抗線蟲的轉基因植物的製作方法

2023-05-29 08:47:41 1

專利名稱：抗線蟲的轉基因植物的製作方法
技術領域：
本公開一般涉及控制植物寄生蟲的組合物和促進根系生長的組合物，更特別涉及控制線蟲病或促進根系生長的核酸組合物。
2.相關技術 線蟲類是無脊椎動物的一個很大的群體，通常指蛔蟲、蟯蟲、線蟲(eelworm)或線蟲(nema)。某些線蟲類是植物寄生蟲，以莖、芽、葉為食，特別是根。植物寄生線蟲類的一個重要的屬是根結線蟲(Meloidogyne spp.)。這些寄生線蟲類感染了大範圍的重要領域、蔬菜、水果和觀賞植物。2001年，僅棉花一項，根結線蟲就導致了兩億零50萬美元的損失。
治療或預防根結線蟲病害的已有方法包括使用化學品、殺蟲劑和煙燻劑。播種前使用土壤煙燻劑控制根結線蟲和其它植物寄生線非常有效。但是，大多數煙燻型殺線蟲劑不再能夠獲得，而且也昂貴，難以適合流行條件下的應用。
作物輪作也用於控制線蟲病害。如果經濟可行的話，洋蔥、胡蘿蔔或萵苣與非寄主型作物如甜玉米和其它穀物輪作，能有效控制北方根結線蟲。不幸的是，目前作物輪作對有機土壤的價值有限，因為多數生長的作物，包括土豆、豆類、芹菜、萵苣、洋蔥和胡蘿蔔均易感疾病。
也嘗試過用覆蓋作物控制線蟲病害。生長在主要作物之間的覆蓋作物可以提供替代的管理策略。已經表明黑麥草、大麥、燕麥、蘇丹草、高羊茅、一年生黑麥草和小麥不是該線蟲的宿主或者是很難寄生的宿主。但是，用覆蓋作物的耗費高，因為覆蓋作物佔用了可以用來生長更有價值的作物的空間。
也試圖用生物控制生物體控制作物的線蟲病害。市場上可以得到的生物控制生物體製劑有限，因為在能支持該控制生物體生長的區域才能應用。況且，用一種生物體控制另一種的結果不可預測，並受到多種因素如天氣和氣候的影響。
另外，根結線蟲(RKN)是作物由於植物寄生性線蟲而減產的最主要原因。最重要的種類(南方根結線蟲[M.incognita]，爪哇根結線蟲[M.javanica]，花生根結線蟲[M.arenaria]，北方根結線蟲[M.hapla]，馬鈴薯根結線蟲[M.chitwoodi])有廣泛的宿主範圍，限制了非宿主輪作的選擇。雖然在各種作物中存在若干宿主抗性基因的實例，但宿主植物抗性的可用性明顯受限於大多數我們的作物缺少適當的抗性基因座(Roberts，P.A.1992.Journal of Nematology 24213-227)。另外，抗性還僅限於一些RKN種類或類群以及某些抗性基因有熱敏感性，因而不適合炎熱的產地。天然抗性基因的另一個局限性在於抗性的持久性，因為持續暴露於抗性栽培種如根結抗性番茄後，會發展出RKN打破抗性的種群。
因此，需要控制、預防或減少植物中線蟲病害的組合物和方法。
還有一個影響作物的問題與根系發育差有關。植物的根系是植物的重要部分，提供了植物生存至關重要的許多功能。例如，根係為植物儲存養分，過濾毒素，幫助調節植物生長，提供吸收水和養料的網絡，並提供支撐植物和強化土壤的機械結構。根系較大的植物生長加快，耐逆性增加。增加或提高作物的根系生長特別有利，因為增加根系生長將增加作物產量。
在多年生作物中，增加根系生長將增加再生長率，增加產量潛能，並增加植物越冬存活的可能性。一年生作物中，增加根系大小將在變化的環境條件下確保產量潛能。塊根作物，增加根系生長意味著更高的產量。
現有的根刺激劑通常包括肥料或植物激素，其用到植物上或植物附近的土壤中時，必須混合或配成特定濃度。過度應用這類刺激劑對植物有副作用，過少應用則達不到所需的結果。另外，應用植物激素有不想要的後果。例如，一種用作生根劑的植物激素是植物生長激素(auxin)或吲哚-3-乙酸(IAA)。IAA在植物的許多活性中發揮著重要作用，包括胚發育、葉子形成、向光性、向重力性、頂端優勢、果實發育、脫離以及生根。
因此，需要新的組合物和方法刺激或增強根系生長或發育。
發明概述 本發明的各個方面總體提供了抑制植物寄生蟲分泌的蛋白質的表達的核酸構建體。在某些方面，蛋白質由線蟲分泌，和任選調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，職務的細胞代謝，在植物細胞中引發信號轉導，或形成取食管確保線蟲從植物形成的巨細胞中取食。一方面，提供了對線蟲，尤其是根結線蟲分泌的食道腺細胞蛋白質特異的抑制性核酸。另一方面，提供了表達或含有一種或多種抑制性核酸(例如抑制性雙股或單股RNA)的轉基因細胞或植物，抑制或減少線蟲食道腺細胞蛋白質的表達。
另一方面，提供了包含抑制性RNA的轉基因植物，其在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的線蟲種類中，例如RKN種類，下調靶線蟲寄生基因的轉錄。因此，本公開提供了對抗多個RKN種類導致的疾病的轉基因植物。
被公開的抑制性核酸所靶向的代表性食道腺細胞蛋白包括，一種或多種由SEQ ID NOs.1、2和5-51編碼的蛋白質。在某些方面，當線蟲進入轉基因植物或轉基因植物細胞，以轉基因植物或轉基因植物細胞為食，或與轉基因植物或轉基因植物細胞產生物理接觸時，一種或多種抑制性核酸被遞送至寄生線蟲上。一旦抑制性核酸被寄生的線蟲內化，抑制性核酸就幹擾、減少或抑制靶食道腺細胞蛋白的表達，例如，通過直接或間接幹擾、減少或抑制一種或多種編碼一種或多種食道腺細胞蛋白的mRNA的翻譯。
還有一個方面提供了用異源核酸轉染的植物細胞，所述異源核酸編碼對於一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白特異的抑制性核酸，其中異源核酸表達的量足以減少或預防線蟲病。在一個方面，轉基因植物表達了抑制性核酸，並且抑制性核酸遞送到以轉基因植物為食或嘗試以轉基因植物為食的線蟲中。通常，抑制性核酸被線蟲內化。示例的抑制性核酸內化的方法包括攝取核酸或吸收核酸。
還有一個方面提供了包含抑制性核酸的轉基因植物，所述核酸對於一種或多種線蟲寄生多肽具有特異性，其中抑制性核酸提供了對兩種或多種線蟲種類的抗性，例如兩種或多種根結線蟲。
其它方面提供了刺激、促進或增強植物或樹木根系生長或發育的組合物。某些方面提供了編碼線蟲食道腺細胞分泌的蛋白質的核酸構建體，其中所述蛋白或其片段當被遞送或與植物接觸時，刺激或增強了根系發展。其它方面提供了含有一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白或其片段的組合物，當與植物或植物細胞接觸時，刺激根系生長。還有的其它方面提供了轉基因植物，其包含一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白或其片段、或者編碼一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白或其片段的核酸，與非轉基因植物或對照植物比較，足以刺激、增強或促進根系生長。
代表性的線蟲食道腺細胞蛋白(也稱作食道蛋白)，包括一種或多種由SEQ ID NOs.1、2和5-51編碼的蛋白或其組合。
還有另一方面提供了被編碼一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白的異源核酸轉染的植物細胞，其中異源性核酸表達的量足以刺激、增強或促進根系生長或發育。
下文伴隨附圖，提出了一種或多種實施方案的詳細資料。本公開的其它特徵、目的和優點從說明書、附圖和權利要求將更為顯見。
附圖簡述

圖1A顯示表達16D10 dsRNA的擬南芥(A.thaliana)接種南方根結線蟲。注意到表達16D10 dsRNA的擬南芥的根上沒有根結病(蟲癭)。
圖1B顯示接種南方根結線蟲的對照植物。
圖2顯示表達16D10的轉基因擬南芥植物的照片，與對照植物(空載體)比較，根系生長增強。
圖3顯示了四種轉基因擬南芥(Arabidopsis)T2純合株L7、L10、L11、L17與對照株(L2，L3)比較，表明根系生長增強的柱狀圖。
圖4顯示了用16D10 dsRNA(RNA1和RNA2)處理過的根結線蟲的二期幼蟲的RT-PCR分析，表明在處理過的線蟲內，寄生基因16D10的轉錄本明顯減少。間苯二酚(Res)用於幫助刺激dsRNA的攝取。單用dsRNA或res，轉錄本沒有減少。Mi-act-內部轉錄對照。
圖5顯示了凝膠的照片，表明RNAi涉及線蟲中的寄生基因8H11或31H06的8H11或31H06的下調表達。
圖6顯示四種根結線蟲用DIG標記的16D10探針進行的限制性內切酶消化的基因組DNA的DNA點雜交。Mi，南方根結線蟲(M.incognita)；Mj，爪哇根結線蟲(M.javanica)；Ma，花生根結線蟲(M.arenaria)；Mh，北方根結線蟲(M.hapla)。E，EcoRI；B，SamHI.M，80ng DIG-標記的分子量標記物(kb) 圖7是柱狀圖，顯示了在表達16D10 dsRNA的轉基因擬南芥上，四種線蟲(Mi，南方根結線蟲；Mj，爪哇根結線蟲；Ma，花生根結線蟲；Mh，北方根結線蟲)的繁殖(每克根上的卵)相對於對照植物減少了。
發明詳述 1.定義 在解釋本公開的各種實施方案之前，應當理解本發明其應用不受下文的說明中文法結構的細節和的內容安排的限制。其它實施方案也能以各種方式實施或進行。同樣，也要體會本文所用的措辭和術語是為了敘述的目的，不應作為限制。
貫穿本公開文本，參考了各種出版物、專利和已發表的專利說明書。在容許的情況下，這些出版物、專利和發表的專利說明書的公開文本在此以全文引作為參考全文，更完整地說明本領域的狀況。除了另有說明，本公開文本包括屬於本領域技術範圍的植物育種、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的常規技術。參見，例如Sambrook和Russell編著的，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd edition(2001)；Current Protocols In Molecular Biology[(F.M.Ausubel，等eds.，(1987)]；Plant BreedingPrinciples and Prospects(Plant Breeding，VoI 1)M.D.Hayward，N.O.Bosemark，I.Romagosa；Chapman & Hall，(1993.)；Coligan，Dunn，Ploegh，Speicher和Wingfeld編著的(1995)CURRENT Protocols in Protein Science(John Wiley &Sons，Inc.)；the series Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)PCR 2A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著(1995)]，Harlow和Lane編著的(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，and Animal Cell Culture[R.I.Freshney，編著.(1987)]. 除非另有說明，技術術語根據其常規用法使用。分子生物學中普通術語的定義可以在下列文獻中找到Lewin撰寫的Genes VII(OxfordUniversity Press出版，2000)；Kendrew等人編著的The Encyclopedia ofMolecular Biology(Wiley-Interscience.出版，1999)；Robert A.Meyers編著的Molecular Biology and Biotechnology，a Comprehensive DeskReference(VCH Publishers，Inc.出版，1995)；Ausubel等人(1987)Protocols in Molecular Biology，Green Publishing；Sambrook和Russell.(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual 3rd.edition。
為了促進理解本公開文本，特提供下列定義 「改變」靶基因在植物細胞中的表達，意思是應用本發明的方法後，靶基因在植物細胞中的表達水平不同於其在應用該方法前的表達水平。改變基因表達優選意味著靶基因在植物中的表達降低了，優選大大降低了，更優選該基因的表達檢測不到。必需基因的表達改變，可以導致在植物細胞中或從其起源的植物的敲除突變表型。或者，改變表達可包括植物基因的表達上調。
「反義RNA」是與靶基因mRNA具有互補序列的RNA鏈，並據認為通過與靶基因mRNA結合誘導RNAi。「有義RNA」具有與反義RNA互補的序列，並退火至其互補的反義RNA上形成siRNA。這些反義和有義RNA通常用RNA合成儀合成。在本發明中，這些DNA是用siRNA表達體系，從分別編碼反義和有義RNA的DNA(反義和有義編碼DNA)細胞內表達的。
術語「生物樣品」指來自任何動物的身體樣品，如哺乳動物，舉例，人。生物樣品可以得自例如血管病、糖尿病或癌症患者。生物樣品可以是生物體液如血清、血漿、玻璃體液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊膜液、乳汁、全血、尿液、腦脊液、唾液、痰液、淚液、汗液、粘液和組織培養介質，以及組織提取物如組織勻漿、細胞提取物，或全細胞或組織。生物樣品可以是，例如，血清、血漿或尿。
用在本文中，「緩衝物」指緩衝溶液，通過其酸-鹼共軛組分的作用對抗pH的改變。
當提到表達時，「控制序列」是指在特定宿主有機體中，表達可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合原核生物的控制序列，例如，包括啟動子、任選操縱子序列、核糖體結合位點等。已知真核細胞利用啟動子、多聚腺苷酸信號和增強子。
術語「細胞」指能複製或分裂的膜包圍生物學單位。
術語「構建體」指包含本發明的一或多種多核苷酸序列的重組基因分子。
用於在宿主生物體中轉基因表達的基因構建體，以5′-3′方向包括啟動子序列；編碼本文公開的抑制性核酸的序列；和終止序列。開放閱讀框可以按照有義或反義的方向。構建體還可以包括可選擇的標記基因和其它用於表達的調節元件。
如本文所用，術語「控制元件」或「調節元件」這裡可互換使用，意思是位於啟動子序列內部或與其鄰接，從而影響啟動子活性的序列。控制元件可以是正和負控制元件。正控制元件需要結合調節元件，啟動轉錄。已知有很多這種正和負控制元件。如本文所述，在異源性控制元件加入到啟動子，改變啟動子活性的情況下，它們位於啟動子序列內部或與其鄰接，從而有助於啟動子調節的表達可操作地連接的多核苷酸序列的活性。
術語「異源性」指元件出現在它們通常不會出現的情況下。例如，啟動子可以與異源性核酸序列連接，比如一個通常不與啟動子可操作地連接的序列。當用於本文描述啟動子元件時，異源性指啟動子元件與通常在天然啟動子中發現的不同，可以是序列、種類，或者是數量不同。例如，啟動子序列中的異源性控制元件，可以是加入的不同啟動子的控制/調節元件以增強啟動子的控制，或者是相同啟動子的附加控制元件。
如本文所用，術語「同源性」分類為「直向同源(orthologues)」和「平行同源(paralogues)」。
術語「宿主植物」指易患線蟲病的植物。
本文所用的短語「誘導表達」意思是通過將含有特定基因的細胞暴露在效應劑或誘導劑或相應條件下，增加特定基因的轉錄和/或翻譯的量或速率。
「誘導劑」是化學或物理試劑，當用於細胞群落時，將增加特定基因的轉錄量。它們通常是小分子，其作用對於具體的操縱子或基因群是特異性的，它們可以包括糖類、磷酸鹽、醇、金屬離子、激素、熱、冷等。例如，異丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和乳糖是tadI啟動子的誘導劑，L-阿拉伯糖是阿拉伯糖啟動子的適用誘導劑。
術語「分離的」，用於描述本文公開的各種組合物時，是指物質已從其天然環境的成分中被鑑別和分離和/或回收。例如，分離的多肽或多核苷酸不再與至少一種其天然結合的成分相結合。其天然環境的汙染成分是通常幹擾多肽或多核苷酸的診斷或治療用途的物質，可包括酶和其它蛋白質的或非蛋白質的溶質。分離的物質包括重組細胞內的原位物質。但是，通常，分離的物質將通過至少一個提純步驟而製備。
「分離的」核酸分子或多核苷酸是已鑑定的與至少一種汙染的核酸分子分離的核酸分子，所述汙染核酸分子在天然來源中通常與其結合。分離的核酸可以是，例如，不與其天然結合的所有成分相結合。分離的核酸分子在形式或裝配上與天然發現的不同。
″IPTG″是化合物「異丙基(β)-D-硫代半乳糖吡喃糖苷」，這裡用作乳糖操縱子的誘導劑。IPTG與lac阻遏蛋白結合，在lac操縱子種產生構象變化，導致lac阻遏蛋白從乳糖操縱子上解離。由於不結合lac阻遏蛋白，可操作地連接的啟動子被激活，下遊基因被轉錄。
術語「乳糖操縱子」指能被lac阻遏蛋白lad結合的核酸序列，如Jacob等，1961，J.MoI.Biol.，3318-356所描述。當lac阻遏蛋白與乳糖操縱子結合時，啟動子不激活。當lac阻遏蛋白被誘導從操縱子上解離時，啟動子激活。
術語「前導序列」指位於所關注的編碼序列上遊的核酸序列。本文描述的前導序列含有已知用於有效結合到核糖體上的特定序列，從而對某些多核苷酸提供了更高的啟動翻譯的效率。
本文所用的術語「哺乳動物」指任何歸類為哺乳動物的動物，包括人、家養和牧養動物，和動物園、運動場的動物或寵物動物，如狗、馬、貓、牛等。哺乳動物可以是，舉例，人。
術語「線蟲食道腺或線蟲食道腺細胞」指位於線蟲的食道的三種大型的轉錄活性腺細胞，一種為背部的，兩種為側腹部的，是與植物被植物寄生線蟲感染和寄生有關的主要的分泌(寄生蛋白)來源，所述植物寄生線蟲為墊刃目(Tylenchida)和滑刃目(Aphelenchida)。
核酸序列或多核苷酸當其與其他核酸序列有功能聯繫時，是「可操作地連接」。例如，前序列或分泌性前導序列的DNA如果被表達為參與多肽分泌的前蛋白，則其與多肽的DNA可操作地連接；啟動子或增強子如果影響序列的轉錄，則其與編碼序列可操作地連接；或者核糖體結合位點如果其位置能使得促進翻譯，則與編碼序列可操作地連接。通常，「可操作地連接」意思是被連接的DNA序列是鄰近的，並且在分泌性前導序列的情況下，是鄰近的和在閱讀框中的。連接可以通過在便利的限制性位點進行連接來實現。如果這樣的位點不存在，則依照常規實踐使用合成的寡核苷酸適配子(adaptor)或接頭(linker)。
術語「直向同源(orthologues)」指相同基因在多個物種中獨立出現。獨立出現的基因具有雖然相似但不一致的胺基酸序列，序列相似性的程度部分取決於物種從具有相同基因的共同祖先進化的距離。
本文所用的術語「平行同源(paralogues)」指基因在同一物種中獨立出現。獨立出現的基因具有雖然相似但不一致的胺基酸序列，序列相似性的程度部分取決於產生獨立出現的基因的基因複製事件的進化距離。
術語「寄生蛋白，寄生多肽，食道多肽，或線蟲食道腺細胞分泌多肽」指與植物的線蟲寄生有關的主要分子；在植物寄生的線蟲食道腺細胞表達、並通過其口針注射到宿主組織中介導植物寄生的寄生基因的產物。
「核酸序列一致性百分比(％)」定義為，在比對序列並在必要時引入缺口以達到最大的序列一致性百分率後，候選核酸序列的核苷酸與參比核酸序列的核苷酸相一致的百分率。為判定核酸序列一致性的百分比的目的而進行的比對，可以用本領域技術範圍內的各種途徑完成，例如，用可公開獲得的計算機軟體如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。測定序列比對的適用參數，包括為了實現與待比較序列的最大限度全長比對所需的任何算法，可通過已知方法測定。
為本文的目的，給定的核酸序列C與給定的核酸序列D相一致或相對的核酸序列一致性％(或者也可表達為給定的核酸序列C與給定的核酸序列D具有或包含一致或相對的一定的核酸序列一致性％)，計算如下 100乘以W/Z的分數 其中W是通過序列比對程序在C和D的程序比對中被評價為相同匹配的核苷酸數量，其中Z是D中核苷酸的總數。應當了解核酸序列C的長度並不等於核酸序列D的長度，C與D的核酸序列一致性％並不等於D與C的核酸序列一致性％。
術語「植物」用的是其最寬的含義。它包括但不僅限於，任何種類木本的、觀賞或裝飾性的、農作物或穀物、水果或蔬菜植物、和光合綠藻(如萊因衣藻[Chlamydomonas reinhardtii])。它也指主要分化為存在於植物發育任何階段的結構的多個植物細胞。所述結構包括但不僅限於，水果、芽、莖、葉、花瓣等。術語「植物組織」包括分化和未分化的植物組織，包括存在於根、芽、葉、花粉、種子和根瘤，以及培養細胞(如單細胞、原生質體、胚、愈傷組織等)中的植物組織。植物組織可以是在植物(planta)中，在器官培養、組織培養或細胞培養中。術語「植物部分」用在本文中指植物結構、植物器官、或植物組織。
非天然存在的植物指沒有人類幹預不會自然出現的植物。非天然存在的植物包括轉基因植物和以非轉基因方法如植物育種產生的植物。
術語「植物細胞」指植物的結構和生理單位，包括原生質體和細胞壁。植物細胞可以是分離的單細胞或培養細胞的形式，或者作為更高組織單位的一部分，如舉例，植物組織、植物器官或整株植物。
術語「植物細胞培養」指植物單位的培養，如舉例原生質體，細胞培養的細胞，植物組織、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和各個發育階段的胚的細胞。
術語「植物材料」指葉、莖、根、花或花的各部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養物、或植物的任何其它部分或產物。
「植物器官」指植物清楚可見的結構和分化部分，如根、莖、葉、花蕾或胚。
「植物組織」指構成結構和功能單位的植物細胞群。包括不管是植物中或是培養中的任何植物組織。該術語包括但不僅限於，整株植物、植物器官、植物種子、組織培養以及構成結構和/或功能單位的植物細胞的任何群。該術語結合或不結合以上列舉或者其它被本定義包含的任何特定類型的植物組織的應用，並沒有意欲排除任何其它類型的植物組織。
「質粒」的命名是小寫「p」前綴和/或跟著大寫字母和/或數字。本文的起始質粒或者有市售，可以不受限制地公開得到，或者能從已有質粒依照發表的程序構建。另外，與所述質粒等同的質粒是本領域已知的，並且對普通技術人員而言是顯見的。
本文所用的「多肽」通常指具有超過大約十個胺基酸的肽和蛋白。多肽可以是「外源性的」，意味著它們是「異源性的」，即對於要用的宿主細胞是外來的，如通過細菌細胞產生的人類多肽。
「靈長類」釋義為表示哺乳動物一個目的任何動物，包括人類、猿、猴、和相關形式，如狐猴(lemurs)和跗猴(tarsiers)。
術語「啟動子」指調節性核酸序列，通常位於基因或蛋白編碼序列的上遊(5』)，其與各種元件結合，負責調節基因或編碼蛋白的序列的表達。適合用於本公開的構建體中的啟動子，在所用的植物中和宿主中的功能是表達本發明的多核苷酸。很多植物啟動子是公眾所知的。其包括組成型啟動子、誘導型啟動子、組織-和細胞-特異的啟動子、以及發育調節啟動子。示例的啟動子和融合啟動子描述於例如美國專利6,717,034中，在此全文引入作為參考。
「純化」意思是通過從組合物中除去(完全或部分)至少一種汙染物，提高組合物中物質的純度。「純化步驟」可以是產生「基本純淨」的組合物的整個提純過程的一部分。以組合物的總重量計，基本純淨的組合物含有至少約90重量％的所關注的物質，並能含有至少約95重量％。
術語「調節元件」或「控制元件」指控制轉錄啟動的DNA序列。控制或調節元件的實例包括但不限於，TATA盒、操縱子、增強子等。控制或調節元件包括負控制元件和正控制元件。負控制元件是為了激活要除去的。已知有很多這類負控制元件，例如操縱子/阻遏蛋白體系。例如，將IPTG與lac阻遏蛋白結合，從lac操縱子上解離，激活並許可轉錄。其它負控制元件包括大腸桿菌(E.coli)trp和λ系統。正控制元件是為了激活要添加的。已知有很多這類正控制元件。
天然含有正負調節元件二者的啟動子很罕見。metE啟動子是一個例子。參見例如，Neidhardt，Ed.，1996，Escherishia coli and Salmonella，第二版，p1300-1309。已知的正和負控制元件的描述可以在，舉例，該參考文獻中找到。正和負控制元件在啟動子內部或鄰近啟動子的位置安排以達到對啟動子增加的調節是已知的，這記述在例如Escherishiacoli and Salmonella(Supra)，p1232-1245中。
小RNA分子通常是長度少於200個核苷酸的單鏈或雙鏈RNA分子。這樣的分子通常少於100個核苷酸，並且長度通常在10-100個核苷酸內變化。在優選的形式中，小RNA分子具有11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個核苷酸。小RNA包括微小RNA(miRNA)和小幹擾RNA(siRNAs)。miRNA是由Dicer-like酶裂解短的莖環狀前體而生成；而siRNA是通過裂解長的雙鏈RNA分子而產生。MiRNA是單鏈，而siRNA是雙鏈。
術語″siRNA″意思是小幹擾RNA，其是無毒性、長度短的雙鏈RNA。一般而言，只要它沒有表現出毒性，對siRNA的長度沒有具體限制。″siRNAs″長度可以是15至49bp，優選15至35bp，更優選21至30bp。或者，要表達的siRNA的終轉錄產物的雙鏈RNA部分可以是，例如，長度為15至49bp，優選15至35bp，更優選21至30bp。SiRNA的雙鏈RNA部分，其中兩條RNA鏈的配對並不限於完全配對的鏈，可以含有由於錯配(相應的核苷酸不互補)、膨出(在一條鏈上缺少相應的互補核苷酸)等而沒有配對的部分。可以含有不配對部分至它們不幹擾siRNA形成的程度。本文用的「膨出」優選包含1-2個不配對核苷酸，並且siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區優選含有1-7個膨出，更優選1-5個。另外，這裡用的「錯配」包含在siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區，優選數目有1-7個，更優選1-5個。在優選的錯配中，核苷酸之一為鳥嘌呤，另一個是尿嘧啶。這種錯配是由於編碼有義RNA的DNA中，C至T、G至A或其混合的突變，但並不特別限於這些。另外，在本發明中，siRNA中兩條RNA鏈配對的雙鏈RNA區，可以含有膨出和錯配二者，其總數優選1-7，更優選1-5。
只要siRNA由於它的RNAi作用而能沉默、減少或抑制靶基因表達，則siRNA的末端結構可以是平頭或粘性(突出)的。粘性(突出)的末端結構不僅限於3』突出端，也可以包括5』突出結構，只要其能誘導RNAi作用。另外，突出的核苷酸的數量不限於已經報導的2或3個，只要該突出端能誘導RNAi作用，可以是任何數目。例如，突出端由1-8個，優選2-4個核苷酸組成。在此，有粘性末端結構的siRNA的總長度表示為，配對雙鏈部分和兩端含有的一對突出單鏈的長度總和。例如，在有19bp雙鏈RNA部分並在兩段帶有4個核苷酸突出端的情況下，總長度表示為23bp。另外，由於該突出序列對靶基因的特異性低，它並不必然與靶基因互補(反義)或相同(有義)。還有，只要siRNA能對靶基因保持其基因沉默作用，siRNA可以在，例如其一端的突出部分，含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。
另外，″siRNA″的末端結構並不必然如上所述在兩端是截斷結構，而是可以有莖-環結構，其中雙鏈RNA一側的兩端通過接頭RNA而連接。雙鏈RNA區(莖-環部分)的長度可以是，例如，15-49bp，優選15-35bp，更優選21-30bp長。或者，作為要表達的siRNA終轉錄產物的雙鏈RNA區長度為，例如15-49bp，優選15-35bp，更優選21-30bp長。此外，對接頭的長度沒有具體限制，只要其長度不妨礙莖部分的配對。例如，為了莖部分的穩定配對和抑制編碼該部分的DNA之間的重組，連接部分可以具有三葉草tRNA結構。即使該接頭的長度妨礙了莖部分的配對，但也可能，例如，構建該接頭部分包括內含子，使內含子在前體RNA加工為成熟RNA期間被切除，從而使莖部分配對。在莖-環siRNA的情況下，沒有環結構的RNA的任一端(頭或尾)可以具有低分子量RNA。如上所述，該低分子量RNA可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA或病毒RNA，或者人工RNA分子)。
「信號肽」指引導蛋白翻譯後轉運的短(15-60個胺基酸長度)肽鏈；通常引導該肽進入細胞的分泌途徑。
「轉化的」、「轉基因的」、「轉染的」和「重組的」指宿主生物體如細菌或植物，其中引入了異源核酸分子。核酸分子可以穩定整合在宿主的基因組中，或者核酸分子也能作為染色體外的分子存在。這樣的染色體外分子可以自我複製。應理解轉化的細胞、組織或植物不僅包括了轉化過程的最後產物，也包括了其轉基因的後代。「非轉化的」、「非轉基因的」或「非重組的」宿主指野生型生物體，如細菌或植物，其不含有異源核酸分子。
「轉化細胞」指通過例如分子生物技術，在細胞內引入了核酸分子的細胞。用在這裡，術語轉化包括了可能將核酸分子引入所述細胞，植物或動物細胞的所有技術，包括用病毒載體轉染、用農桿菌(Agrobacterium)轉化、用質粒載體、用電穿孔引入裸DNA、脂質轉染、和粒子槍轟擊，並包括瞬時的以及穩定的轉化體。
術語「轉基因植物」指含有通常不會在這種類型的植物或樹木中發現的重組基因材料，並通過人類的操作將其引入所述植物(或植物的親本)中的植物或樹木。因此，從通過轉化導入了重組DNA的植物細胞生長而成的植物，是轉基因植物，還有含有該引入的轉基因(不管是有性產生或是無性產生)的該植物所有後代。應當理解術語轉基因植物包括整株植物或樹木以及植物或樹木的部分，例如穀粒、種子、花、葉、根、果實、花粉、莖等。
術語「翻譯起始增強子序列」，用在這裡，指能確定基因的翻譯起始部位和效率的核酸序列(參見，例如，McCarthy等，1990，Trends inGenetics，678-85)。翻譯起始增強子序列可延伸包括結合到相對於核糖體結合位點5』和3』方向的序列。核糖體結合位點定義為至少包括Shine-Dalgarno區和起始密碼子，以及之間的任何鹼基。另外，翻譯起始增強子序列可以包括未翻譯的前導序列和上遊順反子的末端，並進而含有翻譯終止密碼子。參見，例如，美國專利5,840,523。
術語「載體」指用於把多核苷酸序列導入宿主細胞，從而產生轉化的宿主細胞的核酸分子。「載體」除了上述基因構建體之外，還可以包括遺傳材料，例如，使其在一種或多種宿主細胞中複製的一種或多種核酸序列如複製起點、可選擇的標記基因和其它本領域已知的遺傳元件(如，將遺傳材料整合在宿主細胞基因組中的序列，等)。
2.
具體實施例方式 抗線蟲的轉基因植物 已經發現，通過下調一種或多種線蟲寄生基因來打斷線蟲的進食周期，是減少、預防或治療植物線蟲病的有效方法。線蟲寄生基因指在食道腺細胞表達、編碼從腺細胞運送並要通過線蟲口針釋入宿主組織的分泌蛋白的基因。特別是已經發現，幹擾線蟲分泌的與宿主植物中專門的取食細胞的形成有關的蛋白的表達，是減少、處理或治療植物線蟲病的有效方法。能夠作為目標的(例如帶有抑制性RNA)、編碼分泌蛋白的代表性寄生基因包括，包括但不限於表2中列舉的基因，或其片段。
線蟲病導致有價值的農作物的重大損失。根結線蟲，根結線蟲(Meloidogyne)種類，是在自然界最成功的寄生蟲之一。它們寄生於各科植物的超過2000種植物，並代表著對世界範圍內農作物產量的巨大威脅。這些活體營養病原體已經發展出了與其宿主高度相關的專門化的和複雜的取食關係。成功的線蟲-宿主相互作用需要來自寄生蟲的分子信號，以直接或間接修改植物根細胞成為精製的取食細胞，稱為巨大細胞，這是線蟲發育和繁殖所需營養的唯一來源。植物-寄生線蟲在取食時通過能伸出的中空口針釋放蛋白樣的分泌物進入植物細胞。這些分泌物，共稱為寄生蟲質(parasitome)，由在大的、轉錄活性食道腺細胞表達的寄生基因編碼(Davis，E.L.，R.Allen，和R.S.Hussey.1994.Developmental expression of esophageal gland antigens and theirdetection in stylet secretions of Meloidogyne incognita.Fundam.Appl.Nematol.17255-262.；Hussey，R.S.，E.L.Davis，和T.J.Baum.2002.Secrets in secretionsgenes that control nematode parasitism of plants.Braz.J.Plant Physiol.14183-194.)。根結線蟲類誘發以形成巨細胞的複雜的細胞修改，是宿主根細胞基因表達改變以及被通過線蟲口針分泌的分子信號所引發的表現型改變的結果。
一種實施方案提供了包含一種或多種抑制性RNA的植物或細胞，所述RNA對一種或多種線蟲寄生基因的一種或多種mRNA特異。例如，本公開提供了表達一種或多種抑制性RNA的轉基因植物，所述RNA在一種或多種抑制性RNA被線蟲吸收或攝取時，下調線蟲寄生基因的表達。轉基因植物可以設計為表達抑制性RNA，所述RNA至少在兩種不同的線蟲種類中，例如，兩種不同的RKN種類中，下調靶寄生基因的轉錄。另一種實施方案提供了含有抑制性RNA的轉基因植物，所述RNA在3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多的線蟲種類中，例如RKN種類中，下調靶寄生基因的轉錄。因此，本公開提供了對抗多種RKN種類導致的疾病的轉基因植物。
另一種實施方案，提供了含有抑制性RNA的轉基因植物，所述RNA對於一種或多種線蟲寄生基因特異，其含量能有效提供植物對抗所有的RKN種類的抗性，例如在Jepson，S.B.1987.Identification ofroot-knot nematodes(Meloidogyne species).C.A.B.International，Oxford，United Kingdom.p1-265中提到的RKN種類，在許可的情況下，全文引入作為參考。
另一種實施方案提供了含有或表達一種或多種抑制性核酸的轉基因植物或轉基因細胞，所述核酸對於至少一部分編碼寄生線蟲的一種或多種分泌性多肽的核酸是特異的。抑制性核酸通常是抑制性小RNA或微小RNA，其對編碼線蟲食道腺細胞蛋白或多肽的mRNA特異。本領域技術人員應該體會，抑制性核酸可以是RNA、DNA或其組合。抑制性核酸可以是單鏈或多鏈，並可以是反義的或酶的。在一種實施方案中，抑制性核酸幹擾、抑制或減少靶mRNA的翻譯。例如，抑制性核酸可以與靶mRNA結合，誘導或促進靶mRNA的降解或物理性阻止細胞翻譯機器將靶mRNA翻譯成功能蛋白。對分泌性多肽的抑制可以與對照比較，例如，不含或不表達抑制性核酸的植物或細胞。「對照」指材料的樣品，已知其與含有本公開的抑制性核酸的樣品在各方面都相同，只除了對照樣品不含有或不表達抑制性核酸。
術語「食道腺細胞蛋白或多肽」指由線蟲寄生基因編碼的分泌性多肽。在一種實施方案中，要被下調的食道腺細胞蛋白或多肽通常是調節至少一種宿主植物基因表達的分泌蛋白。在公開的組合物和方法中被下調的示例性線蟲多肽，包括但不限於由SEQ ID NOs 1、2或5-51或者其片段編碼的多肽或其片段。分泌性多肽可以直接或間接增加或減少宿主基因的表達。例如，當食道腺細胞蛋白或多肽結合到宿主植物核酸(包括基因組DNA，RNA和mRNA)上時，可發生直接調節。例如，當多肽與一種或多種其它蛋白或因子結合，形成複合體時，可以發生間接調節。然後，該複合體可以與宿主植物核酸結合，或者促進或者抑制轉錄或翻譯。分泌蛋白的下調緩解或減少了至少一種與線蟲病有關的症狀。線蟲病的示例性症狀包括但不限於，產生蟲癭、巨細胞、枯斑(lesion)、矮小(stunting)、養分和水分缺乏、梢枯(diebaek)、以及植物感染的線蟲數量。轉基因植物或細胞中，線蟲病水平的減少或抑制可以與對照植物或細胞中線蟲病的水平相比較。在一種實施方案中，抑制性核酸減少、抑制、減輕、治療或預防了線蟲病。
在另一種實施方案中，待下調的食道腺細胞蛋白或多肽由與巨細胞形成有關的寄生基因所編碼。在另外的實施方案中，靶寄生基因編碼涉及線蟲通過根組織遷移的的多肽或核酸，改變細胞代謝、在受體細胞中引起信號轉導、或形成能使線蟲從巨細胞取食的取食管。另外，食道腺細胞蛋白或多肽能導致細胞壁改變，並可能在細胞外空間與信號轉導受體相互作用，影響細胞代謝、細胞周期、選擇性蛋白降解、局部防禦反應以及在植物細胞核內部調節活性。
食道腺細胞蛋白或多肽調節的植物基因實例，包括但不限於與已知稱為巨細胞的線蟲專門取食細胞的形成有關的基因。例如，線蟲寄生基因16D10編碼與稻草人樣(scarecrowlike)轉錄調節子結合的蛋白。能被線蟲食道腺細胞多肽調節的代表性植物基因，包括但不限於WUN1，POX，CAT，GST，Mia-1，Mia-2，Mia-3，Mia-4，CHS1-CHS3，LOX，幾丁質酶，胰蛋白酶抑制劑，甜味誘發蛋白(Miraculin)，HMGR，TSW12，LEAU，LEMMI9，C6-19，C27-45，TASU，UBC DB#103，RPE，ISDGh，IPPP，LPPL，mUCp，內膜蛋白，20s蛋白酶體，DAP脫羧酶，GRP，ENOD40，ATA01或其組合(Gheysen，G.and Fenoll，C.2002.Annual Review of Phytopathology 40191，許可的情況下，全文引入作為參考)。通常，植物基因直接或間接涉及根細胞生長、根細胞分裂或被寄生線蟲攝取的特定營養物的產生。基因可以在根細胞或植物的任何其它細胞中表達。
一種實施方案中，當抑制性核酸遞送到線蟲中時，與對照比較，線蟲的靶分泌蛋白的表達被減少、受抑或阻斷。遞送抑制性核酸可以，舉例，由於線蟲食用轉基因植物或細胞而使線蟲與抑制性核酸接觸的時候完成。線蟲可以在取食期間攝取抑制性核酸，或者核酸可以通過主動運輸或被動擴散跨越線蟲的細胞膜而運輸。應該理解，抑制性核酸可以與誘導或促進線蟲攝取抑制性核酸的藥劑組合或交替遞送。誘導劑的實例包括但不限於間苯二酚(3-羥基苯酚)。
在一種實施方案中，轉基因植物或轉基因細胞表達抑制性核酸的量足以在抑制性核酸遞送到線蟲中時，在線蟲中調節線蟲食道腺細胞多肽或蛋白的表達。抑制性核酸在轉基因植物或細胞中的表達水平，可以用本領域已知的方法控制，例如用帶有強啟動子或組成型活性啟動子、高拷貝數載體等。植物或細胞可以是被穩定或瞬時轉染。
寄生線蟲的實例包括但不限於，根結線蟲(Meloidogyne spp.)類的成員，也稱作根結線蟲(root-knot nematode)。代表性的種包括但不限於花生根結線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯根結線蟲和禾穀類根結線蟲(M.naasi)。
代表性的宿主植物的系統科包括爵床科(Acanthaceae)，槭樹科(Aceraceae)，獼猴桃科(Actinidiaceae)，龍舌蘭科(Agavaceae)，番杏科(Aizoaceae)，莧科(Amaranthaceae)，番荔枝科(Annonaceae)，傘形科(Apiaceae)，夾竹桃科(Apocynaceae)，天南星科(Araceae)，五加科(Araliaceae)，棕櫚科(Arecaceae)，馬兜鈴科(Aristolochiaceae)，鳳仙花科(Balsaminaceae)，金刀木科(Barringtoniaceae)，落葵科(Basellaceae)，小檗科(Berberidaceae)，樺木科(Betulaceae)，紫葳科(Bignoniaceae)，紅木科(Bixaceae)，木棉科(Bombacaceae)，紫草科(Boraginaceae)，黃楊科(Buxaceae)，刺果藤科(Byttneriaceae)，仙人掌科(Cactaceae)，雲實科(Caesalpiniaceae)，美人蕉科(Cannaceae)，山柑科(Capparaceae)，忍冬科(Caprifoliaceae)，番木瓜科(Caricaceae)，石竹科(Caryophyllaceae)，木麻黃科(Casuarinaceae)，木麻黃科(Casuarinaceae)，衛予科(Celastraceae)，藜科(Chenopodiaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，金粟蘭科(Chloranthaceae)，鴨蹠草科(Commelinaceae)，旋花科(Convolvulaceae)，山茱萸科(Cornaceae)，榛木科(Corylaceae)，景天科(Crassulaceae)，葫蘆科(Cucurbitaceae)，柏科(Cupressaceae)，桫欏科(Cyatheaceae)，莎草科(Cyperaceae)，四數木科(Datiscaceae)，五椏果科(Dilleniaceae)，薯蕷科(Dioscoreaceae)，川續斷科(Dipsacaceae)，柿科(Ebenaceae)，杜鵑花科(Ericaceae)，大戟科(Euphorbiaceae)，蝶形花科(Fabaceae)，大風子科(Flacourtiaceae)，荷包牡丹科(Fumariaceae)，龍膽科(Gentianaceae)，牻牛兒苗科(Geraniaceae)，苦苣苔科(Gesneriaceae)，銀杏科(Ginkgoaceae)，草海桐科(Goodeniaceae)，藤黃科(Guttiferae)，血皮草科(Haemodoraceae)，金縷梅科(Hamamelidaceae)，蠍尾蕉科(Heliconiaceae)，田基麻科(Hydrophyllaceae)，金絲桃科(Hypericaceae)，鳶尾科(Iridaceae)，胡桃科(Juglandaceae)，燈心草科(Juncaceae)，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科(Lauraceae)，百合科(Liliaceae)，亞麻科(Linaceae)，半邊蓮科(Lobeliaceae)，馬錢科(Loganiaceae)，幹屈菜科(Lythraceae)，木蘭科(Magnoliaceae)，金虎尾科(Malpighiaceae)，錦葵科(Malvaceae)，竹芋科(Marantaceae)，野牡丹科(Melastomataceae)，楝科(Meliaceae)，防己科(Menispermaceae)，含羞草科(Mimosaceae)，桑科(Moraceae)，芭蕉科(Musaceae)，苦檻藍科(Myoporaceae)，楊梅科(Myricaceae)，肉豆蔻科(Myristicaceae)，桃金孃科(Myrtaceae)，紫茉莉科(Nyctaginaceae)，木犀科(Oleaceae)，柳葉菜科(Onagraceae)，蘭科(Orchidaceae)，Othnaceae，酢漿草科(Oxalidaceae)，芍藥科(Paeoniaceae)，露兜樹科(Pandanaceae)，罌粟科(Papaveraceae)，胡麻科(Pedaliaceae)，商陸科(Phytolaccaceae)，松科(Pinaceae)，胡椒科(Piperaceae)，海桐花科(Pittosporaceae)，車前科(Plantaginaceae)，懸鈴木科(Platanaceae)，白花丹科(Plumbaginaceae)，禾本科(Poaceae)，川薹草科(Podostemaceae)，花荵科(Polemoniaceae)，遠志科(Polygalaceae)，馬齒莧科(Portulacaceae)，報春花科(Primulaceae)，山龍眼科(Proteaceae)，石榴科(Punicaceae)，毛茛科(Ranunculaceae)，木犀草科(Resedaceae)，鼠李科(Rhamnaceae)，薔薇科(Rosaceae)，茜草科(Rubiaceae)，芸香科(Rutaceae)，楊柳科(Salicaceae)，檀香科(Santalaceae)，無患子科(Sapindaceae)，瓶子草科(Sarraceniaceae)，虎耳草科(Saxifragaceae)，玄參科(Scrophulariaceae)，菝葜科(Smilacaceae)，茄科(Solanaceae)，梧桐科(Sterculiaceae)，安息香科(Styracaceae)，檉柳科(Tamaricaceae)，杉科(Taxodiaceae)，堅果番杏科(Tetragoniaceae)，山茶科(Theaceae)，假輪葉科(Theophrastaceae)，瑞香科(Thymelaeaceae)，椴樹科(Tiliaceae)，旱金蓮科(Tropaeolaceae)，時鐘花科(Turneraceae)，香蒲科(Typhaceae)，榆科(Ulmaceae)，蕁麻科(Urticaceae)，敗醬科(Valerianaceae)，馬鞭草科(Verbenaceae)，堇菜科(Violaceae)，葡萄科(Vitaceae)，澤米蘇鐵科(Zamiaceae)，姜科(Zingiberaceae)，或蒺藜科(Zygophyllaceae)。
根結本公開能被抑制性核酸轉染的宿主植物的通用名，包括但不限於番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆(甜瓜、西瓜等)、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
本領域技術人員應當理解，本公開包括五十種或更多種已知的根結線蟲的任何種類。
另一種實施方案提供了具有抑制性核酸的組合物，所述核酸對於編碼由一種或多種SEQ ID NOs.1、2或5-51或其片段或同源物的多肽的mRNA或其片段有特異性，當遞送到線蟲時，例如當線蟲以表達或含有抑制性核酸的植物或細胞為食時，核酸的量足以抑制由一種或多種SEQ ID NOs.1、2或5-51編碼的多肽或其同源片段。組合物可以含有一種或多種殺線蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑或其組合。代表性的殺線蟲劑包括但不限於三氯硝基甲烷、溴代甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸鈉、四硫代碳酸鈉；以及氨基甲酸鹽如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲醯基肟(aldicarb)、2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃酚(benzofuranol)甲基氨基甲酸鹽(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亞胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺醯基)丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亞硫醯基)苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S.S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。
另一種實施方案提供了含有編碼對mRNA或其片段特異性的抑制性核酸的核酸的細胞，所述核酸，其中mRNA編碼的食道腺細胞蛋白或多肽能夠直接或間接調節根細胞基因表達、線蟲通過根組織的遷移、細胞代謝、信號轉導，或者與線蟲從巨細胞取食的取食管的形成有關，或者至少一種與巨細胞形成有關的植物基因。另外，食管腺細胞蛋白或多肽或食道多肽能導致細胞壁改變，並與信號轉導受體在細胞外間隙中可能相互作用，影響細胞代謝、細胞周期、選擇性蛋白降解、局部防禦反應以及調節植物細胞核內部活性。該細胞可以是原核或真核細胞，並且通常是植物細胞，尤其是根細胞。
另一種實施方案提供了為植物提供線蟲抗性的方法，是將植物與對於一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白特異的一種或多種抑制性核酸接觸，所述核酸的量足以減少線蟲病，其中一種或多種食道腺細胞蛋白調節植物或細胞的基因表達、巨細胞的形成、線蟲通過植物根組織的遷移、植物的細胞代謝、在植物細胞內引發信號轉導、或形成能使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。一個方面提供了對線蟲尤其是根結線蟲分泌的食道腺細胞蛋白特異的抑制性核酸。抑制性核酸可以噴灑到植物上或以其它方式遞送到植物，使得抑制性核酸能與寄生線蟲接觸。
另一個實施方案提供了含有抑制性核酸例如siRNA或微小RNA的轉基因植物或植物細胞，當所述抑制性核酸遞送到取食植物或植物細胞的線蟲中時，其下調根結線蟲的食道腺細胞蛋白。RNA幹涉是本領域已知的。參見例如，Kreutzer等的國際PCT公開WO 00/44895；Zernicka-Goetz等的國際PCT公開WO 01/36646；Fire的國際PCT公開WO 99/32619；Plaetinck等的國際PCT公開WO 00/01846；Mello和Fire的國際PCT公開WO 01/29058；Deschamps-Depaillette的國際PCT公開WO 99/07409；Li等的國際PCT公開WO 00/44914；和Trick等的US20040098761。
在一種實施方案中，線蟲不是大豆胞囊線蟲。
另一種實施方案中，抑制性核酸並不直接致死胚胎或成年線蟲，或者並不與線蟲繁殖能力有關，反而是抑制線蟲從轉基因植物或植物細胞取食或獲取養分的能力。
在一些實施方案中，抑制性雙鏈RNA(dsRNA)來自「外源模板」。這樣的模板可以是植物或線蟲核苷酸序列的全部或部分，它可以是DNA基因序列，或者是從寄生線蟲中分離的mRNA通過例如逆轉錄酶產生的cDNA。當該模板是DNA基因序列的全部或部分時，優選其來自基因的一個或多個或所有的外顯子。當dsRNA來自內源性或外源性模板時，對於可以合成其的方式沒有限制。例如，siRNA可以化學合成，通過體外轉錄產生；用RNase III家族的酶(如Dicer，RNase III)消化長鏈dsRNA產生；從siRNA表達質粒或病毒載體在細胞內表達；或者從PCR衍生的siRNA表達盒在細胞內表達。
然後，體外製備的SiRNA通過轉染、電穿孔或其它方法，被直接導入細胞。或者，可以轉染在細胞內表達siRNA的基於DNA的載體和盒。RNAi可以用手工和/或自動程序，在體外或體內合成。體外合成可以是化學或酶法，例如採用克隆的RNA聚合酶(如T3，T7，SP6)，用於轉錄內源性DNA(cDNA)模板、或二者的混合物。
在體內，dsRNA可以用本領域公知的重組技術合成(例見，Sambrook，等，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Third Edition(2001))。例如，細菌細胞可以用表達載體轉化，所述載體包含dsRNA將從其衍生的DNA模板。或者，可以用表達載體或其它方式轉化需要抑制基因的表達的細胞，例如植物細胞。模板的一個或多個拷貝的雙向轉錄，可以通過該表達載體或不同的表達載體編碼的轉化的細胞的內源性RNA聚合酶，或者克隆的RNA聚合酶(T3，T7，SP6)來編碼。表達構建體的使用和生產是本領域已知的(參見WO98/32016；美國專利5,593,874，5,698,425，5712,135，5,789,214和5,804,693)。基因表達的抑制可以通過以下來靶定器官、組織或細胞類型中的特定轉錄；環境條件(如溫度，化學品)；和/或在發育階段或年齡的工程化的轉錄，特別是例如dsRNA在植物細胞體內合成時。dsRNA還可以用已知的基因遞送系統遞送到特定組織或細胞類型中。這些系統的成分包括種子特異性凝集素啟動子和來自APETALA3的花特異性的啟動子。列舉這些載體只是為了說明有很多市售的和公知的載體可為本領域技術人員所用。
如果在細胞之外合成，RNA可以在導入細胞之前提純。提純可以是用溶劑(如苯酚/氯仿)或樹脂提取、沉澱(例如在乙醇中)、電泳、色譜或其組合。但是，提純可導致dsRNA的丟失，並因此可能完全不能進行或只能最低限度進行。RNA可乾燥儲存或溶解在水溶液中，水溶液可含有緩衝液或鹽以促進退火和/或穩定RNA鏈。
適用的dsRNA也能含有一個或多個修飾的鹼基，或有修飾的主鏈，以增加穩定性或為了其它原因。例如，可以修飾天然RNA的磷酸二酯連接以包含至少一個氮或硫雜原子。此外，也能用含有稀有鹼基如肌苷或修飾鹼基如三苯甲基化鹼基的dsRNA，只提這兩例。應當理解，本領域技術人員已經了解，在RNA上已經進行了各種各樣的修飾，用於多種目的。此處使用的術語dsRNA包括這種化學、酶或代謝修飾的dsRNA形式，前提是前從內源性模板衍生得到。
雙鏈結構可以通過自身互補的RNA單鏈或兩條分開互補的RNA鏈形成。RNA雙鏈體的形成可以在植物細胞之內或之外啟動。
dsRNA至少一條鏈的序列含有與靶mRNA的至少一部分互補的區，足以使dsRNA與靶mRNA特異性雜交。在一個實施方案中，siRNA與靶mRNA的至少一部分基本一致。「一致性」，如本領域所知，是兩種或多種多核苷酸(或多肽)序列之間根據序列比較確定的關係。本領域中，一致性也意味著多核苷酸序列之間的序列關聯度，通過所述序列的鏈間匹配確定。一致性可以很容易地計算出(ComputationalMolecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，N.J.，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
由於有很多測定兩條核苷酸序列之間的一致性的方法，該術語已被技術人員所熟知(Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988).通常用於測定序列之間一致性的方法包括但不限於在Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988))中公開的那些。設計優選的測定一致性方法，在待測序列之間給予最大的匹配。測定一致性的方法在電腦程式中被編碼。測定兩條序列之間的電腦程式法包括但不限於，GCG程序包(Devereux，J.，等，NucleicAcids Research 12(1)387(1984))，BLASTP，BLASTN，and FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403(1990))。本領域中執行該方法的另一個廣為人知的軟體包是CLUSTAL程序。它比較兩條多核苷酸的序列，並通過在任一條適當的序列中通過插入間隔找出最佳比對。最佳比對的一致性也能用諸如BLASTx的軟體包計算。該程序比對了相似序列的最大的一段，並對匹配度(fit)分配了適合的值。對於任何一種比較模式，都可以找到數個相似的區域，每個都有不同的分值。本領域技術人員應理解，長度不同的兩條多核苷酸可以對較長的片段進行全長比較。或者可以比較小區域。通常比較同樣長度的序列用於進行有用的比較。
在一個實施方案中，抑制性核酸與至少一部分靶mRNA具有100％序列一致性。但是，也可用具有70％、80％或超過90％或95％序列一致性的抑制性核酸。從而可容許由於基因突變、株系多態性或進化趨異可以預期的序列變異。
RNA雙鏈體區域可以有能與靶基因基因轉錄體的一部分雜交的核酸序列(如400mM NaCI，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下雜交12-16小時；隨後清洗。) 雖然dsRNA的最佳長度可根據靶基因和實驗條件而變化，但RNA雙鏈區可至少是19，20，21-23，25，50，100，200，300，400或更多鹼基長度。
靶基因是編碼分泌蛋白的線蟲基因，特別是調節下述作用的分泌蛋白植物或細胞的基因表達，巨細胞形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，引發植物細胞中的信號轉導，或形成能讓線蟲從在植物中形成的巨細胞取食的取食管。一個方面提供了對線蟲，特別是根結線蟲分泌的食道腺細胞蛋白特異的核酸。通常，dsRNA或抑制性核酸與靶基因整體基本一致，即基因的編碼部分。但是，dsRNA或抑制性核酸可以與靶基因的部分基本一致。該部分的大小取決於具體靶基因，並可由本領域技術人員通過改變dsRNA大小並觀察是否抑制了基因的表達來測定。
根生長增強的植物 一個實施方案提供了含有或表達一種或多種核酸的轉基因植物或轉基因細胞，所述核酸編碼寄生線蟲的一種或多種線蟲食道腺細胞多肽或其片段。較之非轉基因植物或對照植物，一種或多種線蟲食道腺細胞多肽或其片段在植物或植物細胞中的表達，促進、刺激或增強了轉基因植物的根生長。根包括種子根、不定根、一級側根、二級側根等，飼養根，初生根，次生根，和粗根。
用於公開的實施方案的線蟲食道腺細胞多肽或其片段能增加根的大小、根的數量、根的表面積和根系的整體質量。能用本公開的組合物和方法產生的塊根作物，比不用本公開的組合物和方法的塊根作物要大。本公開的組合物和方法產生的其它作物能夠抗旱、抗腐蝕(erosion)或增大的環境應力。環境應力包括諸如降雨量、溫度和溼度的氣候改變。
線蟲食道腺細胞多肽或其片段包括但不限於，由SEQ ID NOs 1、2或5-51，其片段或其組合編碼的多肽。線蟲食道腺細胞多肽或其片段可直接或間接增進、刺激或加強根生長。例如，在線蟲分泌性多肽與包括基因組DNA、RNA和mRNA的宿主植物核酸結合時，可發生直接調節。間接調節可發生在例如，多肽與一種或多種其它蛋白或因子結合形成複合物時。然後該複合物能與宿主植物核酸結合，或促進或抑制轉錄或翻譯。
在一個實施方案中，轉基因植物或轉基因細胞表達的線蟲食道腺細胞多肽或其片段的量，是有效刺激、增強或促進根生長或發育的量。或者，線蟲食道腺細胞多肽或其片段可以直接遞送到植物。線蟲食道腺細胞多肽或其片段在轉基因植物或細胞中的表達水平可以用本領域已知的方法控制，例如用帶有強啟動子或組成型活性啟動子的載體、高拷貝載體等。植物或細胞能被穩定或瞬時轉染。
線蟲的實例包括但不限於，根結線蟲(Meloidogyne spp.)類的成員，也稱作根結線蟲(root-knot nematode)。代表性的種類包括但不限於花生根結線蟲、南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、北方根結線蟲和禾穀類根結線蟲。
代表性的宿主植物的系統科包括爵床科，槭樹科，獼猴桃科，龍舌蘭科，番杏科，莧科，番荔枝科，傘形科，夾竹桃科，天南星科，五加科，棕櫚科，馬兜鈴科，鳳仙花科，金刀木科，落葵科，小檗科，樺木科，紫葳科，紅木科，木棉科，紫草科，黃楊科，刺果藤科，仙人掌科，雲實科，美人蕉科，山柑科，忍冬科，番木瓜科，石竹科，木麻黃科，木麻黃科，衛予科，藜科，藜科，金粟蘭科，鴨蹠草科，旋花科，山茱萸科，榛木科，景天科，葫蘆科，柏科，桫欏科，莎草科，四數木科，五椏果科，薯蕷科，川續斷科，柿科，杜鵑花科，大戟科，蝶形花科，大風子科，荷包牡丹科，龍膽科，牻牛兒苗科，苦苣苔科，銀杏科，草海桐科，藤黃科，血皮草科，金縷梅科，蠍尾蕉科，田基麻科，金絲桃科，鳶尾科，胡桃科，燈心草科，唇形科(Labiatae)，唇形科(Lamiaceae)，樟科，百合科，亞麻科，半邊蓮科，馬錢科，千屈菜科，木蘭科，金虎尾科，錦葵科，竹芋科，野牡丹科，楝科，防己科，含羞草科，桑科，芭蕉科，苦檻藍科，楊梅科，肉豆蔻科，桃金孃科，紫茉莉科，木犀科，柳葉菜科，蘭科，Othnaceae，酢漿草科，芍藥科，露兜樹科，罌粟科，胡麻科，商陸科，松科，胡椒科，海桐花科，車前科，懸鈴木科，白花丹科，禾本科，川薹草科，花荵科，遠志科，馬齒莧科，報春花科，山龍眼科，石榴科，毛茛科，木犀草科，鼠李科，薔薇科，茜草科，芸香科，楊柳科，檀香科，無患子科，瓶子草科，虎耳草科，玄參科，菝葜科，茄科，梧桐科，安息香科，檉柳科，杉科，堅果番杏科，山茶科，假輪葉科，瑞香科，椴樹科，旱金蓮科，時鐘花科，香蒲科，榆科，蕁麻科，敗醬科，馬鞭草科，堇菜科，葡萄科，澤米蘇鐵科，姜科或蒺藜科。
能根結本公開被編碼RKN食道腺細胞分泌性多肽的核酸轉染的宿主植物的通用名，包括但不限於番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆(甜瓜、西瓜等)、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、苜蓿、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
本領域技術人員應該理解，本公開包括分泌改變宿主基因表達的蛋白的任何線蟲。例如，一種實施方案提供了含有編碼根結線蟲成員分泌的蛋白的核酸的轉基因植物或細胞，其中分泌的蛋白刺激、增強或促進根生長或發育。
另一種實施方案提供了包含具有序列SEQ ID NOs.1、2或5-5 1或其片段或其同源物的核酸的組合物。當該組合物被遞送到植物或植物細胞時，刺激、促進或增強根生長或發育。
還有一種實施方案提供了包含一種或多種由SEQ ID NOs.1、2或5-51或者其同源物被遞送到植物或植物細胞時所編碼的多肽或其片段的組合物。
這裡公開的根刺激組合物可任選含有生長增強劑、肥料、一種或多種殺線蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑或其組合。代表性的殺線蟲劑包括但不限於三氯硝基甲、溴甲烷、1，3-二氯丙烯、甲基二硫代氨基甲酸鈉、四硫代碳酸鈉；以及氨基甲酸鹽如2-甲基-2-(甲基硫代)丙醛O-甲基氨基甲醯基肟(aldicarb)、2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃酚甲基氨基甲酸鹽(carbofuran)、甲基2-(二甲基氨基)-N-[[(甲基氨基)羰基]氧基]-2-氧代硫代乙烷亞胺(oxamyl)、2-甲基-2-(甲基磺醯基)丙醛O-[(甲基氨基)羰基]肟(aldoxycarb)、0，0-二乙基O-[4-(甲基亞硫醯基)苯基]硫代磷酸酯(fensulfothion)、O-乙基S，S-二丙基二硫代磷酸酯(ethoprop)、和乙基-3-甲基-4-(甲基硫代)苯基(1-甲基乙基)氨基磷酸酯(phenamiphos)。
另一種實施方案提供了含有一種或多種編碼線蟲分泌性多肽或其片段的細胞，例如植物細胞，其中線蟲分泌性多肽直接或間接刺激、增強或促進根生長或發育。細胞可以是原核或真核，並通常是植物細胞，特別是根細胞。
還有一種實施方案提供了為植物提供抗乾旱的方法，是將植物接觸有效刺激、促進或增強根發育的量的一種或多種線蟲食道蛋白或編碼線蟲食道蛋白的核酸。組合物可以噴灑在植物上、施用在植物周圍的土壤中或以其它方式遞送給植物，使該組合物與植物接觸。
植物轉化技術 本公開的DNA分子和RNA分子用常規重組DNA技術整合到植物或細菌細胞。通常，本公開的DNA或RNA分子包含在轉化載體中。可使用本領域已知的眾多這類載體系統，如質粒。表達系統的成分可以修飾用以，比如，增加導入的RNA片段的表達。例如，可以採用截斷序列、核苷酸取代或其它修飾。可用本領域已知的表達系統在適當的條件下，實際轉化任何植物細胞。包含本發明DNA分子的轉基因優選是穩定轉化並整合到宿主細胞的基因組中。轉化的細胞優選再生進入整株植物。轉化技術的詳細說明在本領域技術人員的知識範圍內。
報導基因或篩選標記基因可包括在表達盒中。本領域已知的適用報導基因的實例可以在例如下列這些文獻中找到Jefferson等(1991)in Plant Molecular Biology Manual，ed.Gelvin等(Kluwer AcademicPublishers)，pp.1-33；DeWet等(1987)MoI.Cell.Biol.7725-737；Goff等等(1990)EMBO J.92517-2522；Kain等(1995)Bio Techniques19650-655；和Chiu等(1996)Current Biology 6325-330. 用於選擇轉化細胞或組織的篩選標記基因可包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因。適用的篩選標記基因包括但不限於，編碼下列物質抗性的基因氯黴素(Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella等(1983)Nature 303209-213；Meijer等(1991)Plant MoI.Biol.16807-820)；潮黴素(Waldron等(1985)Plant MoI.Biol.5103-108；Zhijian等(1995)Plant Science108219-227)；鏈黴素(Jones等(1987)MoI.Gen.Genet 21086-91)；壯觀黴素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5131-137)；博來黴素(HiIIe等(1990)Plant MoI.Biol 7171-176)；磺醯胺(Guerineau等1990)Plant MoI.Biol.15127-136)；溴苯腈(bromoxynil)(Stalker等(1988)Science 24241 9423)；草甘膦(Shaw等(1986)Science233478481)；草胺膦(phosphinothricin)((DeBlock等(1987)EMBO J.62513-2518). 在轉基因事件的回收中可提供用處但在終產物中可能不需要的其它基因包括但不限於，例如GUS(b-葡萄糖苷酸酶(glycoronidase)；Jefferson(1987)Plant MoI.Biol.Rep.5387)，GFP(綠色螢光蛋白；Chalfie等(1994)Science 263802)，螢光素酶(Riggs等(1987)Nucleic Acids Res.15(19)8115和Luehrsen等(1992)MethodsEnzymol.216397-414)和編碼花青素產物的玉米基因(Ludwig等(1990)Science 247449). 包含與所關注的異源核酸序列可操作地連接的啟動子序列的表達盒，可用於轉化任何植物。以這種方式，可獲得遺傳修飾的植物、植物細胞、植物組織、種子等。
轉化規程以及將核苷酸序列導入植物的規程可以根據轉化靶向的植物類型或植物細胞而改變，即單子葉或雙子葉。將核酸序列導入植物細胞和將序列插入植物基因組的方法包括，顯微注射(Crossway等(1986)Biotechniques 4320-334)，電穿孔(Riggs等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602-5606，農桿菌介導的轉化(Townsend等，U.S.Pat.No.5,563,055；Zhao等WO US98/01268)，直接基因轉移(Paszkowski等(1984)EMBO J.32717-2722)，和彈道顆粒加速(例見，Sanford等，U.S.Pat.No.4,945,050；Tomes等(1995)″Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，″inPlant Cell，Tissue，and Organ CultureFundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等(1988)Biotechnology 6923-926).還參見Weissinger等(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanford等(1987)Particulate Science andTechnology 527-37(洋蔥)；Christou等(1988)Plant Physiol.87671-674(大豆)；McCabe等(1988)Bio/Technology 6923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P175-182(大豆)；Singh等(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(大豆)；Dafia等(1990)Biotechnology 8736-740(水稻)；Klein等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854305-4309(玉米)；Klein等(1988)Biotechnology 6559-563(玉米)；Tomes的美國專利5,240,855；Buising等的美國專利5,322,783和5,324,646；Tomes等(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cellsvia Microprojectile Bombardment，″in Plant Cell，Tissue，and OrganCultureFundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91440-444(玉米)；Fromm等(1990)Biotechnology 8833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等(1984)Nature(London)311763-764；Bowen等的美國專利5,736,369(穀類)；Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845345-5349(百合科)；De Wet等(1985)in The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.Chapman等(Longman，N.Y.)，pp.197-209(pollen)；Kaeppler等(1990)Plant Cell Reports 9415-418 and Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker介導的轉化)；D′Halluin等(1992)Plant Cell 41495-1505(電穿孔)；Li等(1993)Plant Cell Reports12250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(稻子)；Osjoda等(1996)Nature Biotechnology 14745-750(藉助於根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)；這裡的所有文獻均全文合併作為參考。
已轉化的細胞可依照常規技術長成為植物。例見，McCormick等(1986)Plant Cell Reports 581-84。然後這些植物生長，並與相同的轉化株或不同的植株授粉，形成具有可識別的組成型表達所需表現型特徵的的雜交株。可以生長兩代或多代以確保所需表現型特徵的組成型表達被穩定保持和繼承，然後收穫種子確保已經實現所需表現型特徵的組成型表達。
可以用化學調節啟動子通過施用外源化學調節劑調節基因在植物中的表達。取決於目標，啟動子可以是化學誘導啟動子(其中施用化學品誘導基因表達)，或者化學抑制啟動子(其中施化學品抑制基因表達)。化學誘導啟動子本領域已知，包括但不限於，被苯磺醯胺除草劑安全劑活化的玉米1n2-2啟動子，被用作出土前除草劑的疏水親電化合物活化的玉米GST啟動子，和被水楊酸活化的菸草PR-1啟動子。其它感興趣的化學調節啟動子包括類固醇響應啟動子(例見糖皮質激素誘導啟動子，描述於Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810421-10425和McNellis等(1998)Plant J.14(2)247-257)以及四環素誘導和四環素抑制啟動子(例見Gatz等(1991)MoI.Gen.Genet.227229-237，以及美國專利，814,618和5,789,156)，這裡全文引入作為參考。
組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子和其它組成型啟動子，公開於WO 99/43838和美國專利6,072,050；核心CAMV 35S啟動子(Odell等(1985)Nature 313810-812)；水稻肌動蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell 2163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant MoI.Biol.12619-632和Christensen等(1992)Plant MoI.Biol.18675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBO J.32723-2730)；ALS啟動子(U.S.Pat.No.5,659,026)等。其它組成型啟動子包括，例如，美國專利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142。
在需要低水平表達時，可用弱啟動子。通常，「弱啟動子」指在低水平驅動編碼序列表達的啟動子。低水平指大約1/1000轉錄至約1/100,000轉錄至大約1/500,000轉錄的水平。或者，可以認識到弱啟動子也包括僅在一些細胞而不在其它細胞表達，而產生總體低水平表達的啟動子。在啟動子以無法接受的高水平表達的情況下，可以刪除或修飾啟動子的部分序列，降低表達水平。
這樣的弱組成型啟動子包括，例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子(WO 99/43838和美國專利6,072,050)、核心35S CaMV啟動子等。其它組成型啟動子包括，例如，美國專利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142。
可以用「組織偏愛的」啟動子在特定組織內靶向基因表達。組織偏愛的啟動子包括Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata等(1997)Plant Cell Physiol.38(7)792-803；Hansen等(1997)MoI.Gen.Genet.254(3)337-343；Russell等(1997)TransgenicRes.6(2)157-168；Rinehart等(1996)Plant Physiol.112(3)1331-1341；Van Camp等(1996)Plant Physiol.112(2)525-535；Canevascini等(1996)Plant Physiol.112(2)513-524；Yamamoto等(1994)Plant CellPhysiol.35(5)773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20181-196；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138；Matsuoka等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；和Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3)495-505。需要的話，這樣的啟動子可以修飾為弱表達。
「種子偏愛的」啟動子包括「種子特異性」啟動子(在種子發育期間有活性的啟動子如種子儲存蛋白啟動子)以及「種子萌發」啟動子(種子萌發期間有活性的啟動子)二者。見Thompson等(1989)BioEssays 10108，這裡合併作為參考。所述種子偏愛的啟動子包括但不限於，Cim1(細胞分裂素誘導信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶)；和ce1A(纖維素合成酶)。γ-玉米蛋白是優選的胚乳特異性啟動子。Glob-1是優選的胚特異性啟動子。對於雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限於，豆類β菜豆蛋白、napin、β伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。對於單子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限於，玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、糯性蛋白(waxy)、shrunken1、shrunken 2、球蛋白1等。
葉子特異性啟動子本領域已知。例見，Yamamoto等(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105357-67；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)773-778；Gotor等(1993)Plant J.3509-18；Orozco等(1993)Plant MoI.Biol.23(6)1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590。
根偏愛的啟動子是已知的，並可從文獻的很多現有啟動子中選擇，或者從各種相容的品種中重新分離。參見，例如，Hire等(1992)PlantMoI.Biol.20(2)207-218(大豆根特異性穀氨醯胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)1051-1061(在法國菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等(1990)Plant Mol.Biol.14(3)433-443(根癌農桿菌的甘露鹼合成酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；和Miao等(1991)Plant Cell 3(1)1 1′-22(編碼胞質穀氨醯胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達)。還參見美國專利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179。
葉綠體靶向的序列在本領域已知，並包括葉綠體的小亞單位核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)(de Castro Silva Filho等(1996)PlantMoI.Biol.30769-780；Schnell等(1991)J.Biol.Chem.266(5)3335-3342)；5-(烯醇式丙酮)莽草醯-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)789-810)；色氨酸合酶(Zhao等(1995)J.Biol.Chem.270(11)6081-6087)；質體藍素 (Lawrence等(1997)J.Biol.Chem.272(33)20357-20363)；分支酸合酶(chorismatesynthase)(Schmidt等(1993)J.Biol.Chem.268(36)27447-27457)；和捕光葉綠素a/b結合蛋白(LHBP)(Lamppa等(1988)J.Biol.Chem.26314996-14999).還參見Von Heijne等(1991)Plant MoI.Biol.Rep.9104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.26417544-17550；Della-Cioppa等(1987)Plant Physiol.84965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.1961414-1421；和Shah等(1986)Science 233478-481. 轉化葉綠體的方法本領域已知。例見，Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12601-606.該方法依靠粒子槍遞送含有選擇標記的DNA，並通過同源重組將DNA靶向到質體基因組上。另外，通過細胞核編碼並由質粒定向的RNA聚合酶的組織偏愛表達，反式激活沉默的質體-bome轉基因，而實現質粒轉化。這樣的體系已在McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917301-7305中得以報告。
所關注的要靶向到葉綠體上的核酸可通過植物細胞核和該細胞器官之間密碼子使用的差異而優化在葉綠體中的表達。在這種方式中，所關注的核酸可以用葉綠體偏愛的密碼子合成。例見，美國專利5,380,831，本文合併作為參考。
依照本公開的轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，並包括但不限於任何線蟲宿主植物。
構建植物表達盒的要求 在轉基因植物中用於表達的核酸序列首先裝配在位於可在植物中表達的適當的啟動子之後的表達盒中。表達盒還能包含轉基因表達需要的或選擇的任何其它序列。這樣的序列包括但不限於，轉錄終止子、提高表達的外來序列如內含子、關鍵序列、和用於將基因靶定到特定細胞器和細胞區室中的序列。然後這些表達盒能容易地轉移到下文所述的植物轉化載體中。下文說明典型的表達盒的各種成分。
啟動子 表達盒中所用的啟動子的選擇決定了轉基因在轉基因植物中的空間和時間表達模式。所選的啟動子在特定細胞類型(如葉表皮細胞，葉肉細胞，根皮層細胞)或者特定的組織或器官(如根、葉或花)中表達轉基因，該選擇反映了基因產物想要蓄積的部位。或者，所選的啟動子在各種誘導條件下驅動基因表達。
啟動子的強度，即啟動轉錄的能力不同。根據所用的宿主細胞體系，可以用本領域已知的眾多適用啟動子的任何一種。例如，對於組成型表達，可以用CaMV 35S啟動子、水稻肌動蛋白(actin)啟動子、或泛素(ubiquitin)啟動子。例如，對於可調節的表達，可以用來自菸草或擬南芥的化學可誘導的PR-1啟動子(例見，美國專利5,689,044)。
適用的啟動子類別是損傷誘導的。據記述許多啟動子都在損傷部位表達。優選的這類啟動子包括下列文獻所述者Stanford等MoI.Gen.Genet.215200-208(1989)，Xu等Plant Molec.Biol.22573-588(1993)，Logemann等Plant Cell 1151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Biol.22783-792(1993)，Firek等Plant Molec.Biol.22129-142(1993)，和Warner等Plant J.3191-201(1993). 合適的組織特異性表達模式包括綠色組織特異性、根特異性、莖特異性和花特異性。適合在綠色組織中表達的啟動子包括調節參與光合作用的基因的許多啟動子，其中很多已從單子葉植物和雙子葉植物中被克隆。適用的啟動子為來自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動子(Hudspeth & Grula，Plant Molec.Biol.12579-589(1989))。適合根特異性表達的啟動子是de Framond所述者(FEBS 290103-106(1991)；EP0 452 269和來自T-1基因的根特異性表達啟動子。莖特異性的適用啟動子在美國專利5,625,136中有記述，並且其驅動玉米trpA基因的表達。
轉錄終止子 有多種轉錄終止子可用於表達盒。其負責終止超出轉基因的轉錄和其正確的多聚腺苷酸化。合適的轉錄終止子是那些已知在植物中發揮功能者，包括CaMV 35S終止子、tm1終止子、胭脂鹼(nopaline)合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。這些既用於單子葉植物也用於雙子葉植物。
提高或調節表達的序列 已發現來自轉錄單位內的許多序列能提高基因表達，這些序列可以與基因結合使用，增加它們在轉基因植物中的表達。例如，各種內含子序列如玉米Adh1基因的內含子已經表現出能提高表達，特別是在單子葉植物的細胞中。另外，還已知病毒衍生的眾多非翻譯的前導序列能提高表達，這些在雙子葉植物的細胞中尤其有效。
編碼序列的最優化 所選基因的編碼序列可進行基因工程改變編碼序列，用以在所關注的作物品種中最佳表達。修飾編碼序列以實現在特定作物品種中的最佳表達的方法已是眾所周知(例見Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324(1991)；和Koziel等，Bio/technol.11194(1993))。
另一種實施方案提供了直接轉化到質體基因組中的RNA分子。質體轉化技術詳盡地記述在美國專利5,451,513、5,545,817和5,545,818；PCT申請WO 95/16783；和McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，7301-7305之中。葉綠體轉化的基本技術涉及將側翼帶有選擇標記連同所關注的基因的克隆質體DNA區域導入適當的靶組織，如用生物飛彈(biolistics)或原生質體轉化(如氯化鈣或PEG介導的轉化)。1-1.5kb的側翼區，稱為靶序列，促進了與質體基因組的同源重組，並進而使質體基因組的特定區域被替換或修飾。起初，葉綠體16S rRNA和rps12基因中賦予壯觀黴素和/或鏈黴素抗性的點突變，被用作轉化的選擇標記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.，and Maliga，P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，8526-8530；Staub，J.M.，和Maliga，P.(1992)PlantCell 4，39-45)。這些標記之間存在的克隆位點使得產生了導入外來DNA分子的質體靶定載體(Staub，J.M.，and Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。用顯性選擇標記，編碼壯觀黴素解毒酶氨基葡萄糖苷-3』-腺苷轉移酶的細菌aadA基因，替換隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，可得到轉化頻率顯著增加(Svab，Z.，and Maliga，P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，913-917)。以前，該標記已經被成功地用於高頻率轉化綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的質體基因組(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)Nucl.Acids Res.194083-4089)。本領域已知有其它用於質體轉化的選擇標記，並包含在本發明的範圍內。
構建植物轉化載體 植物轉化領域的普通技術人員已知，多種轉化載體可用於植物轉化，並且本公開有關的基因能與任何這類載體結合應用。載體的選擇取決於選擇的轉化技術和轉化的目標品種。對於某些目標品種，優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。轉化中常規用的選擇標記包括npt11基因，其賦予了對卡那黴素和相關抗生素的抗性(Messing & Vierra.Gene 19259-268(1982)；Bevan等，Nature 304184-187(1983))，bar基因，賦予了對除草劑草銨膦(phosphinothricin)的抗性(White等，Nucl.Acids Res 181062(1990)，Spencer等Theor.Appl.Genet 79625-631(1990))，hph基因，賦予了對抗生素潮黴素的抗性(Blochinger &Diggelmann，MoI Cell Biol 42929-2931)，manA基因，在存在甘露糖時允許陽性選擇(Miles and Guest(1984)Gene，3241-48；U.S.Patent No.5,767,378)，和dhfr基因，賦予了對氨甲蝶呤的抗性(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))，和EPSPS基因，賦予了對草甘膦的抗性(U.S.Pat.Nos.4,940,935 and 5,188,642)。
許多載體可用於應用根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉化。它們通常帶有至少一個T-DNA邊緣序列，並包括如pBIN19的載體(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))。適合農桿菌轉化的典型載體包括二元載體(binary vector)pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB 10及其潮黴素選擇衍生物。(例見，美國專利5,639,949)。
不使用根癌農桿菌的轉化避免了所選的轉化載體對T-DNA序列的需求，因此除了如上述含有T-DNA序列的載體之外，利用了缺乏這些序列的載體。不依靠農桿菌的轉化技術包括藉助於粒子轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉化。載體的選擇主要取決於對要轉化的品種的優先選擇。適合非農桿菌轉化的典型載體包括pCIB3064、pSOG 19和pSOG35。(例見，美國專利5,639,949)。
轉化技術 一旦所關注的DNA序列被克隆到表達系統中後，它即被轉化到植物細胞中。轉化的方法和植物再生的方法在本領域中是公知的。例如，Ti質粒載體被用於遞送外源DNA，以及直接攝取DNA、脂質體、電穿孔、顯微注射和微彈(microprojectile)。另外，農桿菌屬的細菌可以用來轉化植物細胞。
轉化雙子葉植物的技術在本領域中是公知的，並包括基於農桿菌的技術和不需要農桿菌的技術。非農桿菌技術涉及通過原生質體或細胞直接攝取外源基因材料。這通過PEG或電穿孔介導的攝取、粒子轟擊介導的遞送或顯微注射實現。在各種情況下，轉化細胞用本領域已知的標準技術，可以再生為整株植物。
大多數單子葉植物品種的轉化現在變得有些常規。優選的技術包括用PEG或電穿孔技術將基因直接轉移進原生質體中、粒子轟擊進入愈傷組織或有組織的(organized)結構中、以及農桿菌介導的轉化。
用本領域已知的方法，經過轉化事件的植物生長、繁殖和育種，產生出具有所需特性的後代，並獲取帶有所需特徵的種子。該方法產生包含本發明RNA片段的植物細胞，其中所述靶基因在所述植物細胞中的表達被所述RNA片段改變，並產生從該植物細胞衍生的植物及其後代、以及源於該植物的種子。
本公開的抑制性核酸或RKN食道腺細胞分泌多肽可單獨使用或作為試劑盒的組分，所述試劑盒具有至少一種進行體外或體內將RNA導入到對象中所必需的試劑。適用的組分是dsRNA和促進dsRNA導入的媒介。這樣的試劑盒也可包括使用說明書，使試劑盒的用戶實施本發明。
另一種實施方案通過將包含雙鏈結構的RNA(所述雙鏈結構具有與靶mRNA的至少一部分互補的核苷酸序列)導入線蟲的宿主植物，提供了對抗線蟲病害的方法；並任選驗證靶mRNA的表達抑制。
一種實施方案通過將植物內或植物上的寄生線蟲與dsRNA接觸，所述dsRNA具有與編碼線蟲分泌蛋白(例如食道腺細胞蛋白)的mRNA至少部分互補的序列，提供了一種治療或預防線蟲病害的方法；其中分泌蛋白調節植物的基因表達。
還有一種實施方案提供了例如含有表達構建體的植物細胞，該構建體編碼形成了雙鏈結構的RNA，所述雙鏈結構具有與編碼線蟲分泌蛋白(例如食道腺細胞蛋白)的靶mRNA的至少部分互補的核苷酸序列，以及提供了含有所述細胞的轉基因植物。
另一種實施方案中，RNA片段包含在兩種不同的RNA分子中。這種情況下，RNA片段在導入所述細胞之前混合，例如在允許其形成雙鏈RNA分子的條件下。在另一種實施方案中，RNA片段依次導入所述細胞。優選，導入每種RNA分子之間的時間間隔短，優選少於一小時。
還有一種實施方案，RNA片段包含在一種RNA分子中。用一種RNA分子，兩個互補RNA片段緊密接近，使得有利於配對和雙鏈形成。這樣的情況下，RNA分子優選能夠摺疊，使包含於其中的所述RNA片段構成雙鏈區。這樣，RNA片段的互補部分能互相識別，彼此配對，並形成雙鏈RNA分子。在另一種實施方案中，RNA片段在導入細胞之前，在使它們能形成雙鏈RNA分子的條件下孵育。另外還有一種實施方案，RNA分子包含有義RNA片段和無義RNA片段之間的接頭。該接頭優選包含由含有功能基因如選擇標記基因的表達盒編碼的RNA序列。在另一種實施方案中，接頭包含由調節序列編碼的RNA序列，如包含內含子加工信號。
另一種實施方案提供了一種dsRNA構建體，其具有與所述dsRNA可操作連接的啟動子，並還可包括所述的dsRNA分子。啟動子可以是異源性啟動子，例如組織特異性啟動子、發育調節啟動子、組成型啟動子、趨異或可誘導啟動子。終止信號也可任選包括在DNA分子中。
單一RNA分子或兩種不同的RNA分子優選能夠形成雙鏈區，其中RNA片段的互補部分彼此識別，互相配對，並形成雙鏈RNA分子。
另一種實施方案以原料、丸粒、顆粒、片狀等形式提供了所公開的轉基因植物材料。這裡公開的抑制性核酸可以是源自上述轉基因植物的種子和種子產物。另一種實施方案提供了一種含有所公開的抑制性核酸的組合物，能塗在種子上。該塗料可以配製成使抑制性核酸在種子成熟和根發育時，能保持抑制線蟲分泌蛋白。
其它的實施方案提供了含有所公開的線蟲食道腺細胞蛋白或其片段的嵌合或融合蛋白。本文所用的「嵌合蛋白」或「融合蛋白」包括與外源多肽連接的線蟲食道腺細胞蛋白或其片段。「外源多肽」是與線蟲食道腺細胞蛋白或其片段不顯著同源的多肽。外源多肽可以融合到線蟲食道腺細胞蛋白或其片段的N-端或C-端。
融合蛋白可包括對配體有高親和力的部分(moiety)。例如，融合蛋白可以是GST融合蛋白，其中線蟲食道腺細胞蛋白或其片段融合到GST的C-端。這樣的融合蛋白可以易於多肽的提純。或者，該融合蛋白可以在其N-端含有異源信號序列。在某些宿主細胞中，蛋白的表達、分泌或運送可通過使用異源信號序列而增加。例如，在植物細胞中，本發明的多肽可以與葉綠體轉運肽融合。葉綠體轉運肽使多肽從植物細胞的細胞質運輸到葉綠體中，從而增加根發育。，已經編碼了融合的部分(如GST多肽)的表達載體可以從市場上得到。編碼線蟲食道腺細胞蛋白或其片段的核酸可以克隆到這樣的表達載體之中，使融合部分符合讀框地連接到多肽上。
下面僅是示範性實施例。應當理解本發明不受限於這些實施例。本公開的其它重要應用可以被本領域普通技術人員容易地認識到。可被本領域普通技術人員潛在認識到的其它用途也是本公開的部分。
本文提到的參考文獻，根據適用的法律所允許的最大限度全文引入。
實施例 實施例1線蟲和植物 根結線蟲品種在溫室生長的番茄(Lycopersicon esculentum cv.Marion或Better-Boy)的根上繁殖。根結線蟲的卵按所述方式收集(Hussey and Barker，1973)。經過孵卵，在25-μm孔篩上將寄生前的二期幼蟲(pre-J2)收集在塑料碗中的去離子水中。通過根混合和篩選，收集南方根結線蟲的不同寄生期(Ding等1998)。用於原位雜交的南方根結線蟲的混合寄生期(MS)，在如De Boer等(1998)所述的卵接種後13-15天收集。相似地，從感染的大豆(Glycine max)的根上收集大豆胞囊線蟲(heterogera glycines)的pre-J2和MS。秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditiselegans)在大腸桿菌(E.coli)的OP50上培養(Brenner，1974)。從生長室生長的菸草(Nicotiana tabacum cv.Petite Havana SR1)和擬南芥生態變種Col-O上，收集一月齡的宿主植物葉子。
實施例2核酸操作 密集(packed)的線蟲Pre-J2用液氮冷凍在1.5ml微量離心管中，並用底部光滑的金屬杆研磨。冷凍的線蟲片段與0.5ml提取液(100mMNaCl，100mM Tris-HCl[pH8.0]，50mM EDTA，1％十二烷基硫酸鈉，4mg/ml蛋白酶K和10μg/ml RNase)混合，並在37℃孵育1小時。DNA用苯酚/氯仿提取，然後用異丙醇沉澱(Sambrook等，1989)。DNA在H2O中再懸浮。菸草和擬南芥的基因組DNA用標準技術提取(Dellaporta 1993)。
用Dynabeads mRNA DIRECT試劑盒(Dynal，Lake Success，NY)，從研磨的植物組織提取和純化mRNA，用10μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水洗脫，並用逆轉錄(RT)-PCR SMART PCR cDNA合成試劑盒(BD Biosciences，Palo Alto，CA)，依照製造商的說明書，轉換成第一鏈cDNA。RT-PCR反應含有下列成分5×第一鏈緩衝液4.0μl，20mMDTT 2.0μl，10mM 50×dNTP 2.0μl，10μM 3′-CDS引物1μl，分離的mRNA 10μl，和Superscript II逆轉錄酶(200單位/μl，Gibco BRL，Rockville，MD)1μl。反應在42℃孵育1小時。
實施例3分離16D10 cDNA克隆 編碼分泌性信號肽的16D10克隆在南方根結線蟲的腺細胞特異性cDNA文庫的隨機測序期間被鑑別(Huang等，2003)，並命名為16D10。pGEM-T Easy載體中的16D10全長雙鏈cDNA序列，通過在測序反應中用T7和SP6引物得到。如SignalP所預測的，16D10 cDNA(364bp)的最長開放閱讀框編碼包括了30aa N-端疏水信號肽的43aa的推導的蛋白(Nielsen等，1997)。雖然13aa(GKKPSGPNPGGNN，Mx 1,223Da)(SEQ ID NO52)的成熟16D10肽沒有提供明顯的BLASTX相似性，但它確實含有擬南芥CLV3-樣蛋白功能結構域的保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO54)的8aa(K-PSGPNP--N)(SEQ IDNO53)(Cock和McCormick，2001)，以及按PROSITE預測的cAMP/cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點[KKpS](Hofmann等，1999)。
實施例4在根結線蟲品種中的基因組克隆 從南方根結線蟲16D10的cDNA序列最末端5』-和3』-端設計的一對基因特異性引物16D10GF(5′-GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTC-S′)(SEQ ID NO55)和16D10GR(δ′-CAGATATAATTTTATTCAG-S『)(SEQ ID NO56)，用於從南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲的200ng基因組DNA擴增相應的基因組序列(或最高同源性的序列)。PCR產物從1.2％瓊脂糖凝膠上切下，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化。提純的產物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega，Madison，W1)中測序。根結線蟲品種的16D10同源物在核苷酸水平享有超過95％的一致性，並且推定的cDNA編碼的推導出的蛋白與南方根結線蟲16D10的蛋白一致。
實施例5Southern印跡分析 每個樣品，10μg基因組DNA以50單位的EcoRI或BamHI(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)完全消化，在0.7％(w/v)瓊脂糖凝膠中分離，轉移到Hybond-N尼龍膜上(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，並用標準規程(Sambrook等，1989)進行印跡。用T7和SP6引物從pGEM-T Easy載體的插入物擴增相應的全長cDNA，產生16D10探針。凝膠純化的PCR產物以PCR-DIG探針合成體系(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)用PCR標記。大約15ngDIG-標記的探針/ml用於每個雜交。在室溫(RT)下，雜交在DIG Easy Hyb液(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)中，於40℃進行16h，隨後用2×SSC/0.1％SDS液清洗2次，每次5分鐘。然後在68℃用0.5×SSC/0.1％SDS液清洗膜兩次，每次30分鐘。在1％阻斷試劑中孵育膜1小時後，膜用綿羊抗-DIG鹼性磷酸酶(AP)結合物的1∶10,000稀釋溶液孵育30分鐘。未結合的抗體通過用馬來酸清洗緩衝液(100mM馬來酸，150mM NaCl，pH7.5，和0.3％Tween 20)清洗兩次，每次15分鐘而清除。膜在AP檢測緩衝液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，和50mMMgCl2)中孵育10分鐘，然後加入化學發光底物3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧雜環丁烷-3，2』-(5』-氯)三環[3.3.1.13，7]癸}-4基)苯基磷酸二鈉(CSPD)(Roche Applied Science)1∶50稀釋液，隨後將膜密封在兩片透明薄膜中並將其暴露在X-線薄膜下1.5小時。含有南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲基因組DNA與16D10 cDNA雜交的印跡，顯示16D10以3-4個拷貝或同源物存在於四種重要的農業根結線蟲種類中(圖6)。沒有檢測到與大豆胞囊線蟲H.glycines、非寄生自由生存的線蟲秀麗隱杆線蟲、和植物(菸草和擬南芥)的基因組DNA的雜交。
實施例6序列分析 在國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)，用BLAST程序PSI-BLASTP和BLASTX，進行序列相似性檢索(Altschul等，1998)。用ClustalW1.8產生了根結線蟲16D10基因組DNA序列的多重序列比對(Jeanmougin等，1994)。對於分泌和切割位點的信號肽的預測藉助於SignalP程序進行(Nielsen等，1997)。
實施例7原位雜交 通過不對稱PCR(Huang等，2003)，16D10 cDNA克隆的特定正向和反向引物，用於合成洋地黃毒甙(DIG)標記的有義和反義cDNA探針(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)等。原位雜交用南方根結線蟲以福馬林固定的、通透化的寄生前幼蟲和混合的寄生期進行(De Boer等，1998；Huang等，2003)。在線蟲內雜交的cDNA探針以鹼性磷酸酶結合的抗DIG抗體和底物檢測，並且標本用複合型光學顯微鏡觀察(DeBoer等，1998)。原位mRNA雜交揭示，16D10在南方根結線蟲的寄生早期，在兩種側腹食道腺細胞中強烈表達。
實施例8免疫螢光分析 按照Goverse等(1994)之前敘述的方法，提純的16D10多克隆抗血清用來以間接免疫螢光法定位16D10在南方根結線蟲的寄生前J2、混合寄生期的切片中的表達。在新鮮配製的含2％多聚甲醛的PBS緩衝液(80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，100mM NaCI，pH7.4)中在40℃固定5天後，線蟲在PBS緩衝液中洗三次，在去離子水中洗一次。固定的線蟲被切成切片，孵育在37℃每ml含有0.6mg蛋白酶K(RocheApplied Science，Indianapolis，IN)的磷酸緩衝鹽水(PBS)緩衝液中1小時。以PBS洗過一次後，部分消化的線蟲放在-80℃冰箱中20分鐘，在乾冰狀冷甲醇中孵育3分鐘，然後在乾冰狀冷丙酮中孵育15分鐘。線蟲用如前所述(Goverse等，1994)的用蛋白酶抑制劑改良的封閉液(10％山羊血清，0.02％NaN3，1mM苯甲基磺醯氟，1×PBS)清洗一次，在4℃下孵育3天，然後立即用於螢光免疫。封閉過的線蟲等分放入96孔Multiscreen板(Millipore，Bedford，MA)的孔中，攪拌在ELISA稀釋劑(0.05％Tween，0.02％NaN3，1％BSA，1×PBS)中1∶250稀釋的16D10純化的多克隆抗體，室溫下在潮溼的艙中過夜。線蟲切片用PBST(1χ×PBS，0.5％Triton X-100)洗三次，每次5分鐘，並在室溫下黑暗中，1∶1000稀釋的螢光素異硫氰酸鹽(FITC)-結合的山羊抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在Tris-鹽水-BSA(0.15M NaCl，0.01MTris，pH7.2，0.2％Triton X-100，3％BSA)中攪拌3小時。切片在PBST中洗兩次，用蒸餾水洗一次。處理的切片在15-μl水滴中被轉移到事先用5μl 0.1％聚-L-賴氨酸(Sigma Chemical)包被的Multitest玻片(ICN-Flow，Horsham，PA)上的單個孔中。切片在玻片上空氣乾燥，用抗淬滅劑(500mM碳酸鹽緩衝液中0.02mg/ml苯二胺，pH8.6，與無螢光的甘油混合)的3μl小滴覆蓋，並用蓋玻片。標本在Olympus螢光顯微鏡下觀察。陰性對照由免疫前的兔血清組成。提純的16D10抗血清結合到寄生前和寄生J2的側腹腺細胞及其細胞質擴展和膨脹壺腹(expanded ampullae)內的分泌顆粒上，其位於掌部的泵室(pumpchamber)後方。在任何的線蟲標本上均沒有觀察到與免疫前的兔血清的特異標記。
實施例9蛋白提取 通過研磨置於液氮的微量離心管中200μl提取緩衝液[100mMTris-HCI，pH7.0，150mM NaCl和1×全蛋白酶抑制劑(completeprotease inhibitors)(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)]內的南方根結線蟲和大豆胞囊線蟲的寄生前J2和混合寄生期，提取線蟲蛋白。通過研磨置於液氮的微量離心管中200μl提取緩衝液[50mM Tris-HCI，pH7.0，150mM NaCl，1×全蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science)]內的轉基因幼苗和根組織，提取植物蛋白(0.5g)。13,000rpm離心10分鐘後，從組織勻漿中回收上清液。用BSA作為標準，評價所有的蛋白濃度(用Bio-Rad Protein Assay Kit II)。作為陽性對照，從Sigma-Genosys，TX合成的16D10肽(GKKPSGPNPGGNN，純度＞95％)(SEQ ID NO52)用於免疫檢測分析(見實施例12-13)。
實施例10採集口針分泌物 按照Davis等(1994)的敘述，在體外產生和採集南方根結線蟲J2的口針分泌物。寄生前J2在室溫的潮溼艙中，在0.4％間苯二酚(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中培育6小時。口針分泌物通過添加等體積的0.1M Tris-NaOH，pH11.0而溶解。溶解的口針分泌物用StrataClean(Stratagene，La JoIIa，CA)濃縮。短時間裡，通過在誘引混合物(460ml)上清液中懸浮1.5ml珠子並將其在恆定的混合下孵育1小時，溶解的分泌蛋白被俘獲。珠子被離心，重新懸浮在2×SDS-PAGE樣品緩衝液中，煮沸3分鐘釋放吸附的蛋白。濃縮的口針分泌物用提純的16D10抗血清，用於酶聯免疫吸附分析(ELISA)和免疫印跡分析(見實施例11-13)。兩種分析均在口針分泌物中，以及南方根結線蟲J2和混合寄生期的總提取物中，鑑別到了16D10。
實施例11生產抗血清 用Eurogentec，Inc.(Herstal，Belgium)的合成的成熟(即不帶N-端信號肽)16D10肽(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO52)免疫兩隻兔子製備16D10抗血清。用肽抗原從15ml最終粗製血清中親和純化抗血清。肽親和純化的16D10多克隆抗血清，用在免疫螢光顯微鏡法(Goverse等，1994)中定位南方根結線蟲標本中16D10的表達，並用在口針分泌物和轉基因植物表達的或體外翻譯的16D10中16D10的免疫檢測。
實施例12Western斑點印跡分析 蛋白質樣品(2μl)點到Hybond ECL硝酸纖維素上。使硝酸纖維素膜空氣乾燥20分鐘。膜在封閉液(2％脫脂奶粉，1×Tris-緩衝鹽水-Tween[TBS-T20mM Tris-HCl，pH7.4，0.8％NaCl，0.1％Tween 20])中37℃孵育過夜，然後用純化的16D10多克隆抗血清(1∶2,000)處理，繼之以抗兔IgG(全分子)鹼性磷酸酶結合物(1∶30,000)(Sigma)處理。膜在1×TBS-T緩衝液中室溫下洗三次，室溫下在底物溶液中(10ml AP緩衝液[100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl]中，45μl硝基藍四唑[NBT]溶液和35μlδ-溴-氯-S-吲哚基-磷酸鹽toluidinium[BCIP]溶液)孵育直至出現顏色。
實施例13ELISA分析 對Pratt等(1986)的方法修改後進行ELISA。Dynatech Immulon板包被有下列來源的硼酸鹽水(0.2M硼酸鈉，75mM NaCl，pH8.5)稀釋的蛋白，4°下過夜1000×濃縮的南方根結線蟲J2的口針分泌物2μl，南方根結線蟲pre-J2、南方根結線蟲MS、大豆胞囊線蟲pre-J2和MS的總提取蛋白10μg，或BSA(Sigma Chemical)10μg作為陰性對照。用100ng合成的16D10肽(純度＞95％，Sigma-Genosys，TX)包被孔，作為陽性對照。用清洗緩衝液(10mM Tris.HCI，pHδ.0，0.5M NaCl)洗孔三次，以PBS(32.9mM Na2HPO4，1.77mM NaH2PO4，0.14M NaCl，pH7.4)的1％BSA室溫下封閉30分鐘。用清洗緩衝液洗一次後，每個包被的孔用被PBS的0.5％BSA液1∶1,000稀釋的純化16D10多克隆抗血清在室溫下孵育1小時。陰性對照包括省略用初級多克隆抗體孵育，和用兔免疫前血清孵育。洗孔三次，用鹼性磷酸酶-結合的山羊抗兔抗體(Sigma Chemical)1∶5,000稀釋，在室溫下孵育1小時，在加入磷酸鹽比色底物之前清洗三次。底物對-硝基苯磷酸鹽根據製造商的說明書，在鹼性磷酸酶緩衝液(1M二乙醇胺，0.5mM MgCl2，pH 9.8)中製備，並在用3N NaOH停止反應前，於室溫下在處理過的孔中孵育30分鐘。在ELISA讀數器上測定405nm和490nm下的吸光度。
實施例14構建質粒 用導入Kpn\或Xba\限制性位點(下劃線處)和終止/啟動密碼子(斜體字)的引物16D10SF(5』-CGGGGIACCLAGATGTTTACTAATTCAATTAA-S′)(SEQ IDNO57)或16D10F(5′-CGGGGTACCTAGATGGGCAAAAAGCCTAGTG-3′)(SEQ IDNO58)和16D10R(5′-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-3′)(SEQID NO59)，從全長cDNA克隆擴增帶有或不帶有信號肽序列的16D10編碼區，克隆到二元載體pBIX的位於CaMV 35S啟動子的控制下的Kpn\和Xba\位點，分別產生pBIX(16D10S)和pBIX(16D10)，並通過測序證實。pBIX從pBI101(BD Biosciences，Palo Alto，CA)衍生而來，含有nos啟動子-nptll-nos終止子盒、35S啟動子-gusA-nos終止子、和帶有具備Kpn\和Xba\位點的多接頭的第二35S啟動子。從擬南芥基因組，用導入Kpn\限制性位點(下劃線者)的引物C3K(5′-GGGGTACCATGGATTCTAAAAGCTTTG-S′)(SEQ ID NO60)和C3R(5′-CCACTAGGCTTTTTGCCAAGGAACAAGAAGCAG-S』)(SEQID NO61)作為信號序列，以及從16D10 cDNA，採用以Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)，使用為成熟肽編碼序列導入Xba\限制性位點(下劃線者)的引物C3F(5』-CTTCTGCTTCTTGTTCCTTGGCAAAAAGCCTAGTGG-S′)(SEQ IDNO62)和16D10X(5′-GCTCTAGATCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO63)，通過PCR擴增生成clv3和16D10雜交表達序列。然後將以上兩種產物用於在融合PCR(fusion PCT)反應中彼此引發。得到的片段克隆到pBIX以產生pBIX(C3S-16D10)，並通過測序驗證。
實施例15轉化菸草毛狀根 質粒pBIX(16D10)、pBIX(16D10S)和作為對照的空載體pBIX，通過電穿孔(Shen and Forde，1989)轉移到髮根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC 15834中，並用髮根農桿菌介導的子葉轉化(Christey，1997)，轉化到菸草中(Nicotiana tabacum cv Petite Havana SR1)。從帶有100mg/L卡那黴素和timentins(230.8mg/L替卡西林二鈉加上7.69mg/L克拉維酸鉀)的含有0.8％Noble瓊脂的Gamborg′s B-5板上，生成了轉化的毛狀根。24℃下，黑暗中培養單個毛狀根稍(約0.5cm)3周，單個毛狀根體系的2-3個根接受GUS-染色(Jefferson等，1987)。經PCR分析證實有卡那黴素抗性並且GUS陽性而沒有細菌汙染的根系，用於建立毛狀根體系。每兩周將根稍在Gamborg′s B-5平板上進行次培養(subculture)，用於在沒有激素的Gamborg’s B-5板上進行根生長分析，切過的根在原來的平板上於24℃黑暗中保持培養用於分析。為了分析根生長，平板在黑暗中水平培養，研究5個來自各轉基因體系的毛狀根，每個重複三次。採用與在轉基因擬南芥的方法中相同的程序，等對按照所述方法(Does等，1991)鑑別的帶有單個轉基因拷貝的轉基因毛狀根或愈傷組織進行有關的RT-PCR和免疫印跡分析。16D10在毛狀根細胞的細胞質中的表達增進了根生長率約65％[在16D10轉基因體系中，2周後平均根長度為5.20±0.61cm(n＝90)，比較之下，對照體系為3.15±0.34cm(n＝90)]，在第5周產生了茂盛的側根，並在根被切下進行次培養之處形成愈傷組織。16D10表達的RT-PCR分析顯示，愈傷組織中穩態mRNA水平高於毛狀根。用純化16D10抗血清進行的免疫印跡分析揭示，16D10在毛狀根和愈傷組織二者中產生。在對照載體轉化的毛狀根中沒有檢測到16D10的表達。
實施例16擬南芥Floral-dip轉化 質粒pBIX(16D10)、pBIX(C3S-16D10)和作為對照的空載體pBIX，以電穿孔(Shen和Forde，1989)導入根癌農桿菌C58C1中，並通過floral dip法(Clough和Bent，1998)，轉化到擬南芥野生型Col-O植株中。卡那黴素抗性、GUS染色(Jefferson等，1987)和16D10的分離(segregate)，與PCR分析結合，證實轉基因純合T2系的產生。反向PCR(Does等，1991)以基因組中的單個轉基因拷貝鑑別純合系，用於分子和根生長分析。每個轉基因系的30株植物，每個重複三次，以16h有光(24℃)/8h黑暗(20℃)的周期，體外培養在帶有3％蔗糖的MS平板上，平板保持垂直以便根生長分析。
產生了四種轉基因擬南芥T2純合子系，其含有在35S啟動子控制下的16D10單個拷貝，沒有信號肽。還產生了來源於空白轉化載體的兩種轉基因系作為對照。RT-PCR和免疫印跡分析證實，16D10在所有的16D10轉基因系中表達，但是不在對照系中表達。與對照比較，16D10在擬南芥細胞的細胞質中的表達增加了初生根的長度達85％[四種16D10轉基因系(n＝90/系)，平均54.01±8.75mm，兩個對照系(n＝90/系)為29.20±4.50mm]，並且側枝和不定根的數量分別增加了1.4倍和2.08倍(圖2和圖3)。初生根生長的增加與側根數量的增加和不定根數量的增加密切相關。3天內根稍生長率的測定顯示，僅在16D10根的分生區有長度增加(20％)，表明細胞數量而不是細胞大小的增加促進了根生長。
實施例17互補實驗 由於成熟16D10肽13aa(GKKPSGPNPGGNN)(SEQ ID NO52)含有擬南芥CLV3-樣蛋白功能區保守C-端13aa基序(KRLVPSGPNPLHN)(SEQ ID NO54)的8aa(K-PSGPNP-N)(SEQ ID NO53)(Cock和McCormick，2001)，以擬南芥CLAVATA3信號肽編碼南方根結線蟲16D10的質粒pBIX(Clv3S-16D10)，藉助於根癌農桿菌C58C1介導的floral-dip轉化(Clough和Bent，1998)，被轉移到擬南芥clv3突變株clv3-1(中間體)、clv3-2和clv3-6中，用於功能互補實驗。作為對照，質粒pBIX(16D10)和pBIX也被導入到clv 3突變體中。還產生了三種轉基因T2純合系用於各自的構建體。按照Fletcher等(1999)的記述，研究16D10轉化的clv3系的表現型(花和莖尖分生組織)並與載體轉化系、擬南芥野生型生態型Col-O以及clv3突變株後代相比較。雖然16D10含有擬南芥CLV3-樣蛋白的功能結構域，但16D10在擬南芥clv3突變株的質外體或細胞質中的表達並沒有恢復野生型表型，表明16D10沒有作為CLV3-樣蛋白的功能。
實施例18組織學分析 擬南芥的初生根被固定和脫水(Dolan等，1993)，用低黏度包埋(Low Viscosity Embedding)試劑盒(Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA)依照製造商的說明書包埋在Spurrs樹脂中。用Reichert-Jung Ultracut E切片機製作薄切片(0.4μM)，並用1％甲苯胺藍染色。根分生組織之內和之上的根橫切片和根稍的縱切片表明，與野生型比較，在轉基因系中，平均細胞大小以及細胞類型和細胞層的數量沒有不同。在我們的轉基因植物中，根形態學也沒有改變，增進生長伴隨著加速根系發育。因此，16D10的異位表達提高了根生長率並誘導側根萌發，可能是通過刺激分生組織中的細胞分裂，增加細胞產生率而不改變分生組織的構成。
實施例19相關RT-PCR 對從等量植物組織中提取的mRNA進行逆轉錄(RT)-PCR。上述的16D10基因特異性引物16D10F和16D10R用在後續的PCR擴增中。在對照中，從擬南芥野生型生態型Col-O中均一表達的UBQ10基因(基因庫登記號NM_202787)設計引物UBQ1(5′-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-S′)(SEQ ID NO64)和UBQ2(5′-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-S′)(SEQ ID NO65)，用於擴增轉基因擬南芥系的483bp獨有序列。引物ActF(5′-CCGGTCGTGGTCTTACTGAT-S』)(SEQ ID NO66)和ActR(5′-GCACCGATTGTGATGACTTG-S』)(SEQ ID NO67)從菸草(N.tabacum cv)Petite Havana SR1均一表達的肌動蛋白基因(基因庫登記號U60494)中設計，用於從轉基因菸草毛狀根中擴增菸草肌動蛋白(Tob104)基因的獨有序列。PCR含有下列成分10×BD Advantage 2PCR緩衝液5μl，10mM dNTP混合物1.0μl，5′引物1.5μl，3′引物1.5μl，cDNA 2μl，水38μl和50×BD Advantage 2聚合酶混合物1.0μl(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。PCR循環的組成為94℃下初始變性步驟2分鐘，隨後是35個循環的94℃下1分鐘、55℃下30秒、72℃下40秒和最後10分鐘72℃下的延伸步驟。每個RT-PCR反應的10微升等分試樣在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳，轉移到尼龍膜上，用相應的DIG-標記的DNA探針雜交。RT-PCR分析表明，16D10轉錄本在16D10轉基因菸草的毛狀根和擬南芥系中穩定存在，但在載體轉化的對照系中缺乏。
實施例20酵母雙雜交篩選 酵母雙雜交篩選中採用了MATCHMAKER酵母雙雜交系統II(BDBiosciences，Palo Alto，CA)。編碼16D10成熟肽的cDNA被按閱讀框克隆進入pGBKT7的GAL4-結合結構域(BD)，產生pGBKT7(16D10)並表達作為誘餌以在pGADT7的GAL4活化結構域(AD)中篩選從番茄根組織的mRNA構建的番茄根cDNA文庫。12個全長編碼SCL的cDNAs(AtSCLI，AtSCL3，AtSCL5，AtSCL6，AtSCLQ，AtSCL13，AtSCL14，AtSCL21，AtSCR，AtSHR，AtRGA，AtGAI)，用各基因的基於基因庫資料庫(Bolle，2004)中相應序列的特定引物，從擬南芥根組織mRNA製成的根cDNA庫進行擴增，並按閱讀框克隆在pGADT7中。各構建體用pGBKT7(16D10)導入酵母菌株AH109。編碼AtSCL6和AtSCL21特定區域的cDNA克隆在pGADT7之中，然後與pGBKT7(16D10)共同轉化到菌株AH109中。包括cDNA文庫篩選、陽性克隆的選擇和β-半乳糖苷酶活性分析的所有程序，依照MATCHMAKER酵母雙雜交系統II(BD Biosciences，Palo Alto，CA)的規程進行。兩種擬南芥SCL蛋白AtSCL.6和AtSCL.21，與16D10在酵母中相互反應。結構域分析表明，16D10與AtSCL.6和AtSCL21的SAW結構域特異性相互反應，但16D10與SCL蛋白的其餘結構域沒有相互反應，顯示了SCL轉錄因子是RKN寄生植物期間分泌的16D10的推定靶標。
實施例21浸透(Soaking)得到RNAi 16D10的42bp和271bp序列用下列引物從全長cDNA克隆分別擴增16D10T7F1(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′)(SEQ ID NO68)和16D10T7R1(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ ID NO69)，和16D10T7F2(5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S)(SEQ ID NO70)和16D10T7R2(5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO71)，各自引入RNA引物位點T7(下劃線者)。用MEGAscript RNAi試劑盒(Ambion，Austin，TX)，按照製造商的說明書，以凝膠純化的PCR產物用作模板，在體外的單一反應中合成16D10RNA的有義鏈和反義鏈，不同的是反應孵育16小時以增加RNA產率。生成的雙鏈(ds)RNA的數量和質量通過標準程序(Sambrook等，1989)估計和定量。dsRNA產物用乙醇沉澱，並重新懸浮在沒有核酸酶的水中，濃度為10-15μg/μl。
大約10,000條新孵化的南方根結線蟲J2浸在含有1mg/ml 16D10dsRNA、1％間苯二酚、0.13mg/ml FITC異構體I、0.05％明膠和3mM亞精胺的1/4M9緩衝液(10.9mM Na2HPO4，5mM KH2PO4，4JmM NH4Cl，和2.2mM NaCl)中，並在旋轉器上室溫下黑暗中孵育4小時。間苯二酚(Res)用來幫助刺激攝取dsRNA。對照樣品在同樣的但沒有間苯二酚或dsRNA的溶液中孵育。浸透後，線蟲通過離心法用不含核酸酶的水徹底清洗5次，用Olympus螢光顯微鏡觀察，處理過的線蟲大約100％攝取FITC，這是攝取dsRNA的標記。用從等量處理過的J2的mRNA合成的cDNA第一條鏈作為模板，用南方根結線蟲組成型表達的肌動蛋白基因(基因庫登記號BE225475)片段擴增的284bp作為對照，以相關RT-PCR分析(relative RT-PCR)對轉基因J2進行分析，確定16D10轉錄體的沉默。根結線蟲二期幼蟲攝取短的或全長16D10 dsRNA，導致了處理過的線蟲中16D10轉錄本顯著減少(圖4)，為用RNAi在根結線蟲體內靶定16D10提供了直接證據。
南方根結線蟲的J2還按上述方法用對8H11(SEQ ID NO17)或31H06(SEQ ID NO33)特異的1mg/ml dsRNA浸透。相關RT-PCR分析揭示，根結線蟲二期幼蟲攝取8H11和31H06 dsRNA，導致了處理過的線蟲中這兩種附加的寄生基因的轉錄本顯著減少(圖5)。
實施例22植物內(In planta)遞送RNAi 用下列分別導入Xho\、Kpn\、Cla\或Xbal限制性位點(下劃線處)的基因特異性引物，從全長cDNA克隆擴增16D10的有義或反義cDNAs(42bp或271bp)16D10Xho1(δ′-CCGCTCGAGGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-S』)(SEQ ID NO72)和16D10Kpn1(5′-CGGGGTACCTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQID NO73)，16D10Cla1(5′-CCATCGATTCAATTATTTCCTCCAGG-S′)(SEQ ID NO74)和16D10Xba1(5』-GCTCTAGAGGCAAAAAGCCTAGTGGGC-3′)(SEQ ID NO75)，16D10Xho3(5′-CCGCTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAG-3′(SEQ IDNO76)和16D10Kpn2(5′-CGGGGTACCGAAATTAACAAAGGAAACC-S』)(SEQ ID NO77)，16D10Cla2(5′-CCAICGAIGAAATTAACAAAGGAAACC-S′)(SEQ IDNO78)和16D10Xba3(5』-GCICIAGACCTCAAAAATACCATAAAG-S′)(SEQ ID NO79)。PCR產物凝膠提純，分別用限制性酶Xho\和Kpn1，或者Cla\和Xba\消化。消化的PCR產物克隆到Xho-Kpn\位點中，或pHANNIBAL的Cla\-Xba\位點中，分別生成pHANNIBAL(16D10#1)和pHANNIBAL(16D10#2)。pHANNIBAL-衍生的質粒的有義和反義16D10cDNA被亞克隆為Not\片段進入二元載體pART27(Gleave，1992)中，產生高度有效的含內含子的「髮夾」RNA(ihpRNA)沉默構建體(Wesley等，2001)。pART27衍生的構建體用電穿孔轉化到根癌農桿菌C58C1中。轉化體在含有利福平(50mg/L)、慶大黴素(25mg/L)和壯觀黴素(100mg/L)的LB培養基上進行選擇，然後通過上述floral-dip轉化導入擬南芥生態型Col-O中。產生了在CaMV35S啟動子下，組成型轉錄16D10特異性ihpRNA的轉基因同源T2系，用於根結線蟲，根結線蟲(Meloidogyne)種類的抗性分析。
實施例23抗性分析 從pART27衍生的構建體轉化生成的擬南芥轉基因系的種子，在70％(v/v)中表面消毒1分鐘，在3％(v/v)的次氯酸鈉中表面消毒5分鐘，然後在無菌蒸餾水中洗5次。消毒的種子在Gamborg′s B-5培養基上發芽和生長3周。消毒南方根結線蟲蟲卵，然後按記載的方法(Sijmons等，1991)，以每株植物約500個卵接種到根部附近。接種後3周，分析感染的根部上的蟲癭數量和大小，接種後8周，感染的根部用酸性品紅按記載(Hwang等，2000)染成紅色，並分析每克根的蟲卵數量。表達16D10 dsRNA的轉基因擬南芥系對四種主要的根結線蟲種類有抗性-南方根結線蟲，爪哇根結線蟲，花生根結線蟲和北方根結線蟲。根蟲癭分析顯示，16D10 dsRNA轉基因擬南芥系上蟲癭的數量(和大小)，與載體轉化系比較，減少了63-90％(圖1A、1B和表1)。線蟲繁殖分析揭示，與對照植物比較，16D10 dsRNA轉基因系每克根的RKN蟲卵數量減少了70-97％(圖7)。
表1 與對照植物比較，接種了四種根結線蟲種類(南方根結線蟲，爪哇根結線蟲，花生根結線蟲和北方根結線蟲)的表達16D10 dsRNA的轉基因擬南芥上蟲癭的產生。
實施例2416d10序列數據 16D10基因組DNA序列(840bp) GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGGT TAGCCA




AATGTTTACTAATTCAATTAA AAATTTAATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTT TTGTCTGTCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCA AATCCTGGAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACG TTTAAATTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAG CTAATTTTGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTG AATTTACTGAATAAAATTATATCTGAAAAAAA(SEQ ID NO1) (粗體是一個476-bp內含子序列) 16D10 cDNA序列(364bp) GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA ATTATTCTTCAATCAAAAAAATGTTTACTAATTCAATTAAAAATTT AATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTG TCTCATTTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTG GAGGAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAAT TAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT GATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTACT GAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA(SEQ ID NO2) 用於製作16D10 RNAi構建體的16D10 cDNA序列區 GAGAAAATAAAATATAAATTATTCCTCAAAAATACCATAAAGTTA ATTATTCTTCAATCAAAAAAArGTTTACTAATTCMTTAAAAATTTA ATTATTTATTTAATGCCTTTAATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGT CTCATTTGTGGATG


AAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAA TTAAACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTT TGATGGTTTCCTTTGTTAATTTCAACATAAAATTAATTGAATTTAC TGAATAAAATTATATCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO2)[粗體42-bp序列用於構建pHANNIBAL(16D10#1)，下劃線的271-bp序列用於構建pHANNIBAL(16D10#2)] pHANNIBAL(16D10#1) (a)構建體(Xho\+42bp 16D10有義鏈序列+Kpn\＝54bp)+Pdk內含子+(C/a1+42bp 16D10反義鏈序列+Xba\＝54bp) Xho1 CICGAGGGCAAAAAGCCT AGTGGGCCAAATCCTGGAGGAAAT AATTGAGGIACC.............. .Kpn\........... ..........................Pdk內含 子........................................... ........................................... C/a1 ATCGATTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCACTAGGCTTT TTGCCICIAGA Xba1 SEQ ID NO3) (b)PCR檢測引物H1 F1 & H1 R1(234bp PCR產物) 引物H1 F2 & H1 R2(273bp PCR產物) pHANNIBAL(16D10#2) (1).構建體#2(Xho\+271 bp 16D10有義鏈序列+Kpn\＝283bp)+Pdk內含子+(C/a1+271bp 16D10反義鏈序列+Xba\＝283bp) Xho\ CTCGAGCCTCAAAAATACCATAAAGTTAATTATTCTTCAATCA AAAAAATGTTT ACTAATTCAATT AAAAATTT AATT ATTT ATTTAATGCCTTTATGGTTACTTTAATGCTTTTGTCTGTCTCAT TTGTGGATGCAGGCAAAAAGCCTAGTGGGCCAAATCCTGGAG GAAATAATTGAAGAAAAATGATTGAAGAAAAACGTTTAAATTA AACGATAAATGGGAAATAATGGAATTTAAATTAAGCTAATTTT GATGGTTTCCTTTGTTAATTTC GGTACC Kpn\-------Pdk內含子 ---------- C/a1 ATCGATGAAATTAACAAAGGAAACCATCAAAATTAGCTTAATT TAAATTCCATTATTTCCCATTTATCGTTTAATTTAAACGTTTTT CTTCAATCATTTTTCTTCAATTATTTCCTCCAGGATTTGGCCCA CTAGGCTTTTTGCCTGCATCCACAAATGAGACAGACAAAAGCA TTAAAGTAACCATTAAAGGCATTAAATAAATAATTAAATTTTT AATTGAATTAGTAAACATTTTTTTGATTGAAGAATAATTAACTT TATGGTATTTTTGAGG TCTAGA(SEQ ID NO4) XaI 表權利要求
1.一種轉基因植物或細胞，其包含對至少一部分編碼線蟲食道腺細胞分泌多肽的核酸有特異性的抑制性核酸。
2.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中所述植物或細胞對由至少兩種不同的線蟲直接或間接引起的線蟲病害有抗性。
3.權利要求2的轉基因植物或細胞，其中所述植物或細胞對由南方根結線蟲(M.incognita)直接或間接引起的線蟲病害有抗性。
4.權利要求3的轉基因植物或細胞，其中所述植物或細胞還對由爪哇根結線蟲(M.javanica)直接或間接引起的線蟲病害有抗性。
5.權利要求4的轉基因植物或細胞，其中所述植物或細胞還對由花生根結線蟲(M.arenaria)直接或間接引起的線蟲病害有抗性。
6.權利要求5的轉基因植物或細胞，其中所述植物或細胞還對由馬鈴薯根結線蟲(M.chitwoodi)直接或間接引起的線蟲病害有抗性。
7.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中通過寄生的線蟲取食轉基因植物或細胞，與對照植物或細胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預防線蟲食道多肽表達的量。
8.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中與對照植物或細胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預防線蟲病害的量。
9.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中通過至少兩種根結線蟲種類的寄生線蟲取食轉基因植物或細胞，與對照植物或細胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預防線蟲食道多肽表達的量。
10.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中與對照植物或細胞比較，抑制性核酸具有有效減少、抑制或預防由至少兩種不同的根結線蟲引起的線蟲病害的量。
11.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中線蟲食道多肽或其片段調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，在植物細胞內引發信號轉導，或形成能使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。
12.權利要求11的轉基因植物或細胞，其中植物或細胞的基因表達通過線蟲食道腺細胞多肽直接或間接地調節。
13.權利要求12的轉基因植物或細胞，其中基因表達的調節發生在根細胞中。
14.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中線蟲是根結線蟲屬(Meloidogyne spp.)的成員。
15.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞是單子葉或雙子葉的。
16.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞是選自薔薇科(Rosaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、西番蓮科(Passifloraceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、錦葵科(Malvaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、葡萄科(Vitaceae)、茄科(Solanaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、茜草科(Rubiaceae)、豆科(Leguminosae)和十字花科(Brassicaceae)的系統發生家族的成員。
17.權利要求16的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
18.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包括至少一部分與編碼由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼的蛋白的部分或全部mRNA互補的序列。
19.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包括小幹擾RNA。
20.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包括微小RNA。
21.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包括反義DNA。
22.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸抑制或幹擾編碼線蟲食道腺細胞多肽的mRNA的翻譯。
23.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸誘導或促進編碼線蟲食道腺細胞多肽的mRNA的降解。
24.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞包括對不同的線蟲食道腺細胞多肽特異的兩種或多種抑制性核酸。
25.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包含非天然或天然核苷酸。
26.權利要求1的轉基因植物或細胞，其中抑制性核酸包含至少一種修飾的核苷酸間的連接。
27.一種組合物，其包含對編碼由SEQ ID NOs 1、2、或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其片段或同源體的mRNA或其片段具有特異性的抑制性核酸，當遞送到線蟲中時，其量足以抑制由SEQ ID NOs1、2或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其同源體的表達。
28.權利要求27的組合物，其中由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼的多肽或其片段調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，在植物細胞內引發信號轉導，或形成使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。
29.權利要求28的組合物，其中植物或細胞的基因表達被多肽直接或間接地調節。
30.權利要求29的組合物，其中基因表達的調節發生在根細胞中。
31.權利要求27的組合物，其中線蟲是根結線蟲屬的成員。
32.權利要求27的組合物，其中轉基因植物或細胞是單子葉或雙子葉的。
33.權利要求27的組合物，其中植物或細胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
34.權利要求33的組合物，其中植物或細胞是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
35.一種細胞，包含編碼抑制性核酸的核酸，所述抑制性核酸對編碼線蟲食道腺細胞多肽的mRNA或其片段具有特異性，所述多肽調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，在植物細胞內引發信號轉導，或形成使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。
36.一種載體，包含與編碼抑制性核酸的核酸可操作連接的啟動子，所述抑制性核酸對編碼線蟲食道腺細胞多肽的mRNA具有特異性，所述多肽調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，在植物細胞內引發信號轉導，或形成使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。
37.權利要求36的載體，其中線蟲食道腺細胞蛋白由SEQ ID NOs1、2或5-51中的一種或多種編碼。
38.一種為植物提供線蟲抗性的方法，包括在植物內表達對線蟲食道腺細胞蛋白特異的抑制性核酸。
39.權利要求38的方法，其中所述線蟲是根結線蟲屬的成員。
40.一種為植物提供線蟲抗性的方法，包括將植物與對一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白特異的一種或多種抑制性核酸接觸，所述抑制性核酸的量足以減少線蟲病害。
41.權利要求40的方法，其中一種或多種線蟲食道腺細胞蛋白直接或間接調節植物或細胞的基因表達，巨細胞的形成，線蟲通過植物根組織的遷移，植物的細胞代謝，在植物細胞內引發信號轉導，或形成使線蟲從植物中形成的巨細胞取食的取食管。
42.權利要求41的方法，其中所述線蟲是根結線蟲屬的成員。
43.權利要求40的方法，其中植物對至少兩種不同的根結線蟲病害具有抗性。
44.權利要求40的方法，其中植物對南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和北方根結線蟲引起的線蟲病害具有抗性。
45.一種轉基因植物或細胞，包含至少一部分編碼寄生線蟲食道腺細胞分泌多肽的核酸。
46.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中與對照植物或細胞比較，食道腺細胞分泌多肽促進轉基因植物根的生長。
47.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中與對照植物或細胞比較，食道腺細胞分泌多肽表達的量有效提高轉基因植物或細胞的根生長。
48.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中食道腺細胞分泌多肽在根細胞中表達。
49.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中線蟲是根結線蟲屬的成員。
50.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中線蟲不是胞囊線蟲屬(Heterodera spp)的成員。
51.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞是單子葉或雙子葉的。
52.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
53.權利要求52的轉基因植物或細胞，其中植物是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
54.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中核酸包括SEQ ID NOs1、2或5-51的至少一部分。
55.權利要求45的轉基因植物或細胞，其中轉基因植物或細胞包含兩種或多種編碼不同線蟲分泌多肽的核酸。
56.一種組合物，包含
包含SEQ ID NOs 1、2或5-51、其互補序列、其片段、或其同源體的核酸，當在植物中表達時，其量足以增強或促進根生長。
57.一種組合物，包含
由SEQ ID NOs 1、2或5-51、其互補序列、其片段、或其同源體編碼的多肽，其量足以增強或促進根生長。
58.權利要求57的組合物，其中線蟲是根結線蟲屬的成員。
59.權利要求57的組合物，其中線蟲是胞囊線蟲屬的成員。
60.權利要求57的組合物，其中轉基因植物或細胞是單子葉或雙子葉的。
61.權利要求57的組合物，其中植物或細胞是選自薔薇科、蝶形花科、西番蓮科、葫蘆科、錦葵科、大戟科、葡萄科、茄科、旋花科、茜草科、豆科和十字花科家族的成員。
62.權利要求61的組合物，其中植物或細胞是番茄、茄子、土豆、甜瓜、黃瓜、胡蘿蔔、萵苣、朝鮮薊、芹菜、葫蘆、大麥、玉米、花生、大豆、甜菜、棉花、豇豆、豆類、紫花苜蓿、菸草、柑桔、三葉草、胡椒、葡萄、咖啡、橄欖或茶。
63.一種細胞，包含編碼刺激根生長的線蟲食道腺細胞分泌多肽的核酸。
64.一種載體，包含與編碼刺激植物根生長的線蟲食道腺細胞分泌蛋白的核酸可操作地連接的啟動子。
65.權利要求64的載體，其中線蟲食道腺細胞分泌蛋白由SEQ IDNOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼。
66.一種刺激根生長或提高側根或不定根生成的方法，包括將線蟲食道腺細胞分泌多肽遞送到根細胞內部。
67.一種產生改變的植物、植物細胞或植物組織的方法，包括將一種或多種線蟲食道腺細胞分泌多肽導入所述植物的細胞、組織或器官中。
68.一種由權利要求45的轉基因植物或細胞產生的種子。
69.一種與相應的野生型植物相比較表現出增強的根生長的重組植物，其中所述重組植物包含與調節序列可操作連接的編碼線蟲食道腺細胞分泌蛋白或其片段的重組核酸。
70.權利要求69的重組植物，其中線蟲食道腺細胞分泌蛋白由SEQ ID NOs 1、2或5-51中的一種或多種編碼。
71.一種融合蛋白，包含由SEQ ID NOs 1、2或5-51或其片段編碼的多肽。
72.權利要求71的融合蛋白，包含植物生長激素或其片段。
全文摘要
本發明提供了提供線蟲抗性的組合物和方法。一方面提供了包含對一種或多種線蟲食道多肽特異的抑制性核酸的轉基因植物或細胞。另一方面提供了對至少兩種不同的根結線蟲具有抗性的轉基因植物或細胞。
文檔編號C07K14/415GK101056534SQ20058003870
公開日2007年10月17日 申請日期2005年10月13日 優先權日2004年10月13日
發明者理察·S·赫西, 黃國中 申請人:喬治亞大學研究基金會公司