用於治療微生物病症的組合物和方法

2023-06-11 20:22:21 2

專利名稱：用於治療微生物病症的組合物和方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及通過調控宿主免疫應答來治療微生物病症。
背景技術：
微生物病原體感染構成全世界的一項主要死因，而且繼續構成全球健康的嚴重威 脅(WH0，The World Health R印ort (2004))。例如，粘附和抹消(attaching and effacing, Α/Ε)細菌病原體諸如腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸致病性大腸桿菌(EPEC)在引起腹瀉、 發病和死亡的細菌之中，尤其是在發展中世界的嬰兒和兒童中(2)。大腸桿菌0157:Η7( — 種EHEC菌株)去年在美國引起許多人住院和3例死亡(MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55，1045 (S印29，2006))。還認為工業化國家所有腹瀉後溶血尿毒症候群(HUS)病例中超 過 90%是由大腸桿菌 0157:H7 感染引起的(R. L. Siegler，Pediatr Clin North Am 42， 1505 (Dec, 1995))。其它EPEC菌株諸如大腸桿菌055:H7也在全世界的嬰兒中引起腸病 (T. S. Whittam 等，Infect Immun 61，1619 (May，1993))。我們關於宿主如何控制 Α/Ε 病原 體感染的許多知識來自對嚙齒類檸檬酸桿菌(Citrobacterrodentium)(小鼠中的一種天 然病原體)感染的研究(L. Eckmann, Ann NY AcadSci 1072，28 (August 1,2006)) 與人類 中EHEC或EHPC的發病機制相似，嚙齒類檸檬酸桿菌對鼠結腸上皮細胞的緊密粘附導致刷 狀緣微絨毛的抹消(稱作附著和抹消(A/E)損害)及結腸增生(D. B. Schauer，S. Falkow, Infect Immun61，2486(Jun，1993))。腸上皮和免疫細胞都在宿主針對Α/Ε病原體的防禦中發揮至關重要的作 用。腸上皮細胞的緊密連接構成阻止微生物離開腸腔的第一道屏障(T.T.MacDonald， G.Monteleone，Science 307，1920 (March 25，2005))。另外，上皮細胞分泌抗微生物肽來控 制胃腸(GI)道中的病原體(A. Takahashi 等，FEBSLett 508,484(Nov 23,2001)) 用齧齒 類檸檬酸桿菌感染期間的免疫缺陷小鼠品系進行的研究確立了 CD4+ T細胞、B細胞、和抗 嚙齒類檸檬酸桿菌特異性抗體應答都是抑制和根除感染的適應性免疫的關鍵成分(L. Bry, M. B. Brenner,J Immunol 172，433 (January 1，2004))。感染期間由淋巴細胞生成的許多細 胞因子能增強上皮細胞的先天免疫應答。然而，仍然不清楚這些細胞因子在A/E病原體感 染期間的具體功能。IL_22(—種IL-10家族細胞因子)是由淋巴細胞(特別是Thl7細胞)生成的 (Y. Zheng 等，Nature 445,648 (Feb 8,2007)) Thl7 細胞屬於最近發現的、也生成 IL-17 的⑶4+ T輔助細胞子集。IL-17在控制細胞外細菌感染中具有重要功能(K. I. Happel等， J. Exp. Med. 202，761 (September 19，2005))。然而，仍然不太知道IL-22在宿主防禦中的作 用。腫瘤壞死因子(TNF)相關蛋白在本領域被認定為具有多種活性(範圍自宿主防禦至對 凋亡的免疫調節)的蛋白質大家族。TNF最初被鑑定為在體外對數種轉化細胞系有細胞毒 性且在體內引起某些腫瘤壞死的血清衍生因子。在該超家族中鑑定到一種相似的因子，並 稱作淋巴毒素(「LT")。由於二十世紀八十年代早期在TNF和LT之間觀察到的相似性， 有人提出將TNF和LT分別稱作TNF- α和TNF- β。如此，科學文獻提到這兩種命名。如本 申請中所使用的，術語「TNF」指TNF-α。稍後的研究揭示了淋巴毒素的兩種形式，稱作LT α和LT β。US 2005-0129614記載了基於結構和生物學相似性的TNF配體超家族的另一種多 肽成員，其被稱作TL-5。TNF蛋白質家族的成員以膜結合的形式(其經由細胞-細胞接觸 局部地起作用)或作為分泌蛋白存在。一個TNF相關受體家族與這些蛋白質起反應，並觸 發多種信號傳導途徑，包括細胞死亡或凋亡、細胞增殖、組織分化、和促炎症應答。TNF-α自 己涉及炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒、細菌、和寄生物感染、惡性腫瘤、和/或神經變性 性疾病，而且是諸如RA和克羅恩氏病等疾病中特定生物學療法的有用靶物。發明概述本發明提供用於通過調控宿主免疫應答來治療微生物病症的組合物和方法。例 如，可以通過提高或降低一種或多種介導抗微生物免疫應答的抗微生物多肽(AMP)的活性 來增強或抑制宿主中的抗微生物免疫應答。更具體地說，本發明提供AMP、其調控劑、及使用此類組合物來治療微生物感染的 方法。所述微生物病症包括但不限於傳染病例如由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病 (IBD)和更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。本發明的AMP是介導抗微生物免疫應答的多肽，而且包括但不限於LT、IL-6、 IL-18、IL-22、IL-23(包括例如IL-23 pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因編碼的 Reg或Reg相關蛋白質。Reg超家族包括來自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且 分成四個亞類，即I型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REG I α、人REG I β、大 鼠Regl、和小鼠RegI ；II型包括小鼠RegII ；III型包括人REG III、人HIP/PAP(在肝細胞 癌-腸_胰中表達的基因/編碼胰腺炎相關蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegIII/ PAPII、大鼠PAP III、小鼠 RegIII α、RegIII β、RegIII γ、小鼠 RegIII δ、和倉鼠 INGAP (胰 島新生相關蛋白)。IV型含有人REG IV。在一個方面，所述REG蛋白質由人REG基因家族 的成員編碼，包括但不限於REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、和Reg相關序列 (RS)。在一些方面，本發明AMP的胺基酸序列包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36、SEQ IDNO 38,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO :54、和 SEQ IDNO :56。在其它方面，編碼本發明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列SEQ ID NO USEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:13、 SEQ ID N0:15、SEQ ID NO : 17、SEQID NO : 19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 49,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :53、和 SEQ IDNO :55。本發明AMP的活性可以相對於另一種AMP或同一種AMP的活性提高或降低和/或 差異調節。本發明AMP的活性的例子包括但不限於AMP表達、結合至結合配偶、信號轉導、 抗微生物活性、或其其它生物學或免疫學活性。在一個方面，一種或多種本發明AMP的活性的升高導致受試者中增強的抗微生物
5免疫應答。在一個方面，本發明的AMP包括但不限於與IL-22直接或間接相互作用的多肽，例 如位於介導宿主對微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信號轉導途徑 的上遊或下遊的多肽。此類AMP的例子包括但不限於LT、IL-6、IL-18、和IL-23 (包括例如 IL-23 pl9 或 IL-23 p40)。本發明的調控劑包括但不限於直接或間接調控AMP活性的多肽和核酸分子(例如 DNA分子或RNA分子)。所述調控的例子包括但不限於本發明AMP活性的升高、降低、誘導 或活化、抑制、或調節(例如上調或下調)。在一個方面，所述調控劑通過降低或抑制IL-22結合蛋白(BP)活性並由此提高 IL-22活性來間接調控IL-22活性。在一個具體的方面，所述調控劑降低或抑制IL-22 BP 結合IL-22並由此提高IL-22活性。在一些方面，所述調控劑是多肽，例如結合AMP或以其它方式與AMP相互作用以提 高、誘導、或調節AMP活性的多肽。在一個方面，所述調控劑是調控AMP活性的融合多肽。在一個方面，所述調控劑是結合AMP的抗體。在一個具體的方面，所述抗體是單克 隆抗體。在另一個方面，所述抗體是選自Fab、Fab，_SH、Fv、scFv、或(Fab，)2片段的抗體 片段。在另一個方面，所述抗體是融合多肽(例如Fc融合多肽)。在另一個方面，所述抗 體是嵌合抗體。在一個具體的方面，所述抗體是人源化的。在另一個方面，所述抗體是人抗 體。在另一個方面，所述抗體與選自人、非人靈長類、或其它哺乳動物(例如豬、綿羊、家兔、 土撥鼠、大鼠、或小鼠)的抗體結合相同表位。在一個具體的方面，所述抗體是AMP激動劑。在另一個具體的方面，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例如DNA 或RNA分子)。本發明進一步提供通過調控抗微生物免疫應答來治療微生物病症的方法。在一個 方面，本發明提供治療受試者中的微生物病症的方法，包括對所述受試者施用有效量的包 含AMP或AMP調控劑的藥物組合物，其中所述AMP選自下組LT、IL_6、IL-18、IL-22、IL-23、 REG I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和 Reg 相關序列(RS)。在一個方面，所述病症 是傳染病例如由EHEC或EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC) 或克羅恩氏病(⑶)。在具體的方面，本發明提供通過刺激或抑制由AMP介導的信號傳導途徑和/或 細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。所述方法對於治療微生物病症是有用的。
例如，在一個方面，本發明提供通過刺激由AMP介導的信號傳導途徑例如由IL-22和/或 IL-23介導的信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。在另一個方面，本發明提供通 過刺激或抑制由細胞因子介導的信號傳導途徑來調控抗微生物免疫應答的方法。例如，在 一個方面，本發明提供通過刺激由細胞因子介導的信號傳導途徑例如IL-22和/或IL-23 信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。此外，本發明提供通過刺激或抑制Tht17 細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。在一個方面，本發明提供刺激生物學系統中由AMP介導的信號傳導途徑的方法， 該方法包括給所述生物學系統提供AMP激動劑。所述生物學系統的例子包括但不限於體外 細胞培養系統中的或生物體體內的哺乳動物細胞。在另一個方面，本發明提供抑制生物學 系統中由AMP介導的信號傳導途徑的方法，該方法包括給所述生物學系統提供AMP拮抗劑。
在一個具體的方面，本發明提供通過刺激生物學系統中由IL-23和/或IL-22介 導的信號傳導途徑來增強生物學系統中的抗微生物免疫應答的方法，該方法包括給所述生 物學系統提供IL-22或IL-22激動劑。在一個方面，所述IL-22激動劑是IL-22。在另一個 方面，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個方面，提供抑制生物學系統中由IL-23介導的信號傳導途徑的方法，該 方法包括給所述生物學系統提供IL-22拮抗劑。在一個方面，所述IL-22拮抗劑是抗體，例 如中和性抗IL-22抗體和/或中和性抗IL-22R抗體。在另一個方面，本發明提供刺激IV_17細胞功能的方法，該方法包括將IV_17細胞 暴露於AMP的激動劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如IL_23、IL_6、 或IL-22)。所述方法對於治療微生物病症是有用的。在一個方面，IL-22激動劑是IL-22。 在另一個方面，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個方面，提供抑制細胞功能的方法，該方法包括將Tht17細胞暴露 於AMP的拮抗劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如IL-23、IL-6、或 IL-22)。在一個方面，所述拮抗劑是抗IL-22抗體，例如中和性抗IL-22抗體。例示性的Thiw7細胞功能包括但不限於刺激由細胞介導的免疫(遲髮型超敏感 性)；募集先天免疫細胞，諸如髓樣細胞(例如單核細胞和嗜中性粒細胞)至炎症部位；和 刺激炎症細胞浸潤入組織中。在一個方面，Tht17細胞功能是由IL-23和/或IL-22介導 的。在又一個方面，本發明提供治療受試者中的微生物病原體(例如細菌或病毒)感 染的方法，包括對所述受試者施用有效量的包含AMP或AMP調控劑的藥物組合物，其中所述 八1^選自下組丄1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和Reg相關序列(RS)。在另一個方面，本發明提供治療受試者中的微生物病症的方法，包括使所述受試 者的細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中所述AMP選 自下組LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REGI α、REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和 Reg 相關序列(RS)。在一個方面，所述病症是傳染病例如由EHEC或EPEC引起的腹瀉、炎性腸病 (IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC)或克羅恩氏病(CD)。在另一個方面，本發明提供調控受到微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的受 試者的細胞中AMP的活性的方法，包括使所述細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸分子 (例如 DNA 或 RNA 分子)，其中所述 AMP 選自下組LT、IL-6, IL-18、IL-22、IL_23、REG I α、 REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β ^ REGIII y) ,REG IV、和 Reg 相關序列(RS)。微生物病原體的例子包括但不限於細菌或病毒。在一個方面，所述微生物病原體 是細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。在一個具體的方面，所述細菌是革蘭氏陰性細 菌。在另一個方面，所述細菌是粘附或抹消(A/E)細菌，而且更具體地是腸出血性大腸桿菌 (EHEC)或腸致病性大腸桿菌(EPEC)。在一個方面，所述細菌是腸致病性大腸桿菌(EHEC)， 是大腸桿菌0157: H7或大腸桿菌055: H7。在另一個方面，本發明提供編碼本發明AMP或其調控劑的多核苷酸。在另一個方 面，本發明提供包含所述多核苷酸的載體。在另一個方面，本發明提供包含所述載體的宿主 細胞。在一個方面，所述宿主細胞是真核細胞。在另一個方面，所述宿主細胞是CHO細胞、
7酵母細胞、或細菌細胞(例如大腸桿菌)。在一個方面，本發明提供製備結合本發明AMP的抗體的方法，其中該方法包括在 適合於編碼所述抗體的多核苷酸表達的條件下培養宿主細胞，並分離所述抗體。在一個具 體的方面，本發明提供製備作為本發明AMP激動劑的抗體的方法。在一個方面，本發明提供檢測生物學樣品中AMP的存在的方法，包括在容許下述 抗體結合AMP的條件下使所述生物學樣品接觸AMP的抗體，並檢測是否形成所述抗體和AMP 之間的複合物。在另一個方面，本發明提供包含一種或多種本發明AMP和/或其調控劑的試劑盒。 在另一個方面，本發明提供包含一種或多種藥物組合物的試劑盒，所述藥物組合物每一種 包含本發明的AMP或其調控劑。附圖簡述

圖1描繪的數據展示了針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的宿主防禦。圖1㈧描繪了未 感染野生型小鼠GI道中IL-22受體亞基的實時RT-PCR分析的結果；圖I(B-F)描繪了齧齒 類檸檬酸桿菌感染後野生型小鼠結腸中各種細胞因子表達的實時RT-PCR分析；圖I(G)描 繪了 C57B1/6 (η = 5)、IL_23p40+(n = 5)、和IL_6+(n = 5)小鼠在嚙齒類檸檬酸桿菌感 染後的存活；而圖I(H)描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後C57Bl/6、IL-23p40+、和IL-6+小 鼠結腸中IL-22和IL-17表達的時間過程實時RT-PCR分析。對於嚙齒類檸檬酸桿菌感染， 小鼠口服接種2xl09CFU細菌。所有上述數據是兩項獨立實驗的代表。圖2描繪的數據展示了 IL-22缺陷使得小鼠對嚙齒類檸檬酸桿菌感染易感。6_7 周齡 IL-22+(圖 2 (A-C))、IL-17RC+(D)、IL_20Ri3 + 小鼠(圖 2(F))或野生型小鼠(圖 2(A-C，E)) 口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌並在指定時間點稱重。來自接種後8天 IL-22+和野生型小鼠的結腸的組織學分析，使用蘇木精和曙紅(H&E)染色(圖2(B和C))。 箭指示黏膜下發炎(圖2 (B))和細菌侵入粘液腺中(圖2 (C))。顯示了代表性數據(圖2 (B) 的棒=100 μ m而圖2 (C)的棒=25 μ m)。野生型C57B1/6小鼠自第0天或接種後第8天開 始隔天腹膜內接受150μ g抗IL-22單抗或同種型對照IgGl單抗(圖2 (E))。< 0. 05， **P < 0. 01，***p < 0. 001。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖3描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間小鼠中IL-22缺陷的影響。 C57B1/6小鼠(圖3(A、B、和F))、IL-22+和野生型小鼠(圖3(C-E、和G)) 口服接種2xl09CFU 嚙齒類檸檬酸桿菌。小鼠還自嚙齒類檸檬酸桿菌接種的同一天開始隔天腹膜內接受150 μ g 抗IL-22單抗或同種型對照IgGl單抗(圖3 (A和B))。在第10天，對結腸照相，並測量各結 腸長度(圖3(A))。使用蘇木精和曙紅(H&E)染色對結腸實施組織學分析(圖3(B))。使用 H&E染色對來自受感染IL-22+和野生型小鼠的結腸和肝(第8天)實施組織學分析(圖 3(C和E))。圖3(C)中的箭指示結腸透壁性炎症和潰瘍形成。圖3(E)描繪了 IL-22+小 鼠中的肝膿毒性微膿瘍。圖3(C)顯示了代表性數據，其中上部小圖的棒= 500μπι，而下部 小圖的棒=100 μ m。在3 (E)中，棒=25 μ m。圖3 (D)描繪了結腸、肝、脾、和腸繫膜淋巴結 中的嚙齒類檸檬酸桿菌的log1(lCFU。圖3(F-G)描繪了通過ELISA獲得的血清抗嚙齒類檸 檬酸桿菌IgG水平。*p<0.05。所有上述數據是兩項獨立實驗的代表。圖4描繪的數據展示了 IL-22在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後誘導抗微生物RegIII 家族蛋白質表達。將C57B1/6小鼠結腸的體外培養物用IOyg IL-22處理24小時，分離
8RNA，並用於微陣列分析(圖4(A))和實時RT-PCR分析(圖4(B))。在圖4(C)中，IL-22+小 鼠和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌，並對自指定時間點收集的各小 鼠結腸分離的RNA實施實時RT-PCR。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖5描繪的數據展示了鼠IL-17RC基因的靶向破壞。圖5 (A)描繪了用於生成 IL-17RC敲除小鼠的策略。將涵蓋IL-17RC編碼序列的外顯子1-5(空心框)用新黴素抗 性盒置換。圖5(B)描繪了使用指定引物集(P1、P2和P3)對來自野生型(WT)和敲除(KO) 小鼠的後代的基因分型。生成來自WT和KO小鼠的尾尖成纖維細胞，在體外用各種濃度的 IL-17A和IL-17F刺激24小時，並收集培養物上清液，用於IL_6ELISA(圖5(C))。圖6描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後野生型小鼠結腸中IL-19、IL_20和IL-24表 達隨時間的實時RT-PCR分析的數據。C57B1/6小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。 在指定時間點收集結腸，並將分離的RNA用於實時RT-PCR分析。圖7描繪的數據展示了 GI道中的IL-20Rci和IL_20Ri3表達。未感染野生型小 鼠GI道中IL-19、IL-20和IL-24的受體亞基的實時RT-PCR分析。圖8描繪的數據展示了鼠IL_20Ri3基因的靶向破壞。圖8㈧描繪了用於生成 IL-20Ri3敲除小鼠的策略。將外顯子1(空心框)用新黴素抗性盒置換。圖8(B)描繪了 使用指定引物集(pl、p2和p3)對來自野生型(WT)、雜合(HET)和敲除(KO)小鼠的後代的 表型分型。圖8(011~和1(0小鼠耳部皮內注射含5001^重組11^20的2(^1 PBS或單獨的 20 μ 1 PBS。24小時後，收集小鼠耳，用於分離RNA。將分離的RNA用於對已知在IL-20信 號傳導後上調的基因的實時RT-PCR分析。圖9描繪了來自接種嚙齒類檸檬酸桿菌、用抗IL-22單抗處理的野生型小鼠的小 鼠結腸的組織學分析的數據。C57B1/6小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。小鼠還 自接種嚙齒類檸檬酸桿菌的同一天開始隔天腹膜內接受150μ g抗IL-22單抗或同種型對 照IgGl單抗。在第10天，使用蘇木精和曙紅(H&E)染色對結腸實施例行組織學分析。箭 指示黏膜潰瘍形成及透壁性炎症。顯示了代表性圖像，上部小圖的棒=500 μ m，而下部小圖 的棒=250 μ m。圖10描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間IL-22+小鼠和野生型同窩 小鼠中的血清Ig水平。IL-22+和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。 在指定時間點，收集小鼠血液。通過ELISA測定總血清IgM和IgG(圖10(A))及血清抗齧 齒類檸檬酸桿菌IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3(圖10(B))的水平。所有數據是兩項獨立實 驗的代表。圖11描繪的數據展示了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後C57B1/6、IL_23pl9+、和 IL-6+小鼠結腸中IL-22(圖11(A))和IL_17(圖11(B))表達的離體結腸培養物ELISA。 對於嚙齒類檸檬酸桿菌感染，小鼠口服接種2xl09CFU細菌。所有數據是至少兩項獨立實驗 的代表。圖12描繪了分離的小鼠IEL、LPMC和結腸上皮細胞上的IL-22R表達的FACS分析 (圖12(A))，及原代人結腸上皮細胞上的IL-22R表達的FACS分析(圖12(B))。所有數據 是至少兩項獨立實驗的代表。圖13描繪的數據展示了由樹突細胞(DC)生成的IL-22對於針對嚙齒類檸檬酸杆 菌感染的先天性免疫應答是至關重要的。在圖13(A)中，Rag2+和野生型Balb/c小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在圖13(B和C)中，小鼠還自接種細菌的同一天開始 隔天腹膜內接受150 μ g同種型對照IgGl單抗或抗IL-22單抗，並在指定時間點稱重。圖 13(B)描繪了時間過程實時RT-PCR分析，而圖13(C)描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後野生 型Balb/c和Rag2+小鼠的結腸中的IL-22和IL-17表達的離體結腸培養物ELISA。圖13 (D) 描繪了來自受到嚙齒類檸檬酸桿菌感染的Rag2+小鼠的第4天結腸中的IL-22、⑶11c、和 DAPI免疫組織化學染色。放大倍數400x。圖13(E)描繪的數據證明了在體外IL-23直接 誘導分離的鼠⑶Ilc+ DC生成IL-22，通過ELISA測量。所有數據是兩項獨立實驗的代表。圖14描繪的數據展示了 IL-22能在人結腸細胞系中誘導STAT3活化。在圖14㈧ 中，IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。一組IL-22+小 鼠還接受mRegllI y -Ig融合蛋白。在指定時間點對動物稱重並監測Zp <0. 05廣ρ <0. 01。 在圖14(B)中，IL-23直接誘導分離的人DC生成IL-22，通過ELISA測量。圖14(C)描繪 了通過FACS獲得的人結腸細胞系上的IL-22R表達。圖14(D)描繪的Western印跡顯示了 IL-22能在人結腸細胞系中誘導STAT3活化。圖14(E)描繪了用IL-22處理的人結腸上皮 細胞系中RegIII β和RegIII Y表達的實時RT-PCR分析。所有數據是兩項獨立實驗的代 表。圖15描繪了用於免疫組織化學的抗IL-22單抗的表徵。圖15㈧描繪了來自第 4天的受到嚙齒類檸檬酸桿菌感染的IL-22+和野生型小鼠或未受感染的野生型小鼠的結 腸切片，用偶聯有Alexa555的抗IL-22單抗(8E11)或同種型對照染色。圖15(B)描繪了 表達IL-22的293細胞的細胞團，用偶聯有Alexa555的抗IL-22單抗(8E11)或同種型對 照染色。放大倍數為200x。圖16描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後C57B1/6和IL_23pl9+小鼠結腸中 RegIII γ和RegIII β表達的時間-過程分析。C57B1/6和IL_23pl9+小鼠口服接種 2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。在指定時間點，收集小鼠結腸，用於提取RNA和後續小鼠 RegIII γ和RegIII β表達的實時RT-PCR分析。圖17描繪了嚙齒類檸檬酸桿菌感染後IL-22+和野生型小鼠結腸中其它Reg家 族成員表達的時間_過程分析。IL-22+和野生型同窩小鼠口服接種2x109CFU嚙齒類檸檬 酸桿菌。在指定時間點，收集小鼠結腸，用於提取RNA和後續實時RT-PCR分析。圖18描繪的數據展示了重組人RegI11_融合蛋白能在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後 部分保護IL-22+。IL-22+小鼠和野生型同窩小鼠口服接種2xl09CFU嚙齒類檸檬酸桿菌。 一組IL-22+小鼠還接受人RegIII_-CFlag融合蛋白。在指定時間點對動物稱重並監測。 *p < 0. 05。圖19A-C描繪了 161種在來自IL-22處理的結腸中差異表達的基因。圖20描繪了 161種在來自IL-22處理的結腸中差異表達的基因的2D分級聚類， 其中通過根據Pearson相關係數有最高聯繫的矢量的迭代凝聚對選定基因聚類，凝聚矢 量的數據通過平均聯繫來匯總(where selected genes wereclustered by iterative agglomeration of vectors most highly linked by Pearsoncorrelation coefficient， with data for agglomerated vectors summarized byaverage linkage)。圖21描繪的數據展示了 LTbRFc和抗IL-22單抗都在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後導 致死亡。
10
圖22描繪的數據展示了 IL-22生成所涉及的多個上遊方面的LT途徑調節。圖23描繪的數據展示了 IL-22部分挽救在用LTbR處理的小鼠中看到的缺陷。圖24描繪的數據展示了抗IL-22單抗處理導致結腸濾泡減少、B/T組構受損、及 結腸中DC、T細胞和B細胞數目減少。發明詳述本發明提供用於通過調控宿主免疫應答來治療微生物病症的組合物和方法。本發明人發現了一種介導免疫應答和哺乳動物對傳染性微生物病原體的抵抗力 的新細胞因子途徑。具體而言，本發明人發現了 IL-22是在粘附或抹消(A/E)細菌病原體 感染早期期間連接適應性免疫應答和先天性上皮防禦的關鍵細胞因子之一。如本文中所顯示的，在感染早期階段期間由免疫細胞生成的細胞因子諸如IL-22 是腸上皮細胞引發完全抗微生物應答和傷口癒合應答以阻止病原性微生物系統性侵入宿 主所必需的。本文中的研究顯示IL-22保護腸上皮屏障的完整性並阻止細菌侵入及系統性 擴散。另外，本文中的研究指示IL-22涉及早期抗細菌IgG應答的引發，而且是在細菌感染 期間自結腸上皮細胞誘導抗微生物凝集素諸如RegIII β和RegIII Y不可缺少的。在齧齒 類檸檬酸桿菌感染期間的IL-22+小鼠中，這兩種機制之一或二者的缺失可促成宿主防禦 應答受損及系統性擴散和死亡升高。如本文中所顯示的，對RegIII β和RegIII γ的誘導指示IL-22在控制各種細菌 感染中可具有更寬的功能。本文中的研究進一步支持細胞及其效應器細胞因子在傳 染性病症和自身免疫性病症中的作用。另外，本文中的研究指示IL-22及其下遊產物諸如 RegIIIii和RegIII γ對於治療傳染性病症可以是有益的。因此，本發明提供通過調控宿主免疫應答來治療此類微生物病症的方法。例如，可 以通過提高或降低一種或多種介導抗微生物免疫應答的抗微生物多肽(AMP)的活性來增 強或抑制受試者中的抗微生物免疫應答。更具體地說，本發明提供AMP、其調控劑、及使用此類組合物來治療微生物病症的 方法。所述微生物病症包括但不限於傳染病例如由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病 (IBD)和更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。通過述及將本文中所引用的所有參考文獻包括專利、申請、和科學文獻完整收入 本文。通用技術本文中所描述或提到的技術和規程一般得到本領域技術人員的充分理解，而且通 常使用常規方法得以採用，諸如例如下列文獻中所記載的廣泛應用的方法Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual第 3片反(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y. ；CurrentProtocoIs in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等㈱，2003) ； JA 書 Methods inEnzymology (Academic Press, Inc.) :PCR 2 A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G.R.Taylor 編，1995)，Harlow 禾口 Lane 編(1988)Antibodies， A Laboratory Manual， and Animal Cell Culture(R. I. Freshney 1987) ；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait 1984) ；Methods in MolecularBiology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook(J. E. Cellis 編，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編，1987) ；Introductionto Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 和P. Ε· Roberts，1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture :Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths和 D.G. Newell 編，1993-8)J. Wiley and Sons ；Handbook ofExperimental Immunology(D. M. Weir 和 C.C.Blackwell 編)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 和 Μ. P. Calos He, 1987) ；PCR =ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis 1994) ；Current Protocols inlmmunology(J. E. Coligan 等 編，1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway 和 P. Travers,1997)； Antibodies (P. Finch,1997) ；Antibodies :A Practical Approach(D. Catty 編，IRLPress, 1988-1989) ；Monoclonal Antibodies :A Practical Approach(P. Shepherd 和 C. Dean 編， Oxford University Press,2000) ；Using Antibodies :A LaboratoryManual (E. Harlow 和 D.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999) ； TheAntibodies (M. Zanetti 和J. D. Capra 編，Harwood Academic Publishers,1995)；及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等編，J. B. LippincottCompany, 1993)。I.定義為了解釋本說明書的目的，應用以下定義，而且在任何適宜的時候，以單數使用的 術語也會包括複數，反之亦然。在下文所列任何定義與通過述及收入本文的任何文件牴觸 的情況中，應當以下文所列定義為準。「抗微生物多肽」或「AMP」指介導或以其它方式影響對微生物病原體的抗微生物免 疫應答的多肽，而且涵蓋其保留AMP活性(例如抗微生物活性或調控抗微生物免疫應答的 活性)的片段、變體、類似物、衍生物或模擬物。這些方法可用於治療感染了或有風險感染 傳染性微生物病原體(例如病毒或細菌)的受試者。AMP的活性可以相對於另一種AMP或 同一種AMP調控或差異調節(例如上調或下調)。本發明的AMP涵蓋天然AMP及其變體形式(在本文中有進一步定義)，而且可 以從多種來源分離，諸如人的組織或其它來源，或者可以通過重組或合成方法製備。天然 AMP可以來自任何物種，例如鼠或人。本發明的AMP包括但不限於LT、IL-6、IL-18、IL-22、 IL-23(包括例如IL-23 pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因編碼的Reg或Reg相關 蛋白。Reg超家族包括來自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且分成四個亞類，即I 型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REG Ια、人REG I β、大鼠Regl、和小鼠RegI ； II型包括小鼠RegII ；III型包括人REG III、人HIP/PAP (在肝細胞癌-腸-胰中表達的基 因/編碼胰腺炎相關蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegIII/ΡΑΡΙΙ、大鼠PAP III、小 鼠RegIII α、RegIII β、RegIII γ、小鼠RegIII δ、和倉鼠INGAP(胰島新生相關蛋白)。IV 型含有人REG IV。另外，人Reg相關序列(RS)據報告是假基因。在一個實施方案中，所述 REG蛋白質由人REG基因家族的成員編碼，包括但不限於REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、和 Reg 相關序列(RS)。淋巴毒素(LT)是腫瘤壞死家族中的一種三聚體細胞因子；由活化的Τ、B、和NK 細胞表達；且涉及炎症應答信號傳導和次級淋巴樣器官體系結構。「淋巴毒素_」或「LT」 在本文中定義為具有美國專利No. 5，824，509圖2Α所示胺基酸序列的生物學活性多肽。 「LT」定義為明確排除人TNFa或其天然動物類似物(Permica等，Nature 312:20/27: 724-729(1984)及 Aggarwal 等，J. Biol. Chem. 260 :2345_2354 (1985))。如本文中所使用的，「LT」指一種或多種如本文中所描述的LT亞基。「淋巴毒素-α 」或「LTa 」定義為明確排除人LT β，例如US 5，661，004中所定義 的。「淋巴毒素α-3三聚體」或「LT α 3」指LT α單體的同三聚體。此同三聚體通過LTiK 跨膜和胞質結構域錨定至細胞表面。「淋巴毒素-α β 」或「 LT α β 」或「 LT α β複合物」指LT α與LT β異三聚體。這 些異三聚體含有兩個LT α亞基和一個LT β亞基(LT α 2 β 1)或一個LT α亞基和兩個LT β 亞基(LT α 1 β 2) 0如本文中所使用的，術語「LT α β 」或「LTab」指由一個LT α亞基和兩個 LT β亞基構成的異三聚體(LR α 1 β 2)。「腫瘤壞死因子受體-I」或「TNFRI」和「腫瘤壞死因子受體-II」或「TNFRII」指 LT α 3同三聚體的細胞表面TNF受體，分別也稱作ρ55和ρ75。「淋巴毒素-β受體」或「1^^-1 」指1^^ β異三聚體所結合的受體。在一些實施方案中，本發明AMP的胺基酸序列包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO :2(人 IL-6)、SEQ ID NO :4 (人 IL-12B)、SEQ ID NO :6 (人 IL-18)、SEQ ID NO 8( A IL-22)、SEQ ID NO 10 (人 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO 12 (人 REG1A)、SEQ ID NO 14(人 REG1B)、SEQ ID NO 16 (人 REG3A，變體 1)、SEQ ID NO 18 (人 REG3A，變體 2)、SEQ ID NO :20(人 REG3A，變體 3)、SEQ ID NO :22 (人 REG3G，變體 2)、SEQ ID NO :24 (人 REG3G，變體 1)、SEQ ID NO 26 (人 REG4)、SEQ ID NO 28 (鼠 IL-6)、SEQID NO 30(鼠 IL-12B)、SEQ ID NO 32(鼠 IL-18)、SEQ ID NO 34(鼠 IL-22)、SEQ ID NO 36(鼠 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQ ID NO 38(鼠 PAP)、SEQ ID NO 40(鼠 REG1)、SEQ ID NO 42(鼠 REG2)、SEQ ID NO 44(鼠 REG3A)、SEQ IDNO :46 (鼠 REG3D)、SEQ ID NO :48 (鼠 REG4)、SEQ ID NO :50 (人LT α )、SEQID NO :52 (人 LT β )、SEQ ID NO :54 (鼠 LT α )、禾口 SEQ ID NO :56 (鼠 LT β )。在其它實施方案中，編碼本發明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列SEQ ID NO :1(人 IL-6)、SEQ ID NO :3 (人 IL-12B)、SEQ ID NO :5 (人 IL-18)、SEQ ID N0:7(人 IL-22)、SEQ ID NO :9 (人 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO :11 (人REG1A)、SEQ ID N0:13(人 REG1B)、SEQ ID NO :15(人 REG3A，變體 1)、SEQ ID NO :17(人 REG3A，變體 2)、SEQ ID NO 19(人 REG3A，變體 3)、SEQ ID NO :21 (人 REG3G，變體 2)、SEQ ID NO :23 (人 REG3G，變體 1)、 SEQ ID NO 25 (人 REG4)、SEQ ID NO 27 (鼠 IL-6) ,SEQID NO 29 (鼠 IL-12B)、SEQ ID NO 31 (鼠 IL-18)、SEQ ID NO 33(鼠 IL-22)、SEQ ID NO 35(鼠 IL-23 pl9 或 IL-23A)、SEQ ID NO 37 (鼠 PAP)、SEQ ID NO 39 (鼠 REG1)、SEQ ID NO 41 (鼠 REG2)、SEQ ID NO 43 (鼠 REG3A)、SEQ IDNO :45 (鼠 REG3D)、SEQ ID NO :47 (鼠 REG4)、SEQ ID NO :49 (人LT α )、SEQID NO :51 (人 LT β )、SEQ ID NO :53 (鼠 LT α )、禾口 SEQ ID NO :55 (鼠 LT β )。「天然序列AMP多肽」或「天然序列AMP多肽」指與衍生自自然界的相應AMP多肽 包含相同胺基酸序列的多肽。此類天然序列AMP多肽可以從自然界分離，或者可以通過重 組或合成手段生成。該術語明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的特定AMP多肽(例如缺 少其相關信號肽的IL-22)、該多肽的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在 等位變體。在本發明的各種實施方案中，本文中所公開的天然序列AMP多肽是成熟的或全 長的天然序列多肽。多肽「變體」指與全長天然多肽序列具有至少約80%胺基酸序列同一性的活性多 肽。通常，多肽變體與全長的或成熟的天然多肽序列將具有至少約80%的胺基酸序列同一性、或者至少約81%的胺基酸序列同一性、或者至少約82%的胺基酸序列同一性、或者 至少約83%的胺基酸序列同一性、或者至少約84%的胺基酸序列同一性、或者至少約85% 的胺基酸序列同一性、或者至少約86%的胺基酸序列同一性、或者至少約87%的胺基酸序 列同一性、或者至少約88%的胺基酸序列同一性、或者至少約89%的胺基酸序列同一性、 或者至少約90%的胺基酸序列同一性、或者至少約91%的胺基酸序列同一性、或者至少約 92%的胺基酸序列同一性、或者至少約93%的胺基酸序列同一性、或者至少約94%的氨基 酸序列同一性、或者至少約95%的胺基酸序列同一性、或者至少約96%的胺基酸序列同一 性、或者至少約97%的胺基酸序列同一性、或者至少約98%的胺基酸序列同一性、和或者 至少約99%的胺基酸序列同一性。「百分比(％ )胺基酸序列同一性」定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最 大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與 特定或參照多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序 列同一性目的的對比可以本領域技術範圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算 機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可決定 用於測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。對於氨 基酸序列比較，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)、或針對(against)給定胺基酸序 列B的％胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列 B的某一％胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算分數 X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的胺基酸殘基 數，且其中Y是B中的胺基酸殘基總數。可以領會，若胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B 的長度不相等，則A相對於B的％胺基酸序列同一性將不等於B相對於A的％胺基酸序列 同一性。作為使用這種方法計算％胺基酸序列同一性的例子，下文表1和2演示了如何計 算指派為「參照蛋白質」的胺基酸序列相對於指派為「IL-22」的胺基酸序列的％胺基酸序 列同一性，其中「IL-22」代表感興趣IL-22多肽的胺基酸序列，「參照蛋白質」代表感興趣 「IL-22」多肽針對其進行比較的多肽的胺基酸序列，而「X」、「Y」和「Z」各自代表不同氨基 酸殘基。表 1IL-22XXXXXXXXXXXXXXX (長度=15 個胺基酸)參照蛋白質 XXXXXYYY YYYY (長度=12個胺基酸)%胺基酸序列同一性=(兩種多肽序列間相同匹配的胺基酸殘基的數目)除以 (IL-22多肽的胺基酸殘基的總數)=5除以15 = 33. 3%表2IL-22XXXXXXXXXX(長度=10 個胺基酸)參照蛋白質 XXXXXYYYYYYZZYZ (長度=15個胺基酸)%胺基酸序列同一性=(兩種多肽序列間相同匹配的胺基酸殘基的數目)除以 (IL-22多肽的胺基酸殘基的總數)=5除以10 = 50%「分離的」生物學分子，諸如本文中所披露的各種多肽、多核苷酸、和抗體，指已經 鑑定且自其天然環境的至少一種成分分開和/或回收的生物學分子。
「有活性的」或「活性」涉及多肽時指天然多肽的生物學和/或免疫學活性，其中 「生物學」活性指除誘導針對天然多肽所擁有的抗原性表位的抗體生成的能力外的天然多 肽生物學功能。「免疫學」活性指誘導針對天然多肽所擁有的抗原性表位的抗體生成的能 力。術語「拮抗劑」以最廣義使用，而且包括部分地或完全的阻斷、抑制、或中和多肽生 物學活性的任何分子。「拮抗劑」還涵蓋完全地或部分地抑制編碼多肽的mRNA轉錄或翻譯 的分子。合適的拮抗劑分子包括例如拮抗性抗體或抗體片段；天然多肽的片段或胺基酸序 列變體；肽；反義寡核苷酸；有機小分子；及編碼多肽拮抗劑或拮抗性抗體的核酸。提及「一 種」拮抗劑涵蓋單一拮抗劑或者兩種或更多種不同拮抗劑的組合。術語「激動劑」以最廣義使用，而且包括部分地或完全地模擬多肽(例如天然AMP) 生物學活性的任何分子。「激動劑」還涵蓋刺激編碼多肽的mRNA轉錄或翻譯的分子。合適 的激動劑分子包括例如激動性抗體或抗體片段；天然多肽；天然多肽的片段或胺基酸序列 變體；肽；反義寡核苷酸；有機小分子；及編碼多肽激動劑或抗體的核酸。提及「一種」激動 劑涵蓋單一激動劑或者兩種或更多種不同激動劑的組合。「抗微生物免疫應答」包括但不限於對微生物病原體感染的抵抗或防禦。所述抵抗 或防禦可導致對微生物病原體的微生物感染性、複製、增殖或其它活性的抑制或降低。具體 而言，導致抗微生物免疫應答的治療可導致微生物病症或微生物病症症狀的緩解。「緩解」、「減輕」或其等同表述指治療性處理和預防性或防範性措施二者，其中目 標是緩解、預防、減緩(減輕)、降低/減少或抑制所針對的微生物病症或其症狀。需要治療 的受試者包括那些早就患有病症的以及傾向於患上病症的或者要預防病症的。關於治療微生物病症，「治療」、「處理」、或其等同表述指改善具有病症的受試者中 的微生物病症或微生物病症症狀。「長期」施用指與短期模式相反，以連續模式施用藥劑，從而將初始治療效果維持 較長一段時間。「間歇」施用指不是無間斷連續進行的治療，而是本質上周期性的。為了治療的目的，「哺乳動物」指歸入哺乳類的任何動物，包括人，嚙齒類(例如小 鼠和大鼠)，和猴；家畜和牲畜；及動物園、運動、實驗或寵物動物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、 豬、山羊、家兔、等。在有些實施方案中，哺乳動物選自人、嚙齒類、或猴。類似地，為了治療 的目的，「受試者」指哺乳動物受試者，而且包括人類和獸醫受試者。「聯合」一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)施用和任意次序的序貫施 用。如本文中所使用的，「載體」包括藥學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採 用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受載體是PH緩 衝水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗 氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明 膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天 冬醯胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性 劑，諸如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。「抗體」 (Ab)和「免疫球蛋白」(Ig)是具有相似結構特徵的糖蛋白。雖然抗體展現出對特定抗原的結合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏抗原特異性的其它抗體 樣分子二者。後一類多肽例如由淋巴系統以低水平生成及由骨髓瘤以升高的水平生成。術語「抗體」和「免疫球蛋白」以最廣義可互換使用，而且包括單克隆抗體(例如 全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體，只要它們展現出期望的生物學活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為 詳細描述的)。抗體可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。特異性結合特定抗原的抗體指能夠以足夠親和力結合抗原，使得該抗體在靶向抗 原中可用作診斷劑和/或治療劑的抗體。優選的是，根據例如放射免疫測定法(RIA)的測 量，此類抗體與非靶多肽的結合程度小於該抗體對靶抗原的結合的約10%。在某些實施 方案中，結合靶抗原的抗體具有彡luM,^ lOOnM、彡lOnM、彡InM、或彡0. InM的解離常數 (Kd)。抗體的「可變區」或「可變域」指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結構域。重鏈的可變 域可稱為「VH」。輕鏈的可變域可稱為「VL」。這些結構域一般是抗體的最易變部分且包含 抗原結合位點。術語「可變的」指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用於每種特定抗 體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性並非均勻分布於抗體的整個可變域。 它集中於輕鏈和重鏈可變域中稱作互補決定區(CDR)或高變區(HVR)的三個區段。可變域 中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區， 它們大多採取摺疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成摺疊片結構一 部分的三個⑶R連接。每條鏈中的⑶R通過FR區非常接近的保持在一起，並與另一條鏈 的⑶R—起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。 恆定域不直接涉及抗體對抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞的 細胞毒性中抗體的參與。根據其恆定域的胺基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕 鏈」可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(入)。根據其重鏈恆定域胺基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白 分成五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGp IgG2、IgG3、IgG4、化~和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恆定域分別稱作a、 S、￡、y和P。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和三維構造是眾所周知的，而且一般性記 載於例如Abbas等，Cellular and Mol. Immunology，第4版(2000)。抗體可以是抗體與一 種或多種其它蛋白質或肽共價或非共價關聯而形成的更大融合分子的一部分。術語「全長抗體」和「完整抗體」在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體 而非如下文所定義的抗體片段。該術語具體指重鏈包含Fc區的抗體。「抗體片段」只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在於完整抗體 中時通常與之有關的至少一項、多至大多數或所有功能。在一個實施方案中，抗體片段包含 完整抗體的抗原結合位點，如此保留結合抗原的能力。在另一個實施方案中，抗體片段，例 如包含Fc區的抗體片段，保留Fc區存在於完整抗體中時通常與之有關的至少一項生物學 功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調控、ADCC功能和補體結合。在一個實施方案中，抗體片
16段是體內半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗 原結合臂，其與能夠賦予該片段以體內穩定性的Fc序列相連接。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各自具有 一個抗原結合位點，及一個剩餘的「Fc」片段，其名稱反映了它易於結晶的能力。胃蛋白酶 處理產生一個F(ab' )2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原。「Fv」是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv種類 由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFv) 種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連接，使得輕鏈和 重鏈在與雙鏈Fv種類類似的「二聚體」結構中相結合。正是在這種構造中，各可變域的三 個CDR相互作用而在VH-VL 二聚體表面上確定一個抗原結合位點。六個CDR共同賦予抗體 以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv) 也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低於完整結合位點。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域 (CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於重鏈CHI結構域的羧基末端增加了少數殘基， 包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對其中恆定域半胱氨酸 殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab『片段之間有 鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯形式。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於 一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與VL結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv能 夠形成結合抗原的期望結構。關於scFv的綜述參見Pluckthun，於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)。術語「雙抗體」指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (VH-VL)中包含相連接的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同 一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從 而產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更完整地記載於例 如 EP 404，097 ；W093/1161 ；Hudson 等(2003)Nat. Med. 9 :129_134 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)也 記載於 Hudson 等(2003) Nat. Med. 9 :129-134。如本文中所使用的，術語「單克隆抗體」指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體， 即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。 如此，修飾語「單克隆」表明抗體不是分立的抗體的混合物的特徵。在某些實施方案中，此 類單克隆抗體典型地包括包含結合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結合多肽序列是通過 包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結合多肽序列在內的過程獲得的。例如，選擇過程可 以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應 當理解，所選擇的靶物結合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結合 序列人源化、提高其在細胞培養物中的產量、降低其在體內的免疫原性、創建多特異性抗體 等，而且包含改變後的靶物結合序列的抗體也是本發明的單克隆抗體。與典型地包含針對 不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製備物不同，單克隆抗體製備物的每種單克
17隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體製備物的優勢在於它們 通常未受到其它免疫球蛋白的汙染。修飾語「單克隆」表明抗體從一群基本上同質的抗體獲得的特徵，不應解釋為要求 通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發明使用的單克隆抗體可通過多種技術來 生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler 等，Nature256 495(1975) ；Harlow 等，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,第 2 版 1988 ；Hammerling 等，於MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981) > 重組DNA法(參見例如美國專利No. 4,816, 567)、噬菌體展示技術(參見例如Clackson 等，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1992) ；Sidhu 等， J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004)；及 Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132 (2004))、及用於在具有部分或整個人免疫球蛋白基因座或編 碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(參見例如W0 98/24893 ； W0 96/34096 ；W0 96/33735 ；W091/10741 ；Jakobovits Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature 362 :255_258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33 (1993)；美國專利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ； 5, 633, 425 ；5, 661, 016 ；Marks 等，Bio. Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 856-859 (1994) ；Morrison, Nature 368 812-813 (1994) ；Fishwild 等， Nature Biotechnol. 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) 及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括「嵌合」抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍 生自特定物種或屬於特定抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩餘部分 與衍生自另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗 體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 ；及Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在一個實施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變 區殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家 兔或非人靈長類的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架 區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒 有找到的殘基。進行這些修飾可以是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體 將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於 非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗 體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。更多細 節參見 Jones 等，Nature321 :522-525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323-329(1988)； 及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考 文獻:Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105_115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 :1035-1038 (1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 428-433(1994)。
18
「人抗體」指擁有與由人生成的抗體的胺基酸序列對應的胺基酸序列和/或使用本 文所公開的用於生成人抗體的任何技術生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人 抗原結合殘基的人源化抗體。根據其重鏈恆定域的胺基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五 大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。「親和力成熟的」抗體指在抗體的一個或多個HVR中具有一處或多處改變、導致 該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。在一個實施方 案中，親和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成 熟的抗體可通過本領域已知規程來生成。Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992) 記載了通過VH和VL結構域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了 HVR和/或框架殘 基的隨機誘變:Barbas 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813 (1994) ；Schier 等， Gene 169 147-155 (1995) ；Yelton 等，J. Immunol. 155 1994-2004 (1995) Jackson 等， J. Immunol. 154 (7) :3310_9 (1995)；及 Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。「阻斷性」抗體、「中和性」抗體或「拮抗性」抗體指抑制或降低其所結合的抗原的 生物學活性的抗體。此類抗體可實質性地或完全地抑制抗原的生物學活性。如本文中所使用的，「激動性抗體」指部分地或完全地模擬感興趣多肽的生物學活 性的抗體。抗體「效應器功能」指那些可歸於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體 Fc區)且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合和補 體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細 胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。「結合親和力」通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶(例如抗 原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，如本文中所使用的，「結合親和 力」指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間1 1相互作用的內在結合親和力。分 子X對其配偶Y的親和力通常可用解離常數(Kd)來表述。親和力可通過本領域知道的常 用方法來測量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且趨於容易解離， 而高親和力抗體通常更快速地結合抗原且趨於保持更長時間的結合。本領域知道測量結合 親和力的多種方法，其中任一種都可用於本發明的目的。下文描述了具體的示例性實施方 案。在一個實施方案中，依照本發明的「Kd」或「Kd值」是通過如下測定法所述使用Fab 型式的目的抗體及其抗原實施的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的。通過在存在 未標記抗原的滴定系列的情況中，用最小濃度的1251標記抗原平衡Fab，然後用抗Fab抗體 包被的平板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(Chen，等(1999)J Mol Biol 293:865-881)。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5iig/ml捕捉用 抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨後用PBS中的2% (w/v)牛血 清清蛋白於室溫(大約23°C )封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc #269620)中，將100pM 或26pM[125I]_抗原與連續稀釋的目的Fab混合(例如與Presta等(1997) CancerRes. 57 4593-4599中抗VEGF抗體，Fab_12的評估一致)。然後將目的Fab溫育過夜；然而，溫育可持續更長時間(例如約65個小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉平板以進 行室溫溫育(例如1小時)。然後除去溶液，並用含0. 1 % Tween-20的PBS洗板8次。平 板乾燥後，加入150 u 1/孔閃爍液(MicroScint-20 ；Packard)，然後在Topcount伽馬計數 器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小於或等於最大結合之20%的濃度 用於競爭性結合測定法。依照另一個實施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)在 25°C使用固定化抗 原CM5晶片在約10個響應單位(RU)測量的。簡言之，依照供應商的說明書用鹽酸N-乙 基-N』-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基 化右旋糖苷生物傳感器晶片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至 5 u g/ml (約0. 2 y M)，然後以5 ill/分鐘的流速注入至獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋 白質。注入抗原後，注入1M乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，在25°C以約 25 u 1/分鐘的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續稀釋的Fab (0. 78nM 至 500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖來計算結合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。 平衡解離常數(Kd)以比率k。ff/k。n計算。參見例如Chen，Y.等(1999) J Mol Biol 293 865-881。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過KfM—s—1，那麼結合速率可 使用螢光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(a stop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度計 (ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的情況中，測量PBS pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25°C的螢光發射強度(激發=295nm ；發射= 340nm, 16nm帶通)的升高或降低。白勺(on-rate, rate of association, association rate) 或「k。n」 也可如上所述使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM-3000 系統(BIAcore，Inc.， Piscataway, NJ)來測定。「分離的」抗體指已經鑑定且自其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環境的汙染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，而且可以包括酶、激素、 和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據 Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序 儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或(3)根據還原性或非還原性 條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少 一種成分不會存在，那麼分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將 通過至少一個純化步驟來製備。術語「標記物」在用於本文時指與某分子(諸如核酸、多肽、或抗體)直接或間接 偶聯以生成「經過標記的/帶標記物的」分子的可檢測化合物或組合物。標記物可以是自 身可檢測的(例如放射性同位素標記物或螢光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化 底物化合物或組合物發生化學改變，產生可檢測的產物。「固相」意指某分子(諸如核酸、多肽、或抗體)可粘著其上的非水性基質。本文中 所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂
20糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚矽氧烷(silicone)製成的固相。在某些實施方 案中，根據語境，固相可包括測定板的孔；在其它實施方案中，它指純化柱(例如親和層析 柱)。此術語還包括離散顆粒的不連續固相，諸如美國專利No. 4，275，149中所記載的。「脂質體」指由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的，可用於對哺乳動物 投遞藥物(諸如核酸、多肽、抗體、激動劑或拮抗劑)的小囊泡。脂質體的成分通常排列成 雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。「小分子」或「有機小分子」在本文中定義為分子量小於約500道爾頓的有機分子。結合靶多肽的「寡肽」指能夠以足夠親和力結合靶多肽，使得該寡肽在靶向多肽中 可用作診斷劑和/或治療劑的寡肽。在某些實施方案中，根據例如表面等離振子共振測定 法的測量，寡肽對無關非靶多肽的結合程度小於該寡肽對靶多肽的結合的約10%。在某些 實施方案中，寡肽以彡ΙμΜ、彡IOOnM,^ ΙΟηΜ、彡InM、或彡0. InM的解離常數(Kd)結合靶 多肽。結合靶多肽的「有機分子」指除本文中所定義的寡肽或抗體以外，能夠以足夠親 和力結合靶多肽，使得該有機分子在靶向多肽中可用作診斷劑和/或治療劑的有機分子。 在某些實施方案中，根據例如表面等離振子共振測定法的測量，有機分子對無關非靶多肽 的結合程度小於該有機分子對靶多肽的結合的約10%。在某些實施方案中，有機分子以 彡ΙμΜ、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM、或彡0. InM的解離常數(Kd)結合靶多肽。「生物學系統」指包含享有共同信號傳導途徑的哺乳動物細胞的體外、離體/回體 (ex vivo)、或體內系統。「微生物病症」指其中微生物病原體引起、介導、或以其它方式促成疾病或狀況的 發病的疾病或狀況。還包括其中刺激或幹預抗微生物應答對疾病進展具有改善效果的疾 病。此術語內包括傳染性疾病或狀況，和源自微生物病原體原發性感染的機會性疾病。此 類傳染病的例子包括但不限於由EHEC和EPEC引起的腹瀉、炎性腸病(IBD)和更具體的潰 瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。術語「Τ細胞介導的疾病」指其中T細胞直接或間接介導或以其它方式促成哺乳動 物發病的疾病。T細胞介導的疾病可能與細胞介導的效應、淋巴因子介導的效應等有關，甚 至與B細胞有關的效應，如果B細胞得到刺激的話，例如受到由T細胞分泌的淋巴因子的刺激。「自身免疫性病症」或「自身免疫(性)，，指其中發生了針對身體自己組織的體液 或細胞介導的免疫應答的任何疾患。「IL-23介導的自身免疫性病症」指由IL-23活性引起 的、維持的、或加劇的任何自身免疫性病症。「炎症」指損傷或感染部位白細胞的積累和血管的擴張，典型地引起疼痛、腫脹、和 發紅。「慢性炎症」指引起炎症的原因持續存在且難以或不可能消除的炎症。「自身免疫性炎症」指與自身免疫性病症有關的炎症。「關節炎炎症」指與關節炎有關的炎症。「炎性腸病」或「IBD」指特徵為胃腸道炎症的慢性病症。IBD涵蓋潰瘍性結腸炎， 其影響大腸和/或直腸，及克羅恩氏病，其可以影響整個胃腸系統，但更常見的是影響小腸 (迴腸)和可能的大腸。
21
術語「有效量」指某分子(例如核酸、多肽、激動劑、或拮抗劑)導致具體所述目的 實現的濃度或量。「有效量」可以憑經驗來確定。「治療有效量」指某分子有效實現所述治 療效果的濃度或量。此量也可以憑經驗來確定。如本文中所使用的，術語「細胞毒劑」指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞 的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如Ι131、1125、γ9°和Re186)、化療劑、和毒素諸如細 菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段。「生長抑制劑」在用於本文時指在體外或在體內抑制細胞，尤其是過表達任何基因 的細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑是顯著降低處於S期的過表達所述基因 的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處於S期以外的位置) 的藥劑，諸如誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春藥類(Vincas) (長春新鹼(vincristine)和長春鹼(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓撲異構酶II抑制 劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、依託 泊苷(etoposide)和博來黴素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如 DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、 雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟 尿啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara_C。更多信息可參見 TheMolecular Basis of Cancer, Mendelsohn 禾口 Israel 編，第 1 章， 題 為 『『Cell eyeleregulation, oncogenes, and antineoplastic drugsMurakami ^,WB Saunders, Philadelphia (1995)，jtMMM 13術語「細胞因子」是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用於另一種細胞群的 蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子 中包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨醯人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素； 甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、 促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎 盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β ；淋巴毒素-α和-β ；穆勒氏(Mullerian)抑制 性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小 板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-β ；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸 如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長因子_1和-II ；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子 (osteoinductive factor)；幹擾素，諸如幹擾素-α、-β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，諸如 巨噬細胞CSF (M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF (GM-CSF)和粒細胞CSF (G-CSF)；白介素(IL)， 諸如 IL-U IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 IL-6、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23 ；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β ；及其它多肽因子， 包括LIF和kit配體(KL)。如本文中所使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重 組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。如本文中所使用的，術語「炎症細胞」指增強炎症應答的細胞，諸如單個核細胞、嗜 曙紅細胞、巨噬細胞和多形核嗜中性細胞(PMN)。II.本發明的組合物和方法A.抗微生物多肽(AMP)及其調控劑本發明的抗微生物多肽(AMP)指介導或以其它方式影響對微生物病原體的抗微 生物免疫應答的多肽。本發明的AMP包括但不限於LT、IL-6、IL-22、IL-23 (包括例如IL-23pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因編碼的Reg或Reg相關蛋白。Reg超家族包括來 自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相關基因，而且分成四個亞類，即I型、II型、III型、和IV 型。例如，I型包括人REGI α、人REG I β、大鼠Regl、和小鼠RegI ；II型包括小鼠RegII ； III型包括人REGIII、人HIP/PAP(在肝細胞癌-腸-胰中表達的基因/編碼胰腺炎相關蛋 白的基因)、大鼠 PAP/ 肽 23、大鼠 RegIII/ΡΑΡΙΙ、大鼠 PAP III、小鼠 RegIII α ,RegIII β、 RegIII Y、小鼠RegIII δ、和倉鼠INGAP(胰島新生相關蛋白)。IV型含有人REGIV。另外， 人Reg相關序列(RS)據報告是假基因。在一個實施方案中，所述REG蛋白質由人REG基因 家族的成員編碼，包括但不限於REG Ia、REG I β、HIP/PAP、REG III, REG IV、和Reg相關 序列(RS)。在一些方面，本發明AMP的胺基酸序列包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36、SEQ IDNO 38,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、禾口 SEQ IDNO :56。在其它方面，編碼本發明AMP的核酸序列包含選自下組的核酸序列SEQ ID NO USEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:13、 SEQ ID N0:15、SEQ ID NO : 17、SEQID NO : 19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 49,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :53、和 SEQ IDNO :55。本發明AMP的活性可以相對於另一種AMP或同一種AMP的活性提高或降低和/或 差異調節。本發明AMP的活性的例子包括但不限於AMP表達、信號轉導、結合至結合配偶、 抗微生物應答、或其其它生物學或免疫學活性。在一個實施方案中，一種或多種本發明AMP的活性的升高導致受試者中抗微生物 免疫應答的增強或誘導。在一個實施方案中，本發明的AMP包括但不限於與IL-22直接或間接相互作用的 多肽，例如位於介導宿主對微生物病原體(例如細菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信號 轉導途徑的上遊或下遊的多肽。此類AMP的例子包括但不限於LT、IL-6、IL-18、和IL-23(包 括例如 IL-23 ρ 19 或 IL-23 p40)。本發明的調控劑包括但不限於直接或間接調控AMP活性的多肽和核酸分子(例如 DNA分子或RNA分子)。所述調控的例子包括但不限於本發明AMP活性的升高、降低、誘導 或活化、抑制、或調節(例如上調或下調)。在一個具體的實施方案中，所述調控劑通過降低或抑制IL-22結合蛋白(BP)活性 並由此提高IL-22活性來間接調控IL-22活性。在又一個實施方案中，所述調控劑降低或 抑制IL-22BP結合IL-22並由此提高IL-22活性。在一些實施方案中，所述調控劑是多肽，例如結合AMP或以其它方式與AMP相互作 用以提高、誘導、或調節AMP活性的多肽。在一個實施方案中，所述調控劑是調控AMP活性 的融合多肽。
在一個實施方案中，所述調控劑是結合AMP的抗體。在一個具體的實施方案中， 所述抗體是單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述抗體是選自Fab、Fab' _SH、Fv、scFv、 或(Fab』)2片段的抗體片段。在另一個實施方案中，所述抗體是融合多肽(例如Fc融合多 肽)。在另一個實施方案中，所述抗體是嵌合抗體。在一個具體的實施方案中，所述抗體是 人源化的。在另一個實施方案中，所述抗體是人抗體。在另一個實施方案中，所述抗體與選 自人、非人靈長類、或其它哺乳動物(例如豬、綿羊、家兔、土撥鼠、大鼠、或小鼠)的抗體結 合相同表位。在一個具體的實施方案中，所述抗體是AMP激動劑。在一個具體的實施方案中，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例如 DNA或RNA分子)。在另一個具體的實施方案中，所述調控劑是重組AMP或編碼AMP的核酸分子(例 如DNA或RNA分子)，其能在細胞中表達。本發明的AMP涵蓋天然全長或成熟AMP及其變體。AMP變體可以通過向編碼AMP 的DNA中引入適宜核苷酸變化和/或通過合成期望的抗微生物多肽來製備。本領域技術人 員會領會，胺基酸變化可能改變本發明多肽的翻譯後加工，諸如改變糖基化位點的數目或 位置或改變膜錨定特徵。如本文中所描述的，在天然AMP中或在AMP的各個結構域中的變異可以通過，例 如，使用保守性和非保守性突變的任何技術和原則，例如美國專利No. 5，364，934中所列舉 的來產生。變異可以是編碼AMP的一個或多個密碼子的替代、刪除或插入，其導致與天然序 列AMP相比AMP的胺基酸序列中的變化。任選的，所述變異是在AMP的一個或多個結構域中 至少一個胺基酸用任何其它胺基酸替代。確定哪個胺基酸殘基可以被插入、替代或刪除而 不會不利地影響期望活性的指導可以通過比較AMP的序列與同源的已知蛋白質分子的序 列並最小化在高同源性區域中進行的胺基酸序列改變的數目來發現。胺基酸替代可以是一 個胺基酸用具有相似結構和/或化學性質的另一個胺基酸替換的結果，諸如用絲氨酸替換 亮氨酸，即保守性胺基酸替換。插入或刪除可以任選地在約1到5個胺基酸的範圍內。通 過在序列中系統性地產生胺基酸的插入、刪除或替代並對使得變體測試由全長或成熟天然 序列展現的活性，可以確定容許的變異。在特定的實施方案中，感興趣的保守性替代在表3中優選替代表頭下顯示。如果 這種替代導致生物學活性的改變，那麼引入更為實質性的改變，在表6中稱為例示替代，或 如下文對於胺基酸種類所進一步描述的，並篩選產物。表3
初始殘基例示替代優選替代
Ala(A)val ；Ieu ；ileval
Arg(R)Iys ；gin ；asnIys
Asn(N)gin ；his ；Iys ；arggin
Asp (D)gluglu
Cys(C)serser
Gln(Q)asnasn
Glu(E)aspasp
240182]Gly(G)pro ；alaala0183]His(H)asn ；gin ；Iys ；argarg0184]Ile(I)Ieu ；val ；met ；ala ；phe ；正亮氨酸Ieu0185]Leu(L)正亮氨酸；ile ；val ；met ；ala ；pheile0186]Lys(K)arg ；gin ；asnarg0187]Met (M)Ieu ；phe ；ileIeu0188]Phe (F)Ieu ；val ；ile ；ala ；tyrIeu0189]Pro (P)alaala0190]Ser(S)thrthr0191]Thr(T)serser0192]Trp (W)tyr ；phetyr0193]Tyr(Y)trp ；phe ；thr ； serphe0194]Val(V)ile ；Ieu ；met ；phe ；ala ；正亮氨酸Ieu0195]AMP多肽的功能或免疫學身份中的實質性修飾可通過選擇對保持下述各項的影
響差異顯著的替代來完成(a)替代區域的多肽主鏈的結構，例如作為摺疊片或螺旋構象， (b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(C)側鏈的體積。基於共同的側鏈特性，可以將天然 存在殘基分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile ；(2)中性、親水性的cys、ser、thr ；(3)酸性的asp、glu ；(4)喊個生的:asn> gln>his> lys> arg ；(5)影響鏈取向的殘基gly、pro ；和(6)芳香族的:trp、tyr、phe。非保守性替代需要交換這些類別或其它類別之一的成員。這種替代的殘基也可以 被導入保守性替代位點，或更優選的，導入其餘的(非保守性)位點。可以使用本領域已知的方法產生變異，諸如寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨 酸掃描和PCR誘變。可以對克隆的DNA實施定點誘變[Carter等，Nucl. Acids Res. ,13 4331(1986) ；Zoller 等，Nucl. Acids Res.，10 :6487 (1987)]、盒式誘變[Wells 等，Gene, 34 315 (1985)]、限制性選擇誘變[Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317 415 (1986)]或其它已知的技術來產生編碼AMP變體的DNA。本文中還提供了 AMP或本發明其它多肽的片段。這些片段可以是在N-末端或 C-末端截短的，或可以缺少內部殘基，例如，當與全長天然蛋白質相比較時。某些片段缺乏 對於AMP或本發明多肽的期望生物學活性非關鍵的胺基酸殘基。因而，在某些實施方案中， AMP或本發明其它多肽的片段是有生物學活性的。在某些實施方案中，全長AMP的片段缺少 N-末端信號肽序列。在某些實施方案中，全長AMP的片段是膜結合的AMP的可溶形式。例 如，AMP的可溶形式可以缺少所有的或實質性部分的跨膜結構域。AMP或本發明其它多肽的共價修飾被包括在本發明的範圍內。一種類型的共價修 飾包括使本發明多肽的目標胺基酸殘基與有機衍生化試劑起反應，所述試劑能夠與多肽的 選定的側鏈或N-或C-末端殘基起反應。使用雙功能試劑衍生化是有用的，例如，對於將多肽交聯至水不溶性的支持基質或表面，用於純化多肽的抗體的方法，反之亦然。通常使用的 交聯劑包括，例如，1，1_ 二(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯例如與 4_疊氮水楊酸的酯、同雙功能亞氨酸酯包括雙琥珀醯亞氨基酯諸如3，3' -二硫代二(琥 珀醯亞氨基丙酸酯)、雙功能馬來醯亞胺諸如二 -N-馬來醯亞氨基-1，8-辛烷、和試劑諸如 3-[(p_疊氮苯基)二硫代]亞氨基丙酸甲酯。其它修飾包括穀氨醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基分別向相應的穀氨醯和天 冬氨醯殘基的脫醯胺作用，脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用，絲氨醯或蘇氨醯殘基的 羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的α氨基的甲基化[T.E.Creighton， Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman &Co. , San Francisco, PP. 79-86 (1983) ]，N-末端胺的乙醯化和任何C-末端羧基的醯胺化。包括在本發明的範圍內的本發明多肽的另一類共價修飾包含改變多肽的天然糖 基化模式。「改變天然的糖基化模式」在此意指刪除本發明多肽的天然序列中發現的一個或 多個碳水化合物模塊(通過除去潛在的(underlying)糖基化位點，或通過化學的和/或酶 學的方法刪除糖基化)，和/或添加多肽天然序列中不存在的一個或多個糖基化位點。此 外，該用語包括在天然蛋白質的糖基化方面的定性改變，包括在存在的各種碳水化合物模 塊的性質和比例方面的改變。本發明的多肽也可以以一定方式修飾來形成嵌合分子，其包含與另一個異源 多肽或胺基酸序列融合的所述多肽。在一個實施方案中，嵌合分子包含所述多肽與標 籤多肽的融合物，該標籤多肽提供抗標籤抗體能選擇性結合的表位。表位標籤一般置 於所述多肽的氨基或羧基末端。所述多肽的這種帶表位標籤的形式的存在可以使用針 對所述帶標籤多肽的抗體來檢測。並且，提供表位標籤使AMP能夠容易地使用抗標籤 抗體或其它類型結合表位標籤的親和基質通過親和純化來純化。各種標籤多肽和它 們相應的抗體是本領域公知的。例子包括聚組氨酸(poly-his)或聚組氨酸-甘氨酸 (poly-his-gly)標籤；流感 HA 標籤多肽和它的抗體 12CA5 [Field 等，Mol. Cell. Biol, 8 2159-2165(1988)] ；c-myc 標籤和它的抗體 8F9、3C7、6E10、G4、B7 禾Π 9E10[Evan 等， Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985)]；及單純皰疹病毒糖蛋白 D (gD) 標籤和它的抗體[Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6) :547_553 (1990)]。其它的標 籤多肽包括 Flag 肽[Hopp 等，BioTechnology, 6 1204-1210 (1988) ] ；KT3 表位肽[Martin 等，Science, 255 192-194 (1992) ] ； α -微管蛋白表位肽[Skinner 等，J. Biol. Chem.，266 15163-15166(1991)]；和 T7 基因 10 蛋白肽標籤[Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6393-6397(1990)]。在另一個實施方案中，嵌合分子可以包含本發明多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白 的特定區的融合物。對於二價形式的嵌合分子(也稱為「免疫粘附素」)，這種融合物可以 是IgG分子的Fc區。Ig融合物優選的包括可溶形式的本發明多肽(例如AMP或其多肽調 控劑)代替Ig分子內至少一個可變區的替代。在一個特別優選的實施方案中，免疫球蛋白 融合物包括IgGl分子的鉸鏈、CH2和CH3，或鉸鏈、CHl、CH2和CH3區。關於免疫球蛋白融 合物的生成也參見1995年6月27日公告的美國專利No. 5，428，130。1.多肽的製備本發明的多肽可以通過常規的重組方法來製備，例如，培養用含編碼AMP或其多肽調控劑的核酸的載體轉化或轉染的細胞。還提供了包含任何這樣的載體的宿主細胞。舉 例來說，宿主細胞可以是CHO細胞、大腸桿菌或酵母。進一步提供了生產任何在此描述的多 肽的方法，包括在適合於表達期望的多肽的條件下培養宿主細胞，並從細胞培養物回收期 望的多肽。在其它實施方案中，本發明提供了嵌合分子，其包含融合有異源多肽或胺基酸序 列的任何在此描述的多肽。這種嵌合分子的例子包括但不限於融合有表位標籤序列或免疫 球蛋白Fc區的任何在此描述的多肽。本領域公知的可選擇的方法也可被用來製備本發明的多肽。例如，編碼多 肽或其部分的序列可以通過利用固相技術的直接肽合成來產生[參見，例如Stewart 等，Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. , San Francisco, CA(1969)； Merrifield, J. Am. Chem. Soc，85 =2149-2154 (1963) ] 可以利用人工技術或通過自動化進 行體外蛋白質合成。舉例來說，可以利用AppliedBiosystems肽合成儀(Foster City,CA) 利用廠商的說明實現自動化合成。可以分別化學合成本發明多肽或其部分的各個部分並利 用化學的或酶學的方法組合來產生全長多肽或其部分。重組表達的本發明多肽可以從培養液或從宿主細胞溶胞物回收。以下規程是適 合的純化規程的示範在離子交換柱上的分級；乙醇沉澱；反相HPLC ；在矽土上或在陽離子 交換樹脂諸如DEAE上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉澱；利用例如S印hadex G-75 的凝膠過濾；蛋白A Sepharsoe柱以除去汙染物諸如IgG ；和金屬螯合柱來結合帶表位標 籤形式的本發明多肽。可以使用蛋白質純化的各種方法，這樣的方法是本領域已知的，在 例如 Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ；Scopes, Protein Purification Principles andPractice, Springer-Verlag, New York (1982)中有記載。選擇的純化步驟 將取決於，例如，採用的生產方法和生產的特定多肽的性質。LT多肽可以通過表達帶標籤的 LT多肽(諸如例如LT α標籤多肽(SEQ ID NO 61))來純化。2.基因表達的檢測編碼本發明多肽的基因的表達可以通過本領域的各種方法來檢測，例如，通過檢 測編碼多肽的mRNA的表達。如在此使用的，術語「檢測」涵蓋定量的或定性的檢測。通過 檢測本發明多肽的基因表達，能鑑定例如表達此基因的那些組織。基因表達可以使用本領 域技術人員已知的某些方法來測量，例如，Northern印跡(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 5201-5205[1980])；定量PCR ；或原位雜交，其利用根據在此提供的序列的適當標 記的探針。或者，基因表達可以通過免疫學的方法來測量，諸如對組織切片的免疫組織化學 染色，和對細胞培養物或體液的測定法，來直接對基因產物的表達定量。對樣品液體的免疫 組織化學染色和/或測定法有用的抗體涵蓋在此提供的任何抗體。方便地，抗體可以針對 編碼例如本發明AMP的天然序列；針對包含AMP序列的片段的合成肽；或針對融合至AMP多 肽或其片段的外源序列(包括合成肽)來製備。B.抗體提供了結合任何上述或下述多肽的抗體。在一個實施方案中，提供了結合本發明 AMP並由此調控AMP活性(例如提高AMP活性)的分離的抗體。例示性的抗體包括多克隆 的、單克隆的、人源化的、人的、雙特異性的、和異源偶聯的抗體。抗體可以是抗體片段，例如 Fab、Fab' _SH、Fv、scFv、或(Fab' )2片段。在一個實施方案中，提供了結合IL-22的分
27離的抗體。在一個這樣的實施方案中，抗體部分地或完全地提高本發明AMP的活性。結合本發明AMP的例示性單克隆抗體在本文中有描述。這些抗體包括抗IL-22抗 體，稱為 3F11.3(〃 3F11" )、11Η4·4(" 11Η4")、和 8Ε11.9(〃 8Ε11")，及抗 IL-22R 抗 體，稱為 7Ε9. 10. 8(" 7Ε9" )、8Α12. 32(" 8Α12" )、8Η11. 32. 28 (「 8Η11")、和 12Η5。在一 個實施方案中，提供了生成任何那些抗體的雜交瘤。在一個實施方案中，提供了與3F11. 3、 11Η4. 4、或8Ε11. 9競爭IL-22結合的單克隆抗體。在另一個實施方案中，提供了與3F11. 3、 11Η4.4、或8Ε11.9結合相同表位的單克隆抗體。在另一個實施方案中，提供了與7Ε9、8Α12、 8Η11、或12Η5競爭IL-22R結合的單克隆抗體。在一個實施方案中，提供了與7Ε9、8Α12、 8Η11、或12Η5結合相同表位的單克隆抗體。下文提供了抗體的各種實施方案1.多克隆抗體抗體可包括多克隆抗體。用於製備多克隆抗體的方法是熟練技術人員已知的。多 克隆抗體可在哺乳動物中生成，例如通過一次或多次注射免疫劑和根據需要的佐劑。通常， 免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下或腹膜內注射而注射到哺乳動物中。免疫劑可包括感興 趣多肽或其融合蛋白。將免疫劑與已知在所免疫哺乳動物中有免疫原性的蛋白質偶聯可能 是有用的。此類免疫原性蛋白質的例子包括但不限於匙孔i威血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀 腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可採用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑 (單磷醯基脂質A、合成的二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以由本領域技術人員無需過 多實驗做出選擇。2.單克隆抗體或者，抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可使用雜交瘤法製備，諸如Kohler和 Milstein,Nature 256 =495(1975)所述。在雜交瘤法中，小鼠、倉鼠或其它適宜的宿主動物 通常用免疫劑免疫以引發生成或能夠生成將特異性結合免疫劑的抗體的淋巴細胞。或者， 可以在體外免疫淋巴細胞。免疫劑將通常包括感興趣多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴細胞 (「PBL」)，若希望人起源的細胞，或是使用脾細胞或淋巴結細胞，若希望非人哺乳動物來源。 然後，使用合適的融合劑，諸如聚乙二醇，將淋巴細胞與永生化細胞系融合以形成雜交瘤細 胞(Goding,Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,Academic Press(1986), PP. 59-103)。永生化細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類、牛和人起源的骨髓 瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可在合適的培養基中培養，所述 培養基優選含有抑制未融合的永生化細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親本 細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，那麼用於雜交瘤的培養基通 常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(「HAT培養基」)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。優選的永生化細胞系是那些高效融合、支持選定的抗體生成細胞穩定的高水平 的表達抗體、並對諸如HAT培養基等培養基敏感的細胞系。更優選的永生化細胞系是鼠 源骨髓瘤系，可從例如索爾克研究所細胞分配中心(Salklnstitute Cell Distribution Center, San Diege, California)和美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)獲得。用於生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人 異源骨髓瘤細胞系也已有記載(Kozbor，J. Immunol. 133 3001 (1984) ；Brodeur等， Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.,
28New York(1987)pp. 51—63)。然後可對雜交瘤細胞在其中培養的培養基測定結合感興趣多肽的單克隆抗體的 存在。優選的是，通過免疫沉澱或通過體外結合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯 免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。此類技術和 測定法是本領域已知的。單克隆抗體的結合親和力可通過例如Munson和Pollard，Anal. Biochem. 107 220(1980)的 Scatchard 分析來測定。在鑑定得到期望的雜交瘤細胞後，該克隆可通過有限稀釋規程進行亞克隆，並通 過標準方法進行培養(Goding，見上文)。適於這一目的的培養基包括例如Dulbecco氏改 良的Eagle氏培養基和RPMI-1640培養基。或者，雜交瘤細胞可在哺乳動物中作為腹水進 行體內培養。可通過常規免疫球蛋白純化規程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝 膠電泳、透析或親和層析，自培養液或腹水分離或純化亞克隆分泌的單克隆抗體。單克隆抗體可以通過使用組合文庫篩選具有期望活性的抗體來創建。例如，本領 域知道用於生成噬菌體展示文庫和對此類文庫篩選具有所需結合特徵的抗體的多種方法。 此類方法一般性的記載於Hoogenboom等(2001)於Methods in Molecular Biology 178 1-37(0' Brien 等，編，Human Press, Totowa，NJ)及(在某些實施方案中)Lee 等(2004) J. Mol. Biol. 340 :1073_1093。在原理上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示 融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(Fv)片段的噬菌體。通過針對期望抗原的親和 層析淘選此類噬菌體文庫。表達能夠結合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而 與文庫中不結合的克隆分開。然後將結合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原 吸附/洗脫循環進一步富集。本發明的任何抗體可以如下獲得，即設計合適的抗原篩選規 程來選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，NIH Pub1ication91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3中記載的合適的恆定區(Fe)序列構建全長抗體克隆。單克隆抗體還可通過重組DNA方法來生成，諸如美國專利No. 4，816，567中所述。 編碼本發明單克隆抗體的DNA易於使用常規規程分離和測序(例如使用能夠特異性結合編 碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。本發明的雜交瘤細胞是此類DNA的優選 來源。一旦分離，可將DNA置於表達載體中，然後將該表達載體轉染到不另外產生免疫球蛋 白蛋白質的宿主細胞中，諸如猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重 組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。還可以修飾DNA，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈 恆定域的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利No. 4，816，567 ；Morrison等，見上文)，或 者通過共價接合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列。可用此 類非免疫球蛋白多肽替代本發明抗體的恆定域，或者可用它替代本發明抗體的一個抗原結 合位點的可變域以產生嵌合二價抗體。3.單價抗體還提供了單價抗體。用於製備單價抗體的方法是本領域眾所周知的。例如，一種 方法牽涉免疫球蛋白輕鏈和經過修飾的重鏈的重組表達。重鏈被截短了，一般在Fc區內的 任何點，用以預防重鏈交聯。或者，相關半胱氨酸殘基被另一胺基酸殘基替代或者被刪除，用以預防交聯。體外方法也適於製備單價抗體。消化抗體以生成其片段，特別是Fab片段，可以使 用本領域知道的常規技術來實現。4.抗體片段還提供了抗體片段。抗體片段可以通過傳統手段，諸如酶促消化，或者通過重組技 術來生成。在某些情況中，使用抗體片段有優勢，而不是完整抗體。片段的較小尺寸容許快 速清除，而且可導致更易於接近實體瘤。關於某些抗體片段的綜述參見Hudson等(2003) Nat. Med. 9 129-134。已經開發了用於生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗 體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science 229:81(1985))。然而，現在可直接 由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達及由大 腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離 抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段並化學偶聯以形成F(ab' )2片段 (Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主 細胞培養物分離F(ab' )2片段。包含補救受體結合表位殘基、具有延長的體內半衰期的 Fab和F(ab' )2片段記載於美國專利No. 5，869，046。用於生成抗體片段的其它技術對於 熟練從業人員將是顯而易見的。在某些實施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185 ；美國專利No. 5，571，894 ；及5，587，458。Fv和scFv是具有完整結合位點、缺少恆 定區的唯一類型；如此，它們可能適於在體內使用時降低非特異性結合。可構建scFv融合 蛋白以生成效應器蛋白質在scFv的氨基或羧基末端的融合。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編，見上文。抗體片段還可以是「線性抗體」，例如如美國專利No. 5，641，870中 所記載的。此類線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。5.人源化抗體還提供了人源化抗體。本領域知道用於將非人抗體人源化的多種方法。例如，人源 化抗體可以具有一個或多個從非人來源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基常常稱作 「輸入」殘基，它們典型的取自「輸入」可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方 法進行(Jones 等(1986)Nature321 :522_525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323_327 ； Verhoeyen等(1988) Science 239 :1534_1536)，通過用高變區序列替代人抗體的相應序 列。因此，此類「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)，其中基本上少於整個 人可變域用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是其中一些高變 區殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用於構建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對於降低抗原性 可以是重要。依照所謂的「最適」(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人 可變域序列的整個文庫進行篩選。然後選擇與嚙齒類序列最接近的人序列作為人源化抗體 的人框架(Sims 等(1993) J. Immunol. 151 2296 ；Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 :901)。 另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。同一 框架可用於數種不同的人源化抗體(Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 ； Presta 等(1993)J. Immunol. 151 :2623)。
30
一般還希望抗體在人源化後保持對抗原的高親和力和其它有利的生物學特性。為 了實現這一目標，依照一種方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和 各種概念性人源化產物的方法來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的且 為本領域技術人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結 構的電腦程式。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可 能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體和輸入序 列選出FR殘基並進行組合，從而獲得期望的抗體特徵，諸如對靶抗原的親和力提高。一般 而言，高變區殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。6.人抗體還提供了人抗體。人抗體可以通過如上所述聯合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv 克隆可變域序列與已知的人恆定域序列來構建。或者，可以通過雜交瘤方法來生成本發 明的人單克隆抗體。用於生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已 有記載，例如 Kozbor J. Immunol. ，133 3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)；及 Boerner 等，J. Immunol.，147 86 (1991) ·現在有可能生成在缺乏內源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫後生成人抗體 完整全集的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈 連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移 大量人種系免疫球蛋白基因將導致在抗原攻擊後生成人抗體。參見例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) Jakobovits 等，Nature 362:255-258(1993)； Bruggermann 等，Year inlmmunol. 7 33 (1993)。基因改組也可用於自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有 與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為「表位印記」(印itope imprinting)，如本文所述通過噬菌體展示技術得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區 用人V結構域基因全集替換，產生非人鏈/人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進行的選擇 導致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級噬菌體展示克隆中恢復消除相 應的非人鏈時遭到破壞的抗原結合位點，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶的選擇。在 重複該過程以替換剩餘非人鏈時，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公布於1993年4月 1日)。與傳統的通過CDR移植進行的非人抗體的人源化不同，此技術提供完全人的抗體， 它們不含非人起源的FR或CDR殘基。7.雙特異性抗體還提供了雙特異性抗體。雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的 單克隆抗體。在某些實施方案中，雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實施方案 中，結合特異性之一針對感興趣的多肽，結合特異性之另一針對任何其它抗原。在某些實施 方案中，雙特異性抗體可結合感興趣的多肽的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用於將細 胞毒劑定位於表達感興趣多肽諸如細胞表面多肽的細胞。這些抗體擁有TAT226結合臂和 結合細胞毒劑(諸如例如肥皂草毒蛋白、抗幹擾素_α、長春花生物鹼類、蓖麻毒蛋白A鏈、 甲氨喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。可將雙特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段 (例如F(ab' )2雙特異性抗體)。
用於構建雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統的是，雙特異性抗體的 重組生產基於兩對免疫球蛋白重鏈_輕鏈的共表達，其中兩種重鏈具有不同的特異性 (Millstein和Cuello，Nature 305 =537(1983)) 由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配， 這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一 種具有正確的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩且產 物收率低。類似的規程披露於1993年5月13日公布的WO 93/08829及Traunecker等， EMBO J. 10 3655(1991)。依照一種不同的辦法，將具有期望結合特異性(抗體_抗原結合位點)的抗體可 變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。例如，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋 白重鏈恆定域進行融合。在某些實施方案中，在至少一種融合物中存在包含輕鏈結合所必 需的位點的第一重鏈恆定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋 白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，並共轉染到合適的宿主生物體中。在用於構建的三種 多肽鏈比例不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了 極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達導致高產量時或在該比例沒有特 別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。在該方法的一個實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性的雜 合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異 性)構成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑， 因此發現這種不對稱結構便於將期望的雙特異性複合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分 開。該方法披露於W094/04690。關於生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh等， Methodsin Enzymology 121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細胞培養物回收的 異二聚體的百分比最大化。界面包含至少部分抗體恆定域(^3結構域。在該方法中，將第 一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通 過將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界 面上產生與大側鏈相同或相似大小的補償性「空腔」。這提供了較之其它不想要的終產物諸 如同二聚體提高異二聚體產量的機制。雙特異性抗體包括交聯或「異源偶聯」抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可 與親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體已經建議用於將免疫系統細胞 靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)，及用於治療HIV感染(W0 91/00360, WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法來製備異源偶聯抗體。合適的交聯劑 是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起披露於美國專利No. 4，676，980。文獻中還記載了自抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來 製備雙特異性抗體。Brerman等，Science 229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗 體以生成F(ab' )2片段的規程。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下還原， 以穩定鄰近的二硫醇並防止分子間二硫鍵的形成。然後將產生的Fab』片段轉變為硫代硝 基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成 Fab'-硫醇，並與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生 的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
最新的進展便於從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，這些片段可化學偶聯以形 成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217_225 (1992)記載了完全人源化的雙特異 性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，並在體外進行定向化 學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表達HER2受體的細胞 和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細胞培養物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技 術。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體 的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原以形成單體，然後重新氧化以形成抗體異二 聚體。這種方法也可用於生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)記載的「雙抗體」技術提供了構建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段 包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)，所述接頭太短使得同一條鏈上 的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結構域與另一個片段上的互 補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報導了通過使用單鏈Fv(sFv) 二 聚體構建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol. 152 =5368(1994)。涵蓋具有超過兩個效價的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等， J. Immunol. 147 60(1991)。8.多價抗體還提供了多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體所結合抗原 的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易的通過編碼抗體多肽鏈的核 酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM 類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。在某些實施方 案中，二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體將包含Fc區 及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。在某些實施方案中，多價抗體包含(或由其 組成)三個至約八個抗原結合位點。在一個這樣的實施方案中，多價抗體包含(或由其組 成)四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中所述多肽 鏈包含兩個或更多個可變域。例如，多肽鏈可包含VDl- (Xl) n-VD2- (X2) n_Fc，其中VDl是第 一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，Xl和X2代表胺基酸或多肽，而η 是O或1。例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CHI-VH-CHI-Fc 區鏈。本文中的多價抗體可進一步包含至少兩條(例如四條)輕鏈可變域多肽。本文中的 多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕 鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。9.單結構域抗體還提供了單結構域抗體。單結構域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整 個或部分輕鏈可變區的單一多肽鏈。在某些實施方案中，單結構域抗體是人單結構域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham，MA ；參見例如美國專利No. 6，248，516 Bi)。在一個實施方案中， 單結構域抗體由整個或部分抗體重鏈可變域組成。10.抗體變體在有些實施方案中，涵蓋本文所述抗體的胺基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。抗體的胺基酸序列變體可以通過將適宜的變化引 入編碼抗體的核苷酸序列或通過肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘 基刪除和/或插入和/或替代。可進行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構建物，倘 若最終的構建物具有期望的特徵。可在製備序列時將胺基酸改變引入受試抗體胺基酸序 列。鑑定抗體中作為優選誘變位置的某些殘基或區域的一種有用方法稱作「丙氨酸掃 描誘變」，如 Cunningham 和 Wells (1989) Science 244 1081-1085 中所述。這裡，鑑定一個 殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和穀氨酸)並 用中性或帶負電荷的胺基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)替換，以影響胺基酸與抗原的相 互作用。然後通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲對替代展示功能敏感性的那 些胺基酸位置。由此，儘管用於引入胺基酸序列變異的位點是預先決定的，然而突變本身的 本質不必預先決定。例如，為了分析指定位點處突變的後果，在靶密碼子或區域進行丙氨酸 掃描或隨機誘變，並對所表達的免疫球蛋白篩選期望的活性。胺基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度範圍由一個殘基至包含 一百個或更多殘基的多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包 括具有N端甲硫氨醯殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶 (如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。在某些實施方案中，本發明的抗體被改變以提高或降低抗體糖基化的程度。多肽 的糖基化典型的或是N-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著於天冬醯胺 殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-χ-絲氨酸和天冬醯胺-χ-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外 的任何胺基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著於天冬醯胺側鏈的識別序列。如此，多肽中 這兩種三肽序列任一的存在產生了潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指將糖類N-乙醯 半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著於羥基胺基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用 5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加或刪除糖基化位點可通過改變胺基酸序列從而創建或消除一個或 多個上述三肽序列而便利的完成(用於N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始 抗體的序列中添加、刪除、或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用於0-連接的 糖基化位點)。若抗體包含Fc區，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國專利申請 No. US 2003/0157108 (Presta, L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結構附 著於抗體 Fc 區的抗體。還可參見 US 2004/0093621 (Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)。 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)和美國專利 No. 6，602, 684 (Umana 等人)中提 到了在附著於抗體Fc區的碳水化合物中有等分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO 1997/30087 (Patel等人)中報告了在附著於抗體Fc區的寡糖中有至少一個半乳糖殘基 的抗體。關於有更改碳水化合物附著於其Fc區的抗體還可參見WO 1998/58964(Raju, S.)和WO 1999/22764 (Raju, S.)。關於具有改良糖基化的抗原結合分子還可參見US 2005/0123546 (Umana 等)。在某些實施方案中，糖基化變體包含Fc區，其中附著於Fc區的碳水化合物 結構缺乏巖藻糖。此類變體具有改進的ADCC功能。任選的是，Fc區還包含進一步改
34進ADCC的一處或多處胺基酸替代，例如Fc區位置298、333和/或334處的替代(Eu殘 基編號方式)。涉及「脫巖藻糖型」或「巖藻糖缺乏型」抗體的出版物的例子包括US 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；W02001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865 ； W02003/085119 ；WO 2003/084570 ；WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742 ； Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336 1239-1249 (2004) ；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87 614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細胞系的例子包括蛋白質巖藻糖化缺陷的Lecl3 CHO 細胞(Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249 :533_545 (1986)；美國專利申請 No. US 2003/0157108 Al，Presta，L ；及 W02004/056312 Al，Adams 等，尤其是實施例 11)和敲除細 胞系，諸如α -1,6-巖藻糖轉移酶基因FUT8敲除的CHO細胞(Yamane-Ohnuki等Biotech. Bioeng. 87 :614(2004))。另一類變體是胺基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個胺基酸殘基用 不同殘基替換。進行替代誘變的感興趣位點包括高變區，但是也涵蓋FR改變。上文表3表 頭「優選替代」下顯示了保守替代。如果此類替代導致期望生物學活性變化，那麼可導入表 3中稱為「例示替代」的更實質變化，或如上文參照胺基酸類別進一步所述，並對所得抗體篩 選期望結合特性。一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘 基。通常，選擇用於進一步開發的所得變體相對於產生它們的親本抗體將具有改變的(例 如改良的)生物學特性。用於生成此類替代變體的一種便利方法牽涉使用噬菌體展示的親 和力成熟。簡言之，將數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，在每個位點產生所有可能 的胺基酸替代。如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個顆粒內包裝的至少 部分噬菌體外殼蛋白(例如M13基因III產物)的融合物。然後對噬菌體展示的變體篩選 其生物學活性(例如結合親和力)。為了鑑定用於修飾的候選高變區位點，可進行掃描誘 變(例如丙氨酸掃描)以鑑定對抗原結合具有重大貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析 抗原-抗體複合物的晶體結構以鑑定抗體和抗原之間的接觸點可能是有益的。所述接觸殘 基及鄰近殘基是依照本領域知道的技術，包括本文詳述的，進行替代的候選位點。一旦產生 這樣的變體，使用本領域知道的技術，包括本文所述的，對該組變體進行篩選，可選擇在一 種或多種相關測定法中具有優良特性的抗體用於進一步的開發。編碼抗體胺基酸序列變體的核酸分子可通過本領域知道的多種方法來製備。這些 方法包括但不限於從天然來源分離(在天然存在胺基酸序列變體的情況中)，或者通過對 較早製備的變體或非變體型式的抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒 式誘變來製備。可能希望在本發明抗體的Fc區中引入一處或多處胺基酸修飾，由此生成Fc區變 體。Fc區變體可包括在一個或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含胺基酸修飾(如 替代)的人Fc區序列(如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。依照此描述和本領域的教導，涵蓋的是，在有些實施方案中，本發明的抗體與野生 型對應抗體相比可在例如Fc區中包含一處或多處改變。與它們的野生型對應物相比，這 些抗體仍將基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認為可在Fc區中進行將會導 致Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(即或是增強或是削弱)的某些改變，例如W099/51642中所述。還可參見關注Fc區變體其它例子的Duncan和Winter，Nature 322 738-40 (1988)；美國專利 No. 5，648，260 ；美國專利 No. 5，624，821 ； R W094/29351。 W000/42072 (Presta)和WO 2004/056312 (Lowman)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體 變體。通過述及將這些專利出版物的內容明確收入本文。還可參見Shields等J.Biol. Chem. 9 (2) =6591-6604 (2001) 0半衰期延長且對新生兒Fc受體(FcRn)(它負責將母體IgG 轉移給胎兒)(Guyer 等，J. Immunol. 117 587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249(1994)) 的結合改良的抗體記載於US2005/0014934A1 (Hinton等)。這些抗體包含具有一處或多處 改進Fc區對FcRn結合的替代的Fc區。具有改變的Fc區胺基酸序列且Clq結合能力升高 或降低的多肽變體記載於美國專利No. 6，194，551B1，W099/51642。通過述及將這些專利出 版物的內容明確收入本文。還可參見Idusogie等J. Immunol. 164 =4178-4184(2000)。在一個實施方案中，本發明提供了在構成Fc區的Fc多肽的界面中包含修飾的 抗體，其中所述修飾便於和/或促進異二聚化。這些修飾包括在第一 Fc多肽中引入隆起 (protuberance)，在第二 Fc多肽中引入空穴(cavity)，其中所述隆起可位於所述空穴中， 從而促進第一和第二 Fc多肽的複合。用於生成具有這些修飾的抗體的方法是本領域已知 的，例如美國專利No. 5，731，168中所記載的。11.抗體衍生物可進一步修飾抗體以包含本領域知道的且易於獲得的額外非蛋白質性質模塊。優 選的是，適於抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不 限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯 吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊環、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚 物或隨機共聚物)、和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙 烷(prolypropylene oxide) /環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、及 其混合物。由於其在水中的穩定性，聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是 任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如 果附著了超過一個聚合物，那麼它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據下列考慮 來確定用於衍生化的聚合物的數目和/或類型，包括但不限於待改進抗體的具體特性或功 能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療等。在另一個實施方案中，提供了抗體與可通過暴露於輻射而選擇性加熱的非蛋白質 性質模塊的偶聯物。在一個實施方案中，該非蛋白質性質模塊是碳納米管(Kam等，Proc. Natl. Acad. Sci. 102 11600-11605 (2005))。輻射可以是任何波長的，包括但不限於對普通 細胞無害但將非蛋白質性質模塊加熱至接近抗體_非蛋白質性質模塊的細胞被殺死的溫 度的波長。在某些實施方案中，抗體可以是經過標記的和/或可以在固體支持物上固定化。 在另一個實施方案中，抗體是抗獨特型抗體。12.異源偶聯抗體還提供了異源偶聯抗體。異源偶聯抗體由兩種共價連接的抗體構成。此類抗體 建議用於例如將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)及用於治 療HIV感染(TO 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP 03089)。涵蓋可在體外使用合成蛋白質 化學的已知方法製備抗體，包括那些涉及交聯劑的方法。例如，可使用二硫化物交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。適於此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽 (iminothiolate)禾口 4-疏基丁酷亞氛酸甲酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美 國專利No. 4，676，980中所披露的。13.效應器功能工程可能希望在效應器功能方面修飾抗體，從而增強例如抗體在治療微生物病症中的 效力。例如，可向Fc區中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區中形成鏈間二硫鍵。具有增 強的抗微生物活性的同二聚體抗體還可使用異雙功能交聯劑來製備。或者，抗體可改造成 具有雙重Fc區，由此可具有增強的活性。14.載體、宿主細胞和重組方法為了重組生產抗體，在一個實施方案中，分離編碼它的核酸，並將其插入可複製載 體，用於進一步克隆(DNA擴增)或表達。可使用常規規程容易地分離編碼抗體的DNA並 測序(如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。可利用許 多載體。載體的選擇部分取決於將要使用的宿主細胞。一般而言，宿主細胞是原核或真核 (通常是哺乳動物)起源的。應當領會，任何同種型的恆定區可用於此目的，包括IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE恆定區，而且此類恆定區可以從任何人或動物物種獲得。a)使用原核宿主細胞生成抗體(1)載體構建可使用標準重組技術來獲得編碼抗體多肽構件的多核苷酸序列。可從抗體生成細 胞諸如雜交瘤細胞分離期望的多核苷酸序列並測序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技 術合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中複製並表達異源多 核苷酸的重組載體。為了本發明，可使用本領域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的 選擇將主要取決於將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉化的具體宿主細胞。根據其 功能(擴增或表達異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細胞的相 容性，每種載體含有多種構件。載體構件通常包括但不限於複製起點、選擇標誌基因、啟動 子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物、和轉錄終止序列。一般而言，包含衍生自與宿主細胞相容物種的複製子和控制序列的質粒載體可以 與這些宿主一起使用。載體通常攜帶複製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的 標誌序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質粒PBR322轉化大腸桿菌。pBR322包含 編碼氨苄青黴素(Amp)和四環素(Tet)抗性的基因，由此提供輕鬆鑑定轉化細胞的手段。 PBR322、其衍生物、或其它微生物質粒或噬菌體還可包含或經修飾而包含可被微生物生物 體用於表達內源蛋白質的啟動子。Carter等人，美國專利No. 5，648，237中詳細記載了用於 表達特定抗體的PBR322衍生物的例子。另外，可將包含與宿主微生物相容的複製子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿 主的轉化載體。例如，可使用噬菌體諸如λ GEM. TM.-11來構建可用於轉化易感宿主細胞諸 如大腸桿菌LE392的重組載體。本發明的表達載體可包含兩對或更多對啟動子-順反子，它們編碼每一種多肽構 件。啟動子是位於順反子上遊(5')的非翻譯調節序列，它調控順反子的表達。原核啟動 子通常分成兩類，誘導型的和組成性的。誘導型啟動子指響應培養條件的變化(例如營養 物的存在與否或溫度變化)而啟動受其控制的順反子的升高水平轉錄的啟動子。
37
眾所周知受到多種潛在宿主細胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化自源DNA切 出啟動子並將分離的啟動子序列插入本發明的載體，由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈或 重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用於指導靶基因的 擴增和/或表達。在有些實施方案中，使用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，它 們通常容許所表達靶基因的更高轉錄和更高產量。適用於原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β -半乳糖苷酶(galactamase)和乳 糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在 細菌中有功能的其它啟動子(諸如其它已知的細菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的 核苷酸序列已經發表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制性位點的接頭或銜接 頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlist等(1980)Cell 20 :269)。在本發明的一個實施方案中，重組載體內的每個順反子都包含指導所表達多肽穿 膜易位的分泌信號序列構件。一般而言，信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載 體的靶多肽DNA的一部分。為了本發明而選擇的信號序列應當是受到宿主細胞識別並加工 (即被信號肽酶切除)的信號序列。對於不識別並加工異源多肽的天然信號序列的原核宿 主細胞，將信號序列用選自例如下組的原核信號序列替代鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp、或 熱穩定的腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發明的一個實施 方案中，表達系統的兩個順反子中都使用的信號序列是STII信號序列或其變體。在另一個實施方案中，依照本發明的免疫球蛋白的生成可在宿主細胞的細胞質 中發生，因此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在那點上，免疫球蛋白輕鏈和重 鏈在細胞質內表達、摺疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌 trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成的細胞質條件，從而容許所表達蛋白質亞基的正確折 疊和裝配。Proba 和 Pluckthun，Gene 159:203(1995)。本發明的抗體還可使用如下表達系統來生成，其中所表達多肽構件的數量比率可 以受到調控，從而將分泌且正確裝配的本發明抗體的產量最大化。這種調控是至少部分通 過同時調控多肽構件的翻譯強度而實現的。Simmons等人，美國專利No. 5，840，523中披露了用於調控翻譯強度的一種技術。 它在順反子內利用翻譯起始區(TIR)的變體。對於指定TIR，可創建具有一定範圍翻譯強度 的一系列胺基酸或核酸序列變體，由此提供針對特定鏈的期望表達水平調節此因素的方便 手段。可通過常規誘變技術導致能改變胺基酸序列的密碼子變化來生成TIR變體。在某些 實施方案中，核苷酸序列中的變化是沉默的。TIR中的改變可包括例如Shine-Dalgarno序 列的數目或間距的改變，及信號序列中的改變。用於生成突變型信號序列的一種方法是在 編碼序列的開端生成不改變信號序列胺基酸序列的「密碼子庫」(即變化是沉默的)。這可 通過改變每個密碼子的第三個核苷酸位置來實現；另外，有些胺基酸，諸如亮氨酸、絲氨酸、 和精氨酸，具有多種第一個和第二個位置，這可在建庫中增加複雜性。Yansura等(1992) METHODS :A Companion toMethods in Enzymol. 4 151-158 中詳細記載了這種誘變方法。在一個實施方案中，對於載體中的每個順反子，生成具有一定範圍TIR強度的一 組載體。這個有限集合提供了每條鏈的表達水平以及期望抗體產物的產量在各種TIR強度 組合下的比較。可通過量化報導基因的表達水平來測定TIR強度，Simmons等人，美國專利 No. 5，840，523中有詳細記載。根據翻譯強度的比較，選擇期望的個別TIR在本發明的表達載體構建物中進行組合。適於表達本發明抗體的原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)和真細 菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細菌的例子包括埃希氏 菌屬(Escherichia)(如大腸埃希氏菌E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢 桿菌 B. subtilis)、腸桿菌屬(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(如 銅綠假單胞菌P. aeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、粘質沙雷 氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀 氏菌屬(Shigella)、根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬 (Paracoccus)。在一個實施方案中，使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施方案中，使用大腸杆 菌細胞作為本發明的宿主。大腸桿菌菌株的例子包括菌株W3110(BaChmann，Cellular and Molecular Biology,第 2 卷，Washington, D. C.，美國微生物學學會，1987，第 1190-1219 頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 Δ fhuA( Δ tonA)ptr3 lac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR 的菌株 33D3 (美國專利 No. 5，639，635)。其 它菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776(ΑΤ(Χ 31,537)和大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)也是合適的。這些例子只是例示而非限制。本 領域知道用於構建具有指定基因型的任何上述細菌衍生物的方法，參見例如Bass等， Proteins 8 :309_314 (1990)。通常必需考慮複製子在細菌細胞中的可複製性來選擇適宜的 細菌。例如，在使用眾所周知的質粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供複製 子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適於用作宿主。通常，宿主細胞應當分 泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細胞培養中摻入額外的蛋白酶抑制劑。(2)抗體生成用上述表達載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼期 望序列的基因而適當改動的常規營養培養基中進行培養。轉化即將DNA導入原核宿主，使得DNA能夠進行複製，或是作為染色體外元件或 是通過染色體成分。根據所用宿主細胞，使用適於這些細胞的標準技術進行轉化。採用氯 化鈣的鈣處理通常用於具有堅固細胞壁屏障的細菌細胞。另一種轉化方法採用聚乙二醇/ DMS0。使用的還有一種技術是電穿孔。在本領域知道的且適於培養選定宿主細胞的培養基中培養用於生成本發明多肽 的原核細胞。合適培養基的例子包括添加了必需營養補充物的LB培養基(Luria broth)。 在有些實施方案中，培養基還含有根據表達載體的構建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包 含表達載體的原核細胞生長。例如，向用於培養表達氨苄青黴素抗性基因的細胞的培養基 中添加氨苄青黴素。在碳、氮、和無機磷酸鹽來源以外，還可含有適當濃度的任何必需補充物，或是單 獨加入或是作為與另一種補充物或培養基的混合物，諸如複合氮源。任選的是，培養基可含 有一種或多種選自下組的還原劑穀胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二硫赤蘚糖 醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養原核宿主細胞。在某些實施方案中，對於培養大腸桿菌，培養的 溫度範圍為約20°C至約39°C、約25°C至約37°C、或約30°C。主要取決於宿主生物體，培養 基的PH可以是範圍為約5至約9的任何pH。在某些實施方案中，對於大腸桿菌，pH為約
396. 8至約7. 4、或約7. 0。如果本發明的表達載體中使用誘導型啟動子，那麼在適於激活啟動子的條件下 誘導蛋白質表達。在本發明的一個實施方案中，使用PhoA啟動子來控制多肽的轉錄。因 此，為了誘導，在磷酸鹽限制培養基中培養經過轉化的宿主細胞。在某些實施方案中，磷 酸鹽限制培養基是C. R. A. P培養基(參見例如Simmons等，J. Immunol. Methods 263 133-147 (2002))。根據所採用的載體構建物，可採用多種其它誘導物，正如本領域所知道 的。在一個實施方案中，所表達的本發明多肽分泌到宿主細胞的周質中並從中回收。 蛋白質回收通常牽涉破壞微生物，通常通過諸如滲壓震擾(osmoticshock)、超聲處理或裂 解等手段。一旦細胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細胞碎片或整個細胞。可以通過例 如親和樹脂層析進一步純化蛋白質。或者，蛋白質可轉運到培養液中並從中分離。可從培 養液清除細胞，並將培養物上清液過濾和濃縮，用於進一步純化所生成蛋白質。可使用普遍 知道的方法諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡測定法進一步分離和鑑定所 表達的蛋白質。在本發明的一個實施方案中，通過發酵過程大量進行抗體生產。多種大規模補 料-分批發酵規程可用於生產重組蛋白。大規模發酵具有至少1000升的容量，在某些實施 方案中是約1，000至100，000升的容量。這些發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養分，尤 其是葡萄糖(優選的碳源/能源)。小規模發酵通常指在體積容量不超過約100升的發酵 罐中進行的發酵，範圍可以是約1升至約100升。在發酵過程中，通常在將細胞在合適條件下培養至期望密度(例如0D550約 180-220，在此階段細胞處於早期穩定期)後啟動蛋白質表達的誘導。根據所採用的載體構 建物，可使用多種誘導物，正如本領域知道的和上文描述的。可在誘導前將細胞培養較短的 時間。通常將細胞誘導約12-50小時，但是可使用更長或更短的誘導時間。為了提高本發明多肽的生產產量和質量，可修改多項發酵條件。例如，為了改善 所分泌抗體多肽的正確裝配和摺疊，可使用過表達伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB, DsbC, DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侶活性的一種肽基脯氨醯-順式，反式-異構 酶)的額外載體來共轉化宿主原核細胞。已經證明伴侶蛋白促進在細菌宿主細胞中生 成的異源蛋白質的正確摺疊和溶解度。Chen等(1999) J.Biol. Chem. 274 :19601_19605 ； Georgiou 等，美國專利 No. 6，083, 715 ；Georgiou 等，美國專利 No. 6，027, 888 ；Bothmann 和 Pluckthun(2000)J. Biol. Chem. 275 17100-17105 ;Ramm 和 Pluckthun (2000)J. Biol. Chem. 275 :17106_17113 ；Arie 等(2001)Mol. Microbiol. 39 :199_210。為了將所表達異源蛋白質(尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質)的蛋白水解降 至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用於本發明。例如，可修飾宿主細胞菌株，在 編碼已知細菌蛋白酶的基因中進行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT, DegP, Tsp、蛋白酶I、 蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。可以獲得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌株，參見例 如Joly等(1998)見上文；Georgiou等，美國專利No. 5，264，365 ；Georgiou等，美國專利 No.5,508,192 ；Hara 等，Microbial Drug Resistance 2 63-72(1996)。在一個實施方案中，在本發明的表達系統中使用蛋白水解酶缺陷且經過過表達一 種或多種伴侶蛋白的質粒轉化的大腸桿菌菌株作為宿主細胞。
40
(3)抗體純化在一個實施方案中，進一步純化本文中生成的抗體以獲得基本上同質的製備物， 用於進一步的測定和使用。可採用本領域知道的標準蛋白質純化方法。下面的規程是合適 純化規程的例示免疫親和或離子交換柱上的分級、乙醇沉澱、反相HPLC、矽土或陽離子交 換樹脂諸如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉澱、和使用例如S印hadex G-75 的凝膠過濾。在一個實施方案中，將固定化在固相上的蛋白A用於本發明抗體產物的免疫親和 純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD細胞壁蛋白質，它 以高親和力結合抗體Fc區。Lindmark等(1983) J. Immunol. Meth. 62 1-13。蛋白A固定化 其上的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔徑玻璃柱或矽酸柱。在有些應 用中，用諸如甘油等試劑包被柱，用以有可能防止汙染物的非特異粘附。作為純化的第一步，可以將衍生自如上所述細胞培養物的製備物施加到蛋白A固 定化固相上，使得目的抗體特異性結合蛋白A。然後清洗固相以清除與固相非特異性結合的 汙染物。最後通過洗脫從固相回收目的抗體。b)使用真核宿主細胞生成抗體用於真核宿主細胞的載體通常包括一種或多種如下非限制性構件信號序列、復 制起點、一種或多種標誌基因、增強子元件、啟動子、和轉錄終止序列。(1)信號序列構件在真核宿主細胞中使用的載體還可在目的成熟蛋白質或多肽的N端包含信號序 列或具有特異性切割位點的其它多肽。可以選擇受到宿主細胞識別並加工(即被信號肽酶 切除)的異源信號序列。在哺乳動物細胞表達中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌 前導，例如單純皰疹病毒gD信號。將這些前體區的DNA以符合讀碼框的方式連接至編碼抗 體的DNA。(2)複製起點通常，哺乳動物表達載體不需要複製起點構件。例如，SV40起點通常可能只因它 包含早期啟動子才使用。(3)選擇基因構件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標誌。典型的選擇基因編碼如下蛋 白質(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青黴素、新黴素、甲氨蝶呤或四環素； (b)補足相應的營養缺陷；或(c)提供不能從複合培養基獲得的關鍵營養物。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。經異源基因成功轉化的那 些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質，因而倖免於選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物 新黴素、黴酚酸和潮黴素。適於哺乳動物細胞的選擇標誌的另一個例子是能夠鑑定有能力攝取抗體核酸的 細胞的選擇標誌，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和II (優選靈長類金屬硫蛋白基 因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，在有些實施方案中，首先通過將所有轉化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的 一種競爭性拮抗劑)的培養基中進行培養來鑑定經DHFR選擇基因轉化的細胞。在有些實 施方案中，在採用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是例如DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如 ATCCCRL-9096)。或者，可通過在含有針對選擇標誌的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那黴素、 新黴素或G418的培養基中培養細胞來選擇經編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標 志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH)的DNA序列轉化或共轉化的宿主細胞(特別是包 含內源DHFR的野生型宿主)。參見美國專利No. 4，965，199。(4)啟動子構件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別且與編碼感興趣多肽(例如抗體) 的核酸可操作連接的啟動子。已知真核細胞的啟動子序列。例如，事實上，所有真核基因都 具有富含AT區，它位於起始轉錄的位點上遊大約25至30個鹼基處。在許多基因的轉錄起 點上遊70至80個鹼基處發現的另一種序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。在大 多數真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA) 尾的信號。在某些實施方案中，任何或所有這些序列可以合適的插入真核表達載體中。在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、 腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B肝病 毒、和猿病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或 免疫球蛋白啟動子)的、來自熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若這些啟動子與宿主細胞 系統相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還 包含SV40病毒複製起點。方便的以HindIII E限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立 即早期啟動子。美國專利No. 4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物 宿主中表達DNA的系統。美國專利No. 4，601，978中記載了該系統的一種修改。關於在小 鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人β 「幹擾素cDNA還可參 見Reyes等，Nature 297 :598_601 (1982)。或者，可使用勞氏肉瘤病毒長末端重複作為啟動 子。(5)增強子元件構件常常通過在載體中插入增強子序列來提高高等真核細胞對編碼本發明抗體的DNA 的轉錄。現在知道來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰島素) 的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40複製起 點晚期側的增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒複製起點晚期 側的增強子、和腺病毒增強子。關於激活真核啟動子的增強子元件還可參見Yani^Nature 297:17-18(1982)。增強子可剪接到載體中，位於抗體多肽編碼序列的5'或3'位置，但是 一般位於啟動子的5'位點。(6)轉錄終止構件在真核宿主細胞中使用的表達載體還可包含終止轉錄和穩定mRNA所必需的序 列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶爾的3'非翻譯區獲得。這些區 域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有 用的轉錄終止構件是牛生長激素聚腺苷酸化區。參見W094/11026及其中披露的表達載體。(7)宿主細胞的選擇和轉化適於克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括本文描述的高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養(組織培養)中的繁殖已經成為常規規程。有用 哺乳動物宿主細胞系的例子有經SV40轉化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)、人胚腎 系(293細胞或為懸浮培養而亞克隆的293細胞，Graham等，J. Gen. Virol. 36 59 (1977))、 幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216 (1980))、小鼠塞託利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))、猴腎細胞(CVl, ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VER0-76， ATCC CRL 1587)、人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL2)、犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34)、牛鼠 (buffalo rat)肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)、人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)、人肝細 胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ,TRI 細胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44-68 (1982))、MRC 5 細胞、FS4 細胞、和人肝瘤(h印atoma)系 Ofep G2)。為了生成抗體，用上文所述表達或克隆載體轉化宿主細胞，並在為了誘導啟動子、 選擇轉化子或擴增編碼期望序列的基因而適當改動的常規營養培養基中進行培養。(8)培養宿主細胞可在多種培養基中培養用於生成本發明抗體的宿主細胞。商品化培養基諸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改 良Eagle氏培養基(DMEM，Sigma)適於培養宿主細胞。另外，可使用下列文獻中記載的 任何培養基作為宿主細胞的培養基:Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美國專利Re. 30，985。任何這些培養基可根據需 要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯 化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩衝劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾範圍的終濃度存在的無機化合物)、 和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領域技術人員知道的任何其它補充物。培養 條件諸如溫度、PH等即為表達而選擇先前與宿主細胞一起使用的，這對於普通技術人員是 顯然的。(9)抗體的純化在使用重組技術時，可在細胞內生成抗體，或者直接分泌到培養基中。如果在細 胞內生成抗體，那麼作為第一步可以通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細胞或 是裂解片段。在抗體分泌入培養基的情況中，可以首先使用商品化蛋白質濃縮濾器(例如 Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自這些表達系統的上清液。可在任何上 述步驟中包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來汙 染物的生長。可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(親和層析是一種便利的 技術)來純化從細胞製備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決於抗體中存在 的任何免疫球蛋白Fc結構域的物種和同種型。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2、或 重鏈的抗體(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62 1-13(1983))。蛋白G推薦用於所有小鼠 同種型和人Y3(Guss等，EMBO J. 5 :1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質可以是瓊 脂糖，但是可使用其它基質。物理穩定的基質諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。在抗體包含CH3結構域的情況中，可使 用Bakerbond ABX 樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)進行純化。根據待回收的抗體， 也可使用其它蛋白質純化技術諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉澱、反相HPLC、矽土上的層 析、肝素SEPHAROSE 上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、 層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱。在任何初步純化步驟之後，可將含有目的抗體和汙染物的混合物進行進一步的純 化，例如低PH疏水相互作用層析，使用pH約2. 5-4. 5的洗脫緩衝液，優選在低鹽濃度(例 如約0-0. 25M鹽)進行。一般而言，用於製備供研究、測試和臨床使用的抗體的各種方法是本領域已完善 建立的，與上文所述方法是一致的和/或本領域技術人員認為對於特定的感興趣抗體是適宜的。C.激動劑和拮抗劑提供了本發明AMP的激動劑和拮抗劑。此類AMP調控劑涵蓋在本發明中，而且對 於治療微生物病症是有用的，如本文中所提供的。在一個實施方案中，本發明AMP的激動劑或激動劑是抗體例如IL-22抗體或抗 IL-22R抗體。在某些實施方案中，抗IL-22抗體是促進IL-22與IL-22R相互作用的激動 性抗體。在另一個實施方案中，抗IL-22抗體是完全或部分阻斷IL-22與IL-22R相互作用 的拮抗性抗體。在某些實施方案中，抗IL-22R抗體結合IL-22R的細胞外配體結合結構域。 例如，抗IL-22R抗體可以結合人類IL-22R的細胞外配體結合結構域，其在SEQ ID NO :3中 約胺基酸18-228中發現。在一個具體的實施方案中，IL-22激動劑是結合IL-22BP且阻斷或抑制IL-22BP結 合IL-22並由此誘導或提高IL-22活性(例如結合IL-22R)的抗體。在另一個實施方案中，本發明AMP的激動劑或拮抗劑是結合AMP的寡肽。在一 個實施方案中，寡肽結合IL-22R的細胞外配體結合結構域。寡肽可以使用已知的寡肽合 成方法來化學地合成，或可以使用重組技術來製備和純化。這種寡肽長度通常是至少約5 個胺基酸，或者長度至少約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或 100個胺基酸。這種寡肽可以使用公知的技術不需過度實驗地鑑定。對此，注意到，用於 對寡肽庫篩選能夠特異性結合多肽靶物的寡肽的技術是本領域公知的(參見例如美國專 利 No. 5，556，762,5, 750，373,4, 708，871,4, 833，092,5, 223，409,5, 403，484,5, 571，689、 5，663，143 ；PCT 公開 No. WO 84/03506 和 W084/03564 ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,81 3998-4002(1984) ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 178-182 (1985)； Geysen 等，於 Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ；Geysen 等，J. Immunol. Meth.，102 :259-274 (1987) ；Schoofs 等，J. Immunol, 140 :611_616 (1988) ；Cwirla, S. E.等 (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 6378 ；Lowman, H. B.等(1991)Biochemistry, 30 10832 ；Clackson, Τ.等(1991)Nature, 352 624 ；Marks, J. D.等(1991)J. Mol. Biol, 222 581 ；Kang, Α. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 8363 ；及 Smith, G. P. (1991)Current Opin. Biotechnol, 2 :668)。在又一個實施方案中，本發明AMP的激動劑或拮抗劑是不同於在此描述的寡肽或 抗體的、結合AMP的有機分子。有機分子可以是例如小分子。在一個實施方案中，有機分子 結合IL-22R的細胞外結構域。結合本發明AMP的有機分子可以使用已知的方法(參見，例 如，PCT公開No. W000/00823和W000/39585)來鑑定和化學地合成。這種有機分子通常大 小小於約2000道爾頓，或者大小小於約1500、750、500、250或200道爾頓，其中能夠結合本 發明AMP的這種有機分子可以使用公知的技術不需過度的實驗來鑑定。對此，注意到，用 於對有機分子庫篩選能夠結合多肽靶物的分子的技術是本領域公知的(參見例如PCT公開 No. W000/00823 和 W000/39585)。在一個具體的實施方案中，IL-22激動劑是結合IL-22BP且阻斷或抑制IL-22BP結 合IL-22並由此誘導或提高IL-22活性(例如結合IL-22R)的有機分子。在一個具體的實施方案中，IL-22拮抗劑是可溶的IL-22受體，例如，非膜結合的 IL-22R形式。這種可溶形式的IL-22R可以與膜結合的IL-22R競爭結合IL-22。在某些實 施方案中，可溶形式的IL-22R可以包含IL-22R的細胞外結構域的所有部分或配體結合部 分，例如，包含SEQ ID NO :3的胺基酸18-228的所有部分或配體結合部分。在某些實施方 案中，可溶形式的IL-22R缺少跨膜結構域。例如，人IL-22R的可溶形式可以缺少SEQ ID NO 3的約胺基酸229-251的跨膜結構域的所有的或實質性的部分。已經報導了 IL-22的天然存在的可溶受體。參見Dumoutier L.等，『『Cloningand characterization of IL-22 binding protein,a natural antagonist ofIL-10-related T cell-derived inducible factor/IL-22, 「 J. Immunol. 166 :7090_7095 (2001)；及 Xu W.等，"A soluble class II cytokine receptor,IL-22RA2,is anaturally occurring IL-22 antagonist, 「 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 :9511_9516 (2001)。本領域中，這 種受體被不同地稱為"IL-22BP」或「IL-22RA2」。人IL-22BP的序列在圖4中顯示。如本文 中所使用的，術語「 IL-22BP」或「 IL-22結合蛋白」指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物 諸如靈長類(例如人和猴)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-22BP，除非另有陳 述。在又一個實施方案中，IL-22的拮抗劑是反義核酸，其降低IL-22或IL-22R基因 的表達(即，其降低IL-22或IL-22R基因的轉錄和/或IL-22或IL_22RmRNA的翻譯)。在 某些實施方案中，反義核酸結合編碼IL-22或IL-22R的核酸(DNA或RNA)。在某些實施方 案中，反義核酸是長度約10-30個核苷酸的寡核苷酸(包括兩個端點之間的所有點)。在 某些實施方案中，反義寡核苷酸包含修飾的糖_磷酸二酯主幹(或其它的糖連接，包括硫 代磷酸酯連接和如WO 91/06629中記載的連接)，其中這種修飾的糖-磷酸二酯主幹對內 源核酸酶具有抗性。在一個實施方案中，反義核酸是寡脫氧核糖核苷酸，其引起編碼IL-22 或IL-22R的mRNA的降解和/或降低的轉錄或翻譯。在某些實施方案中，反義核酸是通過 「RNA幹擾」(「RNAi」)降低靶核酸的表達的RNA。對於RNAi的綜述，參見，例如，Novina等 (2004) Nature 430 :161_164。這種 RNA 衍生自例如短幹擾 RNA (siRNA)和 microRNA。例如， siRNA可以作為長度約18-26個核苷酸的雙鏈寡核糖核苷酸來合成。見上文。在又一個實施方案中，提供了 IL-22的激動劑。示範性的激動劑包括，但不限於， 天然IL-22或IL-22R ；保持天然多肽的至少一種活性的IL-22或IL-22R片段、變體或修飾形式；能夠結合併活化IL-22R的試劑；及誘導IL-22或IL-22R或編碼IL-22或IL-22R的 核酸過表達的試劑。D.藥物配製劑本發明提供了藥物配製劑。在一個實施方案中，藥物配製劑包含1)活性劑，例如 任何上文所述多肽、抗體、激動劑、或拮抗劑；和2)藥學可接受載體。在另一個實施方案中， 藥物配製劑進一步包含至少一種別的治療劑。藥物配製劑可通過將具有期望純度的藥劑與任選的製藥學可接受的載體、賦形劑 或穩定劑(Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α.編，1980)混合， 以凍幹配製劑或水溶液的形式製備供貯存。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所採用的劑 量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧 化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化己烷雙 胺；苯扎氯銨、苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烴基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯 或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基) 多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮； 胺基酸，諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或 山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；和/或非離子表面 活性劑，諸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。脂轉染或脂質體也可用於將藥劑投遞入細胞。在藥劑是抗體片段的情況中，優選 特異性結合靶蛋白質的最小抑制性片段。例如，根據抗體的可變區序列，可以設計保留結合 靶蛋白質序列能力的肽分子。此類肽可以化學合成和/或通過重組DNA技術生成(參見例 如 Marasco 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :7889_7893 [1993])。本文中所公開的抗體還 可配製成免疫脂質體。可通過本領域知道的方法來製備包含抗體的脂質體，諸如Epstein 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 3688 (1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030(1980)；及美國專利No. 4，485，045和4，544，545中所記載的。美國專利No. 5，013，556 中披露了循環時間延長的脂質體。特別有用的脂質體可用含有磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG 衍生化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物通過反相蒸發法生成。將脂質體擠過具有 限定孔徑的濾器，以產生具有期望直徑的脂質體。可將本發明抗體的Fab』片段經二硫化 物交換反應與脂質體偶聯，如Martin等，J. Biol. Chem. 257 =286-288(1982)中所記載的。 任選在脂質體中包含化療劑(諸如多柔比星)。參見Gabizon等，J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)。藥劑還可包載於例如通過凝聚技術或通過界面聚合製備的微膠囊中(例如分別 是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物投遞系統中 (例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技 術披露於例如 Remington' s PharmaceuticalSciences,H 16 版，Osol, A.編，1980。可製備藥劑的持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適例子包括含有藥劑的固體疏水 性聚合物半透性基質，該基質是定型產品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子 包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專 利No. 3，773，919)、L-穀氨酸與L-穀氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林 構成的可注射微球體)及聚-D-(_)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇 酸等聚合物能夠釋放分子達100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。當封裝 的抗體在身體中長時間維持時，它們可能由於暴露於37°C的潮溼環境而變性或聚集，導致 生物學活性損失和免疫原性可能改變。可以根據所涉及的機制來設計合理的穩定化策略。 例如，如果發現聚集機制是經由硫_ 二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那麼可通過修飾巰 基殘基、自酸性溶液凍幹、控制溼度、採用適宜添加劑和開發特定聚合物基質組合物來實現 穩定。本文中的藥物配製劑還可含有所治療具體適應症所必需的超過一種活性化合物。 例如，在一個實施方案中，含有超過一種活性化合物的藥物配製劑包含1)至少一種IL-22 激動劑，例如結合IL-22的抗體和/或結合IL-22R的抗體；和2)至少一種結合IL-6或 IL-23的抗體(其中可以以任何組合選擇任何數目的2)中所列抗體)。在另一個實施方案 中，藥物配製劑包含兩種或多種具有互補活性的活性化合物。E.治療方法本發明還提供治療微生物病症的方法。在一個實施方案中，本發明提供治療受試 者中的微生物病症的方法，包括對所述受試者施用有效量的包含AMP或AMP調控劑的藥物 組合物，其中所述AMP選自下組:LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、 REG IIKREG IV和Reg相關序列(RS)。在一個實施方案中，所述病症是由EHEC或EPEC引 起的腹瀉、炎性腸病(IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩氏病(CD)。在一個實施方案中，本發明提供治療受試者中的微生物病原體(例如細菌或病 毒)感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的包含AMP或AMP調控劑的藥物組合物，其 中所述六1^選自下組山1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III、 REG IV和Reg相關序列(RS)。在另一個實施方案中，本發明提供調控受到微生物病原體(例如細菌或病毒)感 染的受試者的細胞中AMP活性的方法，包括使所述細胞接觸AMP或AMP調控劑，其中所述 AMP 選自下組LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β 或 REGIIIy)、REG IV、和 Reg 相關序列(RS)。在另一個實施方案中，本發明提供治療受試者中的微生物病症的方法，包括使所 述受試者的細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中所 述八1^選自下組丄1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV和Reg相關序列(RS)。在一個實施方案中，所述病症是由EHEC或EPEC引起的腹瀉、炎 性腸病(IBD)或更具體的潰瘍性結腸炎(UC)或克羅恩氏病(CD)。在另一個實施方案中，本發明提供調控受到微生物病原體(例如細菌或病毒)感 染的受試者的細胞中AMP活性的方法，包括使所述細胞接觸編碼AMP或AMP調控劑的核酸 分子(例如DNA或RNA分子)，其中所述AMP選自下組LT、IL-6, IL-18, IL-22、IL-23, REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β 或 REGIII γ )、REG IV、和 Reg 相關序列 (RS)。微生物病原體的例子包括但不限於細菌或病毒。在一個實施方案中，所述微生物 病原體是細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。在一個具體的實施方案中，所述細菌是
47革蘭氏陰性細菌。在另一個實施方案中，所述細菌是粘附或抹消(A/E)細菌，而且更具體地 是腸出血性大腸桿菌(EHEC)或腸致病性大腸桿菌(EPEC)。在一個實施方案中，所述細菌是 腸致病性大腸桿菌(EHEC)，是大腸桿菌0157 :H7或大腸桿菌055 :H7。本發明的治療方法包括本發明的一種或多種組合物或藥物配製劑。除非另有陳 述，這些方法包括體外的、回體的(ex vivo)和體內的治療方法。在各種實施方案中，本發明提供通過刺激或抑制由AMP介導的信號傳導途徑和/ 或細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。所述方法對於治療微生物病症是有 用的。例如，在一個實施方案中，本發明提供通過刺激由AMP介導的信號傳導途徑例如由 IL-22和/或IL-23介導的信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。在另一個實施 方案中，本發明提供通過刺激或抑制由細胞因子介導的信號傳導途徑來調控抗微生物免疫 應答的方法。例如，在一個實施方案中，本發明提供通過刺激由細胞因子介導的信號傳導途 徑例如IL-22和/或IL-23信號傳導途徑來增強抗微生物免疫應答的方法。此外，本發明 提供通過刺激或抑制Tht17細胞功能來調控抗微生物免疫應答的方法。在一個實施方案中，本發明提供刺激生物學系統中由AMP介導的信號傳導途徑的 方法，該方法包括給所述生物學系統提供AMP激動劑。所述生物學系統的例子包括但不限 於體外細胞培養系統中的或生物體體內的哺乳動物細胞。在另一個實施方案中，本發明提 供抑制生物學系統中由AMP介導的信號傳導途徑的方法，該方法包括給所述生物學系統提 供AMP拮抗劑。在一個具體的實施方案中，本發明提供通過刺激生物學系統中由IL-23和/或 IL-22介導的信號傳導途徑來增強生物學系統中的抗微生物免疫應答的方法，該方法包括 給所述生物學系統提供IL-22或IL-22激動劑。在一個實施方案中，IL-22激動劑是IL-22。 在另一個實施方案中，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個實施方案中，提供抑制生物學系統中由IL-23介導的信號傳導途徑的方 法，該方法包括給所述生物學系統提供IL-22拮抗劑。在一個實施方案中，所述IL-22拮抗 劑是抗體，例如中和性抗IL-22抗體和/或中和性抗IL-22R抗體。在另一個實施方案中，本發明提供刺激Tht17細胞功能的方法，該方法包括將 細胞暴露於AMP的激動劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如
IL-23、IL-6、或IL-22)。所述方法對於治療微生物病症是有用的。在一個實施方案中，IL-22 激動劑是IL-22。在另一個實施方案中，所述IL-22激動劑是結合IL-22的抗體。在另一個實施方案中，提供抑制Tht17細胞功能的方法，該方法包括將Tht17細胞 暴露於AMP的拮抗劑，其中所述AMP介導由IL-23介導的信號傳導途徑(例如IL-23、IL-6、 或IL-22)。在一個實施方案中，所述拮抗劑是抗IL-22抗體，例如中和性抗IL-22抗體。例示性的Thiw7細胞功能包括但不限於刺激由細胞介導的免疫(遲髮型超敏感 性)；募集先天免疫細胞，諸如髓樣細胞(例如單核細胞和嗜中性粒細胞)至炎症部位；和 刺激炎症細胞浸潤入組織中。在一個實施方案中，細胞功能是由IL-23和/或IL-22 介導的。本發明的組合物依照已知的方法施用給哺乳動物，優選人類，諸如，作為推注或通 過一段時間的連續輸注的靜脈內施用，通過肌肉內的、腹膜內的、腦脊內的、皮下的、關節內 的、滑膜內的、鞘內的、口腔的、體表的、或吸入(鼻內、肺內)路徑。多肽和抗體的靜脈內或
48吸入施用是優選的。為了治療或降低微生物病症的嚴重程度，本發明組合物的適宜劑量將取決於如上 文定義的要治療的病症的類型、病症的嚴重程度和進程、施用藥劑是預防還是治療目的、早 先的治療、患者的臨床史和對化合物的響應、及主治醫師的判斷。一次性或在一系列治療中 將化合物適當地施用給患者。例如，取決於病症的類型和嚴重程度，約1 μ g/kg至15mg/kg(例如0. l_20mg/kg) 的多肽或抗體是對患者施用的起始候選劑量，例如，無論是通過一次或多次分開的施用還 是通過連續的輸注。典型的每日劑量可以從約1 μ g/kg到100mg/kg或更多，取決於上述的 因素。對於持續幾天或更長時間的重複施用，取決於狀況，持續進行治療直到產生期望的對 疾病症狀的抑制。然而，其它劑量方案也是有用的。可以通過常規的技術和測定法來容易 地監測此療法的進展。F.診斷方法和檢測方法在一個實施方案中，本發明提供檢測生物學樣品中AMP的存在的方法，包括在容 許下述抗體結合AMP的條件下使所述生物學樣品接觸AMP的抗體，並檢測是否形成所述抗 體和AMP之間的複合物。在一個實施方案中，本發明提供監測受試者中微生物病症治療的方法，其中所述 方法包括檢測自需要治療的受試者獲得的組織細胞測試樣品中編碼AMP的基因的表達水 平，並檢測測試樣品中的表達水平。檢測可以是定性的或定量的。在一個實施方案中，所述 測試樣品包含血液或血清。在一個實施方案中，檢測編碼AMP的基因的表達水平包括(a) 使抗AMP抗體接觸自所述哺乳動物獲得的測試樣品，並(b)檢測所述抗體與所述測試樣品 中AMP之間複合物的形成。所述抗體可以連接有可檢測標記物。複合物形成可以通過，例 如，光學顯微術、流式細胞術、螢光測定術或本領域已知的其它技術來監測。測試樣品可以 自懷疑患有微生物病症的個體獲得。在一個實施方案中，檢測編碼AMP多肽的基因的表達水平包括檢測來自所述基因 的mRNA轉錄水平。mRNA轉錄水平可以通過本領域技術人員已知的各種方法來定量地或定 性地檢測。mRNA轉錄水平也可以通過檢測從所述mRNA產生的cDNA的水平來直接地或間接 地檢測。檢測mRNA轉錄水平的示範性的方法包括但不限於實時定量RT-PCR和基於雜交的 測定法，包括基於微陣列的測定法和基於濾膜的測定法，例如Northern印跡。在另一個實施方案中，本發明提供檢測生物學樣品中AMP的存在的方法，包括在 容許下述抗體結合AMP的條件下使所述生物學樣品接觸AMP的抗體，並檢測是否形成所述 抗體和AMP之間的複合物。在另一個實施方案中，本發明涉及診斷試劑盒，其含有適合的包裝中的抗AMP。所 述試劑盒優選的含有使用所述抗體來檢測AMP的說明書。在一個實施方案中，所述診斷試 劑盒用於診斷微生物病症。在一個實施方案中，所述診斷試劑盒用於診斷微生物感染。在另一個實施方案中，本發明提供包含一種或多種本發明AMP和/或其調控劑的 試劑盒。在另一個實施方案中，本發明提供包含一種或多種藥物組合物的試劑盒，所述藥物 組合物每一種包含本發明的AMP或其調控劑。G.測定法1.基於細胞的測定法和動物模型
免疫性疾病的基於細胞的測定法和動物模型在實施本發明的某些實施方案中是 有用的。在下文實施例中提供的某些基於細胞的測定法是有用的，例如，用於測試IL-22拮 抗劑或激動劑的效力。體內動物模型對於實施本發明的某些實施方案也是有用的。還在下文實施例中描 述了示範性的動物模型。這些模型的體內性質使得它們對於人類患者中的應答是預測性 的。免疫相關疾病的動物模型包括非重組的和重組的(轉基因的)動物。非重組動物模型 包括例如齧齒動物如鼠模型。這種模型可以通過使用標準技術將細胞導入同基因小鼠來產 生，例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內植入、腎囊下植入、等。移植物抗宿主疾病模型提供了評估針對MHC抗原和次要移植物抗原的T細胞反應 性的手段。當免疫活性細胞被移植到免疫抑制的或耐受的患者中時，移植物抗宿主疾病發 生。供體細胞識別並應答宿主抗原。應答可以從危及生命的嚴重炎症到腹瀉和體重減輕的 輕微病情。評定移植物抗宿主疾病的適合規程在Current Protocols in Immunology，見上 文，單元4. 3中詳細記載了。皮膚同種移植物排斥的動物模型是測試T細胞介導體內組織破壞的能力的手段， 和它們在移植物排斥中的作用的度量。大多數常見的和公認的模型使用鼠尾部皮膚移植 物。重複的實驗已經顯示了皮膚同種移植物排斥由T細胞、輔助T細胞和殺傷效應器T細 胞而不是抗體來介導° Auchincloss,H. Jr.禾口 Sachs,D. H. ,Fundamental Immunology,第 2 版，W. Ε· Paul 編，Raven Press，NY，1989，889—992。在 Current Protocols in Immunology, 上文，單元4. 4中詳細記載了適合的規程。可以用於測試本發明的化合物的其它移植物排 斥模型是 Tanabe，Μ.等，Transplantation (1994) 58 23 和 Tinubu，S. Α.等，J. Immunol. (1994)4330-4338記載的同種異基因心臟移植物模型。接觸超敏反應是細胞介導的免疫功能(遲髮型超敏反應)的簡單體內測定法。 在這個規程中，皮膚暴露於引起遲髮型超敏反應的外源半抗原，所述遲髮型超敏反應被 測量和定量。接觸敏感性涉及起始的敏化階段(sensitizingphase)，接著是引發階段 (elicitation phase) 0當T淋巴細胞遭遇它們早先接觸過的抗原時，發生引發階段。發生 腫脹和發炎，使得它成為人類變應性接觸性皮炎的極好的模型。在Current Protocols in Immunology,編 J. Ε. Cologan, Α. Μ. Kruisbeek, D. H. Margulies,Ε. Μ. Shevach 禾口 I Strober, John Wiley & Sons, Inc.，1994，單元4. 2.中詳細記載了適合的規程。還可參見Grabbe， S.和 Schwarz，T，Immun. Today 19(1) :37_44(1998)。此外，本發明的組合物可以在銀屑病樣疾病的動物模型上測試。例如，本發明的組 合物可以在Schon，Μ. P.等，Nat. Med. (1997)3 183記載的scid/scid小鼠模型中測試，其 中小鼠展現出類似於銀屑病的組織病理性皮膚損傷。另一種適合的模型是如Mckoloff， B.J.等，Am. J.Path. (1995) 146:580所述製備的人類皮膚/scid小鼠嵌合體。另一種 適合的模型在Boyman等，J ExpMed(2004) 199 (5) :731_6中記載，其中人類前銀屑病性 (prepsoriatic)皮膚被移植到AGR129小鼠上，引起銀屑病性皮膚損傷的發生。作為編碼多肽的內源基因與該基因已經改變的DNA分子之間同源重組的結果，可 以構建具有缺陷的或改變的編碼在此鑑定的多肽的基因的敲除動物。例如，編碼特定多肽 的cDNA可以用於依照建立的技術克隆編碼該多肽的基因組DNA。編碼特定多肽的基因組 DNA的一部分可以被刪除或用另一種基因替換，諸如編碼可用於監測整合的選擇標誌的基因。通常，幾千個鹼基的未改變的側翼DNA(在5'和3'兩個末端)被包括在載體中[同源 重組載體的描述參見，例如Thomas和Capecchi，Cell，51 :503(1987)]。載體被導入胚胎幹 細胞系(例如，通過電穿孔)中，並且選擇其中導入的DNA與內源DNA已經同源重組的細胞 [參見，例如Li等，Cell，69 915 (1992)]。選擇的細胞然後注射到動物(例如，小鼠或大鼠) 的胚泡中來形成聚集嵌合體[參見，例如Bradley，於Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells :A PracticalApproach,Ε. J. Robertson,編(IRL,Oxford,1987),pp. 113-152]。 然後，嵌合的胚胎能植入適合的偽孕雌性養育動物中，並使胚胎足月妊娠來創建「敲除」動 物。在它們的生殖細胞中攜帶同源重組的DNA的子代可以通過標準技術來鑑定，用於培育 其中動物的所有細胞含有同源重組的DNA的動物。敲除動物可以特徵在於例如它們抵禦某 些病理疾患的能力和它們由於缺乏所述多肽發生病理疾患。2.藥物候選物的篩選測定法藥物候選物的篩選測定法設計用以鑑定與在此鑑定的多肽或其生物學活性片段 結合或複合、或者以其它方式幹擾多肽與其它細胞蛋白質相互作用的化合物。這種篩選測 定法將包括可適應化學物質文庫的高通量篩選，使得它們特別適合於鑑定小分子藥物候選 物的測定法。所涵蓋的小分子包括合成的有機或無機化合物，包括肽(優選可溶性肽)、 (多)肽-免疫球蛋白融合物、以及特別是抗體，包括但不限於多克隆抗體和單克隆抗體及 抗體片段、單鏈抗體、抗獨特型抗體、以及這些抗體或片段的嵌合的或人源化的形式，以及 人抗體和抗體片段。可以以各種形式實施測定法，包括蛋白質_蛋白質結合測定法、生物化 學篩選測定法、免疫測定法和基於細胞的測定法，它們是本領域良好表徵的。所有測定法的 共同之處在於它們要求使測試化合物接觸在此鑑定的多肽，接觸的條件和持續時間足以容 許所述多肽與測試化合物相互作用。在結合測定法中，相互作用是結合，可以在反應混合物中分離和檢測形成的複合 物。在一個特定的實施方案中，多肽或測試化合物通過共價的或非共價的附著而固定化在 固相上，例如微量滴定板上。非共價附著一般通過用多肽或測試化合物的溶液包被固體表 面並乾燥來實現。或者，固定化的抗體，例如對要固定化的多肽特異性的單克隆抗體可以用 於將多肽錨定至固體表面。通過將用可檢測標記物標記的非固定化成分添加至固定化成 分，例如，含有錨定成分的包被表面，來進行測定法。當反應完成時，未反應的成分被除去， 例如，通過洗滌，檢測錨定在固體表面上的複合物。當最初的非固定化成分攜帶可檢測標記 物時，固定化在表面上的標記物的檢出表明發生了複合。在最初的非固定成分不攜帶標記 物的情況中，例如通過使用特異性結合固定化的複合物的帶標記物的抗體能檢測複合。如果測試化合物與在此鑑定的特定多肽相互作用於但不結合，那麼它與該蛋 白質的相互作用可以通過檢測蛋白質-蛋白質相互作用的公知方法來測定。這種測定 法包括傳統方法，諸如，交聯、免疫共沉澱、以及通過梯度或層析柱的共純化。此外，蛋 白質-蛋白質相互作用可以通過如Chevray和Nathans，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 5789-5793(1991)所披露的、使用Fields和同事記載的基於酵母的遺傳系統[Fields 和 Song，Nature (London) 340，245-246 (1989) ；Chien 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 9578-9582(1991)]來監測。許多轉錄激活物(諸如酵母GAL4)由兩個物理上分立的模塊結 構域組成，一個起到DNA結合結構域的作用，而另一個發揮轉錄激活結構域的功能。在上述 公開物中記載的酵母表達系統(一般稱為「雙雜交系統」)利用了這種性質，採用兩種雜合蛋白，在一種中，靶蛋白質融合至GAL4的DNA結合結構域，在另一種中，候選激活蛋白質融 合至激活結構域。GALl-IacZ報導基因在GAL4激活的啟動子的控制之下的表達取決於經由 蛋白質-蛋白質相互作用的GAL4活性的重構。用半乳糖苷酶的產色底物檢測含有相 互作用多肽的菌落。用於使用雙雜交技術鑑定兩種特定蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互 作用的完整試劑盒(MATCHMAKER )可從Clontech購買。這種系統也可以擴展到繪製涉及 特定蛋白質相互作用的蛋白質結構域，以及定位對這些相互作用至關重要的胺基酸殘基。為了鑑定幹擾在此鑑定的多肽與其它細胞內或細胞外成分的相互作用的化合物， 可以在容許所述多肽與所述成分相互作用的條件下製備含有所述多肽和所述成分的反應 混合物。為了測試測試化合物抑制相互作用的能力，在缺乏和存在所述測試化合物的情況 下製備反應混合物。如果在存在所述測試化合物的情況下所述多肽與所述成分的相互作用 降低，那麼稱所述測試化合物抑制所述多肽與所述成分的相互作用。在某些實施方案中，鑑定AMP的激動劑或拮抗劑的方法包括使AMP接觸候選激動 劑或拮抗劑分子並測量在通常與所述AMP相關的一種或多種生物學活性方面可檢測的改 變。這些活性包括但不限於在下文實施例中描述的那些。在一個實施方案中，本發明提供用於鑑定IL-22多肽的激動劑的方法，包括使 IL-22多肽接觸候選激動劑分子並測量在通常與所述IL-22多肽相關的一種或多種生物學 活性方面可檢測的改變。這些活性包括但不限於在下文實施例中描述的那些。3.抗體結合測定法抗體結合研究可以以任何已知的測定法來進行，例如，競爭性結合測定法、直接 和間接夾心式測定法、及免疫沉澱測定法。Zola，MonoclonalAntibodies :A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press, Inc. ,1987)。競爭性結合測定法依靠標記的標準物與測試樣品分析物競爭對有限量的抗體的 結合的能力。測試樣品中靶蛋白質的量與結合至抗體的標準物的量成反比。為了便於測定 結合的標準物的量，優選在所述競爭之前或之後使抗體不溶，從而結合至抗體的標準物和 分析物可以方便地與保持未結合的標準物和分析物分開。夾心式測定法涉及使用兩種抗體，每一種都能夠結合要檢測的蛋白質的不同的免 疫原性部分，或表位。在夾心式測定法中，測試樣品分析物被固定化在固體支持物上的第一 抗體結合，此後第二抗體結合至所述分析物，從而形成不溶的三部分複合物。參見，例如，美 國專利No. 4，376，110。第二抗體可以自身用可檢測模塊標記(直接夾心式測定法)，或可 以使用用可檢測模塊標記的抗免疫球蛋白抗體來測量(間接夾心式測定法)。例如，一類夾 心式測定法是ELISA測定法，其中可檢測模塊是酶。免疫組織化學也可以用於確定抗體所結合的抗原的細胞位置。對於免疫組織化 學，組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可以包埋入石蠟並用防腐劑諸如例如福馬林固定。製品在另一個實施方案中，本發明提供了包含對於本文所述微生物病症的診斷或治療 有用的組合物的製品。所述製品包括容器和說明書。適合的容器包括，例如，瓶、管形瓶、注 射器和試管。所述容器可以由各種材料諸如玻璃或塑料製成。容器裝有對於所述疾患的診 斷或治療有效的組合物，並且可以具有無菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或管形瓶)。組合物中的活性試劑通常是本發明的多 肽、抗體、激動劑或拮抗劑。在容器上或與容器相連的說明書或標籤表明了所述組合物是用 於診斷或治療所選的疾患。所述製品可以進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受的緩 衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以進一步包括從商業和用戶立 場出發的其它想要的材料，包括其它緩衝液、稀釋劑、濾器、針、注射器和帶使用說明書的包 裝插頁。在一個實施方案中，本發明提供了一種製品，包括(a)包含AMP或其調控劑(例如IL-22激動劑)的組合物；(b)裝有所述組合物的容器；和(c)附加在所述容器上的標籤，或包括在所述容器中的包裝插頁，關於在微生物病 症的治療中使用所述激動劑。所述組合物可以包含有效量的激動劑。
實施例下文是本發明方法和組合物的實施例，而且在本文中出於例示目的提供，而非意 圖限制本發明的範圍。應當理解，鑑於本文中所提供的一般描述，可實施各種其它實施方案。除非另有陳述，實施例中提及的商品化試劑依照製造商的說明書使用。在以下實 施例中及在整個說明書中以ATCC登記號鑑別的那些細胞的來源是美國典型培養物保藏中 心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。本文中所呈現的數據首次證明了 IL-22是在A/E細菌病原體感染早期期間連接適 應性免疫應答和先天性上皮防禦的關鍵細胞因子之一。如本文中所顯示的，對RegIII β和 RegIII Y的誘導也指示IL-22在控制各種細菌感染中可具有更寬的功能。所述數據進一步 支持Thl7細胞及其效應器細胞因子在傳染性疾病和自身免疫性疾病中的作用。最後，本研 究指示IL-22及其下遊產物諸如RegIII β和RegIII γ對於治療某些傳染性疾病可以是有 益的。實施例1 :IL_23是傳染病過程期間IL-22調節所必需的本文中的數據證明IL-23是傳染病過程期間IL-22調節所必需的。IL-22R和IL-IOR^鏈這兩種IL-22受體對都在野生型C57B1/6小鼠的GI道中 表達(圖1A)。它們在十二指腸、空腸、迴腸、和結腸中的表達比它們在皮膚中的表達要 高，皮膚是IL-22在其中顯示誘導增生的組織。一致的是，結腸上皮細胞和上皮下成肌纖 維細胞都報告響應IL-22。在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間，在野生型小鼠的結腸中誘導了 IL-22(圖1B)，正如促進Thl7細胞分化的細胞因子，包括IL-23的pl9和p40亞基(圖 1C-D)、和IL-6 (圖1E)。所有這些細胞因子被快速誘導，峰值表達位於接種後第4天前後。 相反，IL-17誘導具有較慢的動力學，而且在接種後第12天達到其最大水平(圖1F)。由於IL-23或IL-6任一在體外促進T細胞生成IL-22，因此本發明人試圖首先限 定它們在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間在調節IL-22生成中的作用。在比較嚙齒類檸檬酸杆 菌感染後野生型、Pl9+、p40+、和IL-6+小鼠的存活率時，我們一致地發現來自p40+組 (圖1G)或pl9+組(數據未顯示)任一的所有小鼠在接種後10天死亡。有趣的是，在第12 天前後在IL-6+組中也觀察到60%的死亡率(圖1G)，指示對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的完全控制一定程度地需要IL-6。接著，我們檢查了 pl9+和IL-6+這兩種小鼠中的IL-22和 IL-17表達(圖1H)。與野生型小鼠相比，雖然IL-17表達在pl9+小鼠中沒有改變(15)， 但是IL-22誘導在ρ 19+小鼠中降低了。然而，在IL-6+小鼠中，雖然IL-22的峰值水平與 野生型小鼠的相當，但是其誘導顯著延遲了(圖1H)。此外，在IL-6+小鼠中，IL-17誘導 顯著降低了，與IL-6對IL-17生成的必需作用一致。在來自受感染小鼠的結腸的離體培養物中通過ELISA直接測量IL-22/IL-17蛋白 質，證實了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間P19+小鼠中IL-22/IL-17生成的動力學和IL-22誘 導的缺失(圖11)。這些數據首次證明IL-23是傳染病過程期間IL-22調節所必需的。這些數據首次證明IL-23是傳染病過程期間IL-22調節所必需的。實施例2:IL_22是促成IL-23在控制微生物感染中的生物學的關鍵下遊效應器細 胞因子IL-23缺陷和IL-6+這兩種小鼠中改變的IL-22調節指示IL-22可能在宿主針對 嚙齒類檸檬酸桿菌感染的防禦中發揮至關重要的作用。為了進一步檢查IL-22的作用，給 IL-22+小鼠接種嚙齒類檸檬酸桿菌。雖然野生型同窩小鼠瞬時減輕體重，但是能夠在第6 天后完全恢復，而IL-22+小鼠在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後繼續減輕體重(圖2A)。約80% 的IL-22+小鼠在接種嚙齒類檸檬酸桿菌後12天變成垂死或死亡(圖2A)。對來自第8天 受感染IL-22+小鼠的結腸的組織學分析展示黏膜厚度與WT小鼠的相比增加(圖2B)。一 致的是，黏膜下炎症也增加(箭，圖2B)。此外，雖然在對照小鼠中，嚙齒類檸檬酸桿菌感染 主要是淺表的，但是在IL-22+小鼠中，大量的細菌深深地滲透入結腸隱窩中(箭，圖2C)。 用抗IL-22R抗體進行的FACS分析(圖12)揭示E-鈣粘蛋白陽性原代鼠結腸上皮細胞表達 IL-22R，但是⑶45+上皮內淋巴細胞(IEL)或固有層單個核細胞(LPMC)不表達IL_22R(圖 12A)。類似地，原代人結腸上皮細胞也表達IL-22R (圖12B)。這些數據提示IL-22直接靶 定結腸上皮細胞。這些數據支持IL-22在宿主針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的防禦中的重要性，而且 指示IL-22可以是促成IL-23在控制微生物感染中的生物學的關鍵下遊效應器細胞因子之
ο實施例3 宿主針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的防禦不需要IL-17A和IL-17F途徑IL-6+小鼠中針對嚙齒類檸檬酸桿菌的宿主防禦的部分受損也可通過這些小鼠 中IL-22誘導延遲來解釋(圖1H，左邊小圖)。然而，也可能受到嚙齒類檸檬酸桿菌感染的 IL-6+小鼠中的致命性可能是由於它們沒有能力上調IL-17(圖1H，右邊小圖)。IL-17途 徑對於控制許多細胞外細菌感染(諸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))是至 關重要的。IL-17 經由 IL-17R 和 IL-17RC 發信號(D. Toy 等，J Immunol 177, 36 (July 1， 2006))，而且自許多細胞類型(包括上皮細胞)誘導促炎症應答(J.WitowskLK.Ksiazek， A. Jorres, CellMol Life Sci 61，567 (Mar，2004))。為 了分析 IL-17途徑在嚙齒類檸檬酸杆 菌感染期間的作用，生成了 IL-17RC+小鼠(圖5)。與野生型同窩小鼠相比，IL-17RC+小 鼠在T細胞、B細胞和其它免疫細胞的發育或組成方面沒有明顯缺陷(數據未顯示)。然而， 自IL-17RC+小鼠尾尖(圖5C)或肺組織(數據未顯示)生成的成纖維細胞在用IL-17A或 IL-17F任一刺激時完全沒有能力生成IL-6，指示IL-17RC對於由IL-17A和IL-17F 二者介 導的功能是必需的受體。在接種嚙齒類檸檬酸桿菌後，IL-17RC+小鼠和野生型同窩小鼠都在感染過程中存活，沒有任何顯著減輕體重(圖2D)或任何結腸組織學差異(數據未顯 示)°這些結果指示宿主針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的防禦不需要IL-17A和IL-17F途 徑，直接排除了 IL-17生成缺陷是在IL-6+小鼠中觀察到的死亡的主要起因的可能性。如 此，在IL-6+小鼠中觀察到的IL-22誘導延遲可能是這些小鼠沒有能力在感染中存活的原 因。然而，IL-6下遊的其它因子可能也是重要的。來自IL-6+小鼠的結果暗示早期IL-22 誘導對於宿主發起足夠的針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的應答以防止致命性可能是至關重 要的。實施例3 JL-22在細菌感染早期階段發揮至關重要的作用為了確定早期IL-22誘導對於宿主發起足夠的針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的應 答以防止致命性是否是至關重要的，自第0天或接種嚙齒類檸檬酸桿菌後第8天開始隔天 施用抗IL-22中和性抗體。正如所預期的，在接種細菌的同時接受抗IL-22單抗的小鼠繼 續減輕體重，而且在接種後12天都變得垂死或死亡。相反，所有用同種型對照抗體處理的 動物都存活(圖2E)。自接種後8天開始接受抗IL-22單抗的小鼠具有與用同種型單抗處 理的小鼠相似的後果，自感染完全恢復。因此，這些數據指示IL-22在嚙齒類檸檬酸桿菌感染早期階段發揮至關重要的作 用，但是在根除細菌的宿主防禦晚期階段不發揮作用。實施例4 :IL_19、IL-20、和IL-24不是宿主針對細菌感染的防禦必需的在人上皮角質形成細胞中，其它IL-10家族細胞因子(IL-19、IL_20、和IL-24)都 誘導與IL-22所誘導的相似的生物學功能(S. M. Sa等，J Immunol 178，2229 (February 15， 2007))。在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間，IL-19、IL-20、和IL-24在野生型小鼠中都上調(圖 6)。因此，它們在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間可能發揮與IL-22相似的作用。IL-19經由 IL-20Ra和IL-2OR0鏈發信號。IL-20和IL-24能經由兩對不同受體(IL-20Rα /IL-20Rβ 和 IL-22R/IL-20R3 )發信號(J. -C. RenauId, Nature Reviews Immunology 3，667 (2003))。 因此，IL-20Ri3是這三種細胞因子的共同受體鏈。在GI道中，IL-20Ra和IL_20Ri3鏈的 表達顯著低於這些鏈在皮膚中的表達(圖7)。為了精密地確定這三種細胞因子在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間的作用，生成了 IL_20Ri3 +小鼠(圖8)。這些小鼠展現正常發育，在所有主要淋巴樣器官中具有與野生型 小鼠相比相似的淋巴細胞組成和發育(數據未顯示)。來自這些小鼠的耳部皮膚在用重組 IL-20處理時未能上調SlOO家族蛋白質，指示體內IL-20信號傳導缺陷(圖8C)。像野生型小鼠一樣，IL_20Ri3 +小鼠在嚙齒類檸檬酸桿菌感染中存活(圖2F)，證 明了 IL-19、IL-20、和IL-24不是宿主針對嚙齒類檸檬酸桿菌的防禦必需的。實施例5 JL-22缺陷在嚙齒類檸檬酸桿菌感染早期階段期間可損及上皮完整性本發明人檢查了嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間IL-22的下遊機制。在接種嚙齒類 檸檬酸桿菌後8天，與對照小鼠相比，在第0天用抗IL-22單抗處理的IL-22+小鼠和野生 型小鼠都形成更加嚴重的血性腹瀉和直腸脫垂髮生率增加(數據未顯示)。與對照小鼠相 比，來自IL-22+小鼠(數據未顯示)或第0天用抗IL-22單抗處理的小鼠的結腸在接種 後10天增厚和縮短(圖3A)，並且具有較小的盲腸。組織學分析進一步揭示缺少IL-22信 號傳導的結腸中炎症增加(圖3B)。在IL-22+和用IL-22單抗處理的小鼠中還都有顯著
55的多灶性黏膜潰瘍形成和多個透壁性炎症病灶(圖3C和圖9)。此外，IL-22+小鼠的腸系 膜淋巴結、脾、和肝中的細菌負荷與野生型小鼠的相比顯著升高。有趣的是，野生型小鼠和 IL-22+小鼠的結腸中的細菌負荷差異可忽略不計(圖3D)。與這些結果一致，也有系統性 細菌擴散的證據，特別是在IL-22+小鼠的肝中，那裡伴有栓塞性微膿瘍的多灶性肝細胞壞 死是明顯的(圖3E)。總之，這些數據指示在IL-22+小鼠中上皮完整性在嚙齒類檸檬酸桿菌感染早期 階段期間受損。實施例6 JL-22缺陷導致抗細菌IgG滴度降低先前的研究確立了抗嚙齒類檸檬酸桿菌抗體在清除細菌中的必需作用。轉移來自 感染後野生型小鼠的血清完全挽救CD4+小鼠免於在嚙齒類檸檬酸桿菌攻擊後死亡(10)。 在我們的研究中，IL-22缺陷小鼠自第8天前後開始變得垂死或死亡，此時野生型小鼠中還 沒有完全形成抗體應答(圖3F)。在第8天，抗嚙齒類檸檬酸桿菌抗體滴度比野生型小鼠中 第16天的滴度低50倍。然而，當我們比較來自野生型和IL-22+小鼠的第8天抗嚙齒類檸 檬酸桿菌抗體的滴度時，IL-22+小鼠中的抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG滴度與野生型小鼠的 相比有出乎意料的顯著降低(圖3G)。相反，IL-22+小鼠中的總IgG、IgM、IgA或抗嚙齒類 檸檬酸桿菌IgM和IgA滴度沒有降低(圖IOA和未顯示的數據)。另外，IgG亞型分析揭示， 雖然接種後8天野生型或IL-22+小鼠中都沒有抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgGl，但是IL-22+小 鼠中的其它抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG亞型(包括IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3)都顯著降 低(圖10B)。不太可能抗細菌特異性IgG的差異促成在此時間點自結腸清除嚙齒類檸檬酸 桿菌，尤其是因為IgG不是靶向結腸黏膜腔的，而且野生型和IL-22+小鼠中的結腸細菌負 荷是相似的(圖3D)。可能循環中的抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG在控制嚙齒類檸檬酸桿菌穿 透經過腸上皮屏障，及阻止系統性擴散中可能是重要的，因為最近的一項研究證明循環中 的IgG(而非分泌性IgA或IgM)是嚙齒類檸檬酸桿菌系統性清除所需要的(C. Maaser等， Infect. Immun. 72，3315 (June 1，2004))。不清楚IL-22缺陷如何導致抗細菌IgG滴度降低。 不太可能IL-22直接作用於B細胞，因為在B細胞上檢測不到IL-22R表達(S. Lecart等， Int. Immunol. 14，1351 (November 1,2002)) 但是，抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG降低可能是促 成IL-22+小鼠中嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間宿主防禦應答缺陷的因素之一。實施例7 JL-22是在細菌感染期間自結腸上皮細胞誘導抗微生物凝集素(諸如 RegIIIP和RegIII γ)不可缺少的根據微陣列分析，離體用IL-22處理來自未感染野生型小鼠的結腸組織上調許多 抗微生物蛋白質，包括S100A8、S100A9、RegIIH RegIII γ、觸珠蛋白、SAA3、和乳運鐵蛋 白(圖4Α、19、和20)。對這些蛋白質的誘導得到了實時RT-PCR的證實(圖4Β和未顯示的 數據)。然而，在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間，只有S100A8、S100A9、RegIIIi3和RegIII γ 在IL-22+小鼠中與野生型小鼠相比差異表達(圖4C)。所有其它基因或是沒被誘導或是 在野生型與IL-22+小鼠的結腸中沒有差異(數據未顯示)。在第4天和第6天，S100A8 和S100A9 二者在IL-22+小鼠的結腸中的表達比在野生型結腸中的略高，提示這些蛋白 質的差異表達很可能不負責在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間在IL-22+小鼠中觀察到的死 亡率升高。在野生型和IL-22+小鼠之間在防衛素(即在受感染上皮的宿主防禦中重要 的蛋白質)(T.Ganz，Science 286，420 (October 15,1999))的表達中沒有發現差異(數據
56未顯示)。有趣的是，在野生型小鼠中觀察到的RegIII β和RegIII γ上調在IL-22+小 鼠中在接種嚙齒類檸檬酸桿菌後被完全消除(圖4C)，指示這兩種蛋白質在控制嚙齒類檸 檬酸桿菌感染中具有潛在功能。RegIIIii和RegIII Y都屬於分泌性C型凝集素蛋白質 家族(H. L. Cash, C. V. ffhitham, L. V. Hooper, Protein Expression and Purification 48, 151(2006))。RegIIIii和RegIII γ表達水平在小鼠中應答細菌建群以及在其它炎性刺 激後顯著升高(S. A. Keilbaugh 等，Gut 54,623 (May 1,2005) ；H. Ogawa 等，Inflammatory Bowel Diseases 9,162(2003) ；H.0gawa,K.Fukushima,I. Sasaki,S. Matsuno,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, G492 (Sep,2000)) RegIIIii或RegIII γ可阻止嚙齒類檸檬酸桿菌深深地侵入結腸隱窩中，因為我 們在來自IL-22+與野生型小鼠結腸的細菌負荷中沒有看到差異(圖3D)。或者，RegIIIii 或RegIII Y蛋白質可起自分泌生長因子的作用，在腸炎症的背景中在上皮修復和/或 保護中發揮作用(H. Ogawa 等，Inflammatory BowelDiseases 9，162 (2003) ；S. L. Pull, J. Μ. Doherty, J. C. Mills, J. I. Gordon, T. S. Stappenbeck, PNAS 102,99 (January 4,2005)； V. Moucadel 等，Eur J Cell Biol80，156 (Feb，2001))。實施例8 適應性免疫不是由IL-22介導的針對嚙齒類檸檬酸桿菌感染的早期宿 主防禦必需的上述數據提示IL-22在先天性免疫和適應性免疫二者中的作用。因此，我們使用 重組活化基因2缺陷(Rag2+)小鼠來精密檢查IL-22在嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間在先 天性與適應性免疫中的功能。由於缺少B和T細胞，及因此沒有能力發起抗嚙齒類檸檬酸 桿菌抗體應答，Rag2+小鼠逐漸減輕體重並最終在第30天前後變得垂死或死亡(圖13A)。 與pl9+或IL-22+小鼠不同，Rag2+小鼠無一在感染的頭兩周裡減輕超過10%它們的體 重或死亡。此外，用抗IL-22單抗處理的Rag2+小鼠減輕體重非常迅速(圖13A)，與用抗 IL-22單抗處理的WT小鼠相似(圖2E)。所有用抗IL-22單抗處理的Rag2+小鼠在第10 天前後變得垂死或死亡(圖13)。這些數據提示IL-22途徑在Rag2+小鼠中仍有活性，而且 IL-22是在嚙齒類檸檬酸桿菌感染早期階段在沒有適應性免疫的情況中保護小鼠免於死亡 所必需的。這些數據還指示抗嚙齒類檸檬酸桿菌IgG滴度降低是在嚙齒類檸檬酸桿菌感染 後在IL-22+小鼠中觀察到的發病和死亡的不充分起因，因為Rag2+小鼠中缺少抗體生成 單獨不引起感染後快速體重減輕和早期死亡。在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後，Rag2+小鼠中的IL-22生成與WT小鼠的相當(圖 13B)。相反，Rag2+小鼠中的IL-17A誘導顯著降低(圖13B和C)。因此，在此模型中，T細 胞和B細胞不是IL-22的來源。用抗IL-22單抗進行的免疫組織化學染色(圖15)在受到 嚙齒類檸檬酸桿菌感染的WT小鼠的結腸中檢測到IL-22陽性細胞，但是未感染結腸或來自 受感染IL-22+小鼠的結腸沒有檢測到。在Rag2+小鼠的結腸中，IL-22陽性細胞主要與 ⑶Ilc+細胞簇共定位(圖13D)，但是不與F4/80、Gr_l、或DX5陽性細胞共定位(數據未顯 示)。另外，在體外，IL-23直接自⑶Ilc+ DC誘導IL-22生成(圖13E)。總之，我們的數據 證明DC是嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間IL-22生成的主要來源之一，而且IL-23能直接促進 DC 生成 IL-22。實施例9 =RegIII在細菌感染期間發揮重要作用有趣的是，在接種嚙齒類檸檬酸桿菌後，在野生型小鼠中觀察到的RegIIIii和
57RegIIIy上調在IL-22+小鼠中(圖4C)以及在pl9+小鼠中(圖16)被完全消除。 RegIIIii和RegIII γ屬於分泌性C型凝集素蛋白質家族。我們發現其它家族成員(包括 Regl、RegII, RegIII α、和RegIII δ (圖17)，但是不包括RegIV(數據未顯示))在受到齧 齒類檸檬酸桿菌感染的結腸中也上調，而且它們的誘導在IL-22+小鼠中被完全消除。外 源小鼠RegIII Y融合蛋白(rmReglllY)顯著保護IL-22+小鼠免於由嚙齒類檸檬酸桿菌 感染誘導的體重減輕，而且大約50%用rmRegIII γ融合蛋白處理的動物在感染中存活，而 100%用對照處理的IL-22+小鼠變得垂死或死亡(圖14Α)。這些數據支持Reg家族蛋白 質(諸如RegIII Y)介導IL-22下遊在控制嚙齒類檸檬酸桿菌感染中的必需功能的假設。最後，IL-23/IL-22/Reg軸的存在在人類系統中也得到確認。人IL-23誘導人DC 生成hIL-22 (圖14B)。原代人結腸上皮細胞(圖12B)和人結腸上皮細胞系HT29和HCT15 表達IL-22R(圖14C)。在體外，原代人結腸上皮細胞生長緩慢，而且在擴增期間逐漸喪失它 們的IL-22R表達(數據未顯示)。因此，我們使用結腸上皮細胞系來測試它們對人IL-22 的應答。11^-22在這些結腸上皮細胞系中誘導31413活化(圖140)，而且1 叩1113和 RegIII Y都被IL-22顯著誘導(圖14E)。重要的是，人RegIII γ融合蛋白(rhRegIII γ) (像rmRegIII γ融合蛋白)還將嚙齒類檸檬酸桿菌感染後IL-22+小鼠的死亡率降低至 40%,比較而言用對照處理的IL-22+小鼠中的死亡率是100% (圖18)。總之，我們的數 據暗示IL-22途徑可能在人GI道中控制細菌感染(特別是A/E細菌感染)中發揮必需作 用。概述本發明人在此證明IL-22在針對粘附和抹消(A/E)細菌病原體的早期宿主防禦中 發揮不可缺少的作用。本文中的數據指示IL-22以兩種機制保護腸上皮屏障的完整性並阻止細菌侵入 及系統性擴散。第一，IL-22涉及引發早期抗細菌IgG應答。第二，IL-22是細菌感染期間 自結腸上皮細胞誘導抗微生物凝集素(諸如RegIIIii和RegIIlY)不可缺少的。這兩種 機制任一或二者的缺失可促成IL-22+小鼠中嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間宿主防禦應答受 損及系統性擴散和死亡率升高。雖然適應性免疫應答是清除這些病原體必需的(L. Bry, M. B. Brenner, JImmunol 172,433 (January 1，2004))，但是感染早期階段期間由免疫細胞生成的細胞因子(諸如 IL-22)也是腸上皮細胞引發完全抗微生物應答和傷口癒合應答以阻止病原性細菌系統性 侵入宿主中必需的。如本文中所顯示的，RegIIIii和RegIII γ誘導也指示IL-22在控制 各種細菌感染中可具有更寬的功能。所述數據進一步支持Thl7細胞及其效應器細胞因子 在傳染病和自身免疫病中的作用。最後，本研究指示IL-22及其下遊產物(諸如RegIII β 和RegIII Y)對於治療某些傳染病可能是有益的。材料和方法小鼠C57B1/6、IL_12p40+、和 IL-6+ 小鼠購自 Jackson Laboratory IL-22+ 小鼠和 IL-12pl9+是如之前所述生成的(11，圖5)。IL-17RC+和IL_20R3 +小鼠是由Lexicon Pharmaceuticals (The Woodlands, TX)通過使用所描述的策略生成的(圖5和圖8)。簡言 之，使用所描繪的尋靶載體通過標準同源重組生成敲除小鼠。將尋靶載體電穿孔入129品系ES細胞中，並鑑定被靶定的克隆。將靶定克隆顯微注射入宿主胚泡中以生成嵌合體。使 嵌合體與C57B1/6動物繁殖以生成Fl雜合子。使雜合子雜交以生成F2野生型、雜合子和 純合子組。使用三種引物的集合經PCR通過尾部DNA對這些研究中所使用的小鼠進行基因 分型。用於IL-2OR0 +小鼠野生型等位基因擴增的引物是5，-GTG GAA GCTACT TGA TGA GTA GGG-3，(pi)和 5，-AGA TGC GAA AAT GGA GAT TAAAAG-3，(p2)，其產生 595bp 產物。 用於ILjORP +小鼠突變型等位基因擴增的引物是5』 -CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3，(p3)和p2，其產生351bp產物。用於IL-17RC+小鼠野生型等位基因擴增的引物是 5，-GAG CCT GAAGAA GCT GGA AA-3， (P3)和 5，-CAA GTG TTG GCA GAG ATG GA-3， (P2)，其 產生534bp產物。用於IL-17RC+小鼠突變型等位基因擴增的引物是5』-TCGCCT TCT TGA CGA GTT CT-3，(Pl)和 P2，其產生 404bp 產物。細菌菌株和小鼠感染將6-8周齡小鼠禁食8小時之後口服接種2xl09個嚙齒類檸檬酸桿菌菌株 DBS100 (ATCC 51459 ；American Type Culture Collection)，總體積 200 μ 1 每隻小鼠。禁 食時，動物可獲得水。接種和所有後續操作在BL-2生物安全櫥中進行。接種後容許動物獲 得食物。通過在LB肉湯中在搖動中於37°C溫育過夜來製備細菌。通過測量0D600吸光度 來評估細菌的相對濃度，並將每份接種培養物連續稀釋和塗板以證實所施用的CFU。 組織收集、組織學和CFU計數如所描述的接種對照或受感染小鼠。在無菌條件下取出全血、脾、肝、腸繫膜淋巴 結、和結腸樣品。將結腸解剖至肛管，並將末端0. 5cm段用於CFU分析。在10%中性緩衝的 福馬林中固定近端區段。將切片用H&E染色以評估組織病理學。將脾、肝、腸繫膜淋巴結、 和結腸稱重並勻漿。將勻漿物連續稀釋並一式三份塗板至MacConkey瓊脂(Remel)。以粉 紅色菌落來鑑定嚙齒類檸檬酸桿菌菌落。於37°C溫育24小時後對菌落計數以測定IoglO CFU每克組織。RNA分離和實時RT-PCR通過RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)依照製造商的指令分離細胞和組織RNA。使用 TaqMan—步RT-PCR大師級混合試劑(Applied Biosystems)用引物和探針在ABI 7500實 時PCR系統(Applied Biosystems)上進行實時RT-PCR。引物和探針的序列如下mIL-22， 正向，5，-TCC GAG GAG TCA GTG CTAAA-3，，反向，5，-AGA ACG TCT TCC AGG GTG AA-3，，和 探針，5，-TGA GCACCT GCT TCA TCA GGT AGC A_3，(FAM, TAMRA) ；mIL_17A，正向，5，-GCTCCA GAA GGC CCT CAG A-3，，反向，5，-CTT TCC CTC CGC ATT GACA-3，，和探針，5，-ACC TCA ACC GTT CCA CGT CAC-3，(FAM, TAMRA)；小鼠核糖體持家基因 RPL-19，正向，5，-GCA TCC TCA TGG AGC ACA T-3，，反向，5，-CTG GTC AGC CAG GAG CTT-3，，和探針，5，-CTT GCG GGC CTTGTC TGC CTT-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-19，正向，5，-AGC CTG GAT TGACAG GAA TC-3，，反 向，5，-GAT AAT CAG ACG AGG CGT TTC-3，，和探針，5，_TCT GGA AAC TCC TGC AGC CTG ACA C-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-20，正向，5，-TTT GGG AGA ACT AGG CAT TCT T-3，，反向，5，-TCT TGG ACAGGA GTG TTC TCA-3，，和探針，5，-CAG CCT CTC CAC TTT CAT CTA TAGCAT CTC C-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-24，正向，5，-GCT CTC CAT GCC ATTTCA A-3，，反向，5，-TGG CCA AGG GTC TGA AGT-3，，和探針，5，-TGT ACATCC CTG CTG TCC TCA AGG C_3，(FAM，TAMRA)； mIL-6，正向，5，-TCCAAT GCT CTC CTA ACA GAT AAG-3，，反向，5，_CM GAT GAA TTG GATGGTCTT G-3，，和探針，5，-TCC TTA GCC ACT CCT TCT GTG ACT CCA-3，(FAM, TAMRA) ；mS100A8, 正向，5，-TGT CCT CAG TTT GTG CAG AATATA AA-3，，反向，5，-TCA CCA TCG CAA GGA ACT CC-3，，和探針，5，-CGAAAA CTT GTT CAG AGA ATT GGA CAT CAA TAG TGA-3，(FAM, TAMRA)； mS100A9，正向，5，-GGT GGA AGC ACA GTT GGC A_3，，反向，5，-GTG TCC AGG TCC TCC ATG ATG-3，，和探針，5，-TGA AGA MG AGAAGA GAA ATG AAG CCC TCA TAA ATG-3，(FAM, TAMRA)； mRegIII γ，正向，5，-ATG GCT CCT ATT GCT ATG CC-3，，反向，5，-GAT GTC CTG AGGGCC TCT T-3，，和探針，5，-TGG CAG GCC ATA TCT GCA TCA TAC C_3，(FAM, TAMRA) ；mPAP/HIP/ RegIII β，正向，5，-ATG GCT CCT ACT GCT ATGCC-3，，反向，5，-GTG TCC TCC AGG CCT CTT T-3，，和探針，5，-TGA TGCAGA ACT GGC CTG CCA-3' (FAM, TAMRA) ；mIL_12p40，正向，5，-ACA TCTACC GAA GTC CAA TGC A-3，，反向，5，-GGA ATT GTA ATA GCG ATC CTGAGC-3，，和探針， 5，-TGC ACG CAG ACA TTC CCG CCT-3，(FAM，TAMRA) ；mIL_23pl9，正向，5，_GGT GGC TCA GGG AAA TGT-3，，反向，5，-GAC AGAGCA GGC AGG TAC AG-3，，和探針，5，-CAG ATG CAC AGT ACT CCA GACAGC AGC-3，(FAM, TAMRA) ；mIL_20R3，正向，5，-CAG GTG CTT CCA GTCCGT CT-3，， 反向，5，-CTC TCC TGG AAT CCC CAA AGT-3，，和探針，5，-CAGCAC AGA TGC CAA CGG CCT CAT-3，(FAM，TAMRA) ；mIL_20Ra，正向，5，_CTG GCC GCT TCG GGA CGC-3，，反向，5，_AAC CAC AGA AGA CACAAG GAA CTG-3，，和探針，5，-TCT GCT GCT GGC CGC TTC GG-3，(FAM，TAMRA)； mIL-22R，正向，5，-GCT GGA CTC CCT TGT GTG T-3，，反向，5，-CAC ATG GCC TCA GTC TCA A-3，，和探針，5，-CGC GGG ACC CTC ATCCTT TG-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-10R^，正向，5，-TCC ACA GCA CCT GAAGGA GTT-3，，反向，5，_GGA GGG AAG GAG MC AGC AGA-3，，和探針，5，_TGG GCC ACC CCC ATC ACA GC-3』 (FAM, TAMRA) 一式兩份運行反應，並將樣品相對於對照持家 基因RPL-19標準化及依照Δ Δ Ct法報告Δ Δ Ct = Δ Ct樣品-Δ Ct參照。Ig ELISA如先前所述對來自所收集全血的血清實施分析(10)。簡言之，用加熱殺死的齧 齒類檸檬酸桿菌或在PBS中1/1000稀釋的山羊抗小鼠Ig捕捉抗體(SouthernBiotech) 包被ELISA板(Nunc)。將經過包被的板在PBS加0. 05% Tween20中清洗，用300 μ 1封閉 緩衝液(PBS+0. 5% BSA+10PPM Proclin)封閉1小時，並清洗，之後添加連續稀釋的標準 品(小鼠單克隆 IgA、IgG, IgG3、和 IgM(SouthernBiotech) ；IgGU IgG2a、和 IgG2b 同種型 (Sigma-Aldrich)；小鼠IgG2c (Bethyl Laboratories))或未知物。將樣品於室溫溫育4小 時。將板清洗五次，並用在測定緩衝液(PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+10PPMProclin,pH 7.4)中1/4，000稀釋的偶聯有辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgA, IgM, IgG, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG2c、和IgG3 (SouthernBiotech)檢測Ig同種型，於室溫溫育1小時。清洗 後，向每個孔添加TMB過氧化物酶底物，並容許顯色15分鐘，然後向每個孔添加終止液(1M 磷酸)。在 MolecularDevices (Sunnyvale, CA)讀板儀中於 450nm 讀取吸光度，0D45(1。體外結腸培養自C57B1/6小鼠取出結腸。用冷的PBS清潔後，縱向切開結腸。將結腸放置 在裝有IOml HBSS (Mediatech)緩衝液的IOOmm培養皿中，該緩衝液含有2. 5 μ g/ml Fungizone-兩性黴素B、10 μ g/ml慶大黴素、100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素(都 來自GIBC0，Invitrogen) 0在培養皿邊緣溫和地刮結腸以清除粘液，並轉移至裝有新鮮 HBSS緩衝液的新培養皿。將結腸切成l-2mm段並在含有10 %熱滅活的FCS (HyClone)、2. 5 μ g/ml Fungizone-兩性黴素B、10 μ g/ml慶大黴素、2mM L-穀氨醯胺、100U/ml青黴素 和100 μ g/ml鏈黴素的RPMI緩衝液中以50mg結腸/lml/孔轉移至24孔板。將10 μ g/ml IL-22 (R&Dsystems)添加至培養物並於37°C溫育24小時。微陣列分析分別使用ND-1000分光光度計(Nanodrop Technologies)和生物分析儀 2100 (Agilent Technologies)測定總RNA樣品的數量和質量。用於製備Cy染料標記的cRNA 和陣列雜交的方法由Agilent Technologies提供。簡言之，使用Agilent的低RNA輸入熒 光線性擴增試劑盒，將總RNA樣品轉變成雙鏈cDNA，然後轉變成Cy染料標記的cRNA。使用 RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)純化經過標記的cRNA。使用ND-1000分光光度計測定cRNA產 量和Cy染料摻入。將750ng經過標記的cRNA片段化，並如製造商的原位雜交試劑盒+所 述雜交至Agilent的全小鼠基因組陣列。將所有樣品用Cy5標記，並針對Cy3標記的通用 小鼠參照(Stratagene)雜交。雜交後，將陣列清洗，乾燥並在Agilent的DNA微陣列掃描 儀上掃描。使用Agilent的特徵提取軟體8. 5來分析所獲得的陣列圖像。為了微陣列數據 聚類(圖20)，通過標準方法將表達數據加工成Agilent對數-比數據。通過根據Pearson 相關係數有最高聯繫的矢量的迭代凝聚對選定基因聚類，其中凝聚矢量的數據通過平均聯 系來匯總。(Selectedgenes were clustered by iterative agglomeration of vectors most highly linked byPearson correlation coefficient，with data for agglomerated vectors summarizedby average linkage.)體外小鼠尾尖成纖維細胞培養和刺激為了建立尾尖成纖維細胞(TTF)，將來自IL-17RC+成年小鼠和野生型同窩小鼠 的尾巴剝皮，切成Icm段，放置在培養皿上，並在高葡萄糖DMEM(含有10% FCS、2nm穀氨醯 胺、100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素)中溫育5天。將遷移出移植物段的細胞轉移至新 板(第2傳代)並在相同培養基中維持。我們使用第3傳代的TTF進行刺激實驗。將TTF 以1.2x10s每孔的密度接種入24孔板。接種後24小時，將重組鼠IL-17A和IL-17F_ Systems)以各種濃度添加至培養物。添加細胞因子後24小時收穫細胞培養物上清液，並 使用小鼠IL-6 ELISA套組(BD Biosciences)遵循製造商的指令通過酶聯免疫吸附測定法 (ELISA)測量鼠IL-6水平。體內鼠IL-22阻斷在嚙齒類檸檬酸桿菌感染之前(第0天)或之後8天(第8天)以150 μ g/小鼠 的劑量隔天腹膜內注射阻斷性抗小鼠IL-22(克隆8E11，同種型小鼠IgGl)單抗(11)。某 對照組還接受同種型對照IgGl單抗。統計學使用Prism軟體(GraphPad)通過單路或雙路ANOVA來計算統計學顯著性。所有 (0. 05的ρ值認為是顯著的，且在正文中指出。除非另有說明，呈現了數據的所有研究是 至少兩項獨立實驗的代表。雖然為了清楚理解的目的已經通過說明和實施例較為詳細地描述了上述發明，但 是說明和實施例不應解釋為限制本發明的範圍。通過述及明確地完整收錄本文中所引用的 所有專利和科學文獻的公開內容。實施例10 嚙齒類檸檬酸桿菌感染期間LT途徑是由IL-22介導的
61
為了幫助確定IL-22對於由LT阻斷引起的死亡是否是重要的，我們實施了挽救實 驗，其中我們在小鼠中在LTbR-Fc處理的同時表達IL-22。我們用於表達IL-22的方法是 水動力學尾靜脈投遞編碼小鼠IL-22的質粒DNA。人LTbR-Ig如下構建將涵蓋細胞外結 構域的人LTbR (第1位至第224位；SEQ IDNO 57)克隆入改良pRK5表達載體中，該載體在 LTbR序列下遊編碼人IgGl Fc區(SEQ ID NO :58)。在CHO細胞中過表達蛋白質，並通過蛋 白A親和層析來純化。鼠LTbR. Ig如下構建將涵蓋細胞外結構域的鼠LTbR(第1位至第 222位；SEQ ID NO 59)克隆入改良pRK5表達載體中，該載體在LTbR序列下遊編碼鼠IgG2a Fc 區(SEQ ID NO 60)。在圖21中，我們發現LTbR-Fc生成與IL-22阻斷相似的體重減輕曲線(圖21右 邊小圖)和死亡曲線(圖21左邊小圖)，這使得我們檢查LT和IL-22之間的關係。嚙齒類 檸檬酸桿菌感染導致結腸中IL-22的早期表達。圖21顯示了接種嚙齒類檸檬酸桿菌的小鼠的百分比存活。將6-8周齡Balb/c小 鼠禁食8小時之後口服接種2xl09個嚙齒類檸檬酸桿菌菌株DBS100 (ATCC 51459 ；American Type Culture Collection)，總體積200 μ 1每隻小鼠。禁食時，動物可獲得水。接種和所 有後續操作在BL-2生物安全櫥中進行。接種後容許動物獲得食物。通過在LB肉湯中在搖 動中於37°C溫育過夜來製備細菌。通過測量0D600吸光度來評估細菌的相對濃度，並將每 份接種培養物連續稀釋和塗板以證實所施用的CFU。在接種那天，還給小鼠注射150ug抗 gpl20單抗、抗IL-22 8E11單抗、或LTbR-Fc，每周3次。LT途徑調節對IL-22生成重要的多個上遊方面。圖22提供了嚙齒類檸檬酸桿菌 感染後LT途徑的數據。A、C、E。在嚙齒類檸檬酸桿菌感染後的不同時間點收穫結腸。隔天 給小鼠注射150ug抗gpl20或LTbR-Fc。使用QiagenRNeasy試劑盒提取RNA。實施Taqman 分析以測定IL-22、RegIIg、p 19、或p40相對於第0天時間點的表達。B。在感染後第4天， 收集結腸。用冷的PBS清潔後，縱向切開結腸。將結腸放置在裝有IOml HBSS(Mediatech) 緩衝液的IOOmm培養皿中，該緩衝液含有2. 5 μ g/ml Fungizone-兩性黴素B、10 μ g/ml慶 大黴素、100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素(都來自GIBC0，Invitrogen)。在培養皿邊緣 溫和地刮結腸以清除粘液，並轉移至裝有新鮮HBSS緩衝液的新培養皿。將結腸切成l_2mm 段並在含有 10%熱滅活的 FCS (HyClone)、2· 5 μ g/ml Fungizone-兩性黴素 B、10 μ g/ml 慶 大黴素、2mM L-穀氨醯胺、100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的RPMI緩衝液中以50mg結 腸/lml/孔轉移至24孔板。將lOng/ml rmIL-22 (R&D systems)添加至培養物並於37°C 溫育24小時。收集上清液，用於IL-22 ELISA。D。第6天結腸固有層細胞。通過⑶Ilc+ 和MHC 11+確定的DC。收穫結腸，並用不含鈣和鎂的HBSS(Invitrogen)及2% FBS和IOmM HEPES衝洗。縱向切開結腸，然後切成2-4cm段，並將各段轉移至裝有不含鈣和鎂的HBSS、 2% FBSUmM EDTAUOmM HEPESjPlmM DTT(Sigma-Aldrich)的 IOcm 皿。在以 200rpm 搖 動中於37°C溫育45分鐘後收集並丟棄IEL級分。為了分離LPMC，剝去剩餘上皮層，並將 結腸段切成方塊並放置在含有10% FCS、20mM HEPES、和0. 5mg/ml膠原酶/分散酶(Roche Diagnostics)的RPMI中。將結腸段在搖動中於37°C溫育1小時。將分離的上皮細胞清洗 並用於FACS分析。在圖22中，我們發現LTbR-Fc阻斷IL-22誘導以及RegIIIg，已經顯示了 IL-22誘 導RegIIIg(圖22A-C)。先前顯示了樹突細胞生成IL-22，而且我們發現感染後6天結腸固有層中的DC數目輕微減少(圖22D)。由LTbR-Fc引起的IL-22減少最有可能是由於IL-23 喪失，因為P19和p40 二者表達在感染期間在LTbR-Fc處理後都受到抑制(圖22E)。IL-22部分挽救在用LTbR處理的小鼠中看到的缺陷。圖23提供關於IL-22對 用LTbR處理的小鼠的影響的數據。A。尾靜脈注射IL-22質粒後血清中IL-22和結腸中 RegIIIg的表達測試。B。用IL-22質粒挽救LTbRFc效果。在第-1天，對動物稱重和分組，對額外的小鼠處以安樂死。稱重後，所有動物禁食 14小時。次日上午(第0天)，所有小鼠口服接種200ul PBS中的2-4X10e9CFU嚙齒類檸 檬酸桿菌。自接種細菌的同一天開始，持續兩周，每周三次i. P.注射200ul PBS中的150ug 對照單抗或Fc融合蛋白。接種後調查人員放回食物。6小時後，通過尾靜脈注射質粒DNA。 尾靜脈注射實驗1)將DNA構建物(pRK載體或pRK-mIL-22)在Ringer氏溶液中稀釋至 某濃度以產生最終劑量10微克/小鼠/注射。2)給每隻小鼠在尾靜脈中靜脈內注射大約 1. 6ml在Ringer氏溶液中含有DNA的溶液。3)為了最大DNA攝取，在4-5秒(最多8秒) 時間裡以靜脈內推注(尾靜脈)來施用劑量。小鼠在不麻醉的情況中限制在圓錐形丙烯酸 限制器中，帶有加熱元件以提高體溫和擴張血管。4)為每隻動物使用一次性使用的無菌注 射器。繼續監測動物直至它們達到臨床正常。5)在服藥後對動物觀察任何不利臨床體徵至 少20分鐘。如果動物在服藥後1小時裡沒有達到臨床正常，對它們處以安樂死或監測它們 直至它們達到臨床正常。對垂死的動物處以安樂死。所有操作在BL-2生物安全櫥中實施。 感染期間，對垂死的動物或那些顯示未得到緩解的痛苦或直腸脫垂的處以安樂死。每天監測小鼠持續4周。在第5天至第17天之間，當用LTbR-Fc處理的小鼠可能 變得垂死時，每天兩次監測小鼠，包括周末。每周收集糞粒以測量嚙齒類檸檬酸桿菌的CFU。 研究期間每周一次對小鼠稱重。若小鼠展現體重減輕15%或更多，則每天對它們稱重。若 體重減輕超過20%，則對小鼠處以安樂死。研究結束時，對所有小鼠處以安樂死，並收集脾 和結腸，用於組織學、RNA或FACS分析。如圖23A所示，自注射後2小時開始，我們能在小鼠血清中檢測到IL-22表達，而 且表達在72小時時下降。我們還能檢測到結腸中的RegIIIg表達，提示當以這種方式表達 時，活性IL-22能作用於結腸。IL-22能部分挽救感染期間由LTb-Fc處理誘導的死亡和體 重減輕(圖23B)。用IL-22單抗(8E11)處理小鼠。圖24顯示的數據證明用IL-22單抗8E11進行 處理導致結腸濾泡減少(reduced)、B/T細胞組構(organization)受損、及結腸中DC、T細 胞、和B細胞數目減少。A。感染後6天，收穫並縱向切開結腸。在不含鈣和鎂的HBSS、2% FBSUmM EDTAUOmM HEPES、和ImM DTT中溫育30分鐘後，溫和地刮結腸以清除上皮細胞。 以白色、圓形物鑑定濾泡。每組5隻小鼠，並且對每份結腸計數和繪圖，作為找到的總濾泡 或找到的大於Imm的總濾泡。B。感染後6天，將結腸用冷的PBS衝洗並在OCT中快速冷凍。 切出6微米切片，乾燥，然後在丙酮中固定。將切片用10%血清封閉，與抗CD5 FITC和抗 B220 APC各10ug/ml—起溫育。在NIKON BX61顯微鏡上捕捉圖像。C。感染後6天，如上 所述分離結腸固有層細胞。實施FAC分析以測定8E11處理後的樹突細胞、CD3 T細胞、和B 細胞數目。如圖24所示，感染後6天，我們用IL-22阻斷性抗體或LTbR-Fc任一處理小鼠， 並對結腸中的淋巴樣濾泡計數，以確定IL-22是否可能在結腸淋巴樣結構的形成中具有作用。我們發現大於Imm的濾泡減少，提示IL-22和LT對於感染後濾泡尺寸增大可能是重要 的(圖24A)。組織學分析顯示阻斷性IL-22破壞濾泡的T和B細胞區帶，而LT阻斷具有相 似的效果(圖24B)。接著，我們確定IL-22阻斷是否導致結腸固有層中細胞數目的變化。 我們發現IL-22阻斷導致感染期間DC、T細胞、和B細胞數目減少。總之，IL-22表現出對 於淋巴樣濾泡形成是重要的，而且可能是結腸中淋巴毒素途徑的重要下遊成分。DocCode-SCOREIFff內容的SCORE佔位頁申請號PCT/US08/82890文件日期11/07/2008此表格在IFW記錄中的存在指明了在上文鑑定的日期以電子格式接收了下列文 件類型。此內容保存在SCORE資料庫中。·設計圖既然這是電子提交的，那麼就沒有物理人工文件夾，在PALM中沒有記錄人工文件 夾，而且不存在紙文件或物理媒體。IFW記錄中的TIFF圖像是自保存在SCORE中的原始文 件創建的。為了獲取SCORE資料庫中的文件，見SIRA制定的說明。在文件入口時(如上所述)·審查員可以經eDAN界面獲取SCORE內容。·其它 USPTO 僱員能登記(bookmark)當前 SCORE URL (http://es/ ScoreAccessffeb/)。內容。
外部用戶可以經公眾和私人PAIR(Public and Private PAIR)界面獲取SCORE 表格修正日期2006年2月8日
權利要求
一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL 22。
2.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體 感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，其中所述 AMP 選自下組IL-6、IL-18、IL-23、REGI α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、Reg 相關 序列(RS)和LT。
3.—種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的 方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP是IL-22。
4.一種調控受到微生物病原體感染的受試者的細胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的 方法，包括使所述細胞接觸分離的AMP，其中所述AMP選自下組IL-6、IL-18、IL-23、REG I α , REG I β、HIP/PAP、REG III、REGIV、Reg 相關序列(RS)和 LT。
5.權利要求1的方法，其中所述感染是微生物病症。
6.權利要求5的方法，其中所述微生物病症是炎性腸病(IBD)。
7.權利要求5的方法，其中所述微生物病症是克羅恩氏或潰瘍性結腸炎(UC)。
8.權利要求1的方法，其中所述微生物病原體是細菌。
9.權利要求8的方法，其中所述細菌是革蘭氏陰性的。
10.權利要求8的方法，其中所述細菌是革蘭氏陽性的。
11.權利要求8的方法，其中所述細菌是粘附或抹消(A/E)細菌。
12.權利要求11的方法，其中所述粘附或抹消(A/E)細菌是腸出血性大腸桿菌(EHEC) 和腸致病性大腸桿菌(EPEC)。
13.權利要求12的方法，其中所述腸致病性大腸桿菌(EHEC)是大腸桿菌0157:H7或大 腸桿菌055: H7。
14.權利要求2的方法，其中所述抗微生物多肽(AMP)是RegIIIβ和RegIII γ。
15.權利要求1的方法，其中所述微生物病原體是病毒。
16.一種通過調控受試者中的抗微生物免疫應答來治療所述受試者中的微生物病原體 感染的方法，包括對所述受試者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)調控劑，其中所述AMP調 控劑是IL-22激動劑。
17.權利要求16的方法，其中所述激動劑提高所述IL-22的表達和/或活性。
18.權利要求16的方法，其中所述激動劑是多肽或核酸分子。
19.權利要求16的方法，其中所述激動劑是融合多肽。
20.權利要求16的方法，其中所述激動劑是Fc融合多肽。
21.權利要求16的方法，其中所述激動劑是抗體或其生物學活性片段。
22.權利要求16的方法，其中所述激動劑是單克隆抗體。
23.權利要求16的方法，其中所述激動劑是人源化抗體。
24.權利要求1或3的方法，其中所述IL-22的胺基酸序列包含SEQID NO :8所示序列。
25.權利要求2或4的方法，其中所述AMP的胺基酸序列包含選自下組胺基酸序列的序 列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :26、SEQID NO :50、禾口 SEQ ID NO :52。
26.權利要求1或3的方法，其中編碼所述IL-22的核酸序列是SEQID NO 7所示序列。
27.權利要求1或3的方法，其中編碼所述AMP的核酸序列包含選自下組核酸序列的序 列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQID NO :49、禾口 SEQ ID NO :51。
28.—種試劑盒，其包括用於治療微生物病症的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含 抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL-22。
29.—種試劑盒，其包括一種或多種用於治療微生物病症的藥物組合物，其中所述藥 物組合物每一種包含不同的抗微生物多肽(AMP)或其調控劑，且其中所述AMP選自下組 IL-6、IL-18、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、Reg 相關序列(RS)、和 LT。
全文摘要
本發明涉及用於通過調控宿主免疫應答來治療微生物病症的組合物和方法。更具體地說，本發明涉及介導抗微生物免疫應答的組合物及使用此類組合物來治療微生物感染的方法。
文檔編號A61P31/00GK101951945SQ200880124173
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月7日 優先權日2007年11月7日
發明者亞歷山大·R·阿巴斯, 佐拉·莫德魯桑, 尼科·P·吉拉蒂, 帕特裡夏·A·瓦爾德茲, 弗雷德裡克·J·德索瓦格, 歐陽文軍, 迪米特裡·M·達尼蘭科, 鄭衍 申請人:健泰科生物技術公司