IFN－α同系物的製作方法

2023-06-08 18:37:21 2

專利名稱：IFN－α同系物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生產新的幹擾素-α同系物。
背景技術：
幹擾素-α是細胞因子基因多樣螺旋束超家族的成員(Sprang，S.R.等(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3815-827)。人幹擾素-α由含有20多個串聯複製的非等位基因的家族編碼，這些基因在胺基酸水平上有85-98％的序列同一性(Henco，K.等(1985)分子生物學雜誌.185227-260)。
已證實幹擾素-α可抑制多種類型的細胞增殖，尤其可用於治療多種細胞增生性疾病，這些疾病常常與癌症，特別是血癌，如白血病相關。這些蛋白質顯示出對以下疾病的抗增殖活性多發性骨髓瘤，慢性淋巴細胞白血病，低級淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性髓性白血病，腎細胞癌，膀胱腫瘤和卵巢癌(Bonnem，E.M.等(1984)J.Biol.Response Modifiers3580；Oldham，R.K(1985)Hospital Practice 2071)。
幹擾素-α也可用於抗多種類型的病毒感染(Finter，N.B等(1991)藥物42(5)749)。幹擾素-α還顯示出抗人乳頭瘤病毒感染，B肝病毒和C肝病毒感染的活性(Finter，N.B.等，1991，文獻同上；Kashima，H等(1988)喉鏡98334；Dusheiko，G.M.等(1986)血液學雜誌3(增刊2)S199；Davis，GL等(1989)新英格蘭醫學雜誌.3211501)。另外，還研究了幹擾素和幹擾素受體在某些自身免疫和炎性疾病的發病機理的作用(Benoit，P等(1993)免疫學雜誌.150(3)707)。
儘管這些蛋白質對多種疾病都有治療價值，但尚未使它們最優化以用作藥物。例如，限制劑量的毒性，受體交叉反應性和短的血清半壽期顯著削弱了多種此類細胞因子的臨床應用(Dusheiko，G.(1997)肝臟病學26112S-121S；Vial，T和Descotes，J.(1994)Drug Experience 10115150；Funke，I.等(1994)Ann.Hematol.6849-52；Schomburg，A.等(1993)J.Cancer Res.Clin.Oncol.119745-755)。與施用幹擾素相伴的多種多樣的嚴重副作用表現包括流感樣症狀，疲勞，神經學疾病，包括幻覺，發燒，肝酶升高和白細胞減少(Pontzer，C.H.等(1991)癌症研究，515304；Oldham，1985，文獻同上)。
幹擾素-α中大量天然序列多樣性的存在(因此重組體具有大的序列空間)，連同幹擾素-α/受體相互作用的複雜性，及其多種治療和預防活性為構建高級幹擾素同系物創造了機會。
發明簡述本發明提供了新的幹擾素-α(IFN-α)同系物多肽，編碼所述多肽的核酸，及其互補核苷酸序列，所述多肽和核酸的片斷，抗多肽的抗體，及其用途，含有幹擾素-α同系物序列特徵鏈的多套數據和使用所述特徵鏈的自動化系統。
一方面，本發明包括分離或重組的幹擾素-α核酸同系物。包括選自SEQID NO1至SEQ ID NO35，或至SEQ ID NO72至SEQ ID NO78的多核苷酸序列及其互補的多核苷酸序列。編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO81或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽的多核苷酸序列及其互補的多核苷酸序列也是本發明的特徵。類似地，在高度嚴緊的條件下與基本上全長的上述任一多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也是本發明的特徵。另外，含有上述任一多核苷酸序列的核苷酸片斷的多核苷酸序列也是本發明的特徵，其中所述核苷酸片斷編碼一種多肽，該多肽在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中具有抗增殖活性。類似地，含有本發明的上述和下述任一多核苷酸序列的核苷酸片斷的多核苷酸序列也是本發明的特徵，其中所述核苷酸片斷編碼一種多肽，該多肽在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
本發明還包括分離或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽含有以下胺基酸序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。根據本領域技術人員的一般常識，該胺基酸序列中的每一個單字母表示特定的胺基酸殘基。
本發明還涉及具有上述任一序列的多肽，所述序列如SEQ ID NO36至SEQ ID NO54。
在其它實施方案中，編碼的多肽含有選自SEQ ID NO36至SEQ IDNO54的胺基酸序列；核酸含有選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO19的多核苷酸序列。
本發明還提供了SEQ ID NO36-70和SEQ ID NO72-79中任一個的多肽片斷。在本發明的一個方面，所述多肽片斷在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中表現出抗增殖活性，或在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中表現出抗病毒活性，或者同時表現出這兩種活性。以下將詳細描述基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗和在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中的抗病毒活性。另一方面，本發明提供了含有上述和下述的本發明任一核酸的核苷酸片斷的多核苷酸序列，其中所述核苷酸片斷編碼多肽片斷，正如下文所詳細描述的那樣，所述多肽片斷在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中表現出抗增殖活性，或在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中表現出抗病毒活性，或者同時表現出這兩種活性。
本發明還包括分離的或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，其中多肽含有含SEQ ID NO36-70中任一個的至少20個連續胺基酸的胺基酸序列。在其它實施方案中，本發明的多肽含有包括以下一個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中胺基酸殘基的編號對應於SEQ ID NO36胺基酸序列中的殘基編號。在多個實施方案中，本發明的被編碼多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少30，至少50，至少70，至少75，至少100，至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少155，至少160，或至少165個連續的胺基酸殘基。在其它實施方案中，所編碼的多肽長度為至少150，至少155，至少160，至少163，或至少165個胺基酸。在另一個實施方案中，所編碼的多肽長度約為166個胺基酸。在其它實施方案中，所編碼的多肽含有選自SEQ ID NO36，SEQ ID N037，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ IDNO45和SEQ ID NO46的胺基酸序列。
在其它實施方案中，本發明提供了含有選自下列的多核苷酸序列的核酸SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ IDNO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
在其它實施方案中，由本文所述發明中的任何核酸所編碼的多肽或其片斷在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。在其它實施方案中，所編碼的多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/毫克(1個單位是誘導50％抗增殖活性所需的以毫克(mg)計的蛋白質量)的抗增殖活性，或者在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/毫克(1個單位是誘導50％抗病毒活性所需的以mg計的蛋白質量)的抗病毒活性。在其它實施方案中，所編碼的多肽能結合I型幹擾素受體，優選結合人I型幹擾素受體，更優選結合人(例如I型)幹擾素-α受體。
本發明還包括含有本文所述發明中的任何核酸，或者表達本文所述發明中的任何多肽的細胞。在一個實施方案中，所述細胞表達由本文所述發明中的核酸所編碼的多肽。
本發明還包括含有上述和下述發明中的任何核酸的載體。所述載體包括質粒，粘粒，噬菌體，或病毒；載體可以是例如表達載體，克隆載體，包裝載體，整合載體等。本發明還包括被本發明的載體轉導的細胞。本發明還包括組合物，其含有上述和下述發明中的任何核酸和賦形劑(優選為藥物可接受的賦形劑)。本發明還包括通過例如轉導載體而產生的，包括上述和下述發明中的任何多肽或核酸的細胞和轉基因動物。
本發明還包括通過用限制性內切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化上述或下述發明中的一種或多種核酸而產生的組合物；以及通過在脫氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶，如熱穩定性的聚合酶的存在下，保溫上述或下述發明中的一種或多種核酸而產生的組合物。
本發明還包括含有上述或下述兩種或多種核酸的組合物。所述組合物可包括核酸文庫，其中所述文庫含有至少約5，10，20或50種核酸。
另一方面，本發明包括分離的或重組的多肽，所述多肽由上述或下述的任何核酸所編碼。在一個實施方案中，所述多肽可含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70，或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的序列。
本發明還包括多肽，其含有由多核苷酸序列所編碼的蛋白質的至少50個連續的胺基酸，其中多核苷酸序列選自(a)SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78；(b)編碼選自SEQ ID NO36至SEQ IDNO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽的多核苷酸序列；和(c)在高度嚴緊條件下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)雜交的多核苷酸序列的互補序列。在多個實施方案中，多肽含有所編碼蛋白質的至少約70，100，120，130，140，150，155，160，165或166個連續的胺基酸。
本發明還包括分離的或重組的多肽，其含有胺基酸序列，該胺基酸序列含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少50個連續胺基酸殘基，和以下一個或多個胺基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於SEQ ID NO36中的編號。在多個實施方案中，多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少約50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166個連續的胺基酸。在更優選的實施方案中，多肽含有SEQ ID NO36，SEQ ID N037，SEQ ID NO39，SEQ IDNO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO45或SEQ ID NO46中任一個的至少約50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166個連續的胺基酸殘基。在其它實施方案中，本發明多肽的長度至少約為50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166個胺基酸殘基，或優選其長度為166個胺基酸。也可以使用較長的多肽，例如含有純化標記等的多肽。所述多肽可在基於人Daudi細胞系的試驗中顯示出抗增殖活性，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中顯示出抗病毒活性。
本發明還包括與抗至少一種抗原的多克隆抗血清特異性結合的多肽，所述至少一種抗原含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85所示胺基酸序列或其片斷的多肽序列。特別地，本發明提供了與抗至少一種抗原的多克隆抗血清結合的多肽，其中所述的至少一種抗原含有SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85所示的至少一種胺基酸序列，或上述任一胺基酸序列的片斷，其中已用一種或多種已知的幹擾素-α多肽或蛋白質減除(subtract)多克隆抗血清，所述多肽或蛋白質包括例如由具有或對應於下列一個或多個GenBankTM登記號的核酸和GenBank中所述的其它類似或同源的幹擾素-α核酸序列所編碼的多肽或蛋白質，所述GenBankTM登記號為J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
上述或下述任何多肽任選在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。上述或下述任何多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或者在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。在其它實施方案中，上述或下述任何多肽能結合I型幹擾素受體，優選結合人I型幹擾素受體，更優選結合人幹擾素-α受體。
在其它實施方案中，上述或下述任何多肽可進一步包括分泌/定位序列，如信號序列，細胞器靶向序列，膜定位序列等。本文所述的任何多肽可進一步包括有利於純化的序列，例如表位標記(如FLAG表位)，多聚組氨酸標記，GST融合物等。任選地，多肽的N末端可包含甲硫氨酸。本文所述發明中的任何多肽任選包括一個或多個經修飾的胺基酸，如糖基化胺基酸，PEG化胺基酸，法尼基化胺基酸，乙醯基化胺基酸，生物素化胺基酸，羧基化胺基酸，磷酸化胺基酸，醯化胺基酸等。
本發明還包括組合物，其含有本文所述的任何多肽以及賦形劑，優選為藥物可接受的賦形劑。
本發明還包括通過給哺乳動物施用一種或多種本文所述發明的多肽而產生的抗體或抗血清，其中所述抗體或抗血清不與已知的α-幹擾素多肽或蛋白質特異性結合，所述多肽或蛋白質包括例如由具有或對應於下列一個或多個GenBankTM登記號的核酸和GenBank中所述的其它類似或同源的幹擾素-α序列所編碼的任何多肽或蛋白質，所述GenBankTM登記號為J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
本發明還包括抗體，它能與含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85之序列的多肽特異性結合。所述抗體是例如多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體，Fab片斷，通過Fab表達文庫產生的片斷等。
本發明還包括生產本發明多肽的方法。一種方法包括將本文所述的任何核酸導入細胞群體，所述核酸與能有效生產編碼多肽的調節序列可操作相連，在培養基中培養細胞以生產多肽，並任選從細胞或培養基中分離多肽。核酸可以是載體的一部分，例如重組表達載體。
本發明還包括抑制腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括將腫瘤細胞與本文所述發明的多肽接觸，從而抑制腫瘤細胞的生長。在一個實施方案中，本發明包括抑制腫瘤細胞群體生長的方法，所述方法包括將腫瘤細胞群體與足以抑制所述腫瘤細胞群體中的腫瘤細胞生長的有效量的本發明多肽接觸，從而抑制所述細胞群體中的腫瘤細胞生長。在多個實施方案中，腫瘤細胞可以是人癌細胞，人白血病細胞，人T-淋巴瘤細胞，人黑素瘤細胞，本文所述的其它人癌細胞等。腫瘤細胞可以是體內的，來自體內的或體外的(例如經培養的細胞)。
本發明還包括抑制被病毒感染的一個或多個細胞內的病毒複製的方法，所述方法包括將一個或多個被感染的細胞與有效量的上述和下述發明中的多肽接觸，從而抑制所述一個或多個細胞中的病毒複製，其中所述的量足以抑制所述一個或多個感染細胞內的病毒複製。在多個實施方案中，病毒可以是RNA病毒，例如人類免疫缺損病毒或C肝病毒，也可以是DNA病毒，例如B肝病毒。被感染的細胞可以是體內的，來自體內的或體外的(例如經培養的細胞)。
本發明還包括為有治療需求的受試者治療自身免疫病的方法，所述方法包括給受試者施用足以治療自身免疫病的，有效量的本文所述發明的多肽。在多個實施方案中，自身免疫病可以是多發性硬化，類風溼性關節炎，紅斑狼瘡，I型糖尿病等。本發明還包括對通過給受試者施用幹擾素-α即可治療的疾病的治療方法的改進，所述改進包括給受試者施用足以治療所述疾病的，有效量的本文所述發明的多肽。通過給受試者施用幹擾素-α即可治療的疾病可以是多發性硬化，類風溼性關節炎，紅斑狼瘡，I型糖尿病，AIDS或AIDS-相關症候群等。
一般說來，本發明還包括通過突變本文的序列而得到的核酸和蛋白質。類似地，本發明還包括通過多樣性生成或重複序列重組(RSR)法(例如DNA改組)而產生的那些核酸和蛋白質。本發明還包括使用本文所述核酸進行的突變和重組方法。例如，本發明的一種方法包括將上述和下述發明中的一種或多種核酸序列與一種或多種其它核酸(包括但不限於本文所述的那些)反覆重組，一種或多種其它核酸中的每個序列編碼幹擾素-α同系物或其胺基酸亞序列。重組步驟任選在體內，來自體內，in silico或體外進行。所述重複重組可產生至少一個重組幹擾素-α同系物核酸文庫。本發明還包括通過此方法產生的重組幹擾素-α同系物核酸，含有所述重組幹擾素-α同系物核酸的細胞，通過此重複重組方法產生的核酸文庫，含有兩種或多種所述重組幹擾素-α核酸的組合物，和含有所述重組幹擾素-α核酸或含有所述文庫的細胞群體。在一個實施方案中，所述文庫含有至少10種所述重組核酸。
本發明還提供了生產經修飾的或重組的幹擾素-α同系物核酸的方法，該方法包括突變本文所述發明的核酸。
本發明還提供了編碼幹擾素-α同系物的核酸，分別相對於人幹擾素-α2a或其它已知的幹擾素-α對細胞群體的生長抑制活性，細胞靜止(cytostatic)活性或細胞毒活性而言，所述同系物對細胞群體(例如癌細胞)具有增加的生長抑制活性，細胞靜止(cytostatic)活性或細胞毒活性。
結合附圖與以下的詳細描述部分，可以更清楚地了解本發明的這些和其它目的和特徵。
附圖簡述

圖1A-1E顯示了本發明例舉的成熟幹擾素同系物多肽序列(SEQ IDNO36-70和79-85)的序列對比排列。
圖2顯示的是分別相對於兩種對照化合物，即人幹擾素α-2a(「IFN-α-2a」或「2a」)和共有人幹擾素(「IFN-Conl」或「Con1」)各自的抗增殖活性和抗病毒活性而言，本發明例舉的幹擾素同系物在基於人Daudi細胞系的試驗中的抗增殖活性，和在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中的抗病毒活性。
圖3A，3B和3C闡明了IFN-α同系物3DA11(SEQ ID NO40)和對照幹擾素，人幹擾素α-2a(「2a」)和共有人幹擾素α(「Con1」)對一系列腫瘤細胞系的活性分布圖。圖3A顯示了IFN-α同系物3DA11和每種對照IFN對各個細胞系的細胞總生長抑制活性，所述活性以GI50值來反映，GI50是使特定細胞系的生長50％受抑制所需的幹擾素α同系物或對照IFNα的濃度(μg/ml)，該值是通過在保溫期結束時，幹擾素α同系物或對照IFNα實驗組中淨蛋白質/多肽的增加度減少50％來測定的。
圖3B顯示了IFN-α同系物3DA11和每種對照IFN對一系列細胞系中的各個細胞系的靜止活性。靜止活性指的是能抑制細胞生長和繁殖的活性。靜止活性被評定為將特定細胞系的細胞的生長和/或繁殖完全抑制，以使保溫期結束時細胞蛋白質的量等於保溫期開始時細胞蛋白質的量(「總生長抑制」或「TGI」)所需的幹擾素α同系物或對照IFNα濃度(μg/ml)的反映。
圖3C闡明了IFN-α同系物3DA11和每種對照IFN對各個細胞系的細胞毒活性。藥劑(如IFN同系物或IFN化合物)的細胞毒性是該藥劑對某些細胞具有的特定破壞作用的程度，或指具有所述破壞作用。該術語一般指的是能導致細胞死亡的藥劑，並特別地用於指免疫現象導致的細胞裂解，和選擇性殺死分裂細胞的化合物藥劑。在圖3C中，以LC50來闡明細胞毒性，觀察與保溫期開始時的細胞淨蛋白質量相比，在保溫結束時，使對照細胞(對照IFNα)中的淨蛋白質增加度降低50％所需的IFN-α同系物3DA11的濃度(μg/ml)，表示在加入特定幹擾素之後的細胞淨損失。細胞毒性可被評定為相對於對照細胞而言，破壞或殺死特定細胞系總細胞數(即總群體)的50％所需的IFN-α同系物3DA11的濃度。
圖4A，4B，4C和4D分別顯示的是相對於兩種對照幹擾素α，即人幹擾素-α2a(「2a」)和共有人幹擾素-α(「Con1」)對白血病細胞系(RPMI-8226)(圖4A)，肺癌細胞系(NCI-H23)(圖4B)，腎癌細胞系(ACHN)(圖4C)和卵巢癌細胞系(OVCAR-3)(圖4D)的細胞靜止活性而言，選定的本發明幹擾素-α同系物的相應細胞靜止活性。細胞靜止活性由特定幹擾素α的TGI值(使細胞系的細胞生長全面受抑制所需的幹擾素α濃度，其中保溫期結束時的細胞蛋白質的量等於保溫期開始時的細胞蛋白質的量)來反映。
圖5表示在分別施用了劑量為2μg，10μg和50μg的兩種例舉的本發明幹擾素-α同系物(被稱為「IFN-CH2.2」和「IFN-CH2.3」)，劑量為2μg，10μg和50μg的鼠IFN-α-4和劑量為2μg，10μg和50μg的人IFN-α-2a之後，存活的小鼠數目(小鼠總數為6)的比較。圖5所示的結果表明在鼠模型系統中，這兩種例舉的IFN-α同系物的改良體外抗病毒活性可以在體內維持和延續。磷酸-緩衝鹽水(PBS)被用作對照。
發明詳述定義除非本說明書其餘部分的上下文中另有定義，本文所用的所有技術和科學術語都與本發明所屬領域的普通技術人員一般理解的含義相同。
根據上下文，「多核苷酸序列」是核酸(核苷酸(A，C，T，U，G等，或者是天然或人工核苷酸類似物)的聚合物)或表述核酸的特徵鏈。由任何特定的多核苷酸序列可確定給定的核酸或互補核酸。
類似地，根據上下文，「胺基酸序列」是胺基酸的聚合物(蛋白質，多肽等)，或表述胺基酸聚合物的特徵鏈。由任何特定的多核苷酸序列可確定給定的核酸或互補核酸。
當核酸，蛋白質，肽，多肽或其它組分與天然狀態下與其相關聯的組分(其它肽，多肽，蛋白質(包括複合物，例如與天然序列相伴隨的聚合酶和核糖體)，核酸，細胞，合成試劑，細胞雜質，細胞組分等)，例如在其來源細胞中正常與其相關聯的其它組分部分或完全分開時，即可認為它們是「分離的」。當核酸，多肽或其它組分與其天然環境中的其它組分部分或完全分開或從中被部分或完全回收，使得它們在組合物，混合物或組分收集物中作為佔絕對優勢的種類存在(即在摩爾基礎上，它們比組合物中的任何其它各個種類的含量更高)時，也可以說它們是分離的。在優選實施方案中，製品由多於70％，一般多於80％，或優選多於90％的該被分離種類組成。
一方面，「基本上純的」或「分離的」核酸(例如RNA或DNA)，多肽，蛋白質或組分也指目的種類(例如核酸或多肽)至少約佔所存在的所有大分子種類之重量(在摩爾基礎上)的50，60或70％。基本上純的或分離的組分也可以至少約佔組合物中所存在的所有大分子種類之重量的80，90或95％。分離的目的種類也可以被純化成實質上為均質(通過常規的檢測方法檢測不到組分中的雜質種類)，其中組分實質上由單一大分子種類的衍生物組成。
術語「分離的核酸」可以指與在產生本發明核酸的生物體的天然基因組中與其緊鄰的兩個編碼序列(即一個在5』末端，一個在3』末端)不緊鄰的核酸(如DNA或RNA)。因此，該術語包括例如通過聚合酶鏈反應(PCR)或限制性內切核酸酶處理而產生的cDNA或基因組DNA片斷，而不論該cDNA或基因組DNA片斷是摻入載體，整合至與其來源生物體相同或不同物種(包括例如病毒)的基因組中，還是與其它編碼序列連接形成編碼嵌合多肽的雜合基因，或者是不依賴於任何其它DNA序列。DNA可以是雙鏈或單鏈，有義或反義。
當核酸或多肽為人工的或經基因工程方法改造的，或者衍生自人工的或經改造的蛋白質或核酸時，可以說它們是「重組的」。當用於談及例如細胞，核苷酸，載體或多肽時，術語「重組」一般表示已通過導入異源(或外源)核酸或改變天然核酸來修飾所述細胞，核苷酸或載體，或者表示已通過導入異源胺基酸來修飾多肽，或者表示細胞源自經如此修飾的細胞。重組細胞表達在細胞的天然(非-重組)形式中未曾發現過的核酸序列(例如基因)，或者表達可能會被異常表達，少量表達或根本不表達的天然核酸序列(例如基因)。術語「重組核酸」(例如DNA或RNA)分子指的是例如非天然的核苷酸序列，或通過至少兩個一般不同時出現，彼此不相關，或者要不然彼此是分開的序列區段的參與(例如人工組合)而製備的核苷酸序列。重組核酸可含有通過將不同來源的和/或人工合成的核酸區段連接在一起或組合起來而形成的核酸分子。術語「重組產生」指的是通常通過以下方法即可實現的人工組合，所述方法包括化學合成方法，核酸區段的重複序列重組或其它核苷酸多樣性的生成方法(例如改組)，或通過例如本領域技術人員已知的基因工程技術對分離的核酸區段進行操作。「重組表達」一般指在體外產生重組核酸，將重組核酸轉移至體內，體外或來自體內的細胞，並在其中表達或增殖重組核酸的技術。「重組多肽」或「重組蛋白質」通常分別指由克隆或重組的基因或核酸產生的多肽或蛋白質。
「亞序列」或「片斷」是完整序列的任何部分，長達和包括完整的序列。
當任何給定聚合物組分(胺基酸殘基，摻入的核苷酸等)的位置通過參照選定胺基酸或核苷酸中的相同殘基位置，而不是給定聚合物中的組分的實際位置來指定時，給定胺基酸或核苷酸聚合物的編號「對應於」選定胺基酸聚合物或核酸的「編號」。
載體是便於將選定核酸轉導至細胞，或在細胞中表達核酸的成分。載體包括例如質粒，粘粒，病毒，YAC，細菌，多聚-賴氨酸等。「表達載體」是重組或合成產生的核酸構建體，它具有一系列允許在宿主細胞中轉錄特定核酸的特定核酸元件。表達載體可以是質粒的一部分，病毒或核酸片斷。表達載體一般包括與啟動子可操作相連的待轉錄核酸。
「基本上全長的多核苷酸或胺基酸序列」指至少約為全長的50％，至少約為60％，一般至少約為70％，一般至少約為80％，或一般至少約為90％，95％，96％，97％，98％或99％或更長的胺基酸序列或核酸序列。
「人α-幹擾素受體」是在人細胞中被α幹擾素天然激活的受體。
某一物質是「天然的」指的是可以在自然界中發現該物質這一事實。例如，存在於生物體包括病毒中，可從其天然來源中分離得到，並且未在實驗室中被人為地有意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然的。在一個方面，「天然」核酸(例如DNA或RNA)分子是以與天然存在的狀態相同的狀態存在的核酸分子；即核酸分子不是分離的，重組的或克隆的。
本文所用的「抗體」指的是蛋白質，其含有一種或多種基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片斷編碼的多肽。公知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恆定區基因，以及各種免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分為κ或λ。重鏈被分為γ，μ，α，δ或ε，它們反過來也將免疫球蛋白的類型分別限定為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(如抗體)結構單位含有四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條「輕鏈」(約25kD)和一條「重鏈」(約50-70kD)。每條鏈的N-末端限定約100至110或更多個胺基酸的可變區，所述可變區主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指的是這些輕鏈和重鏈。抗體的存在形式可以是完整的免疫球蛋白，或是由多種肽酶消化產生的多個已被詳細鑑定的片段。因此，例如，胃蛋白酶在絞鏈區中的二硫鍵處消化抗體，產生Fab的二聚體F(ab)』2，Fab自身是通過二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。可在溫和的條件下還原F(ab)』2，打斷絞鏈區中的二硫鍵，從而將F(ab)』2二聚體轉變為Fab』單體。Fab』單體實質上是具有部分絞鏈區的Fab(關於其它抗體片段的詳細描述可參見「基礎免疫學」，W.E.Paul編，Raven出版社，紐約(1993))。儘管通過消化完整抗體可得到多個抗體片段，但本領域技術人員仍希望可通過化學方法或利用重組DNA方法學來從頭合成這些Fab』片段。因此，本文所用術語抗體也包括通過修飾完整抗體而產生的抗體片段，或使用重組DNA方法學從頭合成的抗體片段。抗體包括單鏈抗體，所述單鏈抗體包括單鏈Fv(sFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈(直接或通過肽接頭)連接在一起，形成延伸的多肽。
抗體的「抗原-結合片段」是抗體中與抗原結合的肽或多肽片段。抗體中有益於，參與，或影響與抗原的結合的那些胺基酸形成了抗原-結合位點。參見Scott，T.A和Mercer，E.I.，簡明百科全書生物化學和分子生物學(deGruyter，第3版，1997)[下文簡稱為″Scott，簡明百科全書″]和Watson，J.D等，重組DNA(第2版，1992)[下文簡稱為″Watson，重組DNA″]，每篇文獻都全文列入本文作為參考。
「免疫原」指的是能引起免疫應答的物質。免疫原的例子包括例如抗原，在誘導自身免疫病時起作用的自身抗原，和癌細胞上表達的腫瘤-相關抗原。
「抗原」是這樣一種物質，它能在宿主中引發抗體形成，或者能產生與所述物質反應的特異性淋巴細胞群體。抗原一般是對宿主而言為外源的大分子(例如蛋白質和多糖)。
術語「免疫測定法」包括使用抗體或免疫原結合或特異性結合抗原的檢測法。免疫測定法的典型特徵在於利用特定抗體的特異性結合特性來分離，靶向，和/或定量抗原。
術語「同源性」一般指兩種或多種結構之間的相似性程度。術語「同源序列」指大分子中具有相似的單體順序的區域。當用於核酸序列時，術語「同源性」指的是兩種或多種核酸序列(如基因)或其片段之間的相似性程度。一般說來，兩種或多種核酸序列之間的相似性程度指的是兩種或多種核酸序列中的兩個或多個核苷酸鹼基(或其它基因型特徵)的組成，順序或排列的相似性程度。術語「同源核酸」一般指含有在核苷酸鹼基組成，排列或順序上具有一定程度相似性的核苷酸序列的核酸。兩種或多種核酸可以是相同或不同的種類或組。術語「同源性百分比」當用於核酸序列時，一般指的是兩種或多種核酸的核苷酸序列之間相似性的百分比程度。
當用於多肽(或蛋白質)序列時，術語「同源性」指的是兩種或多種多肽(或蛋白質)序列(如基因)或其片段之間的相似性程度。一般說來，兩種或多種多肽(或蛋白質)序列之間的相似性程度指的是兩種或多種多肽(或蛋白質)中的兩個或多個胺基酸的組成，順序或排列的相似性程度。兩種或多種多肽(或蛋白質)可以是相同或不同的種類或組。術語「同源性百分比」當用於多肽(或蛋白質)序列時，一般指的是兩種或多種多肽(或蛋白質)序列的胺基酸序列之間相似性的百分比程度。術語「同源多肽」或「同源蛋白質」一般分別指具有相似的胺基酸序列和功能的多肽或蛋白質。這種同源多肽或蛋白質的相關性體現在具有相似的胺基酸序列和功能，但使用本文所述的技術，可以從不同或相同的物種中衍生或獲得它們。
本文所用術語「受試者」包括但不限於生物；哺乳動物，包括例如人，非人靈長類動物(如猴)，小鼠，豬，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，猴，綿羊或其它非人哺乳動物；非-哺乳動物，包括例如非-哺乳類脊椎動物，如鳥類(如雞或鴨)或魚；和非-哺乳類無脊椎動物。
術語「藥物組合物」指的是適於給包括動物或人的受試者用作藥物的組合物。藥物組合物一般包含有效量的活性劑和藥物可接受的載體。
術語「有效量」指的是足以產生所需效果的劑量或量。所需效果包括在所述劑量或量的受體中產生的客觀或主觀的改善。
「預防性治療」是給未顯示出疾病跡象或症狀，或僅顯示出疾病的早期跡象或症狀的受試者施用治療，使得所施用的治療能減弱，防止或減少產生疾病的風險。預防性治療的作用是預防性地治療疾病。「預防活性」指諸如核酸，載體，基因，多肽，蛋白質，物質，其組合物的藥劑施用於未顯示出疾病跡象或症狀，或僅顯示出疾病的早期跡象或症狀的受試者後，能減弱，防止或減少受試者產生疾病的風險的活性。「可用於預防的」藥劑或化合物(如核酸或多肽)指的是可用於減弱，防止，治療或減少疾病的產生的藥劑或化合物。
「治療性治療」是給顯示出疾病的症狀或跡象的受試者施用的治療，其中給受試者施用治療的目的是減弱或消除疾病的跡象或症狀。「治療活性」指諸如核酸，載體，基因，多肽，蛋白質，物質，或其組合物的藥劑施用於顯示出疾病的跡象或症狀的受試者後，能消除或減弱這些跡象或症狀的活性。「可用於治療的」藥劑或化合物(如核酸或多肽)指的是可用於減弱，治療或消除疾病的跡象或症狀的藥劑或化合物。
術語「基因」廣義地指任何與生物學功能相關的DNA區段。基因包括編碼序列和/或其表達所需的調控序列。基因也包括非-表達的DNA核酸區段，例如形成其它蛋白質的識別序列的區段。
一般說來，下文所用的術語和下文所述的細胞培養，分子遺傳學，分子生物學，核酸化學和蛋白質化學的實驗室方法都是本領域技術人員眾所周知的和常用的那些術語和方法。如Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第2版)，Vol.1-3，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989(下文簡稱為″Sambrook″)和最新分子生物學方法，F.M.Ausubel等編，最新方法，Greene PublishingAssociates，Inc和John Wiley Sons，合資公司(1999年增補)(下文簡稱為″Ausubel″)中所述的標準技術可用於重組核酸方法，核酸合成，細胞培養方法和轉基因摻入，如電穿孔，注射和脂質轉染法。一般情況下，根據說明書進行寡核苷酸合成和純化步驟。一般根據本領域的常規方法和本文中提供的多篇普通參考文獻進行技術和方法的操作。其中的方法據信是本領域技術人員眾所周知的，為了方便讀者，提供了這些方法。
本文定義或表徵了多個其它的術語。本發明的多核苷酸幹擾素-α同系物序列本發明提供了分離或重組的幹擾素-α同系物多肽，和編碼該多肽的分離或重組的多核苷酸。
如下文所詳細描述的那樣，根據本發明，編碼新的幹擾素-α同系物多肽的多核苷酸序列，編碼幹擾素-α同系物多肽片段的核苷酸序列(如亞序列)和編碼相關融合多肽或蛋白質或其功能等同物的核苷酸序列，在本文中被統稱為「幹擾素-α同系物」，「幹擾素同系物核酸」，「IFN-α同系物」，「IFN同系物」，「IFN核酸」，「幹擾素同系物」，「幹擾素核酸」，「重組幹擾素-α」，「重組幹擾素-α核酸」，「本發明的核酸」，「本發明的多核苷酸」或「本發明的核苷酸」。本發明的多核苷酸，核苷酸和核酸中也包括和包含上述各個術語的多核苷酸，核苷酸和核酸片段。術語「核酸」和術語「核苷酸」可以互換使用。
在經改組的幹擾素-α相關序列的文庫中發現了編碼本發明多肽的多核苷酸。篩選文庫成員對人腫瘤細胞系的抗增殖活性，並在某些情況下分析它們對感染了病毒的人細胞的抗病毒活性。在篩選出的針對感染了病毒的小鼠細胞具有抗病毒活性的經改組文庫中，發現了本文提供的序列子集。按實施例中所述鑑定幹擾素同系物的編碼序列。
簡單地說，將經改組的成熟幹擾素-α編碼序列的文庫導入大腸桿菌。按實施例1所述，在針對人Daudi腫瘤細胞系的高-物料流通量的抗增殖活性試驗中篩選菌落，選擇表達活性多肽的菌落，再-篩選，測定表達水平。分離選定菌落的DNA，對其進行再-改組以產生第二代文庫，將第二代文庫導入大腸桿菌，在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中篩選抗增殖活性。將選自第一和第二代文庫篩選的菌落的DNA轉導至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，產生穩定的細胞系。按實施例1所述，純化，定量CHO表達的蛋白質，並使用人Daudi細胞系分析其抗增殖活性，任選使用被腦心肌炎病毒(EMCV)感染的人WISH細胞分析其抗病毒活性。編碼幹擾素-α同系物多肽的經改組核酸的例子在本文中被鑑定為SEQ ID NO1至SEQ ID NO35，所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，所述核酸分別編碼在本文中被鑑定為SEQ ID NO36至SEQ ID NO70的成熟幹擾素-α同系物多肽。另外，在針對被EMCV感染的小鼠細胞的高物料流通量的抗病毒活性篩選試驗中篩選經改組的成熟幹擾素-α編碼序列文庫。編碼在基於鼠細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性的多肽的經改組核酸的例子在本文中被鑑定為SEQ IDNO72至SEQ ID NO78，所述核酸編碼在本文中被鑑定為SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的成熟幹擾素同系物多肽。
另一方面，本發明提供了分離或重組的核酸，其含有選自下列的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO1至SEQ ID NO35，或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO71的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(c)在至少嚴緊或至少高度嚴緊的雜交條件(或超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊雜交條件)下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)，或與多核苷酸序列(a)或(b)的50，120，130，140，145，150，155，160或165個核苷酸鹼基的亞序列或片段雜交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段編碼完整或部分多肽，所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，或在本領域已知的用於測定抗病毒活性的試驗中具有抗病毒活性。
另一方面，本發明提供了分離或重組的核酸，其含有選自下列的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO72至SEQ ID NO78，或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(c)在至少嚴緊或至少高度嚴緊的雜交條件(或超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊雜交條件)下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)，或與多核苷酸序列(a)或(b)的50，120，130，140，145，150，155，160或165個核苷酸鹼基的亞序列或片段雜交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段編碼完整或部分多肽，所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，或在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
本發明也包括成熟的幹擾素-α同系物多肽，其含有在本文中被鑑定為SEQ ID NO71的胺基酸，本發明還包括編碼所述多肽或所述多肽的片段的多核苷酸序列，所述多肽片段在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，和/或在基於鼠細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
本發明還包括分離或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，其中多肽含有以下胺基酸序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。根據本領域技術人員的一般常識，該胺基酸序列中的每一個單字母表示特定的胺基酸殘基。所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性(例如至少約為8.3×106個單位/mg)，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性(至少約為2.1×107個單位/mg)。
如下文所詳述，本發明的多核苷酸可用於多個方面，包括但不限於在體內和來自體內地治療多個受試者的多種疾病的方法中用作治療劑和預防劑；用於體外方法，如診斷方法以檢測，診斷和治療多個受試者的多種疾病；用於例如基因治療；在例如治療性和預防性地治療疾病的方法中用作治療劑和預防劑；用作免疫原；用於診斷和篩選試驗；用作診斷探針以探測互補或部分互補的核酸的存在(包括檢測編碼IFN-α的核酸)。製備本發明的多核苷酸可根據已知的合成方法，通過標準的固相方法製備本發明的多核苷酸和寡核苷酸。一般說來，單獨合成長約20，30，40，50，60，70，80，90和/或100個核苷酸鹼基的片段，然後(通過例如酶促或化學連接法，或聚合酶介導的重組方法)將它們連接起來，以形成實質上任何所需的連續序列。另一方面，單獨合成大於100個核苷酸鹼基(如150，180，200，210，240，270，300，330，360，390，400，420，450，465，474，470，475，489，490，495，496個鹼基)的核苷酸片段，然後(通過例如酶促或化學連接法，或聚合酶介導的重組方法)將它們連接起來，以形成實質上任何所需的連續序列。例如，可使用Beaucage等，(1981)四面體通訊221859-69所述的經典亞磷醯胺法，或Matthes等，(1984)EMBO J，3801-05所述的方法(例如，這些方法一般在自動合成方法中實施)，通過化學合成製備本發明的多核苷酸和寡核苷酸，包括其片段(和本文所述的那些片段)。根據亞磷醯胺法，在例如自動化的DNA合成儀中合成寡核苷酸，然後進行純化，退火，連接，並克隆至適當的載體。
另外，實質上任何核酸都可從多個商家中的任何一家訂購得到，例如TheMidland Certified Reagent Company([email protected])，The Great AmericanGene Company(http//www.genco.com)，ExpressGen Inc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和很多其它的公司。類似地，肽和抗體也可從多個商家中的任何一家訂購得到，例如PeptidoGenic([email protected])，HTI Bio-products，Inc.(http//www.htibio.com)，BMA Biomedicals Ltd.(U.K.)，Bio.Synthesis，Inc.和很多其它的公司。
也可通過使用寡核苷酸探針篩選cDNA文庫(例如通過象在典型的多樣性生成法，如改組法中那樣重組同源核酸而產生的文庫)，得到本發明的特定多核苷酸，其中所述探針能雜交或PCR-擴增編碼幹擾素同系物多肽及其片段的多核苷酸。篩選和分離cDNA克隆的方法是本領域技術人員眾所周知的。該技術描述於例如Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第2版)，Vol.1-3，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989(下文簡稱為″Sambrook″)和最新分子生物學方法，F.M.Ausubel等編，最新方法，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley Sons合資公司(1999年增補)(下文簡稱為″Ausubel″)。
如本文所詳述，本發明的多核苷酸包括編碼新的成熟幹擾素-α同系物的序列和與該編碼序列互補的序列，以及該編碼序列的新片段及其互補序列。多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，包括mRNA，cRNA，合成RNA和DNA，和cDNA。多核苷酸可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非-編碼(反義，互補)鏈。多核苷酸任選包括幹擾素-α同系物的編碼序列(i)的分離形式，(ii)與其它編碼序列聯合以編碼例如融合蛋白，前-蛋白質，前-蛋白質原等，(iii)與能在適當宿主中有效表達編碼序列的非-編碼序列，如啟動子，終止元件，或5』和/或3』非翻譯區域聯合，和/或(iv)在載體或宿主環境中，其中幹擾素-α同系物的編碼序列是異源核酸序列或基因。序列也可與一般的核酸組合製劑聯合，其中包括載體，緩衝液，佐劑，賦形劑等。
編碼各個幹擾素-α同系物多肽的術語DNA或RNA包括任何寡脫氧核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸序列，它們通過在適當宿主細胞中表達，導致產生本發明的幹擾素-α同系物多肽。DNA或RNA可在適當宿主細胞，或在無細胞(體外)系統中產生，或者可以(通過例如擴增技術，如PCR)合成或用化學方法產生。利用本發明的多核苷酸本發明的多核苷酸有多個用途，例如重組生產(即表達)本發明的幹擾素-α同系物多肽；在例如治療性和預防性地治療疾病的方法中用作治療劑和預防劑；用於基因治療方法和相關應用領域；用作免疫原；用於診斷和篩選試驗；用作診斷探針以探測互補或部分互補的核酸的存在(包括檢測編碼天然IFN-α的核酸)；用作其它反應，例如改組反應或突變反應的底物以產生新的和/或經改良的IFN-α同系物等。多肽的表達根據本發明，編碼新的和/或成熟的幹擾素-α同系物，幹擾素-α蛋白質的片段，相關融合蛋白，或其功能等同物的多核苷酸序列在本文中被統稱為「幹擾素-α同系物多肽」，「幹擾素-α同系物蛋白質」，或「幹擾素-α同系物」，「幹擾素同系物」，「IFN-α同系物」，「IFN同系物」，「IFN多肽」，「IFN蛋白質」，「本發明的多肽」或「本發明的蛋白質」。本發明的多肽或蛋白質欲包括和包含上述每個術語的多肽或胺基酸片段。本發明的多核苷酸序列被用於能介導幹擾素-α同系物多肽在適當宿主細胞中表達的那些重組DNA(或RNA)分子。由於遺傳密碼內在的簡併性，也可以使用編碼基本上相同或功能上等同的胺基酸序列的其它核酸序列來克隆和表達幹擾素同系物。經修飾的編碼序列本領域技術人員應懂得，修飾編碼序列(包括例如編碼本發明的幹擾素-α同系物或其片段的核苷酸序列)以增強其在特定宿主中的表達是有利的。遺傳密碼是豐餘的，它具有64個可能的密碼子，但大多數生物偏好使用這些密碼子中的一部分。在物種中最常使用的密碼子被稱為最適密碼子，那些不常使用的密碼子被分為稀有或不常用密碼子(例見Zhang S.P.等(1991)基因10561-72)。可取代密碼子以反映宿主的優選密碼子使用情況，該方法被稱為「密碼子最優化」或「物種密碼子偏性的控制」。
可以製備出含有特定原核或真核宿主所偏好的密碼子(Murray，E.等(1989)核酸研究17477-508)的最優化編碼序列，從而使與未經最優化的序列所產生的轉錄物相比，能提高翻譯速率，或產生具有所需特性，如較長半壽期的重組RNA轉錄物。也可以修飾翻譯終止密碼子以反映出宿主的偏好。例如，釀酒酵母和哺乳動物的優選終止密碼子分別為UAA和UGA。單子葉植物的優選終止密碼子是UGA，而昆蟲和大腸桿菌優選使用UAA作為終止密碼子(Dalphin M.E.等(1996)核酸研究24216-218)。
為了多種原因，可對本發明的多核苷酸序列進行改造以改變幹擾素同系物編碼序列，所述改變包括但不限於修飾基因產物的克隆，加工和/或表達的改變。例如，可使用本領域眾所周知的技術，例如定點誘變導入改變，以插入新的限制性位點，改變糖基化模式，改變密碼子的偏好，導入剪接位點等。載體，啟動子和表達系統本發明還包括重組構建體，其含有一種或多種本文所寬泛描述的核酸序列(例如編碼本發明的幹擾素-α同系物或其片段的核酸序列)。構建體包括載體，例如質粒，粘粒，噬菌體，病毒(包括逆轉錄病毒)，細菌人工染色體(BAC)，酵母人工染色體(YAC)等，其中在正向或反向上插入了本發明的核酸序列。在此實施方案的優選方面，構建體還含有調節序列，包括例如與序列可操作相連的啟動子。大量適當的載體和啟動子是本領域技術人員已知的，也可以商購獲得。
描述本文所用分子生物學技術，包括載體，啟動子的利用和很多其它相關論題的普通教科書包括Juo，P-S.，簡明生物醫學和分子生物學詞典(CRC出版社，1996)；Singleton等，微生物學和分子生物學詞典(第2版，1994)；劍橋科學和技術詞典(Walker編，1988)；Hale Marham，HARPERCOLLINS生物學詞典(1991)；Scott和Mercer，簡明生物化學和分子生物學百科全書(第3版，1997)；Berger和Kimmel，分子克隆技術指南，酶學方法，第152卷，Academic出版公司，San Diego，CA(下文簡稱為″Berger″)；Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊(第2版)，Vol.1-3，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989(″Sambrook″)和最新分子生物學方法，F.M.Ausubel等編，最新方法，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley Sons合資公司(1999年增補)(″Ausubel″)。足以教導熟練技術人員進行體外擴增方法，包括聚合酶鏈反應(PCR)，連接酶鏈反應(LCR)，Qβ-複製酶擴增和其它RNA聚合酶介導的技術(例如NASBA)，以產生本發明的同源核酸的技術可參見例如Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美國專利4,683,202；1997年7月28日公開的美國專利4,683,195；PCR方法方法和應用指南(Innis等編)Academic出版公司，San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim Levinson(1990年10月1日)CEN36-47；NIH研究雜誌(1991)3，81-94；KWoh等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA86，1173；Guatelli等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA87，1874；Lomell等，(1989)臨床化學雜誌，35，1826；Landegren等，(1988)科學241，1077-1080；Van Brunt(1990)生物技術8，291-294；Wu和Wallace(1989)基因4，560；Barringer等，(1990)基因89，117以及Sooknanan和Malek(1995)生物技術13563-564。
PCR一般指的是通過本領域眾所周知的方法擴增極少量的特定核酸，RNA和/或DNA片段的方法(參見例如美國專利4,683,195和上述其它參考文獻)。一般使用所需區域末端或更遠處的序列信息來設計寡核苷酸引物。所述引物的序列與待擴增模板的相反鏈相同或相似。相反鏈的5』末端核苷酸可與擴增物的末端相符。可使用PCR擴增特定的RNA或特定的DNA序列，重組DNA或RNA序列，來自總基因組DNA的DNA和RNA序列，和轉錄自總細胞RNA，噬菌體或質粒序列的cDNA等。PCR是使用另一種(如已知的)核酸作為引物，來擴增核酸檢測樣品的核酸聚合酶反應法的一個例子，但不是唯一的例子。克隆經體外擴增的核酸的改良方法描述於Wallace等，美國專利5,426,039。通過PCR擴增大核酸的改良方法簡述於Cheng等，(1994)自然369684-685和其中的參考文獻，其中產生了長至40kb的PCR擴增子。本領域技術人員應懂得實質上使用逆轉錄酶和聚合酶可將任何RNA轉變為適於限制性消化，PCR擴展和測序的雙鏈DNA。參見Ausubel，Sambrook和Berger，文獻同上。
本發明還涉及被本發明的載體轉導的宿主細胞，和通過重組技術生產本發明的多肽(包括其片段)。用本發明的載體對宿主細胞進行基因工程改造(即轉導，轉化或轉染)，所述載體可以是例如克隆載體或表達載體。載體可以是例如質粒，病毒顆粒，噬菌體等形式。可在常規營養培養基中培養經改造的宿主細胞，必要時可對培養基成分進行改動以活化啟動子，選擇轉化子或擴增幹擾素同系物基因。如溫度，pH等的培養條件與選擇用於表達的宿主細胞先前所用的相同，它們對於本領域技術人員而言是顯而易見的，也可參見本文提及的參考文獻，包括例如Freshney(1994)動物細胞培養，基本技術手冊，第3版，Wiley-Liss，紐約和其中提及的參考文獻。
也可在非-動物細胞，如植物，酵母，真菌，細菌等中生產本發明的幹擾素同系物多肽和蛋白質。除了Sambrook，Berger和Ausubel外，有關細胞培養的詳細資料可參見Payne等，(1992)液體系統的植物細胞和組織培養，John Wiley Sons，Inc.紐約，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)植物細胞，組織和器官培養；基本方法，Springer實驗室手冊，Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)以及Atlas和Parks(編)，微生物培養基手冊(1993)，CRC出版社，Boca Raton，FL。
可將本發明的多核苷酸包含在多個表達載體的任一個中以表達多肽。所述載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；衍生自質粒和噬菌體DNA，病毒DNA，如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒和很多其它病毒之組合的載體。可以使用任何能將遺傳物質轉導至細胞，並且當需要複製時可以複製並在相關宿主中能存活的載體。
表達載體中的核酸序列與適當的轉錄控制序列(啟動子)可操作相連以介導mRNA合成。所述啟動子的例子包括LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp啟動子，噬菌體λPL啟動子和其它已知能控制原核或真核細胞或其病毒中的基因表達的啟動子。表達載體還含有用於翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體任選包括用於擴增表達的適當序列。另外，表達載體還任選含有一種或多種選擇標記基因以提供表型性狀，用於選擇經轉化的宿主細胞，如針對真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或針對大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
可使用含有本文所述的適當DNA序列，以及適當啟動子或控制序列的載體轉化適當宿主，以使宿主表達蛋白質。適當表達宿主的例子包括細菌細胞，如大腸桿菌，鏈黴菌屬和鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如釀酒酵母，巴斯德畢赤氏酵母和粗糙鏈孢黴；昆蟲細胞，如果蠅和草地夜蛾；哺乳動物細胞，如CHO，COS，BHK，HEK293或Bowes黑素瘤；植物細胞等。應理解不是所有細胞或細胞系都需要能夠產生完全功能性的幹擾素同系物；例如，可在細菌或其它表達系統中產生幹擾素同系物的抗原性片段。本發明並不受所用宿主細胞的限制。
在細菌系統中，可根據幹擾素同系物的用途來選擇多種表達載體。例如，當需要大量幹擾素同系物或其片段以誘導抗體時，則需要能介導易於純化的融合蛋白高水平表達的載體。所述載體包括但不限於多功能的大腸桿菌克隆和表達載體，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中幹擾素同系物編碼序列被連接至載體中，與氨基末端的Met序列和隨後的β-半乳糖苷酶的7個殘基位於同一讀碼框內，從而產生雜合蛋白；pIN載體(Van Heeke Schuster(1989)生物化學雜誌2645503-5509)；pET載體(Novagen，Madison WI)等。
類似地，在酵母釀酒酵母中，可使用多種含有組成型或誘導型啟動子，如α因子，醇氧化酶和PGH的載體來生產本發明的幹擾素同系物蛋白質。有關評述可參見Ausubel等，(文獻同上)和Grant等，(1987；酶學方法153516-544)。
在哺乳動物宿主細胞中，可利用多種表達系統，如基於病毒的系統。當使用腺病毒作為表達載體時，任選將編碼序列連接至腺病毒轉錄/翻譯複合物中，所述複合物由晚期啟動子和三聯前導序列組成。插入病毒基因組中非必需的E1或E3區域會導致存治病毒能在被感染的宿主細胞中表達幹擾素同系物(Logan和Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。另外，可使用轉錄增強子，如Rous肉瘤病毒(RSV)增強子來增強哺乳動物宿主細胞中的表達。其它表達元件特定的起始信號有助於有效翻譯幹擾素同系物編碼序列。這些信號包括例如ATG起始密碼子和鄰接的序列。當將幹擾素同系物編碼序列，其起始密碼子和上遊序列插入適當表達載體時，無需其它的翻譯控制信號。然而，當僅插入編碼序列(如成熟蛋白質的編碼序列)或其部分時，必須提供外源轉錄控制信號，包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須位於正確的讀碼框內以確保轉錄完整的插入物。外源轉錄元件和起始密碼子可以是不同的來源，可以是天然的和合成的。通過包含適於所用細胞系統的增強子，可以增強表達效力(Schaf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20125-62；Bittner等(1987)酶學方法，153516-544)。分泌/定位序列本發明的多核苷酸也可以與編碼分泌/定位序列的核酸融合，例如框內融合，從而將多肽表達靶向至所需的細胞區室，膜或細胞器，或者介導多肽分泌至周質間隙或細胞培養基中。所述序列是本領域技術人員已知的，其包括分泌前導肽，細胞器靶向序列(例如核定位序列，ER滯留信號，線粒體轉位序列，葉綠體轉位序列)，膜定位/錨著序列(如終止轉移序列，GPI錨著序列)等。由本發明的多核苷酸表達的多肽包括對應於分泌和/或定位序列的胺基酸序列。表達宿主在其它實施方案中，本發明涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是真核細胞，如哺乳動物細胞，酵母細胞或植物細胞，或宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。通過磷酸鈣轉染，DEAE-Dextran介導的轉染，電穿孔，或其它普通技術(Davis，L，Dibner，M和Battey，I.(1986)基本分子生物學方法)，可將構建體導入宿主細胞。細胞中可包含本發明的核酸，所述核酸編碼多肽，其中所述細胞表達多肽(例如通過本文所述的試驗測定，具有抗病毒或抗增殖活性的幹擾素-α同系物多肽)。本發明還包括含有本發明的任何核酸的載體，並包括被所述載體轉導的細胞。另外，本發明還包括含有上述或整個說明書所述的任何多肽或核酸的細胞和轉基因動物，例如通過轉導本發明的載體而產生的細胞和轉基因動物。
任選根據細胞調節插入序列的表達或按所需方式加工經表達的蛋白質的能力來選擇宿主細胞株。蛋白質修飾包括但不限於乙醯基化，羧基化，糖基化，磷酸化，脂質化和醯基化。裂解蛋白質的「前」或「前原」形式的翻譯後加工對於正確插入，摺疊和/或行使功能是至關重要的。對於這種翻譯後的活性而言，諸如CHO，HeLa，BHK，MDCK，293，WI38等的不同宿主細胞具有特定的細胞機器和特徵性的機制，可在它們中進行選擇以確保正確修飾和加工導入的外源蛋白質。
為了長期，高產地生產重組蛋白質，可使用穩定的表達。例如，可使用表達載體轉導能穩定表達本發明多肽的細胞系，所述表達載體含有病毒複製起點或內源性表達元件和選擇標記基因。導入載體之後，使細胞在滋養培養基中培養1至2天，然後轉移至選擇培養基中。選擇標記的目的是賦予抗性以進行選擇，它的存在允許培養和回收成功表達導入序列的細胞。例如，使用適於細胞類型的組織培養技術可增殖穩定轉化細胞的抗性群落。
任選在適於表達並從細胞培養物中回收編碼蛋白質的條件下，培養被編碼本發明多肽的核苷酸序列轉化的宿主細胞。根據所用序列和/或載體的不同，由重組細胞產生的蛋白質或其片段可被分泌，與膜結合或包含在細胞內。本領域技術人員應懂得可在含有編碼本發明成熟幹擾素同系物的多核苷酸的表達載體中設計信號序列，所述信號序列可介導成熟的多肽穿過原核或真核細胞膜分泌出來。其它多肽序列本發明的多核苷酸也可包含與標記序列(例如便於純化本發明的編碼多肽的序列)融合在一個框內的編碼序列。這種便於純化的結構域包括但不限於可以在固定化的金屬上純化的金屬螯合肽，如組氨酸-色氨酸組件，與穀胱甘肽結合的序列(如GST)，血凝素(HA)標記(對應於流感病毒血凝素蛋白的表位；Wilson，I.等(1984)細胞37767)，麥芽糖結合蛋白序列，FLAGS延伸/親和純化系統(Immunex Corp.，Seattle，WA)中所用的FLAG表位等。在純化結構域和幹擾素同系物序列之間包含可被蛋白酶裂解的多肽接頭序列將有利於純化。有望用於本文所述組合物和方法中的一個表達載體提供了融合蛋白的表達，所述融合蛋白含有與多聚組氨酸區域融合的本發明多肽，它們之間被腸激酶裂解位點隔開。組氨酸殘基便於在IMIAC(固定化金屬離子親和層析，如Porath等(1992)蛋白質的表達和純化3263-281)上純化，而腸激酶裂解位點可以使幹擾素同系物多肽從融合蛋白中分離出來。也可使用pGEX載體(Promega；Madison，WI)將外源多肽表達成與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白。通常，這種融合蛋白是可溶性的，通過吸附至配體-瓊脂糖珠(例如，當與GST融合時，為穀胱甘肽-瓊脂糖)，接著在游離配體的存在下進行洗脫，可以容易地從裂解細胞中純化出融合蛋白。多肽的生產和回收轉導適當的宿主株(系)並將宿主株(系)培養至適當的細胞密度之後，通過適當的方式(例如溫度轉變或化學試劑誘導)誘導選定的啟動子，將細胞再培養一段時間。一般通過離心收集細胞，用物理或化學方法破碎細胞，保留所得粗提取物以進行進一步純化。可通過本領域眾所周知的任何便利的方法破碎表達蛋白質所用的微生物細胞，包括反覆凍融，超聲處理，機械破碎或使用細胞裂解劑或其它方法。
如上所述，很多篇參考文獻可用於培養和生產很多種細胞，包括源自細菌，植物，動物(尤其是哺乳動物)和古細菌的細胞。參見例如Sambrook，Ausubel和Berger(文獻同上)，以及Freshney(1994)動物細胞培養，基本技術手冊，第3版，Wiley-Liss，紐約和其中提及的參考文獻，Doyle和Griffiths(1997)哺乳動物細胞培養基本技術，John Wiley和Sons，紐約；Humason(1979)動物組織技術，第4版，W.H.Freeman和Company；和Ricciardelli等(1989)體外細胞發育生物學，251016-1024。關於植物細胞培養和再生，可參見Payne等(1992)液體系統中的植物細胞和組織培養，JohnWiley Sons，Inc.，紐約，NY；Gamborg和Phillips(編)(1995)植物細胞，組織和器官培養；基本方法，Springer實驗室手冊，Springer-Verlag(Berlin HeidelbergNew York)和植物分子生物學(1993)R.R.D.Croy編，Bios ScientificPublishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 1983706。細胞培養基通常可參見Atlas和Parks(編)微生物培養基手冊(1993)CRC出版社，Boca Raton，FL。有關細胞培養的其它資料可參見商家提供的文獻，例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的生命科學研究，細胞培養目錄(1998)(″Sigma-LSRCCC″)，和例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的植物培養目錄和增補本(1997)(″Sigma-PCCS″)。
也可通過本領域眾所周知的多種方法中的任一種，從重組細胞培養物中回收和純化本發明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析(如使用本文所述的任何標記系統)，羥基磷灰石層析和凝集素層析。必要時，在完成成熟蛋白質的構型時，可以使用蛋白質的重新摺疊步驟。最終，在最後的純化步驟中可以使用高效液相層析(HPLC)。除了上文提及的參考文獻外，多種純化方法是本領域眾所周知的，包括例如Sandana(1997)蛋白質的生物分離，Academic出版公司；和Bollag等(1996)蛋白質方法，第2版，Wiley-Liss，紐約；Walker(1996)蛋白質方法手冊，Humana出版社，NJ，Hahis和Angal(1990)蛋白質純化應用操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英國；Harris和Angal，蛋白質純化方法操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英國；Scopes(1993)蛋白質純化原理和實踐，第3版，Springer Verlag，紐約；Janson和Ryden(1998)蛋白質純化原理，高解析度的方法和應用，第2版，Wiley-VCH，紐約；和Walker(1998)CD-ROM版的蛋白質方法，Humana出版社，NJ。體外表達系統也可使用本發明的DNA或RNA，利用無細胞轉錄/翻譯系統生產多肽。幾種這樣的系統可以商購得到。體外轉錄和翻譯方法的一般性指南可參見Tymms(1995)體外轉錄和翻譯方法分子生物學方法，第37卷，GarlandPublishing，紐約。經修飾的胺基酸本發明的多肽可含有一個或多個經修飾的胺基酸。經修飾的胺基酸的存在對例如(a)延長多肽的血清半壽期，(b)降低多肽的抗原性，(c)增加多肽的儲存穩定性是有利的。例如，在重組生產時可以共-翻譯或翻譯後修飾胺基酸(例如在哺乳動物細胞中表達時，N-X-S/T基元的N-聯糖基化)，或通過合成的方式修飾胺基酸。
經修飾的胺基酸的非限制性例子包括糖基化胺基酸，硫酸化胺基酸，異戊二烯化(如法尼基化，香葉基香葉基化)胺基酸，乙醯基化胺基酸，醯基化胺基酸，PEG化胺基酸，生物素化胺基酸，羧基化胺基酸，磷酸化胺基酸等。能詳盡指導本領域技術人員修飾胺基酸的參考文獻有很多，例舉的方法可參見Walker(1998)CD-ROM版本的蛋白質方法，Human出版社，Towata，NJ。
本發明的多核苷酸和多肽有多個用途，包括但不限於例如重組生產(即表達)本發明的重組幹擾素-α同系物；在體內和來自體內地治療多個受試者的多種疾病的方法中用作治療劑和預防劑；用於體外方法，如診斷和篩選方法以檢測，診斷和治療多個受試者(如哺乳動物)的多種疾病(例如癌症，基於病毒的疾病，基於血管生成的疾病)；用作免疫原；在基因治療方法和基於DNA或RNA的傳遞方法中，用於將本發明的生物活性多肽體內，來自體內或體外傳遞至或施用於受試者的組織，群體或細胞，器官，移植物，身體系統(如器官系統，淋巴系統，血液系統等)；用作DNA疫苗，多-成分的疫苗以用於治療性和預防性地治療多個受試者(如哺乳動物)的多種疾病(例如癌症，基於病毒的疾病，基於血管生成的疾病)；用作佐劑以增強或擴大受試者的免疫應答；用作多步加強免疫方法(例如包括通過傳遞DNA或RNA核苷酸(例如編碼本發明多肽或編碼另一種多肽的核苷酸)引發免疫，接著再次用多肽(例如本發明的多肽或其它多肽)加強免疫的形式)的成分；用作診斷探針以探測互補或部分互補的核酸的存在(包括檢測編碼天然幹擾素-α的核酸)；用作其它反應，例如改組反應，突變反應或其它多樣性生成反應的底物，以產生新的和/或經改良的幹擾素-α同系物和編碼這種同系物的新的幹擾素-α核酸，例如產生新的治療或預防特性等；用於聚合酶鏈反應(PCR)或克隆方法，例如包括消化或連接反應，以鑑定新的和/或經改良的天然或非天然IFN-α核酸和由其編碼的多肽。任選將編碼本發明幹擾素同系物的多核苷酸，或該多核苷酸的互補物施用於細胞，以完成治療或預防用的方法，或在體內，來自體內或體外表達治療用產物。包括體內或來自體內的應用，例如基因治療的這些應用包括多種技術，通過它們可以改變細胞中的基因表達。所述方法包括例如導入表達例如治療或預防用多肽，如本發明的幹擾素同系物的基因。所述方法包括例如用含有本發明的多核苷酸和/或多肽的逆轉錄病毒進行感染。任選地，逆轉錄病毒還含有其它外源的，例如治療或預防性的基因構建體序列。一方面，如下文所詳述，本發明提供了通過給需要進行治療的受試者，包括生物或哺乳動物，包括例如人，靈長類動物，小鼠，豬，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，綿羊；或非哺乳類脊椎動物，如鳥類(如雞或鴨)或魚，或無脊椎動物的一個或多個細胞體內，來自體內或體外施用一種或多種本文所述發明的核酸，預防或治療性治療所述受試者的疾病的基因治療方法。
另一方面，如下文所詳述，本發明提供了通過給需要進行治療的受試者(包括本文所定義的那些)的一個或多個細胞體內，來自體內或體外施用一種或多種本文所述發明的多肽，預防或治療性治療所述受試者的疾病的方法。多肽表達使用本領域技術人員眾所周知的技術，編碼本發明的幹擾素同系物多肽的多核苷酸對體內或來自體內的治療或預防應用特別有用。例如，用多核苷酸(DNA或RNA)對來自體內的培養細胞進行改造，然後將經改造的細胞返回至患者體內。也可對體內或來自體內的細胞進行改造，以分別在體內或來自體內地表達多肽。
已知多種病毒載體適於生物體在體內或來自體內地轉導和表達。所述載體包括逆轉錄病毒載體(參見Miller(1992)最新微生物學和免疫學論題1581-24；Salmons和Gunzburg(1993)人類基因治療4129-141；Miller等(1994)酶學方法217581-599)和腺-相關病毒載體(參見Carter(1992)最新生物技術觀點3533-539；Muzcyzka(1992)最新微生物學和免疫學論題15897-129)。可以使用的其它病毒載體包括腺病毒載體，皰疹病毒載體和新培斯病毒載體，一般描述於例如JollY(1994)癌症基因治療151-64；Latchman(1994)分子生物技術2179-195；和Johanning等(1995)核酸研究231495-1501。
基因治療提供了多種方法用於抵抗慢性傳染病(例如HIV感染，病毒性肝炎，單純皰疹病毒(HSV)，B肝病毒(HepB)，登革病毒等)，以及非-傳染性疾病，包括癌症和變應性疾病和一些形式的先天性缺陷，如酶缺陷。已使用了幾種方法將核酸導入體內，來自體內和體外的細胞。這些方法包括基於脂質體的基因傳遞(Debs和Zhu(1993)WO93/24640和美國專利5,641,662；Mannino和Gould-Fogerite(1988)生物技術6(7)682-691；Rose，美國專利5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等(1987)Proc.NatlAcad.Sci.USA847413-7414)；Brigham等(1989)美國醫學科學雜誌298278-281；Nabel等(1990)科學2491285-1288；Hazinski等(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol 4206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.NatlAcad.Sci.(USA)847851-7855)；腺病毒載體介導的基因傳遞，例如用於治療癌症(參見例如Chen等(1994)Proc.Natl Acad.Sci.USA 913054-3057；Tong等(1996)Gynecol.Oncol.61175-179；Clayman等(1995)癌症研究51-6；O′Malley等(1995)癌症研究551080-1085；Hwang等(1995)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.137-16；Haddada等(1995)最新微生物學和免疫學論題199(Pt.3)297-306；Addison等(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA 928522-8526；Colak等(1995)腦研究69176-82；Crystal(1995)科學270404-410；Elshami等(1996)人類基因治療7141-148；Vincent等(1996)神經外科雜誌85648-654)，和很多其它疾病。另外，已使用複製-缺損的逆轉錄病毒載體，其攜有治療性的多核苷酸序列作為逆轉錄病毒基因組的一部分，其中特別應提及簡單的MuLV載體，參見例如Miller等(1990)分子細胞生物學104239(1990)；Kolberg(1992)NIH研究雜誌443，和Cornetta等(1991)人類基因治療2215)。另外，還使用了與配體-特異性的，基於陽離子的轉運系統相結合的核酸轉運(Wu和Wu(1988)生物化學雜誌26314621-14624)。也已描述了裸露的DNA表達載體(Nabel等(1990)，文獻同上；Wolff等(1990)科學2471465-1468)。通常，通過將編碼本文所述幹擾素同系物的核酸摻入適當載體，可以使這些方法適應於本發明。
描述基因治療方法，通過將本發明的核酸導入患者而適應於本發明的普通教科書包括Robbins(1996)基因治療方法，Humana出版社，NJ，和Joyner(1993)基因靶向操作方法，IRL出版社，牛津，英國。反義技術除了表達本發明的核酸作為基因替代核酸外，一旦細胞中不再需要表達核酸時，所述核酸還可用於有義和反義地抑制表達，例如下調本發明核酸的表達。類似地，也可使用本發明的核酸，或其亞序列或反義序列阻斷天然同系物核酸的表達。多種有義和反義技術是本領域已知的，例如可參見Nellen(1997)反義技術操作方法，IRL出版社，牛津大學，牛津，英國和Agrawal(1996)反義治療劑Humana出版社，NJ和其中提及的參考文獻。藥物組合物本發明的多核苷酸和多肽(包括例如含有本發明的多核苷酸或多肽的載體，細胞，抗體等)可與適當的藥物載體組合以用於治療和預防用途。所述組合物含有治療或預防有效量的本發明的多核苷酸或多肽，和藥物可接受的載體或賦形劑。藥物可接受的載體包含任何標準的藥物載體，緩衝液和賦形劑。所述載體或賦形劑包括但不限於鹽水，緩衝鹽水(如磷酸緩衝鹽水溶液)，葡萄糖，水，甘油，乙醇，乳劑(如油/水或水/油乳劑)，多種類型的潤溼劑和/或佐劑，及其組合。適當的藥物載體和試劑描述於REMINGTON′S藥物科學(Mack出版公司，Easton，第19版，1995)。配製方式應該與活性劑(如核苷酸，多肽，載體，細胞等)的給藥模式相適應。施用核酸，多肽，載體，細胞，抗體和蛋白質的方法是本領域眾所周知的，並在下文中進一步討論。用作探針本文還希望包括一般具有至少12個鹼基，優選至少15個鹼基，更優選至少20，30或50個鹼基的多核苷酸(本文也稱之為寡核苷酸)的用途，所述多核苷酸能在至少高度嚴緊(或超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊的條件)的條件下與上述幹擾素同系物的多核苷酸序列雜交。根據上述文獻中所述的方法，多核苷酸可用作探針，引物，有義和反義試劑等。序列變異沉默變異本領域技術人員應懂得由於遺傳密碼的簡併性，可產生很多種編碼本發明的幹擾素同系物多肽的核酸序列，其中的一些與本文清楚公開的核酸序列有很低的序列同源性。
表1密碼子表胺基酸 密碼子丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys C UGC UGU天冬氨酸 Asp D GAC GAU穀氨酸 Glu E GAA GAG苯丙氨酸 Phe F UUC UUU甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU組氨酸 His H CAC CAU異亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU賴氨酸 Lys K AAA AAG亮氨酸 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met M AUG天冬醯胺 Asn N AAC AAU脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU穀氨醯胺 Gln Q CAA CAG精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU纈氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
例如，通過密碼子表(表1)可以看出密碼子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG和CGU都編碼胺基酸精氨酸。因此，在本發明核酸中每一個由一個密碼子特指為精氨酸的位置處，可將密碼子改變為上述相應密碼子中的任一個，而不會改變編碼的多肽。應理解RNA序列中的U相當於DNA序列中的T。
例如，使用相當於SEQ ID NO1中的核苷酸1-15的核酸序列TGT GATCTG CCT CAG，該序列的沉默變異包括TGC GAC TTA CCA CAA，編碼胺基酸序列CDLPQ的這兩個序列相當於SEQ ID NO36中的胺基酸1-5。
這種「沉默變異」是一種將在下文討論的「經保守修飾的變異」。本領域技術人員會意識到可通過標準技術修飾核酸中的每一個密碼子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸唯一的密碼子)以編碼功能相同的多肽。因此，在任何所述序列中暗含編碼多肽的核酸的每一種沉默變異。本發明提供了編碼本發明多肽的核酸序列的每一種和每一個可能變異，它們通過根據可能的密碼子選擇來組合。根據編碼本發明的幹擾素同系物多肽的核酸序列所用的標準三聯體遺傳密碼(如表1所示)製備這些組合。通過考慮序列以及遺傳密碼，具體提供和描述了本文每一種核酸的上述所有變異體。保守變異特定核酸序列的「經保守修飾的變異」或簡稱為「保守變異」指的是編碼相同或實質上相同的胺基酸序列的那些核酸，或當核酸不編碼胺基酸序列時，指的是基本上相同的序列。本領域技術人員認為改變，添加或缺失編碼序列中的單個胺基酸或小百分比的胺基酸(一般低於5％，更優選低於4％，3％，2％或1％)的各個取代，缺失或添加是「經保守修飾的變異」，其中改變導致胺基酸缺失，胺基酸添加或用化學相似的胺基酸取代胺基酸。
提供功能相似的胺基酸的保守取代表是本領域眾所周知的。表2列出了6組，其含有可「保守取代」另一個胺基酸的胺基酸。
表2保守取代的組
因此，本發明所列多肽序列的「經保守取代的變異」或簡稱為「保守取代」包括用相同保守取代組的經保守選擇的胺基酸取代多肽序列中小百分比，一般低於5％，更優選低於4％，3％，2％或1％的胺基酸。
例如，在本文中被鑑定為SEQ ID NO36的多肽的保守取代變異會在166個胺基酸長的多肽的約8或9個殘基(即約5％胺基酸)中含有根據上文所定義的6組「保守取代」。
在其它例子中，如果4個保守取代位於相當於SEQ ID NO36的胺基酸殘基141-166的區域，根據表2列出的保守取代，該區域WEVVR AEIMRSFSFS TNLQK RLRRKE的保守取代變異的例子包括WEVVRSEIMRSFSYS TNLQRRLRRKD和WELVR AEIVR SFSFS TNLNK RLRKKE等(在上述例子中，下劃線的為保守取代)。本文列出的蛋白質序列結合上述取代表，提供了所有經保守取代的蛋白質的列表。
最後，添加不會改變核酸分子的編碼活性的序列，例如添加非-功能性序列也是基本核酸的保守變異。
本領域技術人員應懂得所公開的核酸構建體的很多種保守變異產生了功能上相同的構建體。例如，如上文所討論，由於遺傳密碼的簡併性，「沉默取代」(即核酸序列中不會改變所編碼多肽的取代)是每一種編碼胺基酸的核酸序列暗含的特徵。類似地，用具有高度相似特性的不同胺基酸取代胺基酸序列中的一個或幾個胺基酸的「保守胺基酸取代」也能容易地被鑑定為與所公開的構建體高度相似。每一種公開序列的這種保守變異也是本發明的特徵。核酸雜交當核酸相互結合(一般在溶液中進行)時即為「雜交」。核酸雜交是由於存在多種已被詳細鑑定的物理-化學力，如氫鍵，溶劑排斥，鹼基堆積等。有關核酸雜交的詳盡指導可參見Tijssen(1993)生物化學和分子生物學實驗室技術-與核酸探針雜交，第I部分，第2章，「雜交原理和核酸探針試驗策略綜述」，以及Ausubel，文獻同上。Hames和Higgins(1995)基因探針1，牛津大學出版社的IRL出版社，牛津，英國(Hames和Higgins 1)和Hames與Higgins(1995)基因探針2，牛津大學出版社的IRL出版社，牛津，英國(Hames和Higgins 2)提供了有關合成，標記，檢測和定量DNA和RNA，包括寡核苷酸的細節。
核酸雜交實驗，如Southern和Northern雜交上下文中的「嚴緊雜交洗滌條件」取決於序列，在不同的環境參數下也是不同的。有關核酸雜交的詳盡指導可參見Tijssen(1993)，文獻同上和Hames和Higgins 1與Hames和Higgins2，文獻同上。
為了本發明的目的，通常將「高度嚴緊的」雜交和洗滌條件選定為比特定序列在確定的離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5℃或更低(如下文所述，也可以用相當的術語描述高度嚴緊的條件)。Tm是50％的測試序列與精確匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和pH下)。很嚴緊的條件被選定為與特定探針的Tm相等。
Tm是核酸雙鏈體的溫度，在此溫度下，雙鏈體在給定條件下50％變性，該溫度可直接測量核酸雜合體的穩定性。因此，Tm相當於從螺旋到隨機捲曲的轉變中點所對應的溫度；對於長的一段核苷酸序列而言，它取決於長度，核苷酸組成和離子強度。
雜交之後，可通過一系列的洗滌除去未雜交的核酸物質，可根據所需結果調整洗滌的嚴緊度。低嚴緊度的洗滌條件(例如使用較高的鹽濃度和較低的溫度)增加敏感性，但可產生非特異性雜交信號和強的背景信號。較高嚴緊度的條件(例如使用較低的鹽濃度和接近雜交溫度的較高溫度)能降低背景信號，一般僅留下特異性信號。參見Rapley，R和Walker，J.M編，分子生物學方法手冊(Humana出版公司1998)(下文稱之為″Rapley和Walker″)，其全文列入本文作為參考。
使用下列等式可估計DNA-DNA雙鏈體的TmTm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是單價陽離子(通常是Na+)的重量摩爾濃度，(％G+C)是鳥苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲醯胺的百分比，n是雜合體的核苷酸鹼基數目(即長度)，參見Rapley和Walker，文獻同上。
按下式估計RNA-DNA雙鏈體的TmTm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是單價陽離子(通常是Na+)的重量摩爾濃度，(％G+C)是鳥苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲醯胺的百分比，n是雜合體的核苷酸鹼基數目(即長度)，文獻同上。
等式1和2一般僅對長於100-200個核苷酸的雜合雙鏈體準確，文獻同上。
可按下式估計短於50個核苷酸的核酸序列的TmTm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相應核苷酸的數目。
在Southern或Northern印跡膜上雜交具有100個以上互補殘基的互補核酸的嚴緊雜交條件例子是在含1mg肝素的50％福馬林中，42℃雜交過夜。嚴緊洗滌條件的例子是0.2×SSC，65℃洗滌15分鐘(有關SSC緩衝液的描述可參見Sambrook，文獻同上)。經常用低嚴緊度的洗滌替代高嚴緊度的洗滌，以除去背景探針信號。低嚴緊度洗滌的例子是2×SSC，40℃洗滌15分鐘。
通常，在特定的雜交試驗中，如果信號噪聲比2.5倍-5倍於(或高於)用不相關探針觀察到的相應數值，則表明檢測到特異性雜交。在本發明的上下文中，檢測到兩個序列之間至少嚴緊的雜交則表明與例如本文序列表中提供的本發明的核酸具有相對較高的結構相似性或同源性。
如上所述，將「高度嚴緊的」條件選定為比特定序列在確定的離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5℃或更低。可在高度嚴緊的條件下鑑定與感興趣的核苷酸序列(例如「探針」)密切相關或相同的靶序列。較低嚴緊度的條件適用於互補性較差的序列，參見例如Raoley和Walker，文獻同上。
可使用比較雜交來鑑定本發明的核酸，這種比較雜交法是區分本發明核酸的優選方法。在本發明的上下文中，檢測到兩個序列之間高度嚴緊的雜交表明與例如本文序列表中提供的核酸具有相對較高的結構相似性/同源性。兩個核苷酸序列之間高度嚴緊的雜交闡明了比通過嚴緊雜交條件檢測到的要高的結構，核苷酸鹼基組成，排列或順序的相似性或同源性水平。特別是，在本發明的上下文中，檢測到高度嚴緊的雜交表明與例如本文序列表中提供的核酸具有較高的結構相似性或結構同源性(例如核苷酸結構，鹼基組成，排列或順序)。例如，需要鑑定能在嚴緊條件下與本文所例舉的核酸雜交的受試核酸。
因此，對嚴緊條件的一個衡量標準是能在高度嚴緊的條件(或很嚴緊的條件，或超-高度嚴緊的雜交條件，或超-超-高度嚴緊的雜交條件)下，與所列核酸(例如核酸序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO35和SEQ ID NO72至SEQID NO78及其互補多核苷酸序列)之一雜交。對任何受試核酸而言，都可憑經驗容易地確定嚴緊條件(包括例如高度嚴緊，超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊的雜交條件)和洗滌條件。
例如，在確定高度嚴緊的雜交和洗滌條件時，可逐漸提高雜交和洗滌條件(例如通過在雜交或洗滌過程中升高溫度，降低鹽濃度，提高去汙劑濃度和/或提高有機溶劑，如福馬林的濃度)，直至達到一套選定的標準。例如，逐漸提高雜交和洗滌條件，直至探針能結合精確匹配的互補靶(該靶核酸含有一種或多種選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO35，SEQ ID NO72至SEQ IDNO78及其互補多核苷酸序列的核酸序列)，所述探針也含有一種或多種選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO35，SEQ ID NO72至SEQ ID NO78及其互補多核苷酸序列的核酸序列，此時的信號噪聲比至少2.5倍，任選5倍於或更高倍於所觀察到的探針與不匹配的靶雜交時的相應數值。此時，不匹配的靶是對應於已知α幹擾素的核酸，例如遞交本申請時，如GenBankTM的公共資料庫中存在的α幹擾素核酸。這種不匹配的靶核酸的例子包括例如具有下列GenBank登記號的核酸J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。本領域技術人員可在GenBank中鑑定其它的此類序列。人幹擾素基因和蛋白質的命名分別討論於Diaz等(1996)幹擾素和細胞因子研究雜誌，16179-180和Allen等(1996)幹擾素和細胞因子研究雜誌，16181-184，皆全文列入本文作為參考。
當受試核酸與探針核酸的雜交程度至少為探針與精確匹配的互補靶的雜交程度的1/2，即信號噪聲比至少為探針與靶雜交的1/2時，可以說受試核酸與探針核酸特異性雜交，其中在所述雜交的條件下，精確匹配的探針與精確匹配的互補靶結合，其信號噪聲比至少約2.5倍-10倍，一般5倍-10倍於所觀察到的探針與任何不匹配的靶核酸雜交時的相應數值，所述不匹配的靶核酸為具有下列GenBank登記號的核酸J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似幹擾素-α序列。
超-高度嚴緊的雜交和洗滌條件是如下所述的條件，其中提高雜交和洗滌條件的嚴緊度，直至探針與精確匹配的互補靶核酸結合的信號噪聲比至少10倍於所觀察到的探針與任何不匹配的靶核酸雜交時的相應數值，所述不匹配的靶核酸為具有下列GenBank登記號的核酸J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似IFN-α序列。如果靶核酸能在這種條件下與探針雜交，且信號噪聲比至少為精確匹配的互補靶核酸的1/2，即可以說該靶核酸與探針能在超-高度嚴緊的條件下結合。
類似地，通過逐漸提高相關雜交試驗的雜交和/或洗滌條件，可以確定甚至更高的嚴緊水平。例如，可以鑑定以下條件，其中提高雜交和洗滌條件的嚴緊度，直至探針與精確匹配的互補靶核酸結合的信號噪聲比至少10倍，20倍，50倍，100倍或500倍或更高倍於所觀察到的探針與任何不匹配的靶核酸雜交時的相應數值，所述不匹配的靶核酸為具有下列GenBank登記號的核酸J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似幹擾素-α序列。如果靶核酸能在這種條件下與探針雜交，且信號噪聲比至少為精確匹配的互補靶核酸的1/2，即可以說該靶核酸與探針能在超-超-高度嚴緊的條件下結合。
能在高度，超-高度和超-超-高度嚴緊條件下與SEQ ID NO1至SEQ IDNO35和SEQ ID NO72至SEQ ID NO78所示核酸雜交的靶核酸是本發明的特徵。所述核酸的例子包括與給定核酸序列相比，具有一個或幾個沉默或保守核酸取代的核酸。
如果在嚴緊條件下不能相互雜交的核酸所編碼的多肽基本上相同，可以認為所述核酸也基本上相同。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大程度的密碼子簡併性產生核酸拷貝時，或者當針對SEQ ID NO36至SEQ ID NO70和SEQID NO79至SEQ ID NO85中的一種或多種而產生抗血清時會出現這種情況，其中已用已知的幹擾素-α序列所編碼的多肽減除所述抗血清，所述多肽包括例如由GenBank中的下列幹擾素-α核酸序列，即GenBank登記號為J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)的核酸序列或GenBank中提供的其它類似的幹擾素-α序列所編碼的多肽。在下文中可以發現有關本發明多肽的免疫學鑑定的詳情。另外，為了區分序列小於約100個核苷酸的雙鏈體，可以使用本領域技術人員已知的TMAC1雜交法，參見例如Sorg，U等，核酸研究(1991，9，11)19(17)，其全文列入本文作為參考。
一方面，本發明提供了一種核酸，它在選自SEQ ID NO1至SEQ IDNO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78的核酸中含有獨特的亞序列。與對應於任何已知幹擾素-α核酸序列的核酸相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的，所述核酸序列包括例如具有下列GenBank登記號的已知序列J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似幹擾素-α序列。通過將SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78中的任一個與整套核酸進行序列比對，即可測定這種獨特的亞序列，所述整套核酸對應於具有例如以下GenBank登記號的已知幹擾素-α核酸序列J00210(α-D)，J00207(α-a)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似幹擾素-α序列。使用設置為預設參數的BLAST算法即可進行序列比對。任何獨特的亞序列都可用作探針以鑑定本發明的核酸。
類似地，本發明包括一種多肽，它在選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽中含有獨特的胺基酸亞序列。與已知幹擾素-α多肽序列的胺基酸亞序列相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的，所述胺基酸亞序列包括例如由對應於以下任一GenBank登記號的已知幹擾素-α核酸或GenBank中提供的其它類似的幹擾素-α核酸所編碼多肽的胺基酸亞序列J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它類似多肽序列的胺基酸亞序列。將多肽與整套已知的幹擾素-α多肽序列進行序列比對，所述多肽是例如由對應於以下GenBank登記號的核酸或GenBank中提供的其它類似幹擾素-α核酸所編碼的多肽J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，(稱為「對照多肽」)(注意當序列對應於非-翻譯序列，如假基因時，只需通過在計算機中將核酸序列翻譯成胺基酸序列即可產生相應的多肽，其中閱讀框被選定為對應於同源α幹擾素核酸的閱讀框)或GenBank中提供的其它類似多肽序列。
此外，本發明提供了靶核酸，它在至少嚴緊或高度嚴緊的條件(或較高嚴緊度的條件)下與獨特的編碼寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸編碼選自SEQ IDNO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽中的獨特亞序列，其中與GenBank中顯示的已知幹擾素-α多肽序列的胺基酸亞序列或對應於任何對照多肽的多肽相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的。按上文所述測定獨特的序列。
在一個實施例中，選擇嚴緊條件以使與編碼寡核苷酸精確互補的寡核苷酸能與編碼寡核苷酸雜交，且其信號噪聲比要比精確互補的寡核苷酸與對應於任何對照多肽的對照核酸雜交的信號噪聲比至少約高5至10倍。可選擇條件以在所使用的特定試驗中觀察到較高的信號噪聲比，例如約15倍，20倍，30倍，50倍或更高倍。在此實施例中，靶核酸與獨特的編碼寡核苷酸雜交，且其信號噪聲比要比對照核酸與編碼寡核苷酸雜交的信號噪聲比至少約高2倍。另外，可選擇較高的信號噪聲比，例如約2.5倍，約5倍，約10倍，約20倍，約30倍，約50倍或更高倍。特定的信號將取決於相關試驗所用的標記，例如螢光標記，比色標記，放射性標記等。
另一方面，本發明提供了一種多肽，該多肽在選自SEQ ID NO36至SEQID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽中含有獨特的亞序列，其中與對應於已知幹擾素-α多肽，如GenBank中提供的幹擾素-α多肽序列的多肽序列相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的。序列重組的底物和形式本發明的多核苷酸可用作多種重組和回歸重組(例如DNA改組)反應，以及其它多樣性生成技術，包括例如Ausubel，Berger和Sambrook，文獻同上所述的誘變技術和標準克隆方法中的底物，即用於產生具有所需特性的其它幹擾素-α同系物。根據所用的篩選或選擇方法，可產生並分離出重組的，例如經改組的幹擾素-α同系物多肽，所述多肽被賦予多種所需特性，例如增強的抗病毒活性，增強的抗增殖活性，針對特定靶細胞的增強的生長抑制，細胞靜止和/或細胞毒活性，降低的免疫原性等。
可以使用多種多樣性生成方法，包括核酸改組方法，這些方法在本領域中已被詳細描述。可以單獨和/或聯合使用這些方法，以產生一種核酸或一套核酸的一種或多種變體，以及所編碼蛋白質的變體。單獨和聯合使用的這些方法可提供有力的，應用廣泛的途徑來產生多樣化的核酸和核酸組合(set)(包括例如核酸文庫)，用於例如改造或快速演變出具有新的和/或改良特性的核酸，蛋白質，途徑，細胞和/或生物體。
儘管在下面將要進行的闡明性討論的過程中對方法進行了區分和分類，但應理解技術經常是相互包容的。實際上，可以單獨或聯合，平行或依次使用多種方法，以產生各種不同的序列變體。
本文所述的任何多樣性生成方法的結果可以是產生一種或多種核酸，可在其中選擇或篩選出編碼具有或賦予所需特性的蛋白質的核酸。通過本文所述的一種或多種方法，或本領域技術人員可以使用的其它方法生成多樣性之後，可在產生的任何核酸中選擇出所需活性或特性，例如增強的抗病毒活性，增強的抗增殖活性，增強的抗-血管生成活性，針對特定靶細胞的增強的生長抑制，細胞靜止和/或細胞毒活性，降低的免疫原性等。測定具有增強的抗病毒，抗增殖，生長抑制，細胞靜止和/或細胞毒活性或降低的免疫原性的核酸的方法包括本文所述的那些方法。所述方法可包括通過本領域的任何試驗，以例如自動化或可自動化的方式鑑定出可以檢測的任何活性。可根據操作人員的意見，依次或平行地評價多種相關(或甚至不相關的)特性。
下列出版物描述了多種多樣性生成方法，包括回歸重組法，和/或產生經修飾的核酸序列的方法，它們可用於本發明的方法，所述出版物包括下列出版物和其中提及的參考文獻Soong，N.W等(2000)「病毒的分子繁殖」，Nature Genetics25436-439；Stemmer，W等(1999)「用於靶向和其它臨床特性的病毒分子繁殖」，腫瘤靶向41-4；Ness等(1999)「枯草蛋白酶亞基因組序列的DNA改組」，Nature Biotechnology17893-896；Chang等(1999)「使用DNA家族改組演變細胞因子」，Nature Biotechnology17793-797；Minshull和Stemmer(1999)「通過分子繁殖進行蛋白質演變」，Current Opinionin Chemical Biology3284-290；Christians等(1999)「使用DNA家族改組定向演變AZT磷酸化所用的胸苷激酶」，Nature Biotechnology 17259-264；Crameri等(1998)「對來自多個物種的基因家族進行DNA改組可促進定向演變」，自然391288-291；Crameri等(1997)「通過DNA改組對砷酸鹽解毒途徑進行分子演變」，Nature Biotechnology15436-438；Zhang等(1997)「通過DNA改組和篩選將半乳糖苷酶定向演變為有效的巖藻糖苷酶」，Proc.Natl Acad Sci.USA 944504-4509；Patten等(1997)「DNA改組在藥物和疫苗中的應用」，Current Opinion in Biotechnology8724-733；Crameri等(1996)「通過DNA改組構建和演變抗體-噬菌體文庫」，天然藥物2100-103；Crameri等(1996)「通過使用DNA改組的分子演變改良綠色螢光蛋白」，Nature Biotechnology14315-319；Gates等(1996)「通過展示於lac阻抑物『帽子二聚體』以從肽文庫中親和選擇性地分離配體」，分子生物學雜誌255373-386；Stemmer(1996)「有性PCR和裝配PCR」，分子生物學百科全書，VCH Publishers，紐約，p447-457；Crameri和Stemmer(1995)「組合多重盒式誘變產生所有突變和野生型盒的變換」，生物技術18194-195；Stemmer等(1995)「單步驟裝配基因和整個質粒形成大量寡脫氧核糖核苷酸」，基因16449-53；Stemmer(1995)「分子算法的演變」，科學2701510；Stemmer(1995)「搜尋序列間隔」，生物技術13549-553；Stemmer(1994)「通過DNA改組在體外快速演變蛋白質」，自然370389-391；和Stemmer(1994)「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA改組體外重組以進行分子演變」，Proc.Natl Acad.Sci.USA9110747-10751。
有關DNA改組和其它多樣性生成方法的其它細節可見於下列美國專利，PCT申請和EP申請Stemmer的USPN5,605,793(1997年2月25日)，「體外重組法」；Stemer等的USPN5,811,238(1998年9月22日)，「通過重複選擇和重組產生具有所需特徵的多核苷酸的方法」；Stemmer等的USPN5,830,721(1998年11月3日)，「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA誘變」；Stemmer的USPN5,834,252(1998年11月10日)，「末端互補的聚合酶反應」；Minshull的USPN5,837,458(1998年11月17日)，「細胞和代謝工程的方法和組合物」；WO95/22625，Stemmer和Crameri，「通過隨機片段化和重新裝配進行誘變」；WO96/33207，Stemmer和Lipschutz，「末端互補的聚合酶鏈反應」；WO97/20078，Stemmer和Crameri，「通過重複選擇和重組產生具有所需特徵的多核苷酸的方法」；WO97/35966，Minshull和Stemmer，「細胞和代謝工程的方法和組合物」；WO99/41402，Punnonen等，「基因疫苗載體的靶向」；WO99/41383，Punnonen等，「抗原文庫免疫」；WO99/41369，Punnonen等，「基因疫苗載體工程」；WO99/41368，Punnonen等，「基因疫苗免疫調製特性的最優化」；EP752008，Stemmer和Craneri，「通過隨機片段化和重新裝配進行DNA誘變」；EP0932670，Stemmer，「通過回歸序列重組改變細胞DNA攝入」；WO99/23107，Stemmer等，「通過病毒基因組改組修飾病毒嗜性和宿主範圍」；WO99/21979，Apt等，「人乳頭瘤病毒載體」；WO98/31837，Del Cardayre等，「通過回歸序列重組改變整個細胞和生物體」；WO98/27230，Patten和Stemmer，「多肽工程的方法和組合物」；EP0946755，Patten和Stemmer，「多肽工程的方法和組合物」；和WO98/13487，Stemmer等，「通過回歸序列改組和選擇最優化基因治療的方法」；WO00/00632，「產生高度多樣性文庫的方法」；WO00/09679，「獲得經體外重組的多核苷酸序列庫的方法和所得序列」；WO98/42832，Arnold等，「使用隨機或確定的引物重組多核苷酸序列」；WO99/29902，Arnold等，「產生多核苷酸和多肽序列的方法」；WO98/41653，Vind，「構建DNA文庫的體外方法」；WO98/41622，Borchert等，「使用DNA改組構建文庫的方法」；和WO98/42727，Pati和Zarling，「使用同源重組改變序列」。
某些美國申請提供了有關DNA改組和相關技術以及其它多樣性生成方法的其它細節，這些申請包括Patten等於1998年9月29日(USSN60/102,362)，1999年1月29日(USSN60/117,729)和1999年9月28日提交的「改組密碼子有所改變的基因」；Del Cardayre等於1998年7月15日(USSN09/166,188)和1999年7月15日(USSN 09/354,922)提交的「通過回歸序列重組改變整個細胞和生物體」；Crameri等於1999年2月5日(USSN60/118,813)，1999年6月24日(USSN60/141,049)和1999年9月28日(USSN09/408,392)提交的「寡核苷酸介導的核酸重組」；Welch等於1999年9月28日(USSN 09/408,393)提交的「使用基於密碼子的寡核苷酸合成進行合成改組」；Selifonov和Stemmer於1999年2月5日(USSN 60/118854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)提交的「製備具有所需特性的特徵鏈，多核苷酸和多肽的方法」；Patten等於1999年3月5日(USSN 60/122,943)，1999年7月2日(USSN 60/142,299)，1999年11月10日(USSN60/164,618)和1999年11月10日(USSN 60/164,617)提交的「重組插入的經修飾核酸」；和Affholter於2000年3月2日提交的USSN60/186,482「單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離」。
正如上述出版物，專利，公開的外國申請和美國專利申請的評論所揭示的，可通過多種已建立的方法實施多樣性生成方法，例如改組(或「回歸(recursive)重組」)核酸以提供具有所需特性的新核酸。這些方法中的任一種都適用於本發明，可用於形成本文所討論的α幹擾素，產生具有新特性或改良特性的新α幹擾素同系物。兩種製備通過這些方法產生的上述幹擾素(如IFN同系物)的方法也是本發明的特徵。簡單地說，幾種不同大類別的序列修飾方法，如重組可用於本發明，這些方法描述於例如上述參考文獻中。首先，可在體外通過上述參考文獻中討論的多種技術中的任一種重組核酸，包括例如用DNA酶消化待重組的核酸，然後連接和/或通過PCR重新裝配核酸。第二，通過例如使細胞申的核酸之間發生重組，在體內或來自體內地回歸重組核酸。第三，可以使用全基因組重組法，其中細胞或其它生物體的完整基因組被重組，任選包括摻加具有所需文庫成分(例如對應於本發明途徑的基因)的基因組重組混合物。第四，可使用合成重組法，其中在PCR或連接反應中合成和重裝配對應於所需靶的寡核苷酸，從而產生新的重組核酸，所述寡核苷酸包括對應於一個以上親代核酸的寡核苷酸。可通過標準的核苷酸添加法，或通過例如三-核苷酸合成法製備寡核苷酸。第五，可實施in silico重組法，其中在計算機中使用遺傳學算法，以重組對應於同源(或甚至非-同源)核酸的序列鏈。任選通過合成對應於重組序列的核酸，例如聯合使用寡核苷酸合成/基因重裝配技術，而將所得重組序列鏈轉變為核酸。可以重複進行上述一般性重組方式中的任一種，以產生一套更具多樣性的重組核酸。第六，可以使用增加天然多樣性的方法，例如通過使各種各樣的核酸或核酸片段與單鏈模板雜交，接著聚合化和/或連接以再生出全長序列，任選地，再降解模板並回收所得的經修飾核酸。上述參考文獻提供了這些和其它基本的重組形式以及基於這些形式的多種經改動方法。無論所用的重組形式如何，本發明的核酸可以(互相，或與相關(或甚至不相關)的核酸)重組，以產生一套具備多樣性的重組核酸，包括例如同源核酸。一般說來，本文所述的序列重組技術提供了特別的好處，因為它們使SEQ ID NO1至SEQ ID NO35和SEQ IDNO72至SEQ ID NO78，或其片段或變體之間能以任何可以使用的方式進行重組，從而提供了一種非常快速的方法，用以研究不同的序列組合影響所需結果的方式。
重組之後，可以在所產生的任何核酸中篩選或選擇所需活性。在本發明的上下文中，包括通過任何本領域已知的試驗，例如以可自動化的方式檢測和鑑定可以測出的任何活性。另外，也可選擇以下有用的特性，如低免疫原性，增加的半壽期，改善的溶解性，可口服的特性等。可以使用任何可用的試驗來檢測多種α-幹擾素相關(或甚至不相關)的特性。
DNA誘變和改組提供了有力的，可廣泛使用的方法用以產生多樣性，所述多樣性可用於改造出具有改良特性的蛋白質，途徑，細胞和生物。除了上述基本方法外，有時還需要聯合使用改組方法學和其它產生多樣性的技術。多種多樣性生成方法可與改組方法聯合使用(或與之分開使用)，並且可在本發明的系統中篩選結果(即各種各樣的核酸群體)。通過可導致各個核苷酸或鄰接或不鄰接的核苷酸組發生變化的方法，即誘變方法，可以導入其它的多樣性。多種誘變方法描述於上述參考文獻中；有關誘變方法的其它細節可參見下列參考文獻。
產生多樣性的誘變方法包括例如重組(PCT/US98/05223；公開號WO98/42727)；定點誘變(Ling等(1997)″Approaches to DNA mutagenesisanoverview，″Anal.Biochem.254(2)157-178；Dale等(1996)″Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod，″Methods Mol.Biol.57369-374；Smith(1985)″In vitro mutagenesis，″Ann.Rev.Genet.19423-462；Botstein Shortle(1985)″Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，″Science 2291193-1201；Carter(1986)″Site directed mutagenesis，″Biochem.J.2371-7；和Kunkel(1987)″Theefficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，″Nucleic Acids MolecularBiology(Eckstein，F和Lilley，D.M.J編，Springer Verlag，Berlin))；使用含尿嘧啶的模板的誘變(Kunkel(1985)″Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection，″Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)″Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection，″Results Probl.Cell Differ.154，367-382；和Bass等(1988)″Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities，″Science 242240-245)；寡核苷酸介導的誘變(Results Probl.Cell Differ.100468-500(1983)；Results Probl.Cell Differ.154329-350(1987)；Zoller Smith(1982)″Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectorsan efficient and generalprocedure for the production of point mutations in any DNA fragment，″NucleicAcids Res.106487-6500；Zoller Smith(1983)″Oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，″Results Probl.CellDiffer.100468-500；和Zoller Smith(1987)″Oligonucleotidedirectedmutagenesisa simple method using two oligonucleotide primers and a singlestranded DNA template，″Results Probl.Cell Differ.154329-350)；硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等(1985)″The use of phosphorothioate-modified DNAin restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，″Nucl.Acids Res.138749-8764；Taylor等(1985)″The rapid generation of oligonucleotide-directedmutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，″Nucl.AcidsRes.138765-8787(1985)；Nakamaye Eckstein(1986)″Inhibition ofrestriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and itsapplication to oligonucleotide-directed mutagenesis，″Nucl Acids Res.149679-9698；Sayers等(1988)″Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis，″Nucl.Acids Res.16791802；和Sayers等(1988)″Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA byreaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，″NuclAcids Res.16803-814)；使用缺口雙鏈體DNA的誘變(Kramer等(1984)″Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，″Nucl.Acids Res.129441-9456；Kramer Fritz(1987)″Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA，″Results Probl.CellDiffer.154350-367；Kramer等(1988)″Improved enzymatic in vitroreactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，″Nucl.Acids Res.167207；和Fritz等(1988)″Oligonucleotide-directed construction of mutationsa gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro，″Nucl.Acids Res.166987-6999)。
其它適當的方法包括點錯配修復(Kramer等(1984)″Point MismatchRepair，″Cell 38879-887)，使用修復-缺損宿主株的誘變(Carter等(1985)″Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，″Nucl.Acids Res.134431-4443；和Carter(1987)″Improved oligonucleotide-directedmutagenesis using M13 vectors，″Results Probl.Cell Differ.154382-403)，缺失誘變(Eghtedarzadeh Henikoff(1986)″Use of oligonucleotides to generate largedeletions，″Nucl.Acids Res.145115)，限制性-選擇和限制性-選擇與限制性-純化(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing thetransition state of subtilisin，″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317415-423)，通過總基因合成進行誘變(Nambiar等(1984)″Total synthesis and cloning of a genecoding for the ribonuclease S protein，″Science2231299-1301；Sakamar和Khorana(1988)″Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducing)，″Nucl.Acids Res.146361-6372；Wells等(1985)″Cassette mutagenesisan efficientmethod for generation of multiple mutations at defined sites，″Gene34315323；和Grundstrom等(1985)″Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，″Nucl.Acids Res.133305-3316)，雙鏈斷裂修復(Mandecki(1986)″Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia colia method for site-specific mutagenesis，″Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，837177-7181)。有關多種上述方法的其它細節可參見Methods in Enzymology，Vol.154，其中還描述了對多種誘變方法中令人心煩的問題的有用控制手段。
也可利用使用添加或簡併寡核苷酸的隨機或半-隨機誘變(Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets ofamino acids for semi-random mutagenesis，″Biotechnology 10297300；Reidhaar-Olson等(1991)″Random mutagenesis of protein sequences usingoligonucleotide cassettes，″Methods Enzvmol.208564-86；Lim和Sauer(1991)″The role of internal packing interactions in determining the structure and stabilityof a protein，″J.Mol.Biol.219359-76；Breyer和Sauer(1989)″Mutationalanalysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 51F to lambdarepressor，″J.Biol.Chem.26413355-60)；「步移誘變」(Crea，R；美國專利5,830,650和5,798,208，和EP專利0527809B1)產生多樣性。
在本發明的一個方面，可使用易錯PCR產生核酸變體。使用該技術，在DNA聚合酶的拷貝保真性低的條件下進行PCR，使得沿著全長PCR產物可獲得高頻率的點突變。這種技術的例子可參見上述參考文獻，例見Leung等(1989)Technique111-15和Caldwell等(1992)PCR Methods Applic.228-33。類似地，在涉及由小DNA片段的混合物裝配PCR產物的方法中，可以使用裝配PCR。可以在相同的小管中平行進行多個不同的PCR反應，用一個反應的產物引發另一個反應的產物。可以使用有性(Sexual)PCR誘變，其中通過基於序列同源性使DNA分子隨機片段化，接著在PCR反應中通過引物延伸進行交換固定，而在體外在不同的，但DNA序列相關的DNA分子之間發生同源重組。該方法描述於上述參考文獻，例見Stemmer(1994)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 9110747-10751。可以使用回歸集團(ensemble)誘變，其中使用蛋白質誘變算法產生表型相關突變體的多樣性群體，所述群體成員的胺基酸序列有所不同。該方法使用反饋機制控制連續多輪組合盒式誘變。該方法的例子見於Arkin Youvan(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA897811-7815。
如上所述，在允許在任何感興趣的核酸序列中產生位點-特異性突變的方法中可以使用寡核苷酸介導的誘變。這種技術的例子可參見上述參考文獻，例如Reidhaar-Olson等(1988)Science，24153-57。類似地，可在用合成的寡核苷酸盒替代雙鏈DNA分子的小區域的方法中使用盒式誘變，所述寡核苷酸盒不同於天然序列。寡核苷酸可含有例如完整的和/或部分隨機化的天然序列。
體內(或來自體內的)誘變可用於在任何克隆的所需DNA中產生隨機突變的方法，所述方法包括在例如大腸桿菌菌株中增殖DNA，所述菌株的一個或多個DNA修復途徑攜有突變。相對於野生型親代而言，這些「增變株」具有較高的隨機突變率。在其中一個菌株中增殖DNA最終將在DNA內產生隨機突變。
可以使用指數集團誘變以產生具有高百分比的特有、功能性突變體的組合文庫，其中一小組殘基被平行地隨機化，以鑑定出每個有所變化的位置處導致產生功能性蛋白質的胺基酸。這種方法的例子可參見Delegrave Youvan(1993)Biotechnology Research 111548-1552。類似地，可以使用隨機和定點誘變。這種方法的例子可參見Arnold(1993)Current Opinion in Biotechnology4450-455。
用於誘變，文庫構建和其它多樣性生成方法的試劑盒也是可以商購的。例如，試劑盒可購自例如Stratagene(如QuickChangeTM定點誘變試劑盒；和ChameleonTM雙鏈，定點誘變試劑盒)，Bio/Can Scientific，Bio-Rad(例如使用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.，Clonetech Laboratories，DNATechnologies，Epicentre Technologies(如5prime 3prime試劑盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs，PharmaciaBiotech，Promega Corp.，Quantum Biotechnologies，Amersham Intemational plc(例如使用上述Eckstein法)和Anglian Biotechnology Ltd(例如使用上述Carter/Winter法)。
任何所述的改組或誘變技術可以與在基因組中導入其它多樣性的方法聯合使用，所述基因組如細菌，真菌，動物或植物基因組。例如，除了上述方法外，還建議使用能產生嵌合核酸多聚體的技術，所述多聚體適於轉化至多個物種(參見例如Schellenberger美國專利5,756,316和上述參考文獻)。當這種嵌合多聚體由彼此趨異(例如由天然多樣性或使用定點誘變，易錯PCR，誘變細菌菌株途徑等產生)的基因組成，並轉化至適當宿主時，可以提供核酸多樣性來源以使DNA多樣化。
轉化至宿主物種的嵌合多聚體適於用作體內(或來自體內的)改組方法的底物。或者，可將共享部分序列相似性或同源性區域的多種多核苷酸轉化至宿主物種，並由宿主細胞在體內(或來自體內地)進行重組。可以使用接下來的多輪細胞分裂產生文庫，所述文庫的成員含有單一，均勻的單體或集中的核酸群體。或者，可通過標準技術回收單體核酸，並以任何所述改組方法進行回歸重組。
也建議使用能生成多樣性的鏈終止法(參見例如美國專利5965408和上述參考文獻)。在此方法中，在存在或缺乏基因特異性引物時，使對應於一種或多種基因的雙鏈DNA混合併變性，所述基因共享序列相似性或同源性區域。然後退火單鏈多核苷酸，並在聚合酶和鏈終止試劑(如紫外線，γ或X射線照射；溴化乙錠或其它嵌入劑；DNA結合蛋白，如單鏈結合蛋白，轉錄激活因子或組蛋白；多環芳烴；三價鉻或三價鉻鹽；或由快速熱循環介導的短縮聚合作用等)的存在下保溫，導致產生部分雙鏈體分子。然後在接下來的多輪複製或部分複製中變性和重新退火部分雙鏈體分子，例如含有部分延伸鏈的所述分子，導致產生多核苷酸，所述多核苷酸共享不同程度的序列相似性或同源性，並且就最初的DNA分子群體而言為嵌合的多核苷酸。任選地，可在該方法的一個或多個階段擴增產物或產物的部分收集物。通過例如上述鏈終止法產生的多核苷酸是根據任一種所述形式的多樣性生成方法(例如RSR，DNA改組)的適當底物。
通過使用不基於同源性的方法和DNA改組(如上述出版物和申請所述，它可以基於同源性或不基於同源性，這取決於確切的形式)可進一步增加多樣性。例如，可以使用Ostermeier等(1999)″A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNA homology″Nature Biotech.171205中描述的用於產生雜合酶的增量截短(ITCHY)產生最初的重組文庫，該文庫可用作一輪或多輪體外，來自體內或體內多樣性生成方法(例如RSR或改組方法)的底物。
已描述了產生多物種表達文庫的方法(例如美國專利5,783,431；5,824,485和上述參考文獻)，有人提出這些方法可用於鑑定所需的蛋白質活性(美國專利5,958,672和上述參考文獻)。一般說來，多物種表達文庫含有來自多個物種或菌株的cDNA或基因組序列，所述序列在表達盒中與適當的調節序列可操作相連。任選將cDNA和/或基因組序列隨機串聯以進一步增加多樣性。載體可以是適於轉化不止一種宿主生物，如細菌物種，真核細胞並在其中表達的穿梭載體。在一些情況下，通過預先選擇編碼所需蛋白質，或與所需核酸雜交的序列而使文庫具有偏倚性。任何此類文庫都可成為本文所述任何方法的底物。
在一些申請中，在改組之前需要預先選擇或預先篩選文庫(例如擴增的文庫，基因組文庫，cDNA文庫，歸一化文庫等)或其它底物核酸，或者使底物偏向於編碼功能性產物的核酸(改組方法本身也具有這些效果)。例如，在對抗體進行改造時，可以在通過任何所述方法生成多樣性(例如DNA改組)之前，利用體內(或來自體內或體外)重組事件使改組方法偏向於具有功能性抗原結合位點的抗體。例如，在根據本文所述任何方法生成多樣性(例如DNA改組)之前，可以擴增得自B細胞cDNA文庫的重組CDR，並將其裝配至框架區域(例如Jirholt等(1998)″Exploiting sequence spaceshuffling in vivo formedcomplementarity determining regions into a master framework，″Gene 215471)。
文庫可以偏向編碼具有所需活性(例如結合親和性，酶活性，抗病毒活性，誘導免疫應答的能力，抗增殖活性，佐劑特性等)的蛋白質的核酸。例如，從文庫中鑑定出具有特定活性的克隆之後，可使用任何已知的導入DNA變化的方法誘變克隆，所述方法包括但不限於DNA改組或其它形式的回歸序列重組或多樣性生成法。然後在含有經誘變的同系物的文庫中篩選所需活性，所述活性可以與最初的特定活性相同或不同。這種方法的一個例子可參見美國專利5,939,250。可通過本領域已知的任何方法鑑定所需活性。例如，WO99/10539提到通過混合基因文庫的提取物與得自代謝旺盛細胞的組分，並鑑定表現出所需活性的組合，即可篩選基因文庫。也有人提出(例如WO98/58085)通過將具有生物活性的底物插入文庫樣品，並使用螢光分析儀，例如流式細胞儀，CCD，螢光計或分光光度計檢測對應於具有所需活性之產物的生物活性螢光，即可鑑定出具有所需活性的克隆。
文庫也可偏向具有特定特徵的核酸，例如與選定的核酸探針雜交的核酸。例如，申請WO99/10539提出可以按下述方法從基因組DNA序列中鑑定出編碼所需活性(例如酶活性，如脂肪酶，酯酶，蛋白酶，糖苷酶，糖基轉移酶，磷酸酶，激酶，加氧酶，過氧化物酶，水解酶，水合酶，腈水解酶，轉氨酶，醯胺酶或醯基轉移酶)的多核苷酸。使基因組DNA群體中的單鏈DNA分子同與配體-綴合的探針雜交。基因組DNA可得自經培養或未經培養的微生物，或得自環境樣品。或者，基因組DNA可得自多細胞生物或其組織。
可以直接由捕獲中所用的雜交探針進行第二鏈的合成，所述探針預先可以從捕獲介質上釋放，也可以不釋放，或者也可通過本領域已知的多種其它策略合成第二鏈。或者，可以使分離的單鏈基因組DNA群體片斷化，而不進行進一步的克隆，並將它們直接用於基於-改組的基因重裝配方法。在一種此類方法中，使得自基因組文庫的片斷群體與對應於相反鏈的部分，或經常是約全長的ssDNA或RNA退火。由該群體裝配複雜的嵌合基因是由基於核酶除去未雜交的片斷末端，聚合化以補平這些片斷之間的缺口，隨後進行單鏈連接來介導的。通過消化(如果是RNA或含有尿嘧啶)，在變性條件下進行磁分離(如果以有助於這種分離的方式標記)或其它可以使用的分離/純化方法，即可除去親代鏈。或者，任選將親代鏈與嵌合鏈一起純化，在隨後的篩選和加工步驟中再除去親代鏈。如Affholter(USSN60/186,482，2000年3月2日提交)的″Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination andnucleic acid fragment isolation″，以及Patten和Stemmer的WO98/27230，″Methods and Compositions for Polypeptide Engineering″所述，也可進行使用單鏈模板和所需核酸的改組，其中所述核酸與模板的一部分結合。
在一種方法中，單鏈分子被轉變為雙鏈DNA(dsDNA)，dsDNA分子通過配體-介導的結合與固體支持物結合。分離出未結合的DNA之後，從支持物上釋放選定的DNA分子，並將其導入適當宿主細胞以產生能與探針雜交的文庫富集序列。按照此方法產生的文庫為本文所述的任何改組反應提供了合乎需要的底物。
產生核酸和多肽的「非-隨機」方法描述於Short，J.″Non-StochasticGeneration of Genetic Vaccines and Enzymes″WO00/46344。包括提出的非-隨機多核苷酸重裝配和基因位點飽和誘變的此類方法，以及本文所述的合成連接多核苷酸重裝配法也可用於本發明。
易於理解的是適用於在多樣化之前富集文庫的上述任何技術也可用於篩選通過多樣性生成法產生的產物或產物文庫。
通過回歸重組本發明的一種或多種多核苷酸與一種或多種其它核酸而產生的重組核酸也構成本發明的一部分。一種或多種其它核酸可包括本發明的另一種多核苷酸；任選地，或者，或另外，一種或多種其它核酸可包括例如編碼天然幹擾素-α或其亞序列，或任何同源的幹擾素-α序列或其亞序列，或幹擾素-β序列或其亞序列(例如GenBank或其它可獲得的文獻中描述的幹擾素-α或幹擾素-β序列)的核酸，或者例如任何其它同源或非同源的核酸(上述某些重組形式，特別是用合成或in silico方法進行的重組不需要同源性)。
如上述參考文獻中詳細描述的那樣，重組步驟可在體內，來自體內，體外或in silico中進行。本發明還包括含有任何所得重組核酸的細胞，通過多樣性生成，重組或回歸重組本文所述的核酸而產生的核酸文庫，含有所述文庫或含有任何重組核酸的細胞群體，載體，病毒，質粒等，其中所述重組核酸是通過多樣性生成或重組(或回歸重組)本文所述的核酸與另一種此類核酸或其它核酸而產生的。計算機系統或計算機可讀介質中存在的資料庫中的相應序列鏈也是本發明的特徵。其它多核苷酸組合物本發明還包括含有兩種或多種本發明的多核苷酸的組合物(例如用作重組底物)。組合物可含有重組核酸文庫，其中文庫含有至少2，3，5，10，20或50或更多種核酸。任選將核酸克隆至表達載體，提供表達文庫。
本發明還包括通過用限制性內切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一種或多種本發明的多核苷酸(在上述某些重組形式中進行)而產生的組合物；和通過用機械方式(例如超聲處理，渦旋等)片斷化或剪切一種或多種本發明的多核苷酸而產生的組合物，該組合物也可在上述方法中用於提供重組底物。類似地，含有多套對應於一種以上本發明核酸的寡核苷酸的組合物也可用作重組底物，並且也是本發明的特徵。為了方便起見，將這些經片斷化，剪切或寡核苷酸合成的混合物稱為片斷化的核酸套。
本發明還包括通過在核糖核苷酸-或脫氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶的存在下保溫一種或多種片斷化的核酸套而產生的組合物。所得組合物形成重組混合物，可用於上述多種重組形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-介導的DNA聚合酶(例如「逆轉錄酶」)；聚合酶可以是例如熱穩定的DNA聚合酶(例如VENT，TAQ等)。幹擾素同系物多肽本發明提供了分離或重組的幹擾素-α同系物多肽，本文也稱之為「幹擾素-α同系物」或「幹擾素同系物」或「IFN-α同系物」或「IFN同系物」。本發明的分離或重組的幹擾素同系物多肽包括含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70和SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的序列的多肽，及其經保守修飾的變體，及其片斷，所述片斷在例如基於人Daudi細胞系的試驗(或其它類似試驗)中具有抗增殖活性，和/或在例如基於鼠細胞系/EMCV的試驗(或其它類似試驗)中具有抗病毒活性。圖1提供了例舉的本發明幹擾素同系物多肽序列的序列比對。本領域技術人員使用公共資料庫和序列比對程序可以容易地將本發明的多肽序列互相比對，或與已知的天然幹擾素-α序列進行比對。
本發明還提供了一種多肽，其含有SEQ ID NO36-70或SEQ ID NO71中任一種的至少約100，120，130，140，150，155，160，163，165或166個連續的胺基酸。一方面，所述胺基酸序列含有胺基酸Lys160和Glu166，其中序列中的胺基酸編號與SEQ ID NO36中的一一對應。
將例舉的本發明序列(圖1)與源自人和非人的已知的天然幹擾素-α和其它I型幹擾素(包括β，δ，ω，τ-幹擾素)序列相比較，可以得出幾個結論。這些序列可以容易地得自多個來源，如GenBank和網址為http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.Shtml的Pfam(蛋白質家族)資料庫。
需特別說明的是在本發明的一些幹擾素同系物多肽序列中存在下列胺基酸殘基(表示為「I組」殘基)，這些殘基不會出現在已知的天然人或非人I型幹擾素序列的等同位置上。
I組Asp11；Pro14；Arg50；Phe55；Asp75；Asn80；Pro111；Leu124；Glu134；Ser140和Ala143；殘基編號對應於SEQ ID NO36中鑑定的成熟幹擾素同系物序列。
需特別說明的是在本發明的一些幹擾素同系物多肽序列中存在下列胺基酸殘基(表示為「II組」殘基)，這些殘基不會出現在已知的天然人幹擾素-α亞型序列的等同位置上。
II組Pro9；(Lys，Ser)12；(Thr，Val)24；Gln34；Arg40；Ser45；Arg47；Leu56；Ile60；Phe67；Ala79，Gly88；His90；Arg91；Glu95；Val101；(Gly，Ala)104；Val112；Gly114；Pro116；Lys133和His136。
在其它實施方案中，幹擾素同系物多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少20，50，100，150，155或160或更多個連續的胺基酸，和/或下列一個或多個胺基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於SEQ IDNO36中的編號，或下列一個或多個胺基酸Pro9，(Lys或Ser)12，(Thr或Val)24，Gln34，Arg40，Ser45，Arg47，Leu56，Ile60，Phe67，Ala79，Gly88，His90，Arg91，Glu95，Val101，(Gly，Ala)104，Val112，Gly114，Pro116，Lys133和His136，其中所述多肽序列中的胺基酸編號對應於SEQ ID NO36的胺基酸序列中每個胺基酸的編號。因此，例如，在此實施方案中，幹擾素多肽含有胺基酸序列，該序列在序列的第9位胺基酸處含有脯氨酸殘基，在第12位含有賴氨酸或絲氨酸殘基，在第24位含有蘇氨酸或纈氨酸殘基，在第34位含有穀氨醯胺殘基，在第40位含有精氨酸殘基等。這種多肽在基於人Daudi細胞系的增殖試驗中表現出抗增殖活性(例如至少約為8.3×106個單位/mg)，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中表現出抗病毒活性(至少約為2.1×107個單位/mg)。一些這種多肽結合人α幹擾素受體。一些這種多肽的長度為166個胺基酸。另一方面，這種多肽可含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO54中任一個的序列。
本發明的任何多肽的抗增殖活性一般與多肽導致細胞或其部分生長或快速地，經常重複地產生新的細胞生長的能力相關。
本發明還包括多肽(例如SEQ ID NO36-71或SEQ ID NO79-85中的任一個)或編碼多肽的核酸(例如SEQ ID NO1-35或SEQ ID NO72-78中的任一個)，其中通過本領域技術人員眾所周知的抗-血管生成試驗測定，所述多肽具有抗-血管生成活性。
本發明還包括(a)含有上述一個或多個I組胺基酸殘基的任何幹擾素-α多肽。
(b)在人樣幹擾素序列(即與人幹擾素顯示出高水平的相似性或同源性的序列)，或與所附序列表中列出的任何序列或其片斷高度相似或同源(即具有至少約為80％，90％，95％，96％，97％，98％或更高的序列同源性或序列同一性百分比)之序列的上下文中含有上述一個或多個II組胺基酸殘基的任何幹擾素-α多肽。
(c)含有下列殘基組合的任何幹擾素-α多肽，所述殘基位於或接近已知或被認為與I型幹擾素受體相互作用的幹擾素-α分子區域，其中所述序列組合(基元)不會出現在任何已知的天然人或非人I型幹擾素的等同位置上(i)(Tyr或Gln)34；加上Ile132或Arg134中的一個或多個；或(ii)Asp78，Glu79或(Asp或Thr)80；加上Ile132或Arg134中的一個或多個。
在另一個實施方案中，本發明提供了含有SEQ ID NO71所示序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S；或所述SEQ ID NO71的片斷的幹擾素α同系物。另一方面，SEQ ID NO71的幹擾素同系物多肽或其片斷在基於人Daudi細胞系的增殖試驗中表現出抗增殖活性(至少約為8.3×106個單位/mg)，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中表現出抗病毒活性(至少約為2.1×107個單位/mg)。下文將詳細討論這兩種試驗。這種多肽可含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO54的胺基酸序列，或者可以由選自SEQ IDNO1至SEQ ID NO19的核苷酸序列編碼。
本文所述的幹擾素同系物多肽的片斷也是本發明的特徵。本發明的幹擾素α同系物片斷一般含有幹擾素同系物多肽，其含有SEQ ID NO36-71或SEQID NO79-85中任一個的至少約20，25或30，一般至少約40，50，60，70，80，90或100個連續的胺基酸。在其它實施方案中，片斷通常含有SEQID NO36-71或SEQ ID NO79-85中任一個的至少約100，110，120，125，130，140，150，155，158，160，162，163，164或165個連續的胺基酸。這種多肽片斷在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性，和/或在基於人或鼠細胞系/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
在其它實施方案中，本發明提供了長度為166個胺基酸的多肽，在一些此類實施方案中，所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗(或其它類似試驗)中具有抗增殖活性，包括例如至少約為8.3×106個單位/mg，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗(或其它類似試驗)中具有抗病毒活性，包括例如至少約為2.1×107個單位/mg。
在其它實施方案中，本發明提供了多肽，其含有由編碼多核苷酸序列編碼的蛋白質的至少100，150，155或160個連續的胺基酸，所述編碼多核苷酸序列含有下列中的任一個(a)SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ IDNO72至SEQ ID NO78；(b)編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQID NO79至SEQ ID NO85中任一個的第一多肽的編碼多核苷酸序列；和(c)在至少高度嚴緊(或超-高度嚴緊或超-超-高度嚴緊條件)的雜交條件下，與基本上全長的(a)或(b)的多核苷酸序列雜交的互補多核苷酸序列。這種多肽在基於人Daudi細胞系的試驗(或其它類似試驗)中具有抗增殖活性，和/或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗(或其它類似試驗)中具有抗病毒活性。本發明的一些這種多肽特異性地結合人α幹擾素受體。本發明的多肽和核酸不必與靶分子或相關分子，包括SEQ ID NO36-71中任一個的多肽或其片斷(包括在本文所述的試驗中具有抗病毒或抗增殖活性的那些)，或SEQ ID NO1-35中任一個的核酸或其片斷(包括在本文所述的試驗中具有抗病毒或抗增殖活性的那些)的相應序列相同，但可以與其基本上相同。可以對多肽進行多種改變，如保守或非保守性地插入，缺失和取代，其中這種改變可為其使用提供好處。可以用多種方法修飾本發明的多肽，只要它們含有與天然或已知幹擾素多肽分子的序列基本上相同(如下文所定義)，或與該序列具有一定百分比的同一性的序列即可。
比對和比較相對較短的胺基酸序列(少於約30個殘基)一般是容易的。比較較長的序列需要更複雜的方法來獲得兩種序列的最佳比對。通過Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol48443的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l Acad.Sci.(USA)852444的相似性檢索法，通過用計算機運行這些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過檢查可以進行比對比較窗口的最佳序列比對，選擇通過多種方法產生的最佳比對(即導致比較窗口中的序列相似性百分比最高)。
術語序列同一性指的是在比較窗口中兩個多核苷酸序列是相同的(即在核苷酸緊接核苷酸的基礎上)。術語「序列同一性百分比」是通過以下方法計算的，即在比較窗口內比較兩個最佳比對的序列，測定兩個序列中出現相同殘基的位置數以產生匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗口中的位置總數(即窗口大小)，將結果乘以100，即得出序列同一性百分比。一方面，本發明提供了幹擾素同系物核酸，它與SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ IDNO72至SEQ ID NO78中任一個的核酸或其片斷具有至少約為80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高百分比的序列同一性。
當用於多肽時，術語基本上相同指的是當通過例如使用預設缺口加權值(下文將會詳細描述)的程序GAP或BESTFIT進行最佳比對時，兩個肽序列享有至少約80％的序列同一性，優選至少約90％的序列同一性，更優選至少約95％的序列同一性或更高(如97，98或99％的序列同一性)。優選地，通過保守的胺基酸取代使不同的殘基位置有所不同。保守的胺基酸取代指的是具有類似側鏈的殘基的可互換性。例如，一組具有脂肪族側鏈的胺基酸是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側鏈的胺基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含醯胺側鏈的胺基酸是天冬醯胺和穀氨醯胺；一組具有芳香族側鏈的胺基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；一組具有鹼性側鏈的胺基酸是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；一組具有含硫側鏈的胺基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守胺基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸和天冬醯胺-穀氨醯胺。一方面，本發明提供了幹擾素同系物多肽，它與SEQ ID NO36-71或SEQID NO79-85中任一個的多肽或其片段具有至少約為80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高百分比的序列同一性。
適於測定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優選例子是FASTA算法，它描述於Pearson，W.R.Lipman，D.J.，1988，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA852444。也可參見W.R.Pearson，1996，Methods Enzymol.266227-258。在計算同一性百分比的DNA序列FASTA比對中使用的優選參數被最優化，BL50矩陣15-5，k-tuple＝2；連接罰分＝40，最優化＝28；缺口罰分-12，缺口長度罰分＝-2；和寬度＝16。
另一種適於測定序列同一性百分比和序列相似性的算法的優選例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述於Altschul等，1977，Nuc.Acids Res.253389-3402和Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410。使用具有本文所述參數的BLAST和BLAST2.0以測定本發明核酸和蛋白質的序列同一性百分比。公眾可以從National Center for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得進行BLAST分析的軟體。該算法包括首先通過鑑定詢問序列中長度W的短字節(word)來鑑定高評分的序列對(HSP)，當與資料庫序列中相同長度的字節進行比對時，所述HSP可以匹配或吻合於部分正數閾值T。T被稱為相鄰字節評分閾值(Altschul等，文獻同上)。這些原始相鄰字節熱點(hit)可以用作線索來啟動檢索，以發現含有它們的較長HSP。熱點字節沿著每個序列在兩個方向上延伸，直到增加累積的比對評分。對核苷酸序列而言，可使用參數M(一對匹配殘基的獎分；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算累積評分。對胺基酸序列而言，使用評分矩陣來計算累積評分。當出現下列情況時，停止在每個方向上延伸熱點字節與其可達到的最大值相比，累積比對評分下降量為X；由於一個或多個評分為負值的殘基比對的積累，累積評分為零或低於零；或者已到達序列的末端。BLAST算法參數W，T和X能測定序列比對的敏感性和速度。BLASTN程序(針對核苷酸序列)使用以下預設值字長(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，並對兩條鏈都進行比較。對於胺基酸序列而言，BLASTP程序使用以下預設值字長為3，期望值(E)為10，BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff Henikoff(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.8910915)序列比對(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，並對兩條鏈都進行比較。
BLAST算法也對兩個序列之間的相似性進行統計學分析(參見例如Karlin Altschul(1993)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.905873-5787)。BLAST算法提供的一個相似性測量值是最小總和可能性(P(N))，它提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的可能性的指示。例如，如果在比較受試核酸與參照核酸時發現最小總和可能性低於約0.2，更優選低於約0.01，最優選低於約0.001，則可認為核酸與參照序列相似。
有用算法的另一個例子是PILEUP。PILEUP使用漸進的成對序列比對由一組相關序列產生多個序列比對，以顯示關係和序列同一性百分比。該算法也能繪製樹形圖，顯示用於產生序列比對的群集關係。PILEUP使用Feng Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360所述漸進序列比對法的簡化方法。所用方法類似於Higgins Sharp(1989)CABIOS5151-153所述的方法。該程序可比對多達300個序列，每個序列的最大長度為5000個核苷酸或胺基酸。多重比對方法始於兩個最相似序列的成對比對，其產生兩個已比對序列的群集(cluster)。然後將該群集與下一個最相關的序列或已比對序列的群集進行序列比對。通過簡單延伸兩個獨立序列的成對序列比對，對兩個序列群集進行序列比對。通過一系列漸進的成對序列比對獲得最終的序列比對。通過指明序列比較區域的特定序列及其胺基酸或核苷酸坐標，並通過指明程序參數，即可運行程序。使用PILEUP，利用下列參數比較參照序列與其它受試序列以測定序列同一性百分比關係預設的缺口加權值(3.00)，預設的缺口長度加權值(0.10)，和加權末端缺口。PILEUP可得自GCG序列分析軟體包，例如版本7.0(Devereaux等(1984)Nuc.Acids Res.12387-395))。
另一種適於多個DNA和胺基酸序列比對的算法的優選例子是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等(1994)Nucl.Acids.Res.224673-4680)。ClustalW在多組序列之間進行多重成對比較，並根據同源性將它們裝配成多個序列比對。缺口開放和缺口延伸罰分分別為10和0.05。對胺基酸序列比對而言，BLOSUM算法可用作蛋白質加權矩陣(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.891091510919)。製備本發明的多肽上文描述了生產和分離本發明的幹擾素同系物多肽的重組方法。除了重組生產以外，可通過使用固相技術直接合成肽來生產多肽(參見Stewart等(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co，San Francisco；Merrifield，J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。可使用人工技術或通過自動化來進行肽合成。例如，根據廠商提供的說明使用Applied Biosystems431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)即可進行自動合成。例如，可以分別化學合成亞序列，並使用化學方法將它們組合在一起以提供全長幹擾素同系物。上文詳細討論的本發明幹擾素同系物多肽的片段也是本發明的特徵，通過使用上文所述的方法可以合成這些片段。
通過在細胞群體中導入本發明的核酸(該核酸與能有效產生編碼多肽的調節序列可操作相連)，在培養基中培養細胞以生產多肽，並任選從細胞或培養基中分離多肽，即可生產本發明的多肽。
另一方面，通過在細胞群體中導入含有本發明的至少一種核酸的重組表達載體(其中至少一種核酸與能有效產生編碼多肽的調節序列可操作相連)，在適當條件下在培養基中培養細胞以生產由表達載體編碼的多肽，並任選從細胞或培養基中分離多肽，即可生產本發明的多肽。使用多肽抗體在本發明的另一方面，使用本發明的幹擾素同系物多肽生產抗體，所述抗體具有例如診斷，預防和治療用途，所述用途與例如幹擾素同系物的活性，分布和表達相關。
通過本領域眾所周知的方法可以產生針對本發明幹擾素同系物的抗體。所述抗體包括但不限於多克隆，單克隆，嵌合，人源化，單鏈抗體，Fab片段和通過Fab表達文庫產生的片段。對治療或預防用途而言，阻斷受體結合的抗體是特別優選的。
用於誘導抗體的幹擾素同系物多肽無需具有生物活性；然而，多肽或寡肽必須具備抗原性。用於誘導特定抗體的肽可具有由至少10個胺基酸，優選至少15或20個胺基酸組成的胺基酸序列。短的一段幹擾素同系物多肽可與另一種蛋白質，如匙孔嘁血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)融合，並針對嵌合分子產生抗體。
產生多克隆和單克隆抗體的方法是本領域技術人員已知的，很多抗體是可以得到的。參見例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；and Harlow and Lane(1989)AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(編)Basic and ClinicalImmunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中提及的參考文獻；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2ded.)Academic Press，New York，NY；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256495-497。其它適當的抗體製備技術包括在噬菌體或類似載體中選擇重組抗體文庫，參見Huse等(1989)Science 2461275-1281；和Ward等(1989)Nature341544-546。特定單克隆和多克隆抗體和抗血清通常以至少約為0.1μM，優選至少約為0.01μM或更好，最常見並優選為0.001μM或更好的KD結合。
製備嵌合(人源化)抗體的詳細方法可見於美國專利5,482,856。有關人源化和其它抗體生產和改造技術的其它細節可參見Borrebaeck(編)(1995)Antibody Engineering，2ndEdition，Freeman and Company，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL at OxfordPress，Oxford，England(McCafferty)，和Paul(1995)Antibody EngineeringProtocols，Humana Press，Towata，NJ(Paul)。
在一個有用的實施方案中，本發明提供了完全人源化的針對本發明幹擾素同系物的抗體。在抗體被用作人患者的體內和來自體內的預防和治療劑的應用中，人源化抗體特別合乎需要。人抗體由特徵性的人免疫球蛋白序列組成。可以使用很多種方法生產本發明的人抗體(參見例如Larrick等，美國專利5,001,065以及Borrebaeck McCafferty與Paul，文獻同上，有關評論)。在一個實施方案中，起初在trioma細胞中生產本發明的人抗體。然後將編碼抗體的基因克隆至其它細胞，如非人哺乳動物細胞，並在其中表達。通過trioma技術生產人抗體的一般方法描述於Ostberg等(1983)，Hybridoma2361367，Ostberg，美國專利4,634,664和Engelman等，美國專利4,634,666。通過此方法獲得的抗體生產細胞系被稱為trioma，因為它們是三個細胞；即兩個人型細胞和一個小鼠細胞的後代。已發現與製備自人細胞的普通雜交瘤相比，trioma能更加穩定地生產抗體。佐劑一方面，本發明的幹擾素同系物多肽或其片段當與抗原一起或在傳遞抗原之後或之前施用時，可用作佐劑以刺激，增強，加強或擴大與抗原相關的免疫應答。另一方面，本發明提供了給受試者施用一種或多種本文所述發明之多肽的方法。治療劑和預防劑如下文所詳細描述的那樣，本發明的幹擾素同系物多肽或其片段可用於預防和/或治療性治療多種疾病。
例如，本發明提供了幹擾素-α同系物多肽(和編碼這種多肽的幹擾素-α同系物核酸)，所述多肽在本文所述的試驗中具有抗病毒和抗增殖活性。一方面，本發明提供了幹擾素-α同系物多肽(和編碼這種多肽的幹擾素-α同系物核酸)，其中抗病毒活性與抗增殖活性的比率大於本文所提及的其它已知幹擾素-α，如GenBank中所列的那些的相應比率。所述多肽(和編碼它們的核酸)可用於治療和/或預防性治療多種疾病，例如用於B肝，C肝，HIV和HSV的治療方案中。在這種治療方案中，一些此類多肽(和編碼它們的核酸)，如幹擾素-α同系物2BA8相對於已知幹擾素-α化合物而言具有顯著的優點，因為相對於已知的幹擾素-α化合物，如幹擾素-α2a而言，它們在施用後可能會表現出較低的副作用，較高的效力，因此僅需要較低的劑量，而能導致較小的免疫原性後果。序列變異經保守修飾的變異本發明的幹擾素同系物多肽包括對SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85所公開的多肽序列的一種或多種經保守修飾的變異(或″保守變異″或″保守取代″)。這種經保守修飾的變異包括取代，添加或缺失，所述變異在SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQID NO85中的任一個中改變，添加或缺失了單個胺基酸或小百分比的胺基酸(一般低於約5％，更優選低於約4％，2％或1％)。
例如，在本文中被鑑定為SEQ ID NO36的166個胺基酸長的多肽的保守修飾變異(例如缺失)的長度至少約為157或158個胺基酸，優選至少約為159或160個胺基酸，更優選至少約為162或163個胺基酸，仍更優選至少約為164或165個胺基酸，它們分別相當於缺失了低於約5％，4％，2％或1％的多肽序列。
在本文中被鑑定為SEQ ID NO36的另一個保守修飾變異(例如″經保守取代的變異″)的例子在166個胺基酸長的多肽中的約8個殘基(即低於約5％)處含有根據表2(見上文)所示的6個取代組的「保守取代」。
本發明的幹擾素同系物多肽序列，包括經保守取代的序列可以作為較大多肽序列的一部分存在，這種情況發生在例如，添加一個或多個結構域以便於純化蛋白質(例如多聚組氨酸區段，FLAG表位區段等)，例如當其它的功能性結構域對蛋白質的幹擾素-α部分的活性具有很小的影響或無影響，或者通過合成後的加工步驟，例如通過用蛋白酶處理可以除去其它的結構域時。
在另一個實施方案中，本發明的幹擾素同系物多肽含有在本文中被鑑定為SEQ ID NO71的下列序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFS FSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S；或所述SEQ ID NO71的片段。如上文所定義，SEQ ID NO71序列的保守修飾變異可在166個胺基酸的多肽中包括總共約8個胺基酸的缺失，插入或保守取代，其中在SEQ ID NO71中被稱為X的位置不發生變異，它們對應的是精確定義的胺基酸。
例如，如果4個保守取代位於對應於SEQ ID NO71的胺基酸141-166的亞序列中，該亞序列WEVVR AEIMR SFSFS TNLQK RLRRKE的保守取代變異的例子包括WEVVRSEIMR SFSYS TNLQRRLRRKD和WELVRAEIVR SFSFS TNLNK RLRKKE等，其中下劃線的為保守取代。
本發明的特徵是幹擾素同系物多肽，其含有SEQ ID NO36-71或SEQ IDNO79-85中任一個的至少約20，通常至少約為25，通常至少約為30，40，50，60，70，80，90或100個連續的胺基酸。在其它實施方案中，多肽一般含有SEQ ID NO36-70或SEQ ID NO79-85中任一個的至少約100，110，120，125，130，140，150，155，158，160，163，164或165個連續的胺基酸。
在其它實施方案中，本發明的幹擾素同系物多肽含有胺基酸序列，所述序列含有下列一個或多個胺基酸殘基(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於胺基酸序列SEQ ID NO36中的胺基酸編號。在優選實施方案中，幹擾素同系物多肽含有胺基酸序列，所述序列含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少150，155或166個連續的胺基酸殘基，並進一步含有Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於胺基酸序列SEQ ID NO36中的胺基酸編號。一些這種多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中表現出至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中表現出至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。通過免疫反應性定義多肽由於與其它α幹擾素同系物相比，本發明的多肽提供了多種新的多肽序列，該多肽也提供了新的結構特徵，所述特徵在例如免疫學試驗中能被識別。特異性結合本發明多肽的抗血清的產生，以及被這種抗血清結合的多肽也是本發明的特徵。
本發明包括幹擾素-α同系物多肽，所述多肽能與針對免疫原產生的抗體或抗血清特異性結合或與之發生特異性的免疫反應，所述免疫原含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70，SEQ ID NO71和SEQ ID NO79至SEQ IDNO85中的一個或多個的胺基酸序列。為了消除與其它幹擾素-α多肽，如已知幹擾素-α多肽的交叉反應性，用可獲得的已知α幹擾素減除抗體或抗血清，所述已知α幹擾素包括例如由具有以下GenBank登記號的核酸編碼的多肽J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或者任何其它已知的幹擾素-α多肽(一般稱為「對照α幹擾素多肽」)。當登記號對應於核酸時，產生由核酸編碼的多肽，並將其用於減除抗體/抗血清。當核酸對應於非-編碼序列，例如假基因時，產生(例如合成產生)對應於核酸閱讀框的胺基酸，或者對其進行最小程度的修飾以包括起始密碼子用於重組生產。
在一個典型的方法中，免疫測定法使用針對一種或多種多肽產生的多克隆抗血清，所述多肽含有一種或多種胺基酸序列，所述胺基酸序列對應於SEQID NO36至SEQ ID NO70，SEQ ID NO71和SEQ ID NO79至SEQ IDNO85中的一個或多個，或其基本上的亞序列(即為所提供的全長序列的至少約30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％或更長)。得自SEQ IDNO36至SEQ ID NO70，SEQ ID NO71和SEQ ID NO79至SEQ ID NO85中的一個或多個的全套潛在多肽免疫原在下文中被統稱為「免疫原性的多肽」。任選在所得抗血清中選擇出對對照α幹擾素多肽和/或其它已知幹擾素多肽具有低交叉反應性的抗血清，通過用一種或多種對照α幹擾素多肽進行免疫吸附來除去任何的交叉反應性，然後，在免疫測定法中使用多克隆抗血清。
為了產生抗血清以用於免疫測定法，按本文所述生產和純化一種或多種免疫原性的多肽。例如，可在哺乳動物細胞系中生產重組蛋白質。使用混合有標準佐劑，如弗式佐劑的免疫原性多肽，和標準的小鼠免疫方法(參見Harlow和Lane(1998)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York，其中標準性描述了抗體的生成，免疫測定法的形式和用於測定特異性免疫反應性的條件)免疫小鼠近交品系(之所以在此試驗中應用近交品系是因為小鼠實質上的基因同一性使得試驗結果更具再現性)。或者，將得自本文所述序列的一種或多種合成的或重組的多肽與載體蛋白質綴合，再用作免疫原。
收集多克隆血清，並在免疫測定法，例如將一種或多種免疫原性的多肽固定於固體支持物上的固相免疫測定法中對免疫原性的多肽進行滴定。選擇，收集滴度為106或更高的多克隆抗血清，並用對照α幹擾素多肽對其進行減除以產生經減除，收集和滴定的多克隆抗血清。
檢測經減除，收集和滴定的多克隆抗血清對對照α幹擾素多肽的交叉反應性。優選在此測定中使用至少兩種免疫原性的α幹擾素多肽，優選與至少兩種對照α幹擾素多肽聯合使用，以鑑定特異性結合免疫原性多肽的抗體。
在此比較試驗中，測定經減除，滴定的多克隆抗血清的區別性結合條件，所述條件導致經滴定的多克隆抗血清與免疫原性α幹擾素結合的信號噪聲比相對於與對照α幹擾素結合的信號噪聲比而言要高至少約5-10倍。即，通過添加非特異性的競爭劑，如白蛋白和脫脂奶粉，或者通過調節鹽條件，溫度等來調節結合反應的嚴緊度。在隨後的試驗中使用這些結合條件以測定受試多肽是否與收集到的經減除的多克隆抗血清特異性結合。特別是，在區別性的結合條件下信號噪聲比比對照多肽高至少2-5倍，與免疫原性的多肽相比，信號噪聲比至少約為前者的1/2的受試多肽與已知的α幹擾素相比，與免疫原性的多肽共享較高的結構相似性或同源性，因此是本發明的多肽。
在另一個例子中，使用競爭結合形式的免疫測定法來檢測受試多肽。例如，如上所述，通過用對照α幹擾素多肽進行免疫吸附，從收集的抗血清混合物中除去交叉反應的抗體。然後將免疫原性的多肽固定於暴露於經減除，收集的抗血清中的固體支持物上。在試驗中加入受試蛋白質以競爭與收集的經減除抗血清的結合。將與固定化蛋白質相比較的，受試蛋白質競爭結合收集的經減除抗血清的能力與試驗中加入的免疫原性多肽競爭結合的能力相比較(免疫原性的多肽能有效地與固定化免疫原性多肽競爭同收集的抗血清的結合)。使用標準算法計算出受試蛋白質交叉反應性的百分比。
在平行的試驗中，與免疫原性多肽競爭結合抗血清的能力相比較，測定對照蛋白質競爭結合收集的經減除抗血清的能力。使用標準算法計算出對照多肽交叉反應性的百分比。當受試多肽的交叉反應性百分比至少高5-10倍時，可以說受試多肽與收集的經減除抗血清特異性結合。
一般說來，可在本文所述的競爭結合免疫測定法中使用經免疫吸附和收集的抗血清以比較任何受試多肽與免疫原性多肽。為了進行這種比較，可以檢測寬範圍濃度的兩種多肽中的每一種，並使用標準技術測定將經減除抗血清與固定化蛋白質的結合抑制50％所需的每種多肽的量。如果所需受試多肽的量比所需免疫原性多肽的量低兩倍，就可以說受試多肽能特異性結合針對免疫原性多肽產生的抗體，條件是所述量至少比對照多肽的約高5-10倍。
最後測定的是特異性，任選用免疫原性多肽(而不是對照多肽)完全免疫吸附所收集的抗血清，直至僅可檢測到所得的經免疫原性多肽減除的抗血清集合與免疫吸附中所用免疫原性多肽的微弱結合或檢測不到結合。然後檢測經完全免疫吸附的抗血清與受試多肽的反應性。如果僅觀察到微弱的反應性或無反應性(即與所觀察到的經完全免疫吸附的抗血清與免疫原性多肽的結合相比，信號噪聲比不超過2倍)，那麼，受試多肽就能特異性結合由免疫原性蛋白質產生的抗血清。幹擾素同系物的抗增殖特性按實施例1所述，在基於人Daudi細胞系的試驗中檢查幹擾素同系物對細胞生長的作用。圖2顯示了與對照幹擾素，人IFN-α2a和共有的人IFN-α(Con1)相比，本發明例舉的幹擾素同系物的抗增殖活性，所述同系物含有SEQ ID NO36至SEQ ID NO54的胺基酸序列。圖中顯示了與人IFN-α2a和共有的人IFN-α相比，一套例舉的幹擾素α同系物的每毫克(mg)幹擾素受試樣品的活性單位數(Y軸)，其中每個同系物樣品在X軸上都有一個名稱(克隆名稱)。這些結果表明含有本發明幹擾素-α同系物的組合物可用於抑制或減少腫瘤細胞增殖的方法中，所述腫瘤細胞包括但不限於人癌細胞，造血癌細胞，人白血病細胞，人淋巴瘤細胞和人黑素瘤細胞。抑制可在體外(用於例如多種增殖試驗)，來自體內或體內(用作例如治療或預防劑)進行。
本發明的幹擾素-α同系物顯示出針對多種癌細胞系的各種各樣的作用模式(參見例如實施例2)。使用體外細胞系篩選(描述於例如Monks，A.等(1991)J.Nat′l Cancer Inst.83757-766)檢測本發明的幹擾素-α同系物的選擇性生長抑制作用和/或對特定癌細胞系的細胞殺傷作用。被篩選的人癌細胞系(參見例如實施例2，表3)包括白血病，黑素瘤和肺癌，結腸癌，腦癌，中樞神經系統癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和腎癌。
在癌細胞系篩選中測定3個活性參數1)GI50(「50％生長抑制」)，為生長抑制活性的測量值，GI50是細胞生長被抑制50％時幹擾素受試樣品(IFNα同系物或對照IFNα)的濃度，所述抑制是通過在保溫階段結束時，與在對照細胞(無受試樣品)中觀察到的相比，幹擾素受試樣品中淨蛋白質/多肽的增加降低50％來測定的；2)TGI(「總生長抑制」)，為細胞靜止活性的測量值，TGI是特定細胞系的細胞生長完全被抑制時幹擾素受試樣品的濃度，其中在保溫期結束時細胞蛋白質的量等於在保溫期開始時細胞蛋白質的量；和3)LC50，為細胞毒活性的測量值，LC50是與保溫期開始時所觀察到的細胞蛋白質量相比，在保溫結束時，測定的細胞蛋白質的量降低50％時幹擾素受試樣品的濃度，它顯示了在加入幹擾素受試樣品之後細胞的淨損失。實施例2中提供了該試驗和數據分析方法的其它細節。
與幹擾素-αCon1和人幹擾素-α2a對照相比，例舉的幹擾素-α同系物3DA11(SEQ ID NO40)針對多種癌細胞系的活性參數示於圖3A，3B和3C。
關於生長抑制活性，同系物3DA11和對照幹擾素-αCon1特別顯示出針對大多數受試細胞系的活性，幹擾素-αCon1一般表現出較高的活性，幹擾素-α2a一般表現出較低的整體活性，並且僅在細胞系亞集中表現出活性(圖3A)。
特別地與之形成對照的是，與幹擾素-Con1和人幹擾素-α2a對照相比，在同系物3DA11的細胞毒和細胞靜止活性中觀察到顯著的差異。在受試的濃度範圍內，同系物3DA11顯示出針對含11個細胞系的細胞群體的顯著細胞靜止活性，而幹擾素-Con1僅顯示出針對含1個細胞系的細胞群體的活性，而同系物3DA11也具有針對這群細胞的活性(圖3B)。另一方面，IFN-α2a在此試驗中對任何受試細胞系都不具有活性。因此，同系物3DA11比共有的人幹擾素-α(Con1)和人幹擾素-α2a具有更寬的細胞靜止活性分布圖。
與幹擾素-Con1和人幹擾素-α2a對照相比，同系物3DA11也顯示出顯著的細胞毒活性(圖3C)。令人驚奇的是，同系物3DA11顯示出針對含8個細胞系的細胞群體的細胞毒活性，而幹擾素-Con1和幹擾素-α2a對照在試驗所用的濃度範圍內對含任何細胞系的細胞群體都未表現出可測的活性。因此，與幹擾素-Con1和人幹擾素-α2a相比，同系物3DA11也具有較寬的細胞毒活性分布圖。
圖4A-4D闡明了本發明例舉的幹擾素-α同系物的細胞靜止活性(由TGI值反映)。在每個圖中，繪製多種幹擾素-α同系物和兩種對照幹擾素(幹擾素-Con和人幹擾素-α2a)針對特定癌細胞系細胞群體的相對細胞靜止活性(表示為-log TGI)圖。
在受試的例舉同系物中，同系物1D3(SEQ ID NO54)和3DA11(SEQ IDNO40)，而不是對照幹擾素中的任一種在試驗濃度範圍內表現出針對白血病細胞系RPMI-8226細胞群體的顯著細胞靜止活性(圖4A)。在此實施例中，相對於任一種對照(幹擾素-Con1或幹擾素-α2a)針對白血病細胞系細胞群體的細胞靜止活性而言，1D3和3DA11同系物顯示出針對細胞群體的至少約高25倍的相應活性(與至少約為1.4個log單位的TGI差異相對應)。
同系物1D3，2G5(SEQ ID NO45)，6CG3(SEQ ID NO52)和3DA11，而不是對照幹擾素中的任一種顯示出針對肺癌細胞系NCI-H23的顯著細胞靜止活性(圖4B)。在此實施例中，相對於幹擾素-Con1或幹擾素-α2a針對肺癌細胞系細胞群體的細胞靜止活性而言，1D3，2G5，6CG3和3DA11同系物顯示出針對肺癌細胞系細胞群體的至少約高12倍的相應活性(與至少約為1.1個log單位的TGI差異相對應)。
同系物1D3，2G5和3DA11，而不是對照幹擾素中的任一種顯示出針對腎癌細胞系ACHN細胞群體的顯著細胞靜止活性(圖4C)。在此實施例中，相對於幹擾素-Con1或幹擾素-α2a針對腎癌細胞系細胞群體的細胞靜止活性而言，1D3，2G5和3DA11同系物顯示出針對所述腎癌細胞系細胞群體的至少約高35倍的相應活性(與至少約為1.55個log單位的TGI差異相對應)。
同系物1D3，2G5，3DA11，2CA5(SEQ ID NO42)和2DB11(SEQ IDNO41)，以及幹擾素-Con1對照，而不是幹擾素-α2a對照顯示出針對卵巢癌細胞系OVCAR-3細胞群體的顯著細胞靜止活性(圖4D)。在此實施例中，就針對各群卵巢癌細胞系細胞的細胞靜止活性而言，同系物1D3顯示出比幹擾素-Con1至少約高2倍的相應活性(與至少約為0.3個log單位的TGI差異相對應)，而1D3，2G5，3DA11，2CA5和2DB11同系物顯示出比幹擾素-α2a至少約高40倍的相應活性(與至少約為1.6個log單位的TGI差異相對應)。
從本文提供的例舉數據可以明顯地看出本發明的幹擾素-α同系物顯示出多種細胞靜止活性分布圖，所述分布圖與幹擾素-αCon1和幹擾素α-2a的顯著不同。
本發明包括幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a或共有的人幹擾素-αCon1而言，其具有增加的細胞靜止活性。在多個實施方案中，幹擾素-α同系物對癌細胞系細胞群體的細胞靜止活性比人幹擾素-α2a的相應活性至少約高2倍(即TGI值至少約低2倍)，或者幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的細胞靜止活性比幹擾素-Con1的相應活性至少約高2倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；中樞神經系統(CNS)癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。
在其它實施方案中，幹擾素-α同系物對癌細胞系細胞群體的細胞靜止活性比人幹擾素-α2a的相應活性至約高5倍(即TGI值至少約低5倍)，或者幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的細胞靜止活性比幹擾素-Con1的相應活性至少約高5倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；中樞神經系統(CNS)癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。在其它實施方案中，幹擾素-α同系物時癌細胞系細胞群體的細胞靜止活性比人幹擾素-α2a的相應活性至少約高10倍(即TGI值至少約低10倍)，或者幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的細胞靜止活性比幹擾素-Con1的相應活性至少約高10倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；中樞神經系統(CNS)癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。
本發明包括幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a或幹擾素-Con1而言，其具有增加的細胞毒活性。在多個實施方案中，幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的細胞毒活性比人幹擾素-α2a的相應活性至少約高2倍(即LC50值至少約低2倍)，至少高5倍，或至少高10倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。在其它實施方案中，幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的細胞毒活性比幹擾素-Con1的相應活性至少約高2倍(即LC50值至少約低2倍)，至少約高5倍，或至少約高10倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。
本發明包括幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a或幹擾素-Con1而言，其具有增加的生長抑制活性。在多個實施方案中，幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的生長抑制活性比人幹擾素-α2a的相應活性至少約高2倍(即GI50值至少約低2倍)，至少約高5倍，或至少約高10倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。在其它實施方案中，幹擾素-α同系物對選自下列一個或多個癌細胞系的細胞群體的生長抑制活性比幹擾素-Con1的相應活性至少約高2倍(即GI50值至少約低2倍)，至少約高5倍，或至少約高10倍白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系。
本文所述的發現是可對幹擾素(如本文所述的幹擾素-α同系物)進行演變，修飾或重組以顯示出多種活性分布圖，該發現為演變和產生定製的，特異性的幹擾素同系物提供了機會，所述同系物可用於治療多種特異性的疾病，包括例如多種癌症或相關疾病。例如，經最優化以使針對特定靶癌細胞類型的效力增強的本發明的幹擾素同系物也可被最優化，以使其(有利地)具有降低的針對非靶細胞的毒性，因此，對施用同系物的受試者(例如患者)產生較低的副作用。
本發明進一步提供了針對取自受試者亞群(如哺乳動物或人患者)，或甚至取自各個受試者(如哺乳動物或人患者)的腫瘤細胞最優化幹擾素同系物的機會，以提供專為各個受試者定製的治療或預防性治療方案。本發明的最優化的幹擾素同系物可提供針對癌症或相關疾病，或其它可用幹擾素治療的疾病，或對目前使用的幹擾素或其它治療方案無反應的疾病的治療或預防效果。幹擾素同系物的抗病毒特性按實施例1所述，在人WISH細胞/EMCV試驗中評價本發明幹擾素同系物的抗病毒活性。圖2顯示了含有胺基酸序列SEQ ID NO36至SEQ IDNO54的本發明例舉的幹擾素同系物的抗病毒活性。
已證實本發明例舉的IFN-α同系物的經改良的體外抗病毒活性能在鼠模型系統體內維持。以前有人證實本發明的兩種IFN-α同系物CH2.2和CH2.3(分別為SEQ ID NO84和85)在基於鼠細胞的試驗中，相對於人IFN-α2a而言，分別具有約206,000-倍和138,000-倍經改良的抗病毒活性，以及在相同的試驗中，與天然鼠幹擾素相比，具有顯著較高的活性(Chang等(1999)Nature Biotechnol.17793-797)。如下文實施例3所述，給用致死劑量的水泡性口炎病毒(VSV)攻擊的Balb/c小鼠施用不同劑量的IFN-α同系物CH2.2和CH2.3，天然鼠幹擾素Mu-IFNα4和人IFN-α2a。高體外活性與觀察到的體內活性較好地相互關聯(圖5)。CH2.2和CH2.3同系物能完全有效地保護小鼠，使其免受致死病毒攻擊，而相同劑量的天然鼠幹擾素部分有效，人IFN-α2a完全無效。這些結果表明含有本發明的幹擾素同系物的組合物可用於抑制被病毒感染的受試者體內的病毒複製的方法中，所述病毒包括但不限於人免疫缺損病毒(HIV)，C肝病毒(HCV)，單純皰疹病毒(HSV)和B肝病毒(HBV)。可在體外(用於例如多種抗病毒試驗)，來自體內(在本文討論的來自體內的方法中用作例如治療或預防劑)或體內(在本文討論的體內方法中用作例如治療或預防劑)進行抑制。將幹擾素同系物用於治療自身免疫和其它免疫-相關疾病本發明的組合物可用於治療或預防性地治療，從而緩解多種免疫系統-相關疾病，所述疾病的特徵在於過高或過低活性的免疫系統功能或其它特徵。所述疾病包括變應原性過高和自身免疫病，如多發性硬化，I型(胰島素依賴型)糖尿病，紅斑狼瘡，肌萎縮性側硬化，Crohn氏病，類風溼性關節炎，口炎，哮喘，變態反應，牛皮癬等。治療和預防組合物根據本領域眾所周知的方法，在適當的體外，來自體內和體內疾病動物模型中檢測含有本發明的一種或多種幹擾素同系物多肽或核酸的治療或預防性組合物，以證實效力，組織代謝並估計劑量。特別地，通過在相關試驗中比較α幹擾素同系物與現有的α幹擾素治療劑或預防劑的活性，即可測定劑量。一方面，本發明提供了方法，它包括如下文所詳細描述的那樣，給哺乳動物或非-哺乳脊椎動物，如鳥(如雞或鴨)施用一種或多種上文所述的本發明的幹擾素同系物核苷酸或多肽(或其片段)，所述哺乳動物包括例如人，靈長類動物，小鼠，豬，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，綿羊。所述組合物一般含有一種或多種本發明的幹擾素同系物核苷酸或多肽(或其片段)和賦形劑，例如藥物可接受的賦形劑。
一方面，通過用限制性內切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一種或多種本發明的核酸(或其片段)來產生本發明的組合物。
在本發明的另一方面，提供了通過在脫氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶，如熱穩定性的聚合酶的存在下，保溫一種或多種上文所述的核酸而產生的組合物。
本發明還包括含有兩種或多種上文所述核酸的組合物。所述組合物可含有核酸文庫，其中文庫含有至少約5，10，20，50，100，150或200或更多種核酸。
通過常用於將分子導入，最終與血液或組織細胞接觸的任何途徑進行給藥。可以任何適當的方式，優選與藥物可接受的載體一起施用本發明的幹擾素-α同系物。給患者施用本發明上下文中的幹擾素同系物的適當方法是可以使用的，儘管可以使用不止一種途徑來施用特定的組合物，但特定的途徑經常能提供比另一種途徑更直接和更有效的反應。
藥物可接受的載體部分由所施用的特定組合物，以及施用組合物所用的特定方法來決定。因此，有很多種適當的本發明藥物組合物的配方。
可通過多種途徑施用多肽組合物，以用於本文所述的預防，治療和診斷方法中的任一種中，所述途徑包括但不限於口服，靜脈內，腹膜內，肌內，經皮，皮下，局部，舌下，陰道或直腸途徑，或通過吸入。也可以經由脂質體施用幹擾素同系物多肽組合物。所述給藥途徑和適當的製劑一般是本領域已知的。
幹擾素同系物多肽或核酸單獨或與其它適當的組分聯合也可被製成經由吸入給藥的氣霧劑(即它們可被「噴霧」)。氣霧劑可被置於加壓的可接受推進劑，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮等中。
適於非腸道給藥的製劑，例如通過關節內，靜脈內，肌內，經皮，腹膜內和皮下途徑給藥的製劑包括含水和不含水的等滲無菌注射溶液，其含有抗氧化劑，緩衝液，抑菌劑和使製劑與給藥受體的血液等滲的溶質，和含水和不含水的無菌懸浮液，它可包括懸浮劑，增溶劑，增稠劑，穩定劑和防腐劑。經包裝的核酸製劑可以存在於單位劑量或多劑量的密封容器，如安鉳和小管中。
非腸道給藥和靜脈內給藥是優選的給藥方法。特別是，現有的α幹擾素治療劑或預防劑已經使用的給藥途徑，以及目前使用的製劑是優選的給藥途徑，以及本發明α幹擾素同系物多肽和核酸的優選製劑。
在來自體內或體內療法的上下文中，被上文所述的幹擾素同系物轉導的細胞也可按上文所述靜脈內或非腸道給藥。應懂得將細胞傳遞給受試者(例如人患者)是常規技術，例如經由靜脈內或腹膜內給藥將細胞傳遞至血液。
在本發明的上下文中，施用給受試者(例如患者)的本發明幹擾素同系物多肽或核酸的劑量足以在一定時間內，在受試者(例如患者)中產生有利的治療或預防反應，或者足以抑制病原體的感染，這取決於具體的應用。通過特定載體或製劑的效力，和所用幹擾素同系物的活性和患者的狀況，以及待治療的患者的體重或表面積來確定劑量。通過在特定患者中施用特定載體，製劑，轉導細胞類型等相伴隨的任何不良副作用的存在，特性和程度來確定劑量的大小。
在本文所述發明的治療和預防治療方法中，本發明幹擾素-α核酸(例如DNA或mRNA)的有效量(例如核酸劑量)的一般範圍是例如約0.05微克/千克(kg)至約50mg/kg，通常約為0.005-5mg/kg。然而，應理解可以按照本領域技術人員熟知的方式，根據多個因素改變核酸(例如核酸劑量)和/或多肽(例如多肽劑量)的有效量，所述因素包括多肽的活性或效力，所施用的任何核酸構建體(例如載體，啟動子，表達系統)的活性或效力，待治療的疾病(例如特定的癌症)和被傳遞核酸的受試者。
為了通過例如傳遞編碼多肽的核酸來傳遞一些多肽，用例如約為0.005mg/kg至約5mg/kg的核酸劑量即可達到足夠水平的翻譯和/或表達。本領域技術人員根據上文提及的因素可以容易地確定其它具有已知生物活性的多肽(和編碼它們的核酸)的劑量。其它已知幹擾素-α針對特定疾病所用的劑量為確定本發明核酸或多肽的劑量和治療方案提供了指南。幹擾素-α同系物多肽的有效量範圍為約1微克至約1毫克，更優選為約1微克至約100微克。
用於本文所述發明的治療和預防性治療方法的組合物可含有例如濃度為約0.1微克/毫升(ml)至約20mg/ml的本發明的幹擾素-α同系物核酸(例如DNA或mRNA)，和藥物可接受的載體(例如含水載體)。
用於本文所述發明的治療和預防性治療方法的組合物可含有例如濃度如上文和本文所述的本發明的幹擾素-α同系物多肽，和藥物可接受的載體(例如含水載體)。
在治療或預防癌症或病毒疾病時，確定載體的有效量，細胞類型或所施用的製劑的過程中，醫師需評價循環血漿水平，載體/細胞/製劑/幹擾素同系物的毒性，疾病的進程和抗-載體/幹擾素同系物抗體的產生。
給例如70千克的患者施用的劑量範圍等於目前使用的幹擾素-α治療或預防性蛋白質的劑量，計算出產生幹擾素同系物序列的載體或細胞的劑量，以產生相同量的幹擾素同系物核酸或表達出的蛋白質。通過任何已知的常規療法，包括細胞毒性劑，核苷酸類似物(例如當用於治療HIV感染時)，生物反應修飾劑等，本發明的載體可補充治療癌症和病毒-介導的疾病。
當應用於患者總的和整體的健康狀況時，為了進行給藥，應以一定的比率施用本發明的幹擾素同系物和轉導細胞，所述比率是通過幹擾素同系物多肽或核酸的LD50，載體，或轉導的細胞類型，和各種濃度的幹擾素同系物多肽或核酸，載體或細胞類型的副作用來測定的。可以經由單劑量或分開的劑量進行給藥。
為了將已被重組α-幹擾素核酸轉導的細胞導入受試者(例如患者)，在灌注之前獲得血樣，並保存血樣以進行分析。在60-200分鐘內靜脈內灌注1×106至1×1012個經轉導的細胞。密切監測生命體徵並通過脈搏血氧計監測氧飽和度。在灌注後5分鐘和1小時獲得血樣，保存該血樣以隨後進行分析。任選在1年內的總共4至6次治療中，每隔2至3個月重複進行leukopheresis，轉導和再灌注。第一次治療之後，根據臨床醫生的判斷力，主要對門診病人進行灌注。如果對門診病人進行再灌注，在治療至少4小時，優選8小時後監測參與者。根據已建立的方法製備再灌注所用的經轉導細胞。參見Abrahamsen等(1991)J.Clin.Apheresis 648-53；Carter等(1988)J.Clin.Arpheresis 4113-117；Aebersold等(1988)，J.Immunol.Methods 1121-7；Muul等(1987)J.Immunol.Methods101171181和Carter等(1987)Transfusion27362-365。培養約2至4周後，細胞數目應達到1×106至1×1012個。在此方面，細胞的生長特徵隨患者的不同和細胞類型的不同而不同。在再灌注轉導細胞之前約72小時，取出等分試樣以分析表型，和表達治療或預防劑的細胞的百分比。
如果經受載體或轉導細胞或蛋白質製劑灌注的受試者(例如患者)出現發燒，怕冷或肌肉疼痛，可以服用適當劑量的阿斯匹林，布洛芬，醋氨酚或其它解熱鎮痛藥物。經受灌注反應，如發燒，肌肉疼痛和怕冷的受試者(例如患者)可在灌注前30分鐘預先服用阿斯匹林，醋氨酚，或例如苯海拉明。杜冷丁可用於對退熱劑和抗組胺劑不能快速反應的更嚴重的怕冷和肌肉疼痛。根據反應的嚴重程度，可以放慢或取消細胞灌注。治療和預防性治療的方法本發明還包括治療或預防性治療疾病的方法，所述方法包括給受試者體內或來自體內地施用一種或多種上文所述發明的核酸或多肽(或含有藥物可接受的賦形劑和一種或多種所述核酸或多肽的組合物)，所述受試者包括例如哺乳動物，包括例如人，靈長類動物，小鼠，豬，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，綿羊；或非-哺乳類脊椎動物，如鳥類(如雞或鴨)或魚或無脊椎動物。
在本發明的一方面，在來自體內的方法中，從受試者體內獲得或取出令人感興趣的一種或多種細胞或細胞群體(例如腫瘤細胞，腫瘤組織樣品，器官細胞，血液細胞，皮膚，肺，心臟，肌肉，腦，黏膜，肝臟，腸，脾臟，胃，淋巴系統，宮頸，陰道，前列腺，口腔，舌等的細胞)，並與一定量的能有效預防或治療疾病的本發明的多肽接觸。然後將經接觸的細胞返回或傳遞至受試者體內獲得細胞的位點，或者待治療的受試者體內另一個令人感興趣的位點(例如包括上文所定義的那些位點)。必要時，可使用標準的和眾所周知的移植技術，將經接觸的細胞移植到受試者體內令人感興趣的組織，器官或系統位點(包括上文所述的所有位點)，或者例如使用標準的傳遞或注入技術將其傳遞至血液或淋巴系統。
本發明還提供了體內方法，其中將受試者的令人感興趣的一種或多種細胞或細胞群體直接或間接地與一定量的能有效預防或治療疾病的本發明的多肽接觸。在直接接觸/給藥形式中，一般通過多種方法中的任一種，包括局部給藥，注射(例如通過使用針頭或注射器)，或疫苗或基因槍傳遞，推入組織，器官或皮膚位點，將多肽直接施用於或轉移至待治療的細胞或感興趣的組織位點(例如腫瘤細胞，腫瘤組織樣品，器官細胞，血液細胞，皮膚，肺，心臟，肌肉，腦，黏膜，肝臟，腸，脾臟，胃，淋巴系統，宮頸，陰道，前列腺，口腔，舌等的細胞)。可通過例如肌內，皮內，皮下，口服，腹膜內，鞘內，靜脈內傳遞多肽，或將多肽置於體腔內(包括例如在外科手術過程中)，或通過吸入或陰道或直腸給藥傳遞多肽。
在體內間接接觸/給藥形式中，一般通過將本發明的多肽直接接觸或施用於能促進治療的一種或多種細胞或細胞群體，而將多肽間接施用於或轉移至待治療的細胞或感興趣的組織位點，包括上文所述的那些位點(例如皮膚細胞，器官系統，淋巴系統或血液細胞系統等)。例如，通過將血液或淋巴系統，皮膚或器官的細胞與足夠量的多肽接觸，以使多肽傳遞至感興趣的位點(例如體內的組織，器官或感興趣的細胞或血液或淋巴系統)，並導致有效的預防或治療作用，即可治療受試者體內的腫瘤細胞。通過使用上文所述的一種或多種給藥途徑或模式，一般即可進行這種接觸，給藥或轉移。
另一方面，本發明提供了來自體內的方法，其中從受試者體內獲得或取出令人感興趣的一種或多種細胞或細胞群體(例如腫瘤細胞，腫瘤組織樣品，器官細胞，血液細胞，皮膚，肺，心臟，肌肉，腦，黏膜，肝臟，腸，脾臟，胃，淋巴系統，宮頸，陰道，前列腺，口腔，舌等的細胞)，並通過使所述的一種或多種細胞或細胞群體與多核苷酸構建體接觸來轉化這些細胞，所述構建體含有編碼所需生物活性多肽(例如本發明的多肽)的本發明的靶核酸序列，所述多肽能有效預防或治療疾病。使一種或多種細胞或細胞群體與足夠量的多核苷酸構建體和控制所述核酸序列表達的啟動子接觸，以使細胞攝入多核苷酸構建體(和啟動子)，充分表達本發明的靶核酸序列，產生一定量的能有效預防或治療疾病的生物活性多肽。多核苷酸構建體可包括控制本發明的核酸序列表達的啟動子序列(例如CMV啟動子序列)和/或，必要時，還包括一種或多種其它的核苷酸序列，所述序列編碼至少一種或多種本發明的另一種多肽，細胞因子，佐劑或共-刺激分子，或其它所需多肽。
轉染後，將經轉化的細胞返回，傳遞或轉移至受試者體內獲得細胞的組織位點或系統，或者待治療的受試者體內的另一個位點(例如腫瘤細胞，腫瘤組織樣品，器官細胞，血液細胞，皮膚，肺，心臟，肌肉，腦，黏膜，肝臟，腸，脾臟，胃，淋巴系統，宮頸，陰道，前列腺，口腔，舌等的細胞)。必要時，可使用標準的和眾所周知的移植技術，將細胞移植到受試者體內令人感興趣的組織，皮膚，器官或身體系統，或者例如使用標準的傳遞或注入技術將其傳遞至血液或淋巴系統。通過使用上文所述的一種或多種給藥途徑或模式，一般即可傳遞，施用或轉移經轉化的細胞。靶核酸的表達可以自然發生，或者也可被誘導(下文將要詳細描述)，所表達的編碼多肽的量應足以和有效地治療位點或組織系統處的疾病。
另一方面，本發明提供了體內方法，其中受試者體內一種或多種令人感興趣的細胞或細胞群體(例如包括上文所述的那些細胞和細胞系統和受試者)被轉化，轉化是通過使細胞或細胞群體與多核苷酸構建體接觸(或使用上文所述的一種或多種給藥途徑或模式施用於或轉移至細胞或細胞群體)來實現的，所述構建體含有編碼所需生物活性多肽(例如本發明的多肽)的本發明的核酸序列，所述多肽能有效預防或治療疾病。
可將多核苷酸構建體直接施用於或轉移至患病細胞(例如通過使用上文所述的一種或多種給藥途徑或模式直接接觸)。或者，首先通過使用上文所述的一種或多種給藥途徑或模式使未患病的細胞或其它患病細胞與足夠量的多核苷酸構建體直接接觸(所述構建體含有編碼生物活性多肽的核酸序列和控制核酸序列表達的啟動子)，使得細胞攝入多核苷酸構建體(和啟動子)，充分表達本發明的靶核酸序列，產生一定量的能有效預防或治療疾病的生物活性多肽，從而使多核苷酸構建體或所得的表達多肽能自然地或自動地從受試者體內最初的傳遞位點，系統，組織或器官轉移至受試者體內患病的位點，組織，器官或系統(例如經由血液或淋巴系統)，而將多核苷酸構建體間接施用於或轉移至患病細胞。靶核酸的表達可以自然發生，或者也可被誘導(下文將要詳細描述)，以使所表達的編碼多肽的量足以和能有效地治療位點或組織系統處的疾病。多核苷酸構建體可包括控制核酸序列表達的啟動子序列(例如CMV啟動子序列)和/或，必要時，還包括一種或多種其它的核苷酸序列，所述序列編碼至少一種或多種本發明的另一種多肽，細胞因子，佐劑或共-刺激分子，或其它所需多肽。
在上文所述的體內和來自體內的治療方法的每一種中，可以施用或傳遞含有賦形劑和本發明的多肽或核酸的組合物。一方面，按上文所述，將含有藥物可接受的賦形劑和本發明的多肽或核酸的組合物施用於或傳遞至受試者，其用量能有效治療疾病。
另一方面，在上文所述的體內和來自體內的治療方法的每一種中，施用給細胞或受試者的多核苷酸的量可以是足以使受試者的一種或多種細胞攝入所述多核苷酸，並充分表達所述核酸序列，產生一定量的能有效增強受試者的免疫應答，包括由免疫原(如抗原)誘導的免疫應答的生物活性多肽的量。另一方面，對每種方法而言，施用於細胞或受試者的多肽量可以是足以增強受試者的免疫應答，包括由免疫原(如抗原)誘導的免疫應答的量。
另一方面，在使用多核苷酸構建體(或含有多核苷酸構建體的組合物)給受試者傳遞生理活性多肽的體內或體內治療方法中，可通過使用可誘導的開啟-和關閉-基因表達系統來誘導多核苷酸構建體的表達。這種開啟-和關閉-基因表達系統的例子分別包括Tet-OnTM Gene Expression System和Tet-OffTMGene Expression System(有關每個系統的詳細描述可參見例如ClontechCatalog2000，pg.110-111)。其它可控或可誘導的開啟-和關閉-基因表達系統是本領域技術人員已知的。使用這種系統，可以精確地，可逆地和定量地調節多核苷酸構建體中靶核酸的表達。例如，可在使經穩定轉染的細胞傳遞或轉移至或接觸感興趣的組織位點，器官或系統之後，再誘導靶核酸的基因表達，其中所述細胞含有多核苷酸構建體，所述構建體含有靶核酸。這種系統對治療方法和形式特別有利，其中它可以有利地延遲或精確控制靶核酸的表達(例如給完成外科手術和/或手術後的康復以時機；使含有靶核酸的多核苷酸構建體有時間到達待治療的位點，細胞，系統或組織；使含有被構建體轉化之細胞的移植物有時間摻入它所嫁接或貼附的組織或器官等)。集成系統本發明提供了計算機，計算機可讀介質和集成系統，它們中含有對應於本文所述多肽和核酸，包括例如本文所列的那些序列及其多種沉默取代和保守取代的序列信息的特徵鏈。
本領域已知的多種方法和遺傳學算法(GO)可用於檢測不同特徵鏈之間的同源性或相似性，或者用於行使其它所需的功能，例如控制輸出文件，提供描述包括序列等的信息的基礎。例如上文討論的BLAST。
因此，可在本文的集成系統中檢測和識別多種嚴緊度和長度的不同類型的同源性和相似性。例如，已設計出很多種同源性測定方法，用於比較性分析生物聚合物的序列，在字處理時檢查拼寫，從多種資料庫中檢索資料。已理解天然多核苷酸的4個主要核鹼基中雙-螺旋成對互補物的相互作用，也可將模擬互補同源性多核苷酸鏈退火的模型用作序列比對或其它操作的基礎，所述操作一般在對應於本文序列的特徵鏈上進行(例如字-處理操作，構建含有序列或亞序列特徵鏈的圖，輸出表格等)。用於計算序列相似性或同源性，且含有GO的軟體包的例子是BLAST，通過輸入對應於本文序列的特徵鏈，BLAST可適用於本發明。
類似地，通過輸入對應於本發明的幹擾素α同系物(核酸或蛋白質，或兩者)的特徵鏈，標準的桌面電腦應用軟體，如字處理軟體(如Microsoft WordTM或Corel WordPerfectTM)和資料庫軟體(例如電子製表軟體如Microsoft ExcelTM，Corel Quattro ProTM或資料庫程序，如Microsoft AccessTM或ParadosTM)可適用於本發明。例如，集成系統可包括具有適當特徵鏈信息的上述軟體，例如用於與用戶界面(例如標準作業系統如Windows，Macintosh或LINUX系統中的圖形用戶界面)相連接以操作特徵鏈。如上所述，也可將專門用於序列比對的程序如BLAST摻入本發明的系統以比對核酸或蛋白質(或相應的特徵鏈)。
本發明中分析所用的集成系統一般包括裝有比對序列所用GO軟體的數字計算機，以及能進入含有本文所述任何序列的軟體系統的數據設置。計算機可以是例如個人電腦(Intel x86或Pentium晶片兼容型DOSTM，OS2TMWINDOWSTMWINDOWS NTTM，WINDOWS95TM，WINDOWS98TM，基於LINUX的機器，MACINTOSHTM，Power PC，或基於UNIX(例如SUNTM工作站)的機器)或其它本領域技術人員已知的可商購的普通計算機。用於序列比對或操作序列的軟體是可以獲得的，或者本領域技術人員使用標準的程式語言，如Visualbasic，Fortran，Basic，Java等可以容易地創建這些軟體。
任何控制器或計算機任選包括監視器，它經常是陰極射線電子管(″CRT″)顯示器，平面顯示器(例如活動矩陣式液晶顯示器，液晶顯示器)或其它顯示器。計算機電路經常被置於盒內，盒中包括多個集成電路晶片，如微處理器，存儲器，界面電路等。盒中也可任選包括硬碟驅動器，軟盤驅動器，高容量的可移動式驅動器，如可寫的CD-ROM和其它普通的周邊設備。任選提供諸如鍵盤或滑鼠的輸入裝置供用戶輸入和選擇在相關的計算機系統中待比較或操作的序列。
計算機一般包括適當的軟體用於接受用戶的指令，所述指令可以是用戶輸入一套參數欄位的形式，例如在GUI中，或者是預先編程的指令形式，例如預先為多種不同的特定操作編程。然後，軟體將這些指令轉變為適當的語言，指示不固定方向的操作和傳送控制器進行所需要的操作。
軟體也可包括(例如根據序列或本文序列的比對)控制核酸合成的輸出元件，或其它發生在序列比對下遊的操作，或其它使用對應於本文序列的特徵鏈進行的操作。
在一個實施方案中，本發明提供了集成系統，其含有含資料庫的計算機或計算機可讀介質，所述資料庫中具有一個或多個序列記錄。每個序列記錄含有一種或多種對應於選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO85的核酸或多肽或蛋白質序列的特徵鏈。集成系統還含有用戶輸入界面，它可以使用戶選擇性地查看一個或多個序列記錄。在一個這種集成系統中，計算機或計算機可讀介質含有比對指令集，可比對特徵鏈與一種或多種其它的，對應於核酸或多肽或蛋白質序列的特徵鏈。
一個這種集成系統包括指令集，其含有下列中的至少一個局部同源性比較測定，同源性序列比對測定，相似性檢索測定和BLAST測定。在一些實施方案中，系統還含有可讀的輸出元件，它可以顯示通過序列比對指令集產生的比對結果。在另一個實施方案中，計算機或計算機可讀介質還含有指令集，它能將至少一種核酸序列翻譯成胺基酸序列，所述核酸序列含有選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78的序列。該指令集可通過將密碼子使用指令集或測定序列同一性的指令集應用於受試核酸序列來選擇核酸。
本發明還提供了使用計算機系統呈現資料庫中儲存的多個序列記錄的至少一種所固有的信息的方法。每個序列記錄含有至少一種對應於SEQ IDNO1至SEQ ID NO85的特徵鏈。該方法包括測定至少一種對應於SEQ IDNO1至SEQ ID NO85中的一種或多種或其亞序列的特徵鏈；確定用戶在列出的至少一種特徵鏈中選擇哪一種；和顯示每種選定的特徵鏈，或比對每種選定的特徵鏈和其它特徵鏈。該方法還包括顯示每種選定的特徵鏈和其它特徵鏈的序列比對和/或顯示列表。試劑盒在其它方面，本發明提供了使本文所述的方法，組合物，系統和儀器具體化的試劑盒。本發明的試劑盒任選包括一種或多種下列組分(1)本文所述的儀器，系統，系統組件或儀器組件；(2)實施本文所述方法，和/或操作本文所述儀器或儀器組件，和/或使用本文所述組合物的說明書；(3)一種或多種α幹擾素同系物組合物(例如含有至少一種本發明的幹擾素α同系物核酸或多肽或其片斷，細胞，載體等的組合物)或組分(本發明的幹擾素α同系物核酸或多肽或其片斷，細胞，載體等)；(4)放置一種或多種本發明的物品，包括所述組分或組合物的容器；和(5)包裝材料。
另一方面，本發明提供了本文所述的任何儀器，儀器組件，組合物或試劑盒用於實施本文所述的任何方法或試驗的用途，和/或任何儀器或試劑盒用於實施本文所述的任何試驗或方法的用途。
實施例實施例1製備和篩選經改組的幹擾素-α文庫通過PCR擴增和DNA酶處理製備約20個人幹擾素-α亞類基因的片斷(長度為25-60個鹼基對(bp))，基本上按Crameri A等(1998；Nature15288-291)所述進行重組，以產生經改組的幹擾素-α成熟編碼序列。通過將經改組的幹擾素-α成熟編碼序列亞克隆至大腸桿菌分泌載體來製備表達文庫。經改組的幹擾素多肽被表達成在C末端與E標記(Amersham-Pharmacia)融合的成熟蛋白質，以便於定量和從周質間隙中純化。使用機器化菌落挑選儀(Q-Bot，Genetix Pharmaceuticals)將大腸桿菌轉化子挑選至微滴板中，並製備周質提取物。
按Scarozza，A.M.等(1992)J.Interferon Res.1235-42所述，檢測周質提取物對人Daudi細胞系的抗增殖活性。
對在Daudi試驗中表現出抗增殖活性的克隆進行再篩選，並通過使用抗-E標記抗體(Amersham-Pharmacia)經Western印跡測定表達水平。選擇已針對表達水平標準化的最高活性的克隆進行測序，並按上文所述，將該克隆用作其它輪改組和篩選的底物。
將得自第一和第二輪改組，並在Daudi試驗中具有相對較高的抗增殖活性的克隆亞克隆至CHO表達載體(pDEI-1011)，其中E-標記/6-His標記(Amersham-Pharmacia)與經改組的幹擾素的C末端融合。將克隆轉染至CHO細胞，用1mg/ml G418選擇穩定的細胞系。在抗-E標記Sepharose柱(Amersham-Pharmacia)上純化CHO-表達的成熟幹擾素，並通過Bradford試驗(Biorad)進行定量。通過Daudi試驗分析CHO-純化的經改組幹擾素的抗增殖活性，按下文所述，使用人WISH細胞/EMCV試驗分析抗病毒活性。人WISH細胞/EMCV抗病毒試驗在96孔培養板中的100μl添加有10％胎牛血清，青黴素(100μg/ml)和鏈黴素(100μg/ml)的RPMI培養基(Gibco-BRL)中，以6×104個細胞/孔的密度接種WISH細胞，於37℃保溫24小時。在孔中加入含幹擾素-α多肽樣品的培養基(總體積為100μl)，於37℃在5％CO2的氣氛中保溫3小時。在孔中加入體積為50μl的EMCV(腦心肌炎病毒)稀釋液，按上述保溫24小時。小心除去培養基，用溫磷酸緩衝鹽水(PBS)將孔衝洗2次。在孔中加入中性紅(用培養基按1∶50稀釋，100μl/孔)，按上述保溫2小時。加入戊二醛(0.5％的PBS溶液，50μl/孔)，按上述保溫30分鐘。用PBS將孔衝洗2次，加入100μl/孔50％甲醇，1％乙酸的溶液。使用微滴板讀數器測定540納米(nm)處的光吸收值。
圖2顯示了與幹擾素-α2a和幹擾素-αCon1相比較而言的，本發明例舉的幹擾素同系物的抗增殖活性和抗病毒活性。圖中顯示了一套例舉的幹擾素α同系物的每毫克同系物的活性單位數(Y軸)，其中每個同系物樣品在X軸上都有一個名稱。實施例2體外癌細胞系篩選使用體外癌細胞系篩選(描述於例如Monks，A.等(1991)J.Nat′l CancerInst.83757-766(下文稱之為″Monks″)和http//dtp.nci.gov./branches/btb/ivclsp.html，皆全文列入本文作為參考)分析本發明的幹擾素-α同系物對特定癌細胞系的選擇性生長抑制和/或細胞殺傷作用。所用60種癌細胞系(表3)包括白血病，黑素瘤，和肺癌，結腸癌，腦癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，中樞神經系統癌，腎系統癌和腎癌。根據″Monks″和http//dtp.nci.gov./branches/btb/ivclsp.html中所述的方法培養人腫瘤細胞系。
被篩選的人癌細胞系
簡單地說，根據特定細胞系的生長特性，將細胞以約5000至約40000個細胞/孔的密度接種於96孔微滴板。接種之後，於37℃將微滴板保溫24小時，然後加入受試樣品(例如本發明的幹擾素同系物或對照幹擾素)。24小時之後，用三氯醋酸(TCA)原位固定每種細胞系的兩個平板，以測定在添加受試樣品時(T0)每種細胞系的細胞群體。在剩下的培養板中，加入經5次10倍連續稀釋，濃度為10-0.8至10-4.8μg/ml(由CHO細胞上清液親和純化的)的幹擾素樣品。
加入樣品之後，將培養板再保溫6天。通過加入TCA終止試驗。
通過在定量蛋白質染料結合試驗中測定細胞蛋白質來測定細胞群體。在每個孔中加入含0.4％(w/v)硫代羅丹明(sulforhodamine)B的1％乙酸溶液(100μl)，接著在室溫下保溫10分鐘。通過用1％乙酸洗5次以除去未結合的染料，並使培養板風乾。用10毫摩爾(mM)Tris溶解與蛋白質結合的染料，在自動化的培養板讀數器上讀出515納米(nm)處的光吸收值。
每個劑量-反應試驗取7份光吸收值測定結果，它們對應於加入樣品前(時間為0；T0)的細胞蛋白質量，在缺乏受試樣品的條件下於保溫期結束時細胞蛋白質的量(對照生長，C)，和5份對應於在存在5種濃度的幹擾素受試樣品時，在保溫期結束時細胞蛋白質量的測定結果(檢測存在5個濃度水平的幹擾素受試樣品時的生長，Ti)。使用這些測定結果計算出每種受試樣品的下列3個參數GI50，或「50％生長抑制」是使細胞生長50％受抑制所需的幹擾素受試樣品的濃度，該值是通過在保溫期結束時，幹擾素受試樣品中淨蛋白質/多肽的增加相對於對照細胞(不含受試樣品)中的而言減少50％來測定的。GI50被計算為受試樣品的濃度，其中[(Ti-To)/(C-To)]x100＝50。見圖3A。
TGI，或「總生長抑制」是使細胞生長全面受抑制所需的幹擾素受試樣品的濃度，其中保溫期結束時的細胞蛋白質的量等於保溫期開始時的細胞蛋白質的量。產生總生長抑制(TGI)的幹擾素受試樣品的濃度被計算為受試樣品的濃度，其中Ti＝To。
LC50是與保溫期開始時所觀察到的細胞蛋白質量相比，在保溫結束時，測定的細胞蛋白質的量降低50％時幹擾素受試樣品的濃度，它顯示了在加入幹擾素受試樣品之後細胞的淨損失。LC50被計算為受試樣品的濃度，其中[(Ti-To)/To]×100＝-50。
如果對於特定的受試樣品而言，在受試的濃度範圍內未達到效果或者效果非常好，所述參數的值被表示為大於或小於受試的最大或最小濃度。實施例3IFN-α同系物的體外活性與體內效力相關聯改組人幹擾素-α基因片斷，並按Chang等(1999)Nature Biotechnol.17793-797所述，在基於鼠細胞的抗病毒試驗中篩選活性。分離出比人幹擾素-α2a針對小鼠細胞的抗病毒活性高105倍的幹擾素-α同系物。多種幹擾素-α同系物的抗病毒活性甚至顯著超過天然小鼠幹擾素，包括Mu-IFN-α4(Chang等，文獻同上)的抗病毒活性。對人幹擾素-α基因片斷進行回歸序列重組(例如DNA改組)以產生新的幹擾素α同系物，隨後針對鼠幹擾素受體篩選這種同系物，結果可鑑定並分離出活性優於與其密切相關的鼠類的幹擾素-α同系物。
在小鼠中進行劑量-反應研究以測定在體外觀察到的高抗病毒活性是否也能在體內維持。在此研究中使用了兩種在本文中被稱為CH2.2和CH2.3(分別為SEQ ID NO84和85)的小鼠-最優化幹擾素-α同系物。CH2.2和CH2.3在體外小鼠細胞抗病毒試驗中，相對於人幹擾素-α2a而言，分別具有約高138,000-倍和206,000-倍的活性，相對於天然小鼠幹擾素-α4而言，具有約高2.5倍和約高1.6倍的活性(Chang等，文獻同上)。
幾組Balb/c小鼠連續4天，以每天為2，10或50μg(總體積為50μl)的皮下劑量接受磷酸緩衝鹽水(PBS)，幹擾素-α同系物CH2.2，幹擾素-α同系物CH2.3，鼠IFN-α4或人幹擾素-α2a。在第2天，將小鼠暴露於致死鼻內劑量(10倍於LC50)的水泡性口炎病毒(VSV)中。數據被表示為能活到第21天的小鼠數目。
圖5顯示了在保護小鼠免受VSV感染方面，與天然小鼠幹擾素Mu-IFN-α4相比，小鼠-最優化幹擾素-α同系物CH2.2和CH2.3同樣有效或更加有效。在保護小鼠免受病毒感染方面，受試濃度的人IFN-α2a幾乎完全無效。因此，本發明的幹擾素-α同系物的體內效力與在體外試驗中觀察到的抗病毒活性的相關性較明顯。
儘管為了闡明和理解的目的，已經較詳細地描述了上述發明，但本領域技術人員通過閱讀此內容可以清楚地知道對形式和細節的多種改變並不背離本發明真正的範圍。例如，可以以多種組合方式使用上文所述的所有技術，方法，組合物，儀器和系統。為了所有的目的，本申請中提及的所有出版物，專利，專利申請或其它文件都全文列入本文作為參考，就象每個單獨的出版物，專利，專利申請或其它文件為了所有目的被單獨地提到需列入本文作為參考一樣。
序列
序列表110沃爾克，海因裡希斯(HEINRICHS，VOLKER)特迪，陳(CHEN，TEDDY)菲利普，A，帕滕(PATTEN，PHILLIP A.)120IFN-α同系物13002-101510/0140.00214014115009/415,1831511999-10-0716088170PatentIn Ver.2.0211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號2DH124001tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggc aacaggaggg ccttgatgct cctggcacaa 60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac aagactttgg attcccccag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggaacagacc 240ctcctagaaa aattttccac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg 300atacaggagg taggggtgaa agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360aggaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa4982102211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號2CA34002tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt gacaggaggg ccatgatact cctggcacaa 60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagat atgatttcgg attcccccag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggaacagagc 240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcagctga atgaactgga agcatgtgtg 300atacaggagg ttggggtggg agagactccc ctgatgaatg gggactccat cctggctgtg 360aagaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa4982103211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號4AB94003tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggc aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa 60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccgg 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atgcagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcaactga atgaactgga agcatgtgtg 300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cctggctgtg 360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgttcc 420tgggaggttg 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tggactccat cctggctgtg 360aggaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821012211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號1F340012tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctgggacaa 60atgggaagaa tctctcattt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga ccttcaacct cttcagcaca aaggactcat ctgttgcttg ggatgagagg 240cttctagaca aactctatac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300atgcaggagg tgtgggtggg agggactccc ctgatgaatg aggactccat cctggctgtg 360agaaaatact tccaaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821013211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號4BE1040013tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacag 60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagat 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tctctgtcct ccatgagatg 180atccaacaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca 240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg 300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cttggctgtg 360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821073211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號CH1.240073tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa 60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaaggca tctctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga ccttccatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggaacagagc 240ctcctagaaa aattttccac tgaacttaac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg 300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg 360aagaaatact tccgaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa 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ggatgagacc 240ctcctagaca aattctacat tgaacttttc cagcaactga atgacctgga agcctgtgtg 300atgcaggagg agagggtggg agaaactccc ctgatgaatg cggactccat cttggctgtg 360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821076211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號CH2.1tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggagga ctttgatgat aatggcacaa 60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg atttcctcag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggacteat ctgctacttg ggatgagaca 240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg 300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cttggctgtg 360aagaaatact tccgaagaat GaGtctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821077211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號CH2.240077tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa 60atgggaagaa tctctccttt ctcctgtctg atggacagac atgactttgg atttccccag 120gaggagtttg atgacaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg 180atccaacaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca 240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg 300atgcaggagg ttggagtgga agacactcct ctgatgaatg tggactctat cctgactgtg 360aagaaatact tccgaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821078211498212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA220223克隆編號CH2.340078tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggagga ctttgatgat aatggcacaa 60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg atttcctcag 120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ceatgagatg 180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca 240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg 300atgcaggagg ttggagtgga agacactcct ctgatgaatg aggactceat cttggctgtg 360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc 420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tctcaacaaa cttgcaaaaa 480agattaagga ggaaggaa49821079211166212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸220223克隆編號CH1.140079Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Met Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 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Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu16521082211166212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸220223克隆編號CH1.440082Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu16521083211166212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸220223克隆編號CH2.140083Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Met Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu16521084211166212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸220223克隆編號CH2.240084Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Met Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu16521085211166212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸220223克隆編號CH2.340085Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met100 105 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu1652108621115212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的DNA40086tgcgacttac cacaa152108721126212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸40087Trp Glu Val Val Arg Ser Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Tyr Ser Thr1 5 10 15Asn Leu Gln Arg Arg Leu Arg Arg Lys Asp20 252108821126212PRT213人工序列220223人工序列的描述合成的胺基酸223人工序列的描述合成的胺基酸40088Trp Glu Leu Val Arg Ala Glu Ile Val Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr1 5 10 15Asn Leu Asn Lys Arg Leu Arg Lys Lys Glu20 2權利要求
1.分離或重組的核酸，其含有選自下列的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO1至SEQ ID NO35，或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(c)在高度嚴緊的雜交條件下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)雜交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)的片段的多核苷酸序列，所述片段編碼在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性的多肽。
2.分離或重組的核酸，其含有選自下列的多核苷酸序列(a)SEQ ID NO72至SEQ ID NO78，或其互補多核苷酸序列；(b)編碼選自SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(c)在高度嚴緊的雜交條件下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)雜交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段編碼在基於鼠細胞系/EMCV的試驗中具有抗病毒活性的多肽。
3.分離或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有以下胺基酸序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。
4.權利要求3的核酸，所述多肽在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中具有抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
5.權利要求3的核酸，其中所編碼的多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。
6.權利要求3的核酸，其中所編碼的多肽含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO54的胺基酸序列。
7.權利要求3的核酸，所述核酸含有選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO19的多核苷酸序列。
8.分離或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有的胺基酸中含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少20個連續的胺基酸，和Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166中的一個或多個胺基酸，其中胺基酸的編號對應於SEQ ID NO36中的編號。
9.權利要求8的核酸，其中所編碼多肽的長度為166個胺基酸。
10.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有抗增殖活性。
11.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
12.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽含有胺基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166。
13.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少50個連續的胺基酸殘基。
14.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少100個連續的胺基酸殘基。
15.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少150個連續的胺基酸殘基。
16.權利要求8的核酸，其中所編碼的多肽含有選自下列的胺基酸序列SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46。
17.權利要求8的核酸，其含有選自下列的多核苷酸序列SEQ IDNO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQID NO7，SEQ ID NO10和SEQ ID NO11。
18.分離或重組的核酸，其含有編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少155個連續的胺基酸，所述胺基酸序列含有胺基酸Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於SEQ ID NO36中的編號。
19.權利要求18的核酸，其中所編碼的多肽含有選自下列的胺基酸序列SEQ ID NO36，SEQ ID N037，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46。
20.含有權利要求1，2，8或18的核酸的細胞。
21.權利要求20的細胞，其中所述細胞表達由所述核酸編碼的多肽。
22.含有權利要求1，2，8或18的核酸的載體。
23.權利要求20的載體，其中所述載體包括質粒，粘粒，噬菌體或病毒。
24.權利要求22的載體，其中所述載體是表達載體。
25.被權利要求22的載體轉導的細胞。
26.含有權利要求1，2，8或18的核酸和賦形劑的組合物。
27.權利要求26的組合物，其中賦形劑是藥物可接受的賦形劑。
28.通過用限制性內切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化權利要求1，2，3，8或18的一種或多種核酸而產生的組合物。
29.通過以下方法產生的組合物，所述方法包括在脫氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶的存在下保溫權利要求1，2，3，8或18的一種或多種核酸。
30.權利要求29的組合物，其中核酸聚合酶是熱穩定性的聚合酶。
31.分離或重組的多肽，所述多肽由權利要求1，2，3，8或18的核酸編碼。
32.權利要求31的分離或重組的多肽，其含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的序列。
33.權利要求31的多肽，它在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。
34.分離或重組的多肽，其含有以下胺基酸序列CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的變體，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。
35.權利要求34的多肽，它在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。
36.權利要求34的多肽，其含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO54的序列。
37.一種多肽，其含有由一種編碼多核苷酸序列編碼的蛋白質的至少100個連續的胺基酸，其中所述多核苷酸序列選自(a)SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78；(b)編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQID NO85的第一種多肽的編碼多核苷酸序列；和(c)在高度嚴緊條件下，與基本上全長的多核苷酸序列(a)或(b)雜交的互補多核苷酸序列。
38.權利要求37的多肽，所述多肽在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中具有抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
39.權利要求37的多肽，其中所述多肽特異性結合人α-幹擾素受體。
40.權利要求37的多肽，其含有所編碼蛋白質的至少150個連續的胺基酸。
41.分離或重組的多肽，其包括含SEQ ID NO36-70中任一個的至少50個連續胺基酸的胺基酸序列，並包括含有以下一個或多個胺基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166的胺基酸序列，其中胺基酸的編號對應於SEQ IDNO36中的編號。
42.權利要求41的多肽，其中所述多肽結合人α-幹擾素受體。
43.權利要求41的多肽，所述多肽在基於人Daudi細胞系的細胞增殖試驗中具有抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有抗病毒活性。
44.權利要求41的多肽，它在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。
45.權利要求41的多肽，其中所述多肽的長度為166個胺基酸。
46.權利要求41的多肽，所述多肽含有胺基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中所述多肽的胺基酸編號對應於SEQ ID NO36中的胺基酸編號。
47.權利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少100個連續的胺基酸殘基。
48.權利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少150個連續的胺基酸殘基。
49.權利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少155個連續的胺基酸殘基。
50.權利要求41的多肽，其含有選自下列的胺基酸序列SEQ IDNO36，SEQ ID N037，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ IDNO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46。
51.分離或重組的多肽，其含有的胺基酸序列中含有SEQ ID NO36-70中任一個的至少155個連續的胺基酸，該分離或重組的多肽含有胺基酸Lys160和Glu166，其中胺基酸的編號對應於SEQ ID NO36中的編號。
52.權利要求51的多肽，其含有選自下列的胺基酸序列SEQ IDNO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ IDNO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO45和SEQ ID NO46。
53.權利要求51的多肽，所述多肽在基於人Daudi細胞系的試驗中具有至少約為8.3×106個單位/mg的抗增殖活性，或在基於人WISH細胞/EMCV的試驗中具有至少約為2.1×107個單位/mg的抗病毒活性。
54.權利要求31，34，37，41或51的多肽，進一步含有分泌/定位序列。
55.權利要求31，34，37，41或51的多肽，進一步含有多肽純化亞序列。
56.權利要求55的多肽，其中便於純化的序列選自表位標記，FLAG標記，多聚組氨酸標記和GST融合物。
57.權利要求31，34，37，41或51的多肽，進一步在N末端含有甲硫氨酸。
58.權利要求31，34，37，41或51的多肽，其含有經修飾的胺基酸。
59.權利要求58的多肽，其中經修飾的胺基酸選自糖基化胺基酸，PEG化胺基酸，法尼基化胺基酸，乙醯基化胺基酸和生物素化胺基酸。
60.含有權利要求31，34，37，41或51的多肽和賦形劑的組合物。
61.權利要求60的組合物，其中賦形劑是藥物可接受的賦形劑。
62.含有權利要求58的多肽和藥物可接受的賦形劑的組合物。
63.與抗至少一種抗原的多克隆抗血清特異性結合的多肽，所述至少一種抗原含有SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ IDNO85中的至少一種胺基酸序列，或其片斷，其中用IFN-α多肽減除所述抗血清，所述IFN-α多肽由對應於下列一個或多個GenBank登記號的核酸編碼J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
64.通過給哺乳動物施用權利要求31，34，37，41或51的多肽而產生的抗體或抗血清，所述抗體或抗血清特異性地結合至少一種抗原，所述至少一種抗原含有的多肽中含有SEQ ID NO36至SEQ ID NO70以及SEQ IDNO79至SEQ ID NO85中的至少一種胺基酸序列，或其片斷，其中抗體或抗血清不能特異性地結合由對應於下列一個或多個GenBank登記號的核酸編碼的IFN-α多肽J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
65.一種能特異性結合多肽的抗體或抗血清，所述多肽含有選自SEQ IDNO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ ID NO85的序列，其中所述抗體或抗血清不能特異性地結合由對應於下列一個或多個GenBank登記號的核酸編碼的IFN-α多肽J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
66.生產多肽的方法，所述方法包括在細胞群體中導入權利要求1，2，3，8或18的核酸，所述核酸與能有效產生編碼多肽的調節序列可操作相連；和在培養基中培養所述細胞以生產所述多肽。
67.生產多肽的方法，所述方法包括在細胞群體中導入含有權利要求1，2，3，8或18的核酸的重組表達載體；和在適於生產由所述表達載體編碼的所述多肽的條件下，在培養基中培養所述細胞。
68.抑制腫瘤細胞群體生長的方法，所述方法包括將腫瘤細胞群體與有效量的權利要求31，34，37，41或51的多肽接觸，從而抑制所述細胞群體中腫瘤細胞的生長，其中所述有效量足以抑制所述腫瘤細胞群體中腫瘤細胞的生長。
69.權利要求68的方法，其中所述腫瘤細胞選自人癌細胞，人白血病細胞，人T-淋巴瘤細胞和人黑素瘤細胞。
70.權利要求68的方法，其中所述腫瘤細胞是在培養中。
71.抑制被病毒感染的至少一個細胞內的病毒複製的方法，所述方法包括將所述至少一個被感染的細胞與有效量的權利要求31，34，37，41或51的多肽接觸，從而抑制所述至少一個感染細胞中的病毒複製，其中所述有效量足以抑制所述至少一個感染細胞內的病毒複製。
72.權利要求71的方法，其中所述病毒是RNA病毒。
73.權利要求72的方法，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒或C型肝炎病毒。
74.權利要求71的方法，其中所述病毒是DNA病毒。
75.權利要求74的方法，其中所述病毒是B型肝炎病毒。
76.權利要求71的方法，其中所述細胞是經培養的。
77.治療患者的自身免疫病的方法，所述方法包括給患者施用有效量的權利要求31，34，37，41或51的多肽。
78.權利要求77的方法，其中自身免疫病選自多發性硬化，類風溼性關節炎，紅斑狼瘡和I型糖尿病。
79.治療通過給受試者施用幹擾素-α即可治療的疾病的方法，所述改良方法包括給受試者施用有效量的權利要求31，34，37，41或51的多肽。
80.權利要求79的方法，其中通過施用幹擾素-α即可治療的疾病選自硬化，類風溼性關節炎，紅斑狼瘡和I型糖尿病。
81.製備經修飾的或重組的核酸的方法，所述方法包括使權利要求1，2，3，8或18的一種或多種核酸的序列與一種或多種其它核酸的序列回歸重組，所述一種或多種其它核酸的每種序列編碼幹擾素-α或其胺基酸亞序列。
82.權利要求81的方法，其中所述回歸重組產生了重組幹擾素-α同系物核酸的至少一種文庫。
83.由權利要求82的方法產生的核酸文庫。
84.含有權利要求83的文庫的細胞群體。
85.由權利要求82的方法產生的重組幹擾素-α同系物核酸。
86.含有權利要求85的核酸的細胞。
87.權利要求81的方法，其中回歸重組在體外進行。
88.權利要求81的方法，其中回歸重組在體內或來自體內進行。
89.含有權利要求1，2，3，8或18中的兩種或多種核酸的組合物。
90.權利要求89的組合物，其中該組合物含有包括至少10種核酸的文庫。
91.生產經修飾或重組的幹擾素-α同系物核酸的方法，所述方法包括使權利要求1，2，3，8或18的核酸突變。
92.由權利要求91的方法生產的經修飾或重組的幹擾素-α同系物核酸。
93.含有資料庫的計算機或計算機可讀介質，所述資料庫含有序列記錄，所述序列記錄含有一種或多種對應於選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO85的核酸或蛋白質序列的特徵鏈。
94.集成系統，其含有含資料庫的計算機或計算機可讀介質，所述資料庫中含有一個或多個序列記錄，每個所述序列記錄含有一種或多種對應於選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO85的核酸或蛋白質序列的特徵鏈，該集成系統還含有用戶輸入界面，它可以使用戶選擇性地查看所述一個或多個序列記錄。
95.權利要求94的集成系統，其中計算機或計算機可讀介質含有比對指令集，可比對特徵鏈與一種或多種其它的，對應於核酸或蛋白質序列的特徵鏈。
96.權利要求95的集成系統，其中指令集含有下列中的一個或多個局部同源性比較測定，同源性序列比對測定，相似性檢索測定和BLAST測定。
97.權利要求95的集成系統，其進一步含有用戶可讀的輸出元件，可以顯示通過序列比對指令集產生的比對結果。
98.權利要求94的集成系統，其中計算機或計算機可讀介質還含有一種指令集，該指令集能將至少一種核酸序列翻譯成胺基酸序列，所述核酸序列含有選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ ID NO72至SEQ ID NO78的序列。
99.權利要求94的集成系統，其中計算機或計算機可讀介質還含有一種指令集，該指令集能將至少一種胺基酸序列逆翻譯成核酸序列，所述胺基酸序列含有選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ IDNO85的序列。
100.權利要求99的集成系統，其中該指令集可通過將密碼子使用指令集或測定序列同一性的指令集應用於受試核酸序列來選擇核酸序列。
101.使用計算機系統呈現資料庫中儲存的多個序列記錄的至少一種所固有的信息的方法，每個所述序列記錄含有至少一種對應於SEQ ID NO1至SEQ ID NO85的特徵鏈，該方法包括確定對應於SEQ ID NO1至SEQ ID NO85中的一種或多種或其亞序列的至少一種特徵鏈的列表；確定用戶在所述列表的至少一種特徵鏈中選擇哪一種；和顯示每種選定的特徵鏈，或將每種選定的特徵鏈與一種另外的特徵鏈進行比對。
102.權利要求101的方法，其進一步包括顯示每種選定的特徵鏈與另外的特徵鏈的序列比對。
103.權利要求101的方法，其進一步包括顯示列表。
104.一種核酸，它在選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO35或SEQ IDNO72至SEQ ID NO78的核酸中含有獨特的亞序列，其中與已知幹擾素-α核酸序列的核酸序列或對應於下列任何GenBank登記號的核酸相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
105.一種多肽，它在選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ IDNO79至SEQ ID NO85的多肽中含有獨特的亞序列，與已知幹擾素-α多肽序列，或由對應於以下任何GenBank登記號的核酸所編碼多肽的序列相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
106.一種靶核酸，它在嚴緊條件下與獨特的編碼寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸編碼選自SEQ ID NO36至SEQ ID NO70或SEQ ID NO79至SEQ IDNO85的多肽中的獨特亞序列，其中與已知幹擾素-α多肽序列，或由對應於以下任何GenBank登記號的核酸所編碼多肽的序列相比，這種獨特的亞序列是獨一無二的J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
107.權利要求106的核酸，其中選擇嚴緊條件以使與獨特的編碼寡核苷酸精確互補的寡核苷酸能與獨特的編碼寡核苷酸雜交，且其信號噪聲比要比精確互補的寡核苷酸與對應於以下任何GenBank號的對照核酸雜交的信號噪聲比至少約高5倍J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，其中所述靶核酸與所述獨特的編碼寡核苷酸雜交，且其信號噪聲比要比對照核酸與該編碼寡核苷酸雜交的信號噪聲比至少約高2倍。
108.權利要求1，2，3，8或18中任一項的核酸，其中核酸編碼幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a對癌細胞群體的生長抑制活性而言，所述同系物對所述癌細胞群體的生長抑制活性有所增強。
109.權利要求108的核酸，其中所述癌細胞群體的癌細胞含有選自下列的癌細胞系白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；中樞神經系統(CNS)癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系，生長抑制活性被測定為使癌細胞系的生長50％受抑制所需的幹擾素-α同系物的濃度(GI50值)，其中幹擾素-α同系物的GI50值比人幹擾素-α2a的GI50值低至少2倍。
110.權利要求109的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的GI50值比人幹擾素-α2a的GI50值低至少5倍。
111.權利要求107的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的GI50值比人幹擾素-α2a的GI50值低至少10倍。
112.權利要求1，2，3，8或18中任一項的核酸，其中所述核酸編碼幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a對癌細胞群體的細胞靜止活性而言，所述同系物對所述癌細胞群體的細胞靜止活性有所增強。
113.權利要求112的核酸，其中癌細胞含有選自下列的癌細胞系白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系，細胞靜止活性被測定為導致細胞系的生長受到完全抑制所需的幹擾素-α的濃度(TGI值)，其中幹擾素-α同系物的TGI值比人幹擾素-α2a的TGI值低至少2倍。
114.權利要求112的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的TGI值比人幹擾素-α2a的TGI值低至少5倍。
115.權利要求112的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的TGI值比人幹擾素-α2a的TGI值低至少10倍。
116.權利要求1，2，3，8或18中任一項的核酸，其中所述核酸編碼幹擾素-α同系物，相對於人幹擾素-α2a對癌細胞群體的細胞毒活性而言，所述同系物對所述癌細胞群體的細胞毒活性有所增強。
117.權利要求116的核酸，其中癌細胞含有選自下列的癌細胞系白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；中樞神經系統(CNS)癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系，細胞毒活性被測定為使保溫期之後測定的細胞系中細胞蛋白的量減少50％所需的幹擾素-α的濃度(LC50值)，其中幹擾素-α同系物的LC50值比人幹擾素-α2a的LC50值低至少2倍。
118.權利要求116的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的LC50值比人幹擾素-α2a的LC50值低至少5倍。
119.權利要求116的核酸，其中所編碼的幹擾素-α同系物的LC50值比人幹擾素-α2a的LC50值低至少10倍。
120.權利要求31，34，37，41或51中任一項的多肽，相對於人幹擾素-α2a對癌細胞群體的抑制活性而言，所述多肽對所述癌細胞群體的生長抑制活性有所增強。
121.權利要求120的多肽，其中癌細胞群體含有選自下列的癌細胞系白血病細胞系；黑素瘤細胞系；肺癌細胞系；結腸癌細胞系；CNS癌細胞系；卵巢癌細胞系；乳腺癌細胞系；前列腺癌細胞系和腎癌細胞系，生長抑制活性被測定為導致細胞系的生長50％受抑制所需的多肽或人幹擾素-α2a的濃度(GI50值)，其中多肽的GI50值比人幹擾素-α2a的GI50值低至少2倍。
122.由權利要求81的方法產生的核酸。
123.由權利要求81的方法產生的幹擾素-α多肽或其胺基酸亞序列。
全文摘要
本發明提供了幹擾素同系物(核酸和多肽)。還提供了包括這些幹擾素同系物多肽和核酸的組合物，含有所述同系物多肽和核酸的重組細胞，製備新同系物的方法，針對新同系物的抗體和使用同系物的方法。還提供了含有核酸或多肽。
文檔編號A61P31/20GK1451045SQ00816713
公開日2003年10月22日 申請日期2000年10月6日 優先權日1999年10月7日
發明者沃爾克·海因裡希斯, 特迪·陳, 菲利普·A·帕滕 申請人:馬克西根公司