包膜(E)蛋白所誘導的受試者或相應細胞對至少兩種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。
還包括重組或合成的多肽，其包含與選自SEQ ID NOS1-49和153-155至少一個的胺基酸序列至少有約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中重組或合成多肽所誘導的受試者或相應的細胞群對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了相應的每個上述的至少一種登革病毒的WT E蛋白所誘導的免疫應答，其中所述WT E蛋白的胺基酸序列長度基本上等於或相當於重組或合成的多肽。
在另一方面，本發明提供重組或合成多肽，其包含與選自SEQ IDNOS1-49和153-155至少一個的胺基酸序列至少有約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中重組或合成多肽所誘導的受試者，如哺乳動物或相應的細胞，對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了相應的每個登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的WT截短的E蛋白所誘導的受試者或相應細胞對選自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答，其中所述WT截短的E蛋白的胺基酸序列長度基本上等於或相當於重組或合成多肽的胺基酸序列。
在又另一方面，本發明提供重組或合成多肽，其包含與選自SEQ IDNOS65-116至少一個的胺基酸序列至少有約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中重組或合成多肽所誘導的受試者或相應的細胞群，如哺乳動物或相應的哺乳動物細胞群，對選自DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過了相應的每個DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的WT PRM15/截短的E蛋白所誘導的受試者(例如哺乳動物或哺乳動物細胞群)對所述至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答，其中每條所述WT PRM15/截短的E蛋白多肽均選自SEQ ID NOS149-152。
本發明進一步提供重組或合成多肽，其包含與選自SEQ IDNOS139-148，236-235，343和345的至少一個的胺基酸序列至少有約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列，其中重組或合成的多肽所誘導的受試者或相應細胞群對選自DEN-1、-2、-3和-4病毒的至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答大約等於或超過所述至少兩種血清型中每種的WT C15/全長prM/全長E融合蛋白所誘導的哺乳動物細胞對至少兩種血清型的每種至少一種登革病毒的免疫應答，其中所述WT C15/全長prM/全長E融合蛋白選自SEQ IDNOS227-230。
還包括由至少兩條本發明重組或合成多肽所構成的蛋白集合體。該蛋白聚合物包括本發明多肽的二聚物、三聚物等以及其它多聚物，其中多肽不需要是同源的。
包括含有至少兩條本發明的多肽的類病毒顆粒，其中多肽不需要是同源的。部分上述類病毒顆粒由選自重組、變異或合成的多肽的至少兩條多肽所構成。部分上述類病毒顆粒由編碼至少兩條本發明多肽的一個或更多的核酸的表達產物所構成。
還提供病毒，例如減毒病毒，其包含至少下述之一(1)本發明的核酸；(2)本發明的多肽；和/或(3)本發明的載體。病毒可包括用本發明的核酸、多肽和/或載體修飾過的黃熱(YE)病毒。還包括含有登革病毒(例如DEN-2或DEN-4)的嵌合病毒，其中包含至少一個本發明多肽以分別替換或加上全長或截短的E蛋白、登革病毒全長prM蛋白或其片斷(例如PRM15)和/或含有天然登革病毒C15/全長prM/全長包膜蛋白的登革病毒融合蛋白。還包括減毒或複製缺陷型嵌合黃病毒(例如登革病毒或YF病毒)或腺病毒，其包含至少一個本發明的核酸或多肽以分別替代黃病毒或腺病毒中相應的核酸或多肽。
還提供DNA或RNA構建體或活的嵌合重組黃病毒，所述DNA或RNA構建體或嵌合重組黃病毒包含將編碼本發明重組蛋白(例如PRM15/截短E，C15/全長prM/全長E，或prME蛋白)的第一核酸區可操作的連接於編碼黃病毒(例如YF病毒或DEN-2、DEN-4)非結構蛋白的第二核酸區。
發明還包括整合系統，其包含存儲有含有至少一個序列記錄的資料庫的計算機或計算機可讀介質，每一上述至少一個序列記錄包括至少一個對應於選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少一個多肽序列或選自SEQ ID NOS156-210，235，254-271，285-330，342和344的核酸序列的字符串，整合系統進一步包括用戶輸入界面，其使得用戶能夠有選擇的顯示上述的至少一個序列記錄。
還提供用計算機系統顯示資料庫中大量序列記錄中至少一個的有關信息的方法，每一序列記錄包括對應SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-210，235-271，285-330，342-345的至少一個字符串，方法包括(a)確定對應SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-210，235-271，285-330，342-345或相應亞序列的至少一個字符串的列表；(b)確定用戶所選擇的列表中的所述至少一個字符串；以及(c)顯示每一選擇的字符串，或用附加的字符串排列每一選擇的字符串。
本發明進一步提供改良的或新的方法或技術以檢測和/或診斷樣品中(包括例如生物樣品，如從受試者例如有登革病毒感染風險的動物包括如哺乳動物如人類中獲得的血清樣品)對一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型的抗體的存在。本發明還提供方法或技術以同時檢測和/或診斷單個樣品中對一種、兩種、三種或四種登革病毒血清型的抗體的存在。本發明的多肽和編碼其的核酸能用於檢測或診斷生物樣品中上述抗體的存在。方便的，含有僅僅10μl轉染了本發明多核苷酸的細胞培養物上清液的組合物能夠用作均一且合適的底物以同時診斷或檢測樣品，例如生物樣品，如從受試者，如人類等有登革病毒感染風險的哺乳動物中獲得的樣品中對全部四種血清型的登革病毒的抗體。生物樣品能夠為例如從受試者中獲得的血清樣品。
在另一方面，本發明提供方法以診斷樣品或檢測樣品中一種或多種結合至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的存在，方法包括(a)在一定條件下將樣品與至少一種本發明的多肽接觸，這樣如果樣品含有一種或多種能結合一種登革病毒的抗體，至少一種抗登革病毒抗體將結合到至少一種多肽上形成混合組合物；(b)將該混合組合物與至少一種能結合抗登革病毒抗體的親合分子接觸；(c)從混合組合物中除去沒有結合的親合分子；並且(d)診斷或檢測是否存在一種或多種親合分子，其中存在一種或多種親合分子表明樣品中存在一種或多種結合至少一種登革病毒的抗體。
另外，本發明提供方法以診斷樣品或檢測樣品中至少一種結合至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的存在，所述方法包括(a)在一定條件下將樣品與至少一種本發明的多肽接觸，這樣如果樣品含有一種或多種能結合登革病毒的抗體，至少一種抗登革病毒抗體將結合到至少一種多肽上形成至少一種抗體-多肽複合體；並且(b)診斷或檢測是否存在至少一種抗體-多肽複合體，其中存在至少一種抗體-多肽複合體表明樣品中存在至少一種結合登革病毒的抗體。
本發明還提供生產上述核酸和多肽的方法。一般的，本發明多核苷酸可以方便的通過標準核酸合成技術(如聚合酶鏈式反應(PCR)-易化重疊核酸裝配)獲得。然而本發明還提供使所選本發明核酸進行遞歸的序列重組的方法以及適當的篩選技術以產生和識別新登革抗原編碼核酸。製造本發明多肽的方法包括體外、體內或回體(ex vivo)用本發明的多肽和/或載體轉染或感染細胞，外加標準的合成蛋白合成技術。
本發明提供的大量可選的、附加的和/或更加特別多核苷酸、多肽、融合蛋白、病毒、載體、細胞、細胞培養物、組合物、轉基因動物、透皮碎片(transdermal patches)、使用本發明核酸和/或多肽的方法、由本發明提供的診斷和檢測化驗、方法和技術均將在下面闡明。


圖1為典型的pMax Vax 10.1載體的示意圖。
圖2圖解說明了一個pMaxVax10.1載體的例子，其中含有編碼含有野生型DEN-2病毒的PRM15信號肽/截短的E蛋白的融合蛋白的核酸插入片斷。pMax Vax10.1載體同樣也可以由編碼含有WT DEN-1、DEN-3或DEN-4病毒的PRM15信號肽/截短的E蛋白的融合蛋白或其變體的核酸構建，其替代編碼WT DEN-2病毒的PRM15信號肽/截短的E蛋白的核酸序列(如圖2所示)。如下面所詳述的，DEN-2聚蛋白(polyprotein)的截短的E蛋白所包含的多肽序列中含有DEN-2E蛋白從E蛋白N端開始按序列順序的約90％的連續胺基酸殘基。「截短的E蛋白」被縮寫為「tE」或「tE蛋白」。本發明還提供pMaxVax10.1載體，其包含本發明中編碼本發明的重組或合成的登革病毒抗原的核酸；該核酸在如圖2所示編碼DEN-2PRM15/截短的E蛋白多肽同樣的位置類似的插入pMaxVax10.1載體中。
圖3顯示了登革病毒抗原的蛋白質印跡，每個包含PRM15信號多肽/截短的(t)E蛋白，其由轉染了以下載體之一的293細胞在溶菌液(L)中表達並且分泌到培養基上清液(SN)中pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO，pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO，pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO。硝酸纖維素膜結合蛋白與鼠腹水中對DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的抗體共同孵育。
圖4包括一系列斑點印跡，其是通過FACS分析由pMaxVax10.12/7載體或pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO載體轉染並且分別與小鼠抗DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的抗血清共同孵育的293細胞獲得。
圖5為pMaxVax10.1 DNA載體表達的本發明的重組PRM15/截短的E登革病毒抗原的蛋白印跡，與具有pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO載體所表達的野生型(wt)胺基酸序列的PRM15/截短的E抗原相比，能與DEN-1、DEN-3和DEN-4鼠抗血清和合適的第二抗體結合。從通過遞歸序列重組(recursive sequence recombination)所獲得的重組庫中的重組核酸裡篩選和選擇編碼這些重組PRM15/截短的E登革病毒抗原的核苷酸。在圖中，字母「C」表示對照載體以及代表通過用不包含登革病毒核酸的pMaxVax10.1null載體轉染293細胞所獲得的數據。
圖6顯示通過ELISA分析從鼠中獲得的抗血清所得到的光密度(OD)值，每隻鼠均被注射了含有用ELISA從重組核酸的庫中識別的典型的重組(例如改組的)核酸序列的pMaxVax10.1載體，其由滅活的DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4包被。術語「WT」表示pMaxVax10.1載體，其包含編碼野生型DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4聚蛋白各自PRM15/截短的包膜蛋白的核酸序列。對照載體包含沒有任何登革病毒核酸序列的pMaxVax10.1null載體(表示為「pMV」)。
圖7顯示抗血清ELISA OD值的比較結果，該抗血清從注射了含有親代登革病毒PRM15/tE核酸(編碼WT DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4多肽序列)或挑選出的典型的編碼重組PRM15/tE登革病毒抗原(Ag)的重組PRM15/tE核酸的pMaxVax10.1載體的鼠血中獲得。還顯示了使用從注射了四種pMaxVax10.1載體混合物的鼠中獲得的抗血清所獲得的結果，每種載體包含編碼四種WT DEN-1PRM15/tE、DEN-2PRM15/tE、DEN-3PRM15/tE和DEN-4PRM15/tE抗原之一的核酸序列(例如pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO)。對照(「pMV」)是不含親代或重組PRM15/tE核酸的pMaxVax10.1載體。
圖8A顯示第76天小鼠血清的交互50％蝕斑減少中和滴度(50％ plaquereduction neutralization titer)(PRNT)的結果，該小鼠在第0天初次注射含有四種WT DEN-1PRM15/tE、DEN-2PRM15/tE、DEN-3PRM15/tE和DEN-4PRM15/tE抗原中任一種，或這四種野生型抗原混合物，或對應抗原18E9、18D7、16G11、18H2、16B4、6E12、2G11、2/7、15D4和18H6之中一種的本發明的重組核酸序列的典型pMaxVax10.1DNA質粒載體。圖8B顯示第76天小鼠血清的交互50％蝕斑減少中和滴度的結果，該小鼠在第0天初次注射含有C15/全長prM/全長E抗原形式的四種WT DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4抗原中的任一種，或這四種野生型抗原混合物，或對應C15/全長prM/全長E抗原5/21-D1、2G11-D4和6E12-D4之中一種的本發明的重組核酸序列的典型pMaxVax10.1DNA質粒載體。
圖9顯示本發明九種分泌重組登革病毒多肽抗原的蛋白質印跡分析，每一種由本發明的重組多核苷酸編碼，其在體內誘導對至少兩種登革病毒血清型的野生型登革病毒的中和抗體應答。「E」表示包膜蛋白，印跡中向右的箭頭表示E蛋白在印跡上的位置。對每個重組抗原，顯示了抗原誘導的抗體應答所中和的不同血清型的數量。PRNT結果顯示在圖8A和8B中。
圖10提供通過ELISA分析從小鼠中獲得的抗血清所獲得的OD圖，其中每個小鼠均注射了含有重組核酸序列的pMaxVax10.1載體。重組核酸序列是通過人密碼子優化編碼的登革病毒序列(例如SEQ ID NOS215-218)的遞歸序列重組所獲得的。每個上述重組核酸序列編碼的重組登革病毒抗原具有以下的形式C15信號序列/全長prM蛋白/全長E蛋白。pMaxVax10.1null載體(「pMV」)作為對照載體。
圖11顯示由本發明重組核酸編碼的本發明典型重組PRM15/截短E登革病毒抗原的胺基酸序列的序列多樣性分析(例如嵌合狀態)結果，其與親代WT DEN-1PRM15/tE、WT DEN-2PRM15/tE、WT DEN-3PRM15/tE和WTDEN-4 PRM15/tE蛋白的序列相比較。該分析證實這些重組抗原包括全部四種親代WT蛋白序列的胺基酸碎片或片段，並因此構成了上述親代序列的嵌合體。
圖12用圖表顯示用本發明的重組pMaxVax10.1載體免疫後的小鼠在用DEN-2病毒激發超過28天後存活下來的比例。在該實驗中，重組pMaxVax10.1載體包含本發明下述三條重組PRM/tE核酸序列中的一個以及這三條核酸序列的混合SEQ ID NOS235(18H6)，SEQ ID NOS204(2G11-D4)和SEQ ID NOS202(6E12-D4)。作為比較，部分小鼠注射了含有WT DEN-2PRM15/tE核酸序列和WT DEN-2 C15/全長prM/全長E或WT DEN-3C15/prM/全長E核酸序列，以及全部四種DEN-1-4 WT PRM15/tE和C15/全長prM/全長E的混合物的pMaxVax10.1載體。注射PBS或pMaxVax10.1null載體的小鼠作為對照小鼠。
圖13A和13B顯示10μl到100μl轉染了本發明典型核酸(例如5/21(SEQID NO157)、2/7(SEQ ID NO156)、6E12(SEQ ID NO159)和2G11(SEQ IDNO157)的293細胞的上清液在與小鼠DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4抗血清反應時的斑點雜交。
圖14為顯示野生型登革病毒基因和相應編碼的登革病毒結構蛋白(衣殼，prM和E蛋白)的示例圖。
圖15A和15B顯示以C15/全長prM/全長E蛋白形式的DEN-3WT和選擇本發明的重組的多肽(PRM15/截短E形式的18H6和C15/全長prM/全長E形式的16G11-25B10)通過20％-60％的蔗糖梯度離心純化。純化的多肽或在聚丙烯醯胺(PAA)凝膠中用考馬斯藍(15A)染色或在蛋白質印跡後轉移到硝化纖維素膜(15B)上用標準技術用DEN特異性抗體染色。(參考，例如，Repley，R.and Walker，J.M.eds.，MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK(1998)，Humana Press，Inc.，Tijssen(1993)LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES[以下簡稱Rapley和Walker，MOLECULARBIOMETHODS HANDBOOK]。E蛋白表示「包膜」蛋白。牛血清清蛋白作為凝膠和蛋白質印跡的對照。顯示的條帶表明形成了DEN-3 C15/全長prM/全長E和16G11-25B10中每個的二聚多肽。
圖16顯示了注射編碼以下本發明重組多肽抗原之一(18H6(SEQ IDNO235)或16G11-25B10(SEQ ID NO255))的pMaxVax10.1載體或通過明礬佐劑混合蔗糖梯度純化的本發明多肽(18H6(SEQ ID NO110)或16G11-25B10(SEQ ID NO251))進行免疫的小鼠血中獲得的抗血清的ELISA的OD值的比較。或者用編碼下述一個本發明重組多肽抗原的pMaxVax10.1載體(如，DNA+DNA)，或用明礬(alum)中的多肽在初次用DNA(如，DNA+蛋白質)或蛋白(如，蛋白質+蛋白質)注射後以3個星期為間隔對小鼠進行2次加強免疫。「Prot.」表示「蛋白質」。
圖17顯示從每組6個猴子的血樣中在不同的時間點(第0，28，56和112天)獲得的抗血清的光密度的比較結果，每組分別在第0，28和84天注射(1)4種pMaxVax10.1核酸載體在PBS中的混合物，每種載體中含有分別編碼WT DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4 C15/全長prM/全長E多肽的四種親代WT登革病毒C15/全長prM/全長E核酸(4WT，Mix)之一；(2)含有編碼重組PRM15/tE登革病毒抗原的典型重組PRM15/tE核酸(18H6)的pMaxVax10.1載體；(3)含有典型的PRM C15/全長prM/全長E核酸(6E12-D4和2G11-D4)的pMaxVax10.1載體，其中每一均編碼C15/全長prM/全長E登革病毒抗原；或(4)3種pMaxVax10.1載體在PBS中的混合物，每一載體包含對應於18H6，6E12-D4和2G11-D4(3Sh，Mix)之一的核酸。對照(「pMV ctrl」)是不含親代或重組PRM15/tE或C15/全長prM/全長E核酸的pMaxVax10.1載體。所有的核酸載體均在PBS中作為組合物給藥。
發明詳述本發明提供新的重組、合成、變異和/或分離的多肽，融合蛋白，抗體，核酸(如多核苷酸)，病毒，類病毒顆粒；含有該核酸和/或編碼該多肽、融合蛋白、抗體、病毒和類病毒顆粒的載體；含有該核酸、多肽、融合蛋白、抗體、病毒、類病毒顆粒和/或載體的細胞和組合物；以及含有一種或多種前述本發明核酸、多肽、融合蛋白、抗體、病毒、類病毒顆粒、載體、細胞和組合物的疫苗。本發明進一步提供本發明所述核酸、多肽、融合蛋白、抗體、病毒、類病毒顆粒、載體細胞和組合物的製備方法與使用方法。
一方面，核酸、多肽、融合蛋白、載體、病毒、類病毒顆粒、細胞、抗體和組合物通常用於調控、促進、誘導和/或增強對一種或多種類病毒和/或一種或多種血清型，包括但不限於如登革-1、登革-2、登革-3和登革-4或其變體的一種或多種登革病毒的免疫應答，和/或分析生物樣品中是否存在對至少一種黃病毒血清型的至少一種黃病毒或其變體的抗黃病毒抗體，以及特別是對至少一種DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4病毒或其變體的抗登革病毒抗體。本發明所述的核酸、多肽、融合蛋白、載體、病毒、類病毒顆粒、抗體、細胞、組合物和方法同樣被認為能用於體內方法以預防性和/或治療性的處理患有與至少一種血清型的至少一種黃病毒或其變體(包括如至少一種血清型的至少一種登革病毒或其變體)相關的疾病的動物(包括，如脊椎動物和哺乳動物)，以及從體外、試管中和/或體內診斷、檢測和/或識別至少一種黃病毒或相應的變體(包括，如，至少一種血清型的至少一種登革病毒或相應的變體)。
在一方面，本發明核酸、多肽、融合蛋白、載體、病毒、類病毒顆粒、抗體、細胞、組合物和方法能特別的用於在體和/或離體的方法以誘導或增強動物對黃病毒科家族的病毒中至少一種病毒(如黃病毒科的成員如日本腦炎病毒)的免疫應答，以及用於預防性和/或治療性處理動物(包括如脊椎動物和哺乳動物)的與至少一種屬於黃病毒科家族病毒的病毒或任何該病毒相應的變體相關的疾病，該病毒家族的病毒包括黃病毒，疫病毒和肝病毒，優選所述至少一種病毒或其變體的，與至少一種血清型的至少一種登革病毒相關的病毒(包括如，但不限於黃病毒科家族的病毒，如黃病毒屬的成員或其它黃病毒，包括，如黃熱病毒、聖路易斯腦炎病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、河谷腦炎病毒、俄羅斯春夏季腦炎病毒和/或西羅尼腦炎病毒，和包括，例如上述FIELDS，VIROLOGY，同上，Vol.1第32和33章(4thed)中所述的與登革病毒相關的病毒或這些病毒的任一變體)。
在另一方面，本發明的核酸、多肽、融合蛋白、載體、病毒、類病毒顆粒、抗體、細胞、組合物以及方法能用於在體外，試管中和/或體內診斷、檢測，和/或識別黃病毒科家族(例如，包括三個屬，黃病毒，疫病毒和肝病毒)的至少一種病毒或所述病毒的變體的方法，優選的其中所述至少一種病毒或相應變體是與至少一種登革病毒相關的病毒(包括，例如但不限於黃病毒科家族的病毒，其它黃病毒，黃熱病毒，聖路易斯腦炎病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、河谷腦炎病毒、俄羅斯春夏季腦炎病毒和/或西羅尼腦炎病毒，和包括例如，FIELDS，VIROLOGY，同上，Vol.1第32和33章(4thed)中所述的與登革病毒相關的病毒或這些病毒的任一變體)。照比本身，應當理解下面詳細描述的登革病毒所代表的包括更一般的黃病毒科病毒家族，包括黃病毒，疫病毒或肝病毒的病毒，尤其是黃病毒屬的成員，優選至少一種血清型的黃病毒，並且特別是密切相關於至少一種血清型的至少一種登革病毒的黃病毒，除非另外申明或與內容明顯矛盾。應當理解下面詳細描述的多肽，依據內容，包括融合蛋白。
本發明的多肽、融合蛋白、核酸、載體、病毒、類病毒顆粒、組合物、細胞和方法還能有效的用於在體和/或離體的方法以誘導動物體內的免疫應答，和/或在體和/或離體的方法免疫動物(包括，如脊椎動物和哺乳動物)抵抗至少一種黃病毒科家族的病毒，如黃病毒或其變體(包括如包含或涉及至少一種登革病毒血清型的至少一種登革病毒的黃病毒或相應的變體)和/或作為對黃病毒科家族至少一種病毒，如黃病毒或其變體的疫苗，和/或更加優選作為對包含或涉及至少一種登革病毒的黃病毒科家族的病毒，如黃病毒或其變體的疫苗。
優選的，本發明提供的重組、合成、突變和/或分離的多肽和/或融合蛋白含有能夠調控、誘導、促進和/或增強可以檢測的免疫應答的胺基酸序列，例如結合黃病毒科家族至少一種病毒，如黃病毒(如登革病毒)的抗體的產生，和/或涉及黃病毒科家族的至少一種類型的抗原，如黃病毒抗原(包括如至少一種類型的登革病毒抗原)在動物細胞(典型脊椎動物細胞和更典型和優選的，哺乳動物細胞，比如人類和非人類靈長動物細胞)在體細胞培養中和/或離體和/或受試者或組織或細胞內的產生。該多肽或融合蛋白的胺基酸序列部分能被稱為本發明的「免疫原性胺基酸」和「抗原性胺基酸」或簡稱為「胺基酸」或「免疫原」或「抗原」。
本發明的重組、合成、變異和/或分離多肽以及相應編碼該多肽的本發明的多核苷酸的一個進一步值得期待的特性為能夠誘導、促進、調控和/或增強對至少一種黃病毒，包括，如至少一種血清型的至少一種登革病毒優選至少2種血清型每種至少一種登革病毒，更優選至少3種血清型每種至少一種登革病毒，更優選至少4種已知登革病毒的血清型(如DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4)每種至少一種登革病毒的免疫應答。
本發明的重組、合成、變異和/或分離的多肽以及相應編碼該多肽的本發明的多核苷酸的進一步值得期待的特性為能誘導、促進、增強或調控對至少一種黃病毒，優選對至少一種血清型的至少一種登革病毒，更優選對至少兩種血清型每種至少一種登革病毒，更優選對至少三種血清型每種至少一種登革病毒，最優選對至少4種已知病毒登革病毒血清型(如DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4)每種至少一種登革病毒的中和抗體應答。
本發明的重組、合成、變異和/或分離的多肽和/或融合蛋白，編碼其和其它多肽以及融合蛋白的多核苷酸和相關細胞、抗體、載體、組合物，診斷試驗和製備與使用該多肽和多核苷酸的方法的更加特別和值得期待的特性在這裡詳細描述。
術語「PRM 15」(或「prM 15」和有時選用「spM」)在用來表示胺基酸時通常表示一般含有約15個胺基酸殘基的胺基酸序列。另外，在一些實施方案中，PRM 15胺基酸序列另外包括一個甲硫氨酸(「Met」或「M」)作為首個胺基酸殘基，在該實施例中，PRM 15胺基酸序列長度約為16個胺基酸。通常，PRM15胺基酸序列包含野生型(WT)、重組、變異或合成的登革病毒prM蛋白的C末端最後15個胺基酸殘基；在一些實施方案中，PRM 15胺基酸序列進一步的包含甲硫氨酸作為序列的首個胺基酸殘基，這樣就有大約16個胺基酸的長度。
關於核苷酸序列，「PRM 15」通常表示一般含有約15個胺基酸殘基的核苷酸序列。在部分實施例中，PRM 15核苷酸序列包括編碼甲硫氨酸的三個核苷酸殘基，該三個殘基為序列中位置最前的三個殘基，其後時按序列順序排列的編碼餘下約15個胺基酸的密碼子。通常，PRM 15核苷酸序列包含編碼WT，重組，變異或合成的登革病毒prM蛋白或其變體C端最後約15個胺基酸的核酸殘基。在部分上述實施例中，PRM 15核苷酸序列進一步包括編碼甲硫氨酸的三個殘基，其位於核苷酸序列的起始位置；在該實施例中，核苷酸序列編碼總共約16個胺基酸。
PRM 15胺基酸序列一般連接在多肽上，並且有效的作為該多肽在細胞中的轉運的信號序列。通常在轉運過程中PRM 15信號序列隨後被從多肽上切除下來。例如，在部分實施例中，PRM 15序列連接於登革病毒包膜(「E」或「Env」)蛋白，如WT，重組，變異或合成的登革病毒E蛋白，或有抗原性或免疫原編碼的片段(如截短的重組，WT或合成E蛋白)或相應的變體。
這裡描述各種PRM 15胺基酸信號序列(參見，如SEQ ID NOS52-64)。這裡還描述各種PRM 15核苷酸序列(參見，如SEQ ID NOS272-284)。通過識別prM序列C端最後大約15個胺基酸殘基能夠容易的在prM蛋白序列中確定PRM 15胺基酸序列。如果需要，Met殘基能加到胺基酸序列的起始位置。通過識別編碼具體的prM序列C端最後約15個胺基酸殘基的核酸序列能類似的確定PRM 15核酸序列；如果需要，編碼Met殘基的密碼子能類似的加為該核酸序列的首個密碼子。PRM 15胺基酸和核酸序列能用本領域一般技術人員所熟知的下述的標準蛋白質和核酸合成技術合成。
在一方面，本發明包括嵌合多肽，其包含的序列有至少約90％胺基酸序列同一性於含有本發明的合成或重組的C15/全長prM/全長E或PRM 15/截短的E多肽從氨基的第16個殘基到最後的胺基酸殘基的胺基酸序列的多肽序列，以及編碼所述嵌合多肽的核酸。
術語「tE」(或「ETRUNC」或「E-truncated」等)在用於表示胺基酸序列時表示黃病毒截短的(「t」或「trunk」)包膜(E)蛋白。該黃病毒可以是分離的野生型，重組，變異或合成的黃病毒或其變體。在一方面，黃病毒包括登革病毒和包含截短的野生型登革病毒E蛋白或其變體的截短的E蛋白，或截短的重組，變異或合成登革病毒E蛋白。與未截短的E蛋白相比，截短的E蛋白缺少未截短E蛋白C端的一個或多個胺基酸殘基。當用於表示核酸序列時，術語「tE」(或「ETRUNC」或「E-truncated」等)表示對應於或編碼截短的E蛋白的截短的核酸序列。編碼截短的E蛋白核酸序列與未截短的核酸相比同樣缺少C端的一個或多個核酸殘基。
在一個實施方案中，截短的登革包膜(E)蛋白(DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4)包含的多肽序列含有各自登革E蛋白按序列順序從各自登革E蛋白胺基酸序列N端胺基酸殘基開始計算的約70％到約98％(如，約85％，86％，87％，88％，89％，90％，92％或95％)的連續胺基酸的殘基。換句話說，截短的E蛋白包含登革E蛋白序列的片段，從全長登革E蛋白序列C端胺基酸殘基開始計算，該片段缺少各自全長登革E蛋白序列的約2％到約30％(如，約15％，14％，13％，12％，10％，8％或5％)的胺基酸殘基。編碼該截短的登革E蛋白的核酸序列不包含編碼從全長登革E蛋白序列C端胺基酸殘基開始計算的各自全長登革E蛋白序列的C端約2％到約30％(如，約15％，14％，13％，12％，10％，8％或5％)的胺基酸殘基的核苷酸殘基。
在一個具體的實施方案中，截短的DEN-1E蛋白包含的多肽序列含有DEN-1E蛋白從N端胺基酸殘基開始按序列順序計算的約87％的連續胺基酸殘基，並且編碼該截短的DEN-1E蛋白的核酸序列不包含編碼DEN-1E蛋白序列從C端胺基酸殘基開始計算的C端最後約13％的胺基酸殘基的核苷酸殘基。
在一個具體的實施方案中，截短的DEN-2E蛋白包含的多肽序列含有DEN-2E蛋白從N端胺基酸殘基開始按序列順序計算的約90％的連續胺基酸殘基，並且編碼該截短的DEN-2E蛋白的核酸序列不包含編碼DEN-2E蛋白序列從C端胺基酸殘基開始計算的C端最後約10％的胺基酸殘基的核苷酸殘基。
在一個具體的實施方案中，截短的DEN-3E蛋白包含的多肽序列含有DEN-3E蛋白從N端胺基酸殘基開始按序列順序計算的約89％的連續胺基酸殘基，並且編碼該截短的DEN-3E蛋白的核酸序列不包含編碼DEN-3E蛋白序列從C端胺基酸殘基開始計算的C端最後約11％的胺基酸殘基的核苷酸殘基。
在一個實施方案中，截短的DEN-4E蛋白包含的多肽序列含有DEN-4E蛋白從N端胺基酸殘基開始按序列順序計算的約90％的連續胺基酸殘基，並且編碼該截短的DEN-4E蛋白的核酸序列不包含編碼DEN-4E蛋白序列從C端胺基酸殘基開始計算的C端最後約10％的胺基酸殘基的核苷酸殘基。
術語「CO」表示「優化密碼子」或「密碼子優化」的序列。當用於表示一段核酸序列的時候，該術語表示一段密碼子優化的核酸序列。當用於表示一段胺基酸序列的時候，該術語表示對應於或由密碼子優化的核酸序列編碼的胺基酸序列。
除非另外說明，術語「多肽，」「蛋白質，」和「肽，」在此處以及在全文中都同義的表示任何由多胺基酸，至少部分，通過共價結合的多聚體形式(例如此處所用的「蛋白質」既表示通過肽鍵結合的胺基酸的線性聚合體(鏈)也表示具有二級、三級或四級結構的蛋白質，其中可包含有肽鏈內或肽鏈之間其它形式的分子內和分子間連接，例如氫鍵和範德華鍵)。除非另外說明，術語「多肽」和「蛋白」包括融合蛋白。
術語「重組」在用於表示胺基酸(如肽、多肽、蛋白質、抗原)的時候一般表示非自然形成的胺基酸(例如沒有在自然界中發現)(例如非自然形成的肽、多肽、蛋白質、抗體)。「重組的多肽」包括重組核酸表達的或能夠表達的任何多肽(然而重組核酸序列不需要包括所有編碼或表達所必須的核苷酸序列元件)，或含有胺基酸序列的任何多肽，其中序列中每個胺基酸殘基均對應於或能夠被核酸序列密碼子編碼，該核酸序列包括重組核酸序列。
術語「重組」在用於表示核酸(如多核苷酸或其它核苷酸)的時候一般表示非自然形成的核酸。當被用於表示核酸時，術語「重組」可以表示核酸被至少一種外源(例如外源的和典型的異源的)核苷酸的引入所修飾或至少一處本身核苷酸組件的變化。「重組載體」表示非自然形成的載體，包括例如含有重組核酸序列的載體。
在一方面，「重組多核苷酸」或「重組多肽」是非自然形成的多核苷酸或多肽。重組多核苷酸或重組多肽可以包含分別從超過一種的源核酸或多肽中獲得的核酸或胺基酸，其中源核酸或多肽可以是自然形成的核酸或多肽，或其本身就已經經過了突變、改變、重組或其它類型的修飾。作為不同核酸或胺基酸序列來源的源多核苷酸或多肽時常是同源的(例如有，或編碼的多肽編碼相同或相似的結構和/或功能)，並且經常來自於有機體的不同隔離群、血清型、菌株、物種或例如來自不同的疾病狀態。
術語「重組」在用於表示細胞的時候表示細胞包含重組分子，例如重組核酸、重組多肽或重組載體(例如非自然形成的核酸、多肽或載體)。在一方面，術語「重組」在用於表示細胞的時候表示細胞複製異源的核酸或表達異源核酸編碼的的肽或蛋白。重組細胞中可以含有在天然(非重組)形式的細胞中所沒有發現的基因。重組細胞中還可以含有在天然形式的細胞中已經存在的基因，其中該基因通過人工方法進行了修改並且被重新引入到細胞中。術語還包括含有細胞內源核酸的細胞，其修飾不需要將核酸從細胞內移出；該修飾包括例如通過基因替換、位點特異性突變和相關技術所獲得的修飾。
術語「合成」在表示分子或組件時分別表示人工或非天然形成的分子或組件。例如合成的多核苷酸時人工、非天然形成的多核苷酸。用於合成產生分子、組件或其結合，包括例如合成的多核苷酸、多肽、融合蛋白、載體、病毒、類病毒顆粒、細胞、組合物等的技術將在此做進一步的描述。
為了方便閱讀，本發明的重組、合成、變異和/或變異的多肽、多核苷酸、融合蛋白、載體、細胞和抗體經常分別簡單表示為「重組」多肽、多核苷酸、融合蛋白、載體、細胞和抗體。
術語「核酸」表示脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的多聚體。除非特別限定，該術語包括含有已知的天然核苷酸類似物的核酸，該類似物與其引用的核酸有類似的結合特性並且與天然形成的核苷酸有類似代謝方式。除非另外指出，特別的核酸序列無疑還包括其保守修飾的變體(例如簡併密碼子替換)以及互補序列和清楚指出的序列。特別的，簡併密碼子替換可以通過產生在一個或多個選擇的密碼子的第三個位置上進行混合基礎的和/或脫氧肌苷殘基替換的序列而實現(Batzer等.(1991)Nucleic AcidRes195081；Ohtsuka等(1985)J Biol Chem2602605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol Cell Probes891-98)。術語核酸可與多核苷酸、以及(在恰當的內容中)與基因、cDNA和基因編碼的mRNA互換使用。
「基因衍生的核酸」表示最終以基因或其亞序列作為模板合成的核酸。這樣，mRNA、從mRNA反轉錄的cDNA、cDNA轉錄的RNA，從cDNA擴增的DNA，從擴增DNA轉錄的RNA等都衍生自基因，並且檢測上述衍生產物表明樣品中存在和/或大量存在原始基因和/或基因轉錄物。
當其與另一段核酸序列間有功能性的聯繫時，核酸「可操作的連接」到另一段核酸序列。例如，啟動子或增強子如果增強編碼序列的轉錄，其將有效的連接於編碼序列。有效連接表示連接的DNA序列一般是連續的，並且在必須連接兩個蛋白編碼區域的地方，是連續的並且在讀碼框內。然而，由於增強子通常在啟動子相隔幾個kb鹼基時才行使功能，並且中間內含序列可以有多種長度，所以部分多核苷酸組件可以有效連接但不是連續的。
「分離的」多肽表示從其正常伴隨的一種或多種組分中和/或環境中(例如其它肽，多肽，蛋白(包括複合體，細胞汙染物，細胞組分等)，細胞等)分離的多肽。「分離的」核酸(或分離的核苷酸或分離的多核苷酸)表示從其正常伴隨的一種或多種組分中和/或環境中分離的核酸(或核苷酸或多核苷酸)。典型的，分離的核酸所表示的核酸沒有與一個或多個能將其與其獲得和/或衍生的序列直接連續的核酸(例如在5』和/或3』端)直接連接。
一般的，組分(如多肽，多核苷酸，融合蛋白，載體，細胞)的分離致使它在組合物中，混合物或收集的組分中成為佔優勢的組分；例如在摩爾基礎上它比組合物中任何其它單獨組分都更多。例如多肽或多核苷酸的分離致使多肽或多核苷酸分別成為組合物，混合物或收集的組分中的佔優勢分子或種類。該「基本上純」的多肽或多核苷酸(或其它組分)，例如，一般在重量(一般在摩爾基礎上)上為特定組合物的所有大分子的至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％。令人滿意的，基本上純的多肽或多核苷酸顯示基本的同質性(例如無法通過常規的檢測方法檢測到組合物中的汙染物)。術語「純的」一般表示通過標準分析技術標測(例如構建譜帶電泳凝膠，層析洗脫物，和/或用於密度梯度離心的介質)多核苷酸或多肽中不含或至少基本上不含其它組分，並且/或者佔有特定組合物中大分子的至少約80％，至少約85％，優選至少90％，以及更優選至少95％。
在此使用的術語「受試者」包括，但不限於，有機體；動物，包括哺乳動物，其中包括如人類，非人類的靈長動物(如，狒狒，猩猩，黑猩猩，猴子)，小鼠，豬，母牛，山羊，貓，兔子，大鼠，天竺鼠，倉鼠，馬，猴子，綿羊或其它非人類的哺乳動物以及非哺乳動物，包括如非哺乳脊椎動物，如鳥類(如雞或鴨)或魚和非哺乳類的非脊椎動物。
術語「細胞因子」包括例如白細胞介素、幹擾素、趨化因子、造血生長因子、腫瘤壞死因子和轉化生長因子。通常，這些小分子量蛋白調控免疫系統細胞的成熟、激活、增殖和分化。
多肽的「變體」是指與親代或引用的多肽有一個或幾個胺基酸殘基存在差異的多肽，通常至少有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75、100或更多的胺基酸殘基存在差異。
核酸的「變體」是指與親代或引用的核酸有一個或幾個核酸殘基存在差異的核酸，通常至少有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、21、24、27、30、33、36、39、40、45、50、60、75、150、225、300或更多的核酸殘基存在差異。
「抗原」表示能夠誘導、促進、增強或調控免疫應答或免疫反應的分子。在一些例子中，免疫應答或免疫反應是體液和/或細胞應答。抗原可以在受試者在體細胞和/或受試者在體和/或受試者離體細胞或組織中誘導、促進、增殖或調控免疫應答或免疫反應。該免疫應答或反應可以包括，但不限於，誘導受試者中抗體的形成，或對抗原產生特異性的淋巴細胞群。抗原一般為來自宿主外的大分子(如蛋白或多糖)。
核酸或胺基酸的「亞序列」或「片斷」表示的核酸序列或胺基酸序列中分別含有更長的核酸序列(如多核苷酸)或胺基酸序列(如多肽)，分別直到並且包括全長(完整)的核酸序列或全長胺基酸序列的任何的部分或片斷。
「佐劑」表示的分子或物質能夠增大或增強免疫應答，包括例如，但不限於，抗原的免疫刺激性或化合物或藥物的藥學效果。佐劑可以非特異性的增強免疫應答，如對抗原的免疫應答。例如，「弗氏完全佐劑」是含有免疫原、乳化劑和分枝桿菌的油和水的乳劑。另一個例子，「弗氏不完全佐劑」中不含有分枝桿菌，其它都相同。佐劑可以包含油、乳化劑、滅活細菌、氫氧化鋁或磷酸鈣(如以凝膠形式)或其組合。佐劑可以給藥受試者(如通過肌肉或皮下注射)以有效劑量從而產生抗體。
「自然形成的」當用於物質時表示該物質能夠在不是由人類人工製造的自然物中發現。生物體(包括病毒、細菌、原生動物、昆蟲、植物或哺乳動物組織)中存在的多肽或多核苷酸序列可以從自然來源中分離，並且沒有被人類在實驗室中有意修改，其是自然形成的。非自然形成的用於描述物質時表示該物質不是自然形成的，如物質不能在自然界中發現，以和人工製造的相區別。
指定的胺基酸多聚體或核酸多聚體的編號方式「對應於」選擇的胺基酸多聚物或核酸多聚物的編號方式，任何指定的多聚物組分(例如胺基酸殘基、核苷酸殘基)的位置被標明為同樣或相當於其在選擇的胺基酸或核酸多聚物中的殘基位置，而不是該組分在指定的多聚物中的真實位置。這樣，例如，指定多肽序列中的指定胺基酸位置的編號方式對應於同樣或相對於其在用作參考序列的選擇的多肽中的胺基酸的位置。
載體是用於進行細胞轉導或轉染核酸，或在細胞中表達核酸的組分或組合物。載體包括如質粒、粘粒、病毒、YAC、細菌、多賴氨酸等。「表達載體」或「表達盒」是核酸元件的核酸構件或序列，其可以轉錄核酸到宿主細胞中和/或可以有效的在與該構件或序列相容的宿主中表達核酸。表達載體或盒可以通過本領域已知的方法重組或合成。表達載體或盒可以是部分的質粒、病毒或核酸片斷。表達載體或表達盒一般包括有效連接了啟動子的需要轉錄的核酸(例如編碼預期多肽的核酸)。需要轉錄的核酸一般在啟動子的指導或控制下。表達載體或盒可選的包括轉錄終止信號。如下所述的，還可以應用有效表達所必須或有用的附加因子。例如，表達載體或盒中還可以包括編碼信號序列的核苷酸序列，該信號序列指導宿主細胞中表達蛋白的分泌。增強子和其它影響核酸表達或基因表達的核酸序列也包括在內。
「基本全長的多核苷酸序列」或「基本全長的多肽序列」表示有多核苷酸序列或多肽序列長度的至少約50％，一般至少約60％、70％或75％，通常至少約80％或85％，或一般至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多。
術語「藥物組合物」表示的組合物適合於對受試者，包括動物或人類進行藥學應用。藥物組合物一般包含有效量的活性物質和載體，包括如藥學上可接受的載體。
術語「有效量」表示分子或組合物的劑量或分量足夠產生預期的結果。例如，給藥受試者一定劑量或分量的特殊抗原或免疫原(或其組合物)，預期的結果可以包括可測定或可測試的對受試者免疫應答的誘導、促進、增強或調控。在一方面，給予受試者一定劑量或分量的特殊病毒抗原或免疫原(或其組合物)以足夠有效的保護受試者抵抗病毒的侵襲，預期的結果可以包括可測定或可測試的對受試者免疫應答的誘導、促進、增強。在另一方面，預期的結果可以包括接受一定劑量或分量的特殊分子或組合物的受試者(例如給藥了一定劑量或分量的特殊分子或組合物的受試者)客觀上或主觀上的改善
「預防性治療」是給予沒有表現和/或患有疾病、病理或醫學紊亂的體徵或症狀，或是僅表現和/或患有疾病、病理或紊亂的早期體徵或症狀的受試者的治療方式，該治療方式是給藥以達到減小、防止和/或減少疾病、病理或醫學紊亂發展的風險。預防性治療通過對疾病或紊亂的預防性處理起作用。「預防性活性」是因子如核酸、載體、基因、多肽、蛋白質、分子、物質或其組合物的活性，其在給藥沒有表現和/或患有病理、疾病或紊亂的體徵或症狀，或僅表現和/或患有病理、疾病或紊亂的早期體徵或症狀的受試者時，能夠減小、預防和/或減少受試者發展該病理、疾病或紊亂的風險。「預防性有效」因子或分子(如核酸或多肽)表示能有效減小、預防、免疫防止、治療和/或減少病理、疾病或紊亂的因子或分子。
「治療性處理」是給予表現和/或患有病理、疾病或紊亂的體徵或症狀的受試者以減小、治療和/或消除上述病理、疾病或紊亂的體徵或症狀的治療方式。「治療性活性」是指因子如核酸、載體、基因、多肽、蛋白、分子、物質或其組合物的活性，其給予表現和/或患有該體徵或症狀的受試者時，能夠消除、治療和/或減小病理、疾病或紊亂的體徵或症狀。「治療性有效」因子或分子(如核酸或多肽)表示能有效的減少、治療和/或消除該病理、疾病或紊亂的體徵或症狀的因子或分子。
術語「基因」廣泛的表示任何與生物學功能相關的DNA片斷。基因包括編碼序列和/或其表達所需的調控序列。基因還包括非表達DNA核酸片斷，其例如組成其它蛋白的識別序列(如啟動子、增強子或其它調控區)。基因可以從大量的來源獲得，包括從感興趣的來源克隆或根據已知或預測的序列信息合成，並且可以包括設計的具有預期參數的序列。
一般的，以下使用的術語和下述的在細胞培養、分子遺傳學、分子生物學、核酸化學和蛋白化學方面的實驗室工作程序是公知的並且是本領域技術人員所常用的。標準技術，例如在Sambrook等，Molecular Cloning-ALaboratory Mannul(第2版)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989(下文中「Sambrook」)以及Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等編，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和Uohn Wiley Sons，Inc.合資(1994，supplemented through 1999)(下文中「Ausubel」)中所述的，被用於重組核酸的方法、核酸合成、細胞培養的方法和強行傳輸到或穿過受試者皮膚或組織的轉基因併入法，如電穿孔、注射、基因槍以及脂質轉染法。一般的，寡核苷酸合成和純化步驟根據說明書進行。技術和步驟一般根據本領域常規方法以及本文提到的多種常規參考書實行。其中步驟被認為是公知於本領域普通技術人員的，在此提供僅為了方便讀者。
在此處所用的，「抗體」所表示的蛋白含有一種或多種基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼的多肽。術語抗體用來表示所有的抗體及其結合片段。確認的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilo和mu恆定區域基因以及無數免疫球蛋白可變區域基因。輕鏈被歸類為kappa或lambda。重鏈被歸類為gamma、mu、alpha、delta或epsilon，其依次分別定義免疫球蛋白的種類，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般的免疫球蛋白(如抗體)結構部件構成四聚體。每個四聚體由兩對同樣的多肽鏈組成，每對中有一個「輕」(約25KDa)和一「重」鏈(約50-70KDa)。每條鏈的N端有大約100到110或更多個胺基酸的可變區域，其主要用於抗原識別。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別表示這些輕鏈和重鏈。
抗體以完整的免疫球蛋白或由多種肽酶消化產生的許多有特徵的片段的形式存在。這樣，例如胃蛋白酶消化抗體鉸鏈區二硫鍵下方產生F(ab)』2，其為Fab的二聚體，Fab本身為通過二硫鍵連接VH-CH1的輕鏈。該F(ab)』2可以在溫和條件下以打斷鉸鏈區的二硫鍵從而轉化F(ab)』2二聚體為Fab』單體的形式降解。該Fab』單體基本上是Fab和鉸鏈區部分。抗體分子的Fc部分很大程度上相當於免疫球蛋白重鏈的恆定區域，並且負責抗體的效應子功能(參見，Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)，以獲得對其它抗體片段更加詳細的描述)。雖然多種抗體片段是根據完整抗體的分解物定義的，本領域技術人員應該了解該Fab』片段可以通過化學的或使用重組DNA的方法重新合成。這樣，在此處使用的術語抗體還包括通過修改完整抗體或用重組DNA方法重新獲得的抗體片段。
抗體還包括單臂複合單克隆抗體、單鏈抗體、包括單鏈Fv(sFv)抗體，其中可變重鏈與可變輕鏈連接在一起(直接或通過肽連接子連接)從而組成連續的多肽，以及雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(tribody)和四鏈抗體(tetrabody)(Pack等(1995)J Mol Biol24628；Biotechnol111271；和Biochemistry311579)。抗體為，例如多克隆、單克隆、嵌合的、人源化的、單鏈的、Fab片段、由Fab表達庫產生的片段等。
術語「抗原決定簇」一般表示能夠特異性結合抗體的肽或多肽決定簇。抗原決定簇通常含有由分子如胺基酸或糖側鏈聚合的化學活性表面基團，並且有特異性的三維結構特性以及特異性的電荷特性。構象和非構象的抗原決定簇存在著差異，當有變性溶劑存在的情況下，前者而非後者的結合消失。
抗體的「抗原結合片段」是抗體的結合或選擇性結合抗原的肽或多肽片段。抗原結合位點由抗體中有助於、參與或影響與抗原結合的胺基酸組成。參見Scott，T.A.和Mercer，E.I.，Concise EncyclopediaBiochemistry andMolecular Biology(de Gruyter，3d ed.1997)和Watson，J.D.等.，RecombinantDNA(2d ed.1992)[下文中」Watson，Recombinant DNA」]，在此引用全文作各種目的參考。
術語「篩選」通常表示識別最優的或優化的分子的過程。各自分子的一些特徵能夠被用於選擇和篩選，包括如在測試系統內誘導期望的免疫應答的能力。選擇是篩選的一種形式，其通過同時表達的選擇標記進行識別和物理分離，在一些遺傳環境下，表達標記的細胞能夠存活而其它的細胞將死亡(或相反)。由於在體外研究初步免疫應答的限制，體內研究是特別有用的篩選方法。在一方面，篩選表示識別多肽(或編碼該多肽的核酸)的過程，其中多肽誘導或能夠誘導受試者或受試者的細胞對至少一種病毒血清型的至少一部分登革病毒的免疫應答，其約等於或超過對照多肽(如野生型多肽)所誘導或能夠誘導的免疫應答。
兩個分子如配體與受體間的「特異性結合的親合」表示在分子混合物中一個分子與另一個的優先結合。如果結合親合為約1×102M-1到約1×1010M-1(如約10-2M-10-10M)或更大，包括約104到106M-1、約106到107M-1或約108到109M-1或1010M-1，那麼分子間的結合一般被認為是特異性的。
「親合力」表示抗體與抗原結合的傾向。親合力越高，抗體與抗原間的相互吸引就越強，抗體與抗原的結合就越多，抗體與抗原結合形成的抗原-抗體複合物的穩定性就越高。
術語「免疫測定」包括用抗體或免疫原結合或特異性結合抗原的試驗。免疫測定可以表述為利用特殊抗體的特異性結合性質分離、定位和/或量化抗原。
本發明提供的重組、合成、變異和/或分離的多肽包含免疫原性胺基酸序列，其與SEQ ID NOS1-49、65-116、139-148、153-155、236-253、343和345中至少一個的胺基酸序列基本同源(如至少約75％、80％、85％、86％、87％、88％或89％，優選至少約90％、91％、92％、93％或94％，更優選95％(如約85％-95％)、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性)。此外，本發明提供重組、合成、變異和/或分離的編碼免疫原性胺基酸序列的多核苷酸，其與SEQ ID DOS156-218、235、254-271、285-330、342和344中至少一個的核酸序列基本同源。當用於多肽時，術語「基本同源」表示兩條或更多胺基酸序列在使用如採用默認間隙權重值的GAP或BESTFIT程序、直接觀察或其它任何合適的技術如這裡進一步描述的序列分析和同源性算法進行最優比對時，序列間有至少約60％、一般至少約65％、通常至少約70％、經常至少約75％、通常至少約80％、至少約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、優選至少約90％或更多(如至少約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約97.5％、約98％、約98.5％、約99％或約99.5％或更多)的胺基酸序列同一性。類似的，在用於核酸時，術語基本同源或基本類似表示兩條或更多核酸序列在使用如採用默認間隙權重值的BLAST、GAP或BESTFIT程序(在下文中與用於評估核酸序列同一性性水平的其它合適方法和技術一起詳細介紹)或直接觀察進行最優比對時，序列間有至少約60％的核酸序列同一性或序列類似，至少約70％或至少約75％的序列同一性或序列類似，更理想的至少約80％或約85％核酸序列同一性或序列類似，優選至少約90％核酸序列同一性或序列類似，更加優化的至少約95％的核酸序列同一性或序列類似(包括如約90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99、99.5或更多比例的核苷酸序列同一性或序列類似)。
關於胺基酸或核苷酸序列的「同源性」(有時表示為「完全同源」-對比於「局部同源」，其在此進一步討論)表示在兩條胺基酸序列或兩條核酸序列相互間進行最優比對時，兩條胺基酸或核酸序列間各自同源的胺基酸殘基或核酸鹼基的百分比。如果在優化比對時，第一個序列某位置上的胺基酸殘基或核苷酸殘基與相應的第二條序列相應位置上的相同，那麼序列顯示關於該殘基位置的同源性。兩條序列間的同源性水平(或「序列同一性百分比」)測定為序列間同源位置的數量對比所分析序列的大小而得到的比例(如序列同一性百分比＝(同源位置的數量/位置的總數)×100)。
「最優比對」是提供兩條比對序列間最高同源性的比對方式。為獲得最優比對，可以引入間隙並且忽略一定數量的非同源序列和/或不確定的序列。優選的，如果需要插入間隙到第一個序列中以獲得最優比對，同源百分比的計算僅使用與對應胺基酸序列配對的殘基(例如，計算不考慮第二條序列中對應第一個序列間隙的殘基)。然而，通常優選的在引入間隙或和/或忽略非同源/不確定序列的同時給予「間隙罰分」。
雖然相對較短的胺基酸或核酸序列間的同源性能夠容易的通過直接觀察確定，但是確定較長序列的同源性一般採用適當的算法進行分析，通常該分析是通過計算機軟體來實現的。當使用序列比較算法時，測試和對照序列通常被輸入計算機，如果需要可設定亞序列等同物並且設定序列算法程序的參數。而後序列比較算法將基於設定的參數計算該測試序列相對於對照序列的序列同一性百分比。已知存在許多可快速獲得最優對比並且計算兩條或更多序列間同源性的數學算法以及使用相應算法的軟體程序。上述程序的例子包括分析胺基酸序列的MATCH-BOX、MULTAIN、GCG、FASTA和ROBUST程序以及分析核苷酸序列的SIM、GAP、NAP、LAP2、GAP2和PIPMAKER程序。優選的同時用於胺基酸和多核苷酸序列分析的軟體分析程序包括ALIGN、CLUSTALW(如版本1.6及其更新的版本)和BLAST程序(如BLAST2.1、BL2SEQ及其更新的版本)。其選擇實例將在下面的章節中作進一步的描述。
對於胺基酸序列分析，使用權重矩陣，如BLOSUM矩陣(如BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM62、BLOSUM80矩陣-參見如Henikoff和Henikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA8910915-10919)、Gonnet矩陣(如Gonnet40、Gonnet80、Gonnet120、Gonnet160、Gonnet250和Gonnet350矩陣)或PAM矩陣(如PAM30、PAM70、PAM120、PAM160、PAM250和PAM350矩陣)來測定同源性。優選BLOSUM矩陣。一般更加優選BLOSUM50和BLOSUM62矩陣。在無法使用上述權重矩陣時(如在分析核酸序列以及使用一些胺基酸分析程序時)，使用記錄殘基/核苷酸匹配或不匹配的記分模式(如對匹配的+5以及對不匹配的模式-4)。
ALIGN程序通過使用修正的動態規划算法獲得所選擇的兩條蛋白或核酸序列的最優全局(完全)比對，該算法參見Myers和Miller(1988)CABIOS411-17。優選的，如果可能，ALIGN程序使用加權末端-間隙。如果使用間隙打開和間隙延伸罰分，對於胺基酸序列對比優選分別將其設定為-5到-15和0到-3，更優選分別為約-12和-0.5到-2，對於核酸序列對比優選分別為-10到-20和-3到-5，更優選分別為約-16和-4。ALIGN程序及其依據的原理可進一步參見如Pearson等(1988)Proc Natl Acad Sci USA852444-48和Pearson等(1990)Methods Enzymol1863-98。
可選的，並且特別是在用於多序列分析(例如超過三條的序列間的比較)時，使用CLUSTALW程序(參見如Thompson，J.D.等(1994)Nuc Acids Res224673-4680)。在一方面，間隙打開和間隙延伸罰分相應的設定為10和0.05。可選的或附加的，CLUSTALW程序用「動態」(與「快速」相對)設定運行。優選的，用CLUSTALW進行核苷酸序列分析採用BESTFIT矩陣，而胺基酸序列則根據序列間的同源性水平採用可變設定的BLOSUM矩陣進行計算(例如使用可以從San Diego Supercomputer Center(SDSC)獲得的CLUSTALW版本1.6的程序)。優選的，CLUSTALW的設定被設為SDSC CLUSTALW的默認設定(例如在胺基酸序列分析中關於特殊親水間隙的罰分)。CLUSTALW程序及其運行所依據的原理可進一步參見如Higgins等CABIOS，(1992)8(2)189-91，Thompson等(1994)Nucleic Acids Res224673-80以及Jeanmougin等(1998)Trends Biochem Sci2403-07。
另一有效的測定同源百分比的算法是FASTA算法，該算法參見Pearson，W.R. Lipman，D.J.(1988)Proc Natl Acad Sci USA852444。還可參見W.R.Pearson(1996)Methods Enzymol266227-258。優選的用FASTA比對DNA序列計算同源百分比的參數為最優的，BL50 Matrix 15-5，k-tupe＝2；joiningpenalty＝40，optimization＝28；gap penalty -12，gap length penalty＝-2；以及width＝16。
其它優選的算法包括BLAST和BLAST2.0算法，其通過將一個選擇的序列與資料庫(如GenSeq)中的多條序列比對，或經過附加算法如BL2SEQ改進後在兩條選擇的序列間進行比對，從而分析至少兩條胺基酸或核苷酸序列。進行BLAST分析的軟體通過國家生物技術信息中心(NCBI)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供給公眾。BLAST算法的參數W、T和X決定了比對的敏感度和速度。BLASTN程序(對核苷酸序列)的運行可使用字符長度(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4並且比較全部兩條鏈。對胺基酸序列，BLASTP程序(如BLASTP 2.0.14；2000年6月29日)的運行可使用字符長度(W)為3以及期望值(E)為10。
BLAST程序分析同樣的或可選的使用低複雜性過濾程序比如DUST或SEQ程序進行優選的修改，該程序優選與BLAST程序的運行整合(參見如Wootton等(1993)Comput Chem17149-63，Altschul等(1991)Nat Genet6119-29，Hancock等(1991)Comput Appl Biosci1067-70，以及Wootton等(1996)Meth Enzymol266554-71)。在該方面，如果使用lambda率，優選將該率設定在0.75到0.95之間，更優選的在0.8到0.9之間。如果間隙存在值(或間隙分值)用於該方面，該間隙存在值優選設定到-5到-15之間，更優選的約-10，並且每個殘基間隙值優選設定在0到-5之間，更優選在0到-3之間(如-0.5)。類似的間隙參數可用於其它的適合的程序。BLAST程序及其運行所依據的原理可進一步參見如Altschul等(1990)J Mol Biol215403-10，Karlin和Altschul(1990)Proc Natl Acad Sci USA872264-68(修正於Karlin和Altschul(1993)Proc Natl Acad Sci USA905873-77)以及Altschul等(1997)Nucl Acids Res253389-3402。
另一個有效算法的例子被用於PILEUP軟體。PILEUP程序通過漸進的、成對的比對從一組相關序列中創建多序列比對以顯示關聯和序列同一性百分比或序列相似百分比。PILEUP採用FengDoolittle(1987)J Mol Evol35351-360中涉及的漸進比對方法的簡化方式，其類似於HigginsSharp(1989)CABIOS5151-153中所涉及的方法。優選的PILEUP程序的參數為默認間隙權重(3.00)，默認間隙長度權重(0.10)以及加權的末端間隙。PILEUP是GCG序列分析軟體包，如版本7.0(參見如Devereaux等(1984)Nuc Acids Res12387-395)的一部分。
其它有效的進行同源性分析的算法包括Smith和Waterman(1981)AdvAppl Math2482中涉及的局部同源算法，Needleman和Wunsch(1970)J MolBiol48443中涉及的同源比對算法以及Pearson和Lipman(1988)Proc NatlAcad Sci USA852444中涉及的類似物的搜索方法。這些算法的計算機實現程序(如GAP，BESTFIT和TFASTA)包括在Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中。
另外的幾種商業軟體包合併了ALIGN、BLAST和CLUSTALW程序及類似的功能，並且可能含有在設定和分析方面明顯的改善。該程序的例子包括GCG包的程序和可以從DNASTAR，Inc.(Madison，WI)中獲得的程序，例如Lasergene_和Protean_程序。優選的比對方法是Jotun Hein方法，其合併在MegaLineTMDNASTAR軟體包(MegaLineTM版本4.03)中依據廠商的用法說明書以及程序特定的默認值使用。
由於多種算法、矩陣和程序普遍的用於分析序列，胺基酸和多核苷酸序列優選根據顯示為特定同源性「附近」一定範圍的同源性(例如特定同源性的+/-10％，更優選的+/-8％，更優選的+/-5％)的近似同源性進行描述。但是，準確的同源性能夠通過使用上述程序中的單獨一個來測定，例如此處涉及的BLAST程序或Hein方法。
在一方面，本發明提供的重組、合成和/或分離的多肽(其可以簡單的表示為多肽或重組多肽)含有的胺基酸序列與SEQ IDNOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中至少一個的胺基酸序列有至少約90％的胺基酸序列同一性。理想的，重組多肽含有的序列與選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少兩條序列有至少約90％的胺基酸序列同一性。較好的，重組多肽含有的序列與選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少五條序列有至少約90％的胺基酸序列同一性。有利的，重組多肽含有的序列與選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少約10條，優選至少約15條，更優選至少約20條序列有至少約90％的胺基酸序列同一性。優選的，重組多肽含有的胺基酸序列與選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少1條，優選至少5條，更優選至少約10條序列有至少約75％，至少約80％，至少約85％，至少約90％，至少約95％，至少約96％，至少約97％，至少約98％或至少約99％同源。
含有選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的胺基酸的重組多肽是優選的。多肽可以含有任何數量的合適的附加胺基酸序列，例如本文其它地方所述的附加序列(如信號序列和/或純化促進抗原決定簇標籤(如Whitehorm等Biotechnology 131215-19(1995))，或該多肽可以由選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的胺基酸序列完整的組成。
可選的，但更通常是附加的，重組多肽可以含有的胺基酸序列與本發明任何多肽的免疫原性胺基酸序列基本上功能型同源，這樣的胺基酸序列如SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任何一個的胺基酸序列。「基本上功能性同源」表示在最優同源對比中，分析的胺基酸序列間有至少約60％，一般至少約65％，通常至少約70％，經常至少約75％，優選至少約80％，更優選至少約85％，最優選至少約90％或更多(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)的功能同源的殘基。「最優功能性同源對比」是提供兩條胺基酸序列間最高水平同源性的比對方式，其使用上述關於「最優比對」的原理。保守的胺基酸殘基置換包括將一類胺基酸殘基中的一個調換為屬於同一類的殘基(在計算功能性同源百分比中同源的胺基酸殘基被認為在功能上同源或保守)。表1顯示胺基酸的分類和這些類的成員。
表1-胺基酸殘基種類

表2提供了保守胺基酸置換的可選的集合，分6個保守組詳細記述。
表2-可選的胺基酸殘基置換組

更多的保守置換存在於上述類中並且能夠可選的實施。保守組的更多的保守置換的例子包括纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸和天冬醯氨-穀氨醯胺。另外的胺基酸群也能夠用如Creighton(1984)ProteinsStructure and Molecular Properties(2d Ed.1993)，W.H.Freeman and Company中涉及的原理闡明。
一般的，與本文披露的免疫原性胺基酸序列，如SEQ ID NOS1-49和153-155中相應的殘基不同源的多肽的免疫原性胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基，通常與最相關的免疫原性胺基酸序列(如最相關的序列選自SEQID NOS1-49和153-155)的不同之處在於保守胺基酸的置換，如用上述表1或表2中提供的多個組中的一個置換，或一般的置換是在每個上述表中單獨一組內進行。這樣，本文多肽或蛋白的描述，結合上述保守組，提供了涉及所述序列的所有的保守替換多肽序列的明確的列表。
一般的，多肽的免疫原性胺基酸序列還顯示與本發明的免疫原性胺基酸序列，通常是SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中至少一個，基本上權重同源。理想的，免疫原性胺基酸序列與至少5條，優選至少約10條，或更多的本發明公開的免疫原性胺基酸序列(如大約5、10或更多選自任何上面涉及的序列組中序列)基本上權重同源。「基本上權重同源」表示至少約60％，優選至少約70％，更優選至少約60％(如約65-85％)，或更多(如約87％、90％、92％、95％或99％)的在多肽一個位置上的非同源胺基酸殘基與在本發明公開的免疫原性胺基酸序列，例如選自SEQID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的胺基酸序列中，最同源的或功能性同源的序列中相應的胺基酸屬於同一個基於權重的「弱保守組」或「強保守組」。優選強組保守。基於權重的保守取決於是否非同源對應胺基酸在一個本文所述的基於權重的矩陣(如BLOSUM50矩陣和優選PAM250矩陣)中得到正分。基於權重的強保守組包括Ser Thr Ala，Asn GluGln Lys，Asn His Gln Lys，Asn Asp glu Gln，Gln His Arg Lys，Met Ile Leu Val，Met Ile Leu Phe，His Tyr，和Phe Tyr Trp。基於權重的弱保守組包括Cys Serala，Ala Thr Val，Ser Ala Gly，Ser Thr Asn Iys，Ser Thr Pro Ala，Ser Gly Asn Asp，Ser Asn Asp Glu Gln Lys，Asn Asp Glu Gln His Lys，Asn Glu Gln His Arg Lys，Phe Val Leu Ile Met和His Phe Tyr。CLUSTALW序列分析程序提供基於權重強保守和弱保守組作為輸出的分析，並且提供優選的技術檢測基於權重的保守，優選採用SDSC使用的CLUSTALW默認設定。
可選的，但一般附加於基本上同源或基本上功能性同源，多肽含有的免疫原性胺基酸序列與至少一個(優選至少5條，更優選至少10條)本文涉及的免疫原性胺基酸序列，例如選自SEQ ID NOS1-49的胺基酸序列，具有類似的親水特性(或顯示類似的親水性)。親水特性可以用Kyte Doolittle指數表示，每種天然胺基酸在指數中的分值如下I(+4.5)，V(+4.2)，L(+3.8)，F(+2.8)，C(+2.5)，M(+1.9)；A(+1.8)，G(-0.4)，T(-0.7)，S(-0.8)，W(-0.9)，Y(-1.3)，P(-1.6)，H(-3.2)；E(-3.5)，Q(-3.5)，D(-3.5)，N(-3.5)，K(-3.9)和R(-4.5)(進一步的介紹可參見如美國專利4,554,101和Kyte Doolittle，(1982)J Molec Biol157105-32)。優選的，免疫原性胺基酸序列中至少約45％，優選至少約60％，更加優選至少約75％(，如至少約85％，至少約90％，至少約91％，至少約92％，至少約93％，至少約94％，至少約95％，至少約96％，至少約97％，至少約98％，至少約99％)的胺基酸殘基與在本發明中公開的最同源或功能型同源的免疫原性胺基酸序列(相對最同源序列)，優選自SEQ ID NOS1-49的相應殘基，不同源，其在親水性上相對於相對最同源序列的對應位置的非同源胺基酸殘基顯示少於+/-2的改變，優選親水性少於+/-1的改變，更優選親水性少於+/-0.5的改變。總的來說，相對於選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155和236-253的相對最同源序列，多肽理想的顯示親水性的總改變少於約150，更優選少於約100，更優選少於約50(如少於約30，少於約20或少於約10)。一般的保持類似或相同親水性的胺基酸替換的例子包括精氨酸-賴氨酸替換，穀氨酸-天冬氨酸替換，絲氨酸-蘇氨酸替換，穀氨醯胺-天冬醯胺替換和纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸替換。算法和軟體，例如可通過SDSC獲得的GREASE程序，提供了常規的方法以快速評定肽片斷或肽部分的親水結構。
該多肽理想地包含與選自SEQ ID NOS1-49，65-116，139-148，153-155，以及236-253的至少一個序列(優選至少5條序列，更優選至少10條序列)基本上同源(例如，具有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，以及更優選地至少約95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)，或至少基本上功能性同源的免疫原性胺基酸序列，其中組合物中至少約90％，優選至少約95％，更優選100％的胺基酸殘基具有大於0的KyteDoolittle親水值，優選至少約1。
重組的截短的E蛋白和全長E蛋白多肽本發明還提供了包含具有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，以及更優選地至少約95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多的胺基酸序列與SEQ ID NOS1-49，以及153-155中的至少一種胺基酸序列同一性的胺基酸序列的重組多肽。所述多肽通常表示為重組的截短的包膜(E)蛋白多肽(或「截短的E」或「tE」多肽)。本發明還提供含有與野生型黃病毒的包膜蛋白，例如，優選登革病毒的包膜蛋白，的胺基酸序列長度相等或基本相等的(例如在85％，87％，88％，90％，92％或更多之內)序列的本發明的重組E多肽。所述多肽通常被稱為重組的全長E蛋白多肽。(「全長E」，「全E」或「E」多肽)。
在另一方面，本發明提供包含基本上與SEQ ID NOS2，3，5，25，29，以及44-46中至少一種同源的胺基酸序列的多肽。該多肽包含與SEQ IDNOS2，3，5，25，29，以及44-46中至少一種有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，以及更優選地至少約95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多胺基酸序列同一性的胺基酸序列。理想地，該多肽含有與選自SEQ ID NOS2，3，5，25，29，以及44-46中的3種，5種或更多序列有至少約85％，至少約90％，至少約95％，或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列。在優選的方面，該多肽可以含有、基本上或全部由SEQ ID NOS2，3，5，25，29，以及44-46中的任一種的胺基酸序列組成。
在具體的一方面，本發明提供包含與SEQ ID NOS2，5或25基本上同源的(例如，具有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，以及更優選地至少約95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)免疫胺基酸序列的多肽。理想地，該胺基酸序列具有至少約85％，優選至少約90％，更優選至少約95％，或更多的(例如，97％，98％，或99.5％)序列與SEQ ID NO5同源。本發明包括包含SEQ ID NOS2，5，或25的多肽。
一些本發明多肽的重組的截短E多肽或者重組的全長E多肽誘導、促進或增強受試者(例如，哺乳動物)，或者受試者的細胞群對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。一些所述的多肽誘導受試者對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少兩種，三種，或四種血清型中的每一種至少一種登革病毒的免疫應答。
一些所述的重組的截短E或全長E多肽誘導受試者對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，與通過每個上述至少一種登革病毒的WT截短的E蛋白誘導受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答相比，大致相當或更高，所述的WT截短的E蛋白含有與重組的或合成的多肽長度基本上相同的胺基酸序列。登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的WT截短的E蛋白分別能夠包含基本上由SEQ ID NOS338，339，340，以及341組成的胺基酸序列。
一些所述的多肽誘導受試者，或者受試者的細胞群，對至少兩種或三種血清型的每一種至少一種登革病毒的免疫應答，與通過至少兩種或三種血清型中的每一種至少一種登革病毒的WT截短的E蛋白所誘導的受試者或細胞分別對所述至少三種血清型的每一種的至少一種登革病毒的免疫應答相比，大致相等或更高。
優選的，重組的截短的E多肽誘導受試者或細胞的對四種血清型中的每一種的至少一種登革病毒的免疫應答，與通過SEQ ID NOS338-341中任一種誘導的對四種血清型中的每一種的至少一種登革病毒的免疫應答相比，大致相等或更高。
一些所述的重組的截短的E或全長E多肽誘導結合至少一種登革病毒血清型的至少一種登革病毒的一種或多種抗體的產生，優選的，所述多肽誘導產生的一種或多種抗體與至少兩種，更優選三種，或更優選四種血清型中每一種至少一種登革病毒相結合。在具體的一方面，重組的截短的E或全長E多肽誘導產生的與至少一，二，三，或血清型的至少一種登革病毒相結合的抗體數量，分別與通過至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型的截短的E蛋白或全長E蛋白誘導的抗體數量相比，大致相等或更多。在優選的一方面，重組的截短的E或全長E多肽誘導產生與至少一種，優選至少兩種，更優選至少三種，甚至更優選至少四種血清型中的每一種的至少一種登革病毒相結合的抗體數量，與通過至少一種，二種，三種或四種血清型的每一種的至少一種登革病毒的野生型截短的E蛋白或全長E蛋白誘導的抗體數量分別相比，大致相等或更多。
一些所述的重組的截短的E和全長E多肽誘導產生的一種或多種抗體，分別比通過至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型的截短的E或全長E蛋白誘導的抗體，更特異性的結合到至少一種血清型的至少一種登革病毒上。
在另一方面，一些本發明所述的重組的截短的E或全長E多肽誘導或產生針對至少一種，優選至少兩種，更優選至少三種，甚至更優選四種登革病毒血清型的每一種的至少一種登革病毒的中和抗體的效價。一些所述多肽誘導或產生針對至少一種血清型的至少一種登革病毒的中和抗體的效價，與通過至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型截短的E蛋白產生的抗至少一種血清型的至少一種登革病毒的中和抗體的效價相比，大致相等或更多，每個所述的野生型截短的E蛋白選自SEQ ID NOS338-341。一些所述的多肽誘導或產生針對至少兩種，至少三種或至少四種血清型中的每一種的至少一種登革病毒的中和抗體的效價，分別與通過至少兩種，至少三種或至少四種血清型中的每一種的至少一種登革病毒的野生型的截短的E蛋白產生的對至少兩種，至少三種或至少四種血清型中每一種至少一種登革病毒的中和抗體的效價相比，大致相等或更多，每種所述的野生型截短的E蛋白選自SEQ ID NOS338-341。
本發明提供了含有前面所述的特徵和此處所描述的特徵(或所述特徵的組合)的重組的截短的E多肽以及重組的全長的E蛋白，以及具有可選的或附加的本文進一步描述的性質的本發明的多肽。
本發明的多肽可以包含任何長度的免疫原性胺基酸序列(例如，大約10-1500胺基酸，更為一般的是50-1000胺基酸，以及更為一般的是大約100-800個胺基酸)。典型的，該本發明的免疫原性胺基酸序列至少約100個，更典型的至少約150，常用大約200，更常用大約250，通常至少約300，更通常至少約350，以及更通常(以及優選常用)至少約400個胺基酸(例如，長度約400-750的胺基酸，更一般的長度約425-685的胺基酸，用於重組的截短的E蛋白多肽，以及常用的約425至約450長度的胺基酸用於本發明的重組的截短的E蛋白多肽，約435至約460或約465長度的胺基酸用於本發明的重組的PRM15/截短的E多肽，以及約650至約680或約700長度的胺基酸用於本發明的C15/全長prM/全長E多肽，如上文及下文進一步所討論的)。
信號肽序列本發明的重組的截短的E蛋白以及重組的全長E多肽也可以或選擇的包含任何合適數量以及類型的附加的胺基酸序列，例如一種或多種的肽片斷。在一個具體的例子中，例如，所述的截短的E或全長E多肽更進一步地包含一組信號肽。通常，當重組的或合成的多肽被在動物細胞中表達時，信號肽指導重組地或合成地多肽到內質網。一般指導到細胞器的運輸和/或至少一部分多肽在細胞中表達後的分泌的信號序列是特別優選的。所述的序列一般以多肽的不成熟的(例如，未全部完成)形式存在，並隨後被細胞蛋白酶去除/降解以達到蛋白質的成熟形式。例如，截短的E或全長E多肽可以包括任何合適的信號序列或信號序列的組合以指導多肽到胞內區室，例如，序列指導多肽轉運(或移位)至(尤其是蛋白被加工或從中釋放)內質網或者分泌的路徑(例如，ER內質網，golgi高爾基體，以及其它的分泌相關的細胞器和細胞內隔室)，細胞核，和/或指導多肽從細胞中分泌，在細胞膜易位，或從分泌蛋白的細胞分離以靶向到第2個細胞上。在這一方面，多肽可以包括細胞內靶向序列(或者「排序信號」)，該序列指導多肽進入核內體和/或溶酶體隔室或其它富含MHC II的隔室，以促進CD4+和/或CD8+T細胞遞呈及應答，例如，來自溶酶體相關膜蛋白1的溶酶體/核內體靶向排序信號(例如，LAMP-1-見，例如，Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA921161-75(1995)和Ravipraskash等，Virology29074-82(2001))，其一部分或同源體(見，例如，美國專利，US5,633,234)，或其它合適的溶酶體，核內體和/或ER內質網靶向序列(見，例如，美國專利US6,248,565)。在一些方面，細胞內靶向序列被設於多肽中靠近或鄰近被證實的/被識別的抗登革病毒T-細胞抗原決定簇序列是可取的，其能夠通過本領域的常規技術以及此處所涉及的技術識別，由此增加T細胞遞呈含有該抗原決定簇的多肽片斷的可能性。優選地，所述多肽由通過一種或多種核苷酸或病毒的核苷酸轉運載體傳輸到宿主的重組的、合成的、突變的和/或分離的DNA或RNA所表達，該載體包括，例如，這裡進一步所描述的一種或多種的基因轉運載體。
優選地，多肽包含當其在哺乳動物細胞中表達時指導該多肽至內質網(ER)的信號序列(例如，促進了多肽的ER移位)。多肽可以含有任一合適的ER-靶向序列。許多ER-靶向序列是本領域所公知的。所述信號序列的例子在美國專利US5,846,540中描述。通常使用的ER/分泌信號序列包括大腸桿菌的ST II或Ipp信號序列，酵母α因子信號序列，以及如皰疹病毒gD信號序列的哺乳動物病毒的信號序列。關於信號序列的進一步的例子在，例如，美國專利US4,690,898，5,284,768，5,580,758，5,652,139以及5,932,445中描述。合適的信號序列可以採用本領域的公知技術識別。例如SignalP程序(在，例如，Nielsen等，(1997)ProteinEngineering101-6中描述)，其可通過生物序列分析中心http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP公開獲得，或者可以使用相似的能夠識別類信號序列區域的序列分析軟體。識別合適的信號肽的相關的技術在Nielsen等，ProteinEng10(1)1-6(1997)中提供。序列可以被用於分析通常與信號序列相關的特徵，例如，在歐洲專利申請0,621,337，Zheng和Nicchitta(1999)J Biol Chen274(51)36623-30，以及Ng等(1996)JCell Biol134(2)269-78中所描述的。
具有上述特徵的重組的截短的多肽一般包含比登革病毒包膜蛋白短的免疫原性胺基酸序列；即，免疫原性的胺基酸序列比登革病毒包膜蛋白殘基總數少一個或多個的殘基。特別地，所述蛋白的免疫原性胺基酸一般為登革病毒包膜蛋白大小的約65-95％，更一般的約80-90％(由各自蛋白中殘基的數量決定)，優選與ER-靶向信號序列組合，該序列通常大小與登革病毒prM序列的約5-20％相當(本發明提供的該胺基酸序列的有效片斷將在本文中進一步描述)。該截短的E多肽通常缺少至少一部分的登革病毒E蛋白C-端跨膜序列或其功能和/或結構同系物。具有該特徵的蛋白與含有該序列的蛋白相比顯示不同的分泌質量。
本發明還提供了包含與完整或全長黃病毒包膜蛋白，優選登革病毒包膜蛋白，長度相同或相似的免疫原性胺基酸序列的重組多肽。與上述包含與黃病毒，例如登革病毒，的截短的包膜蛋白長度相同或相似的免疫原性胺基酸序列的「截短的」E序列相比，該胺基酸序列可分別稱為「部分全長」和「全長」E多肽序列。此外，如下文所述，本發明還提供包含具有信號肽序列的所述全長免疫原性序列的多肽。
在一個具體的例子中，本發明的重組的截短的E多肽或全長的E多肽進一步的含有信號肽序列，該信號肽序列包含，或基本上由長度至少大約為10(例如，約8-20)個胺基酸殘基的，與黃病毒prM蛋白序列的C端5-20％至少有約50％(優選至少約60％，65％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，或更多)以及更為優選的是至少約85-95％的胺基酸序列同一性的胺基酸序列組成。例如，在一方面，該信號肽包含黃病毒prM蛋白序列(例如，登革prM蛋白序列)的C端最後15個胺基酸殘基。任何合適的黃病毒C端prM序列可以作為信號肽的基礎。黃病毒可參見例如，FIELDS VIROLOGY，同上，VIROLOGY，B.N.Fields等，Raven Press，Ltd.，New York，AcademicPress(2nd，1999)。幾個黃病毒的prM序列同樣是已知的(見，例如，Despres等.(1990)Virus Res16(1)59-75，Venugopal等.(1995)Vaccine Aug；13(11)1000-5，國際專利申請WO01/39802，GENBANK Accession Nos.AAK97602，AAD28623，GNWVTB，BAA23792，BAA23784，BAA08221，BAA08220以及AAF34187)。這些或其它黃病毒prM信號序列或其基本同源的同系物(例如，具有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％或94％，和更加優選至少約95％(如約87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的C端部分可以通過標準的DNA合成技術產生(同源序列可以通過直接的誘變，遞歸序列重組，合理的序列設計，或其它任一合適的技術產生，其實例將在本文中進一步討論)，並且融合到編碼胺基酸序列的序列(例如，編碼黃熱病病毒C端至多10-20胺基酸的序列或其同源序列可以被融合到編碼SEQ ID NOS1-49以及153-155中任一個的序列)中。當在哺乳動物細胞中表達時，在該prM序列的5』端引入起始密碼子一般在胺基酸序列中增加了一個N端甲硫氨酸(其它的修飾可能在細菌和/或其它的真核細胞中發生，例如在起始密碼子處引入甲醯甲硫氨酸殘基)。發明人關注包含或基本上由該胺基酸序列或至少其N端組成的多肽的N端甲硫氨酸序列在多方面的產生和應用。標準的核酸合成技術是本領域公知的(見，例如，Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Let 221859-1869(1981)，Mathers等，EMBO J.3801-805(1984)，Saiki等，Science 239487-491(1988)美國專利4,683,202，以及其它均在此引為參考)。
在一方面，重組的截短的E多肽或全長E多肽更進一步地包含信號肽，該信號肽包含約5-25個胺基酸的信號序列(例如約15個胺基酸，一般約10-20個胺基酸)，其具有至少約至少約50％或至少約60％，優選至少約70％，80％，或85％(例如，至少約65至約90％)，以及更優選地至少約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多胺基酸序列與含有選自DEN-1 prM、DEN-2 prM、DEN-3 prM和DEN-4 prM的prM蛋白的C端最後15個胺基酸的胺基酸序列，或含有甲硫氨酸殘基及其後具有選自DEN-1 prM、DEN-2 prM、DEN-3 prM和DEN-4 prM(各自SEQ IDNOS52-55)的prM蛋白的C端最後15個胺基酸的胺基酸序列同一性。包含甲硫氨酸及其後15個胺基酸殘基的該胺基酸序列一般被稱為「PRM 15」序列。在另一方面，信號肽包含的信號序列含有表現出與SEQ ID NOS52-64中的至少一種有至少約55％胺基酸序列同一性的類似大小的胺基酸序列(優選至少約65％，更優選至少約75％，以及更優選至少約85％，至少約90％，至少約95％(例如，約80-99％))。在一方面，信號肽包含選自SEQ IDNOS52-64中任一的信號序列。在重組的截短的E多肽或全長E多肽中的信號序列的位置依賴於所應用的信號序列的類型。信號序列位置通常決定於其對於蛋白殘餘物的功能。優選地，信號肽序列被定位在免疫原性E多肽序列的N端，特別是當信號序列為黃病毒的prM序列或其同系物時。信號肽序列可以結合多肽上任何合適的部分以使信號序列可以進行預期的靶向功能。一般的以及優選的，信號肽序列被定位到靠近(例如，在大約20個胺基酸或更少之內)重組的免疫原性胺基酸序列(例如，截短的E多肽或全長E多肽)，或者，更理想地，直接被融合到免疫原性胺基酸序列的N端。在一些例證中，其它異源區域或連接物可以定位在信號序列與免疫原性的E多肽之間。這些原件的內容將在本文其它地方作進一步的論述。
PRM 15/截短的E多肽和PRM 15/全長E多肽含有登革病毒prM信號肽序列或其同系物(例如，SEQ ID NOS52-64中任一的信號肽序列)的重組的E截短的多肽一般被稱為信號肽/截短的E多肽，或信號肽/全長E多肽。在具體的形式，信號肽含有黃病毒(例如，登革病毒)prM蛋白15個C端胺基酸殘基，包含該信號肽和本發明的重組的截短的E多肽或全長E多肽之一的重組的多肽被分別稱為PRM 15/截短的E蛋白多肽(也稱為「PRM 15/截短的E」多肽或「PRM 15/tE」多肽)或PRM 15/全長E蛋白多肽(也稱為「PRM 15/全長E」多肽或「PRM 15/full E」多肽)。PRM 15序列一般被連接到截短的E或全長E多肽的首個胺基酸上。此外，PRM 15/tE和PRM 15/全長E多肽序列一般包含甲硫氨酸殘基作為序列的首個胺基酸。
本發明的多肽包含本發明的重組的截短的E多肽或全長E多肽以及理想的包含一個胺基酸序列的信號序列，該胺基酸序列與SEQ ID NOS65-116中至少一種有至少約65％，至少約70％，優選至少約80％，優選至少約85％，87％或89％，更優選地至少約90％，92％，93％或94％，以及更為優選地至少約95％的胺基酸序列同一性(所述地同源同時考慮prM片斷或部分，例如，截短的E多肽的PRM 15片斷和剩餘的，免疫原性胺基酸序列)。在一具體的例子中，所述多肽包含與SEQ ID NOS66，67，69，89，93，以及108-110中至少一種有至少約75％(例如，約80％至100％)，理想的至少約85％，較好的至少約90％，以及更為理想的約95％的胺基酸序列同一性的胺基酸。優選的，該多肽也包含選自SEQ ID NOS65-116的胺基酸序列或與SEQ IDNOS65-116有至少約95％，98％，99％，或更多同源的胺基酸序列。更為優選地，該多肽包含選自(或至少具有約98％，約99％，或更多同源的)SEQID NOS66，67，69，89，93，以及108-110的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了包含與SEQ ID NOS65-116中至少一種的胺基酸序列有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，以及更優選地至少約95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多胺基酸序列同一性的胺基酸序列的重組的或合成的多肽，該重組的或合成的多肽誘導受試者對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。
一些所述的PRM 15/截短的E或PRM 15/全長E多肽所誘導受試者或受試者的細胞群對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4組中至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答分別與至少一種血清型的野生型的PRM 15/截短的E或野生型的PRM 15/全長的E多肽所誘導的對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答相當或更多。在一方面，該野生型PRM15/截短的E蛋白多肽選自SEQ ID NOS149-152。部分該PRM15/截短的E或PRM15/全長E多肽誘導的受試者或其細胞對至少兩種，至少三種或優選至少四種血清型中每一種至少一種登革病毒的免疫應答分別與至少兩種，至少三種或至少四種血清型的每一種的至少一種登革病毒所誘導的對至少兩種，至少三種或至少四種血清型中每一種至少一種登革病毒的免疫應答相當或更多。一些所述的PRM 15/tE多肽包含具有至少90％胺基酸序列與SEQ ID NOS66，67，69，89，93，以及108-110中至少一種序列同一性的胺基酸序列。在一具體的方面，該多肽包含選自SEQ ID NOS66，67，69，89，93，以及108-110中的胺基酸序列。
一些所述的PRM 15/tE和全長E多肽誘導產生一種或多種與至少1，至少2，優選至少3，更優選至少4種登革病毒血清型(例，登革-1，登革-2，登革-3，和/或登革-4)的至少一種登革病毒相結合的抗體。在一方面，PRM 15/截短的E多肽產生的與至少一種血清型的至少一種登革病毒相結合的抗體的數目與至少一種血清型的WT PRM 15/截短的E蛋白(也稱為「PRM 15/截短的E多肽」)誘導的抗體數目相當或更多，每種WT PRM 15/截短的E蛋白多肽選自SEQ ID NOS149-152。
一些所述的PRM 15/tE多肽包含與SEQ ID NOS65-116中至少一種序列有至少90％序列同一性的胺基酸序列，其誘導產生的與至少兩種或三種血清型的每一種的至少一種登革病毒結合的抗體數量與由至少兩種或三種血清型的每一種的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白所誘導的大致相當或更多，所述每種所選血清型的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白選自SEQ IDNOS149-152。對一些所述的多肽而言，所誘導的與至少四種血清型的每一種的至少一種登革病毒相結合的抗體的數量與由SEQ ID NOS149-152之一所誘導的大致相當或更多。
此外，一些所述的PRM 15/tE多肽所誘導產生的一種或多種抗體比由至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型的PRM 15/截短的E多肽所誘導的抗體更能特異性的與至少一種血清型的至少一種登革病毒結合，其中具體的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白選自SEQ ID NOS149-152。
在另一方面，本發明的重組的PRM 15/tE多肽和PRM 15/全長E多肽誘導或產生針對至少一種登革病毒血清型的至少一種登革病毒，優選至少兩種血清型的每一種的至少一種登革病毒，更優選至少三種血清型的每一種的至少一種登革病毒，更為優選選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的至少四種血清型的每一種的至少一種登革病毒的中和抗體的效價。
在本發明的一方面，中和抗體的效價大約等於或高於至少一種血清型的至少一種登革病毒的PRM 15/tE或PRM 15/tE多肽所產生的中和抗體的效價，至少等於或高於由至少一種血清型的至少一種登革病毒的野生型PRM15/截短的E多肽或野生型PRM 15/全長E多肽所產生的中和抗體的效價。
在一具體的方面，對一些所述的PRM 15/tE多肽而言，誘導的對至少兩種，三種或四種登革病毒血清型的每一種的至少一種登革病毒的抗體的效價與對至少一種血清型的至少一種登革病毒的相當或更高，與由至少兩種，三種或四種血清型的每一種的相同的登革病毒的野生型PRM 15/截短的E多肽所誘導的至少相當或更高，其中具體的相同血清型(作比較)融和蛋白的野生型PRM 15/截短的E多肽選自SEQ ID NOS149-152。
一些所述的PRM 15/tE多肽在哺乳動物體內誘導對至少兩種，三種或四種血清型的每一種的至少一種登革病毒的至少一種中和抗體應答，其在哺乳動物與至少兩種，三種或四種血清型的每一種的至少一種登革病毒相接觸時，不發生抗體依賴性增強(ADE)。
在本發明的一方面，誘導對四種登革病毒血清型的中和抗體應答的重組的多肽包含與SEQ ID NOS66，67，69，89，93，以及108-110中至少一種序列有至少90％序列同一性的胺基酸序列。
在另一方面，本發明進一步的提供重組的PRM 15/截短的E多肽，其包含序列模板Met Xaa1Xaa2Xaa3Phe Ile Leu Xaa4Met Leu Val Xaa5Pro SerXaa6Xaa7Met Arg Cys Xaa8Gly Xaa9Xaa10Asn Xaa11Asp Phe Val Glu GlyXaa12Ser Gly Xaa13Xaa14Trp Val Asp Xaa15Val Leu Glu His Gly Xaa16Cys ValThr Thr Met Ala Xaa17Xaa18Lys Pro Thr Leu Asp Xaa19Glu Leu Xaa20Lys ThrXaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Ala Xaa26Leu Arg Xaa27Xaa28Cys Ile Glu AlaXaa29Xaa30Xaa31Asn Xaa32Thr Thr Xaa33Xaa34Arg Cys Pro Thr Gln Gly GluXaa35Xaa36Xaa37Xaa38Glu Glu Gln Asp Xaa39Xaa40Xaa41Xaa42Cys Xaa43Xaa44Xaa45Xaa46Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly LysGly Xaa47Xaa48Xaa49Thr Cys Ala Xaa50Phe Xaa51Cys Xaa52Xaa53Xaa54Xaa55Glu Gly Xaa56Xaa57Val Gln Xaa58Glu Asn Leu Xaa59Tyr Xaa60Xaa61Xaa62Xaa63Thr Xaa64His Xaa65Gly Xaa66Xaa67His Xaa68Val Gly Asn Xaa69ThrXaa70Xaa71Xaa72Gly Xaa73Xaa74Xaa75Xaa76Ile Thr Pro Gln Xaa77Xaa78Xaa79Xaa80Glu Xaa81Xaa82Leu Xaa83Xaa84Tyr Gly Xaa85Xaa86Xaa87Xaa88Xaa89Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Xaa90Xaa91Xaa92Leu Xaa93Xaa94Met Lys Xaa95Lys Xaa96Trp Xaa97Val His Xaa98Gln Trp Xaa99Xaa100Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Xaa101Gly Ala Xaa102Thr Xaa103Xaa104Xaa105Xaa106Trp Asn Xaa107Lys Glu Xaa108Xaa109Val Thr Phe Lys Xaa110Xaa111HisAla Lys Xaa112Gln Xaa113Val Xaa114Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Xaa115MetHis Xaa116Ala Leu Xaa117Gly Xaa118Thr Glu Xaa119Xaa120Xaa121Xaa122Xaa123Gly Xaa124Thr Xaa125Xaa126Phe Xaa127Gly Xaa128Leu Lys Cys Xaa129Xaa130Xaa131Met Xaa132Lys Leu Xaa133Xaa134Lys Gly Xaa135Ser Tyr Xaa136Met CysThr Gly Xaa137Phe Xaa138Xaa139Xaa140Lys Glu Xaa141Ala Glu Thr Gln His GlyThr Xaa142Xaa143Xaa144Xaa145Val Xaa146Tyr Xaa147Gly Xaa148Xaa149Xaa150Pro Cys Lys Ile Pro Xaa151Xaa152Xaa153Xaa154Asp Xaa155Xaa156Xaa157Xaa158Xaa159Xaa160Xaa161Gly Arg Leu Ile Thr Xaa162Asn Pro Xaa163Val Xaa164Xaa165Lys Xaa166Xaa167Pro Val Asn Ile Glu Xaa168Glu Pro Pro Phe Gly Xaa169SerXaa170Ile Xaa171Xaa172Gly Xaa173Xaa174Xaa175Xaa176Xaa177Leu Xaa178Xaa179Xaa180Trp Xaa181Xaa182Lys Gly Ser Ser Ile Gly Xaa183Met Phe GluXaa184Thr Xaa185Arg Gly Ala Xaa186Arg Met Ala Ile Leu Gly Xaa187Thr AlaTrp Asp Xaa188Gly Ser Xaa189Xaa190Xaa191Xaa192Xaa193Xaa194Xaa195Xaa196Xaa197Xaa198Xaa199Xaa200Xaa201Xaa202Xaa203Xaa204Xaa205Xaa206Xaa207Xaa208Xaa209Xaa210Xaa211Xaa212Xaa213(SEQ ID NO51)的免疫原性胺基酸序列，其中Xaa在一具體的位置代表在該位置有任一或沒有胺基酸殘基(一般的及優選的，少於20個可變位置為單個殘基缺失，即，表示沒有胺基酸在該指示位置)。優選的，在這方面的多肽一般通過天然存在的胺基酸，優選親水值高於0的胺基酸來描繪其特徵。用於每個可變的位置(在序列模板中通過下標數字標定)的優選的胺基酸在表3中列出。表3



如表3中所應用的，短線(-)表示在序列模板的指示位置優選為單個殘基缺失(即，序列模板的特殊位置可以缺少幾個胺基酸殘基)，理想的，多肽具有的胺基酸序列中每個上述可變位置均為一種表2所列的優選殘基(或單個殘基缺失，如果適用)。
在一具體的方面，本發明提供重組的PRM 15/截短的E多肽，其包含序列模板為Met Xaa1Xaa2Xaa3Phe Ile Leu Xaa4Met Leu Val Xaa5Pro Ser Xaa6Xaa7Met Arg Cys Val Gly Xaa8Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Xaa9Ser GlyXaa10Xaa11Trp Val Asp Xaa12Val Leu Glu His Gly Xaa13Cys Val Thr Thr MetAla Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Xaa14Glu Leu Xaa15Lys Thr Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Ala Xaa21Leu Arg Xaa22Xaa23Cys Ile Glu Ala Xaa24Ile Xaa25AsnXaa26Thr Thr Xaa27Xaa28Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Xaa29Xaa30LeuXaa31Glu Glu Gln Asp Xaa32Xaa33Xaa34Xaa35Cys Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39Val AspArg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Xaa40Xaa41Thr CysAla Lys Phe Xaa42Cys Xaa43Xaa44Xaa45Xaa46Glu Gly Xaa47Xaa48Val GlnXaa49Glu Asn Leu Xaa50Tyr Thr Xaa51Xaa52Ile Thr Xaa53His Xaa54Gly Xaa55Xaa56His Xaa57Val Gly Asn Asp Thr Xaa58Xaa59Xaa60Gly Xaa61Xaa62Xaa63Xaa64Ile Thr Pro Gln Xaa65Ser Xaa66Xaa67Glu Ala Xaa68Leu Xaa69Xaa70TyrGly Thr Xaa71Xaa72Xaa73Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Xaa74Xaa75Xaa76Leu Leu Thr Met Lys Xaa77Lys Xaa78Trp Xaa79Val His Xaa80GlnTrp Phe Xaa81Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Xaa82Gly Ala Xaa83Thr Xaa84Xaa85Xaa86Xaa87Trp Asn Xaa88Lys Glu Xaa89Xaa90Val Thr Phe Lys Xaa91Xaa92HisAla Lys Xaa93Gln Xaa94Val Xaa95Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met HisXaa96Ala Leu Xaa97Gly Ala Thr Glu Xaa98Xaa99Xaa100Xaa101Xaa102GlyXaa103Xaa104Xaa105Xaa106Phe Xaa107Gly His Leu Lys Cys Xaa108Xaa109Xaa110Met Asp Lys Leu Xaa111Leu Lys Gly Xaa112Ser Tyr Xaa113Met Cys ThrGly Xaa114Phe Xaa115Xaa116Xaa117Lys Glu Xaa118Ala Glu Thr Gln His GlyThr Xaa119Xaa120Xaa121Xaa122Val Xaa123Tyr Xaa124Gly Xaa125Xaa126Xaa127Pro Cys Lys Ile Pro Xaa128Xaa129Xaa130Xaa131Asp Xaa132Xaa133Xaa134Xaa135Xaa136Xaa137Xaa138Gly Arg Leu Ile Thr Xaa139Asn Pro Xaa140Val Xaa141Xaa142Lys Xaa143Xaa144Pro Val Asn Ile Glu Xaa145Glu Pro Pro Phe Gly Xaa146SerXaa147Ile Xaa148Xaa149Gly Xaa150Xaa151Xaa152Xaa153Xaa154Leu Xaa155Xaa156Xaa157Trp Xaa158Xaa159Lys Gly Ser Ser Ile Gly Xaa160Met Phe Glu Xaa161ThrXaa162Arg Gly Ala Xaa163Arg Met Ala Ile Leu Gly Xaa164Thr Ala Trp Asp PheGly Ser Xaa165Gly Gly Xaa166Xaa167Thr Ser Xaa168Gly Lys Xaa169Xaa170HisGln Xaa171Phe Gly Xaa172Xaa173Tyr Xaa174Xaa175Xaa176Xaa177Xaa178(SEQ IDNO50)的免疫原性胺基酸序列。如上所述，其中Xaa代表任一胺基酸殘基(通常為天然存在的胺基酸殘基，優選親水值高於0的胺基酸殘基)或單個殘基缺失(一般的，少於20個可變位置為殘基缺失，即，表示沒有胺基酸在該指示位置)。
每一可變位置(在序列模板中通過下標數字標定)的優選胺基酸在表4中列出。表4



每一可變位置(在序列模板中通過下標數字標定)的優選胺基酸在表4中列出。理想地，所述多肽具有一免疫原性胺基酸序列，其中每一種上述可變位置均為一種表3所列的優選殘基(或單個殘基缺失，如果適用)。
本發明還提供重組的截短的E多肽，其誘導的對至少兩種血清型的每一種的至少一種登革病毒的免疫應答與至少兩種血清型的野生型PRM15/截短的E多肽所誘導的對至少兩種血清型中的每一種的至少一種登革病毒的免疫應答相比，大致相當或更多，其中每個所述野生型PRM15/截短的E多肽選自SEQ ID NOS149-152。
C15/全長prM/全長的E多肽本發明也提供了一種重組或合成的多肽，其包含與SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345中至少一個的胺基酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列。另一方面，還提供包含與SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345中至少一個的胺基酸序列有至少約70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列同一性的胺基酸序列的重組的或合成的多肽。本發明中這類多肽一般稱作C15/全長prM/全長的E蛋白多肽(或簡稱「C15/full prM/full E」多肽)。
該C15/全長prM/全長的E多肽誘導受試者，如哺乳動物對登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。進一步的，一些上述的多肽誘導受試者對選自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少兩種，優選至少三種，更優選是至少四種血清型的每種至少一種登革病毒的免疫應答。更優選的，所誘導的對至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答要約等於或者強於由相應的至少一種血清型的WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白所誘導的對至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答，其中用於比較的同一血清型的WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白選自SEQ ID NOS227-230。
一個特別方面，C15/全長prM/全長的E多肽誘導對選自四種血清型中每一種至少一種登革病毒所產生的免疫應答要約等於或者強於由選自SEQID NOS227-230中任何序列所誘導的對至少一種登革病毒的免疫應答。
這種C15/全長prM/全長的E多肽誘導產生一種或多種結合至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體。優選的，這種多肽會誘導產生一種或多種的對至少兩種，至少三種，優選至少四種登革病毒血清型的每種至少一種登革病毒的抗體。，這種多肽誘導產生結合至少一種血清型中至少一種登革病毒的抗體的數量要約等於或者多於由WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白所誘導產生的結合至少一種血清型中至少一種登革病毒的抗體的數量，其中選出用於比較的每種特定血清型的WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白選自SEQ IDNOS227-230。
一方面，重組的C15/全長prM/全長的E多肽誘導產生許多結合至少兩種或至少三種血清型中每種至少一種登革病毒的抗體，其中所產生的抗體數量分別約等於或多於由選自SEQ ID NOS227-230的對應至少兩種或三種血清型的每種的WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白所誘導產生的結合至少兩種或至少三種血清型中每種至少一種登革病毒的抗體的數量。在一個實施方案種，C15/全長prM/全長E多肽誘導產生的結合登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中每種至少一種病毒的抗體的數量約等於或者多於由SEQ ID NOS227-230中任一序列所誘導產生的結合四種血清型每種至少一種登革病毒的抗體的數量。
與同一血清型的登革病毒的相應的野生型C15/全長prM/全長的E多肽所誘導的抗體相比，該重組野生型C15/全長prM/全長的E多肽誘導的抗體能更加特異性的結合至少一種特定血清型的至少一種特定登革病毒，其中野生型C15/全長prM/全長的E多肽選自SEQ ID NOS227-230。
本發明重組C15/全長prM/全長的E多肽的另一個特性是可以誘導產生針對至少一種血清型的至少一種登革病毒的中和抗體效價。一方面，這種多肽產生針對至少兩種，或至少三種，或至少四種血清型中每種至少一種登革病毒的中和抗體效價。一些該多肽誘導受試者對至少兩種、三種或四種血清型的每種至少一種登革病毒的至少一種中和抗體應答，而在將受試者分別與至少兩種、三種或四種血清型每種至少一種登革病毒接觸時沒有出現抗體依賴性增強(ADE)現象。
這種多肽誘導受試者產生的對至少一種血清型至少一種登革病毒的中和抗體效價約等於或者大於由至少一種血清型的至少一種登革病毒的WTC15/全長prM/全長E融合蛋白所誘導的受試者對至少一種血清型的至少一種登革病毒的中和抗體的效價，這裡的WT C15/全長prM/全長的E融合蛋白可以選自SEQ ID NOS227-230。更進一步的，一些多肽產生的對至少兩種、三種或四種血清型中每種至少一種登革病毒的中和抗體效價要分別約等於或者大於由至少兩種、三種或四種血清型中每種至少一種登革病毒的WTC15/全長prM/全長的E融合蛋白所產生的對至少兩種、三種或四種血清型中每種至少一種登革病毒的中和抗體的效價，其中的WT C15/全長prM/全長的E多肽可以選自SEQ ID NOS227-230。
一方面，具有這些免疫原性原性和免疫刺激性的多肽包含與SEQ IDNO140或者SEQ ID NO141的胺基酸序列有至少約95％胺基酸序列同一性的胺基酸序列。特別的，這樣的多肽包含有SEQ ID NO141。
本發明中一些該C15/全長prM/全長的E多肽誘導的對至少兩種血清型中每種中至少一種登革病毒的免疫應答要約等於或者強於由至少兩種血清型的每種WT C15/全長prM/全長的E多肽所誘導的對任何至少兩種血清型中每種至少一種登革病毒的免疫應答，其中WT C15/全長prM/全長的E多肽可以選自SEQ ID NOS227-230。
重組C15/全長prM/全長的E多肽具有另外的生物學屬性，其可以良好的誘導，促進，調控，和/或增強免疫應答，例如，在受試者細胞，包括如哺乳動物細胞中形成免疫原性病毒或者類病毒顆粒的能力。本發明提供了大量這種重組多肽，其中該多肽能夠互相結合(如預期的，與其它的多肽和核酸)形成一種或更多的VLPs或病毒。
本發明還提供了本發明中所述的多肽的抗原性或免疫原性片段。這種多肽的抗原性或免疫原性片段可以包含約10個，約20個，約30個，或約50個胺基酸的胺基酸序列，其含有至少一個在相應的WT登革病毒C15，prM和E蛋白胺基酸序列中沒有的T細胞抗原決定簇，其中新的抗原決定簇從上述的新的免疫原性胺基酸序列中的其中一個獲得。通過例如引入另外的胺基酸殘基和/或多肽或肽段(例如，信號肽序列或C端E蛋白序列，N端prM蛋白序列，或者C15/N端prM蛋白序列)從而增加多肽的長度來擴展所述多肽。該多肽通常的和優選的大小將進一步的在本申請別處進行論述。
C端E蛋白片段多肽本發明的一個方面，本發明中所述的重組免疫原性或抗原性截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，和C15/全長prM/截短的E多肽可以進一步的包含另外的胺基酸序列，該胺基酸序列類似、基本類似、或同源於黃病毒的野生型E蛋白或黃病毒重組E蛋白(例如，更好是一種登革病毒或黃熱病毒)的C端跨膜區的氨基序列段或片段(如，疏水胺基酸序列)。該胺基酸序列，可以被稱作(黃病毒)E蛋白的C端胺基酸片段，C端E蛋白片段(或者簡稱「restof envelope」或「rest of env」序列)，通常具有大約20到大約70的胺基酸殘基的長度，更一般的是大約40到大約65胺基酸殘基的長度，而常常是大約40到大約65胺基酸殘基的長度。這樣的胺基酸片段可以包含對應E蛋白的「主幹錨定區域」的胺基酸序列，其通常當E蛋白結合在病毒中時，將E蛋白的剩餘部分(如，截短的E蛋白部分)錨定到細胞膜上。
一些上述的C端E蛋白片段每一個都含有一個胺基酸序列，這個序列中至少大約有45％，理想的是至少大約50％或55％(例如，大約60-99％)，優選是至少大約60％或65％，再優選是至少大約70％或75％，更優選是至少大約80％或85％，而最優選是至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的胺基酸序列與SEQ ID NOS127-136中至少一個胺基酸序列同一性。
每一個這樣的C端E蛋白片段都位於靠近(例如，大約20個胺基酸之內)或融合到以下任一個上1)本發明中重組的截短包膜(tE)蛋白多肽的C端胺基酸(如，SEQ ID NOS 1-49和154-155)；2)本發明中重組PRM15/tE多肽的C端胺基酸(如，SEQ ID NOS 65-116)；3)本發明中重組全長的prM/tE融合蛋白的C端胺基酸；或4)本發明以上所述的重組C15/全長prM/Te蛋白多肽的C端胺基酸。該C端E蛋白片段用作延伸截短的E多肽的長度，使之達到與野生型黃病毒，優選特定血清型的登革病毒，的全長E多肽大約相等或基本相同的長度。因此，進一步含有該C端E多肽的本發明的重組截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，和C15/全長prM/截短的E多肽通常分別表示為重組全長E多肽，PRM15/全長的E多肽，和C15/全長prM/全長的E多肽。
一方面，(黃病毒)E蛋白的C端胺基酸片段的胺基酸序列包含，或者通常基本由對應下述的序列模式的胺基酸序列組成Gly Val Ser Trp Xaa1Xaa2Xaa3Ile Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Trp Xaa9Xaa10Asn Ser Xaa11Xaa12Thr SerXaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18Xaa19Xaa20Gly Xaa21Xaa22Thr Leu GlyXaa24Xaa25Val Xaa26Ala，其中Xaa代表任一胺基酸殘基(見SEQ ID NO137)。表5提供了序列模式中不同位置的優選胺基酸殘基。
表5

理想的情況是，這個序列模式中每一個可變位置被表5中一個優選的殘基佔據。
本發明還包括編碼上述和下述的全部重組多肽的多核苷酸。這些多肽和編碼多肽的核苷酸有效的用於本發明所述的方法中，這些方法包括，但不限於，通過誘導，調控，增強，和/或促進哺乳動物對至少一種黃病毒血清型中的至少一種登革病毒的免疫應答進行治療的預防性和/或治療性方法，和/或檢測或者診斷樣品中結合一種或多種血清型中一種或多種登革病毒的抗體存在的方法。
N端C15/截短的prM多肽重組PRM15/tE多肽和PRM15/全長E多肽可以進一步的包含另外的胺基酸序列，這個序列中至少大約有50％，理想的是至少大約60％(例如，大約65-100％)，優選的是至少大約70％，再優選是至少大約80％，而更優選是至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多的胺基酸序列與SEQ ID NOS117-126中至少一個胺基酸序列同一性。在一個實施方案中，該胺基酸序列至少有以下兩段(1)從衣殼蛋白序列的C端開始反向計算的黃病毒(例如，優選登革病毒)的重組或野生型衣殼(C)蛋白的最後15個胺基酸殘基，和(2)從prM蛋白序列N端開始順序計算的除了prM蛋白C端最後15個胺基酸外的黃病毒的(優選登革病毒)重組或野生型prM蛋白全部胺基酸殘基。一般的，段(1)和段(2)是連接或結合的，段(1)在段(2)之前，位於N端。該胺基酸序列通常被稱作C15/prM的N端胺基酸片段序列或N端C15/截短的prM多肽(或「rest of C15/PRM」，因為它包含C蛋白的15個殘基和prM蛋白除去15個C端殘基後的剩餘殘基)。該N端C15/截短的prM多肽通常有至少大約150，160，165，170，175或180個胺基酸殘基的長度。一些上述多肽片段有至少大約165到大約175個胺基酸的長度。一些上述的多肽片段有至少大約167到大約171個胺基酸的長度。
N端C15/截短prM多肽位於或接近(例如，大約20個胺基酸之內)，或直接融合到本發明所述的免疫原性多肽的信號肽或免疫原性胺基酸序列(例如免疫原性截短的E多肽序列或免疫原性全長E多肽序列)的N端上，其依賴於該多肽中信號肽的位置(和存在)。例如，在一種格式中，一個N端C15/截短的prM多肽位於或接近或直接融合到本發明的重組的PRM15/tE登革病毒多肽的N端(例如SEQ ID NOS65-116)或本發明的重組PRM15/全長E多肽的N端上(SEQ ID NOS139-148，236-253)。另一方面，該N端C15/截短prM多肽位於或接近(例如，大約20個胺基酸之內)或直接融合到本發明所述的一個重組的截短E登革病毒多肽的N端上(例如SEQ ID NOS1-49和153-155)或本發明的一個重組全長E多肽的N端上。
另一方面，重組PRM15/tE多肽或PRM15/全長E多肽進一步包括一個位於或接近或直接融合到PRM15/tE多肽或PRM15/全長E多肽的N端上的N端C15/截短prM多肽，其中N端C15/截短prM多肽含有對應SEQ ID NO138中所列序列模式的胺基酸序列，其包括Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Pro Xaa12Xaa13Xaa14Ala Phe Xaa15Leu Xaa16Xaa17Arg Xaa18Gly Glu Pro Xaa19Xaa20Ile Val Xaa21Xaa22Xaa23Glu Xaa24GlyXaa25Xaa26Leu Leu Phe Lys Thr Xaa27Xaa28Gly Xaa29Asn Xaa30Cys ProXaa31Ala Xaa32Asp Leu Gly Glu Xaa33Cys Xaa34Asp Tur Xaa35Thr TyrLys Pro Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39Xaa40Glu Pro Xaa41Asp Xaa42Asp CysTrp Cys Asn Xaa43Thr Xaa44Xaa45Trp Val Xaa46Tyr Gly Thr Cys Xaa47Xaa48Xaa49Gly Leu Xaa50Arg Arg Xaa51Lys Arg Ser Val Ala Leu Xaa52ProHis Xaa53Gly Xaa54Gly Leu Xaa55Thr Arg Xaa56Xaa57Thr Trp Met Ser Xaa58Glu Gly Ala Trp Xaa59Xaa60Xaa61Xaa62Xaa63Xaa64Glu Xaa65Trp Xaa66Leu Arg Xaa67Pro Xaa68Phe Xaa69Xaa70Xaa71Ala Xaa72Xaa73Xaa74AlaXaa75Xaa76Ile Gly Xaa77Xaa78Xaa79Xaa80Gln Xaa81，其中Xaa代表任意胺基酸殘基。表6提供了該N端C15/截短的prM多肽序列上可變(Xaa)位置的優選胺基酸殘基。
表6

理想的，上述序列模式中每一個可變位置上均是上面所列的胺基酸殘基。
在某些情況，本發明中的重組PRM15/tE多肽(例如具有與選自SEQ IDNOS65-116的多肽序列至少85％同源的多肽)進一步包含含有選自SEQ IDNOS117-126的序列的N端C15/截短prM多肽和/或含有選自SEQ ID NOS127-136的序列的C端E蛋白片段。
在其它方面，本發明的多肽，例如重組截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，或C15/全長prM/截短的E多肽，理想的包含一個C端E蛋白片段，其含有與四種血清型之一的野生型登革病毒E蛋白的C端E蛋白片段序列(例如，SEQ ID NOS 127-130)有少於100％的序列同一性(如，大約99％，98％，97％，96％，95％，94％，90％)的胺基酸序列。本發明的多肽，例如重組PRM15/截短的E多肽或PRM15/全長E多肽還或可選的包含N端C15/截短prM多肽，其含有與野生型登革病毒prM蛋白的N端C15/截短的prM多肽序列(例如，SEQ ID NOS117-120)有少於100％的序列同一性(如，大約99％，98％，97％，96％，95％，94％，90％)的胺基酸序列。
在某些方面，C15/全長prM/全長E多肽包含含有與野生型登革病毒E蛋白的C端E蛋白的序列有少於100％的序列同一性的C端E蛋白片段和含有與野生型登革病毒的N端C15/截短prM多肽有少於100％的序列同一性的C15/截短prM多肽，該多肽含有與選自SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345中至少一個序列有至少大約65％，70％，典型的是至少大約75％或80％，優選的是至少大約85％(包括例如至少大約85-99.5％)，進一步優選的是至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更多的胺基酸序列同一性的多肽序列。更優選的，該多肽含有(或至少含有大約80％，85％，88％，90％，95％，97％，98％，99％序列同一性的)選自SEQ ID NOS 139-148，236-253，343和345的多肽序列。含有與SEQ IDNO140或SEQ ID NO141相比至少大約80％，優選的是至少大約85％，更優選的是至少大約90％(例如大約90％，92％，93％，94％或95％)的序列同一性的多肽是本發明的特殊之處。優選的多肽含有(或至少含有大約96％，97％，98％，99％或更多序列同一性的)SEQ ID NO141的序列。
本發明還提供了獨立於上述任一多肽的本發明新的C端蛋白片段多肽和C15/截短prM多肽的應用。例如，含有或基本由至少一個該新的C端E蛋白片段多肽和/或至少一個該新的C15/截短prM多肽組成的多肽可以用來誘導或促進哺乳動物對如登革病毒的黃病毒的免疫應答；還可以用在診斷或測定生物體樣品中結合一個或多個登革病毒的抗體存在的方法中；和/或用於登革病毒免疫原或抗原的構造。本發明還提供了編碼C端E蛋白片段多肽和C15/截短多肽的核酸序列單獨或與其它核酸序列，包括編碼本發明PRM/tE多肽的核酸序列，結合後的應用。
發明人還設想了發明中(如SEQ ID NOS 56-64)新的PRM15同系物(也稱作「prM15 homologs」)的應用，例如，在登革病毒免疫原或抗原的構建中，作為截短的或全長的登革病毒E蛋白抗原(例如SEQ ID NOS 1-49和153-155)的信號肽，或者作為其它病毒多肽，如黃病毒的截短或全長E蛋白，或者非病毒多肽的信號肽。本發明還提供了編碼該信號肽的核酸序列(如這裡描述的編碼該胺基酸序列的多核苷酸部分)，單獨應用或者與其它的核酸序列，如重組截短E多肽結合後的應用。一方面，還設想了該信號肽核酸序列與免疫原性核酸(如編碼任一SEQ ID NOS1-49和153-155序列的核酸)在DNA疫苗中的應用。
免疫原性多肽包括或者基本上包括一個與選自SEQ ID NOS 1-49和153-155序列基本同源的胺基酸序列(例如至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％同源，優選的是至少大約90％，91％，92％，93％或94％同源，更優選的是至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)，其長度是至少大約400到500個胺基酸(更加典型的是至少440到460個胺基酸的長度)。該免疫原性胺基酸序列和相應的多肽本身的更低長度的限定通常是由該多肽所期望的用途所決定的。在一些情況下，對於用於促進對登革病毒免疫應答的免疫原性多肽，其大小類似於至少一個截短登革病毒包膜蛋白(如大約440個胺基酸)。可選的，該截短E多肽還可以延伸至本文所述的全長E蛋白多肽(具有一個至少與WT登革病毒E蛋白或WT黃病毒E蛋白長度相同的胺基酸序列)。可選的，對於用於誘導免疫應答的多肽，其含有PRM15/截短E多肽(如，具有大約435-465個胺基酸，或一個C15信號序列/全長prM/全長E多肽(如，具有大約650-680個胺基酸))。
病毒和類病毒顆粒本發明還提供了包含一個或更多本發明中的多肽，核酸，載體的重組或合成病毒和類病毒顆粒(VLPs)。這樣的可以減毒的病毒或VLPs，用於誘導，調節，增強或促進對選自上述至少一種血清型中至少一種黃病毒的免疫應答，而該黃病毒優選登革病毒。該病毒和VLPs還可以用於治療和/或預防黃病毒的傳染(如，一種或更多的登革病毒引起的傳染)或保護不被黃病毒傳染(如，一種或更多的登革病毒引起的傳染)。這樣的病毒和VLPs還可以用於疫苗來防止登革病毒傳染和/或ADE。
一方面，本發明提供的病毒包括(a)含有與選自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意核苷酸序列至少大約90％，95％或100％的序列同一性的核苷酸序列的核酸；和/或(b)含有與選自SEQ ID NOS 1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任意序列有至少大約90％，95％或100％序列同一性的胺基酸序列的多肽。
還提供了嵌合病毒，其包含(a)含有與選自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意序列有至少大約90％，95％或100％序列同一性的核苷酸序列的核酸，和至少一種選自包括黃病毒或腺病毒的其它病毒的基因組的附加核酸。黃病毒可以是一種登革病毒(如，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4)，或黃熱病毒，日本腦炎病毒；馬腦炎病毒；西羅尼病毒)；和/或(b)含有與選自SEQ ID NOS 1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任意序列至少大約90％，95％或100％序列同一性的胺基酸序列的多肽，和至少一種包含黃病毒的結構或非結構多肽或者包含黃病毒的結構或非結構多肽的片段的附加胺基酸，這裡所述的黃病毒是一種登革病毒(如，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4)，或非登革病毒，(例如黃熱病毒，日本腦炎病毒；馬腦炎病毒；西羅尼病毒)。
另一方面，本發明提供了誘導宿主對第一次黃病毒的免疫應答的方法，包括(a)提供一種包含有與選自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意序列至少大約90％，95％或100％序列同一性核苷酸序列的核酸，其中所述的核酸包含一個DNA序列；(b)由DNA序列產生傳染性的RNA轉錄物；(c)把RNA轉錄物引入細胞；(d)表達細胞內的RNA轉錄物以產生病毒；(e)從所述細胞內收集病毒；和(g)給宿主接種該病毒。
這裡所述的應用中，術語「病毒」不僅包括完整的病毒顆粒，而且包括含有一個或更多本發明所述多肽的類病毒顆粒(VLPs)。包含有上述C15/全長prM/全長E多肽和全長prM/截短E多肽之一的多肽的預期特徵是通過這種多肽在哺乳動物宿主內形成類病毒顆粒(VLPs)。VLPs缺少病毒複製所必需的病毒成分，因此表現出病毒的高減毒形式。本發明中的VLP可以表現為多肽(例如，重組抗原)，其對一種或更多的黃病毒血清型，優選的一種或更多的登革病毒血清型，有保護性。VLPs可以表現為多於一種的多肽(如，重組抗原)；例如，一個VLP可以表現為而且因此用作保護性抗原的多價疫苗。在一些實施方案中，本發明的方法用來獲得具有上述預期特性和屬性的VLPs，這些特性和屬性包括，例如，涉及增強的至少兩種黃病毒血清型(更好的是至少兩種登革病毒血清型)的交叉保護和/或交叉反應，分泌，和/或表達。以下幾種已知病毒的病毒蛋白可以形成VLPs，包括人乳頭病毒，HIV(Kang et al.，Biol.Chem.380353-64(1999))，塞姆利基森林病毒(Notka etal.，Biol.Chem.380341-52(1999))，人體多瘤病毒(Goldmann etal.，J.Virol.734465-9(1999))，輪狀病毒(Jiang et al.，Vaccine 171005-13(1999))，細小病毒(Casal，Biotechnology and Applied Biochemistry，Vol 29，Part2，pp141-150(1999))，犬細小病毒(Hurtado et al.，J.Virol.705422-9(1996))，和肝炎E病毒(Li et al.，J.Virol.717207-13(1997))。
可以通過任何合適的技術檢測到這樣的VLPs的構成。檢測介質中VLPs合適的已知技術包括，例如，電子顯微鏡技術，動態光散射(DLS)，選擇性色譜分離(例如，VLPs的離子交換，疏水交互作用，和/或尺寸排除色譜分離)和密度梯度離心法。
另一方面，本發明還提供了修飾，突變，合成或重組的登革病毒。因此，本發明提供了含有至少一個本發明所述的重組登革病毒核酸或多肽的修飾的(例如，突變，合成，或重組)登革病毒。一個具體實例，本發明提供了通過在受試者細胞群中本發明所述的重組核酸的表達或翻譯得到的修飾或重組登革病毒，所述的細胞例如，哺乳動物的細胞，包括例如，鼠，靈長類動物，和/或人類細胞。另外一個具體實例，本發明提供了一種包含至少一個本發明所述的重組DNA核苷酸序列的修飾或重組的登革病毒。另一個具體實例，本發明提供了通過在細胞群如哺乳動物細胞群內RNA核酸的表達或翻譯得到的修飾或重組登革病毒，該RNA核酸包含一個RNA核酸序列，該序列包括本發明所述的修飾或重組的DNA核酸序列，其中這樣的DNA核酸序列的每一個胸腺嘧啶核苷酸殘基都被一個尿嘧啶核苷酸殘基所代替；本發明還包括一個上述RNA核酸序列的互補序列。另一個優選具體實例是，本發明提供了包含RNA核苷酸序列的修飾或重組登革病毒，上述RNA核苷酸序列包含選自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中任意的分離或重組的DNA核酸序列，其中上述的DNA核苷酸序列中的胸腺嘧啶核苷酸殘基都被尿嘧啶核苷酸殘基所代替；本發明同樣提供了所述RNA核苷酸序列的互補序列。
屬性和特性本發明中的重組，合成，突變，和/或分離的多肽顯示出多種屬性和特性，而且在上下文種都有效。一個方面是，這樣的多肽可以用於檢測和診斷生物體標本中抗黃病毒抗體，特別是前面詳述的抗登革病毒抗體的方法。另一方面，本發明所述的重組，合成，突變，和/或分離的多肽的一個特性是可以促進動物或動物細胞組中對登革病毒中至少一部分(例如，登革病毒抗原，登革病毒抗原聚集物，登革病毒片段，登革病毒的VLP，或者選自一種，兩種，三種甚至四種血清型中的一個滅活，減毒或加強的登革病毒)的免疫應答，細胞組優選哺乳動物，更優選人類。「促進」包括任何可察覺的提高，包括誘導免疫應答和增強已經存在的免疫應答。本發明中的多肽可以在宿主中誘導細胞毒性(或其它T細胞)的免疫應答，體液(抗體介導的)免疫應答，或(首選的)兩者都有。這種多肽可以促進宿主，例如哺乳動物對至少登革病毒(如具體的登革病毒抗原)的一部分的抗體的產生。理想的，該多肽促進對登革病毒(可以由已知的IgG/IgM動力學分析技術所決定)的記憶抗體應答，而且該多肽誘導或促進對登革病毒的一種「穩固」(可記憶且無毒性的)抗體應答。
本發明中所述一種或更多的多肽的從屬於給藥或表達的對宿主例如哺乳動物的免疫應答還有更多的特殊特性，包括CD4+和CD8+淋巴細胞特別是CD8+淋巴細胞的引發和刺激，宿主細胞的抗登革病毒IgM和/或IgG抗體生成的促進，T細胞的活化和細胞因子的釋放(包括，但不限於，例如，一個或更多腫瘤壞死因子(TNF)(例如TNF-α))，產生一個或更多的白介素(IL)(例如，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12)，產生一個或更多的幹擾素(IFN)(例如，IFN-γ，IFN-α，IFN-β)，TGF(來自T細胞)，補體激活，血小板活化，增加和/或減少Th1細胞的應答，增加和/或減少Th2細胞的應答，和體液免疫的記憶。
本發明多肽的重要特性是增強受體內對選自一種或更多血清型，優選多種，中的至少一種登革病毒的免疫應答。例如，本發明提供了包含免疫原性胺基酸序列的多肽，這個序列可以在動物體內，例如哺乳動物體內，誘導一種或更多的結合選自至少兩種病毒血清型每種中至少一種登革病毒的抗體。
本發明中更優選的多肽可以增強動物體，例如哺乳動物對選自至少三種病毒血清型中每種一種或更多的登革病毒的免疫應答。例如，當抗原性或免疫原性的劑量被表達到，應用到，或傳遞到哺乳動物內時，本發明中特有的多肽會促進對選自至少三種病毒血清型每種一種或更多的登革病毒的一種或更多的抗體產生。
本發明中多肽的一個優點是具有在在體及離體情況下(用以對比只能在細胞培養物內誘導該免疫應答的多肽)，誘導對至少一種血清型中的至少一種登革病毒的至少一部分(優選多重部分一例如多重抗原決定簇)的免疫應答的能力。本發明中的一些多肽可以誘導受試者對所有四種已知的登革血清型的抗原(包括登革病毒Ags)的一種或更多的抗體(抗體反應)(例如，包括但不限於，SEQ ID NOS 2，3，5，25，29，66，67，69，89，93，44-46，108-110，140和141)。
本發明中PRM15/tE多肽的一個優點是具有誘導或增強對一種或更多血清型中一種或更多登革病毒的免疫應答的能力，這種誘導或增強效果要大約等於或甚至超過由包含有野生型登革病毒PRM15/tE多肽的PRM15/tE多肽(例如，SEQ ID NOS 149-152)所誘導或增強的對一種或更多血清型中一種或更多登革病毒的免疫應答的效果。優選的，這種PRM15/tE多肽具有至少等於或強於一個野生型任意血清型登革病毒PRM15/tE抗原多肽(例如，多於任意選自SEQ ID NOS 149-152的序列)同樣誘導或增強的對選自一種或更多血清型中一種或更多登革病毒的免疫應答的效果的能力。優選的，在誘導哺乳動物細胞對至少兩種，優選的為至少三種，更優選的是至少四種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答的效果上，本發明所述的多肽的效果要分別等於或強於野生型登革病毒PRM15/tE多肽的效果。
此外，在在體或離體條件下誘導或增強受試者對選自全部四種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答的效果上，本發明所述的一些多肽的效果也要或者選擇性的至少等於或強於所有四種血清型的野生型登革病毒PRM15/tE抗原多肽的結合的效果(如等於或強於SEQ ID NOS149-152的結合)。
本發明所述的C15/全長prM/全長E多肽的一個優點是具有大約相當於或者甚至好於由野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽(如，SEQ IC NOS227-230)同樣誘導或增強的對選自至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答的效果的能力。優選的，在誘導受試者對至少兩種，優選的為至少三種，更優選的是至少四種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答的效果上，本發明所述的多肽的效果要分別相當於或強於野生型登革病毒C15/全長prM15/全長E多肽的效果。
一方面，一個C15/全長prM/全長E多肽的具有好於一個任意血清型的C15/全長prM/全長E抗原多肽(如，多於任意選自SEQ IC NOS 227-230的序列)所誘導或增強的對選自至少一種血清中至少一種登革病毒的免疫應答的效果的能力。
而且，一些這樣的C15/全長prM/全長E PRM15/tE多肽也可以或者選擇性的在受試者體內或來自受試者細胞中的離體條件下，誘導或增強對至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答，且效果要至少大約等於或強於所有四種登革病毒血清型的C15/全長prM/全長E抗原多肽的結合(例如等於或大約SEQ ID NOS227-230的結合)對選自至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答的效果。
一些本發明所述的形成VLPs的C15/全長prM/全長E多肽誘導受試者中對至少一種血清型中至少一種登革病毒的免疫應答要大約相當於或強於一個不完全野生型登革病毒截短衣殼/全長prM/全長E VLP，一個滅活登革病毒顆粒，或兩者一起所誘導的同樣的免疫應答。選定的C15/全長prM/全長E多肽同樣具有至少相當於或強於由減毒的WT登革病毒誘導的受試者對同樣的選自至少一種血清型登革病毒中的至少一種登革病毒的免疫應答的能力。
本發明中所述截短E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽的特別的優點是，在同樣增強對選自所有四種已知的血清型中至少登革病毒的免疫應答時，它們具有大約相當於或強於同源性野生型登革病毒截短E多肽或PRM15/tE多肽(如，SEQ ID NOS 149-152)或相同血清型的C15/全長prM/全長E多肽(如，SEQ ID NOS 227-230)或所有四種血清型的該野生型多肽的結合，其中任一的能力。本發明進一步提供了對選自所有四種血清型中一種或更多登革病毒的免疫應答的增強效果強於由任意血清型或其組合的野生型登革病毒PRM15/tE所誘導的免疫應答的效果(例如，強於基本上包含任意選自SEQ ID NOS 149-152中序列的多肽所誘導的免疫應答的效果)。本發明還提供了對選自所有四種血清型中一種或更多登革病毒的免疫應答的增強效果強於任意血清型或其組合的野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽所誘導的免疫應答的效果(例如，強於基本上包含任意選自SEQ ID NOS227-230中序列的多肽)。
本發明中所述多肽產生或誘導的免疫應答可以由任意合適的方法進行度量。評價體液免疫應答的合適技術的實例包括流動血細胞計數，免疫印跡法(檢測薄膜緣蛋白)，包括點印跡法，免疫組織化學法(細胞或組織著色)，酶免疫測定法，免疫沉澱反應法，免疫組織化學法，RIA(放射性免疫測定)和其它EIAs(酶免疫測定)，例如ELISA(包含夾心ELISA和競爭ELISA的酶聯免疫吸收實驗)和ELIFA(酶聯流動免疫分析)。ELISA分析包括特別的第一抗體與抗原的反應。第一抗體-抗原複合物的結果通過使用一個對第一抗體的第二抗體進行檢測；第二抗體被酶標記而且一個酶介導的顯色反應通過與第一抗體的反應產生。用於這些分析的合適的抗體標籤包括放射性同位素；酶，例如山葵過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)；生物素；和螢光染料，例如螢光素或若丹明。在這裡直接或間接的免疫測定都可以使用。HPLC和毛細管電泳法(CE)也可以用在免疫測定中來檢測抗體與目標物質的複合物。這些技術的常規指導方法和相關原理介紹在例如，Harlow and Lane(1998)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York，Hampton R et al.(1990)SEROLOGICAL METHODS ALABORATORY MANUAL，APS Press，St.Paul Minn.，Stevens(1995)CLINICAL IMMUNOLOGY AND SEROLOGYALABORATORY PERSPECTIVE，CRC press，Bjerrum(1998)HANDBOOK OFIMMUNOBLOTTING OF PROTEINS，Vol.2，Zoa(1995)DIAGNOSTICIMMUNOPATHOLOGYLABORATORY PRACTICE AND CLINICALAPPLICATION，Cambridge University Press，Folds(1998)CLINICALDIAGNOSTIC IMMUNOLOGYPROTOCOLS IN QUALITY ASSURANCEAND STANDARDIZETION，Blackwell Scinec Inc.，and Maddox D E et al.(1983)J.EXP.MED.1581211。ELISA技術和相關原理的特別介紹在例如，Reen(1994)Methods Mol Biol.32461-6，Goldberg et al.(1993)Curr OpinImmunol5(2)278-81，Voller et al.(1982)Lab Res Methods Biol Med559-81，Yolken et al.(1983)Ann N Y Acad Sci420381-90，Vaughn et al.(1999)Am JTrop Med Hyg60(4)693-8，and Kuno et al.J Virol Methods(1991)33(1-2)101-13。有關Western blot的指導技術的介紹可以在以下找到，如，Ausubel et al.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(WileyInterscience Publishers 1995).專門可以效仿的Western blot技術應用的介紹可以在以下找到，如，Churdboonchart et al.(1990)Southeast Asian J Trop MedPublic Health21(4)614-20和Dennis-Sykes et al.(1985)J Biol Stand13(4)309-14。專門的有關流式血細胞計數技術的介紹提供在，例如，Diamond(2000)IN LIVING COLORPROTOCOLS IN FLOW CYTOMETRY AND CELLSORTING，Springer Verlag，Jaroszeki (1998)FLOW CYTOMETRYPROTOCOLS，1st Ed.，Shapiro(1995)PRACTICAL FLOW CYTOMETRY，3rdedition，Rieseberg et al.(2001)Appl Microbiol Biotechnol56(3-4)350-60，Scheffold and Kern(2000)J Clin Immunol20(6)400-7，and McSharry(1994)Clin Microbiol Rev(4)576-604。
簡單地說，蛋白質印跡分析可以通過把重組登革熱抗原，如本發明所述的重組多肽，附著到硝化纖維膜上並對吸附有染料的抗體進行染色。在使用指示酶的方法中使用有指示標籤的抗體。該標籤可以是一種酶，從而可以使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)。該標籤同樣可以是一种放射性元素，從而也可以使用放射性免疫測定(RIA)。
細胞毒性和其它T細胞免疫應答同樣可以通過任何合適的技術進行檢測。這樣的技術實例包括ELISpot分析(尤其是，IFN-gamma ELISpot)，細胞內因子染色技術(ICC)(尤其是與FACS聯合分析)，CD8+T細胞四聚體染色/FACS，標準的和修飾過的T細胞擴增分析，鉻釋放CTL分析，有限稀釋分析法(LDA)，和CTL殺傷分析。T細胞擴增分析的指南和原理描述在，如，Plebanski and Burtles(1994)J Immunol Meth17015，Sprent et al.(2000)PhilosTrans R Soc Lond B Biol Sci355(1395)317-22，and Messele et al.(2000)ClinDiagn Lab Immunol7(4)687-92.。LDA描述在如，Sharrock et al.(1990)Immunol Today11281-286。ELISpot分析方法和相關原理描述在，如，Czerinsky et al.(1998)J Immunol Meth247(1-2)17-24，Ogg and McMichael(1999)Immunol Lett66(1-3)77-80，Schmittel et al.(2001)J Immunol Meth247(1-2)17-24，Kurane et al.(1989)J Exp Med170(3)763-75，Chain et al.(1987)_J Immunol Meth 99(2)221-8，and Czerkinsky et al.(1988)J ImmunolMeth，11029-36，as well as U.S.Pat.Nos.5,750,356 and 6,218,132。四聚體分析描述在如，Skinner et al.(2000)J Immunol165(2)613-7。其它的T細胞分析技術在Hartel et al.(1999)Scand J Immunol49(6)649-54和Parish et al.(1983)JImmunol Meth58(1-2)225-37中都有描述。
T細胞的活化作用可以通過檢測CTL活性或活化抗原如IL-2受體，CD69或HLA-DR分子的表達來進行分析。純化T細胞的擴增可以在一個混合淋巴細胞培養物(MLC)分析中測量出來。MLC分析在本技術領域是已知的。簡要的說，混合淋巴細胞反應(MLR)使用了作為刺激器細胞的放射性PBMC和以同種異源的PBMC作為應答器。刺激器細胞是有放射性的(2500rads)，且是和同種異源的PBMC(1×105cells/well)在96孔平底微量滴定培養皿中按照1∶1的比例共同培養了總共5天。在培養期間的最後8小時內，細胞被3H-胸腺嘧啶進行1uCi/孔的脈衝振動，而且細胞通過上述的細胞收集器收集到濾紙上。3H-胸腺嘧啶的摻入是通過標準技術進行檢測。這樣分析中的T細胞增殖可以通過測試孔的平均每分鐘脈衝數來表示。
ELISpot分析可以測量T細胞分泌的特有細胞因子如幹擾素-gamma或瘤壞死因子-alpha的數量，這種細胞因子可用做T細胞效應器的標記物。專用細胞因子ELISA儀器可以在市場上買到(例如一個IFN-gamma-專用ELISPot可以從RD Systems，Minneapolis，MN得到)。ELISpot分析在實施例部分有進一步的描述(這些和其它的分析在例如實施例23-26中有描述)。
本發明所述的一種特有的重組多肽(如，重組截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，全長prM/全長E多肽，全長prM/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽)可以誘導對選自一種特定血清型的登革病毒的免疫應答大致相當或者強於的同源野生型登革病毒多肽(如，截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，全長prM/全長E多肽，全長prM/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽)誘導的免疫應答，這裡的大致相當或強於的免疫應答通常是大致相當或更強的體液免疫應答。例如，對於病毒血清型重組多肽會產生至少大約相當或多於同源野生型登革病毒多肽(如，野生型登革病毒截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，全長prM/全長E多肽，全長prM/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽)所產生的中和抗體滴度。本發明所述的特有的重組截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，全長prM/全長E多肽，全長prM/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽在哺乳動物細胞內或體內理想的可以誘導T細胞反應，這個反應基本上相似於(例如，實際上至少大約80％，大約85％，大約90％，大約95％或大約100％)哺乳動物細胞內或體內的伴隨給藥或野生型登革病毒截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，全長prM/全長E多肽，全長prM/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽表達的T細胞反應。
可選的，為了在哺乳動物體內得到期望的T細胞反應，重組截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽可以通過給藥或者相應的一個或多個野生型登革病毒截短E多肽或全長E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全長prM/全長E多肽，E多肽，和/或其中片段分別的(例如，含有已知的上述多肽的T細胞抗原決定簇的胺基酸序列)表達。為了維持T細胞反應，重組多肽中可以含有一個或多多的多肽片段，這些片段來自衣殼蛋白，prM蛋白和野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4E蛋白的至少8個胺基酸長度，而且典型有大約8個到大約25個胺基酸(例如，大約10個到大約20個胺基酸)長度，這裡所述的一個或多多多肽片段包含一個野生型登革病毒C蛋白，prM蛋白或E蛋白的T細胞抗原決定簇。另一個優選方案，一個重組PRM15/tE多肽包含有T細胞抗原決定簇序列，或這種T細胞抗原決定簇序列的變體或變體，這些序列可在兩種或多種(例如交叉)血清型的，更好的是三種或四種血清型的野生型登革病毒PRM15多肽和/或E蛋白中觀察到。另一個優選方案，一個重組C15/全長prM/全長E多肽包含有T細胞抗原決定簇序列，或這種T細胞抗原決定簇序列的變體或變體，這些序列可在兩種或多(例如交叉)種血清型的，優選的是三種或四種血清的野生型登革病毒C15多肽，prM蛋白，和/或E蛋白中觀察到。
本發明所述重組多肽(包括，如tE或全E多肽，PRM15/tE多肽，或C15/全長prM/全長E多肽)的一個優點是具有在受試者中誘導對登革病毒中和抗體應答的能力。中和抗體應答可以被例如蝕斑減少中和實驗的方法測量出來。任意合適的PRNT分析法都可以用來檢測一個多肽(或表達這種多肽的多核苷酸)是否誘導對選自一種或多種的血清型中的一種或更多種的登革病毒的一種或多種的中和抗體。一個對登革病毒的蝕斑減少中和實驗的實例在Russel et al.，J Immunol(1967)99285-290中有相應介紹，其中綜合了涉及到它的全部用途。其它的PRNT方法和形式都是本技術領域眾所周知的一般技術方法。這種分析的結果依賴於所選擇的期望中和程度。例如，一個PRNT50，是減少至少50％血小板形成單位(p.f.u)的經檢驗的最高血清稀釋物。典型的情況是報導出相反的PRNT數值(具體細節見實施例部分中這類分析方法的實行和分析的結果)。較好的是，如上述，選擇本發明中的重組多肽(和本發明中表達這種多肽的多核苷酸)能夠對受體中選自至少一組或至少兩種血清的登革病毒誘導中和抗體反應。更佳的是，選擇本發明中的重組多肽(和本發明中表達這種多肽的多核苷酸)能夠對受體中選自至少三種血清中每組一種或更多的登革病毒誘導一個中和抗體反應。如上所述，一些本發明中所述的重組多肽能夠對受試動物中例如哺乳動物體內選自已知的四組野生型登革病毒血清中每組一種或更多的登革病毒誘導中和抗體反應。
除了可以誘導中和抗體反應之外，在誘導對選自至少一組血清中至少一種登革病毒的中和抗體方面，本發明所述的重組PRM15/tE多肽也相當於或高於同源血清野生型登革病毒PRM15/tE多肽中的至少一種(例如選自SEQID NOS 149-152中的至少一種)。相比所有我們所知的四組血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽，本發明這樣的多肽對選自至少一組血清中的至少一種登革病毒也可以或者選擇性的誘導更高的中和抗體的滴度(例如相比分別含有基本上選自SEQ ID NOS149-152的四種多肽的組合有更高的中和抗體滴度)。另一方面，相比任意病毒血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽，本發明提供的一種PRM15/tE多肽可以對受體中選自四組血清中每一組的至少一種登革病毒誘導更高的中和抗體滴度(例如相比含有任何本質上選自SEQID NOS 149-152序列的多肽有更高的中和抗體滴度)。
對選自至少兩種病毒血清中每一組至少一種登革病毒，優選的是選自至少三種病毒血清，更優選的是選自至少四種病毒血清的每一組至少一種登革病毒，本發明同樣提供了PRM15/tE多肽，這種多肽能夠對上述病毒誘導一個相當於或高於至少兩種或至少三種或至少四種已知血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽(例如SEQ ID NOS149-152中的至少兩種或三組或四組，或者基本上含有SEQ ID NOS149-152中任一序列的多肽)對上述病毒所誘導的中和抗體滴度。
另一方面，除了可以誘導中和抗體反應之外，在誘導產生針對選自至少一組血清中至少一種登革病毒的中和抗體方面，本發明所述的重組C15/全長prM/全長E多肽也可以產生相當於或高於同源血清野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽中的至少一種(例如選自SEQ ID NOS 227-230中的至少一種)的抗體滴度。相比所有我們所知的四組血清的野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽的組合，本發明這樣的C15/全長prM/全長E多肽對選自至少一組血清中的至少一種登革病毒也可以或者選擇性的誘導更高的中和抗體的滴度(例如相比分別含有本質上選自SEQ ID NOS227-230的四種多肽的組合有更高的中和抗體滴定度)。另一方面，相比任意病毒血清的野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽，本發明提供的一種C15/全長prM/全長E多肽可以對受試體中選自四組血清中每一組的至少一種登革病熱毒誘導更高的中和抗體滴度(例如相比含有任何本質上選自SEQ ID NOS227-230序列的多肽有更高的中和抗體滴度)。
對選自至少兩種病毒血清中每一組至少一種登革病毒，較好的是選自至少三種病毒血清，更好的是選自至少四種病毒血清的每一組至少一種登革病毒，本發明同樣提供了重組的C15/全長prM/全長E多肽，這種多肽能夠對上述病毒誘導一個相當於或高於至少兩種或至少三種或至少四種已知血清的野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽(例如SEQ ID NOS227-230中的至少兩種或三組或四組，或者本質上含有SEQ ID NOS149-152中任一序列的多肽)對上述病毒所誘導的中和抗體滴度。
本發明中一個特有的有益特徵是伴隨多肽有能力對受試體內所有已知的四組病毒血清的登革病毒誘導一個中和抗體反應。相比所有四組血清(例如，分別選自SEQ ID NOS 19-152和227-230)的同源野生型登革病毒多肽(例如，野生型PRM15/tE或野生型C15/全長prM/全長E多肽)或這種野生型多肽的組合，本發明所述PRM15tE和C15/全長prM/全長E多肽的一個意外的效果是能夠對選自所有四組血清的一種或更多的登革病毒誘導中和抗體的一個更高水平。
本發明中所述重組多肽的一個特有的期望特性是能夠對動物體內包括例如哺乳動物的脊椎動物體內的登革病毒誘導一個中和抗體反應，所述登革病毒至少是一種，較好的是選自多種血清中的至少兩種，更好的是選自所有四種登革熱血清中的登革病毒。因此，例如，從動物(例如哺乳動物)體中得到的血清投到本發明所述的一個重組多肽的免疫原性或抗原的總量(或投到足夠表達重組多肽的免疫原性或抗原總量的本發明所述的重組多肽總量)或其中表達本發明所述多肽的免疫原性或抗原的總量，被稀釋至少大約30倍，優選的是至少大約40倍或大約50倍，更優選的是至少大約60倍(例如至少大約70倍，80倍或更高)，在含有至少三種病毒血清中的登革病毒樣品的50％的登革病毒的蝕班減少中和滴度檢測，表現出中和抗體反應。
「抗原量(antigenic amount)」表示抗原的數量，例如一種多肽抗原或這編碼種多肽抗原的多核苷酸的數量，它足夠在體外細胞和/或受試者體內或受試者回體細胞或組織中誘導，提高，增強或調控免疫應答或免疫反應。可以通過例如服用或給予多肽本身的抗原量，或者服用或給予編碼這種抗原多肽的多核苷酸的數量，產生出多肽的抗原量。
另一方面，本發明所述的重組多肽對哺乳動物體內選自全部四組登革病毒血清型的至少一種登革病毒誘導一個中和抗體反應，這種重組多肽在感染登革病毒的哺乳動物上沒有出現抗體依賴性增強(ADE)的情況下被給藥。更加詳細的說，本發明提供了重組多肽，其中的血清來自動物(例如哺乳動物)，且其已經被給藥，服用了至少一種這種重組多肽的抗原或免疫原性劑量，或者至少一種重組核酸，或者稀釋至少大約40倍，大約50倍或60倍，優選的是至少大約70倍或大約80倍或更多的編碼和/或表達本發明所述的重組多肽的抗原或免疫原性劑量的載體，這種多肽中和了包含有選自在蝕班減少中和滴度檢測中四組病毒血清型中一組或更多組中至少一種登革病毒的樣品的至少30％，40％，45％，50％，55％，60％或更多。
另一方面，本發明提供的多肽對選自兩組或更多血清更好的是所有四組登革病毒血清型中每一組的一種或更多地登革病毒顯示出一個至少大約40，50，60或大約70或更高(例如，大約40到大約100，大約40到大約80，大約60到大約80，或大約70到大約100)的PRNT50數值的倒數。另一個優選的方面，來自受試體的包含有這種水平的多肽(通過表達的或服用的)的血清，稀釋至少大約20倍，40倍，60倍，70倍或80倍，可以中和在蝕班減少中和滴度檢測(PRNT)中至少至少約50％的一種黃病毒的樣品；另一方面，一種這樣的稀釋物可以中和含有PRNT分析中四組登革病毒血清型中每組一種登革病毒的樣品的至少約50％。
本發明另一個方面，本發明所述多肽對選自所有四組病毒血清型至少一種登革病毒誘導中和抗體反應，理想的情況是沒有顯示出一種血清型登革病毒不相符的中和抗體反應程度，而對選自其它血清型的一種或更多的登革病毒的免疫應答或保護是允許的(例如通過顯性免疫掩飾)。在這一方面，在對含有本發明所述至少一種重組多肽的抗原總量的受體中獲得的所有四組血清中每一組一種或更多登革病毒時，PRNT50數值的倒數在理想情況下在以下一個範圍內，最高的PRNT50數值的倒數少於大約4x最低的PRNT50數值的倒數(例如，少於大約3.9x，約3.8x，約3.5x，約3.4x或約3.3x最低的PRNT50數值的倒數)，少於大約3x最低PRNT50數值的倒數(例如，少於大約2.9x，約2.8x，約2.5x，約2.4x或約2.3x最低PRNT50數值的倒數)，而且更好的是少於大約2x最低PRNT50數值的倒數(例如，少於大約1.9x，約1.8x，約1.7x，約1.6x，約1.5x，約1.4x，約1.3x，約1.2x，約1.1x最低PRNT50數值的倒數)，或從大約4x或更少到大約1.5x更少的最低PRNT50數值的倒數。本發明還提供了一種包含兩種或更多血清型的兩個或多個的重組多肽混合物的組合物，其中所述組合物對不包括在組合物內的血清型的一種或多種登革病毒不表現出免疫顯性。
本發明所述的重組多肽可以是一種分泌的或細胞膜結合(或連接)多肽。在不少例子中，這種重組多肽理想情況下是一種分泌多肽。例如，在一個例子中，一些本發明所述分泌的重組的PRM15/tE多肽令人驚奇的比至少一種病毒血清型的野生型登革病毒PRM15/tE多肽分泌的更有效(例如，比包含或實質上含有至少一個選自SEQ ID NOS 149-152的序列的多肽更有效)，而且比任意四組病毒血清型的野生型PRM15/tE多肽還要更加的有效(例如，比包含有或實質上含有任意選自SEQ ID NOS 149-152的序列的多肽更有效)。一些本發明所述分泌的重組C15/全長prM/tE多肽要比至少一組病毒血清型的WT登革病毒C15/全長prM/tE多肽分泌的有效，且比任意選自四組病毒血清型的WT C15/全長prM/tE多肽更加有效。
本發明所述分泌的重組C15/全長prM/全長多肽要比至少一組病毒血清型的WT登革病毒C15/全長prM/全長多肽分泌的有效(例如，比包含有或實質上含有至少一個選自SEQ ID NOS 227-230的序列的多肽更有效)，而且比任意選自四組病毒血清型的WT C15/全長prM/全長多肽更加有效(例如，比包含有或實質上含有任意選自SEQ ID NOS 227-230的序列的多肽更有效)。
任何合適的技術可以用來分析多肽或蛋白的分泌。例如，分泌的水平可以通過比較蛋白質印跡法/免疫印跡法的結果來測量，而蛋白質印跡法/免疫印跡法利用被編碼這種多肽的多核苷酸轉染的細胞的上層清液和表達同源WT登革病毒的多核苷酸轉染的細胞的類似上層清液，其中這種重組和WT多肽都是通過一個本質上同源的表達盒進行表達(例如，包含或實質上含有識別啟動子，增強子和多聚腺嘌呤區的表達盒。例如見下述的一個pMaxVax10.1載體。下述的實施方案提供了這種分析蛋白分泌的技術。
任何合適的技術可以用來檢測本發明中重組多肽(或用於比較相應的野生型病毒多肽)的表達水平。這樣的技術包括例如RNA印跡法(介紹在如McMaster et al.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 744835-38(1977)andSambrook，infra)，逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)(介紹在如U.S.Patent5,601,820 and Zaheer et al.(1995)Neurochem Res201457-63，and in situ)，雜交技術(介紹在如U.S.Patents 5,570,340 and 5,506,098)。蛋白的定量同樣可以通過Lowry分析和其它分類的蛋白定量分析(見如Bradford(1976)AnalBiochem72248-254 and Lowry et al.(1951)J Biol Chem193265)來實現。從被編碼這種重組多肽的多核苷酸轉染的細胞溶解產物中得到的本發明所述重組多肽，蛋白質印跡法是評定重組多肽表達水平的一種首選技術。下述的實施方案提供了這種評定重組多肽表達水平(用於比較的野生型多肽的表達水平)技術的使用。
本發明所述多肽和編碼這種多肽的核酸有一個特有的有益特性，它們能夠在面對至少一組血清型至少一種登革病毒的時候在受試體內例如哺乳動物(包括靈長類動物)的體內誘導保護性免疫應答。更好的是，在面對選自至少兩種病毒血清型或至少三種甚至至少四種病毒血清型時，本發明所述的多肽可以在受試體內誘導一個保護性免疫應答。
產生保護性免疫應答決定於，例如，受試體被至少一組血清型中至少一種登革病毒的感染後沒有出現疾病情況或症狀。在小鼠模型實驗中，通常是在注射登革病毒之後，保護性免疫應答的產生使小鼠免於死亡。雖然高等的靈長類動物測試是首選測試，但通常是用這樣的小鼠模型實驗做登革病毒疫苗測試(如見，Johnson and Roehrig，J.Virol.73(1)783-6(1999))。在人體中，當在受到登革病毒感染後(最好是用多病毒血清型的至少一種登革病毒重複感染後)，保護性免疫應答的產生在可以檢測到的減少，更佳的是DF和/或DHF完全沒有發生的時候。通常情況，雖然不是必要的，但是本發明所述的保護多肽仍然會對一種或更多種登革病毒或複合血清型病毒(例如，兩組，三組或四組血清型)誘導出中和抗體。
本發明所述多肽可以包含上述任意特性的合適的組合。例如，其中一種情況，本發明提供的多肽(例如重組截短E多肽)，其包含與選自SEQ ID NOS1-49和153-155中至少一個胺基酸序列有至少大約65％，優選的是至少大約75％(例如大約80-95％)同源的一個胺基酸序列，這種多肽對受試體內選自四組病毒血清型中每一組中一種或多種的登革病毒能誘導出相比相應血清型的WT截短E蛋白多肽更加有效的抗體。
另一種情況，本發明提供的一種多肽(例如重組或合成PRM15/tE多肽)，其包含與選自SEQ ID NOS 65-116中至少一個序列有至少大約65％，至少大約75％，優選的是至少大約85％，90％或95％同源的胺基酸序列，這種多肽對受試體內選自四組病毒血清型中每一組中一種或更多種的登革病毒能誘導出相比任意選自SEQ ID NOS 149-152的WT登革病毒多肽所誘導的至少一種抗體更加有效的一種或多種的抗體。
另一種情況，本發明提供的一種多肽(例如重組C15/全長prM/全長E多肽)，其包含與選自SEQ ID NOS 39-148和236-253(或選自SEQ ID NOS39-145，147-148和236-253或任意含有兩種或更多這種多肽組合的序列)中至少一個胺基酸序列有至少大約65％，至少大約75％(例如大約80-95％)，和/或優選的是至少大約85％或90％同源的胺基酸序列，這種多肽對受試體內選自四組病毒血清型中每一組中一種或更多的登革病毒能誘導出相比任意選自SEQ ID NOS 227-230WT登革病毒多肽所誘導的至少一種抗體更加有效的抗體。
重組tE多肽可以與ER引導的信號胺基酸序列連接或延伸，通常其與C-末端黃病毒prM胺基酸序列基本上同源，更好的是與登革病毒PRM15序列或新的同源物(例如任意選自SEQ ID NOS 52-64的一個序列)基本同源(或選自上述序列)(如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選的是至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選的是至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)，如上所述，因此形成一個信號多肽/tE多肽，例如一個PRM15/tE多肽(例如任意選自SEQ ID NOS 1-49和153-155序列的多肽)。這樣一種重組tE多肽或PRM15/tE多肽可以被上述的C端E蛋白片段多肽延長形成重組全長E多肽或PRM15/全長E多肽，其中C端E蛋白片段多肽例如可以是一個與任意選自SEQ ID NOS 127-136序列大體同源(例如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選的是至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選的是至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的序列。另外或作為選擇的，一個重組PRM15/tE多肽或一個PRM15/全長多肽可以被上述的一個N端C15/截短prM多肽延長分別的形成一個重組C15/全長prM/tE或C15/全長prM/全長E多肽，其中N端C15/截短prM多肽例如可以是一個與選自SEQ ID NOS 117-126中任一序列基本同源(例如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選的是至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選的是至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的序列。如上面或下面的實施方案中所述，這樣的重組多肽相比由WT DEN序列形成的prM/E融合蛋白有更高的表達和/或分泌水平。
一些這種重組tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM/全長E和C15/全長prM/tE多肽同樣可以具有對受試體例如哺乳動物宿主中選自至少一組血清型的至少一種登革病毒以及更好的是選自多組血清型的一種或多種登革病毒誘導產生中和抗體反應的能力。如上所述，對選自至少一組血清型中的至少一種登革病毒的這種多肽會比至少一種同樣或相似血清型和相似大小和構型的登革病毒(例如，野生型登革病毒tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM/全長E，C15/全長prM/tE)誘導更高的中和抗體滴度。一些這種重組tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM/全長E和C15/全長prM/tE多肽也具有對受試體中選自至少一組血清型的至少一種登革病毒誘導保護性免疫應答，更好的是具有對受試體中選自至少兩種血清型中每組一兩種登革病毒誘導保護性免疫應答。這些本發明所述的重組tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM/全長E和C15/全長prM/tE多肽也具有對受試體中選自DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4血清型中每組至少一種登革病毒誘導保護性免疫應答。理想的是，這些多肽在沒有ADE發生時對選自兩組或更多登革病毒血清中一種或多種病毒誘導這樣的中和抗體反應和/或保護性免疫應答。
另一個優選方案，本發明提供了重組tE多肽，其中包含與至少一種選自SEQ ID NOS 1-49和153-155的胺基酸序列有至少大約65％，至少大約75％(例如大約80-95％)，優選的是至少大約85％或大約90％或大約95％胺基酸序列同一性性的胺基酸序列，這種多肽會對受試體中至少兩種病毒血清型中一種或多種登革病毒誘導一個中和抗體反應。更好的是，這種多肽會對受試體中選自DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4血清型中每組一種或多種的登革病毒誘導中和抗體反應。可選擇的，這種中和抗體(Ab)的產生相比一種或多種登革病毒的同源野生型截短E能產生更高的中和抗體滴度。這些多肽同樣可以結合本發明所述的任意上述特性，或其中的組合物，伴隨多肽(例如，ER引導序列的包涵物，至少一個C端E蛋白片段多肽和/或至少一個N端C15/截短prM多肽的包涵物，高等的分泌物，高等的表達物，和受體例如一種哺乳動物體內對多種血清型的一種或多種登革病毒在沒有ADE產物時的護保性免疫應答產物)。這樣的多肽表現出本發明多肽的一種或更多特性(例如，能夠對一中或多種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答；相比對應WT登革熱多肽，能夠對一種或多種血清型的至少一種登革病毒誘導更強的免疫應答；能夠對受試體中選自多種血清型的一種或多種登革病毒誘導中和抗體產物)或者其中的任意合適的組合。這些多肽均可以用於本發明所述的方法之中，包括對至少一種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答的方法，和對登革病毒誘導保護性免疫應答的方法，和/或檢測樣品中一種或種多血清的登革病毒的抗體存在。
本發明的另一個方面，這種多肽包含有與SEQ ID NOS 65-116其中至少一個序列基本同源的(例如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選的是至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選的是至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)胺基酸序列。更佳的多肽包含有任意選自SEQ ID NOS 65-116的一個序列。這樣的多肽表現出本發明中伴隨多肽的上述任意特性(例如，能夠對一種或種多血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答；相比對應WT登革熱多肽，能夠對一種或多種血清型至少一種登革病毒誘導更強的免疫應答；能夠對受試體中選自多種血清型的一種或多種登革病毒誘導中和抗體產物)或者其中的任意合適的組合，而且可以用在對至少一種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答的方法，對登革病毒誘導保護性免疫應答的方法，和/或檢測或診斷樣品中對一種或多種血清型的登革病毒的抗體存在的方法。
還有另外一個方面，本發明提供了一種多肽，這種多肽包含有與SEQ IDNOS 139-148，236-253，343和345或SEQ ID NOS139-145，147-148，236-253，343和345其中任意一個序列大體同源的(例如，至少大約65％胺基酸同源性，優選的是至少大約75％的胺基酸同源性，再優選的是至少大約80％或85％的胺基酸同源性，而更優選的是至少90％或至少95％胺基酸同源性)胺基酸序列。其中較佳的多肽包含有選自SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345的其中一個序列。這樣的多肽表現出本發明中伴隨多肽的上述任意特性(例如，能夠對一種或多種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答；相比對應的WT登革熱多肽，能夠對一種或多種血清型至少一種登革病毒誘導更強的免疫應答；能夠對受試體中的多種血清型的一種或多種登革病毒誘導中和抗體產物)或者其中的任意合適的組合，而且可以用在對至少一種血清型中的至少一種登革病毒誘導免疫應答的方法，對登革病毒誘導保護性免疫應答的方法，和/或檢測或診斷樣品中的一種或種多血清型的登革病毒的抗體存在的方法。
另一方面，本發明提供了由包含多核苷酸序列編碼的重組截短E多肽，所述多核苷酸序列選自(a)具有與選自SEQ ID NOS 285-330或與其互補的多核苷酸序列中至少一種多核苷酸序列至少大約85％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸殘基均被尿嘧啶核苷酸殘基替代的SEQ ID NOS 285-330中的DNA序列或者與其互補RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列或與其互補的RNA多核苷酸序列具有至少大約85％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在嚴格條件下能與基本全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)在嚴格條件下能與基本全長的任意選自(a)-(d)的遺傳密碼簡併的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意組合的多核苷酸序列。
還有另外一個方面，本發明提供了由包多核苷酸序列編碼的重組PRM15/tE多肽，所述多核苷酸序列選自(a)具有與選自SEQ ID NOS 256-200和235或與其互補的多核苷酸序列中的至少大約85％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸殘基均被尿嘧啶核苷酸殘基替代的SEQ ID NOS 156-200和235中DNA序列或與者互補的RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列或與其互補的RNA多核苷酸序列具有至少大約85％，90％或95％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在嚴格條件下能與基本上全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)在嚴格條件下能與基本上全長的任意選自(a)-(d)的遺傳密碼簡併的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意組合的多核苷酸序列。這樣的多肽表現出本發明中伴隨多肽的任意特性而且可以用於本發明所述方法中，例如，對至少一種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答的方法，和/或檢測或診斷樣品中一種或種多血清型的登革病毒的抗體存在的方法。
另一方面，本發明包含由多核苷酸序列編碼的重組C15/全長prM/全長E多肽，所述多核苷酸序列選自(a)具有與選自SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344或與其互補的多核苷酸序列中至少大約85％，90％或95％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸殘基均被尿嘧啶核苷酸殘基替代的SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344中一個DNA序列或者與其互補的RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)與(b)中至少一個RNA多核苷酸序列或其互補的RNA多核苷酸序列具有至少大約85％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在嚴格條件下能與基本上全長的(a)-(c)的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(e)在嚴格條件下能與基本上全長的任意選自(a)-(d)的遺傳密碼簡併的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意組合的多核苷酸序列。這樣的多肽表現出本發明中伴隨多肽的上述任意特性而且可以用於本發明所述方法中，例如，對至少一種血清型中的至少一種登革病毒誘導免疫應答的方法，和/或檢測或診斷樣品中一種或多種血清型的登革病毒的抗體存在的方法。
本發明的重組多肽有利於能夠持久的對受試體中選自至少兩種，較好的是至少三種，而更好的是至少所有四組病毒中一種或多種登革病毒誘導免疫應答。例如，在給受試體服用或給予至少一個本發明所述的多肽的抗原或免疫原性計量之後，對選自至少一種血清中至少一種登革病毒誘導的中和抗體免疫應答可以持續至少大約30天，至少大約40天，較好的是至少大約50天，再好的是至少大約70或大約80天，更好的是至少大約100天，更久的是至少大約120天，而進一步可以持續至少大約180天(例如大約3，4，6或9個月，大約1年，2年或更久)。
另一方面，服用或給予本發明所述的至少一種多肽通過服用或給魚合適的核酸載體(例如一個pMaxVax10.1載體)該載體含有編碼至少一種抗原或免疫原性計量的至少一種多肽，在受試體中至少一種多肽的初始表達之後，對選自至少一種血清型中的至少一種登革病毒誘導的中和抗體免疫應答可以持續至少大約30天，至少大約40天，較好的是至少大約50天，再好的是至少大約70或大約80天，更好的是至少大約100天，更久的是至少大約120天，而進一步可以持續至少大約180天(例如大約9個月，大約1年，2年或更久)。
通過服用本發明所述重組多肽例如是一種重組嵌合的登革病毒PRM15/tE或C15/全長prM/全長E多肽的(或編碼表達這樣多肽的多核苷酸或載體，實施例中將進一步描述)獲得免疫應答，理想情況可以持續長於通過服用相應的野生型登革病毒多肽(例如是一種野生型登革病毒PRM15/tE或C15/全長prM/全長E多肽)或服用編碼表達這樣的野生型登革病毒多肽的多核苷酸或載體得到的一個更持續的免疫應答時間。
另一方面，本發明提供了一種包含有至少大約8個胺基酸殘基長度，至少大約10個胺基酸殘基長度或至少大約15個胺基酸長度的至少大約3，5，6，7，8，10，15，20，25，30個或更多的胺基酸(殘基)序列片段的重組或嵌合多肽，其中這樣的胺基酸殘基來自一個或更多的野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4prM/E胺基酸序列，而且其中的這種多肽包含有來自任意一個野生型登革病毒prM/E序列的至少大約2個(優選的是至少大約3，4，5，10，15或更多)不連續片段。這種重組或嵌合多肽也可以或選擇性的可以促進或增強免疫應答，特別是在體液免疫應答的情況下，大約相當於或高於包含4個或更少的不同登革病毒和/或黃病毒胺基酸序列片段的重組或嵌合登革病毒抗原和/或黃病毒抗原。
另一個面，例如，本發明提供了包含有至少大約1O到40個胺基酸殘基長度的至少大約5到20個胺基酸殘基片段的重組或嵌合多肽，其中這樣的胺基酸序列片段是一個或更多的野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4prM/E胺基酸序列的不連續片段。
核酸本發明還提供了一種包含有編碼本發明上述任意多肽包括重組和嵌合tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM/全長E和C15/全長prM/tE多肽的核苷酸序列的核酸。除非根據上下文正式說明或截然相反的情況外，術語「核酸」和「多核苷酸」在有關本發明所述的重組登革熱抗原編碼DNA，RNA或其它新的核酸分子中是同樣的含義。編碼本發明所述的一種重組，合成，突變和/或分離多肽的核酸可以是適於表達本發明所述多肽的核酸的任意類型(例如，單鏈或雙鏈標準RNA，DNA，或它們的組合體)，還可以包括任意合適的核苷酸鹼基，鹼基類似物和/或主鏈(例如，包含或由磷脂酸鹽更好的是磷酸二酯形成的主鏈)。對核酸的修飾特別的可以在一個編碼這種多肽的mRNA密碼子的第三位置上。提供了對包含在多核苷酸序列中的核苷酸修飾的例子，如the MANUAL OF PATENT EXAMININGPROCEDURE§2422(7th Revison-2000)。在文中別處有另外的和非常規的序列修飾的介紹。在一些例子中，本發明所述的核酸可以是一個分離核酸。本發明中的核酸可以被稱作重組的，合成的和/或突變的核酸或多核苷酸；本發明中的重組的，合成的和/或突變的核酸或多核苷酸通常被簡單的稱作一「重組核酸」，「重組多核苷酸」，或甚至更簡單的稱作一「核酸」或「多核苷酸」。本發明的核酸可以被稱作重組的或合成的編碼登革抗原的核酸。
另一方面，本發明的重組核酸包括任意導致在期望宿主細胞內表達或轉譯本發明所述重組多肽(例如合適的產物)的核苷酸序列。本發明重組多肽的合適產物可以是本發明多肽免疫原性劑量或抗原劑量的表達。「免疫原」是誘導，促進，增強或調控免疫應答的分子(例如，在基於體外細胞的分析，或服用免疫原的受試體內，或被移植到受試體中的來自體內的細胞(例如，受試體的細胞或組織))。另一個特別的方面，「免疫原」是引起免疫應答的抗原。在某一個特別方面，免疫原是引起強免疫應答的抗原，尤其是在對至少一種病原體(例如至少一種血清型的至少一種黃病毒)的保護性免疫的情況下。「免疫原劑量」通常是分子的數量，例如，多肽或多核苷酸，它們能夠誘導，促進，增強或調控體外細胞內的免疫應答，和/或受試體內或來自受試體的細胞或組織的免疫應答。另一方面，免疫原性劑量是指引起免疫應答的抗原的數量，這個免疫應答對至少一種病原體，例如一種黃病毒(例如一種或多種血清型的至少一種登革病毒)提供了至少部分或全部保護性免疫。多肽的免疫原形劑量的產生，可以通過例如對體外細胞或一定數量的受試體內或來自受試體內的細胞或組織服用或給予免疫原性劑量的多肽本身，或者通過對體外細胞或一定數量的受試體內或來自受試體內的細胞或組織服用或給予編碼免疫原性劑量多肽的核苷酸。
編碼本發明所述多肽的核酸具有上述的一個或更多屬性。本發明所述核酸同樣應用在本發明所述方法之中，包括對包含接觸，服用或給予編碼本發明所述多肽的核酸的受試體(或受試體的細胞群)中至少一種血清型中至少一種黃病毒(例如最好是登革病毒)誘導免疫應答的方法，對包含接觸，服用或或給予編碼本發明所述多肽的核酸的受試體(或其細胞群)中一種或多種血清型中至少一種黃病毒(例如最好是兩種或多種血清型中的至少一種登革病毒)誘導保護性免疫應答的方法。
同樣的，本發明所述核酸不局限於直接編碼用於表達或本發明多肽產物的核苷酸序列。例如，這種核酸包括由本發明所述多肽通過intein-like表達得到的核苷酸序列(在例如Colson and Davis(1994)Mol Microbiol12(3)959-63，Duan et al.(1997)Cell89(4)555-64，Perler(1998)Cell92(1)1-4，Evans et al(1999)Biopolymers51(5)333-42，and de Grey，TrendsBiotechnol(2000)18(9)394-99中有介紹)，或包含自剪接內含子(或其它自剪接RNA轉錄物)的核苷酸序列，其構成中間重組的編碼多肽的序列(如U.S.Patent 6,010,884中所述)。這種多核苷酸同樣包括一些序列，它們由通過得到編碼所述多肽的mRNA轉錄物達到RNA水平或通過轉錄之前的反式剪接機制達到的DNA水平(關於這種機制的原理在例如Chabot，TrendsGenet(1996)12(11)472-78，Cooper(1997)Am J Hum Genet61(2)259-66，and Hertel et al.(1997)Curr Opin Cell Biol9(3)350-57有介紹)。由於這種遺傳密碼子的固有簡併性，一些核酸可以編碼成本發明所述的任意特有多肽。因此，例如，這裡所述的任意特有編碼重組的登革熱抗原的核酸可以通過替換一個或更多密碼子為基於遺傳密碼子簡併性的同等密碼子(由這種密碼子有關的胺基酸進行稱呼)來進行修飾。
本發明所述多核苷酸可以通過任意合適的合成，處理和/或分離技術或它們的組合技術來獲得。例如，本發明所述多核苷酸通常且較佳的通過標準核酸合成技術如本技術領域已知的固相合成技術獲得。這些技術中，適於大約100個鹼基的片段通常是分別合成，然後結合例如酶或化學連接的方法，或多聚酶介導的重組方法形成本質上任意期望的連續核酸序列。通過化學合成技術的使用，也可以容易(或選擇性的完成)完成本發明所述核酸的合成，這些化學合成技術例如，典型的磷醯胺方法，介紹在例如Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters221859-69，或Matthes et al.(1984)EMBO J3801-05，這些通常用於自動化合成方法。本發明所述多核苷酸期望通過磷醯胺技術更好的是通過自動DNA合成器所獲得。其它合成核酸的技術及相關原理的介紹在，如，Itakura et al.(1984)Annu Rev Biochem53323，Itakura et al.(1984)Science1981056，and Ike et al.(1983)Nucl Acid Res11477。
通常，普通的成品核酸可以通過各種商業資源獲得，例如The MidlandCertified Reagent Company([email protected])，the Great American GeneCompany(http//www.genco.com)，ExpressGenInc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)。同樣的，普通的肽和抗體也可以通過各種資源獲得，例如PeptidoGenic([email protected])，HTIBioproducts，Inc.(http//www.htibio.com)，和BMA BiomedicalsLtd.(U.K)，Bio.Synthesis，Inc。
用於修飾核酸的重組DNA技術在本技術領域是已知的(例如，限制性核酸內切酶消化，連接，逆轉錄法和cDNA生產法，和PCR)。有用的重組DNA技術技術和相關原理介紹在，如，Mulligan(1993)Science260926-932，Friedman(1991)THERAPY FOR GENETIC DISEASES，OxfordUniversity Press，Ibanez et al.(1991)EMBO J102105-10，Ibanez et al.(1992)Cell69329-41(1992)，and U.S.Patents 4,440,859，4,530,901，4,582,800，4,677,063，4,678,751，4,704,362，4,710,463，，4,757,006，，4,766,075和4,810,648，而更多的介紹出現在Sambrook et al.(1989)MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Press，其第三版(2001)，Ausubel et al.(1994-1999)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Wiley Interscience Publishers(with GreenePublishing Associates for some editions)，Berger and Kimmel，「Guide toMolecular Cloning Techinques」inMeth Enzymol，152 Acad.Press，Inc.(SanDiego，CA)，and Watson et al.，RECOMBINANT DNA(2d ed)。
如文中所詳述，本發明所述重組核酸包括(1)編碼上述任意多肽序列和其免疫原性或抗原片段(包括例如本發明所述的重組免疫原性tE，全長E，PRM15/tE，PRM15/全長E，C15/全長prM15/全長E和C15/全長prM/tE多肽)和其互補序列的多核苷酸序列；(2)與(1)(和其片段)所述多核苷酸序列互補的多核苷酸序列；在嚴格條件下與這裡定義的核酸包括任意選自(1)和(2)中多核苷酸序列和其互補序列雜交的多核苷酸；(3)包括(1)和(2)中所述的所有這種核酸序列的新的免疫原性或抗原片段，其中具有一種或更多的上述的免疫應答誘導屬性，或者編碼具有一種或更多上述免疫應答誘導屬性的一種或更多的多肽，以及這種片段的互補序列；和(4)上述物質的變體，類似物和同源衍生物。
本發明所述多核苷酸可以是雙鏈或單鏈，而且如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼(例如反義或互補)鏈。除編碼本發明所述多肽的核酸序列之外，本發明所述多核苷酸包括一個或更多另外的編碼核酸序列使得編碼例如融合蛋白，前蛋白，前蛋白原，異源跨膜結構域，引導序列(不同於信號序列)或類似物(更多的特有例子在文中有進一步介紹)，和/或包括非編碼核苷酸序列，例如內含子，或對編碼序列在合適的宿主內的表達起作用的5′和/或3′不翻譯區。
例如，編碼截短E或全長E蛋白的本發明所述多核苷酸(也就是tE-編碼或全長E-編碼多核苷酸)可以進一步包含核苷酸序列，該核苷酸序列編碼了位於靠近或融合到本發明所述tE-編碼或全長E-編碼免疫原性序列上的ER-引導信號序列。更佳的是，編碼了信號序列的核酸序列具有上述的信號序列的首選特徵(例如，一個黃病毒更好是一個登革病毒prM蛋白C端的15個胺基酸的片段，或與此基本同源的序列)。
另一方面，本發明提供了包含與選自SEQ ID NOS 272-284更佳的是SEQID NOS 272-280中至少一個序列具有基本同源的核苷酸序列(例如，至少大約65％，70％，75％，優選是至少大約80％或85％，而更優選是至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性)的編碼信號序列的核酸。這種編碼信號肽的多核苷酸序列用途相似而且包括了上述本發明信號肽的應用。另一方面，包含有選自SEQ ID NOS 272-284中一個序列的截短E多肽編碼或全長E多肽編碼核酸同樣是本發明所特有的。
本發明還提供了新的核酸在重組登革病毒抗原的用途和其它應用(例如，誘導對一種或多種登革病毒的免疫應答方法中的應用，和/或治療或預防方法如疫苗中的應用，在診斷或分類方法如核酸探針方法中的應用，在編碼這種重組登革病毒抗原的較小核酸序列的擴增方法中的應用(這些應用在文中別處有介紹))。
例如，其中一個方面，本發明提供了包含與選自SEQ ID NOS 285-330中至少一個多肽序列大體序列同一性的(例如，至少大約65％，70％，75％，優選至少大約80％或85％，更優選至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性性)多核苷酸序列的核酸。另一種特殊情況，這種核酸包含選自SEQ ID NOS 285-330的序列。這種核酸編碼有本發明所述的至少一種重組截短E多肽，而且通常稱作編碼重組tE多肽的核酸。這種核酸具有上述重組核酸的一個或更多的屬性。
包含和/或基本包含例如選自SEQ ID NOS 285-330中序列的核酸編碼的多肽的長度大約與本發明上述的截短E型重組登革抗原的長度相同。這種核酸通常是至少大約1300個核苷酸長度，而且通常是大約1300-1375個核苷酸長度(例如大約1340個核苷酸長度)。
本發明同樣提供了包含有編碼重組截短E多肽登革抗原的第一核苷酸序列和編碼一個信號肽的第二核苷酸序列的核酸。例如，其中一個例子，本發明提供了包含與選自SEQ ID NOS 156-200和235種至少一個序列基本同源的(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)序列的核酸。更佳的是，這種多核苷酸包含有選自SEQ ID NOS 156-200和235中的一個序列。這種核酸通常是至少大約1350個核苷酸長度，而且更通常是大約1350-1400個核苷酸長度(例如大約1385個核苷酸長度)。這種核酸編碼PRM15/tE多肽，而且通常稱作編碼PRM15/tE多肽得到核酸。另一種特殊情況，這種核酸包含有選自SEQ ID NOS 157-159，185，187，172，200和235中的一個序列。這種核酸具有上述的重組核酸的一個或更多屬性。
本發明還提供了與選自SEQ ID NOS 211-214中至少一個多肽序列基本序列同一性的(例如，至少大約65％，70％，75％，優選至少大約80％或85％，更優選至少大約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性性)核酸序列。另一種特殊情況，這種核酸包含有選自SEQID NOS 211-214的序列。這些核苷酸序列是分別編碼DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4 PRM15/tE多肽的人類優化密碼子核苷酸序列，而且通常稱作人類CO編碼WT PRM15/tE多肽的核酸。由這些核酸序列編碼的多肽提供了優於非人類CO編碼WT PRM15/tE多肽的核苷酸序列的生物學屬性。這種多核苷酸在結構上明顯不同而且缺少與非人類CO編碼WT PRM15/tE多肽的核苷酸序列的基本同源。例如，相比由非人類CO WT登革病毒PRM15/tE序列表達的相似PRM15/tE多肽，由這些序列編碼的多肽可以被表達和/或分泌更高的水平。
本發明還提供了與選自SEQ ID NOS 215-218中至少一個多肽序列大基本同源的(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)核酸序列。另一種特殊情況，這種核酸包含有選自SEQ ID NOS 215-218的一個序列。這些核酸序列是分別編碼DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4 PRM15/tE多肽的人類優化密碼子核苷酸序列，而且通常稱作人類CO WT編碼C15/全長prM/全長E多肽的核酸。由這些核酸序列編碼的多肽表現出優於非人類CO WT編碼C15/全長prM/全長E多肽的核酸表達的C15/全長prM/全長E多肽的生物學屬性。例如，相比由非人類CO WT編碼C15/全長prM/全長E多肽的核酸序列表達的相似C15/全長prM/全長E多肽，由這些序列編碼的多肽可以被表達和/或分泌更高的水平。
本發明還提供了編碼例如以下所述的抗原融合蛋白的重組核酸(1)C15登革病毒信號序列(其中同樣包括了作為信號序列的第一殘基的蛋氨酸殘基，因此形成一個16個胺基酸的信號序列)；(2)全長prM登革病毒序列；和(3)全長包膜(E)蛋白序列，其中這裡的三種序列按照1，2和3的順序融合在一起。另一方面，本發明提供了編碼抗原融合蛋白的重組核酸，這些抗原融合蛋白每一個都包含由全長prM登革病毒序列融合的一個全長包膜(E)蛋白序列。
另一方面，本發明提供了核酸，該核酸包含了至少包含編碼tE多肽的多核苷酸序列或編碼PRM15/tE多肽的多核苷酸序列的第一個多核苷酸序列，以及編碼有與選自SEQ ID NOS 127-136中序列具有至少大約55％，優選至少大約65％，更優選至少大約75％(例如至少大約80％，85％，90％，95％或更多)的胺基酸序列同一性性的多肽序列的第二個多核苷酸序列。或者，第二個多核苷酸序列與選自SEQ ID NOS 127-136中的序列具有至少大約55％，優選至少大約65％，更優選至少大約75％(例如至少大約80％，85％，90％，95％或更多)的胺基酸序列同一性性。在某些情況下，這種核酸理想的包含選自SEQ ID NOS 223-226的序列。
另一方面，本發明提供了包含與選自SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344中至少一個序列具有基本同源(例如至少大約65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性)的多核苷酸序列的核酸。一些特殊情況中，這種核酸包含有選自SEQID NOS 201-210，254-271，342和344中的序列。這種核酸編碼了本發明所述的重組C15/全長prM/全長E多肽，而且通常被稱作編碼重組C15/全長prM/全長E多肽的核酸。這種核酸具有上述重組核酸的一個或更多屬性。
本發明還提供了一種核酸，其基本上核酸的全長與本發明公開和/或上述的核酸序列在至少中等的嚴格雜交條件下，至少嚴格的雜交條件下，至少更嚴格的雜交條件下，或優選非常嚴格的雜交條件下進行雜交。「核酸的大體全長」是指這個核酸序列長度的至少大約50％，普遍的是至少大約60％，至少大約70％或75％，通常是至少大約80％，至少大約85％，至少大約88％，而且典型的是至少大約90％，例如，至少大約91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多。因此，本發明提供了一種多核苷酸，其包含與核酸與相關序列(例如，文中公開的核酸序列，如，選自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的序列)至少大約50％，優選至少大約65％，更優選至少大約80％雜交的核酸序列(檢測序列)。更佳的是，這種雜交核酸至少在嚴格條件下和優選至少更高的嚴格條件下與公開的核酸序列(例如，選自上述的SEQ ID NOS中的序列)雜交。核酸雜交實驗中的中等嚴格，嚴格和更高嚴格雜交條件是本技術領域的已知技術。同樣的，這裡簡要的介紹可以組合達到這些嚴格水準的因素的例子。
典型的中等嚴格條件包括在37℃下20％福馬林(或甲醯胺)的溶液3，0.5xSSC，50Mm磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸鹽溶液，和20mg/ml剪切降解的鮭精DNA中溫育，然後通過1xSSC在大約37-50℃條件下的過濾器中清洗，或者大體類似的條件，例如Sambrook et al.，supra，和/或Ausubel，supra中介紹的中等嚴格條件。
核酸分析的典型的嚴格(或常規嚴格)條件包括至少大約100個包括在有1mg肝素的50％福馬林(或甲醯胺)溶液中在42℃下培養的過夜進行雜交的核苷酸。正常嚴格的清洗中採用，例如，包含0.2xSSC的溶液在大約37-50℃條件下進行大約15分鐘的清洗(SSC的介紹見Sambrook，supar)。正常嚴格清洗先於低嚴格清洗去除背景探針信號。低嚴格清洗採用，例如，包含2xSSC的溶液在大約40℃條件下進行大約15分鐘的清洗。更嚴格清洗中採用包含0.15M Nacl的溶液在大約72℃下清洗大約15分鐘。對一個例如超過100個核苷酸的葡聚糖進行低於上述的正常嚴格清洗的中等(正常)嚴格清洗的實例是，採用包含1xSSC的溶液在大約45℃條件下進行大約15分鐘的清洗。對一個例如超過100個核苷酸的葡聚糖進行低嚴格清洗的實例是，採用包含4-6xSSC的溶液在40℃條件下進行15分鐘的清洗。對短探針(例如大約10到50個核苷酸)，嚴格條件通常包括低於大約1.0M鈉離子濃度的鹽，通常是PH值在7.0到8.3的大約0.01-1.0M鈉離子濃度的鹽(或其它鹽)，而且溫度通常是至少大約30℃。嚴格條件同樣可以包括例如甲醯胺等去穩定劑的加入。
高嚴格條件是所用的條件，例如，(1)用於清洗的低離子濃度和高溫，例如50℃條件下0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，(2)在雜交過程中使用變性劑，如甲醯胺，例如42℃，PH值6.5的含有50％(v/v)甲醯胺和0.1％BSA/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/50Mm磷酸鈉緩衝器的750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，或(3)42℃條件下使用50％甲醯胺，5xSSC(0.75M Nacl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(Ph6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt’s溶液，聲波降解鮭精DNA(50μg/mL)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸鹽溶液，清洗條件在(i)42℃在0.2xSSC，(ii)在55℃50％甲醯胺溶液中和(iii)55℃在0.1xSSC(優選結合EDTA)。
更一般地或可選擇地，高嚴格條件被選擇用於在大約5℃確定離子濃度和pH值或低於熱融點(Tm)溫度條件下的特殊序列的雜交。這個Tm是50％的檢測序列雜交到完全匹配試樣的溫度(具有確定離子濃度和pH值)。換句話說，這個Tm顯示了在給定條件下這種核酸雙螺旋50％變性的溫度，而且它給出了這種核酸雜交物穩定性的直接測量方法。因此，Tm相當於代表螺旋轉變成無規則螺旋的中間點的溫度；它依賴於長度，核苷酸組成，和核苷酸長度伸展的離子濃度。通常情況，在「嚴格條件」下，探針將雜交到它的目標序列，而不是其它序列。「非常嚴格條件」被選擇成同樣的Tm用於具體的探針。
DNA-DNA雙螺旋的Tm可以利用公式(1)進行估算Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是單價陽離子(通常是鈉離子)的摩爾濃度，(％G+C)是鳥嘌呤核苷(G)和胞嘧啶(C)的百分比，(％f)是甲醛的百分比，而n是雜交體核苷酸鹼基(也就是長度)的數目。見Rapley and Walker.MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK supra。一個RNA-DNA雙螺旋的Tm可以利用公式(2)進行估算Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是單價陽離子(通常是鈉離子)的摩爾濃度，(％G+C)是鳥嘌呤核苷(G)和胞嘧啶(C)的百分比，(％f)是甲醛的百分比，而n是雜交體核苷酸鹼基(也就是長度)的數目。Id.公式1和2通常只是在雜交物雙螺旋長於大約100-200個核苷酸的時候是準確的。Id.短於50個核苷酸長度核酸序列的Tm可以利用以下公式進行計算Tm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相應核苷酸中的數目。
大多數情況，未雜交核酸物質期望通過一系列清洗被清除，其中的嚴格程度可以在進行雜交分析時依據期望結果來進行調整。低嚴格清洗條件(例如用高濃度的鹽溶液和低的溫度)可以增加敏感度，但是產生非特異性的雜交信號和高背景信號。更嚴格條件(例如使用低濃度鹽溶液和接近於雜交溫度的高溫)降低背景信號，通常只剩下特異性信號。其它的雜交技術的介紹提供在，例如，Rapley and Walker，MOLECULAR BIOMETHODSHANDBOOK，supra(特別關於這種雜交實驗的介紹在part I，chapter 2，「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays」)，Elsevier，New York，也在Ausubel，supra，Sambrook et al.，supra，Wastonet al.，supra，Hames and Higgins(1995)GENE PROBES 1，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，England，and Hames and Higgins(1995)GENE PROBES2，IRL Press at Oxford University Press，Oxfird，England。
更好的是，完全與編碼重組登革抗原的序列互補的寡核苷酸序列或者其它公開的序列與編碼重組登革抗原的序列在至少大約2倍(2x)(例如大約2.5倍)，優選至少大約5倍，再優選至少大約7倍，更優選至少大約10倍的條件下進行的雜交，與編碼大約相同長度WT登革病毒多肽或編碼同源WT登革病毒多肽的多核苷酸序列具有至少大約90％同源性的完全互補的寡核苷酸序列相比，具有更高的信噪比。例如，如果這個重組序列是編碼PRM15/tE的多核苷酸序列，控制核酸可以是編碼DEN-1 PRM15/tE，DEN-2PRM15/tE，DEN-3 PRM15/tE或DEN-4 PRM15/tE多肽的編碼野生型PRM15/tE的多核苷酸，或者這種核酸包含有與選自任意以下核苷酸序列具有至少大約90％同源性的多核苷酸序列SEQ ID NO 231(包含GenBank Acc.No.AB074761的核酸殘基894-2285的DEN-1 PRM15/E trunc WT cDNA序列)；SEQ ID NO232(包含GenBank Acc.No.NC_001474的核酸殘基892-2274的DEN-2PRM15/E trunc WT cDNA序列)；SEQ ID NO 233(包含GenBank Acc.No.M25277的核酸殘基893-2263的DEN-3 PRM15/E trunc WT cDNA序列)；和SEQ ID NO 234(包含GenBank Acc.No.M14931的核酸殘基894-2285的DEN-4 PRM15/E trunc WT cDNA序列)。這種條件可以認為是對特異性雜交的指示。
上述雜交條件可以被調整或改變，在雜交核酸序列的選擇上達到任意期望的嚴格程度。例如，上述高嚴格雜交和清洗條件可以逐漸增強(例如，在雜交或清洗中通過增加溫度，減少鹽溶液的濃度，增加清潔劑濃度和/或增加例如福馬林的有機溶劑的濃度)直到滿足選擇的標準設定。例如，雜交和清洗條件可以逐漸增加直到具有完全與互補的靶序列匹配的探針，獲得的信噪比至少大約2.5x，而且任選地至少大約5x(例如大約10x，約20x，約50x，約100x，或甚至約500x)與非本發明所述核酸雜交得到同樣高的信噪比，這種已知的核酸選自GenBank，和/或野生型登革病毒核酸序列，包括例如，編碼野生型登革病毒截短E多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，PRM15/全長E多肽或C15/全長/prM全長E多肽的野生型登革病毒核酸。在雜交分析中，本發明的重組多肽通常與大約相同長度或包含相同或相似形式的野生型多肽進行比較或分析(例如，本發明的重組C15/全長prM/全長E多肽與野生型黃病毒C15/全長prM/全長E多肽進行比較)。
另一方面，本發明提供了包含至少大約900個核苷酸(包括例如至少大約900-3000個核苷酸，至少大約1000-2000個核苷酸)，優選至少大約1200個核苷酸，更優選至少大約1300個核苷酸的序列的核酸，其編碼了在受試體中對登革病毒誘導免疫應答的胺基酸序列，其中這個核酸在至少中等嚴格條件下選擇性的與至少一個選自SEQ ID NOS 156-200和235的序列雜交，用來野生型PRM15/tE編碼序列(例如SEQ ID NOS 231-234)或其一部分或片段進行比較。另一方面，例如，本發明所述核酸優選與選自SEQ ID NOS156-200和235種至少一個序列雜交，並與來自DEN-3的野生型PRM15/截短E編碼序列(例如GenBank Accession.No.M25277記錄的核苷酸序列的核苷酸893-2263)進行比較。更好的是，這個核酸選擇性的與至少一個選自SEQID NOS 156-200和235的序列雜交，並與任意已知的野生型和/或修飾的(例如減毒株)病毒包括GenBank所述黃病毒(和登革病毒)的WT PRM15/tE編碼序列和/或PRM15/tE編碼序列進行比較。對編碼例如WT PRM15/tE蛋白，WT PRM/全長E蛋白，WT C15/全長prM/全長E蛋白的野生型黃病毒核苷酸序列或WT黃病毒基因組的這些片段的測定是本技術領域的一種常用技術。
另一方面，本發明提供了包含至少大約900個核苷酸，通常是至少大約1000個核苷酸，典型的是至少大約1100或1200個核苷酸，更優選至少大約1300個核苷酸的序列的核酸，其編碼了在受試體中對登革病毒誘導免疫應答的胺基酸序列，其中這個核酸在至少中等嚴格條件下選擇性的與至少一個選自SEQ ID NOS 211-218的序列雜交，用來與任意選自SEQ ID NOS 231-234或其它已知的PRM15/tE編碼登革病毒的多核苷酸進行比較。理想的是，在高嚴格條件下，優選正常嚴格條件下，更優選在中等嚴格條件下，本發明的這種核酸雜交到選自SEQ ID NOS 231-234中至少一個序列的選擇性要好於它雜交到任意選自SEQ ID NOS 231-234或其它已知的PRM15/tE編碼登革病毒的多核苷酸。
本發明同樣提供了包含不與任一本發明所述的特有核酸序列(例如選自SEQ ID NOS 156-218，235，253-271，285-330，342和344的序列)雜交的序列的核酸，但是由於核酸密碼子的簡併性和/或非編碼序列的錯位(例如，從DNA序列中剪接出的核苷酸序列形成RNA，這個RNA編碼了包含與本發明所述任意重組多肽序列基本同源的序列(例如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的胺基酸序列的多肽)，將會發生雜交，從而不能影響其它雜交核酸(靶序列或檢測核酸)表達多肽，該多肽的結構，功能或其它類似於至少一種本發明所述重組的多肽。這種無雜交但是相關靶序列具有至少大約60，至少大約300，優選至少大約900，再優選至少大約1200，更優選至少大約1300個核苷酸的長度。
另一方面，本發明提供了編碼多肽的核酸，這種多肽包含與選自SEQ IDNOS 1-49和153-155至少一個序列基本同源(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大約400個胺基酸殘基的具有免疫原性的胺基酸序列。另一個方面，本發明包括了編碼多肽的核酸，這種多肽包含與選自SEQ IDNOS 65-116至少一個序列基本上同源(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大約450個胺基酸殘基的具有免疫原性的胺基酸序列。更特別的是，這種核酸編碼的多肽，其包含了與任意選自SEQ ID NOS 66，67，69，89，93和108-110中至少一個序列基本上同源(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大約400個胺基酸殘基的具有免疫原性的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供編碼多肽的核酸，這種多肽包含與選自SEQ IDNOS 139-148，236-253，343和345至少一個序列基本上同源(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大約650個胺基酸殘基的具有免疫原性的胺基酸序列。更加特別的情況是，這種核酸編碼了多肽，其中包含與任意選自SEQ ID NOS 140-141中的序列大體同源(例如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大約650個胺基酸殘基的具有免疫原性的胺基酸序列。優選的是，這種核酸編碼了包含SEQ ID NOS 141或140序列的多肽。
理想情況的，本發明所述核酸可以編碼在受試體內對至少一種血清型中的至少一種登革病毒誘導免疫應答的多肽。優選的，這種核酸包含這樣的序列，其編碼了至少一個包含了在受試體中對選自四種病毒血清型中每一3至少一種登革病毒誘導免疫應答的具有免疫原性的胺基酸序列的多肽。理想情況，由這種核酸序列編碼的胺基酸對受試體中至少一種血清型中至少一種登革病毒所誘導的免疫應答要至少相當於或強於由相應野生型特有血清型的登革病毒多肽所誘導的免疫應答。理想情況，這種核酸編碼了這樣多肽，該多肽在對受試體中一種登革病毒優選是多種(最佳是四種)病毒血清型中的一種或多種登革病毒表現出體液和細胞免疫應答(例如，重組C15/全長prM/全長E多肽，如包含有SEQ ID NO 141中序列的多肽)，其中由這種編碼的多肽促進/誘導的體液免疫應答，細胞免疫應答，或優選兩種免疫應答要分別的大約相當於或強於由相應野生型登革病毒多肽(例如，一組或更多組血清的野生型登革病毒C15/全長prM/全長E多肽)誘導/促進的相應的體液免疫應答，細胞免疫應答，和/或兩種免疫應答。
另一方面，這種重組多肽包含了多核苷酸序列，該序列編碼了至少一個在受試體內對至少一種血清性中的至少一種登革病毒誘導產生出一種或更多中和抗體的多肽。特殊情況下，這種重組核酸編碼了一種對受試體內至少兩種至少三種或優選至少四種中每一種至少一種登革病毒誘導產生出中和抗體的多肽。更好的是，相比至少一種血清型的至少一種登革病毒相同或相近大小的編碼野生型登革病毒抗原的野生型核酸和相同形式的野生型核酸，編碼至少一種血清中至少一種登革病毒的核酸，誘導的中和抗體滴度要至少相當於或大於上述野生型核酸的誘導的滴度。例如其中一個例子，編碼PRM15/tE多肽的核酸(例如SEQ ID NOS 156-200和235)對至少一種血清型中至少一種登革病毒所誘導的中和抗體的滴度，要至少相當於或大於編碼野生型PRM15/tE多肽的核酸(例如SEQ ID NOS 149-152)對至少一種血清型中至少一種登革病毒所誘導的中和抗體的滴度。
更好的是，本發明所述的重組核酸包含了多核苷酸序列，這個序列編碼了對受試體內四種血清型中每一種至少一種登革病毒誘導產生一種或更多中和抗體的免疫原性多肽(例如，編碼了重組tE，全長E，PRM15/tE，C15全長prM/全長E或prM/全長E多肽的核酸)。由這種編碼的免疫原性多肽誘導的中和抗體反應通常在哺乳動物被登革病毒感染時和/或在哺乳動物在受到這種重組核酸之前所感染的病毒血清型不同的血清型的登革病毒第二次感染時不會誘導ADE。
另一方面，本發明所述的重組核酸包含了多核苷酸序列，該序列編碼了對受試體內至少一種血清型中的至少一種登革病毒誘導保性護免疫應答的多肽。另一方面，這種核酸包含多核苷酸序列，該序列編碼多肽，當這個多肽在受試體中被表達時，這個多肽對選自至少兩種，優選至少三種，更優選所有四種病毒血清型中每一種至少一種登革病毒誘導保護性免疫應答。
本發明進一步提供了包含有本發明所述核酸的片段，這個片段編碼了對受試體內至少一種登革病毒誘導免疫應答的多肽，這個片段相比相似大小和/或形式的WT登革病毒抗原是特有的。優選的，這種核酸片段編碼了在受受體內對所有四種血清型中至少一種登革病毒誘導免疫應答的多肽，而更優選的是，編碼在受試體內對所有四種血清型中至少一種登革病毒誘導產生中和抗體和/或保護性免疫應答的多肽。
本發明所述的核酸可以包含除了上述編碼重組登革抗原的序列之外的任意合適數目的其它序列，和/或選擇性的可以包含任意合適數目的編碼重組登革抗原的序列。例如，核酸可以包含兩個或更多拷貝的編碼登革抗原的序列和/或編碼多種不同登革抗原的核苷酸序列。例如，可以包含以下的一個或更多的核酸序列(1)編碼重組C15/全長prM/全長E多肽的核苷酸序列；(2)編碼重組全長prM/全長E多肽的核苷酸序列；(3)編碼重組PRM15/tE多肽的核苷酸序列；(4)編碼WT或重組信號肽，C15或PRM15的核苷酸序列；(5)編碼重組tE多肽的核苷酸序列；和(6)編碼重組全長E多肽的核苷酸序列。
另一個特有方面，該核酸包含編碼佐劑和或細胞因子，共刺激分子(例如，哺乳動物的B7-1或B7-2或者具有與它們大體同源或包含其變體的胺基酸序列)，或異源抗原(例如，黃熱病毒抗原，瘧疾疫苗等)的第二序列。這種核酸可以包含與編碼重組登革抗原的序列任意合適方式結合的這種序列的任意合適數目和拷貝。這種序列可以是表達盒的一部分，但更通常和優選的情況是包含在分離表達盒中(這種序列的例子在下面有進一步的介紹)。在某些情況下，這種編碼重組登革抗原的序列和第二核酸序列(例如編碼細胞因子的序列)可以被連接到分離和不同的表達控制序列，它們可以在不同的時間進行表達和/或在對不同的應答下(例如對不同的誘導物的應答)。
通常，本發明所述的任何一個核酸可以通過使用文中舉例的有關上述編碼登革病毒prM/E融合蛋白序列技術進行修飾以增加在特殊宿主中的表達。在一個特殊宿主中最常用的密碼子被稱作最佳密碼子，而那些不經常被使用的被稱作少數或低使用密碼子(例如見Zhang，S.P.et al.(1991)Gene10561-72)。密碼子的代替可以影響宿主中優先密碼子的使用，這個過程稱作「密碼子最佳化」或「種類密碼子偏性控制」。包含一個特殊原核生物或真核宿主最佳密碼子的最佳編碼序列可以被用來增加轉譯比例或產生具有期望屬性的重組RNA轉錄物，所述屬性例如與非最佳序列產生的轉錄物相比具有更長的半衰期。生產最佳密碼序列的技術是已知的(例如見E.et al.(1989)Nuc Acids Res17477-508)。轉譯終止密碼子也可以被修改來影響宿主的選擇。例如，酒酵母和哺乳動物的優選終止密碼子分別是UAA和UGA。單子葉植物的優選終止密碼子是UGA，然後昆蟲和大腸桿菌優選使用UAA作為終止密碼子(例如見Dalphin，M.E.et al.(1996)Nuc Acids Res24216-218)。密碼子的相鄰排列同樣可以影響核酸序列的生物學屬性，而且本發明還提出了提供共同用於一個特殊宿主的密碼子相鄰排列的核酸的修飾方法。因此，本發明所述的核酸序列可以包含最佳密碼子核苷酸序列，也就是用於特殊物種的最佳密碼子頻率和/或最佳密碼子對(也就是相鄰密碼子)(例如，這種多肽可以通過在人體中由基於密碼子頻率或密碼子對所說的「少數」人類密碼子的替換得到的最佳多核苷酸序列的表達來被表達，例如使用在Buckingham et al.(1994)Biochimie 76(5)351-54和U.S.Patents 5,082,767，5,786,464和6,114,148中所述的這些技術)。可以效仿實施例1中提供的生產最佳密碼子序列的技術。
除了上述的最佳密碼子核酸序列之外(例如，編碼重組tE的多核苷酸序列，編碼全長E的多核苷酸序列，編碼PRM15/tE的多核苷酸序列，編碼C15/全長prM/全長E的多核苷酸序列，等等)，本發明所述核酸通常表達多肽的表達水平要高於編碼野生型登革熱多肽序列的相應野生型多核苷酸序列(例如，編碼WT登革病毒tE的多核苷酸序列，編碼WT登革病毒全長E的多核苷酸序列，編碼WT登革病毒PRM15/tE的多核苷酸序列，編碼WTC15/全長prM/全長E的多核苷酸序列，等等)所表達的表達水平。因此，例如，本發明提供了編碼了一個或更多本發明所述PRM15/tE多肽的核酸，在大體相同長度且在受試體的宿主例如哺乳動物宿主內通過大體上同源表達盒所表達的條件下，上述核酸中至少一個這種重組多肽被表達更加有效於包含任意選自SEQ ID NOS 231-234中一個序列至少一部分的核酸的表達。
引人注意的是，通過文中所述的編碼C15/全長prM/全長E多肽的多核苷酸表達的一些重組C15/全長prM/全長E多肽相比最佳密碼子C15/全長prM/全長E多肽編碼序列(例如任意選自SEQ ID NOS 215-218中序列)同樣具有更高的分泌水平。
這種核酸典型情況是DNA，而且通常是雙螺旋DNA序列。然而，本發明同樣提供了單螺旋DNA，單螺旋RNA，雙螺旋RNA和包含本發明所述的核酸序列的雜交DNA/RNA核酸。其中一方面，本發明包括了包含任意本發明所述的DNA核苷酸序列中的胸腺嘧啶核苷酸被尿嘧啶核苷酸所取代的RNA序列。本發明還提供了，例如，包含與選自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中至少一個序列大體同源(例如具有至少大約75％，80％，85％，90％，95％或更多核酸序列同一性性)的RNA核酸序列。本發明還提供了包含有DNA序列其中所有的胸腺嘧啶核苷酸都被尿嘧啶核苷酸所取代的RNA核酸，而且RNA多核苷酸序列互補與所有這樣的RNA核酸本發明進一步提供了RNA核酸，其具有與選自SEQ ID NOS 285-330中至少一個序列大體同源(例如至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的序列。更具體的情況，本發明提供了包含任意選自SEQ ID NOS 285-330的DNA序列其中的每一個胸腺嘧啶殘基都被一個尿嘧啶殘基所取代的RNA核酸。這種RNA核酸通常是至少大約1000個核苷酸，大約1200個核苷酸，大約2000個核苷酸的長度。本發明還提供了至少一個編碼本發明中具有免疫原性的胺基酸序列的RNA核酸的片段，而且RNA多核苷酸序列與這些片段互補。本發明還包括了在至少中等嚴格，優選至少正常嚴格，更優選至少高嚴格雜交條件下雜交這種RNA核酸(例如包含任意選自SEQ ID NOS 285-330且其中每一個胸腺嘧啶核苷酸均被尿嘧啶核苷酸取代的DNA序列)的RNA多核苷酸序列。
另一方面，本發明提供了包含有至少一個與本發明所述重組核酸序列結合和/或通常是連的表達調控序列。一個「表達調控序列」任意一種啟動，增強或調控其它核酸序列表達(典型和優選轉錄)的核酸序列。合適的表達調控序列包括組成型啟動子，誘導型啟動子，阻抑型啟動子和增強子。
啟動子對重組多肽表達水平發揮特別重要的影響。本發明所述核酸(例如重組DNA核酸)包含任意合適的啟動子。合適的啟動子的例子包括巨細胞病毒(CMV)啟動子，HIV長末端重複啟動子，磷酸甘油酸(PGK)啟動子，魯斯氏肉瘤病毒(RSV)啟動子，例如RSV長末端重複(LTR)啟動子，小鼠乳瘤病毒(MMTV)啟動子，HSV啟動子，例如Lap2促進劑或皰疹胸腺嘧啶核甙激酶啟動子(如Wagner et al.(1981)Proc Natl Acad Sci78144-145中所述)，SV40或愛潑斯坦巴爾病毒衍生的啟動子，腺聯結病毒(AVV)啟動子，例如p5啟動子，金屬硫蛋白啟動子(例如羊金屬硫蛋白促進劑或鼠金屬硫蛋白啟動子(例如見Palmiter et al.(1983)Science 222809-814中所述))，人類普遍存在的C啟動子，E，coil啟動子，例如紫膠或色氨酸啟動子，噬菌體λPL啟動子，和其它已知的調控原核生物或真核生物細胞基因表達的啟動子(直接在細胞內或者在感染細胞的病毒內)。啟動子在哺乳動物內特別是在人體內顯示出強的組成型基準表達，特別優選巨細胞病毒(CMV)啟動子例如CMV直接早期啟動子(例如在U.S.Patent 5,168,062中所述)和與這種啟動子具有大體序列同一性性的啟動子。同樣優選具有新的或增強屬性的重組啟動子，例如在PCT申請Int』l Publ.No.WO02/00897中所述的啟動子。
這種啟動子具有任何合適的作用機理。因此，這種啟動子可以是，例如，「誘導」啟動子，(例如，生長激素啟動子，金屬硫蛋白啟動子，熱衝擊蛋白啟動子，ElB啟動子，低氧誘導啟動子，輻射誘導啟動子，或腺病毒MLP啟動子和三聯前導序列)，誘導-阻抑型啟動子，發育階段相關啟動子(例如珠蛋白基因啟動子)，特有細胞或特有組織啟動子(例如，平滑肌細胞α-肌動蛋白啟動子，肌漿球蛋白輕鏈1A啟動子，或血管內皮鈣粘著蛋白啟動子)。合適的誘導型啟動子包括蛻化素和蛻化素相似誘導型啟動子(蛻化素相似誘導型啟動子可以通過Stratagene(LaJolla CA)獲得)。其它合適的市場上能買到的誘導型啟動子類包括誘導Tet-Off或Tet-on的啟動子類(Clontech，Palo Alto，CA)。這種誘導型啟動子可以是任何引起一個適當信號上調和/或下調的啟動子。另外的誘導型促進劑包括阿拉伯糖誘導型啟動子，類固醇誘導型啟動子(例如糖皮質激素誘導型啟動子)，也包括pH，壓力和熱誘導型啟動子。
這種啟動子可以是而且通常是天然宿主的啟動子，或感染特殊宿主的病毒衍生的啟動子(例如可以優選，人類β肌動蛋白啟動子，人類EF1α啟動子，或衍生於優先連接到人類AAV核酸的促啟動子)，對那些不經常出現在提到的宿主中的序列的免疫學反應應當嚴格的迴避其基因的表達。這種多核苷酸也可以或者包括一種連結到有關多樣基因(編碼多個融合蛋白的基因)的雙向啟動子體系(如U.S.Patent 5,017,478中所述)。
這種核酸也可以連接到修飾的或嵌合的啟動子序列。這種啟動子序列嵌合入包含至少兩個核酸序列部分，這些核酸序列部分基於或由至少兩種不同來源獲得或衍生(例如，一個有機體基因組的兩個不同區，兩種不同的有機體，或合成序列的有機體的組合)。合適的啟動子還包括重組，突變或遞歸重組(例如改組)啟動子。最小的啟動子單元，本質上包含一個特定TATA結合序列，可以例如單獨使用或與另外的啟動子單元結合使用。缺少TATA啟動子在某些情況下也是合適使用的。這種啟動子和/或其它表達調控序列可以包括已去除，修飾或滅活一個或多個調控單元。優選的啟動子包括介紹在Int』l Patent申請WO02/00897中的啟動子，其中的一個或多個可以連接到和/或與本發明所述核酸和載體共同進行使用。其它改組的和/或重組啟動子也可以合併入以及與本發明所述核酸和載體共同使用，例如，方便多肽表達。
其它合適的啟動子和有關這些合適啟動子選擇，使用和構造原理的介紹如下，例如，Werner(1999)Mamm Genome10(2)168-75，Walther et al.(1996)JMol Med74(7)379-92，Novina(1996)Trends Genet12(9)351-55，Hart(1996)Semin Oncol23(1)154-58，Gralla(1996)Curr Opin Genet Dev6(5)526-30，Fasseler et al.(1996)Methods Enzymol2733-29，Ayoubi et al(1996)，10(4)FASEB J10(4)453-60，Goldsteine et al.(1995)Biotechnol Annu Rev1105-28，Azizkhan et al(1993)Crit Rev Eukaryot Gene Expr3(4)229-54，Dynan(1989)Cell58(1)1-4，Levine(1989)Cell59(3)405-8，and Berk et al(1986)Annu RevGenet2045-79，as well as US Patent 6,194,191。其它合適的啟動子可以通過使用Eukaryotic Promoter Database(release 68)(現在可以通過到訪http//www.epd.isb-sib.ch/)和其它相似的資料庫例如Transcription RegulatoryRegions Database(TRRD)(version4.1)(可以通過到訪http//www.bionet.nsc.ru/trrd/)和transcription factor database(TRANSFAC)(可以通過到訪http//transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html)進行確定。
作為啟動子的選擇，特別是在RNA載體和構建物中，這種核酸序列和/或載體可以包含一個或更多內部核糖體進入位點(IRESs)，編碼IRES的序列，或RNA序列增強子(Kozak契合序列類似物)，例如菸草花葉病病毒omega基本序列。
本發明還提供了多核苷酸(或載體)，其中也包含或選擇性的包含一個上遊激活序列(UAS)，例如Ga14激活序列(例如在U.S.Patent 6,133,028中所述)或其它合適的上遊調控序列(例如在U.S.6,204,060中所述)。
除具有免疫原性的多核苷酸序列之外，本發明所述的多核苷酸或載體包括所有其它的表達調控序列(例如，增強子，轉譯終止序列，起始序列，剪接調控制序列，等)。這種多核苷酸可以包括在哺乳動物細胞內有功能的Kozak契合序列，這個序列是自然存在或修飾的序列例如US6,107,477中介紹的修修2飾Kozak契合序列。這種核酸可以包括幫助在表達載體中的一個編碼序列和/或片段有效轉譯的特異起始信號。這些信號包括，如ATG密碼子和鄰位序列。在一個編碼序列中，它的起始密碼子和上遊序列被插入適當的表達載體中，不需要其它的轉譯調控信號。但是，當在編碼序列中(例如編碼成熟蛋白編碼序列)或其中的一部分被插入時，必須提供包括ATG起始密碼子的外源核酸轉錄調控信號。此外，這種起始密碼子必須是在正確的閱讀框中來確保整個插入的轉錄。外源轉錄單元和起始密碼子可以有不同的來源，天然的或合成的都可以。表達效果的增強可以通過細胞系統合適的增強子內涵物的使用來達到(例如見ScharfD.et al.(1994)Results Probl Cell Differ20125-62；and Bittnet et al.(1987)Methods in Enzymol153516-544中所述)。合適的增強因子包括，例如，魯斯氏肉瘤病毒(RSV)增強子和U.S.Patent6,225,082中所述的RTE增強子。包括ATG起始密碼子和鄰位序列的起始密碼子期望的被連接到多核苷酸之中。在一個多核苷酸序列中，它的起始密碼子和上遊序列被插入適當的表達載體中，不需要其它的轉譯調控信號。但是，當在編碼序列中(例如編碼成熟蛋白的序列)或其中的一部分被插入時，必須提供包括ATG起始密碼子的外源核酸轉錄調控信號。這種起始密碼子必須是在正確的閱讀框中來確保整個插入的轉錄。外源轉錄單元和起始密碼子可以有不同的來源，天然的或合成的都可以。表達效果的增強可以通過細胞系統合適的增強子內涵物的使用來達到(例如見ScharfD.et al.(1994)ResultsProbl Cell Differ20125-62；and Bittnet et al.(1987)Methods in Enzymol153516-544中所述)。
本發明所述的核酸(例如DNA)也可以包含為轉譯起始的核糖體連接位點和轉錄終止區。合適的轉錄終止區是，例如，由DNA核酸所生產的RNA轉錄物的切斷和聚腺苷酸化序列。任何合適的聚腺苷酸化序列都可以被使用，包括合成的優化序列，也包括BGH(牛生長激素)的聚腺苷酸化序列，人類生長激素基因，多瘤病毒，TK(胸腺嘧啶激酶)，EBV(愛潑斯坦巴爾病毒)，兔β球蛋白和乳突淋瘤病毒，包括人類乳突淋瘤病毒和BPV(牛乳突淋瘤病毒)。優選多腺苷酸轉換(polyA)序列中包括SV40(人類肉瘤病毒-40)聚腺苷酸化序列和BGH polyA序列。這種polyA序列介紹在，例如，Goodwin et al.(1998)Nucleic Acids Res26(12)2891-8，Schek et al.(1992)Mol Cell Biol12(12)5386-93，and van den Hoff et al.(1993)Nucleic Acids Res21(21)4987-8。另外有關合適聚腺苷酸化序列的選擇原理介紹在，例如，Levittet al.(1989)Genes Dev19893(7)1019-1025，Jacob et al.(1990)Crit RevEukaryot Gene Expr1(1)49-59，Chen et al.(1995)Nucleic AcidsRes23(14)2614-2620，Moreira et al.(1995)EMBO J14(15)3809-3819，Carsellet al.(1989)Mol Cell Biol19899(10)4248-4258。
這種多核苷酸可以進一步包含位點特異性重組的位點，其可以被用來調控這種多核苷酸的轉錄，在例如U.S.Patents 4,959,317，5,801,030和6,063,627，European Patent Application 0 987 326和International Patent Application WO97/09439中有介紹。
本發明進一步提供了一種核酸，這種核酸進一步包含一個或更多具有免疫刺激的寡核苷酸序列，例如，符合序列模式N1CGN2)x的序列，其中N1是，5′到3′，任意兩種嘌呤，任意的嘌呤和任意的鳥嘌呤，或者任意三種核苷酸；其中N2是，5′到3′，任意兩種嘌呤，任意的鳥嘌呤和任意的嘌呤，或者任意三種核苷酸；而x是大於0或1的任意數字。免疫調籠序列在本技術領域是已知的，介紹在，例如，Wagner et al.(2000)Springer Semin Immunopathol22(1-2)147-52，Van Uden et al.(2000)Springer Semin Immunopathol22(1-2)1-9，and Pisetsky(1999)Immunol Res19(1)35-46，as well as U.S.Patents6,207,646，6,194,388，6,008,200，6,239,116和6,218,371。這種具有免疫刺激的聚核苷酸序列可以是非甲基化的。另一方面，本發明提供了一種核酸，其包含編碼本發明所述一種或更多重組多肽的多核苷酸序列，而且進一步的包含至少一個編碼文中所述的至少一個具有免疫刺激序列的多核苷酸序列。選擇性的，這種具有免疫刺激的寡核苷酸序列通過一個第二個多核苷酸序列表達，而這個第二個多核苷酸序列是從編碼本發明所述重組多肽的第一個多核苷酸序列中分離出來的(例如，在分離或第二載體)。
另一方面，本發明提供了一種核酸，其包含了編碼本發明所述一種或更多重組多肽的多核苷酸序列，而且進一步的包含至少一個編碼至少一種蛋白佐劑的多核苷酸序列。選擇性的，這種蛋白佐劑通過第二個多核苷酸序列表達，而這第二個多核苷酸序列是從編碼本發明所述重組多肽的第一個多核苷酸序列中分離出來的(例如，在分離或第二載體)。優選的是，這種佐劑是一種促進由本發明所述免疫原性重組多肽誘導的免疫應答的細胞因子。優選的是，這種細胞因子是粒細胞巨噬細胞菌落刺激性因子(GM-CSF，例如人類GM-CSF)，幹擾素(例如人類幹擾素(IFN)α，IFN-β，IFN-γ)，或一種多肽其包含一個與至少一種這樣的細胞因子序列大體同源(例如，具有至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％或94％，更優選至少大約95％(例如大約87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多的序列同一性)的核酸序列。編碼這種因子的基因是已知的。人類GM-CSF序列介紹在，如，Wong et al.(1985)Science228810，Cantrell et al.(1985)Proc Natl Acad Sci826250，and Kawasaki et al.(1985)Science230291。理想的，在具體例子中，這種核酸表達了可檢測到的GM-CSF的數量或其功能類似物，可以刺激樹狀細胞(DCs)和/或T細胞的代謝和分化，增加了抗原的遞呈，和/或增加了單核細胞的活性，增加了由具有免疫原性的核酸序列誘導的免疫應答。合適的幹擾素基因，例如IFN-γ基因也已經是已知的(例如，見Taya et al.(1982)，Embo J1953-958，Cerretti et al.(1986)J Immunol136(12)4561，and Wang et al.(1992)Sci China B35(1)84-91)。理想的，IFN，例如IFN-γ是由增加具有免疫原性的胺基酸序列的免疫應答(例如增強由具有免疫原性胺基酸序列誘導的T細胞免疫應答)的量的核酸進行表達。可以和本發明所述多核苷酸和/或多肽共同表達或者共同服用的優選的IFN類似物和IFN相關分子介紹在，例如，International PatentApplications WO 01/25438和WO 01/36001中。大約5到10μg的編碼GM-CSF的質粒和大約5到10μg的編碼本發明所述多肽的質粒的共同服用被期望有效的在小鼠模型體中增強抗體反應。
另一方面，本發明所述的核酸包含T7 RNA聚合酶啟動子，這種啟動子可以連接到這種核酸序列上，促進由這種核酸序列得到的單鏈RNAs。T7和T7衍生序列是已知的且可以在實例中使用T7的表達體系(例如見Tabor andRichardson(1986)Proc Natl Acad Sci USA821074，Studier and Moffat(1986)J Mol Biol189113，and Davanloo et al.(1964)Proc Natl Acad Sci USA812035)。一個方面，例如，核酸包含有T7 RNA聚合酶和編碼至少一種本發明所提供的多肽的多核苷酸序列。此外，本發明的核酸可以包含用於在微生物內增殖的複製起點。在哺乳動物細胞內使用的細菌複製起點(Ori)優選是一個不是反效果的基因表達。有用的複製起點序列的例子包括第一代噬菌體ori，RK2 oriV，pUC ori和pSC101 ori。優選的複製起端序列包括ColEI ori和p15(可以由plasmid PACYC177，New England Biolab，Inc.得到)，作為選擇的在一些情況下另外的低拷貝的複製ori序列(相似於p15)也是可取的。這種核酸在這樣的期望技術中作為穿梭載體，能夠在真核或原核宿主內(例如，包含在真核生物和原核生物中均被識別的含有複製起點的載體)複製和/或表達(理想情況是兩者都是-這樣的能夠表達的載體被稱作「表達載體」)。
本發明的多核苷酸優選位於和/或服用於一個合適的傳遞載體(也就是載體)的組成之中。這種載體可以是任意合適的載體，包括染色體的，非染色體的和合成核酸載體(包含上述表達盒單元(表達調控和其它核酸關聯序列)的核酸序列)。這樣載體的例子包括SV40衍生物，細菌質粒，噬菌體DNA，baculo病毒，酵母菌質粒，質粒和噬菌體DNA結合物的衍生載體，和病毒核酸(RNA或DNA)載體。例如見附圖1和2。
其中一方面，這種核酸被服用到一個裸DNA或RNA載體中，包括，例如，線性表達單元(如Sykes and Johnston(1997)Nat Biotech17355-59中所述)，緊湊核酸載體(如U.S.Patent 6,077,835和/或Intenational Patent ApplicationWO 00/70087中所述)，質粒載體例如pBR322，pUC19/18或pUC118/119，「微型」小尺寸核酸載體(如Schakowski et al.(2001)Mol Ther3793-800中所述)或作為沉澱核酸載體構建物，例如CaPO4沉澱構建物(如Intenational PatentApplication WO 00/46147，Benvenisty and Reshef(1986)Proc Natl Acad SciUSA839551-55，Wigler et al.(1978)，Cell14725，and Coraro andPearson(1981)Somatic Cell Genetics7603中所述)。核苷酸載體及其的應用是本技術領域已知的(例如見U.S.Patents 5,589,466和5,973,972)。
這種載體可以是適於在細菌體系中表達的表達載體。任何用於細菌宿主中的載體都可以被使用。合適的載體包括，例如，指示易於純化的融合蛋白高水平表達的載體(例如多功能大腸桿菌克隆或表達載體例如BLUESCRIPT(Stratagene)，pIN載體(Van Heeke Schuster，J Biol Chem2645503-5509(1989))；pET載體(Novagen，Madison WI)；和類似的載體)。
這種表達載體也可以或選擇性的可以是適於在酵母菌系中表達的載體。任何在酵母菌系中適於表達的載體都可以被使用。合適的載體例如，酵母屬麥酒，包括例如，包含基本的或誘導型啟動子例如α因子，乙醇氧化酶和PGH的載體(評論見Ausubel，supra，Berger，supra，and Grant et al.Methods inEnzymol153516-544(1987))。
這種表達載體可以在宿主細胞內產生。這種宿主細胞可以是真核細胞，例如哺乳動物細胞，酵母菌細胞或植物細胞，或者這種宿主細胞也可以是原核細胞，例如細菌細胞。這種構建物引入宿主細胞可以使用磷酸鈣轉染，DEAE-Dextran介導的轉染，電穿孔，基因或疫苗槍，注射或其它普通技術(例如見Davis et al.BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)中關於體內的，來自體內的和體外的方法的描述)的影響。
本發明的這種核酸和核酸載體可以進一步包含非天然生成核苷酸和核苷酸序列。本發明重組核酸序列的修飾包括形成包含有硫代磷酸主鏈的重組核酸序列(例如編碼黃病毒抗原的多核苷酸序列)至少一個部分或片斷，在核酸序列中結合至少一種用來代替或除天然形成核苷酸之外的合成的核苷酸類似物，以及添加除了鳥嘌呤，腺嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶之外的基，或者在這樣的序列中使用這種非常規形成的鹼基。這種修飾與較長的半衰期聯繫在一起，而因此被優選用在本發明所述核酸載體中。因此，一個方面，本發明提供了包含有至少一個上述修飾或其中的任意組合的重組核酸和核酸載體，其中這種核酸在哺乳動物宿主內的持續時間長於沒有這樣的一種或幾種修飾的大體同源的核酸。
這種表達載體也包含編碼分泌/定位序列的核苷酸，其中目標多肽表達一個理想的細胞隔，膜或細胞器，或者其引導多肽分泌物到胞質隙或細胞培養基中。這樣的序列在本技術領域是已知的，包括分泌前導或信號肽，細胞器靶序列(例如核定位序列，ER保留信號，線粒體轉變序列，葉綠粒轉變序列)，膜定位/錨定序列(例如，終止轉移序列，GPI錨定序列)，以及類似的序列。
另外，本發明所述表達載體可選擇的包含一個或更多可選擇的標記基因來提供轉化宿主細胞選擇的顯型特徵，例如在真核細胞培養中的二氫葉酸還原酶抗性，新酶素抗性，嘌呤酶素抗性和/或殺稻瘟菌素抗性，或者例如在E.coli.中的四環素或氨苄青黴素抗性。
本發明另外提供了包含粘粒的核酸。任何合適的粘粒載體可以用來複製，轉移和表達本發明中的核酸序列。通常情況，粘粒包含細菌oriV，抗生素選擇標記，克隆位點，和一個或者兩個噬菌體λ衍生的cos位點。這種粘粒可以是穿梭粘粒或哺乳動物粘粒，包含SV40 oriV和理想情況的合適的哺乳動物選擇標記。粘粒載體在例如Hohn et al.(1998)Biotechnology10113-27中進一步的介紹。
本發明還提供了包含一個或更多核酸序列的重組構建物，如上面大量內容所述的，這些核酸序列包含編碼重組黃病毒抗原的多核苷酸序列(例如，編碼重組登革病毒抗原的多核苷酸序列)。這種構建物包含載體，例如質粒，粘粒，噬菌體，病毒，細菌人造染色體(BAC)，酵母菌人造染色體(YAC)，和類似的，在向前或相反的起始點插入的本發明中的核酸序列。
本發明的一個方面，本發明所述的重組DNA序列(例如編碼重組黃病毒抗原的DNA序列)的服用通過裸DNA質粒或結合有一個或更多轉染增強劑的質粒來完成，文中對此有進一步介紹。這種質粒DNA載體可以具有任意合適式的組合。在某些情況下，優選的質粒DNA載體包含強的啟動子/增強子區(例如人類CMV，RSV，SV40，SL3-3，MMTV或HIV LTR啟動子)，有效poly(A)端序列，大腸桿菌中質粒物的複製起點，作為可選擇性標記的抗生素抗性基因，和適宜的克隆位點(例如多位點接頭)。用於本發明核酸服用的特殊質粒載體是載體pMaxVax10.1，其結構和特徵在實施例1(附圖1和2)中有介紹。選擇性的，這樣的質粒載體包括至少一個免疫刺激序列(ISS)和/或至少一個編碼合適細胞因子的基因(例如，GM-CSF序列)，文中別處有進一步介紹。
另一方面，本發明所述序列的核酸通過病毒載體被安置和/或傳送到宿主細胞或宿主動物中。任何合適的病毒載體可以在這種情況下被使用，而且其中的一些是本領域已知的。病毒載體可以包含任意數目的病毒多核苷酸，這些病毒多核苷酸可以單獨使用或與一種或更多病毒蛋白結合使用，這種載體便於在期望的宿主細胞的轉化，複製和/或表達本發明所述的核酸。這種病毒載體可以是多核苷酸，這種多核苷酸包含有病毒染色體組，病毒蛋白/核酸結合物，類病毒樣顆粒(VLP)，類似於那些U.S.Patent 5.849,586和InternationalPatent Application WO97/04748中所述的載體的全部或部分，或者包含有本發明所述病毒核酸和核酸的完整病毒樣顆粒。病毒樣顆粒病毒載體(也就是重組病毒)可以包含野生型病毒樣顆粒或一種修飾的病毒樣顆粒，特別是下文所要介紹的例子。
這種病毒載體需要另外一種用於複製和/或表達的載體或野生型病毒(也就是輔助依賴病毒)的存在，例如腺病毒載體擴增器(amplicon)。通常情況，這種病毒載體本質上含有野生型病毒樣顆粒，或修飾的病毒樣顆粒，這種修飾的病毒樣顆粒是在它的蛋白和/或核酸內含物中進行的，用於增加轉基因容量或輔助這種核酸的轉染和/或表達(這種載體的例子包括皰疹病毒/AVV擴增器)。
優選，雖然不是必要的，這種病毒載體顆粒衍生於，基於，包含或含有一病毒，該病毒通常的感染動物，優選脊椎動物，例如哺乳動物尤其是人類。這方面合適的病毒載體顆粒包括，例如，腺病毒載體顆粒(包括任何腺病毒科病毒或其衍生的病毒)，腺伴隨病毒載體(adeno-associated viral vector)顆粒(AVV載體顆粒)或其它細小病毒和細小病毒的載體顆粒，乳突淋瘤病毒載體(palillomaviral vector)顆粒，黃病毒載體，甲病毒屬載體(alphaviral vector)，皰疹病毒載體，痘病毒載體，逆轉錄酶病毒載體，包括慢病毒載體。這些病毒和病毒載體的例子在，如FIELDS VIROLOGY，supra，Fields et al.Eds.，VIROLOGY Raven Press，Ltd.，New York(3rd ed.，1996 and 4th ed.，2001)，ENCYCLOPEDIA OF VIROLOGY，R.G.Webester et al.，eds.，AcademicPress(2nd ed.，1999)，FUNDAMENTAL VIROLOGY，Fields et al.，eds.，Lippincott Raven(3rd ed.，1995)，Levine，「Viruses，」Scientific American LibraryNo.37(1992)，MEDICAL VIROLOGY，D.O.White et al.，eds.，Acad.Press(2nded.，1994)，INTRODUCTION TO MODERN VIROLOGY，Dimock，N.J.etal.，eds.，Blackwell Scientific Publications，Ltd.(1994).
可以和本發明所述的多核苷酸以及方法一起使用的病毒載體包括腺病毒和腺伴隨病毒載體，例如，在Carter(1992)Curr Opinion Biotech3533-539(1992)and Muzcyzka(1992)Curr Top Microbiol Immunol15897-129(1992)中所述。AVV載體另外的類型和例子介紹在如，Buschacheret al.，Blood，5(8)，2499-504，Carter，Contrib.Microbiol.485-86(2000)，Smith-Arica，Curr.Cardiol.Rep.3(1)41-49(2001)，Taj，J.Biomed.Sci.7(4)279-91(2000)，Vigna et al.，J.Gene Med.2(5)308-16(2000)，Klimatcheva etal.，Front.Biosci.4D481-96(1999)，Lever et al.，Biochem.Soc.Trans.27(6)841-47(1999)，Snyder，J.Gene Med.1(3)166-75(1999)，Gerich et al.，Knee Surg.Sports Traumatol.Arthrosc.5(2)118-23(1998)，andDuring，Adv.Drug Deliv.Review 27(1)83-94(1997)，and U.S.Patents 4,797,368，5,139,941，5,173,414，5,614,404，5,658,785，5,858,775，and 5,994,136，以及文中別處其它相關介紹。腺伴隨病毒載體可以通過使用由例如U.S.Patent4,797,368 and Laughlin et al.，Gene 2365-73(1983)提到的方法進行構建和/或純化。
和本發明所述的多核苷酸以及方法一起使用的病毒載體的另一種類型是一種乳頭瘤病毒載體(palillomaviral vector)。合適的乳頭瘤病毒載體在本技術領域是已知的且介紹在，如Hewson(1999)Mol Med Today5(1)8，Stephens(1987)Biochem J248(1)1-11，and U.S.Patent 5,719,054中。特別優選的乳頭瘤病毒載體提供在如International Patent Application WO 99/21979中。
甲病毒在其它的情況下可以是基因傳遞載體。甲病毒在本技術領域是已知的而且介紹在，如Carter(1992)Curr Opinion Biotech3533-539，Muzcyzka(1992)Curr Top Microbiol Immunol.15897-129，SchlesingerExpert Opin BiolTher.2001 Mar；1(2)177-91，Polo et al.Dev Biol(Basel).2000；104181-5，Wahlfors et al.Gene Ther.2000 Mar；7(6)472-80，Colombage et al.Virology.1998 Oct 10；250(1)151-63，and International Patent Application WO 01/81609，WO 00/39318，WO 01/81553，WO 95/07994，and WO 92/10578。
另外一組可用的病毒載體是皰疹病毒載體。皰疹病毒載體的例子介紹在，如Lachmann et al.，Curr Opin Mol Ther1999 Oct；1(5)622-32，Fraefel et al.，Adv Virus Res.2000；55425-51，Huard et al.，Neuromuscul Disord.1997 Jul；7(5)299-313，Glorioso et al.，Annu Rev Microbiol.1995；49 675-710，Latchman，Mol Biotechnol.1994 Oct；2(2)179-95，and Frenkel et al.，Gene Ther.1994；1Suppl 1S40-6，as well as U.S.Patents 6,261,552 and 5,599,691。
逆轉錄病毒載體，包括慢病毒載體，在有些特殊情況下也可以是可用的基因傳遞載體。許多的逆轉錄病毒載體是本技術領域已知的。這些逆轉錄載體的例子介紹在，如Miller，Curr Top Microbiol Immunol(1992)1581-24；Salmons and Gunzburg(1993)Human Gene Therapy4129-141；Miller etal.(1994)Methods in Enzymology217581-599，Weber et al.，Curr Opin MolTher.2001 Oct；3(5)439-53，Hu et al.，Pharmacol Rev.2000 Dec；52(4)493-511，Kim et al.，Adv Virus Res.2000；55545-63，Palu et al.，Rev Med Virol.2000 May-Jun；10(3)；185-202，and Takeuchi et al.，Adv Exp Med Biol.2000；46523-35，as well as U.S.Patents 6,326,195，5,888,502，and 5,672,510。
腺病毒載體也可以是用於基因轉移的合適病毒載體。腺病毒載體是本技術領域已知的而且介紹在，如Graham et al(1995)Mol Biotechnol33(3)207-220，Stephenson(1998)Clin Diagn Virol10(2-3)187-94，Jacobs(1993)Clin Sci(Lond).85(2)117-22，US Pat.5,922,576，5,965,358 and 6,168,941 andInt』l Patent Appns WO 98/22588，WO 98/56937，WO 99/15686，WO 99/54441，and WO 00/32754。用於本發明實驗的腺病毒載體，皰疹病毒載體和Sindbis病毒載體介紹在如Jolly(1994)Cancer Gene Therapy151-64，Latchman(1994)Molec Biotechnol2179-195，and Johanning et al.(1995)Nucl Acids Res231495-1501。
其它合適的病毒載體包括痘病毒載體。這樣的載體的例子介紹在如Berencsi et al.，J Infect Dis(2001)183(8)1171-9；Rosenwirth et al.，Vaccine2001 Feb 8；19(13-14)1661-70；Kittlesen et al.，J Immunol(2000)164(8)4204-11；Brown et al.Gene Ther20007(19)1680-9；Kanesa-thasan et al.，Vaccine(2000)19(4-5)483-91；Sten(2000)Drug60(2)249-71。牛痘病毒載體是優選的痘病毒載體。這種載體和其使用的例子提供在，如Venugopal et al.(1994)Res Vet Sci57(2)188-193，Moss(1994)Dev Biol Stand8255-63(1994)，Weisz et al.(1994)Mol Cell Biol43137-159，Mahr and Payne(1992)Immunobiology184(2-3)126-146，Hruby(1990)Clin Microbiol Rev3(2)153-170，and International Patent Applications WO 92/07944，WO 98/13500，andWO 89/08716。
本發明的另一方面是包含有至少一個本發明所述重組核酸序列(例如，重組PRM15或C15信號肽，編碼重組tE多肽的核酸，編碼全長E多肽的核酸，編碼PRM15/tE多肽的核酸，C編碼15/全長prM/全長E多肽的核酸，編碼C15/全長prM/tE多肽的核酸)的黃病毒載體。這種核酸可以位於黃病毒基因組的任意合適的部位。例如，這種核酸可以被插入或用於取代這種基因組的核苷酸序列片段，通常情況是與所述核酸相同的編碼了相似於或等同多肽的核苷酸序列。例如，重組編碼C15/全長prM/全長E多肽的核酸可以取代黃病毒基因組的編碼野生型C15/全長prM/全長E的序列的全部或部分。因此，本發明的重組多肽可以被放置在這種黃病毒包膜多肽的片段中。
在這種情況下，一種或更多本發明所述的核酸可以被結合入任意合適的黃病毒載體。這些合適的載體的例子介紹在，如Bonaldo et al.，Mem InstOswaldo Cruz.2000；95 Suppl 1215-23，Caufour et al.Virus Res.2001 Nov5；79(1-2)1-14，Guirakhoo et al.J Virol.2001 Aug；75(16)7290-304，Pletnev etal.Virology.2000 Aug 15；274(1)26-31，Guirakhoo et al.J Virol.2000 Jun；74(12)5477-85，and International Patent Applications WO 93/06214 and WO01/53467。構建重組病毒載體和/或修飾已知的或重組病毒載體的技術公開在Sambrook(出處同上)和文中提到的其它出處中。複製缺損(RD)黃病毒(包括例如RD登革熱和黃熱病毒)也可以用作載體或用於傳遞載體。包含在內的複製缺損黃病毒(例如RD登革熱或YF病毒)包含有至少一個本發明所述多肽用於代替或增加天然黃病毒(例如登革熱或YF病毒)包膜蛋白或天然黃病毒(例如登革熱或YF病毒)prM蛋白和包膜蛋白。同樣期望具有一種複製缺損黃病毒，其包含有至少一種本發明所述核酸用於代替或增加編碼了黃病毒包膜蛋白或黃病毒prM蛋白和包膜蛋白的WT黃病毒基因組的一個核酸片段。
在蚊子宿主內複製缺損以及可以與本發明所述多肽結合作為一種疫苗的登革病毒介紹在International Patent Application WO 00/14245中。一種或更多病毒和/或黃病毒組的病毒載體，包括，例如但不限於一種黃熱病毒或運載本發明所述的至少一種核酸和/或至少一種多肽的黃熱病毒載體(例如見Guirakhoo et al.，J.Virol.75(16)7290-304(2001))，它們的使用被相信是有利的。
另一方面，本發明提供了包含有黃病毒組中一種病毒(例如黃熱病毒，所述黃熱病毒例如黃熱17D病毒以及類似的病毒)的嵌合病毒，其中編碼黃病毒組病毒的完全E蛋白的核酸序列或其中的片段(例如核酸序列編碼的tE蛋白)被本發明所述的相應的編碼重組E蛋白的核酸序列(或編碼重組tE多肽的核酸)所代替。這種嵌合病毒可以是黃病毒組中的減毒病毒(例如減毒黃熱病毒)。本發明還提供了黃病毒組中的嵌合病毒(例如黃熱病毒)，其中黃病毒組病毒(例如黃熱病毒)的編碼E蛋白的基因(或編碼截短E蛋白的基因)被本發明所述的編碼重組E蛋白的核苷酸(或編碼重組tE多肽的核苷酸)所代替。通常情況，本發明的代替重組核苷酸的核苷酸長度大體等於被替代的病毒核苷酸序列的長度。編碼截短E蛋白的核酸序列通常包含相當於編碼了E蛋白的基因缺少編碼了E蛋白至少大約8％，10％或12％的C末端胺基酸殘基的核苷酸殘基的核苷酸片段。
本發明也提供了包含有黃病毒組中一種病毒的基因組(例如黃熱病毒基因組或登革病毒基因組)的核酸，其中編碼E蛋白的基因組的核苷酸序列被編碼重組全長E蛋白或重組截短E多肽的本發明所述的重組核苷酸序列所代替。包含在內的是替代核酸(由病毒分離的)和由所有這樣的核酸編碼的多肽。
相似的，本發明提供了包含有黃病毒組中(例如黃熱病毒，所述黃熱病毒例如黃熱17D病毒或登革病毒例如DEN-2，DEN-3)的嵌合病毒，其中黃病毒組病毒(例如黃熱病毒)的編碼PRM15/截短E多肽的核酸序列被本發明所述的編碼重組PRM15/截短E多肽的核酸序列所代替。本發明還提供黃病毒組中的嵌合病毒(例如黃熱病毒)，其中黃病毒組病毒(例如黃熱病毒)的編碼C15/全長prM/全長E多肽的核酸序列被本發明所述的編碼重組C15/全長prM/全長E多肽的核酸序列所代替。在所有的這些具體的例子中，這種嵌合病毒可以是黃病毒組中的減毒病毒(例如減毒黃熱病毒)。這種代替重組核苷酸的核苷酸長度大體等於被替代的病毒核苷酸序列的長度。同樣包含在內的是這樣的替代核酸(病毒所分離的)和由所有這樣的核酸編碼的多肽。
本發明包括了含有黃病毒組中病毒和一種或更多合成或重組的本發明所述的多肽或核酸的嵌合複製缺損或減毒病毒。這樣的嵌和病毒可以通過一種或更多合成或重組的本發明所述的多肽或核酸的結合變為複製缺損或減毒。通過WT黃病毒基因組的替代部分和上述的合成或重組核酸生產複製缺損或減毒病毒的方法包括在內。
同樣包括在內的是包含全長嵌合黃病毒基因組的基因組的嵌合病毒，這種全長嵌合黃病毒基因組包含有一種包含至少一個本發明所述的第一個核酸的核苷酸序列，上書的至少一種第一個核酸編碼至少一種本發明所述重組或合成登革病毒結構蛋白，其中上述至少一種第一個核酸被連結到至少一種第二個核酸編碼至少一種第二黃病毒的非結構蛋白，其中這種第二黃病毒不是登革病毒，而且其中這種嵌和黃病毒被定義為具有基因組大約11-kp正鏈RNA病毒，這個基因組編碼用於開放閱讀框的三種結構蛋白，capsid(C)，premembrane(prM)和envelope(E)，以及隨後的七種非結構蛋白，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。
任何黃病毒可以通過至少一種本發明所述核酸，優選在核酸水平，使用標準分子生物學技術，來進行修飾。通常的，在這些情況中，這種特殊編碼天然prM/E的核酸序列(例如編碼tE，全長E，PRM15/tE或C15/全長prM/全長E多肽的天然序列)的至少一部分被去除而且由本發明所述重組核酸取代/代替，這樣的重組多肽被編碼而且這種黃病毒包含本發明所述重組多肽替代或增加的編碼天然prM/E的序列(例如編碼天然序列的tE，全長E，PRM15/tE或C15/全長prM/全長E多肽)。一個方面，這種技術由非減毒黃病毒通過例如用至少一種本發明所述重組多肽取代這種天然黃病毒基因組(例如編碼tE，全長E，PRM15/tE或C15/全長prM/全長E多肽的天然序列)的至少一個核苷酸片段或部分來進行。這樣的結合可以生產出減毒嵌合病毒。另一方面，這種技術由已經滅活或已經包證明是減毒病毒基因組的黃病毒進行。在一些具體的例子中，這種減毒黃病毒是減毒登革病毒，例如PDK53，這樣的例子介紹在，如Bhhamarapravati et al.，Vaccine1844-47(2000)，Men et al.，J.Virol.70(6)3930-37(1996)，Kanesa-thasan，Kanesa-thasan et al.，Vaccine193179-88(2001)和International Patent Applications WO 00/57910，WO 00/57909，WO 00/57908和WO 00/57904。由登革熱-2病毒族衍生的低致病性和/或低副作用減毒登革病毒可以在那些使用的病毒之列。一個方面，這樣的重組(例如減毒)黃病毒載體或病毒的大約50或大約1×102血小板形成單位(pfu)或轉化灶形成單位(ffu)到大約6×1010pfu或到大約7×1010pfu(例如大約3.5×1010pfu或到大約4.5×1010pfu)的劑量提供了有效量用來在合適的受試體內(例如動物例如包括人類的哺乳動物)對至少一種黃病毒(例如至少一種血清型中的登革病毒)誘導免疫應答。這樣的劑量通過文中所述的任意途徑(例如皮下注射)給藥到受試體中。另一個方面，這樣重組(例如減毒)黃病毒載體或病毒的大約1×102到大約5×104pfu，大約1×102pfu到大約1.5×104pfu，大約1×102到大約1×103pfu，或者大約1×103到大約1×106pfu或大約1×108pfu的劑量可以有效的對至少一種黃病毒(例如給藥到受試體中的至少一種血清型中的至少一種登革病毒)誘導免疫應答。選擇性的，最小致死量(MLD50)等於任意上述的可以被給藥到受試體中的pfu劑量。
包括本發明所述重組分子的載體或病毒的毒性和治療功效可以在細胞培養或實驗動物中使用標準藥學步驟來測定。其中一個就是使用文中所述步驟和那些本技術領域已知的其它技術測定MLD50(總量50％的最小致死量)和/或ED50(總量50％中有效治療的劑量)。同樣見S.Plotkin and W.Orenstein，VACCINES(W.B.Saunders Co.1999 3d ed.)所述用於已知的黃病毒疫苗，包括黃熱病毒17D疫苗。核酸，多肽，蛋白，融合蛋白，轉換細胞和本發明所述的其它形式可以被給藥在可測定的量上，例如，通過這些形式的MLD50，和它們在不同濃度下的副作用，應用於病人大部分和整體的健康狀態下。因此，例如，本發明提供了誘導免疫應答的方法，這個免疫應答通過給藥在等於或大於藥學上可接受的化合物的ED50的量，這種化合物包含有本發明所述的重組多肽或核酸的重組黃熱病毒顆粒(例如17D疫苗變體)的數量。給藥可以通過一次給藥或分開給藥(要麼通過共同給藥，連續給藥或其中的組合)來完成。使用方法和說明的描述，如Plotkin(Vaccines)和其它參考文獻一併引入本文。在相關的方面，關於評估核酸，多肽，載體和細胞有效成分增強免疫力的劑量的描述，如歐洲專利申請E.P.115633和其它參考文獻一併引入本文。
在一些方面，優選的病毒載體會在宿主細胞或宿主中是減毒的或複製缺損的。AAV載體，在補充腺病毒或至少腺病毒基因產物(由比如有幫助的病毒，質粒或者有互補關係的細胞產生)缺乏時是複製缺損。所謂的「複製缺損」是指病毒載體包含缺少至少一種必要複製基因的功能的基因組。上述的基因、基因功能、或者基因或基因組區域的缺損定義為因病毒基因組的必要遺傳物質的缺損而減毒或刪除了核酸序列被全部或者部分刪除的基因的功能。必要複製基因的功能正是那些複製缺損的病毒載體複製(也就是增殖)所需要的。而病毒載體顆粒的功能是否由於病毒載體顆粒的種類而不同則有爭論。複製缺損病毒載體顆粒的例子的描述，可參見Marconi等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(21)，11319-20，Johoson和Friedmann，Methods CellBiol.，43(pt.A)，211-30(1994)，Timiryasova等，J GeneMed.，3(5)，468-77(2001)，Burton等，Stem Cells，19(5)，358-77(2001)，Kim等，Virology，282(1)，154-67(2001)，Jones等，Virology，278(1)，137-50(2000)，Gill等，J.Med.Virol.，62(2)，127-39(2000)，Chen和Engleman，J.Virol.，74(17)，8188-93(2000)，Marconi等，Gene Ther.，6(5)，904-12(1999)，Krisky等.，Gene Ther.，5(11)，1517-30(1998)，Bieniasz等Virology，235(1)，65-72(1997)，Strayer等，Biotechniques，22(3)，447-50(1997)，Wyatt等，Vaccine，14(15)，1451-8(1996)，和Penciolelli等，J.Virol.，61(2)，579-83(1987)。其它複製缺損以簡單MuLV載體為基礎。參見如Miller等(1990)Mol Cell Biol104239(1990)；Kolberg(1992)J NIH Res443，和Cornetta等(1991)Hum GeneTher2215)。
重組的病毒載體的基本構造在本文可以很好的理解，通過使用分子生物學技術，比如Sambrook等，MOLECULAR CLONINGA Laboratorymanual(Cold Spring Harbor Press 1989)and third edition thereof(2001)，Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley IntersciencePublishers 1995)，和Watson等，RECOMBINANT DNA，(2d ed.)，和本文提到的其它幾篇文獻一併引入本文作為參考。比如腺病毒載體顆粒可以通過已知的方法構建或者純化，比如Graham等，Mol.Biotechnol.，33(3)，207-220(1995)，U.S 5,965,358，Donthine等，Gene Ther.，7(20)，1707-14(2000)，和其它的描述文獻。腺結合病毒載體可以通過已知的方法構建或者純化，例如U.S.4,797,368和Laughin等，Gene，23，65-73(1983)。關於其它的病毒載體的類似技術也是已知的，特別是皰疹病毒載體(見例如，Lachman等，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(5)，622-32(1999))，透鏡狀病毒載體，和其它反向病毒載體。一般的，病毒載體包含核酸的嵌入物(例如，野生型腺病毒載體可包含高達3KB的未刪除嵌入物)，或者更典型的，包含一種或多種病毒基因組的刪除物可望調節核酸和其它核酸的嵌入物並阻止在宿主細胞內的複製。
一方面，可用的病毒載體是靶向病毒載體，與類似的野生型病毒載體顆粒相比，包含一種限定或者擴展的取向。典型的靶向作用可以通過病毒顆粒的衣殼和/或包膜蛋白的修飾來完成。靶向病毒載體的實例和涉及的原理可參見，如國際專利申請WO92/06180，WO94/10323，WO9738723，和WO00/11201，Engelstadter等，Gene Ther.，8(15)，1202-6(2001)，van Beusechem等，Gene Ther.，7(22)，1940-6(2000)，Boerger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(17)，9867-72(1999)，Bartlett等，Nat.Biotechnol.，17(2)，181-6(1999)，Girod等，Nat.Med.，5(9)，第1052-56頁(作為Nat.Med.，5(12)，第1428頁的修正)(1999)，J GeneMed.1999 Sep-Oct；1(5)300-11，Karavanas等，Crit Rev Oncol Hematol.1998Jun；28(1)7-30，Wickham等，J.Virol.，71(10)，7663-9(1997)，Cripe等，CancerRes.，61(7)，2953-60(2001)，Van Deutekom等，J.GeneMed.，1(6)，393-9(1999)，McDonald等，J.Gene Med.，1(2)，第103-10頁(1999)，Peng，Curr Opin Biotechnol，1999 Oct；10(50)454-7，Staba等Cancer Gene Ther.，7(1)13-9(2000)，Kibbe等，Arch.Surg.，135(2)，191-7(2000)，Harari等，GeneTher.，6(5)，第801-7頁(2000)，和Bouri等，Hum Gene Ther.，10(10)，第1633-40頁(1999)，和Laquerre等，J.Virol.，72(12)，9683-97(1997)，Buchholz，Curr Opin MolTher.1999 Oct；1(5)613-21，U.S.6,261,554，5,962,274，5,695,991，和6,251,654，和歐洲專利申請E.P.1002119和1 038 967。特別地，靶向載體和製造這些載體的技術可見國際專利申請WO99/23107。
病毒載體顆粒可以是一種嵌合的病毒載體顆粒。嵌合病毒顆粒載體的實例被描述在，Reynolds等Mol.Med.Today，5(1)，25-31(1999)，Boursnell等，Gene，13，311-317(1991)，Dobbe等，Virology，288(2)，283-94(2001)，Grene等AIDS Res.Human.Retroviruses，13(1)，41-51(1997)，Reimanm等，J.Virol.，70(10)，6922-8(1996)，Li等，J.Virol.，67(11)，第6599-66頁(1993)，Dong等，J.Virol.，66(12)，7374-82，Wahlfors，Hum Gene Ther，1999 May 1；10(7)1197-206，Reynolds等Mol.Med.Today，5(1)，25-31(1999)，Boursnell等，Gene，13，311-317(1991)，和US5,877,011，6,183,753，6,146,643和6,025,341。
本發明的非病毒載體也能與運送該載體到達宿主的特定區域的分子相交結合(比如，特定器官、組織、和/或細胞類型)。比如核酸可以與目標蛋白結合，如病毒蛋白，其與受體或與特定目標受體的結合蛋白結合(比如，通過，Wu and Wu，J.Biol.Chem.，263(29)，14621-24(1988)的技術修飾)。目標陽離子油脂組合物也是本領域所公知的(見例如，U.S，6,120,799)。其它的目標基因構建的技術可見國際專利申請WO99/41402。
在進一步的實施方案中，本發明提供包含本發明的一種或多種上述核酸、載體、多肽，抗體，融合蛋白，或其它構建物或者上述物質的一種或多種的任意組合的宿主細胞。宿主細胞可以是真核細胞，例如，哺乳動物細胞，酵母細胞，或者植物細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，比如細菌細胞。構建物引入宿主細胞可以使用磷酸鈣轉染，DEAE-右旋核苷介導的轉染，電穿孔法，基因或疫苗槍，注射或者其它常用的技術(見如，Davis，L.，Dibner，M.，和Battey，I.(1986)BASIC METHODS IN MOLECMLAR BIOLOGY)用於體內，來自體內，和體外的方法。
宿主細胞菌株可以根據其在所需方式中調恐插入序列的表達或加工表達蛋白的能力任意選擇。這種蛋白的修飾包括，但不僅限於，乙醯化作用，羧化作用，糖基化作用，磷酸化作用，酯化作用和醯化作用。切開「前蛋白(pre)」或「前原蛋白(prepro)」的形式的轉錄後加工對於正確的插入，摺疊和/或功能是很重要的。不同的宿主細胞比如大腸桿菌，芽孢桿菌，酵母或者哺乳動物的細胞比如CHO，HeLa，BHK，MDCK，HEK293，WI38等對轉錄後活性具有特殊的細胞機械性和機制特性，可以選擇確保正確的修飾和引入外部蛋白的過程。
本發明的核酸可以插入適當的宿主蛋白(在培養物或宿主生物體內)來允許宿主表達蛋白。任意適當的宿主細胞都可以通過本發明所述的核酸用於轉化/轉導。適當的宿主表達的實例包括細菌細胞，比如大腸桿菌，鏈黴菌屬(Streptomyces)，芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(氏)菌(Salmonella typhimurium)；真菌細胞，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichia pastoris，和Neurospora crassa；昆蟲細胞例如果蠅屬(Drosophila)和Spodopterafrugiperda；哺乳動物細胞，例如Vero細胞，HeLa細胞，COS細胞，WI38細胞，NIH-3T3細胞(和其它纖維原細胞，例如MRC-5細胞)，MDCK細胞，KB細胞，SW-13細胞，MCF7細胞，BHK細胞，HEK-293細胞，弓形黑素瘤細胞(Bowes melanoma cell)，和植物細胞等。可以理解，不是所有的細胞或細胞系都需要有能力去生成具有完全功能的多肽或片段；比如，多肽的抗原片段可以在細菌或其它表達系統中生成。其它適當細胞的實例可參見如US5,994,106和國際專利申請WO95/34671。
本發明也涉及用本發明所述的載體轉導，轉化或者轉染的宿主細胞。本發明的載體一般可包含本發明所述的核酸(例如，編碼重組的PRM15或者C15信號肽的核酸，編碼tE多肽的核酸，編碼全長E多肽的核酸，編碼的PRM15/tE多肽的核酸，編碼C15/全長prM/全長E的核酸)。宿主細胞用本發明的載體遺傳工程產生(如，轉導，轉化或者轉染)，載體可以是，例如，克隆載體或者表達載體。載體可以是例如以質粒，病毒顆粒，噬菌體等形式。用於產生本發明的多肽和/或複製本發明的病毒載體的適合於轉導和/或用本發明的病毒載體感染所述的適當細胞，包含上面所述的細胞。已經被證明可以作為適當的包裹病毒載體顆粒的細胞在下面文獻中描述，例，Inoue等，JVirol.，72(9)，7024-31(1998)，Polo等，Proc Natl.Acad.Sci.，96(8)，4598-603(1999)，Farson等J.Gene Med.，1(3)，195-209(1999)，Sheridan等，Mol.Ther.，2(3)，262-75(2000)，Chen等，Gene Ther.，8(9)，697-703(2001)，和Pizzaro等，Gene Ther.，8(10)，737-745(2001)。對於複製缺損的病毒載體，例如AAV載體，補充細胞系，或經輔助病毒轉化的細胞系，或者編碼基本基因的質粒轉化的細胞系對於病毒載體的複製是必需的。
工程宿主細胞可以在常規的營養介質中培養，該媒體可作為合適的活性助長劑，選擇性轉化劑，或者有興趣基因的擴增來進行修飾。培養環境例如溫度，PH，和其它對於宿主細胞的選擇性表達是有益的，並且對本領域來說是已知的技術，參考文獻可包括，例如，ANIMAL CELL TECHNOLOGY，Rhiel等，(Kluwer Academic Publishers 1999)，Chaubard等，Genetic Eng.News，，20(18)(2000)，Hu等，ASM News，59，65-68(1993)，Hu等，Biotechnl.Prog.，1，209-215(1985)，Martin等，Biotechnol.，(1987)，Freshney，CMLTURE OFANIMAL CELLSA MANUAL OF BASIC TECHNIQUE，4thED.，(Wiley，2000)，Mather，I NTRIDUCTION TO CELL AND TISSUE CMLTURETHEORY ANDTECHNIQUE，(Plenum Press，1998)，Freshney，CMLTURE OF IMMRTALIZEDCELL，3rdED.，(John Wiley Sons，1996)，CELL CMLIUREESSENIALTECHNIQUES，Doyle等，(John WileySons 1998)，和GENERALTECHNIQLUES OF CELL CMLTURE，Harrison等，(Cambridge Univ.Press1997)。核酸也可以在植物細胞中包含，複製，和/或表達。植物細胞的培養技術的描述，可參下如下文獻，例如，Payne等，(1992)PLANT CELL ANDTISSUE CMLTURE IN LIQUID SYSTEMS John WileySons，Inc，NewYork，NY；Gamborg和Phillips(1995)，PLANT CELL，TIS SUE ANDORGANCMLTUREFUNDAMENTAL METHODS Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelbe New York)和PLANT MOLECMLARBIOLOGY(1993)R.RD Croy Bios scientific Publishers，oxford，U.K.ISBN 0 12198370 6。常規的細胞培養環境可見Atlas和Parks，THE HANDBOOK OFMICROBIOLOGICAL MEDIA(1993)CRC Press，Boca Ratn，FL。
對於重組蛋白產品的長期高產，穩定的表達可以被應用。例如，穩定表達本發明的多肽的細胞系可以用表達載體轉導，該表達載體包含病毒複製起點或者內部表達元件和可選擇的標記基因。隨著載體的引入，細胞可以在它們轉到選擇性的介質之前在養分豐富的介質中生長1-2天。選擇性標記的目的是給予抗性來進行選擇，它的出現允許成功表達引入序列的細胞生長和復原。比如，對於細胞不同類型使用適當的組織培養技術可以使穩定的轉化細胞抗性增殖。
用表達載體和/或多核苷酸在合適的環境下轉化的宿主細胞任意的被培養來進行表達和在細胞培養中恢復編碼蛋白。通過這樣的重組細胞產生的多肽或者片段可能是分泌的，膜結合的，或者包含在細胞內的，取決於所用的序列和/或載體。包含本發明的編碼了成熟多肽的多核苷酸的表達載體可以由通過原核或者真核細胞膜直接分泌成熟多肽的信號序列來達到。有關這些信號序列原理的討論可見於本文其它地方。
非細胞轉錄/翻譯系統也可以用來產生由本發明所述的DNA和/或RNA或者片段產生的本發明所述的重組多肽或者片段。一些所述系統是商業上可用的。常規的離體複製和翻譯指南可見於Tymns(1995)，IN VITROTRANSCRIPTION AND TRANSLATION PROTOCOLMENTHODS INMOLECMLAR BIOLOGY，Volumn 37，Garland Publishing，NY。
本發明進一步提供包含至少一種本發明所述的多肽，至少一種本發明所述的載體，至少一種本發明所述的核酸，至少一種本發明所述的細胞，至少一種本發明所述的抗體，或者它們的任意組合和一種載體，賦形劑，或者稀釋劑的組合物。這些組合物可以任意包含任意量的適當數量的多肽，融合蛋白，核酸，載體，和/或本發明所述的細胞。而且提供藥物組合物，包含至少一種本發明所述的多肽，載體，核酸，細胞，抗體或者他們的組合和藥學可接受的載體，賦形劑，或者稀釋劑。
例如，在具體實施中，本發明提供了含有賦形劑或者載體和大多數的本發明的多種重組多肽(比如，二，三，四，或者更多重組多肽)的組合物，該組合物誘導體細胞和/或T細胞對抗至少一種血清型(比如，至少一種血清型登革熱的登革病毒)黃病毒，例如哺乳動物的免疫應答。同時也提供包含藥學可接受的賦形劑或者載體的相應的藥物組合物。
另一方面，本發明提供的組合物(包括藥物組合物)，包含賦形劑或者載體(或者藥學可接受的賦形劑或者載體)和較大量的更多登革抗原(比如，二，三，四，或者更多抗原)，其中至少一種抗原是本發明所述的重組多肽，該組合物誘導體細胞和/或T細胞對至少一種血清型的至少一種登革病毒，例如哺乳動物的免疫應答。更適宜的，該聯合登革抗原組合物誘導受試者保護性的免疫應答對抗一種或多種至少二，三，或共四種血清型的登革病毒。
另一方面，本發明提供的組合物(包括藥物組合物)，其包含(1)賦形劑或者載體(或者藥學可接受的賦形劑或者載體)；(2)多核苷酸包含受試體(比如，哺乳動物)內表達的核酸序列，產生本發明所述的重組多肽；(3)至少一種另外的核酸序列其編碼WT或者重組的登革病毒抗原和/或者至少一種WT或者重組的登革病毒抗原多肽。這些重組的或者WT登革病毒抗原可以是如下的形式，例如，WT或者重組tE多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，C15/全長prM/全長E多肽，PRM15/全長E多肽，或者C15/全長prM/tE多肽。這些組合物誘導體細胞和/或T細胞反應，和更適宜的，誘導機體內一保護性免疫應答對抗一種或多種血清型登革病毒，在組合物中編碼本發明所述多肽的核酸和編碼至少一種另外的登革病毒抗原的核酸序列可以是同樣的多核苷酸，或者兩種或者更多不同的或者獨立的多核苷酸，如果需要，不同種類的多核苷酸序列可以由一種或多種適當的載體分離或定位。在組合物中，與本發明所述的重組多肽聯合應用或者聯合表達的至少一種登革抗原可以是本發明的重組多肽，自然產生的WT登革病毒抗原，或者已知的不同的自然產生的登革抗原(如，a hybid DEN-2/DEN-3 envelope as described inBielefeldt-Ohmann等，J.Gen Virol，78(11)2723-2733(1997))。一方面，至少一種另外的登革抗原包含至少一個自然產生的抗原決定簇(比如，T細胞抗原決定簇，其中組合物誘導免疫應答(比如，T細胞反應)，該反應與由同樣或相似形式的相應WT登革病毒抗原誘導的免疫應答(比如，T細胞反應)本質上是等同的(如，WT tE多肽，全長E多肽，PRM15/tE多肽，C15/全長prM/全長E多肽，PRM15/全長E多肽，或者C15/全長prM/tE多肽)。通常的，在所述的所有分析和適當的比較中，由重組的登革病毒抗原與具有同樣的或者充分相似的形式和/或大小的WT登革病毒抗原相比較(比如，重組的PRM15/tE多肽與WT PRM15/tE多肽相比較)。相似地，特別形式和/或大小的核酸編碼的重組登革病毒抗原與具有相同或者充分相似的形式或者大小的WT登革病毒抗原相比較。
在一個方面，本發明的組合物包含由第一核酸序列編碼的多肽的多核苷酸，該多肽誘導中和抗體反應對抗至少一種至少兩種登革病毒血清型(更適宜的，對抗全部四種血清型中的一種或更多登革病毒)的至少一種登革病毒，和較大量的另外的核酸編碼多肽，包含已知的病毒抗原決定簇(比如，T細胞抗原決定簇)，選自DEN-1，DEN-2，DEN-3和/或DEN-4。
另外的或者可選擇的，該組合物可以包含一種或多種本發明所述的多肽，以保持至少一種已知的野生型登革抗原決定簇(如，T細胞抗原決定簇)。這些野生型的登革抗原決定簇是本領域已知的，文獻包括，比如，the regionsof the DEN-2 envelope protein comprising from about amino acid residues 35-50，59-78，135-157，145-169，240-250，270-298，295-307，335-354，and/or356-376(見Rothman等，J.Virol 70(1O)6540-6546(1996)，Leclerc等，MolImmunol 30(7)613-625(1993)，和Roehrig等，Virology 191(1)31-38(1994))。另外的，登革熱E和prM蛋白內的抗原決定簇(如，T細胞抗原決定簇)可以通過抗原決定簇分析(如，T細胞抗原決定簇分析)識別，該識別通過本領域已知的普通的程序和計算來完成，這些例子將會進一步描述。可以通過後續序列比較來識別本發明所述的多肽，該多肽保持這類抗原決定簇並加入組合物。
可望的，本發明所述的藥學組合物包含藥學可接受的賦形劑或者載體和抗原或免疫原，至少一種本發明所述的重組多肽，多核苷酸，載體(或者它們的任意組合)，其足夠誘導發生在受試體內的至少一種血清型的至少一種黃病毒(如，登革病毒)的免疫應答。該藥學組合物可以用體內或者體外方法。另一個特別的方面，在藥物組合物施用時，本發明所述的藥物組合物中重組的多肽，多核苷酸，或者載體的最少量應當足夠誘導機體內的保護性免疫應答。也就是說，劑量應當足夠以對抗至少一種血清型的黃病毒感染。另一方面，藥物組合物包含一種藥學可接受的賦形劑或載體和抗原或免疫原，至少含一種本發明所述的重組多肽，多核苷酸，或者載體(或它們的任意組合)，其劑量足夠誘導機體內的免疫應答。該組合物特別對抗至少兩種，三種或者四種血清型的至少一種登革病毒。
組合物(或藥學組合物)可以是任何無毒性成分，該成分不會干擾至少一種本發明所述的多肽，多核苷酸，或載體的免疫原性。組合物包含一種或多種賦形劑或載體，同時藥學組合物包含一種或多種藥學可接受的載體。廣泛的可接受的載體，稀釋劑和賦形劑是本領域已知的。本發明的組合物和藥學組合物具有廣泛的適合的成分組成。例如，使用水作為載體等，緩衝鹽，比如磷酸緩衝鹽(PBS)以及對於本發明所述的多肽，多核苷酸，和/或載體的注射有利的類似物。這些溶液是已消毒的和一般的不與其它物質反應的。組合物可以按常規的，熟知的消毒技術進行消毒。組合物可以包含藥學可接受的輔料，該輔料是按照生理學的情況估計的需求加入的，比如，PH調節劑和緩衝劑，毒性調節劑和類似物，比如，醋酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，乳酸鈉及類似物。任何適當的載體都可以用於本發明所述的多肽，多核苷酸，和/或載體，治療蛋白的幾種載體用法也是本領域已知的。
組合物，藥學組合物和/或藥學可接受的載體也包含稀釋劑，填充劑，鹽，緩衝劑，洗滌劑(比如非離子洗滌劑，如吐溫-80)，穩定劑，穩定劑(如糖或非蛋白胺基酸)，防腐劑，組織固定劑，增溶劑，和/或藥學組合物中的其它適合的輔料。在這方面，藥學組合物的適合物質的實例可見於Berge等，J.Pharm.Sci.，66(1)，第-19(1977)，Wang和Hanson，J.Parenteral.Sci.Tech.，42，S4-S6(1988)，U.S.專利6,165,779和6,225,289及其它。藥學組合物也可以包含防腐劑，抗氧劑，或別的本領域技術人員已知的輔料。另外的藥物可接受的載體也是本領域已知的。另外的合適載體的例子的描述，可見於Urquhart等，Lancet.，16，367(1980)，Lieberman等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS(2nd ed.vol.3，1998)，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMSDRMG DELIVERYSYSTEMS(7th ed.2000)，Martindale，THE EXTRA PHARMACOPEIA(31stedition)，Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES(16th-20thedition)，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，Goodman和Gilman(9th ed.-1996)，WILSON AND GISVOLDS TEXTBOOK OFORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY，Dolgado和Remers等(10th ed.-1998)和U.S.5,708,025和5,994,106。藥學可接受的組合物的成分可見於，如，Platt，Clin.Lab Med.，7，289-99(1987)，Aμlton，PHARMACEUTICSTHE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN，ChurchillLivigstone(New York)(1988)，EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGEPREPARATIONS，CSHP(1998)，和「Drug Dosage」，J.Kans.Med.Soc.，70(1)，30-32(1969)。另外的藥學可接受載體，尤其是適合的載體用法可見於，如，國際專利申請WO98/32859。
本發明的組合物或藥學組合物可以包含或是脂質體形式。合適的脂質體成分包括但不限於，甘油酸酯，甘油二酸酯，硫脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂素，膽酸以及相似物。這些脂質體成分的製備可見於美國專利4,837,028和4,737,323。
組合物或藥學組合物的組成可以是規定的，至少是部分規定的，由多肽，多核苷酸，細胞，和/或感興趣的載體。因為具有幾種可能的服用途徑，藥學組合物和/或組成是可變化的。例如，採用黏膜吸收和經皮吸收用法時，組合物中滲透劑應該適當，可以滲透過屏障。這類滲透劑是本領域的常規已知的，包括，例如用於黏膜吸收用法，洗滌劑，膽酸鹽，和梭鏈孢酸衍生物。相反的，黏膜吸收用法也可採用鼻噴霧或栓劑。
本發明的多肽和/或多核苷酸組合物，包括藥學組合物的普通用法可以是注射。注射可接受的組分包括一種或更多適宜的液體載體，例如水，石油，生理鹽水，滅菌水，Cremophor ELTM(BASF，PARSIPPANY，NJ)，磷酸緩衝鹽(PBS)，或油。液體藥學成分可以進一步包括生理鹽水溶液，葡萄糖(或其它糖類溶液)，多羥基化合物，或乙二醇，例如乙烯乙二醇，丙烯乙二醇，PEG，改善流動性的包衣材料，例如，卵磷脂，等張劑，例如甘油硬脂酸酯鋁和凝膠。適宜的，注射成分應當是無熱源物質，穩定和水溶液的形式。適宜的，注射水溶液包含等張劑，例如氯化鈉，Ringer氏注射液，葡萄糖，乳酸Ringer氏注射液，或者等同的傳輸媒介(例如，氯化鈉/葡萄糖注射液)。注射劑可以是關節內(在連接處)注射，靜脈內注射，肌肉注射，真皮注射，次真皮注射，腹膜內注射和皮下注射，包括水和非水，無菌等張注射液，可以包括抗氧化劑，緩衝液，抑菌劑和溶劑，其補償由公式計算出來的預期容納血液的等張力(比如，PBS和/或鹽水，如0.1M NaCl)，和滅菌水與非水，包括懸浮劑，增溶劑，增強劑，穩定劑和防腐劑。
本發明的多肽，多核苷酸或載體的用法可以由任意適合的輔料作為傳輸系統來促進。適合的產生非生物降解物質的輔料包括hydroxapatite，生物玻璃，鋁酸鹽，或其它陶瓷類物質。在一些申請中，螯合劑如羥甲基纖維素(CMC)，甲基纖維素，或羥丙基甲基纖維素(HPMC)，可以把多肽，多核苷酸，或載體連接起來進行局部傳輸。
在另一方面，本發明所述的多核苷酸或載體由泊洛沙姆，聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，或其它表面活性劑或類皂類親脂物質在體內，體外或離體系統中能夠傳輸到受試體內大量細胞或組織或皮膚。可見於US6,149,922，6,086,899和5,990,241，一併引入本文作為參考。
本發明的載體和多核苷酸可以與一種或多種轉染促進劑聯合使用。在一些實例中，本發明的核酸和/或核酸載體可任意的與穩定促進鹽類，載體(如PEG)，和/或靶向轉染物質(如，磷酸鹽，右旋糖酐載體，氧化鐵載體，或biolistic傳輸(「基因槍」)載體，例如金珠或粉末載體)(見US4,945,050)。其它的轉染促進劑包括可與核酸/核酸載體交聯的濾過性毒菌的顆粒，磷酸鈣沉澱劑，蛋白酶，脂肪酶，Bipuvicaine溶液，皂角苷，脂質(尤其是有電荷的脂質)，脂質體(尤其是陽離子脂質體，其實例可見於別處)，轉染促進肽或蛋白質複合物，(如聚乙烯亞胺，聚賴氨酸，或病毒的蛋白-核酸複合物)，病毒顆粒(virosome)，或修飾細胞或類細胞結構(如融合細胞)。
本發明的核酸也可以通過體內或體外電穿孔方法，可見於US6,110,161和6,261,281和Widera等，J.of Immunol.1644635-4640(2000)，在這裡一併引入本文作為參考文獻。本發明的至少一種多肽，多核苷酸，和/或載體的經皮吸收可以由包含至少一種多肽，多核苷酸，和/或載體的任何適當的組合物和任何形式的經皮吸收片段來促進。本發明提供經皮吸收片段發明物。例如至少一種多肽，多核苷酸，和/或載體可以包括在藥物儲藏片段中的液體儲藏物，或者，可選擇的，在簡單的整體經皮吸收片段物中，多肽和/或多核苷酸可以通過適宜的分散材料分散穿透。任意的，該片段包括免疫抗原或抗原量的多肽。這些片段也是本領域已知的。該片段至少可以被動或通過離子電滲傳輸多肽，多核苷酸，和/或載體到達受試體的皮膚或組織。增強機體對於至少一種血清型的登革病毒的免疫性包括使用透皮吸收片段到受試體皮膚一段時間，並處於足夠增強受試體對於登革病毒免疫性的條件下。
該組合物，特別是藥物組合物，可望包含至少一種多肽，多核苷酸，和/或載體的劑量，施用時應當足夠誘導機體尤其是人體的免疫應答。該組合物可以包含任何合適劑量的多肽，多核苷酸，和/或載體。適當的劑量可以由任何的適宜的技術來確定。在簡單的劑量試驗中，低劑量的組合物被施用於試驗機體或系統(如，動物模型，非細胞系統，或者整個細胞分析系統)。對於免疫多肽，多核苷酸，和/或載體組合物(相應於通過病毒載體基因傳輸)的劑量的探討業是本領域已知的。簡言之，劑量通常是由多肽，多核苷酸，和/或載體的效力，病人的條件，和體重和/或治療病人的目標決定的。劑量的大小也是由病人所在的環境，自然條件，與這類特別的多肽，多核苷酸，載體，組成，組合物，轉導細胞，細胞類型或類似物質的副作用決定的。所涉及的治療劑和預防劑的劑量確定原則，可見於，如，Platt，Clin.LabMed.，7，289-99(1987)，，″Drμg Dosage″，J.Kans.Med.Soc.，70(1)，30-32(1969)，和其它上面所述的參考文獻(如前面提到的，Remington′s，).
通常，核酸組合物包含至少約1μg到大約10mg的核酸，包括約1μg到大約15mg，包括約1μg到大約10mg，大約500μg到大約10mg，大約500μg到大約5mg，大約1mg到大約5mg，大約2mg到大約5mg，大約1μg到大約2mg，包括大約1μg到大約1mg，大約1μg到大約500μg，1μg到大約100μg，1μg到大約50μg，和1μg到大約10μg的核酸。包含核酸的載體，也可以相同劑量使用。一方面，給予施藥對象的組合物包含大約1，2，5，或10mg的核酸或載體。本發明所述的兩種或更多核酸的混合物(或兩種或更多編碼核酸的載體的混合物)也可以相同劑量使用。核酸中載體和稀釋劑的量取決於施用的核酸的量。例如，2mg核酸與1mL的載體或稀釋劑一起使用。組合物中核酸的量取決於其使用的個體，核酸的性質(如由編碼肽，優化密碼子，和/或啟動子決定的基因表達水平)，和使用形式。例如，由大約1μg的核酸分散進或分散到適宜的顆粒上的biolisic或「基因槍」傳輸方法，就可以介入甚至大型動物機體，如人體的免疫應答中。在一些例子中，5μg，甚至最少1μg或更多的核酸的biolistic傳輸方法是合適的。核酸的biolistic傳輸方法將進一步討論。
當核酸組合物採用注射方法時，需要大劑量。一般的，注射用的核酸組合物至少是大約1μg，優選約5μg核酸，更優選至少大約25μg核酸或至少大約30μg，50μg，通常至少大約75μg或至少大約80μg核酸，更適宜的是至少大約100μg或者至少大約150μg核酸，更適宜的是至少大約500μg，至少大約1mg，至少大約2mg，至少大約5mg，或者更多。在一些實施方案中，注射用核酸組合物包含大約0.25-5mg核酸，有代表性的稀釋劑，載體或者賦形劑的量是大約0.5-1mL。一般的，核酸注射液包含大約0.5mg，大約1mg，大約1.5mg，甚至大約2mg核酸，通常體積為大約0.25mL，大約0.5mL，0.75mL，或大約1mL。一方面，2mg核酸應該與1mL的載體，稀釋劑或賦形劑(如，PBS或鹽)一起使用。但是，在一些實施方案中，低劑量核酸的注射液(如少於約5μg，比如約4μg，約3μg，約2μg，或約1μg)與上述的高劑量相比，對於抗體反應具有等同或者更強的效力。
本發明所述的病毒載體可以包含任何適宜數量的病毒載體顆粒。病毒載體顆粒或病毒載體顆粒編碼的核酸的劑量取決於與其產生相關的病毒載體類型(如該載體是否是甲病毒載體，乳頭瘤病毒載體，HSV病毒載體，和/或AAV病毒)，該病毒載體是否是基因轉移載體或重組肽顯示載體，施用個體，或別的上面討論過的因素。一般的，關於基因轉移載體，藥學可接受的組合物包括在大約1mL體積中包含大約1×102的病毒載體顆粒(如，1mL中至少1×102到大約1×108的顆粒)。更高的劑量也是適宜的(如，至少約1×106，約1×108，約1×109，約1×1010，或更多顆粒/mL)。
本發明的核酸組合物可以包含另外的核酸。如，核酸可以與第二免疫刺激序列或第二細胞因子/編碼佐劑的序列(如，編碼IFN-γ和/GM-CSF的序列)合用。這些序列的例子已在前文描述。本發明進一步提供一種包含較大量如重組C15/全長prM/全長E多肽或全長prM/全長E多肽形式的VLPs(至少一種類型)。合乎需要的，組合物包含的VLPs的劑量足夠誘導機體內，如哺乳動物宿主的保護性免疫應答。VLPs的劑量的選擇與前文提到的病毒載體顆粒及本發明所述的其它組合物相類似。
本發明也提供一種包含兩種或更多種本發明所述的多肽的集合體。此外，本發明提供包含大量的一種或更多交聯(multimeric)多肽。特別的，本發明的重組登革抗原在一定條件下可以形成二聚物(在一些實施方案中是三聚物)，可以在機體內保持交聯(multimeric)狀態，如下面實施例所顯示的哺乳動物個體。
本發明進一步提供一種製備和使用本發明所述的多肽，多核苷酸，載體和細胞的方法。一方面，本發明提供一種製備重組多肽的方法，通過引導核苷酸進入大量處於培養介質中的細胞，在介質中培養細胞(保持一段時間和處於適宜基因表達的環境)來產生多肽，從細胞，培養介質或兩者中，分離多肽。多肽可以通過離心過濾器(Amicon)的先濃縮與細胞溶解產物，和/或細胞培養介質分離開，可選擇的，用硫酸銨或聚乙烯乙二醇衝洗，然後在PBS或其它適宜的緩衝液中再懸浮。多肽隨後可以用大小排阻層析在聚丙烯醯胺葡聚糖S-400上純化，如Hjorth，R.和J.Moreno-Lopez.1982.，J.Virol.Methods 5151-158中所述的，或另外的親和層析法，或通過20-60％蔗糖梯度離心過濾，見Konish，E.，S.等，1992，Virology 188714-720(見Figs.15A-15B).包含所需多肽的部分可以通過蛋白銀著色和免疫印跡法和其後的ELISA或SDS-PAGE來修飾。所需的片段可以是共有和進一步濃縮的。梯度離心過濾片段中的蔗糖可以用PD-10(Amersham Biosciences)凝膠過濾分離。其它的純化技術包括疏水作用層析法(Diogo，M.M，等，2001.，J GeneMed.3577-584)或其它本領域已知的適宜方法.。多種多肽的純化方法也是本領域已知的，包括如，Sandana(1997)BIOSEPARATION OF PROTEINS，Academic Press，Inc.，Bollag等1.(1996)PROTEIN METHODS，2 EditionWiley-Liss，NY，Walker(1996)THE PROTEIN PROTOCOLS HANDBOOKHumana Press，NJ，Harris和Angal(1990)PROTEIN PURIFICATIONAPPLICATIONSA PRACTICAL APPROACH IRL Press at Oxford，Oxford，England，Scopes(1993)PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES ANDPRACTICE 3rd Edition Springer Verlag，NY，Janson和Ryden(1998)PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES，HIGH RESOLUTION METHODSAND APPLICATIONS，Second Edition Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press，NJ。適宜多肽產生的細胞也是本領域已知的，其討論可見於別處(如，維洛細胞，293細胞，BHK，CHO，和COS細胞都是適宜的)。細胞可以通過任何適宜的技術溶解，如超聲法，微流化，物理切應力，弗氏細胞壓碎器溶解或使用降解劑溶解。本發明提供一種包括將載體插入細胞的多肽的製備方法，在合適的環境下培養細胞以在載體中進行核酸表達，和在細胞，培養環境，或兩者中分離多肽。細胞的選擇以所需的多肽和載體為基礎(如，優選大腸桿菌細胞作為細菌質粒，反之哺乳動物穿梭質粒和/或腺病毒，尤其是缺乏EI的腺病毒，優選293細胞)。
除重組產物外，多肽也可由固相法直接肽合成(見如，Stewart等.(1969)SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS，WH Freeman Co，San Francisco andMerrifield J.(1963)JAm Chem Soc 852149-2154)。肽合成可以由手動或自動完成。自動合成可以完成，如用using Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)的技術和製造商的技術說明。例如，序列可以單獨以化學方法綜合和用化學方法產生多肽或片段。可選擇的，綜合多肽也可來自專業生產多肽的任何公司。最常見的，本發明的多肽由如前文所述的表達編碼核酸和再生多肽產生。
另一方面，本發明提供一種製備多肽的方法，包括誘導核酸，載體或其組合物引入受試體，典型和優選是引入哺乳動物(如，鼠，非人類靈長類，蝙蝠，小猿，豬或者猴子)，其中多肽可以在受試體內表達，並與動物或受試體副產物分離開來。多肽與受試體如動物或動物副產物的分離，可以使用任何適宜的技術，取決於受試體和回收策略。例如，表達多肽可以由老鼠、猴子或豬的血清中回收。本發明也提供含有本發明所述的核酸的轉基因動物(優選哺乳動物，例如前面所述的哺乳動物)。該轉基因動物可以將核酸整合進入宿主染色體(如由AAV載體，慢病毒載體，用於整合促進序列的biolistic技術等)或將核酸處於表面染色體中(如非整合質粒載體或非整合病毒載體的插入物)。表面染色體載體可以設計為比整合載體有更多短暫的基因表達。RNA基礎的載體在這方面有特殊的優點。
本發明也提供製備至少一種與登革病毒結合的抗體的方法。本發明進一步提供製備至少一種與血清型登革病毒結合的抗體，優選與兩種或三種的，更優選全部四種血清型的(每個型的)一種或多種登革病毒，其包含有效量(如抗原或免疫原性劑量的)的至少一種重組多肽或抗原或免疫性原片段。或有效量的載體或編碼至少一種多肽的核酸，或包含有效量的至少一種多肽或核酸或編碼多肽，施用於適宜的動物宿主或宿主細胞。宿主細胞是培養的或動物宿主是在抗原-抗體複合物形成的條件下維持。其後製備的抗體是從細胞培養，動物或動物的副產品回收的(例如，哺乳動物的血漿)。抗體的製備可以有本發明的至少一種多肽，或肽或多肽片段，包含至少大約10個胺基酸，優選至少大約15個胺基酸(如，約20個胺基酸)，更優選至少大約25個胺基酸(如，約30個胺基酸或更多)。可以選擇的，培養了足夠時間和處於適宜轉基因表達的周期的核酸或載體可以插入適當的細胞，其中通過核酸序列的表達就可以製備抗體，該抗體可與由核酸序列編碼的重組抗原結合。獲得的抗體可以用於診斷和/或預防。抗體和包含抗體的組合物，藥物組合物(其原理同前文所述的組合物和藥物組合物)是本發明的特點。
對應答至少一種多肽，其片段，或表達該多肽的載體和/或多核苷酸所製備的抗體可以是任何適宜的形式。本發明製備的抗體包括，如多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體，抗原結合片段和由抗原結合片段表達文庫產生的片段。製備多克隆抗體，單克隆抗體的方法是本領域已知的，許多抗體都是有用的，見如，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，John Colligan等，eds.，Vols.I-IV(John Wiley Sons，Inc.，NY，1991 and 2001 Supplement)，and Harlow and Lane(1989)ANTIBODIESALABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Press，NY，Stites等.(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMLINOLOGY(4th ed.)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，和其它參考文獻，，Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY，及Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497。其它適宜的抗體製備方法包括選自噬菌體或相似載體中的重組基因文庫抗體，見如Huse等(1989)Science 2461275-1281；和Ward等.(1989)Nature 341544-546。特異的多克隆和單克隆抗體及抗血清經常以至少約0.1μM，優選至少約0.01μM或更好，至少約0.001μM或更好的KD結合。
製備嵌合體(人源化的)抗體的詳細方法可參見美國專利U.S.5,482,856.其它的關於人源化和其它抗體製備和工程可參見Borrebaeck(ed.)(1995)ANTIBODY ENGINEERING，2nd Ed.Freeman and Co.，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)ANTIBODY ENGINEERING，APRACTICAL APPROACH IRL at Oxford Press，Oxford，England(McCafferty)，和Paμl(1995)ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS Humana Press，Towata，NJ(Paul)。
人源化抗體是應用時所尤其希望的。應用時，抗體作為治療劑/或預防劑施用於哺乳動物體內或體外的細胞或組織，該抗體傳輸或移植進入哺乳動物(如人)。人源化抗體包含特有的人源免疫球蛋白序列。本發明所述的人源化抗體可以應用許多技術來製備(見，如Larrick等，U.S.Pat.No.5,001,065，和上面已經提及的Borrebaeck Mc Cafferty and Paμl)。在一個實施方案中，人源化抗體最初在三源雜交瘤(triomas)中產生。基因編碼的抗體然後克隆和在別的細胞中表達，如非人類哺乳動物細胞。由三源雜交瘤製備人源化抗體的一般方法，可見Ostberg等(1983)，Hybridoma 2361-367，Ostberg的美國專利U.S.4,634,664，和Engelman等的美國專利U.S.4,634,666。抗體製備的細菌株的獲得方法之所以叫三源雜交瘤，是因為三個細胞，兩個來自人類，一個來自小鼠。三源雜交瘤製備抗體要比一般的用人類細胞的方法更穩定。
其它的有用的製備抗體的技術可見，如Gavilodono等，Biotechniques，29(1)128-32，134-6，and 138(2000)，Nelson等，Mol.PathoL，53(3)111-7(2000)，Laurino等，Ann.Clin.Lab.-Sci.，29(3)158-66(1999)，Rapley，Mol.Biotechnol.3(2)139-54(1995)，Zaccolo等，Int.J.Clin.Lab.Res.23(4)192-8(1993)，Morrison，Annu.Rev.Immunol.10239-65(1992)，″Antibodies，Annigene，and MolecμlarMimiery″，Meth.Enzymd.178(J.J.Langone，Ed.1989)，Moore，Clin.Chem.，35(9)1849-53(1989)，Rosalki等，Clin.Chim.Acta 183(1)45-58(1989)，和Tami等，Am.J Hosp.Pharm.43(11)2816-25(1986)，以及U.S.4,022,878，4,350,683，和4,022,878。具有高粘合性的抗體的製備技術可見於Border等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 97(20)10701-05(2000)。
本發明進一步提供一種促進，誘導，增強或調恐哺乳動物對至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答的方法，包括給受試體使用免疫原性劑量的至少一種多肽，如人或非人類的靈長類動物，以使哺乳動物受試體對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答可以被促進，誘導，增強或調控。優選的，多肽包含在藥學組合物中，並含有上述藥學可接受的載體或賦形劑。通常，可注射的藥學組合物包含適宜的、藥學可接受的載體(如，PBS)，免疫原性劑量的多肽由肌內，腹膜，皮下，經皮，皮下或皮內注射入受試體內。可選擇的，biolistic蛋白傳輸技術(疫苗槍傳輸)也可應用(將在別處討論)。任何其它適宜的技術也可應用。多肽給藥也可由脂質體促進(以下將進一步討論)。
本發明也包括一種通過使用抗原或免疫原性劑量的至少一種核酸和/或至少一種核酸載體(NAV)增強受試體對登革病毒的免疫應答的方法，優選的對受試體施用在藥學組合物中包含藥學可接受的載體和使用抗原或免疫原性劑量的至少一種核酸和/或核酸載體。
接下來討論核酸，可以理解也同樣(確實，更)適用於本發明所述的核酸載體。該核酸組合物可以通過任何適宜的給予途徑施用或傳輸給受試體。在本發明的一方面，核酸是胃腸外(如，皮下，肌內，或皮內)，局部，或經皮吸收的。核酸可以通過使用針或者類似裝置注射直接進入組織，如，肌肉。可見於Nabel等，(1990)，如前；Wolf等，(1990)Science，2471465-1468)，Robbins(1996)GENE THERAPY PROTOCOLS，Humana Press，NJ，和Joyner(1993)GENE TARGETINGA PRACTICAL APPROACH，IRLPress，Oxford，England，和U.S.5,580,859和5,589,466。其它方法如「biolistic'或顆粒介導的轉化(見，U.S.4,945,050，U.S.5,036,006，Sanford等，J.Particμlate Sci.Tech.，5，27-37(1987)，Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，9568-72(1990)，和Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2726-30。本發明的核酸的適宜介導物可見於，如，U.S.5,591,601，5,593,972，5,679,647，5,697,901，5,698,436，5,739,118，5,770,580，5,792,751，5,804,566，5,811,406，5,817,637，5,830,876，5,830,877，5,846,949，5,849,719，5,880,103，5,922,687，5,981,505，6,087,341，6,107,095，6,110,898，和國際專利申請WO98/06863，WO 98/55495，和WO 99/57275，這些文獻一併引入本文作為參考。
使用標準基因槍傳送，感興趣的載體或核酸沉澱到微金屬珠的表面。用震蕩波或膨脹的氦氣加速這些微粒，穿透組織到幾個細胞層的深度。例如。由Agacetus公司製造的AccelTM基因傳送裝置。Middleton WI適合用在這方面。核酸或載體可以使用如下的技術傳送，例如，肌肉注射，皮內注射，皮下注射，和/或腹膜內注射。其它的關於biolistic傳送的裝置和技術在國際專利申請WO99/2796，WO99/08689，WO99/04009，和WO98/10750，和美國專利5,525,510，5,630,796，5,865,796，和6,010,478有描述。
所述的核酸可以和易轉染劑一起傳送，上述例子中已有描述。所述核酸通常可以由和/或液體顆粒傳送(相對與固體biolistic傳送而言)。這樣的核酸傳送技術，合成物，和增加的構建物的例子適合用於本發明所述的核酸的傳送載體，例如，美國專利5,525,601，5,593,972，5,679,647，5,697,901，5,698,436，5,739,448，5,770,580，5,792,751，5,804,566，5,811,406，5,817,637，5,830,876，5,830,877，5,846,949，5,849,719，5,880,103，5,922,687，5,981,505，6,087,341，6,107,095，6,110,898，和國際專利申請WO98/06863，WO98/55495，和WO99/57275，引用其全部內容這裡的每一個引用其全部內容的申請可以用於所有的目的。
抗原的傳輸技術和形式的選擇能夠影響用藥後觀測到的免疫應答的類型。比如，許多抗原的基因槍傳送與Th2-偏向的反應相關(通過較高的IgG1抗體滴度和相對低的IgG2a滴度標記)。有利地，至少一些本發明所述的VLPs有望克服伴隨使用登革病毒抗原的這種Th2偏向。特異性的免疫應答的偏向使醫師或技術人員能引導通過使用本發明所述的多肽和/或多核酸所產生的免疫應答。
可選的，核酸可以通過基於脂質體的基因傳輸被呈遞給宿主。與基於脂質體的基因傳輸相關的技術和原理可見於，如Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino和Goμld-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)682-691；Rose U.S.5,279,833；Brigham(1991)WO 91/06309；Brigham等.(1989)Am JMed Sci298278-281；Nabel等(1990)Science2491285-1288；Hazinski等.(1991)Am J Cell Molec Biol4206-209；及Wang和Huang(1987)Proc NatlAcad Sci USA847851-7855)，Felgner等.(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA847413-7414，以上一併引入本文作為參考。用於運送核酸的藥學可接受的脂質體組合物在別處將進一步被描述。
任何免疫原性含量的核酸量可以應用。有代表性地，核酸由注射給予，大約50μg-5mg，通常地大約100μg-大約2.5mg，典型地大約500μg-大約2mg或大約800μg-1.5mg，經常為2mg或1mg被施用。
用於這些通過基因槍給藥的方法中的DNA質粒的含量，如，代表性地，比直接注射給藥量少100-1000倍。例如，相應於上面第一個範圍，用基因槍傳輸DNA質粒的給藥量大約為50×10-8-5×10-5g(少100倍)或從大約50×10-9-大約5×10-6g。不管靈敏度，優選至少大約1μg的核酸被用於這種biolistic傳輸技術。
編碼重組登革抗原的核酸序列的表達，可以與任何適宜的如前文所述的啟動子和/或其它表達控制序列可操作地連接。比如，多核苷酸構建體的表達可以通過採用可誘導的開啟和關閉基因表達的系統來誘導。這種開啟和關閉基因表達系統的例子分別包括Test-One基因表達系統和Test-Off基因表達系統(見，如，Clontech Catalog 2000，110-111對每個系統的詳細描述)。
本發明的病毒載體的呈遞還能在機體中誘導產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。任何適宜的病毒載體，以任何適宜的濃度被用於誘導免疫應答。對宿主機體給予大量的逆轉錄病毒載體(實例可見，如，Buchscher等(1992)J.Virol.66(5)2731-2739，Johann等(1992)J Virol.66(5)1635-1640(1992)，Sommerfelt等，(1990)Virol.17658-59，Wilson等.(1989)R Virol.632374-2378，Miller等，J Virol.652220-2224(1991)，Wong-Staal等1PCT/US94/05700，Rosenburg和Fauci(1993)inFUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，THIRD EDITION Paμl(編輯)Raven Press，Ltd.，New York和其它參考文獻)，AAV載體(如，West等(1987)Virology16038-47，Kotin(1994)Human Gene Therapy 5793-801，Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.941351，Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.5(11)3251-3260，US4,797,368和5,173,414，和國際專利申請WO 93/24641)，或腺病毒載體(如Berns等.(1995)Ann.NY Acad.Sci.77295-104；Ali等.(1994)Gene Ther.1367-384；和Haddada等.(1995)Curr.Top.Microbiol.Emmunol.199(Pt3)297-306)，使得從而在體內產生載體內這類核酸的表達的免疫原性水平，導致所希望的免疫應答。其它適宜的病毒載體將在別處描述(包括可選擇的適宜的逆轉錄病毒，AAV，和腺病毒載體的可替代例子)。
這些和提取類型的病毒載體顆粒的適宜注射條件被描述在，如，Bachrach等，J.Virol.，74(18)，8480-6(2000)，Mackay等，J.Virol.，19(2)，620-36(1976)，和FIELDS VIROLOGY，同上文。其它用於病毒載體製備和應用的技術可見於，如，″Practical Molecμlar VirologyViral Vectors for GeneExpression″inMETHODS IN MOLECMLAR BIOLOGY，vol.8，Collins，M.編輯，(HumanaPress 1991)，VIRAL VECTORSBASIC SCIENCE AND GENE THERAPY，第一次編輯(Cid-Arregui等，編輯)(Eaton Publishing 2000)，″Viral ExpressionVectors，″in CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY，Oldstone等，編輯(Springer-Verlag，NY，1992)，和″Viral Vectors″inCURRENT COMMUNICATIONS IN BIOTECHNOLOGY，Gluzman和Hμghes，編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。
本發明提供的包括重組分子的載體的毒性和治療效果可以在細胞培養和動物實驗中採用標準藥學實驗來測定。例如，本領域技術人員可以用本文提供的技術或本領域技術人員已知的其它技術測定LD50(半數致死量)和ED50(半數有效量)。核酸，多肽，蛋白質，融合蛋白，轉導細胞和本發明的其它製劑的給藥應當是遵循已決定的量，如製劑的ED50和各種濃度下的副作用，病人的健康情況和一般狀況。給藥可以是一次或分開幾次完成。
病毒載體可以定向到特定的組織，細胞，和/或器官。這些載體的例子在前文被描述。如，病毒載體，或核酸載體可以用於選擇性的把核酸序列運送到單核細胞，樹突細胞，與樹突細胞交聯的細胞(如，與Langerhans細胞交聯的角化細胞)，T細胞，和/或B細胞。該病毒載體可以是複製缺陷的病毒載體。病毒載體顆粒也可以通過修飾來減少宿主對病毒載體的免疫應答，以實現持久的基因表達。這些「秘密行動」(「stealth」)載體的描述可見於，如，Martin，Exp.Mol.Pathol.，66(1)3-7(1999)，Croyle等，J.Virol.，75(10)4792-801(2001)，Rollins等，Hum.GeneTher.，7(5)，619-26(1996)，Ikeda等，J.Virol.，74(10)4765-75(2000)，Halbert等，J.ViroL，74(3)，1524-32(2000)，和國際專利申請WO 98/40509。可選擇的或另外的，病毒載體顆粒也可以通過一種被選擇來減少機體對於病毒載體顆粒的免疫應答的策略來施用。用於在對宿主給藥時降低對病毒載體顆粒的免疫應答的策略可見於，如，Maione等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(11)，5986-91(2001)，Morral等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(22)，2816-21(1999)，Pastore等，Hum.Gene Ther.，10(11)，1773-81(1999)，Morsy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(14)，7866-71(1998)，Joos等，Hum.Gene Ther.，7(13)，1555-66(1996)，Kass-Eisler等，Gene Ther.，3(2)，154-62(1996)，US6,093,699，6,211,160，6,225,113，US2001-0066947A1.
任何適宜的病毒載體顆粒的種群和濃度(劑量)可以用於誘導宿主機體的免疫應答。在本發明的一些方面，代表性的使用至少大約1×102顆粒(如，該方法包括使用在大約1-2mL注射液和藥學可接受的溶液中的適宜病毒載體顆粒，該病毒載體顆粒的量為至少大約1×102顆粒/mL到大約1×109顆粒/mL)。當傳輸到宿主時，病毒載體顆粒的數量使得感染複數(MOI)期望地為至少大約1-100，優選為至少大約1-100，更優選為至少大約5-30。病毒載體顆粒劑量的討論將在別處描述。
術語「接觸抗原」(「prime」)一般指將本發明的多肽(如，重組登革病毒抗原)或編碼這種多肽的多核苷酸體外給予和傳輸給細胞培養物或細胞或細胞群體，或體內給予和傳輸給患者或者離體給予和傳輸給患者組織或細胞的。首次給予和傳輸(主要接觸)可能不足以誘導或促進可測量反應(如，抗體反應)，但對誘導記憶應答或增強二次應答是足夠的。術語「攻擊」一般指誘導，促進，或調節免疫應答的過程。
優選的，首次將本發明的多肽或多核苷酸體外傳輸或給予給細胞或細胞培養物，或者體內或離體傳輸或給予患者的組織或細胞，接著進行一次或多次的二次(通常是重複的)給予多核苷酸和/或多肽。例如，在進行多肽組分的首次給藥後，通常至少在首次多肽給予後約7天(更加典型地在首次多肽給予後約14-35天或大約2，4，6，12或24個月)，進行第一次重複給予(「接觸抗原加強」)基本相同(如果不相同的話)劑量的多肽，代表性的與第一次給藥相似的劑量(如，在1-2mL注射劑和藥學可接受溶液中有約5μg到約1mg，或約5μg-0.1的多肽)。優選的，第二次重複給藥(或「二次加強」)如果不相同的話，以相似的多肽組分劑量，在初次給藥後的約2-9，3-6，9-18，或約12-24個月。
任何施用本發明的多肽的技術也可以包括共同施用一種或多種適宜的輔料。適宜輔料的例子包括Freund氏乳化油(完全的和不完全的)，鋁鹽(氫氧化鋁和/或磷酸鋁)，脂多糖(如，細菌LPS)，脂質體(包括乾燥脂質體和包含細胞因子(如含有IFN-Y和/或GM-CSF的)的脂質體)，內毒素，磷酸鈣和鈣化合物微粒(見，如國際專利申請WO00/46147)，分枝菌佐劑，山梨醇單油脂，液狀石蠟，乳化花生油佐劑(佐劑65)，百日咳桿菌產物/毒素，霍亂毒素，非離子阻斷聚合表面活性劑，粒狀棒狀桿菌衍生物P40，脂肪酸，脂肪族胺，石蠟和植物油，鈹，和免疫刺激複合物(免疫刺激複合物如Hglund等″ISCOMs and immunostimμlation with viral antigens″in SUBCELLMLARBIOCHEMISTRY(Harris，J.R.編輯)Plenum，紐約，1989，39-68，Morein等，″The ISCOM-an approach to subunit vaccines″in RECOMBINANT DNAVACCINESRATIONALE AND STRATEGY(Isaacson，R.E.編輯)MarcelDekker，紐約，1992，369-386，和Morein等，Clin Immunotherapeutics 3461-75(1995))。近來，單磷醯脂質A，氟草胺-A的免疫刺激複合物，和包含蘇氨醯肌衍生物和胞壁醯二肽的興泰克輔料組分(SAFs)也可用於人體疫苗。適合連用或連續使用一種或多種本發明的多肽的不同類型的輔料是本領域已知的。這些輔料的例子可見於如，Vogel等，A COMPENDIUM OF VACCINEADJUVANTS AND EXCIPIENTS(第二次編輯)(http//www.niaid.nih.gov/aidsvaccine/pdf/compendium.pdf-accessed January 24，2002)，Bennet等，J.Immun Meth 15331-40(1992)，Bessler等，Res Immunol.143(5)519-25(1992)，Woodard，Lab Animal Sci 39(3)222-5(19R9)，Vogel，AIDS Res andHuman Retroviruses 11(10)1277-1278(1995)，Leenaars等，VetImmunolImmunopath 40225-41(1995)，Linblak等，Scandinavian J LabAnimal Sci 141-13(1987)，Buiting等Res Immunol 143(5)541-548(1992)，Gupta and Siber，Vaccine(14)1263-1276(1996)，和美國專利US 6,340,464，6,328,965，6,299,884，6,083,505，6,080,725，6,060,068，5,961,970，5,814,321，5,747,024，5,690,942，5,679,356，5,650,155，5,585,099，4,395,394，和4,370,265。
施用本發明的核酸代表性地和優選地進行加強(至少一次追加給藥，優選至少一次和二次加強)。一次追加典型是首次免疫接種。首次核酸施用後，進行重複施用核酸在首次給藥後的至少大約7天，優選約14-35天，或2，4，6，9，或12個月。重複給藥的劑量通常和首次給藥的劑量大致相當(如果不相同的話)，(如，在1-2mL注射劑和藥學可接受溶液中有約50μg到約15或約20mg，約1mg到約10mg，或約2-5mg)。
可選擇的，核酸的首次給藥後可以追加免疫原性量的多肽的給藥。優選的，二次加強還優選用核酸和/或多肽進行，其劑量與第一次追加給藥和/或首次給藥的劑量相當，並在多肽首次給藥的大約2-9，3-6，9-18或12-24個月之後。任意次的核酸和/或多肽的追加給藥都是允許的。
多肽，核酸和/或載體可用於促進對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的任何免疫應答。例如，至少一種重組多肽，核酸和/或載體可以免疫原性的或抗原性的量作為預防劑被施用給未感染特定血清型登革病毒的哺乳動物(優選為人)。有利地，至少一種重組多肽，核酸，和/或載體的給藥可誘導抵抗至少一種血清型的至少一種登革病毒的攻擊的保護性免疫應答，也可認為是抵抗由所述至少一種血清型的至少一種登革病毒引起的登革病毒感染的「疫苗」。優選的，施用至少一種重組多肽，核酸，和/或載體誘導抵抗至少兩種，三種，更優選四種血清型的至少一種一種登革病毒攻擊的保護性免疫應答，，這樣，也可分別被認為是抵抗至少兩種，三種，更優選四種血清型登革病毒引起的病毒感染的「疫苗」。
一個有利方面，至少本發明的重組多肽，核酸，和/或載體被給予已被至少一種特定血清型登革病毒感染的哺乳動物，尤其是人，以誘導哺乳動物(人)體內抵抗一種或多種其它血清型登革病毒的保護性免疫應答(比如，中和抗體免疫應答)，更優選在施用至少一種重組多肽，核酸，和/或載體，以及在用血清型不同於先前感染哺乳動物的登革病毒血清型的一種或多種血清型登革病毒攻擊時，不出現ADE。至少一種重組多肽，核酸，和/或載體也可被施用於用至少一種登革病毒血清型活躍感染的哺乳動物，，幫助抵抗登革病毒進一步感染的免疫應答的產生。更優選的，重組多肽，核酸，和/或載體以足夠在受登革病毒感染威脅(或特別受DF和/或DHF的威脅)的人體中誘導產生保護性免疫應答的劑量被施用，或人正在或已經用至少一種血清型登革病毒感染，來避免二次感染時的DHF，優選不存在ADE。
本發明所述的多核苷酸和載體可以由體外傳輸到細胞、組織或器官。另外，本發明提供一種增強對於登革病毒的免疫應答的方法，包括把至少本發明的一種核酸和/或本發明的載體插入大量的細胞並將細胞植入哺乳動物中。體外給藥策略是本領域已知的(見，如美國專利申請U.S.5,399,346和Crystal等，Cancer Chemother.Pharmaco1.，436S(副刊).S90-S99(1999))。細胞和組織可以在體外通過注射針或基因槍注射或植入哺乳動物中。簡言之，在體外技術中，提供了細胞培養物(如，器官細胞，皮膚、肌肉細胞等)或靶組織，或優選從宿主獲得，然後將它們與載體或多核苷酸組合物接觸，然後再植入宿主(如，使用前面描述的技術或相關技術)。核酸的體外給藥也可以用於避開非希望的核酸整合和進行核酸或載體的定向傳輸。這些技術也可用培養的組織或合成生產的組織來進行。可選擇的，細胞可以被提供或從宿主獲取，與免疫原性量的本發明的多肽接觸(如一起培養)，當細胞被植入或再植入宿主時，該免疫原性量足以預防性地誘導對於登革病毒的免疫應答(優選保護性免疫應答，如，保護性中和抗體反應)。被接觸細胞然後傳輸或返回到患者中獲取這些細胞的位置，或被治療的患者中所關心的其它位置(如包括前面定義的位置)。希望得到的，可採用標準和已知的移植技術把接觸細胞移植到患者中所關心的組織，器官或系統(包括上面所述的)或如，採用標準的傳輸或輸入技術傳輸到血液和淋巴系統。這些技術可以用任何適宜的細胞種類完成。例如，一方面，激活的T細胞可以通過從機體(如哺乳動物，比如人)獲得T細胞來提供，對T細胞施用足夠量的一種或多種本發明的多肽來有效激活T細胞(或施用足夠量的一種或多種具有啟動子的本發明的核酸，使得一個或多個T細胞攝入核酸並足夠表達以產生有效量的多肽來激活所述的T細胞)。活化的T細胞然後返回機體。T細胞可以由許多本領域的已知技術從機體中獲得或分離，包括，如機體的外周血得到T細胞或由機體的腫瘤直接得到T細胞。其它體外方法的優選細胞包括擴增的淋巴細胞，特別是B細胞，抗原遞呈細胞(APCs)，如樹突細胞，或更優選的表皮黑素細胞，單核細胞，巨噬細胞，骨髓抽吸物，或萬能供血幹細胞。多肽或多核苷酸載體的體外給藥的優選方面是能確保在傳輸或攝取細胞到機體前多核苷酸不會被整合到細胞的基因組中。可望的，細胞可採用本領域已知的標準技術來從已經攝取了多核苷酸或載體，而未發生整合的細胞中選擇。
本發明包括誘導機體對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，包括(a)提供大量的B細胞，樹突細胞，或兩者；(b)用至少一種本發明的核酸轉化細胞，以使核酸不會被整合到細胞的基因組中，和(c)傳輸有效量的細胞到機體，其中在傳輸後該細胞表達至少一種核酸和在機體中誘導對至少一種登革病毒的免疫應答。採用這些方法，在用核酸轉化細胞之前從機體獲得該細胞，並在用至少一種核酸轉化後，細胞被傳輸到相同的機體。一些這種進一步包含將以下物質傳輸到機體1)包含GM-CSF或幹擾素(IFN)的多肽，2)編碼GM-CSF或幹擾素的核酸，和3)編碼GM-CSF和幹擾素的核酸。
另一方面，本發明提供一種使用大量的本發明的重組VLPs或減毒病毒來誘導免疫應答的方法，它們由包括本發明的重組C15/全長prM/全長E多肽，或全長prM/全長E多肽的多肽群體形成。VLPs或減毒病毒的給藥採用前文所述的施用多肽和病毒載體相似的方法進行(如，VLPs優選以藥學可接受的注射液注入或透過皮膚，或肌內或腹膜內給藥)。通過適宜的技術施用多肽，載體和多核苷酸時，皮膚和肌肉是優選的給藥目標。因此，傳輸多肽，多核苷酸或載體進入或穿過機體，如哺乳動物(優選人)的皮膚是本發明的一個特點。這些給藥可以通過經皮吸收裝置來實現，或更優選的，多肽，多核苷酸和/或載體的biolistic傳輸進入或穿過機體的皮膚，或進入機體的暴露肌肉。本發明提供的經皮吸收裝置已在本文別處描述，例如，可以應用於宿主的皮膚一段適宜的時間，足夠將多核苷酸和/或載體傳輸到哺乳動物，由此產生針對至少一種登革病毒的免疫應答。通過注射包含本發明的多肽，多核苷酸，或載體的液體溶液的肌肉是尤其便捷的肌肉施用。可有利地定向的特殊細胞包括樹突細胞，其它APCs，B細胞，單核細胞，T細胞(包括T輔助細胞)，和與該免疫系統細胞相關的細胞(如角化細胞或其它與表皮黑素細胞相關的皮膚細胞)。本發明的載體和核酸的靶向作用將在別處討論。靶向給藥可以由包含可操作地連接到細胞和/或組織特異性啟動子的核酸的核酸和載體完成，其實例是本領域已知的。
本發明的多核苷酸可以通過任何適宜的傳輸系統給藥，以使機體發生對登革病毒的免疫應答的多肽重組的表達。例如，有效量的包括本發明的核酸的細菌細胞群體被施用給機體，導致本發明的重組多肽核酸的表達，並在機體中誘導對登革病毒的免疫應答。被開發用於哺乳動物基因送遞的細菌細胞是本領域已知的。另一方面，將電穿孔技術應用於有效數量的細胞或有效靶向組織，方便了本發明的多核苷酸或載體(優選多核苷酸載體)的給藥，使得核酸和/或載體被細胞攝取，並在其中被表達，導致了生成本發明的重組多肽和隨後在哺乳動物中誘導對登革病毒的免疫應答。
一方面，核酸，多肽，和/或載體可以與其它核酸或其它核酸載體聯用，該載體包括可以在施用本發明的核酸、多肽和/或載體時增強對登革病毒免疫應答的其它核酸。優選地，該第二核酸包含編碼GM-CSF，幹擾素(如IFN-γ)，或兩者的序列，其實例將在別處討論。可選擇的，該第二條核酸包括在本文別處描述的免疫刺激(CpG)序列。GM-CSF，IFN-γ或其它多肽輔劑可以與多肽、核酸，和/或載體聯用。聯合使用可以是在施用本發明的多肽，核酸，和/或載體之前，同時，或之後使用，可在任意時間使用，只要可以增強對於登革病毒的免疫應答就可。
登革病毒可以通過伊蚊叮咬傳播，對在熱帶生活或旅行的人們構成很大威脅。登革病毒感染的臨床表現大部分是登革熱型發燒，是一種自限性(self-limited)纖維病。死亡率在1-5％的致命的登革熱出血/登革熱休克綜合症(DHF/DSS)經常與續發性感染相關。
多種登革病毒血清型可以在一局部地區流行的，因此檢測同時抵抗多種血清型的患者的血清樣本是很重要的，尤其是在患者生活的地區流行的那些血清型。在一個所有四種登革病毒血清型可能都流行的地區中，檢測同時抵抗所有四種血清型的患者的血清是重要的。為了治療，確定感染登革病毒病人的特定血清型並不總是必要的；然而，將特定感染病毒與其它導致出血熱的病毒區分開是重要的。在培養環境中培養登革病毒是冗長的，並且得到的病毒樣本的質量通常變化很大，這是由於不同病毒的生長能力和穩定性差異。這使得難以在ELISA平板的每個孔中產生恆定的多種(如二種，三種，尤其是四種)血清型的抗原含量。另外，由於難以獲得滅活病毒，這種分析平板非常昂貴，不能在貧窮國家裡進行大規模的臨床檢測。
本發明提供使用至少一種重組登革病毒抗原嵌合多肽的新的診斷測定法，該多肽顯示四種登革病毒血清型的一種或多種的一種或多種構象表位和/或確定抵抗一種，兩種，三種或四種血清型登革病毒的一種或多種抗體。這些重組多肽可以被特異性抗血清確定。本發明的重組登革病毒抗原作為診斷工具，對於獲取抵抗一種，兩種，三種和優選全部四種登革病毒血清型的抗體是有用的。具體的，本發明提供一種使用至少一種本發明的重組或合成多肽的診斷分析法，該多肽顯示兩種，三種或四種登革病毒血清型(DEN-1，DEN-2，DEN-3，和/或DEN-4)的一種或多種構象表位和/或確定抵抗一種，兩種，三種或四種血清型登革病毒的一類或多種抗體(如，多價抗原)。
更優先的，本發明提供一種診斷分析法，使用至少一種本發明的重組或合成的多肽，該多肽顯示四種登革病毒血清型每種的一種或多種構象表位和/或確定抵抗四種血清型的每種的至少一種登革病毒的抗體。正如下面實施例中詳細描述的，這些四價抗原多肽誘導機體內的抗體反應因此可作為疫苗的候選。
例如，四種重組PRM15/tE多肽(2/7E，5/21，2G11，和6E12)作為診斷抗原被選用(見實施例19)。可選的，「全長」克隆(2/7E-D1，5/217E-D1，2G11E-D4，和6E12-D4)也可應用。已經證明對於TBE，以及別的黃病毒來說，病毒性prM和100％的E基因的表達導致病毒樣顆粒(VLP)的形成，即物理的和抗原性的組裝病毒顆粒。據信，本發明的重組C15/全長prM/全長E(如2/7E-D1，5/21-D1，2G11-D4和6E12-D4)或全長prM/全長E克隆構成VLPs。在人293細胞被表達，VLP樣抗原被分泌到培養液中，可以容易地分離抗原。
圖13A的Western印跡圖顯示的是由特異類型抗血清確定四種四價克隆體(2/7E，5/21，2G11，和6E12)和人293細胞中表達和分泌抗原。為了診斷，該抗原可用於斑點印跡測定法，ELISA，或測驗片ELA。從製備，儲存和處理方面考慮，斑點印跡測定法是有利的測定法。作為診斷工具的重組多價抗原的使用可以由實施例19中的斑點印跡測定法證明。每種重組多價多肽都被完全分泌，可以由四種特異性的抗登革病毒抗血清識別，這樣就可以用於檢測抵抗任意四種登革病毒血清型的血清抗體，該抗體得自動物，包括人的生物樣本。該診斷測定法有利地可以同時檢測機體血清樣本和抵抗所有四種血清型的抗體。
本發明進一步提供診斷或篩選組合物的方法，優選來自機體(如脊椎動物，如哺乳動物)的生物試樣，如血液或血清，來檢查是否存在或缺乏一種或多種病毒血清型的一種或多種抗黃病毒的抗體，包括一種或多種抵抗一種或多種與登革病毒相關的黃病毒或其變體的抗體，特別是抗登革病毒的抗體(包括，如抵抗一種或多種登革病毒或其變體的抗體)。在這方面，本發明提供診斷或篩選樣本中是否存在一種或多種與至少一種血清型的至少一種登革病毒結合的抗體(或在組合物中檢測是否存在一種或多種抗體)。該方法包括在一定條件下將樣本與本發明的多肽接觸，使得如果樣本包含與至少一種血清型登革病毒結合的抗體和與至少一種抗登革病毒抗體結合的抗體，該抗體結合到該多肽上形成混合物，將混合物與連接抗登革病毒抗體的親和分子接觸，從混合物中移除未結合的親和分子，檢測組合物中存在或不存在的親和分子。其中，親和分子的存在表明在樣本中存在結合到至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體。
另一方面，本發明提供一種診斷，檢測，鑑別，選擇，或篩選樣本中存在的連接或特異連接到(與之反應)至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的方法。一方面，這些方法包括在一定條件下將樣本與本發明的多肽接觸，如果樣本包含結合至少一種登革病毒的抗體，至少一種抗登革病毒的抗體結合到該多肽上來形成抗體-多肽複合物，並檢測抗體-多肽複合物的存在與否，其中，抗體-多肽複合物的存在可預示連接到登革病毒的抗體的存在。在一些這種方法中，該方法包括篩選，檢測，選擇或診斷樣本中是否存在抗體，該抗體特異性連接或特異性結合一種或多種血清型登革病毒。優選地，該樣本是生物樣本，優選由哺乳動物中獲得，該哺乳動物可疑和/或傾向於感染一種或多種登革病毒。任何的適宜的生物樣本(如果存在的話，其包括足夠的用於分析的抗體)都是可用的。代表性的和優選的，可以從哺乳動物，尤其是人中獲得血清並用於分析。可選擇的，抗體濃度高的組織，如淋巴組織，可被用來分析。
本發明也包括用於至少一種登革病毒抗體的免疫測定法，含使用本發明的多肽作為檢測樣本。上述的方法可以進一步修飾來構成任意適合的免疫測定，其實例已在上面描述。優選的免疫測定法包括斑點印跡法測定，ELISA測定(如競爭性ELISA測定)，和測驗片EIAs。在該方法的準備中，多肽結合(或聯合)到固體或半固體基質上，促進抗原-抗體複合物的形成。採用適宜於顯影的反應物可以方便抗原-抗體複合物的檢測，例如，在本文別處描述的ELISA和FACS測定中應用的染料。本發明也提供包含這些元件的組合物。例如，本發明提供包含至少一種連接到固體基質的至少一種本發明的多肽的組合物，和可選擇地包括使連接到多肽的抗體顯影的反應劑。
本發明也提供一種用於免疫測定法的試劑盒，包括結合到固態基質的本發明的多肽的組合物，結合適合在將基質與懷疑包含抗登革病毒抗體的生物樣本培養後來顯影抗原-抗體複合物的反應劑。
用於進行免疫測定來檢測樣本組合物中的一種或多種抗登革病毒的抗體適宜基質通過獲得無細胞培養液來提供，從用本發明的多核苷酸(包含核酸載體)轉化的細胞培養物中吸取。細胞至少部分地分泌多肽到細胞培養液中，使得被吸取的培養液(上清液)包括足夠用於免疫測定的量的多肽。值得注意的是，大約10μl的細胞上清液可作為敏感免疫測定的基質，其能測定對於複合血清型登革病毒的抗體的存在，更優選的，對於所有四種病毒血清型的抗體，優選的，得自哺乳動物(如，人)宿主的血清樣本。發明者考察了使用較大量的這種上清液(如約20μl，約50μl，約100μl或更多)，和用本發明的核酸(或核酸載體)轉染的細胞，以及用本發明的病毒載體感染的細胞的細胞溶解產物。上清液可與基質連用來完成EIAs(如，ELISA測定的ELISA平板或用於班點印跡測定的適宜薄膜)或直接應用於免疫沉澱作用，或其它直接測定的免疫組織化學的技術。可以按照本發明的多肽改進的類似技術可見美國專利US 5,939,254和本文引用的其它文獻。
本發明還包括檢測來自機體，如哺乳動物，的生物樣本是否存在抵抗黃病毒的抗體的方法，包含在一定條件下將至少一種本發明的多肽(或包含至少一種多肽和載體或固體基質的組合物)與得自機體的生物樣本接觸，使得生物學樣本中能夠結合黃病毒的抗體與該多肽結合，形成抗體-多肽複合物；通過檢測生物樣本中抗體-多肽複合物的存在，就可以指示出生物樣本(如，血液或血清)中抗體的存在。
兩種或多種本發明的多肽的集合或文庫也可用於診斷技術。可選擇的，本發明的多肽可加到其它分子集合中(如，多肽集合，如病毒抗原的集合)。包含兩種或多種本發明的多肽的文庫是本發明的一個特點。本發明的另外一個特點是本發明的多肽的文庫(如，本發明的多肽的片段的集合或本質相同的本發明的多肽的集合)。本發明的多肽可以被用於這些文庫中來實施診斷技術(如病毒感染和/或其它病症診斷的多重診斷技術)。例如，在伴隨發熱的致病體(或其它病症)中致病性抗原文庫，包含至少一種本發明的多肽，可用於哺乳動物，優選人的感染的診斷。以發生在樣本和庫中至少一種組分之間的可探測生物樣本反應的方式進行哺乳動物生物樣本與該文庫的反應，從而指示哺乳動物感染的類型。在用於診斷技術的診斷晶片(蛋白質晶片)中結合一種或多種本發明的多肽是本發明的一個特點。
另一方面，本發明提供通過遞歸序列重組(recursive sequencerecombination)(如，DNA改組和合適的篩選/選擇方法)獲得的多肽，其通過本發明的核酸序列(尤其是本發明的多種核苷酸序列和/或多種野生型黃病毒，優選登革病毒，抗原編碼序列)執行。例如，本發明提供通過遞歸序列重組方法得到的多肽，其包含選自SEQ ID NO169-174序列的至少一種的第一核酸和選自SEQ ID NO169-174和215-218的第二核酸，以產生重組或合成核酸文庫，篩選重組或合成核酸文庫來鑑別編碼重組多肽的優化核酸，該核酸編碼在機體中誘導對至少一種血清型的至少部分登革病毒的免疫反應的重組多肽，這種免疫反應與由第一核酸編碼的多肽，第二核酸編碼的多肽或其組合誘導的免疫反應相當或更大。特有地，選自第一群和第二群的多重核酸可用於核酸文庫的產生或製備。
在一些實施方案中，本發明提供一種重組或合成多肽，由如下方法製備，該方法包含(a)至少一種包含選自SEQ ID NO211-214的多核苷酸序列的第一核酸和至少一種第二核酸的組合，其中第一核酸和第二核酸在兩種或多種核酸上是不同的，以製備重組或合成核酸文庫；(b)選擇或篩選重組或合成核酸文庫來鑑別至少一種重組或合成核酸，該核酸編碼至少一種誘導機體產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答的重組或合成多肽，該免疫應答與由第一或第二核酸或其組合編碼的多肽誘導的對所述至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答類似或更大；和(c)表達至少一種重組或合成核酸以獲得重組或合成多肽。
在另一些實施方案中，本發明提供一種重組或合成多肽，由如下方法製備，該方法包含(a)至少一種選自包含SEQ ID NO211-214的多核苷酸序列的第一核酸和至少一種第二核酸的組合，其中第一核酸和第二核酸在兩種或多種核酸上是不同的，以製備重組或合成核酸文庫；(b)選擇或篩選重組或合成核酸文庫來鑑別至少一種重組或合成核酸，該核酸編碼至少一種誘導機體產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答的重組或合成多肽，該免疫應答與由至少第一核酸或至少第二核酸編碼的多肽誘導的對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答類似或更大；(c)合用包含選自SEQ ID NO211-214序列的第三核酸的重組或合成核酸，以製備第二個重組或合成核酸文庫；(d)選擇或篩選第二個重組或合成核酸文庫來鑑別至少一種進一步重組或合成核酸，該核酸編碼至少一種誘導機體產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答的進一步重組或合成多肽，該免疫應答與由至少第一核酸，至少第二核酸或至少第三種核酸或它們的任意組合編碼的多肽誘導的對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答類似或更大；和(e)表達至少一種進一步重組或合成的核酸以獲得進一步重組或合成的多肽。上述兩個實施方案中，一些這種重組或合成多肽在機體中誘導抵抗第一核酸編碼的多肽和抵抗第二核酸編碼的多肽的免疫應答。進一步的，上述兩個實施方案中，一些這種重組或合成的多肽在機體中誘導抵抗登革病毒-1，登革病毒-2，登革病毒-3，登革病毒-4血清型病毒的免疫應答，該免疫應答與由至少第一核酸編碼的多肽或由第二核酸編碼的多肽或由第三核酸編碼的多肽或它們的任意組合誘導的免疫應答類似或更大在另一些具體實例中，本發明提供一種重組或合成多肽，由如下方法製備，該方法包含(a)至少一種包含選自SEQ ID NO215-218的多核苷酸序列的第一核酸和至少一種第二核酸的組合，其中第一核酸和第二核酸在兩種或多種核酸是不同的，以製備重組或合成核酸文庫；(b)選擇或篩選重組或合成核酸文庫來鑑別至少一種重組或合成核酸，該核酸編碼至少一種誘導機體產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答的重組或合成多肽，該免疫應答與由至少由第一核酸或至少第二核酸或兩者編碼的多肽誘導的對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答類似或更大；和(c)表達至少一種重組或合成核酸以獲得至少一種重組或合成多肽。
更普遍的，除在所列舉的標準克隆化方法，如，Ausubel，Berger，和Sambrook中應用外，本發明的多核苷酸和其片段可作為任何不同的重組和遞歸序列重組反應的基質，來製備編碼具有所需性質的重組登革病毒抗原的其它多核苷酸或其片段。許多這類的反應的也是已知的，由發明者和他們的合作者所開發的。
許多用於分生或鑑別具有一種或多種所述性質的本發明的分子的不同生成方法是可獲得的並在本領域被描述的。這些操作可單獨使用，和/或聯合用於製備一種或多種核酸變異體或核酸組合以及被編碼的蛋白質變異體。個別地和全體地，這些操作提供有效的、廣泛的生成多種有用核酸和核酸組合(包括如，核酸文庫)的途經，這些核酸和核酸組合可用於如具有新的或改良性質的核酸，蛋白質，途經，細胞和/或有機體的加工或快速演變。在確保清楚地討論進行區別和分類，可以預期這些技術並不總是互相排斥的。實際上，各種方法可以單獨地或聯合地，並聯或串聯使用，來獲得不同序列的變異體。
本文所描述的任何產生多樣性的操作的結果可以是由一種或多種核酸的產生，這些核酸可以從具有或賦予期望特性的核酸，或編碼具有或賦予期望特性的蛋白質的核酸中選擇或篩選。在使用一種或多種本文的方法或本領域技術人員可以獲得的其它方法產生多樣性後，從任何製備的核酸選擇具有所需活性或性質的核酸，如能夠誘導，促進，增強或調整抵抗至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，或T細胞增殖和/或激活，細胞因子產生(如，(如產生白細胞介素-3和/或IFN-Y)，在機體中產生與至少一種血清型，優選兩種，三種，或四種血清型的黃病毒(如登革病毒)結合的抗體，和/或在機體中產生抵抗至少一種黃病毒(如登革病毒)和抵抗至少一種，兩種，三種或四種血清型黃病毒的中和抗體。例如，所需的性質可以是能夠在機體中誘導，促進，調整或增強中和抗體的產生，該中和抗體抵抗機體內至少一種登革病毒-1，登革病毒-2，登革病毒-3和登革病毒-4血清型的登革病毒。其包括鑑定能被檢測到的任何活性，例如，本領域的任意測定法的自動化或可自動的形式，如在本文中討論的和在下面實施例部分的實施方案中例舉的測定法。多種相關的(或甚至不相關)的性質可以在醫生慎重的判斷下連續或平行地評價。
對用於生成本文描述的編碼本發明的多肽的修飾核酸序列的各種產生多樣性操作的描述可以在以下的公開出版物及其引用的文獻中看到Soong，N.等(2000)″Molecμlar breeding of viruses″Nat Genet25(4)436-439；Stemmer，等(1999)″Molecμlar breeding of viruses for targeting and otherclinical properties″Tumor Targeting41-4；Ness等(1999)″DNA Shufflingof subgenomic sequences of subtilisin″Nature Biotechnology 17893-896；Chang等(1999)″Evolution of a cytokine using DNA family shuffling″NatureBiotechnology17793-797；Minshμll and Stemmer(1999)″Protein evolution bymolecμlar breeding″Current Opinion in Chemical Biology 3284-290；Christians等(1999)″Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylationusing DNA family shuffling″Nature Biotechnology17259-264；Crameri等(1998)″DNA shuffling of a family of genes from diverse species acceleratesdirectedevolution″Nature391288-291；Crameri等(1997)″Molecμlarevolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling，″NatureBiotechnology15436-438；Zhang等(1997)″Directed evolution of an effectivefucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944504-4509；Patten等(1997)″Applications of DNAShuffling to Pharmaceuticals and Vaccines″Current Opinion in Biotechnology8724-733；Crameri等(1996)″Construction and evolution of antibody-phagelibraries by DNA shuffling″Nature Medicine2100-103；Crameri等(1996)″Improved green fluorescent protein by molecμlar evolution using DNAshuffling″Nature Biotechnology14315-319；Gates等(1996)″Affinityselective isolation of ligands from peptide libraries throμgh display on a lacrepressor′headpiecedimer″Journal of Molecμlar Biology255373-386；Stemmer(1996)″Sexual PCR and AssemblyPCR″InThe Encyclopedia of MolecμlarBiolo.VCH Publishers，紐約.447-457；Crameri and Stemmer(1995)″Combinatorial mμltiple cassette mutagenesis creates all the permutations ofmutant and wildtypecassettes″BioTechniques18194-195；Stemmer等，(1995)″Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbersofoligodeoxy-ribonucleotides″Gene，16449-53；Stemmer(1995)″TheEvolution of MolecμlarComputation″Science2701510；Stemmer(1995)″Searching SequenceSpace″Bio/Technology13549-553；Stemmer(1994)″Rapid evolution of a protein in vivro by DNA shuffling″Nature370389-391；and Stemmer(1994)″DNA shuffling by random fragmentation and reassemblyin vivro recombination for molecμlar evolution.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751.
術語「改組」用於此來指不同序列之間的重組，一些實施方案中，改組也可包括經由同源重組或非同源重組的交換，例如經由cre/lox和/或flp/frt系統。改組以由多種不同形式執行，包括如體外和體內改組形式，計算機模擬改組形式，利用雙鏈或單鏈模板的改組形式，基於引物的改組形式，基於核酸片斷改組形式，和寡核苷酸介導的改組形式，所有這些形式都是基於不同序列之間的重組事件，其更詳細的描述或參考將在下文提到，以及其它類似的以重組為基礎的形式。
產生多樣性的突變方法包括，例如，定點突變(Ling等.(1997)″Approaches to DNA mutagenesisan overview″Anal Biochem.254(2)157-178；Dale等.(1996)″Oligonucleotide-directed random mutagenesis usingthe phosphorothioate method″Methods Mol.Biol.57369-374；Smith(1985)″invivro mutagenesis″Ann.Rev.Genet.19423-462；Botstein Shortle(1985)″Strategies and applications of in vivro mutagenesis″Science2291193-1201；Carter(1986)″Site-directed mutagenesis″Biochem.J.2371-7；和Kunkel(1987)″The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis″inNucleic Acids Molecμlar Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；採用包含尿嘧啶的模板的突變(Kunkel(1985)″Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypicselection″Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492；Kunkel等.(1987)″Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypicselection″Methods in Enzmol154，367-382；和Bass等.(1988)″Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities″Science242240-245)；寡核苷酸指導的突變(Methods inEnzymol.100468-500(1983)；Methods in Enzymol.154329-350(1987)；Zoller Smith(1982)″Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectorsanefficient and general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment″Nucleic Acids Res.106487-6500；Zoller Smith(1983)″Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors″Methods in Enzymol.100468-500；and Zoller Smith(1987)″Oligonucleotide-directed mutagenesisa simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template″Methods inEnzymol.154329-350)；磷硫醯修飾的DNA突變(Taylor等.(1985)″The useof phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA″Nucl.Acids Res.138749-8764；Taylor等.(1985)″The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA″Nucl.Acids Res.138765-8787(1985)；Nakamaye Eckstein(1986)″Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis″Nucl.Acids Res.149679-9698；Sayers等(1988)″Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis″Nucl.Acids Res.16791-802；和Sayers等.(1988)″Strandspecific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide″Nucl.Acids Res.16803-814)；採用缺口二聯體DNA的突變(Kramer等(1984)″The gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction″Nucl.Acids Res.129441-9456；Kramer Fritz(1987)Methods in Enzymol.″Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA″154350-367；Kramer等.(1988)″Improved enzymatic in vivro reactionsin the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction ofmutations″Nucl.Acids Res.167207；和Fritz等.(1988)″Oligonucleotide-directed construction of mutationsa gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vivro″Nucl.Acids Res.166987-6999)。
其它適宜的產生多樣性的方法包括點錯配修復(Kramer等(1984)″PointMismatch Repair″Cell38879-887)，利用修復缺陷的宿主菌株的突變(Carter等(1985)″Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis usingM13vectors″Nucl.Acids Res.134431-4443；和Carter(1987)″Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors″Methods in Enzvmol.154382-403)，缺失突變(Eghtedarzadeh Henikoff(1986)″Use ofoligonucleotides to generate large deletions″Nucl.Acids Res.145115)，限定-選擇和限定-純化(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation instabilizing the transition stateof subtilisin″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317415-423)，總基因合成突變(Nambiar等(1984)″Total synthesis and cloning ofa gene coding for the ribonuclease S protein″Science2231299-1301；Sakamarand Khorana(1988)″Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)″Nucl.Acids Res.146361-6372；Wells等(1985)″Cassette mutagenesisan efficientmethod for generation of mμltiple mutations at defined sites″Gene 34315-323；和Grundstrm等(1985)″Oligonucleotide-directed mutagenesls bymicroscale′shot-gun′gene synthesis″Nucl.Acids Res.133305-3316)，雙鏈斷裂修復(Mandecki(1986)″Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia colia method for site-specific mutagenesis″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181；和Arnold(1993)″Protein engineering forunusualenvironments″Current Opinion in Biotechnology4450-455).許多以上方法的其它詳細內容可以見Methods in EnzymologyVolume 154，其也記載了對各種突變方法中的故障檢查問題的有效控制。
另外的點突變技術的描述可見於，如，Edelman等，DNA，2，183(1983)，Zoller等，Nucl.Acids Res.，10，6487-5400(1982)，和Veira等，Meth.Enzymol.，153，3(1987))。其它有用的突變技術包括丙氨酸掃描，或隨機突變，例如，由易錯PCR誘導的重複隨機點突變，化學突變劑暴露，或在突變基因細胞中多核苷酸表達(見，如Bornscheueret等，Biotechnol.Bioeng，58，554-59(1998)，Cadwell和Joyce，PCR Methods Appl.，3(6)，S136-140(1994)，Kunkel等，Methods Enzymol.，204，125-39(1991).Low等，J.Mol.Biol.，260，359-68(1996)，Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.，64(2)，492-95(1998)，和Zhao等，Nat.Biotech.，16，258-61(1998)對於這些技術的討論)。適宜的用於PCR定點突變或類似技術的引物可以由在如Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765(1978)中描述的方法來製備。
其它適宜的促進序列多樣性的有用技術包括PCR突變技術(如被描述在如Kirsch等，Nucl.Acids Res.，26(7)，1848-50(1998)，Seraphin等，Nucl.Acidsres.，24(16)，3276-7(1996)，Caldwell等，PCR Methods Appl.，2(1)，28-33(1992)，Rice等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(12)，5467-71(1992)和U.S.5,512,463)，基於Wells等，Gene，34，315(1985)描述的方法的盒式誘變技術，噬菌粒展示技術(如描述在如Soumillion等，Appl.Biochem.Biotechnol.，47，175-89(1994)，O』Neil等，Curr.Opin.Struct.Biol.，5(4)，443-49(1995)，Dunn，Curr.Opin.Biotechnol.，7(5)，547-53(1996)，和Koivunen等，J.Nucl.Med.，40(5)，883-88(1999))，反向翻譯進化(見，如U.S.6,194,550)，飽和突變，見如U.S.6,171,820)，PCR合成改組(見如U.S.5,965,408)和遞歸總體突變(REM)(如被描述在，如Arkin和Yourvan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，7811-15(1992)和Delgrave等，Protein Eng.，6(3)，327-331(1993))。用於將多樣性導入同源序列文庫的技術也在US6.159,687和6,228,639中提供。
對各種產生多樣性的方法的進一步詳細描述可以在下面的美國專利，PCT公開和申請，歐洲公開文本中找到Stemmer等的US5,605,793(1997.2.25，)″Methods for in Vitro Recombination；″Stemmer等的US5,811,238(1998.9.22)，″Methods for Generating Polynucleotides havingDesired Characteristics by Iterative Selection and Recombination；″Stemmer等的U.S.5,830,721(1998.11.3)，″DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly；″Stemmer等的US5,834,252(1998.11.10)，″End-ComplementaryPolymerase Reation；」Minshμll等的US5,837,458(1998.11.17)，″Methods andVompositions for Cellμlar and Metabolic Engineering；″Stemmer和Crameri的WO95/22625，″Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；″Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，″End Compleplementary PolymeraseChain Reaction；″Stemmer和Crameri的WO97/20078，″Mothods for GeneratingPolynucleotides having Dedired Characteristics by Iterative Selection andRecombination；″Minshμll和Stemmer的WO97/35966，″Methods andCompositohs for Cellμlar and Metabolic Engieering；″Punnonen等的WO99/41402，″Antigen Library Immunization；″Punnonen等的WO99/41369，″Genetic Vaccine Vector Engineering；″Punnonen等的WO99/41368，″Optimization of Immunomodμlatory Properies of Genetic Vaccines；″Stemmer和Crameri的E.P.752008，″DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly；″Stemmer的E.P.0932670，″Evolving Cellμlar DNA Uptake byRecursive Sequence recombination；″Stemmer等的WO99/23107，″Modificationof Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling；″Apt等的WO99/21979，″Human Papillomavirus Vectors；″del Cardayre等的WO98/27230，″Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive SequenceRecombination；″Patten和Stemmer的WO98/27230，″Methods and Compositionsfor Polypeptide Engineering；″Stemmer等的WO98/27230，″Methods forOptimization of Gene Therqpy by Recursive Sequence Shuffling and Selection″，WO 00/00632，″Methods for Generating Highly Diverse Libraries″，WO00/09679，″Methods for Obtaining in vivro Recombined PolynucleotideSequence Banks and Resμlting Sequences″，Arnold等的WO98/42832，″Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random orDefined Primers″，Arnold等的WO 99/29902，″Method for CreatingPolynucleotide and Polypeptide Sequences″，Vind的WO 98/41653，″An invivro Method for Construction of a DNALibrary，″Borchert等的WO98/41622，″Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling，″和Pati和Zafling的WO 98/42727，″Sequence Alterations using HomologousRecombination″；Patten等的WO 00/18906，″Shuffling of Codon-AlteredGenes；″del Cardayre等的WO 00/04190，″Evolution of Whole Cells andOrganisms by Recursive Recombination″；Crameri等的WO 00/42 561，″Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination″；Selifonov和Stemmer的WO 00/42559，″Methods of Popμlating Data Structures for Use inEvolutionary Simμlations；″Selifonov等的WO 00/42560，″Methods fr MakingCharacter Strings，Polynucleotides Polypeptides Having DesiredCharacteristics；″Welch等的PCT/US00/26708，″Use of Codon-VariedOligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling；″和Affholter的PCT/US01/06775″Single-Stranded Nucleic Acid Template-MediatedRecombination and Nucleic Acid Fragment Isolation″.
幾種不同序列修飾方法的一般種類，包括突變，重組等，都可以用於本發明並且被列舉，如在上下文所引用的文獻中。下面將舉例說明本發明的用於產生多樣性的優選形式，包括，如一些基於多樣性產生形式的重組。
核酸可以用上面的參考文獻中所述的任何不同技術在體外重組，包括，如，DNA酶消化將被重組的核酸後，通過連接和/或PCR再組裝核酸。例如，可以採用性染色體的PCR突變，其中DNA分子的隨機(或假隨機，或甚至非隨機)片段體外重組，基於序列相似性，在具有不同但是相關DNA序列的DNA分子之間發生重組，接著在聚合酶鏈式反應中通過延伸將交換固定。這個過程和許多可變的過程可以參見上面所述的參考文獻，如Stemmer(1994)Proc.Natl.acad.USA9110741-10751。
類似的，核酸可以在體外遞歸地重組，如，通過允許在細胞的核酸之間發生重組。許多這樣的體外重組形式在上文標記的參考文獻中公開。這些形式任意地在感興趣的核酸之間的直接重組，或在包含在感興趣核酸的載體，病毒，質粒等之間的重組，和其它形式。這些方法的詳細內容可在上文標記的參考文獻中找到。還可以採用完整基因組重組方法，其中細胞或其它有機體的完整基因組發生重組，任意地，包含在基因組重組混合物中加入期望的文庫成分(如相應於本發明所述途徑的基因)。這些方法具有很多應用，包括用於鑑別未知的靶向基因。這些方法的詳細描述，可見於，如del Cardayre等的WO98/31837，″Evolution of Whole Cell and Organisms by RecursiveSequence Recombination；″和如del Cardayre等的PCT/US99/15972，其題目也是″Evolution of Whole Cell and Organisms by Recursive SequenceRecombination″。
還可以採用合成重組的方法，其中對應於目標靶點的寡核苷酸被合成和在PCR或連接反應中被再組裝，其包括相應於一種以上親本核酸的寡核苷酸，這樣就產生了新的重組核酸。寡核苷酸可以由標準的核苷酸加入法製備，或可由如三核苷酸途徑製備。這些途徑的詳細描述可在上文標記的參考文獻中找到，包括如Crameri等的WO00/42561，″Oligonucleotide mediated NucleicAcid Recombination；″Welch等的PCT/US00/26708，″Use of Codon-VariedOligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling；″Selifonov等的WO00/42560，″Methods for Making Character Strings，Polynucleotides andPolypeptides Having Desired Characteristics；″和Selifonov和Stemmer的WO0042559，″Methods of Popμlating Data Structures for Use in EvolutionarySimμlations.″計算機模擬重組方法是有效的，其中使用遺傳算法來計算相應於同源(或甚至非同源的)核酸的重組序列鏈。產生的重組序列鏈可以通過合成相應於重組序列的核酸轉化為核酸，如，與寡核苷酸合成/基因再組裝技術一起使用。這種途徑可以產生隨機的，部分隨機的或設計的變異體。許多關於計算機模擬(in silico)重組的詳細描述，包括在電腦系統中採用遺傳算法，基因操作及類似，與生成相應的核酸(和/或蛋白)組合，以及結合設計的核酸和/或蛋白(如以交換位點選擇為基礎)以及設計的，假隨機或隨機重組方法的描述可見於Selifonov等的WO 00/42560，″Methods for Making Character Strings，Polynucleotides and Polypeptides Having Desired Characteristics″和Selifonov和Stemmer的WO 00/42559″Methods of Popμlating Data Structures for Use inEvolutionary Simμlations″.對於計算機模擬重組方法的更加詳細描述可以在這些申請中找到。這些方法通常適用於本發明的核酸序列多肽序列。
許多評價自然多樣性方法可以被使用，如，通過不同核酸或核酸片段雜交到單鏈樣板，接著通過聚合和/或連接來再生全長序列，典型地，接著降解模板和回收生成的改進的核酸。在利用單鏈模板的方法中，由基因組文庫得到的片段總體用部分的或常常是相應於互補鏈的近似全長ssDNA或RNA來退火。從該總體中組裝複雜的嵌合基因，然後由核酸酶基礎去除非雜交片段末端來調節，然後通過聚合作用填充片段之間的缺口，接著進行單鏈連接。親本多核苷酸鏈可以通過消化(如，RNA或尿嘧啶包含物)，變性條件下的磁性分離(如，有助於分離的標記方法)和其它可選的分離/純化方法來去除。可選的，親本鏈可以任意的與嵌合鏈共同純化和在後來的篩選和加工過程中除去。其它關於此類方法的詳細描述可見於，由Affholter申請的PCT/US01/06775，″Single-Stranded Nucleic Acid Template-MediatedRecombination and Nucleic Acid FragmentIsolation″。
在另一種方法中，單鏈分子被轉化為雙鏈DNA(dsDNA)，dsDNA則由配基介導的方式結合到固體載體上。分離為結合的DNA之後，被選擇DNA分子從載體上釋放並被導入適宜的宿主細胞中來產生富含序列文庫，並該序列雜交到探針上。這種方法產生的文庫提供採用任何本文所描述的操作進一步多樣化所需的底物。
任意前述的常規重組形式可以反覆實行(如，一次或多次循環突變/重組或其它產生多樣性的方法，可選擇地接著採用一種或多種選擇方法)來產生更加多樣的重組核酸組。
採用多核苷酸連終止方法的突變已經被提出(見如，US 5,965,408，″Method of DNA reassembly by interrupting synthesis″to Short，和上述的參考文獻)，可以應用於本發明。在這種方法中，對應於一種或多種基因的具有序列相似的區域的雙鏈DNA可以被結合和變性，無論特異於基因的引物存在與否。然後單鏈多核苷酸復性，並在聚合酶和鏈終止劑(如，紫外線，γ或X射線照射；溴乙錠或其它插入分子；DNA結合蛋白，如單鏈結合蛋白，轉錄活化因子，或組蛋白；多環芳烴；三價鉻或三價鉻鹽；或快速熱循環介導的縮短聚合作用；及其類似物)的存在條件下培養，結果產生了部分雙鏈的分子。部分雙鏈的分子，如包含部分的伸展鏈然後在複製或部分複製的循環中變性和再復性，最終產生具有不同程度的序列相似性的和相對於開始的DNA分子變異的多核苷酸。任意的，該產物，或該產物的部分群體可以在過程中在一個或多個階段被擴增。如上所述，由以上鏈終止方法製備的多核苷酸，對於所述的任何重組形式都是適宜的底物。
多樣性可以由核酸或大量核酸產生，其使用的方法為被稱為「產生雜交酶增加截斷」(「ITCHY」)，見Ostermeier等(1999)″A combinatorial approachto hybrid enzymes independent of DNA Biotech 171205。這種途徑也可用於產生變異體的起始文庫，其可任意的作為一種或多種種體外或體內重組方法的底物。見，Ostermeier等(1999)″Combinatorial Protein Engineering byIncremental Truncation″Proc.Acad.Sci.USA，963562-67；Ostermeier等(1999)，″Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering ofNovelBiocatalysts，″Biological and Medicinal Chemistry，72139-44。
導致單個核苷酸或連續或非連續核苷酸組發生改變的突變方法，可有利地用於誘導核苷酸變異。許多突變的方法可以在上述引用的參考文獻中找到；下面是關於突變方法的其它詳細描述，這些方法也是可以用於本發明。例如，易錯聚合酶鏈式反應可以產生核酸變異體。使用該技術，PCR是在DNA聚合酶的複製忠實性低的情況下進行，這樣就在PCR產物的全長上都獲得了高几率的點突變。這些技術可參見上面的參考文獻和，如Leung等(1989)Technique 111-15和Caldwell等(1992)PCR Methods Applic.228-33。類似的，裝配PCR可以應用於包括由小DNA片段的混合物的發生的PCR產物的裝配的過程。大量不同的PCR反應可以在相同的反應混合物中同時發生，一個反應的產物會啟動另一個反應的生產。
寡核苷酸定向突變可以用於在目標核酸序列上誘導點特異突變。這些技術的實例可見於上述參考文件，如Reidhaar-Olson等(1988)Science，24153-57。盒式誘變可用於以不同於自然序列的合成寡核苷酸表達盒置換雙鏈DNA分子的小區域的過程。寡核苷酸可包括，如完全和/或部分的隨機自然序列。
遞歸總體突變作用是一個在其中蛋白質變異算法被用於產生表型相關變體的不同群體的過程，該群體成員的胺基酸序列不同。該方法採用反饋機制來監控重組盒式誘變的連續循環。該方法的例子可見Arkin Youvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815。指數總體突變作用可用於產生包含具有高比例特異和功能變異的組合文庫。所關心序列中的小組殘基可隨機地同時在各個改變後的位置鑑別產生功能性蛋白質的胺基酸。這些過程的例子可見Delegrave Youvan(1993)Biotechnology Research 111548-1552。
體內突變作用可用於通過DNA增殖在任意被克隆的目標DNA中產生隨機突變，如，在具有一種或多種DNA修復途徑突變的大腸桿菌中。「突變子」(「mutator」)菌株比野生親本菌株具有更高的隨機突變率。在這些菌株中增殖DNA將最終會在DNA內產生隨機突變。這些技術在上述的參考文獻中都有描述。可選的，體內重組技術可以被應用。例如，多種共享部分序列相似性的單體多聚核苷酸的多樣性可以被轉化到宿主中，並通過宿主細胞體內重組。細胞分裂的後續循環也可用於產生文庫，其成員包括單一的同源群體，或單體多核苷酸的集合。可選擇的，單體核酸可以通過標準技術回收，如，PCR和/或克隆，和以任意重組形式被重組，包括上述的遞歸重組形式。其它可用於體內重組和序列變異的技術可見US5,756,316。
產生多物種表達文庫的方法已經有描述(除了上面指出的參考文獻外，參見如，Peterson等.(1998)US5,783,431″METHODS FOR GENERATINGAND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS″和Thompson等(1998)U.S.5,824,485 METHODS FOR GENERATING AND SCREENINGNOVEL METABOLIC PATHWAYS)，以及它們用於鑑別蛋白質活性的用途也被提出(除上述參考文獻外，見Short(1999)U.S.5,958,672″PROTEINACTIVITY SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROMUNCMLTIVATED MICROORGANISMS″)。多物種表達文庫包括，一般而言，包含大量來自物種或菌株的cDNA或基因組序列的文庫，這些序列在表達盒中被可操作地連接到適當的調節序列上。cDNA或基因組序列可任意地被隨機地連接來進一步增強多樣性。該載體可以是適合在多種宿主生物體中轉化和表達的穿梭載體，如細菌，真核細胞。在一些例子中，該文庫偏向於預先選擇編碼目標蛋白質或雜交到目標核酸的序列。任何這種文庫可以作為底物用於任意如上所述的方法中。
本發明所述的多核苷酸序列可以通過標準技術進行加工來產生其它修飾，例如插入新的限制性位點，改變糖基化模式，改變pegylation模式，基於宿主細胞密碼子優化的序列修飾，導入重組酶位點和和導入剪接位點。
在一些應用中，在多樣化之前，期望預選或預先篩選文庫(如，擴增文庫，基因組文庫，互補DNA文庫，標準化文庫等)或底物核酸，如，通過基於重組的突變操作，或將底物偏移到編碼功能性產物的核酸。該文庫也可以偏向於具有特定特性的核酸，如與被選擇的核酸探針雜交。
生成核酸和多肽的「非隨機(Non-Stochastic)」方法也稱為「非隨機(Non-Stochastic)產生遺傳疫苗和酶」WO 00/46344。這類方法，包括被提出的非隨機(Non-Stochastic)多核苷酸再組裝和位點飽和突變方法，也可以用於本發明。利用混合或簡併寡核苷酸隨機或半隨機突變法也被描述在，如Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets ofamino acids for semi-random mutagenesis″Biotechnology 10297-300；Reidhaar-Olson等(1991)″Random mutagenesis of protein sequences usingoligonucleotide cassettes″Methods Enzymol.208564-86；Lim和Sauer(1991)″The role of internal packing interactions in determining the structure andstability of a protein″.Mol.Biol.219359-76；Breyer和Sauer(1989)″Mutational analysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 5IF to lambda repressor″J.Biol.Chem.26413355-60)；和″Walk-ThroμghMutagenesis″(U.S.5,830,650和5,798,208，和歐洲專利EP0 527 809).
容易理解地，任何上述的適合於在多樣化之前豐富文庫的方法也能用於篩選由產生多樣性的方法製備產物，或產物的文庫。
用於突變，文庫構建和其它產生多樣性的方法的試劑盒也是商業上可獲得的。例如，試劑盒可以來自Stratagene(如QuickChangeTM定位突變試劑盒；和ChameleonTM雙鏈，定位突變試劑盒)，Bio/Can Scientific，Bio-Rad(使用上述的Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.，Clonetech Laboratories，DNA Technologies，Epicentre Technologies(如5引物3引物試劑盒)，GenpakInc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs，Pharmacia Biotech，Promega Corp.，Quantum Biotechnologies，AmershamInternational plc(如，使用上述的Eckstein法)，和Anglian Biotechnology Ltd(如使用上述的Carter/Winter)。
上述參考文獻提供了許多突變形式，包括重組，遞歸重組，遞歸突變和組合或具有其它突變形式的重組，以及這些形式的改進。無論採用任何產生多樣性的形式，本發明的核酸可以被重組(互相，或與相關(或甚至無關)的序列)來產生重組核酸的不同組合，包括，如同源核酸組合，以及相應的多肽。
重組核酸可由本發明的一種或多種多種多聚核酸序列和一種或多種其它核酸來製備，單獨地或聯合使用上述的形式，構成本發明的一部分。一種或多種其它核酸可以包括本發明的其它多核苷酸；任意地，可選擇地或另外地，一種或多種另外的核酸可包括，如編碼自然存在的登革病毒prM的核酸和/或E蛋白的編碼序列，其它黃病毒的prM和/或E序列，或，如其它的同源或非同源核酸或其片斷(上述的特定重組形式，特別是那些合成地或計算機模擬地完成的，不需要具有有效重組的同源性)可望地，得自上述重組方法的重組多肽是功能性嵌合多肽。例如，上述方法之一製備的多肽常常和可望用於在機體中誘導抵抗第一核酸編碼的多肽和抵抗由第二核酸編碼的多肽的免疫反應。由於多種，優選至少三種，或更優選的為至少四種或多種的核酸被用於本發明的遞歸序列重組技術，從重組反應的核酸產物獲得的多肽一般包含兩種或更不同於親本序列編碼的多肽的多肽片段或肽部分。每個這樣的肽片段和肽部分是一種或多種的連續胺基酸的胺基酸序列，一般地，長度至少10個，15個，20個或至少30個或更多個胺基酸。這些肽片段或肽部分，可以由序列分析技術鑑別。具有這些序列變異(或複合的嵌合物)的本發明的肽的例子將在以下的實施方案部分描述。這類相對於親本序列編碼的特殊肽的獨特肽片段或肽部分可以通過肽片段或片斷相互分離開，分別相應於其它親本核酸編碼的肽。親本的肽片段或片斷可以是任意適宜的大小。典型地，一個親本肽片段或片斷，其長度包含至少10，至少15，至少20和至少大約30或更多個胺基酸。多種肽片斷或肽部分應當包含存在於由親本核酸編碼的肽中的表位。這一方面，由本發明的核苷酸序列表達的重組多肽應當包含至少大約一，二，或更多T細胞表位和/或在至少一種，優選每一種的親本核酸編碼的多肽中存在的抗原序列。當然，重組也能導致不在任何的親本核酸序列中出現的新的編碼序列，這樣的話，產生在任何的親本核酸序列中被存在的新表位。
由以上所述的重組，突變和標準核苷酸合成技術製備的多核苷酸可以用於篩選適宜的特性，例如，具有本發明的新登革病毒抗原的任何想要性質的重組多肽的表達，將在別處詳細討論。由這些技術製備和具有這些特性的多肽是本發明的一個重要特點。例如，本發明提供一種由重組多核苷酸編碼的重組多肽，該多核苷酸是由任何本發明的核酸序列通過遞歸序列重組製備的，該核酸序列誘導機體對於至少一種，兩種，三種或優選四種病毒血清型的至少一種或多種登革病毒的免疫應答。優選的，該由這種多肽的服用或表達誘導的機體的免疫應答是和由第一核酸編碼的多肽，第二核酸編碼的多肽，或它們的組合誘導的免疫基本相當或更強。
本發明的多肽可以包含任意適宜數量的非登革病毒抗原肽片段。相應的，本發明的多核苷酸可以包含任意適宜數量的編碼這類非登革病毒抗原肽片段的核酸片段。這些肽片段典型的連接到本發明的多肽的C或N末端，正如所希望的，形成融合蛋白。這類融合蛋白是本發明的一個重要特點。一般地，本發明提供一種具有任何上述本發明特徵的多肽，進一步包含異源的融合配體(非登革抗原編碼的肽片段或肽部分)，顯示至少一種生物學活性，可以從機體內剩餘的多肽中獨立地找到。數量眾多的異源融合配體可以加入到除本發明上述的免疫抗原胺基酸序列(和任意的信號序列)之外的多肽上。
特別有用的融合配體是方便多肽純化的肽片段或肽部分(「多肽純化次序列」)。適宜的多肽純化次序列也是本領域已知的。這類融合配合體的例子包括多組氨酸序列，允許在固化材料上純化的組氨酸-色氨酸模塊，例如六組氨酸肽。編碼這種標記的序列被加入到pQE載體，其來自QIAGEN，Inc.(Chatsworth，California)，連接穀胱甘肽的序列(如，穀胱甘肽-S-轉移酶(GST))，血凝素(HA)標記(相應的，得自流行性感冒血凝素蛋白；Wilson，I.等(1984)Cell 37767)，麥芽糖結合蛋白序列，可用於FLAG擴展/親和純化法體系(Immunex Corp，Seattle，WA)的FLAG表位—商業上可獲得的FLAG表位還可以從Kodak獲得(New Haven，Connecticut)，硫氧還蛋白(TRX)，卵白素，及類似物。純化域和免疫抗原胺基酸序列或免疫抗原胺基酸序列/多肽的信號序列部分之間的可蛋白酶裂解的多肽連接序列的內含物可用於方便融合蛋白的免疫抗原片段的純化。組氨酸殘基便於在IMIAC(固定化金屬離子親和層析，見Porath等(1992)Protein Expression and Purification 3263-281)純化，而腸激酶切位點提供一種從融合蛋白中分離多肽的方法。PGEX載體(Promega；Madison，WI)也可方便表達作為具有穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。這些序列的其它例子和用於蛋白純化可見於，如國際專利申請WO 00/15823。多肽表達後和由這些融合配體或其它(如上所述)分離後，可以利用蛋白質重摺疊步驟，正如所希望的那樣，完成成熟多肽的構型。
本發明的融合蛋白也可包括一種或多種促進融合蛋白檢測的其它肽片段或肽部分。例如，報導肽片段或肽部分(如，綠色螢光蛋白(GFP)，半乳糖苷酶或其可檢測的結構域)可被結合到融合蛋白中，可以被結合到本發明的多肽的其它標記分子包括放射性核素，酶，螢光團，小分子配基，及類似物。
本發明的多肽可進一步由至少一種修飾胺基酸的內含物修飾。一種或多種修飾胺基酸的內含物可以是有益地，例如，(a)增加多肽的血清半衰期，(b)減少多肽抗原性，或(c)增強多肽的保存穩定性。胺基酸被修飾是，例如，在重組產物的翻譯過程中或翻譯後(如，在哺乳動物細胞中表達中的N-X-S/T基序的N-聯糖基化作用)或由合成方法修飾。修飾胺基酸的非限制例子包括糖基化胺基酸，硫酸化胺基酸，異戊二烯化(prenlyated)(如法尼基化，香葉基香葉基化(geranylgeranylated))胺基酸，乙醯化胺基酸，醯化胺基酸，PEG化胺基酸，生物素醯化胺基酸，羧酸化胺基酸，磷酸化胺基酸，及其類似物。足以指導本領域技術人員進行胺基酸修飾的參考文獻充分貫穿於本文始終。其實例可見於Walker(1998)PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM HumanaPress，Towata，NJ。優選的，修飾的胺基酸選白糖基化胺基酸，PEG化胺基酸，法尼基化胺基酸，乙醯化胺基酸，生物素醯化胺基酸，胺基酸/連接到油脂成分，和連接到有機衍生劑的胺基酸。
本發明的另一個特點是包含上述免疫原性胺基酸序列的多肽，並進一步包含定向序列，其與信號序列不同。例如，多肽可以包含定向到特異細胞種類上的受體的序列(如，單核細胞，樹突細胞，或相關細胞)，以使多肽的定向傳送到細胞和/或相關的組織。信號序列在上面被描述，包括膜定位/錨序列(如，翻譯停止序列，糖基磷脂醯肌醇錨序列)和類似物。
另一方面，多肽可包含促進多肽穩定、多肽分泌(不是通過信號指引)或兩者的融合配偶體。例如，多肽可包含免疫球蛋白(Ig)域，如含有Fc鏈，CH2域，和CH3域的IgG多肽，可促進多肽的穩定性和/或分泌。
本發明的融合蛋白進一步包含另外的免疫胺基酸序列。例如，融合蛋白可包含與黃病毒衣殼蛋白，優選登革病毒衣殼蛋白(如，DEN-2或DEN-4)的序列片段或部分實質同源的(如，至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)胺基酸，其長度最少為大約20個胺基酸。例如，多肽可包含本發明的免疫胺基酸序列的融合蛋白和黃熱病病毒或腺病毒被膜，衣殼或其它蛋白。可選擇的或另外的，本發明的多肽(或編碼本發明的多肽的多核苷酸)可和一種或多種登革病毒衣殼蛋白，或該蛋白的片斷或部分合用，例如包含T細胞表位的登革病毒殼體的片段或部分(這些表位的例子是本領域已知的，(見，如Gagnon等J Virol，70(1)141-147(1996))，或一種或多種編碼多肽或肽的核酸。多肽也或可選擇的包含或與一種或多種登革病毒非結構蛋白或一種或多種編碼蛋白或本質同源的肽(如，具有至少75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少90％，91％，92％，93％，或94％，更優選至少約95％(如，約87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的核酸。例如，添加非結構蛋白(如，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和/或NS5)可以增加T細胞反應，如果其包括一種或多種其它的T細胞表位。本發明包括與WT NS登革病毒蛋白具有至少約80％，85％，90％或更高的序列同一性的多肽以及這種多肽的如本文描述的用途。聯合傳送包括非結構蛋白B細胞和/或T細胞表位(其可在N1(和相關的NS-1或NS1)，N3(NS-3或NS3)，或N5(NS-5或NS5)中見到，如Mathew等J Clin Invest，98(7)1684-1692(1996)，Okamoto等JGen Virol79697-704(1998)，Green等，Virology 234(2)383-386(1997)，and Garcia等Am JTrop Med Hyg 56(4)466-70(1997))，或共同表達編碼這種多肽的序列，可以改進多價免疫應答反應，該免疫反應由在機體內，如哺乳動物中傳送和/或表達重組多肽來誘導。
融合蛋白的肽片斷或肽部分可以任意適宜方式結合。典型地和優選地，第一和第二肽片段或部分是共價結合的(如，通過肽鍵和雙硫鍵)。肽片段或部分可直接融合(如，免疫胺基酸序列的羧酸端可融合到純化序列或異源免疫原性序列的氨基端)。融合蛋白可以包含適宜數量的修飾鍵，如，肽部分中或之間的電子等排體。可選擇的，融合蛋白可以包括肽片段或部分之間的肽接頭，該片段或部分包括一種或多種未形成生物活性肽部分的胺基酸序列。任意適宜的肽接頭都是可用的。接頭可以是任意適宜的大小。典型地，該接頭是少於大約30個的胺基酸殘基，優選少於約20個胺基酸殘基，更優選的是約10個或少於10個胺基酸殘基。典型地，該接頭主要包含或包括中性胺基酸殘基。適宜的接頭的一般描述可見於，如US5,990,275，6,010,883，6,197,946，和歐洲專利申請EP0 035 384。如果肽片段或肽部分的分離是可行的，促進分離的接頭也是可用的。這類接頭的例子可見於US4,719,326。包含甘氨酸和/或絲氨酸殘基的「柔韌」(″Flexible″)接頭也是有益的。這類接頭的例子可見於，如McCafferty等，Nature，348，552-554(1990)，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883(1988)，Glockshuber等，Biochemistry，29，1362-1367(1990)，and Cheadle等，Molecμlar Immunol.，29，21-30(1992)，Huston etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883(1988)，Bird等，Science，242，423-26(1988)，和U.S.5,672,683，6,165,476，和6,132,992.
接頭的使用可以減少不需要的對於由兩種肽片段或肽部分形成的融合蛋白的免疫應答，這樣可以導致在融合蛋白中意外地出現了MHC I和/或MHC II表位。除了使用接頭外，鑑別不需要表位序列或鄰近序列可以PEG化(例如，由賴氨酸殘基插入來促進PEG連接)來保護鑑別表位不被暴露。其它用於降低本發明的融合蛋白的免疫原性的技術可以在融合蛋白給藥時一併使用，包括US6,093,699中的技術。
本發明的重組多肽希望不含無關的表位(即非登革病毒相關表位)或表位的結合點。這些技術也可以用於防止無關表位或表位結合點的出現。分析表位的技術將在實施例部分進一步提供，可以用於有利地設計不具有此類無關和/或不希望表位的重組抗原。
本發明的多肽片段在促進機體對於登革病毒的免疫應答中也是有用的。本發明提供這些片段和使用的方法。例如，本發明提供一種長度為至少75個胺基酸的多肽片段，其與野生型衣殼蛋白或野生型的DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4的prM/E蛋白是不同的，該片段誘導機體產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答。在機體給藥和適當表達的時候，特異的多肽片段誘導對於多重血清型(如兩種，三種或所有已知的四種)的一種或多種登革病毒的免疫應答，包括對於兩種，三種或四種血清型每種中的一種或多種登革病毒的中和抗體反應，優選誘導對於兩種，三種或四種血清型每種中的一種或多種登革病毒的保護性免疫應答。
除編碼和表達本發明的重組免疫多肽外，核酸也對於表達的有義(sense)和反義抑制(如控制組織中的表達水平偏離被施用的核酸或載體的期望表達水平)也是有用的。多種有義(sense)和反義抑制是本領域已知的，見，如Lichtenstein Nellen(1997)ANTISENSE TECHNOLOGYA PRACTICALAPPROACH IRL Press at Oxford University，Oxford，England，Agrawal(1996)ANTISENSE THERAPEUTICS Humana Press，NJ，以及其中引用的文獻。
本發明進一步提供包含作為實質互補序列(也就是，包含補充至少約90％，優選至少約95％的序列)核酸序列的核酸，更優選的是任意的上述核酸序列的互補序列。這些補充的核酸序列可用於探針，製備本發明核酸序列，和作為反義核酸雜交到本發明的核酸。短的寡聚核酸序列包含互補核酸的序列，如，約15，20，30或50個基質(優選至少約12個基質)，在高度嚴格的條件下雜交到本發明所述的核酸的可作為探針(如，檢測在特異細胞或組織中是否存在本發明的核酸和/或方便本發明的核酸的純化)。包含互補序列的多核苷酸可作為引物來擴增本發明的核酸。
本發明進一步提供包含編碼選自SEQ ID NOS1-49和153-155的多肽的獨特次序列的序列的本發明的核酸的片段，這些獨特序列相對於SEQ IDNOS338-341任何之一而言。也提供包含編碼選自SEQ ID NOS65-166的多肽的獨特次序列的序列的本發明的核酸的片段，這些獨特序列相對於SEQID NO149-152而言。同時提供包含編碼選自SEQ ID NO139-148，236-253，343，345多肽的獨特次序列的序列的本發明的核酸的片段，這些獨特序列相對於SEQ ID NO227-230而言。
本發明同時提供包含至少約300個核酸的獨特序列的本發明的核酸的片段，優選至少約400個，更優選至少約600個，希望的是至少約900個，更優選的是至少約1200個來自選自任何SEQ ID NO285-330序列的核酸，作為比較的是選自SEQ ID NO338-341的野生型病毒tE多肽編碼序列和類似的已知登革病毒截斷E多肽編碼核酸序列，包含在GenBank中可獲得的序列，更優選的是，與任意已知的野生型黃病毒截斷E多肽編碼核酸序列比較。給藥時，這些片斷誘導機體產生抵抗至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，其中可以用於在機體和其細胞中誘導抵抗至少一種登革病毒的免疫應答的方法(如，對抗至少一種登革病毒血清型的中和Ab反應)。
另一方面，本發明提供包含至少約300個核酸的單一序列的核酸片段，優選至少約400個，更優選至少約600個，希望的是至少約900個，更優選的是至少約1200個選自SEQ ID NO156-200和235序列的核酸，作為比較的是選自SEQ ID NO149-152的野生型登革病毒PRM15/tE-多肽編碼序列和類似的已知登革病毒PRM15/tE多肽編碼核酸序列，包含在GenBank中可獲得的，更優選的是，與任意已知的野生型黃病毒PRM15/tE-多肽編碼序列比較。給藥時，這些片斷誘導機體產生抵抗至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，其中可以用於在機體或機體細胞群體中誘導抵抗至少一種登革病毒d的免疫應答的方法(如，抵抗至少一種登革病毒血清型的中和Ab反應)。
另一方面，本發明提供一種包含至少約300個核酸的核酸單一序列的片斷，優選至少約400個，更優選至少約600個，希望的是至少約900個，和更希望的是約1200個選自SEQ 1D NO201-210，211-218，254-271，342，和344任何之一的核苷酸，作為比較的是，選自SEQ ID NO227-230的任何之一的非密碼子優化WT C15/全長prM/全長E-多肽編碼序列和已知的登革病毒C15/全長prM/全長E序列多肽編碼的核酸序列，包括在GenBank中可以獲得的，和更加優選與任何已知的野生型黃病毒C15/全長prM/全長E-多肽編碼序列比較。這些片斷在機體或其細胞群體中誘導對於至少一種血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，並且可用於其中包括在該機體或細胞誘導產生對於至少一種血清型的至少一種登革病毒免疫應答的方法(如抵抗一種或多種血清型的中和Ab反應)。
本發明也提供一種選擇性結合到至少一種SEQ ID NO285-330的核酸或其互補序列。作為比較的是，選自SEQ ID NO338-341野生型的登革病毒tE多肽編碼序列和已知的登革病毒截斷E多肽編碼核酸序列，包括在GenBank中可以獲得的，更優選的，作為比較的是，任意已知的野生型黃病毒截斷E多肽編碼核酸序列，或其互補序列，用於應用。
本發明也提供選擇性結合到至少一種SEQ ID NO156-200，211-214，和235，或其互補序列的核酸，作為比較的是，野生型的選自SEQ ID NO149-152的登革病毒PRM15/tE多肽編碼序列或相似的已知登革病毒PRM15/tE多肽編碼序列，包含在GenBnak中可獲得的，更優選的，作為比較的是，已知的野生型的黃病毒PRM15/tE多肽編碼核酸序列，或其互補序列可以應用。
本發明進一步包含選擇性雜交到至少一種SEQ ID NO201-210，215-218，254-271，342，和344的核酸，或其互補序列，作為比較的是選自SEQ ID NO227-230的無密碼子優化野生型登革病毒C15/全長prM/全長E-多肽編碼序列和已知登革病毒C15/全長prM/全長E多肽編碼核酸序列，包括GenBank中可後代的，更優選的，作為比較的是任何已知的野生型黃病毒C15/全長prM/全長E多肽編碼的核酸序列。
本發明進一步提供由裂解本發明的核酸獲得的組合物和/或核酸，該核酸可以由機械的，化學的，或酶學的裂解方法來分裂。核酸的分裂技術是本領域已知的。酶學裂解方法的分裂，優選核酸內切酶，核酸外切酶，核糖核酸酶，或DNA酶(如，benzon核酸酶，如Benzonase_)消化核酸。組合物也包括由上述技術完成的多種核酸的分裂產物。
本發明能夠進一步提供通過一種方法製備的組合物和/或核酸，該方法包括在三磷酸核酸(NTPs，優選dNTPs)和核酸聚合酶存在時培養本發明的核酸。典型的和優選的，該聚合酶是熱穩定的聚合酶，如Taq聚合酶。
另一方面，本發明提供不同的本發明的核酸文庫或集合和/或包含至少一種本發明的核酸的核酸文庫。例如，本發明提供包含至少一種與至少一種選自SEQ ID NO156-218，235，254-271，285-330，342，and 344的多核苷酸序列本質同源(如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％，或94％，更優選至少大約95％(如約87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)的核酸的核酸文庫另一方面，本發明也提供不相同的核酸文庫，該核酸與至少一種選自選自SEQ ID NO156-218，235，254-271，285-330，342，和344的序列具有實質的同一性(如，至少大約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少大約90％，91％，92％，93％，或94％，更優選至少大約95％(如至少大約87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)。例如，在任何情況下，該文庫都是由前面所述的遞歸序列重組序列獲得的文庫。
因此，例如，本發明提供一種包含通過一種方法獲得的核酸文庫的組合物，該方法包含重組至少包含選自SEQ ID NO211-214和/或215-218序列的第一核酸和至少第二核酸，其中第一核酸和第二核酸在兩個或更多核酸中互不相同，來製備重組的或合成的核酸的文庫。本發明也提供採用本發明的任意核酸通過類似重組反應來製備的核酸。
本發明也提供包含將至少一種本發明的核酸序列通過遞歸序列重組到至少一種其它核酸上的重組方法。不管該基因文庫或基因集合是如何製備的，該基因文庫或集合可以包含任何適當數量的核酸種類。例如，該文庫可以包含至少大約2，5，10，50或更多本發明的不相同的核酸。該文庫可以被插入一種或多種細胞中，如，通過文庫轉染技術。這樣的一種細胞群體也被包括。
本發明也提供一種包含該文庫的組合物。例如，如上面所述的核酸文庫可用於基因表達的診斷(如，通過本領域熟知的「基因晶片」技術)。該文庫可以進行表達，雜交，或其它任何用於任何適宜的診斷目的的檢驗的形式。
本發明也提供一種製備修飾核酸的方法，包括突變本發明的核酸(如，選自SEQ ID NO156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸)。本發明進一步提供一種使用該方法製備的修飾核酸。突變本發明的核酸的方法將在別處描述。
本發明的多核苷酸可以用適體的形式(被描述在如，Famμlok andMayer-http//www.chemie.uni-bonn.de/oc/ak-fa/publications/CTMI-paper.pdf)，能夠與適合的靶點結合。本發明的核酸也可用於形成三聯的抑制核酸。該核酸也可連接到DNA結合功能域上，使不期望的基因的表達沉默(如，作為基因誘餌)。
本發明同時提供本發明的多肽的蛋白質模擬物。肽模擬物的描述可見，如US5,668,110和其引用的參考文獻。此外，融合蛋白可以通過在融合蛋白的一個或多個胺基酸的側鏈添加保護基來進行修飾。這些保護基可以促進融合肽傳送通過膜，如果需要或通過特定組織，例如，通過降低肽的親水性和增加肽的親脂性。適宜的保護基例子包括酯保護基，胺保護基，醯基保護基和羧酸保護基，都是本領域已知的(見，如US6,121,236)。本發明的合成溶解蛋白可以採用任何形式。例如，融合蛋白可以從其天然構象進行結構修飾來形成環肽或其它結構修飾肽。本發明的多肽也可被連接到一種或多種非蛋白質高分子材料上，典型的是親水性合成高分子，如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧乙烯，這被描述在如US4,179,337，4,301,144，4,496,689，4,640,835，4,670,417，和4,791,192，或類似的高分子材料，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如上面討論的，多肽可以經過常規蛋白質修飾，例如羧化作用，糖基化作用，羥化作用，油脂或油脂衍生化，甲基化作用，十四烷基化，磷酸化作用和硫酸化。其它翻譯後修飾包括乙醯化作用，醯化作用，ADP-核糖基化作用，黃素共價結合，亞鐵血紅素共價結合，核酸或衍生物共價結合，磷脂醯肌醇共價結合，交聯，成環作用，二硫鍵形成作用，脫甲基作用，甲醯化作用，糖基磷脂醯肌醇錨，碘化作用，氧化作用，蛋白酶解加工，異戊烯化，消旋作用，硒化，精胺醯化，和遍在蛋白化作用。其它常見的蛋白質修飾可見於，如，Creighton，Seifteretal.(1990)MethEnzymol 18626-646，和Rattan等(1992)Ann NY Acad Sci 66348-62。這類修飾通常是本發明的重組多肽(可選擇的，這些修飾可以綜合地實行)翻譯後修飾的結果。從宿主細胞中的核酸表達的多肽的翻譯後修飾根據表達多肽的宿主或宿主細胞類型而變化。例如，與哺乳動物細胞系統相比，糖基化作用在細菌如大腸桿菌通常不發生，而在杆狀病毒體系中顯著變化。相應的，如果需要糖基化作用，多肽應當在糖基化宿主中表達(產生)，一般為真核細胞(如哺乳動物細胞或昆蟲細胞)。另外的和特別優選的蛋白質修飾將在別處討論。多肽的修飾可以由任何適宜技術來驗證，包括，如X射線衍射，磁共振成像，質譜法，和/或色譜儀(如，反相色譜法，親和色譜法，或氣-液色譜法)。
多肽也可含有或選擇性含有適宜量的非天然胺基酸(如P胺基酸)和/或可選擇胺基酸(如硒代半胱氨酸)，或胺基酸類似物，如列於Manual of PatentExamining Procedure 2422(7th Revision-2000)上的物質，其可通過蛋白合成被結合，如固相蛋白合成(如，Merrifield(1969)Adv Enzvmol 32221-296和其它文獻)。
近年來，包括蛋白酶傳染因子決定域的融合蛋白的製備方法也被用於製備可非孟德爾式遺傳到後代細胞的蛋白質載體(見如，Li等，J.Mol.Biol.，301(3)，567-73(2000))。在包含免疫抗原胺基酸序列的融合蛋白中包含這種蛋白酶傳染因子決定序列，理想地提供了包含不需要改變宿主基因組的融合蛋白的可遺傳蛋白載體。
本發明同時提供包含長度至少為約45個胺基酸的胺基酸序列的多肽，優選長度為至少約55個胺基酸，更優選的是至少約80個胺基酸，對應於任意的SEQ ID NO139-148，236-253，343，和345的多肽片段，與由SEQ IDNO215-217編碼的多肽和已知的登革病毒C15/全長prM/全長E多肽相比較，上述的胺基酸序列是唯一的。另外，本發明提供包含長度為至少約45個胺基酸的，胺基酸序列的多肽，優選長度為至少約55個胺基酸，更優選的是至少約80個胺基酸的胺基酸序列的多肽，對應於任意的SEQ ID NO156-200和235的多肽片段，與由SEQ ID NOS211-214編碼的多肽和已知的登革病毒PRM15/tE多肽相比較，上述的胺基酸序列是唯一的另外，本發明也提供被多克隆抗血清特異結合的多肽，該血清在抵抗至少一種抗原，至少一種包含選自SEQ ID NO1-49和153-155的胺基酸序列，或其抗原性或免疫原性片段中產生，其中，所述抗原性或免疫原性多肽片段誘導機體產生抵抗至少一種病毒血清型的至少一種登革病毒的免疫應答，該免疫反應與由至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗原性或免疫原性片段誘導的哺乳動物細胞中的免疫應答相當或更大；其中多克隆抗血清去除了至少一種(1)選自SEQ ID NO338-341的截斷被膜蛋白和(2)包含已知登革病毒截斷E多肽的胺基酸序列片段的截斷被膜蛋白，其中，所述的胺基酸序列片段與任意的SEQ ID NO338-341截斷的E蛋白具有長度本質相同(如，至少有大約75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)。
本發明也包含與多肽特異結合的抗體或抗血清，該多肽包含選自SEQID NO1-49和153-155的胺基酸序列，其中抗體或抗血清不與包含SEQ IDNO338-341的多肽和已知的登革病毒截斷E蛋白的一種或多種的多肽特異結合。
進一步提供一種被抵抗對抗至少一種抗原時產生的多克隆抗血清特異結合的重組或合成多肽，該抗原包括選自SEQ ID NO65-116的胺基酸序列或其片段，其中抗血清扣除由SEQ ID NO149-152編碼的多肽和已知的登革病毒PRM15/tE多肽。
進一步提供被抵抗至少一種抗原時產生的多克隆抗血清特異結合的重組或合成多肽，該抗原包括選自SEQ ID NO139-148，236-253，343，和345的胺基酸序列或其片段，同時，該抗血清扣除由SEQ ID NO227-230編碼的多肽和已知的登革病毒C15/全長prM/全長E多肽中。
一般而言，本發明的多肽提供可被如免疫測定法確定的結構特徵。包括至少一種與本發明的多肽特異結合的(對於至少一種抗原的)抗體的抗血清的製備物，以及被該抗血清結合的多肽是本發明的一個特點。包括所述抗體的結合劑可以結合本發明的登革病毒抗原多肽和/或其片段，其親和力為大約1×102M-1到大約1×1010M-1(即，大約1×10-2-1×10-10M)或更多；包括大約104到106M-1，大約106到107M-1，或大約108M-1到109M-1或1010M-1。傳統雜交瘤技術可用於製備親和力高達大約109M-1的抗體。然而，新技術，包括噬菌體展示和轉基因鼠可用於達到更高的親和力(如，高達至少大約1012M-1)。一般的，更高的親和力是有益的。
為了製備用於免疫測定法中的抗血清時，至少一種本發明的免疫多肽(或編碼多肽的多核苷酸)以上述的方法製備和純化。例如，重組多肽可以在哺乳動物細胞系中製備。可選擇的，近交系小鼠可用免疫蛋白結合標準佐劑免疫，例如弗氏佐劑或鋁，和標準小鼠免疫方法(見Harlow和Lane，同上文，可用於抗體產生，免疫測定形式和可用於決定特異免疫反應性的條件的標準說明)。可選擇的，得自至少一種本文所述的多肽或由多核苷酸序列表達的至少一種合成或重組多肽可與載體蛋白連接，作為製備抗血清的免疫原。多克隆抗血清在免疫測定中收集和滴定抵抗免疫多肽的濃度，例如，包含固化在固體載體中的一種或多種免疫蛋白的固相免疫測定法。上述方法中，製備出了新的抗體和抗血清。用效價為106或更高的多肽(或多核苷酸和/或載體)給藥產生的抗血清通常被選擇、收集，並扣除對照共刺激的多肽，製備已扣除了的、收集的、滴定的多克隆抗血清。
抗體的交叉反應能力可以使用標準的方法來測定，比如競爭性結合免疫測定，和/或平行結合試驗，用於確定交叉反應能力的百分比的的標準計算。通常地，當試驗多肽的交叉反應的百分比至少為5-10x時，該試驗多肽被認為特異地結合收集的扣除的抗血清和抗體。
由免疫抗原產生或引起的抗血清可以與相關抗原結合(如交叉反應)。在這種情況下，交叉反應的抗原包含相同或本質等同的抗原表位或包含外形足夠相似來結合抗體的表位。
本發明同時提供多核苷酸共有序列，其得自本文描述的兩種或多種的多核苷酸序列的比較(如，從兩種或多種選自SEQ ID NO156-218，235，254-271，285-330，342，和344的序列的比較中獲得的共有序列)。優選的，核酸提供一種非自然產生或重組多核苷酸，其包含從得自這種共有序列核酸中選擇的序列。本發明也提供多核苷酸共有序列，得自至少兩種本發明的多核苷酸的相似分析(如任意選自SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的兩種胺基酸的比較)。本發明進一步提供包含根據由共有序列分析得到的序列模式(方式)的序列的多肽。這些方式的例子在本文被描述，例如由多肽的標準比對得到。
本發明也提供包含與本文特定公開的序列之一具有本質的局部序列同一性的序列的多肽和/或多核苷酸，不同於總體/全部序列同一性(這裡首先討論的)。局部序列同一性可以使用局部序列排列軟體確定，如，上述的BLAST程序，LFASTA程序，或更優選的LALIGN程序。優選的，使用BLOSUM50矩陣分析的LALIGN程序可用於胺基酸序列分析，+5匹配/-4錯配分析可用於多核苷酸序列分析。缺口伸展(Gap extension)和開口罰分(openingpenalties)優選與上述採用LALIGN的分析相同。在使用k-tup值設定(又稱「k-tuple」或ktup值)的LAGIGN(或其它程序)分析中，優選ktup值設定為蛋白質0-3和核酸序列0-10(如約6)。一方面本發明提供如一種多核苷酸的序列，其包括與本發明的核酸的免疫抗原胺基酸編碼部分在超過至少約300，優選至少約450，更優選至少約600，優選至少約900和更優選的為至少約1200核酸序列上具有本質部分同源(也就是本質同一性序列的百分比相似)(如，有至少約75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，優選至少約90％，91％，92％，93％，或94％，更優選的至少約95％(如，約87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)。儘管其由於缺口罰分和/或分析序列長度的差別，導致缺乏本質的同一性。類似的，本發明提供包含至少約10個胺基酸序列的多肽，優選至少約20個，更優選至少約50個，有利地至少約100個，更有利的至少約200個，或多種(如，至少大約300，350，或375)胺基酸殘基，其與重組多肽的免疫抗原胺基酸序列(如，重組tE序列，全長E序列，PRM15/tE序列，C15/全長prM/tE序列，C15/全長prM/全長E序列)具有本質局部同一性。
雖然不必要，希望本發明的重組多肽和野生型登革病毒多肽，或至少與重組多肽長度相似片斷具有一級的，二級的和/或三級的結構相似性。例如，重組的tE，全長E，PRM15/tE，C15/全長prM/tE，或C15/全長prM/全長E多肽可分別與野生型登革病毒病病毒tE，全長E，PRM15/tE，C15/全長prM/tE，或C15/全長prM/全長E多肽具有一級，一級和/或三級的結構相似性。結構相似性可以由任何適宜技術確定，優選使用適宜的軟體程序進行評價。這些程序的例子包括MAPS程序和TOP程序(如，Lu，Protein DataBank QuarterlyNewsletter，num；78，10-11(1996)，和Lu，J.Appl.Cryst.，33，176-183(2000))。多肽和/或prM/E蛋白質顯示拓撲學多樣性(如，局部差異少於大約20，優選少於15，更優選少於10)，或兩者的組合。然而，具有高度結構差異多肽是適宜的和甚至是優選的。這些不同的功能性的肽可以由上述的遞歸序列重組技術得到。可選擇的，蛋白質的結構可以由PROCHECK程序比較(見，如Laskowski，J.Appl.Cryst.，26，283-291(1993))，MODELLER程序，或具有上述特徵的商業可用的程序。可選擇的，結構預測可以由使用如PredictProteinserver程序(得自http//dodo.cpmc.columbia.Edu/predictprotein/)的序列比較方法進行比較。可用於確定結構相似性的蛋白結構分析的其它技術可見於，如Yang和Honig，J.Mol.Biol.，301(3p，665-78(2000)，Aronson等，Protein Sci.，3(10)，1706-11(1994)，Marti-Remon等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，29，291-325(2000)，Halaby等，Protein Eng，12(7)，563-71(1999)，Basham，Science，283，1132(1999)，Johnston等，Crit.Rev.Biochem MolW Biol.，2961，1-68(1994)，Moμlt，Curr.Opin.Biotechnol.，10(6)，583-6(1999)，Benner等，Science，274，1448-49(1996)，和Benner等，Science，273，426-8(1996)，以及國際專利申請WO00/45334。
本發明的試劑盒任意包括至少以下一種(1)上述的裝置，系統，系統組件，或裝置組件；(2)至少一種試劑盒組分，其包含至少一種本發明的多肽，多核苷酸(或兩者的片段)，載體，抗體，和/或細胞；一種或多種包含至少一種本發明的多肽，多核苷酸載體和/或抗體的細胞；一種表達本發明的多肽的細胞；組合物，藥學組合物，或疫苗組合物(適合作為哺乳動物疫苗的組合物)，包含至少一種上述任意的至少一種發明物(如，多肽，多核苷酸，載體，抗體，和/或細胞)或它們的任何組合；(3)執行任何所述方法的說明書，包括誘導免疫應答的方法，免疫方法，檢測或診斷生物樣本中至少一種血清型的至少一種登革病毒的抗體的存在的方法，治療或預防方法，使用任意在(2)中指出的組分或疫苗或任意這種組分的組合物的說明書；和/或操作上述任何裝置，系統或組件的說明書；(4)裝載上述至少一種組分或組合物的容器和(5)包裝材料。進一步的，本發明提供使用上述任意裝置，組分，組合物，或試劑盒執行上述方法或測定，和/或使用任意裝置，組分，組合物，或試劑盒執行上述方法或測定。
本發明提供電腦，電腦可讀介質，和包含多肽和核苷酸序列信息字符串的集成系統，包括，如，本文所列舉的序列和各種沉默取代和保守取代。本領域已知的各種方法和遺傳算法(GAs)可用於檢測不同字符串的同源性或相似性，或用於執行其它希望的函數到控制輸出命令，提供包括序列或相似物的信息的掃描圖像的基質。實例包括上述的BLAST。
各種嚴緊性和長度的不同連續的同源性和相似性可以在本文的集成系統中檢測和確定。如，許多同源性的測定方法已經被設計來比較分析生物多聚體序列，文字處理的拼寫檢查，和不同資料庫的數據檢索。基於天然多核苷酸中的4種基本核鹼基的雙螺旋配對互補作用，模擬互補同源多核酸鏈的退火的模型可作為尤其是對應於所述序列的字符串進行的序列對比或其它操作應用(如，文字處理操作，包含序列或次序列字符串的圖形構造，輸出表等)。具有用於計算序列相似性的GAs的軟體包的例子是BLAST，其可通過輸入對應於該序列的字符串來應用於本發明。
相似地，標準的桌面應用軟體如文字處理軟體(如Microsoft Word或Corel WordPerfect)和資料庫軟體(如表格程序，如Microsoft Excel，CorelQuattro Pro或資料庫程序如Microsoft Access或Paradoxm))可以通過輸入相應於本發明的多肽或多核苷酸或兩者，或兩者的片段的字符串適用於本發明。例如，集成系統可以包括含有合適的字符串信息，如結合用戶界面(如，標準作業系統的用戶界面，如Windows，Macintosh或LINUX系統)來處理字符串。專門的排列程序如BLAST也可合併進該系統用於核酸或蛋白質(或相應的字符串)的排列。
在本發明中用於分析的集成系統任意包括具有用於排列序列的GA軟體的數碼電腦，另外還有進入包含上述任何序列的軟體系統的數據集。電腦可以是，如一臺PC(Intel x86或Pentium chip-compatible DOS，OS2TMWINDOWSTM WINDOWS NTTM，WINDOWS95TM，WINDOWS98LINUX基礎的機器，一臺MACINTOSHTM，Power PC，或UNIX(e.g.，SUNTM工作站)基礎的機器)或其它該領域已知的商業通用的電腦。用於排列或處理序列的軟體是可獲得的，或很容易由技術人員採用標準程序語言，如Visualbasic，Fortran，Basic，Java，或其它相似的語言編寫。
控制器或電腦任意地包括監視器，其一般是陰極射線管顯示器(「CRT」)，平板顯示器(如，活性液晶顯示器，液晶顯示器)或其它。電腦電路一般放置在包含在集成電路片的機箱裡，如微處理器，內存，接口電路，和其它裝置。機箱裡也任意有硬碟驅動器，軟磁碟驅動器，高容量可移動的驅動器，如可寫入CD-ROM，和其它常見的周邊設備。輸入設備，如鍵盤或滑鼠也任意提供給用戶輸入和用於用戶選擇比較序列或相關的電腦系統的其它操作。
電腦可以包括適當的軟體以用戶輸出到系統參數的方式來接收用戶的指令，如圖形用戶接口(GUI)，或以預編程序指令的方式，如，預編的多種不同的特別操作。然後軟體把這些指令轉換成適當的語言，來指令流體方向的操作和傳輸到控制器，來執行所需的操作。該軟體也包括輸出元件，來控制核酸合成物(如以序列或序列比對為基礎)，或發生在比對後的其它操作，或利用與序列相當的字符串完成的其它操作在本發明的這種實施方案的的特別方面，本發明提供一種電腦或電腦可讀介質，其包含序列記錄的資料庫，該序列記錄包含一種或多種與選自SEQ ID NO156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸，或選自SEQID NO1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的多肽序列的字符串。
本發明也提供一種包含有序列記錄的資料庫的電腦或電腦可讀介質的集成系統，每個序列記錄包含至少一個對應於選自SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345的核酸或蛋白序列的字符串，該集成系統進一步允許用戶觀看一種或多種序列記錄的用戶輸入界面。對於這種集成系統，電腦或電腦可讀介質包含比對指令系統，其將字符串與至少一個對應於核酸或蛋白質序列的其它字符串比對。該指令系統包括一個或多個局部同源性比較測定，同源性比對測定，確定相似性的檢索和BLAST確定。這些系統也包含用戶可讀的輸出元件，可顯示比對指令系統產生的比對。一方面，電腦或電腦可讀介質進一步包含把至少一個選自SEQID NO156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸序列翻譯為胺基酸序列的指令系統。另一方面，電腦和電腦可讀介質進一步包含把至少一個選自SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的核酸序列逆向翻譯為胺基酸序列的指令系統。在一些系統中，指令系統選擇由提供密碼子選擇系統或與測試核酸序列同一性的決定序列來選擇核酸。
同時提供使用電腦系統保存信息的方法，該信息與資料庫中儲存的大量序列紀錄中的至少一個相關，所述的序列紀錄每個都包含相應於SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345中的至少一個或多個字符串。該方法包括確定相應於一種或多種上面所述的SEQ IDNOS或其亞序列的字符串列表；確定該列表中的一個和多個字符串被用戶選定；顯示被選擇的字符串，或將該被選擇的字符串與其它字符串比對。這些方法包含顯示被選擇的字符串與其它字符串的比對和/或顯示列表。
進一步的，本發明提供一種產生和/或選擇多肽變異體的方法，包含採用對應於SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345的字符串，優選結合其它生物學功能信息(如，抵抗一種或多種登革病毒血清型的中和抗體效價)進行計算，優選使用電腦介質來提供便利，其分析結果產生一種或多種胺基酸序列，序列特徵的圖形，序列變化(突變)，和/或顯示有相似或生物學性質改善的多肽的結構。這種方法可以包括將字符串用於任何適宜的本領域已知的遺傳建模或計算中，包括，如，統計分析技術，Markov建模，主成分分析，神經網絡分析，隨機重組建模方法，和物理重組方法。這些技術的例子可見於，如，國際專利申請WO01/83559，WO99/49893，和WO 01/61344，和U.S.6,269,312。另外的技術和原理可見於如國際專利申請WO00/42561，WO 01/51663，和WO01/90197以及Norton等，Virus Res 55(1)37-48(1998)，，Rappuoli，Curr Opin Microbiol 3(5)445-450(2000)，Petersen等，Scand J.Immunol 53(4)357-364(2001)，和NakaiJ.StructBiol 134(2-3)103-116(2001)。具有利用與SEQ ID NO1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345相當的字符串的計算機模擬建模產生的非野生型序列的胺基酸和核酸序列是本發明的一個特點。
除非另有說明或有上下文可以清楚地反駁，本發明所述的多肽，多核苷酸，載體，細胞，組合物和方法的特徵可以由任何適當的方式結合。
本發明所述的任何分子，包括核酸，多肽，蛋白質，融合蛋白，或任何載體，細胞或包含上述組分的組合物都可被用於任何所述本發明的方法和應用中。一方面，本發明提供任意這類分子，包括核酸，多肽，蛋白質，縮氨酸，或融合蛋白，或任意載體，細胞，或包含所述的任意分子的組合物的用途，作為藥劑，藥物，治療劑或預防劑，或疫苗來治療或預防疾病或紊亂，包括那些本文所述的疾病或紊亂(如與登革病毒感染相關的)或相似病症。另外一方面，本發明提供任意分子(如，核酸，多肽，蛋白質，融合蛋白質，或縮氨酸)或任何載體、細胞，或包含任何分子的組合物的用途，用於生產藥劑，預防性的或治療性的物質，藥物，或疫苗，它們用於任何可應用於治療或預防疾病和紊亂包括此處所描述的(例如，那些與登革病毒感染相關的)的治療性或預防性的方法中。
實施例下述實施例更進一步的舉例說明本發明，但是無論如何不被理解為限定保護範圍。
實施例1本實施例舉例說明製備和確定新型核酸，其編碼重組、合成或者突變的登革病毒抗原，包含這種登革病毒抗原的多肽，轉運這種核酸到哺乳動物細胞的典型DNA載體的構建，通過用這種載體轉染哺乳動物細胞以表達這種核酸，使得編碼的登革抗原高水平的表達和分泌。
A.編碼新型登革抗原的核苷酸序列的合成分析四種WT DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4病毒中每一種的多種蛋白的胺基酸序列以確定四種WT登革病毒血清型中的每一種的聚蛋白的下述區域(1)相當於prM蛋白的C端15個胺基酸的登革聚蛋白序列的胺基酸片段或片斷(「PRM15」)，所述的prM蛋白的15個胺基酸片段用於作為登革包膜蛋白(E蛋白)的信號序列；(2)包含登革病毒聚蛋白序列的全長E蛋白序列的絕大部分的胺基酸，即不包含對應於E蛋白序列的C端區域的大約5％到約12％胺基酸殘基，其編碼部分疏水性區域)。因此，胺基酸序列從四種WT登革病毒血清型中的每一種的聚蛋白序列中被確定；每一個這種胺基酸序列包括包含prM蛋白的C端15個胺基酸殘基(例如，M蛋白的15個胺基酸殘基)和大約90％-95％的E蛋白的N端胺基酸殘基的融合蛋白(因此，稱為「截短的」E蛋白)。見圖14。這些從每個野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4聚蛋白中確定的胺基酸序列分別被稱為Den-1PRM15/trunc E(或者Den-1PRM15/tE)(SEQ ID NO149)，Den-2PRM15/trunc E(或者Den-2PRM15/tE)(SEQ ID NO150)，Den-3PRM15/trunc E(或者Den-3PRM15/tE)(SEQ ID NO151)，Den-4PRM15/trunk E(或者Den-4PRM15/tE)(SEQ ID NO152)登革抗原融合蛋白，這些序列被共同稱為「截短的」親本多肽。這些融合蛋白可以通過質粒載體的表達製得，例如大腸桿菌載體，病毒載體，杆狀病毒載體，或其它質粒載體，並且通過本領域公知的和這裡所描述的標準技術在昆蟲細胞，大腸桿菌細胞，或者哺乳動物培養物中製備得到。此外，蛋白可通過由本領域公知的和本文前面所提及的標準蛋白合成技術製得的蛋白片段或肽片段組裝而成。
這四種被確定的胺基酸序列中的每一種被反翻譯回核苷酸序列，通過標準的人類密碼子頻率表(http//www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？Species＝Homo+sapiens+[gbpri])，獲得人類密碼子優化DNA序列。
對四種登革病毒血清型中的每一種，用標準技術合成包含每種被確定的人類密碼子優化PRM15和截短的E融合蛋白編碼序列的重疊部分的DNA寡核苷酸。對四種登革病毒血清型中的每一種而言，共同構成PRM15/E截短的蛋白的編碼序列的重疊的寡核苷酸部分可以進行雜交。對應優化密碼子序列的DNA序列可以用被雜交的寡聚部分為模板通過標準PCR基因合成製得。對於每種PCR基因合成反應而言，採用含有與PRM15序列重疊的核苷酸序列，附加的BamHI位點和5』-ACC-3』Kozak共有序列(Cell151109-23(1978))的5』正向引物，以及包含與截短的E基因重疊的核苷酸序列和EcoRI限制位點的3』反向引物，使得這些位點和共有序列被加入到生成的編碼PRM15/截短的E編碼PCR產物中。生成的人類密碼子優化的PRM15/截短的E編碼DNA序列分別被稱為Den-1PRM15/truncE CO(或者Den-1PRM15/tE CO)(SEQ ID NO211)，Den-2PRM15/trunc E CO(或者Den-2PRM15/tE CO)(SEQ ID NO212)，Den-3PRM15/trunc E CO(或者Den-3PRM15/tE CO)(SEQ ID NO213)和Den-4PRM15/trunk E CO(或者Den-4PRM15/tE CO)(SEQ ID NO214)，「PRM15」表示包含編碼prM的C端的15個胺基酸的信號核苷酸序列(即PRM15)和一般地附加甲硫氨酸殘基(在15個胺基酸序列之前的第一個胺基酸殘基)，「trunc」E或者「tE」表示編碼了截短的E蛋白的核苷酸序列，而「CO」表示優化密碼子。相同的是，它們都被用做這裡所描述的遞歸序列重組方法中的親本核酸，所以這些核苷酸序列被稱為截短的親本核苷酸序列。
用相似的程序確定和製備多肽序列，其包括具體的WT登革病毒血清型(例如，Den-1，Den-2，Den-3，Den-4)聚蛋白的衣殼蛋白(C蛋白)的15個胺基酸殘基，對應上述WT登革病毒聚蛋白的全長prM蛋白的胺基酸序列，以及對應上述WT登革病毒聚蛋白的全長的E蛋白的胺基酸序列。所述步驟是通過採用四種WT登革病毒聚蛋白的每一種來實施的，合成的多肽序列分別被稱為Den-1 C15/全長prM/全長E(或者Den-1 C15/prM/E)(SEQ IDNO227)，Den-2 C15/全長prM/全長E(或者Den-2 C15/prM/E)(SEQ IDNO228)，Den-3 C15/全長prM/全長E(或者Den-3 C15/prM/E)(SEQ IDNO229)，Den-4 C15/全長prM/全長E(或者Den-4 C15/prM/E)(SEQ IDNO230)登革抗原融合蛋白。
編碼這四種登革抗原融合蛋白中每一種的人類密碼子優化序列是如前面所描述那樣確定與製得的，合成的核苷酸序列分別被稱為Den-1 C15/全長prM/全長E CO(或者Den-1 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO231)，Den-2 C15/全長prM/全長E CO(或者Den-2 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO232)，Den-3 C15/全長prM/全長E CO(或者Den-3 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO233)，Den-4C15/全長prM/全長E CO(或者Den-4 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO234)登革抗原核苷酸序列。
B、pMax Vax10.1的構建典型的哺乳動物表達載體被稱為「pMax Vax10.1」(見圖1)，其除其它物質外還包含(1)啟動哺乳動物細胞中的轉基因(或其它核苷酸序列)表達的啟動子(包括但不限制於，例如，CMV啟動子或其變體，和被改組的、合成的，或者重組的啟動子，包括在國際
發明者多裡斯·阿普特, 朱哈·龐諾南, 艾麗斯·M·布林克曼 申請人:馬克西根公司