Bst2抑制劑的作用的製作方法

2023-06-29 07:55:56

專利名稱：Bst2抑制劑的作用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抑制發炎期間細胞間粘附的分子和其用途。本發明也涉及 在抑制參與炎症的細胞的細胞間粘附和激活中使用骨髓基質抗原-2 ( Bone Marrow Stromal Antigen-2, Bst2 )蛋白或其片段作為誘斜或Bst2結合抗體 以及小分子。本發明也涉及發現Bst2配位體和Bst2配位體抑制劑的方法。 本發明也涉及包含前述物質的組合物和預防或治療炎症相關疾病的方法。
背景技術：
炎症是身體保護組織免於感染、損傷或疾病的正常反應。炎症反應以 由受感染組織中的細胞產生和釋放化學因子開始。化學因子引起發紅、腫 脹、疼痛、發熱和功能喪失。發炎組織中的細胞產生募集白細胞到發炎部 位的信號。白細胞必須粘附於內皮細胞以從血流遷移到發炎部位。同時， 白細胞應粘附於抗原呈遞細胞(antigen presenting cell)以允許正常的特異 性免疫反應，且最後應粘附於合適靶細胞以溶解病原體感染細胞、癌細胞 或其類似細胞。所募集到的白細胞清除任何感染性或有害因子，且從損傷 組織去除損壞細胞的碎片。
浸潤白細胞通過吞噬入侵孩i生物或死細胞而在正常炎症的組織再生和 免疫反應中發揮關鍵作用。然而，浸潤白細胞在病理性慢性炎症中引起嚴 重或致命的狀態。因持續炎症反應而將自身細胞異常識別為非自身(外來) 或過度發炎引起多種發炎性疾病，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、白內障、 再灌注損傷、感染性腦膜炎、類風溼性關節炎、嗜喘、膿毒症(敗血症)、發 炎性腸病和多發性硬化症。
白細胞與內皮細胞之間的相互作用如下。
白細胞具有雙重功能，可以在血流中循環和粘附於特定細胞的形式起 作用。具體來說，粘附的白細胞與內皮細胞相互作用，使與抗原呈遞細胞
的細胞間粘附穩定或充當遷移到發炎性或感染部位的效應細胞(effector cell)。對於正常特異性免疫反應，白細胞應粘附於抗原呈遞細胞，且最終應 粘附於合適靶細胞以溶解病原體感染細胞、癌細胞或其類似細胞。在同種 異體移植排斥、皮膚感染或損傷區域出現白細胞的大量入侵，且在多種疾
5病中也被觀察到，這些疾病包括退化性關節疾病(諸如，骨關節炎)、銀屑 病(牛皮癬)、多發性硬化症、哮喘、類風溼性關節炎、接觸性皮炎和發炎性 腸病。
在這些疾病中，大於95。/。的骨髓細胞(myeloidcell)移到發炎部位並在發
炎部位積聚:，白細胞，發，性，應的關鍵因子，其發揮抗菌〉分泌和吞，
症或需要出現炎症的組織中。實際上，諸如非類固醇消炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drug， NSAID )或糖皮質激素的消炎劑透過阻止白細胞的 粘附和流入發揮治療功效。在動物模型中，對細胞間粘附的抑制可改良或 預防自體免疫疾病動物模型中的疾病或同種異體移植排斥。最近臨床研究 已揭露抑制LFA-1/ICAM-1或VLA-4/VCAM-l相互作用的人化單克隆抗體 對包括銀屑病、多發性硬化症和發炎性腸病的自體免疫疾病具有顯著的功 效和良好的安全性。
為炎症相關疾病的發病機理的重要特徵白細胞對內皮細胞不受控制 的入侵，乃通過多步過程發生，這一過程以白細胞粘附且結合於內皮細胞 的表面開始。白細胞與內皮細胞表面的結合由存在於白細胞和內皮細胞表 面上的細胞表面分子所促成(Bevilacqua, / C/z'"./"vw/. 11:767-804, 1993 )。 細胞表面分子因白細胞從血流中遷移出而過度表達。
白細胞與內皮細胞之間的相互作用是許多發炎性疾病的關4定因素。舉 例來說，有人提出增強的白細胞-內皮細胞相互作用導致肝微灌注病症是肝 功能衰竭的主要促成因素(Croner等人，M/cravosc 67:182-191, 2004 )。 舉例來說，動脈粥樣硬化是典型的發炎性疾病，其中包括T淋巴細胞和活 化巨噬細胞的大量發炎性細胞集中於動脈粥樣硬化部位。單核細胞於動脈 內皮的離散片段中的積聚和粘附是動脈粥樣化形成中最早的可檢測的事件 且為動脈粥樣硬化發病機理的主要特徵(Ross, iVa/ww 362:801-809, 1993 )。 在這一區域內，存在豐富的促發炎細胞因子，包括調控區域發炎性反應的 幹擾素-Y和腫瘤壞死因子-a。大量粘附分子表達於單核細胞表面上(Valente 等人，C/rcw/加'o" 86:11120-25, 1992)，且覆蓋在動脈粥樣硬化病灶上的內皮 細胞表達大量血管配位體(Poston等人,J: PaAo/， 140:665-673, 1992 )。
白細胞外滲穿過內皮屏障是諸如類風溼性關節炎的發炎性疾病發病機 理中的關鍵事件。內皮細胞參與關節炎的基本機制，諸如腫瘤壞死因子-a 和誘發炎症的細胞因子(諸如白細胞介素-1(3)的多種炎症介體通過這一機
高，從而導致白細胞與內皮細胞之間的相i作用增強。將白細胞募集到血
管內皮細胞也是哮喘的重要步驟。
在患有哮喘的患者的氣管中，存在增大數目的已激活嗜酸性粒細胞、CD25陽性T淋巴細胞和具有血液單核細胞表型特徵的不成熟巨噬細胞。人 白細胞抗原(HLA) II類的表達在上皮細胞、巨噬細胞和其它浸潤細胞中 增加(Arm等人，v4t/v.//wmmo/. 51:323-382, 1992 )。
白細胞遷移穿過血腦屏障的速率增加是多發性硬化症的主要症狀。白 細胞中的緊密連接蛋白質與內皮細胞中的緊密連接蛋白質之間的相互作用 在生理條件下促使白細胞外滲到中樞神經系統中且緊密連接蛋白質的表達 改變是多發性硬化症的病理學先決條件(Worthylake等人，Cwr. Qp/". CW/ 祝o/. 13:569-577,2001 )。
如上所述，因為白細胞粘附於內皮細胞在多種疾病中很重要，所以對 細胞間粘附的抑制可產生各種發炎性和免疫疾病的治療策略。
在分子生物學方面，已知以下分子參與炎症。
細胞因子(cytokines): —般針對嚴重細菌感染或外傷性損傷的會產生的 全身性炎症可影響早期損傷的組織系統末梢(Lush和Kvietys， M/cra">r"/a"o" 7:83-101， 2000 )。從受侵染組織釋放的細菌產物和其它誘發 炎症的介體誘導誘發炎症的介體的形成，所述介體包括腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-alpha, TNF-a )、白細胞介素-l(3、 y畫幹擾素和白細胞 介素-6。在膿毒病中，血管內皮損傷促進TNF-a和白細胞介素-l卩的產生。 這些細胞因子直接作用於內皮細胞並增強白細胞粘附(Pober等人， / /麵畫/. 137:1893-1896, 1986; Dustin和Springer, / CW/腸/. 107:321-331， 1988; Cotran和Pober， ■/爿m. Soc. TVep/zra/. 1:225-235， 1988 )。這些細月包因子 也激活血液和血管內皮中的血液嗜中性粒細胞(Arai等人，4朋"i ev 59:783-836， 1990 )。舉例來說，TNF-a通過自分泌或旁分泌通路誘 導出 一 系列細胞因子、趨化因子和蛋白酶(Ghezzi和Cerami， Md/zoA Mo/. MW. 98:1-8. 2004)。白細胞介素-6通過粘附分子的表達誘發單核內皮細胞 相互作用和發炎性損傷，從而啟始動脈粥樣硬化過程。白細胞介素-6血液 濃度的增強涉及血管炎症和動脈粥樣硬化發展(Rader， N. J iWed
343:1179-1182, 2000 )。白細胞介素-17誘導許多炎症介體的表達且參與嗜中 性粒細胞的分化、成熟和趨化性(Witowski等人，CW/ Mo/ Zz> 61:567-579, 2004)。白細胞介素-17含量的增加已與數種病理學病症相關， 包括氣管炎症、類風溼性關節炎、腹膜內膿腫和粘附、發炎性腸病、同種 異體移植排斥、銀屑病、癌症和多發性硬化症。
細胞表面粘附分子多種發炎性細胞因子誘導內皮細胞-淋巴細胞粘附 分子(endothelial cell-lymphocyte adhesion molecules ， ELAMs )於糹田月包表面 上的表達(Nortamo等人， / /附ww"o/. 21:2629-2632， 1991 )。其被分為兩 類細胞間粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1 )和內皮 細月包-'淋巴細月包粘P付分子-1 ( endothelial cell-lymphocyte adhesion molecule-1 ，ELAM-1 ) ( Staunton等人，CW/ 52:925-933， 1988 )。血管內皮回應於各種介 體會表達特定細胞表面糖蛋白。血液白細胞的結合和外滲通過與特異性配 位體或對應物受體的相互作用實現(Bevilacqua等人，1993, 1994)。參與這 一過程的分子包括作為CD18配位體的細胞間粘附分子-l (ICAM-1 )、識別 白細胞表面上的糖接合物的選擇素(selectins)和與同一家族中的其它成員 白細胞整合素(integrin)分子相互作用的免疫球蛋白超家族的成員(Panes等 人，J屍/^wo/. 269:H1955-1964， 1995; Khan等人，Mz.cra">cw/""o" 10:351-358, 2003; Nelson等人,82:3253-3258， 1993; Bevilacqua和 Nelson,C7/". /wveW. 91:379-387， 1993 )。白細胞循環受選擇素調控，且白 細胞於內皮細胞上的遷移和粘附由(32整合素、Mac-l( CDllb/CD18、 aMb2、 CR3)和LFA-1引發。Mac-1和LFA-1與表達於內皮細胞表面上的對應物 受體ICAM-1相互作用。
與炎症治療相關的先前技術包括以下各技術。
US5367056專利描述通過處理中斷與作為受體或配位體的內皮細胞-白 細胞粘附分子(ELAM)的結合的分子或其片段來抑制多形核白細胞 (polymorphonuclear leukocyte, PMN)與內皮糹田月包的結合。這——專利也4苗 述抑止ELAM表達的反義核苷酸和核糖酶。這一專利更描述鑑別抑制 ELAM與其配位體的結合的分子的方法和針對ELAM和其配位體的抗體。
US5863540專利揭示通過投與足以抑止T細胞激活的量的CD44蛋白 肽或其衍生物抑止T細胞激活的方法。也揭示通過投與足以抑制CD44介 導的細胞粘附或單核細胞IL1釋放的量的CD44蛋白肽或其衍生物抑制 CD44介導的細胞粘附或CD44介導的單核細胞IL1釋放的方法。更揭示通 過投與與藥物或細胞毒性劑連接的CD44蛋白肽或其衍生物將藥物或細胞 毒性劑傳輸到炎症部位的方法。
US5912266專利涉及抑制由細胞表面分子的p2整合素家族介導的細胞 間粘附。這一專利揭示適用於抑制或治療與細胞粘附相關的發炎性和其它 病理學反應的醫藥組合物。這一專利也揭示抑制或治療白細胞與淋巴細胞 引起細胞或組織損傷的病理學病狀的方法。
WO03026692專利涉及針對CD3抗原複合體的抗體對患有慢性關節炎 症和類風溼性關節炎的患者的治療用途。
EP1304379專利涉及包含部分或整個能夠與CD18抗原結合的抗原決 定區的人化抗CD 18抗體。
US6689869專利描述人化抗CD18抗體在膿毒病和其它感染性或非感 染性外傷期間抑制白細胞流入肺和其它器官中的用途。人化抗CD18抗體可 用於抑制患有內毒素休克或成人呼吸窘迫症候群的患者中白細胞進入肺和 其它器官。可投與抗體以治療嗜喘或溶栓治療後白細胞介導的再灌注損傷。這一抗體也可用於減輕或消除正被投與抗感染劑的患者的炎症或用於在抗 癌劑化學治療期間輔助向患者投與治療藥物。
US5821336專利描述為炎症介體或炎症介體前驅體、其衍生物(諸如 突變體和片段)的分子量為160,000道爾頓的多肽和其製備方法。這一專利 也揭示編碼多肽和衍生物的核香酸序列、包含核苷酸序列的載體、針對多 肽或其衍生物的抗體和抗體衍生物。也描述使用抗體和抗體衍生物的針對 發炎性病狀和霍奇金'淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas )的斷和治療方法。

發明內容
炎症需要至少三個連續步驟來將包括白細胞的免疫細胞吸引到發炎部 位，所述步驟如下(1 )通過細胞因子和/或細胞間相互作用激活包括白細 胞的免疫細胞，諸如淋巴細胞、多形核白細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞； (2)所聚集的免疫細胞遷移且被募集到發炎部位，在發炎部位其通過粘附 於內皮細胞將相關信號轉導到內皮細胞中；(3 )T淋巴細胞和巨噬細胞被激 活並分泌細胞因子(諸如，白細胞介素-2)以增強發炎反應。
本發明的發明者發現Bst2蛋白介導免疫細胞的同型粘附或免疫細胞與 內皮細胞之間的異型粘附，所述粘附在炎症中發揮關鍵作用，且進一步發 現所述蛋白質的拮抗劑在炎症的主要的三個步驟中起作用且因此可用於預 防和治療炎症相關疾病，從而引出本發明。
一方面，本發明針對一種阻止免疫細胞結合其他細胞的方法，其包含 使免疫細胞和/或其他細胞與包含Bst2拮抗劑的組合物接觸。其它細胞可為 免疫細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、腦細胞、脊髓細胞、周圍神經細胞、 心臟細胞、骨骼肌細胞、肺細胞、肝細胞、腎細胞、血管細胞、胰腺細胞、 大腸和小腸細胞、胃細胞、食道細胞、鼻咽細胞、膜細胞或結締組織細胞。 Bst2拮抗劑可為Bst2誘辨。且Bst2誘何可為Bst2片段或其變異體，與Bst2 蛋白相比，所述Bst2片段或其變異體對另一分子或蛋白質具有類似或改良 結合。Bst2拮抗劑更可為融合於穩定蛋白質的Bst2誘斜、Bst2誘斜-Fc嵌 合或融合構築體、Bst2誘斜-白蛋白嵌合或融合構築體或聚乙二醇化 (pegylated—Bst2誘斜。另夕卜，Bst2拮抗劑可為特異性結合Bst2和/或小鼠 Dampl蛋白的單克隆抗體或抗體樣蛋白質域。
在本發明的另 一方面中，Bst2拮抗劑可為化學性化合物。
在又一方面中，在上述方法中，免疫細胞和其它細胞可位於發炎部位 或位於遠離發炎但能傳輸發炎性和免疫細胞因子或其它發炎性信號到發炎 部位的部位。另外，組合物可包括細胞粘附或信號傳輸抑制化合物或免疫 抑制化合物。在一優選實施例中，細胞粘附抑制化合物可為ICAM1拮抗劑 或LFA拮抗劑。在又一實施例中，本發明針對具有消炎活性的Bst2誘何或Bst2誘何-免疫球蛋白Fc嵌合體。優選地，可使誘何融合於免疫球蛋白的任何域。具 體來說，Bst2誘何可融合於IgG重鏈Fc的鉸鏈-CH2-CH3部分、可為通過 IgG k鏈-重鏈雙硫鍵穩定的Bst2融合蛋白；或無其它Bst2 二聚合對應物的 Bst2誘餅-IgG Fc。
在另一實施例中，本發明針對對Bst2和/或Bst2同源物具有特異性的 單克隆抗體。同源物可為小鼠Dampl蛋白。另外，單克隆抗體可包含兩個 臂，其中一個含有特異性結合除Bst2或其同源物以外的蛋白質的區域。具 體來說，表達所述單克隆抗體所結合的Bst2的細胞阻止Bst2配位體-Bst2 相互作用或Bst2-Bst2相互作用。
在另一替代實施例中，本發明針對分離Bst2配位體的方法，其包含
(i) 獲得與Bst2結合的細胞；
(ii) 從表達配位體的細胞中篩選與Bst2結合的配位體，從而分離Bst2 的配〗立體。
在另一實施例中，本發明針對轉基因小鼠，其體細胞和生殖細胞包含 功能上受破壞的Damp或Bst2基因，其中受破壞基因在胚胎期時被引入小 鼠或小鼠的祖先中，其中在受破壞基因純合的情況下顯示炎症相關病症。
在另一實施例中，本發明針對轉基因小鼠，其體細胞和生殖細胞包含 完全或部分用Bst2基因置換的Damp基因，其中Bst2基因在胚胎期時被引 入小鼠或小鼠的祖先中。
在另一方面中，本發明針對減輕個體炎症的方法，其包含向發炎部位 投與包含Bst2拮抗劑的組合物。
方法，其包含向有需要的個體投與包;Bs:拮抗劑的組合物。'組合物可包 含另一消炎化合物。且所指示的疾病可為動脈粥樣硬化、類風溼性關節炎、 嗜喘、膿毒症、潰瘍性結腸炎、I型糖尿病、白內障、多發性硬化症、急性 心肌梗塞、心臟病發作、銀屑病、接觸性皮炎、骨關節炎、鼻炎、克羅恩 氏病(Crohn's disease )、自體免疫疾病、惡病質(cachexia)、急性胰腺炎、自 體免疫血管炎、自體免疫和病毒性肝炎、延遲型過敏反應、充血、冠狀動 脈再狹窄、腎小球腎炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、與角膜移植相關 的發炎性眼病、由外傷所致的腦損傷、癲癇症、出血、中風、鐮刀形紅細 胞貧血症、II型糖尿病、月巴胖症、年齡相關黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD )、溼滲、皮炎、學習/認知障礙、神經退化性疾病、帕 金森病(Parkinson's disease),阿爾茨海默病(Alzheimer disease )、潰瘍性 結腸炎、輻射誘發的損傷、灼燒或電誘發的損傷、引起組織死亡和免疫細 胞浸潤的中毒、藥物誘發的損傷、吸入誘發的損傷、輻射、抽吸誘發的肺損傷、由化學治療或放射性治療引起的炎症、自體免疫疾病、狼瘡、舍格
倫病(Schogren disease )、包括多發性硬化症的脫髓鞘疾病、包括多發性肌 炎的發炎性肌病、硬皮病、結節性多動脈炎、肉狀瘤病、局部和全身骨化 性肌炎、包括阿爾茨海默病的澱粉樣相關疾病、推間盤突出、脊髓和神經 損傷、雷意氏症候群(Reye syndrome )、細菌性和病毒性腦炎和腦膜炎、朊 病毒相關疾病、古立安-白瑞症候群(Guillain-Barre syndrome )、狂犬病、脊 髓灰質炎、大腦出血、顱內出血相關損傷、慢性疲勞症候群、血栓靜脈炎、 痛風、肉芽腫病、包括腎小球腎炎和間質性腎炎的腎炎、昆蟲刺過敏、過 敏性反應、再生障礙性貧血、骨髓衰竭、多發性器官衰竭、曱狀腺炎、胰 島炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和藥物誘發的肝病、胰腺 炎、缺血性腸病、急性呼吸窘迫症候群或心包炎。
在又一方中面，本發明針對檢定有效抑制Bst2介導的細胞-細胞結合的 化合物的方法，其包含測定與Bst2結合的化合物。另夕卜，Bst2誘斜可重組 表達於宿主細胞中。
由以下發明說明、其所附參考圖式和其所附的權利要求書，將對本發 明的這些和其它目標更透徹地了解。


由下文所給的具體實施方式
和僅以說明的方式給出且因此不限制本發 明的隨附圖式，將對本發明更透徹地了解。
圖1是繪示人類Bst2與小鼠Dampl之間的序列相似性的胺基酸序列比對。
圖2A-2B繪示將人類Bst2誘何和小鼠Dampl誘何克隆到表達載體中
的方法中所使用的聚合酶鏈反應(PCR)引物的位置。
圖3A-3B繪示人類Bst2誘斜和小鼠Dampl誘斜的電泳分析的結果。
圖4繪示U937細胞同型聚集過程中Bst2基因的表達模式。
圖5繪示Bst2過度表達對U937細胞同型聚集的促進作用。
圖6A-6E繪示Bst2誘何對U937細胞同型聚集的作用。
圖7A-7G繪示Bst2誘何對人類血管內皮(human vascular endothelial,
HUVEC )細胞與U937細胞之間的細胞間粘附的作用。
圖8A-8F繪示Bst2誘斜對HUVEC與U937細胞之間的細胞間粘附的
劑量依賴型作用。
圖9A-9G繪示Bst2 siRNA對HUVECs與U937細胞之間的細胞間粘附 的作用。
圖10A-10B繪示Bst2過度表達對Jurkat細胞的聚集和Jurkat細胞中白 細胞介素-2 (IL-2)的產生的作用。圖11 A-l II繪示Bst2誘鉺和Bst2 siRNA對Jurkat細胞聚集的作用。 圖12A-12B是繪示Bst2誘何對Jurkat細胞聚集和IL-2產生的作用的曲線圖。
圖13繪示處理Bst2誘何後所沉降的免疫細胞的數目的變化。 圖14繪示處理Bst2誘飾後細胞因子的含量減少。 圖15A-15D繪示人類Bst2與小鼠Dampl之間的功能相似性。 圖16A-16D繪示Bst2誘餅和小鼠Dampl誘辨對小鼠的卯白蛋白誘發 的。孝喘的抑制作用。
圖17繪示用於製備Bst2誘飾的聚乙二醇(PEG )接合形式的PEG部分。
圖18繪示PEG接合Bst2誘飾的代謝降解改良。 圖19繪示炎症相關疾病中Bst2的表達和分布。
圖20A-20D繪示融合於Fc區的Bst2誘何的示意圖。A: Bst2誘斜自 身；B:融合於IgG重鏈Fc的鉸鏈-CH2-CH3部分的Bst2誘何；C:通過 自然存在的IgG k鏈-重鏈雙硫鍵而穩定的Bst2融合蛋白；D:表達Bst2誘 餅-IgGFc而無其它Bst2 二聚對應物。
圖21A-21D繪示圖20的Bst2誘何-IgGFc融合蛋白的代表性載體圖。
圖22繪示PCR克隆和融合策略。
圖23A-23B繪示經純化Bst2誘辨和其它Fc融合體的聚丙烯醯胺凝膠 電泳(PAGE)。 A:描繪親和力純化後各種Bst2融合蛋白的經考馬斯亮蘭 (Coomassie )染色的代表性PAGE凝膠(4 ~ 12%梯度凝膠，英傑 (Invitrogen ) )。 B:尺寸排阻色譜法後的PAGE。
圖24A-24B繪示A: Bst2塗布板和B: BSA塗布板上的Bst2誘辨與免 疫細胞的直接結合。
圖25繪示Bst2誘斜或Fc融合體的血漿半衰期。
圖26繪示Bst2誘辨-Fc融合體在Bst2誘何與細胞之間的結合中的抑制 作用。
圖27A-27D繪示Bst2誘何-Fc融合體對小鼠嗜喘模型的作用。 圖28A-28B繪示人類-小鼠嵌合Bst2小鼠的產生。A:鼠類(上圖，黑 色)和人類(下圖，灰色)的基因組座位(genomic locus )。外顯子(Exon) 以矩形框形式繪示。跨膜域的末端用箭頭指示，且起始曱硫胺酸(ATG) 的位置用星號指示。整個編碼外顯子的大概物理距離在基因組座位下方指 示。這個圖未按比例繪製。B:製造嵌合人類-小鼠BST2的策略。
圖29A-29E繪示內源性Bst2為受IFNy刺激後的內皮細胞(HUVEC ) 與單核細胞(U937)之間的異型聚集所需。A:對照；B:炎症的IFNy刺 激；C:炎症的IFNy刺激+對照siRNA; D:炎症的IFNy刺激+Bst2 siRNA;E:由A-D產生的Bst2 siRNA的定量分析。
圖30繪示Bst2 siRNA處理或ICAM1 siRNA處理分別不影響經IFNy 處理的HUVEC的ICAM1表達或Bst2表達。執行逆轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)分析。
圖31A-31G繪示Bst2 siRNA與ICAM1 siRNA的組合處理，且繪示在 異型粘附4企定中的疊加效應。A:對照；B:炎症的IFNy刺激；C:炎症的 IFNy刺激+對照siRNA; D:炎症的IFNy刺激+Bst2 siRNA; E:炎症的IFNy 刺激+ICAMl siRNA; F:炎症的IFNy刺激+ICAMl siRNA十Bst2 siRNA; G:由A-F產生的Bst2 siRNA和ICAM1 siRNA的定量分衝斤。
圖32A-32M繪示異型粘附檢定中抗ICAM1或Bst2誘斜的劑量依賴型 反應。A繪示對照；B、 C、 D、 E和F繪示炎症的IFNY刺激+漸增劑量的 ICAM-1 Ab; G繪示炎症的IFN丫刺激+對照BSA; H《會示炎症的IFNy刺激 +對照IgG; I、 J、 K和L繪示炎症的IFNy刺激+漸增劑量的BST2誘斜； M繪示由A-L產生的抗ICAM1和Bst2誘飾的劑量依賴型反應的定量分析。
圖33A-33C繪示Bst2誘餅與抗ICAM的組合處理對細胞粘附產生疊加 效應。使用次最佳劑量的Bst2誘餌(100 ng/ml)和抗ICAM1 ( 1 |iig/ml )。 當使用Bst2誘斜與抗ICAMl時，細胞粘附完全^皮抑制到對照水平。
圖34繪示細胞因子處理後Bst2 mRNA的相對表達量。如所指示，繪 示Jurkat、人類血管內皮細胞(human vascular endothelial cell, HUVEC )、 HeLa或冠一夫動月7:K平〉'骨月幾細月包(coronary artery smooth muscle cell, CASMC ) 經血清、佛波酯(PMA) ( 12或18小時)、T淋巴細胞(OKT) ( 12或18 小時)、肺瘤壞死因子-a ( TNF-a )、幹擾素y或PGJ2處理後的Bst2 mRNA 含量(以對數比表示)。由實時PCR測量Bst2 mRNA含量。
圖35繪示迫使細胞A (其表達Bst2配位體)與細胞B (其表達蛋白質 或化合物y的受體)之間相互作用和信號轉導的方法的示意圖。包含Bst2 誘辨和蛋白質或化合物y的二價融合蛋白可充當迫使細胞a與細胞B之間 相互作用的連接物。如此可改良細胞A與細胞B之間的信號轉導。
圖36繪示噬菌體克隆與Bst2/Dampl誘何的結合。
圖37A-37B繪示抗Bst2/Dampl單克隆抗體(A)重鏈可變區和(B ) k 鏈可變區。
(a)在非還原條件下；("b)在還原條件下, '
圖39繪示在小鼠的卵白蛋白誘發的孝喘中經抗Bst2/Dampl單克隆抗 體處理後所沉降的免疫細胞的數目的變化。
具體實施例方式
13在本申請案中，"一"用於指單個或多個目標。
如本文中所使用，"拮抗劑"或"阻斷劑"是指抑制、阻斷或降低誘發炎症 的蛋白質的活性的物質。拮抗劑的作用機制不受特別限制。拮抗劑的實例
包括有機或無機化合物；聚合化合物，諸如蛋白質、碳水化合物和脂質； 和多種化合物的複合物。如本文中所使用，"Bst2拮抗劑"或"Bst2阻斷劑" 是指抑制、阻斷或降低Bst2蛋白的誘發炎症活性方面的活性的物質。
如本文中所使用，"Bst2配位體"或"Bst L"是指與Bst2特異性結合的分子。
如本文中所使用，蛋白質的"同源物"是在不考慮與參考蛋白質的總序列 相似性的程度的情況下，認為具有與參考蛋白質相似的活性或相似的比活 性的蛋白質。
如本文中所使用，術語"發炎性疾病"是指由身體抵抗有害影響的防禦反 應或感染反應所引起的所有疾病，其產生具有諸如發紅、腫脹、壓痛、疼 痛、發燒和功能障礙的症狀的狀態(物理、化學和生物狀態)。
如本文中所使用，術語"修飾，，指示非肽聚合物與Bst2蛋白或其片段連 接的過程。
如本文中所使用，術語"非肽聚合物"是指兩個或兩個以上重複單元彼此 連接的生物相容性聚合物。非肽聚合物的實例包括聚乙二醇、聚丙二醇 (polypropylene glycol, PPG )、共聚乙二醇/丙二醇、聚氧化乙烯 (polyoxyethylene， POE )、聚氨基曱酸酯、聚磷腈(polyphosphazene )、多 糖、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基乙醚、聚丙烯醯胺、 聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂質聚合物、曱殼素(chitin)、透明質酸和 肝素。優選非肽聚合物為聚乙二醇。
如本文中所使用，術語"可操作性連接"是指核酸表達控制序列與編碼標 耙蛋白質的第二核酸序列之間以使得允許出現一般功能的方式的功能性連 接。舉例來說，啟動子可與編碼蛋白質的核酸序列可操作性連接並影響編 碼序列的表達。與載體的可操作性連接可使用'所屬領域中熟知的基因重組 技術來製備，且位點特異性DNA裂解和連接可使用所屬領域中通常已知的 酶來實現。
如本文中所使用，術語"預防"意指通過投與組合物抑制發炎性疾病或延 遲發炎性疾病發生的所有活動。如本文中所使用，術語"治療"是指減輕並有 利地影響患有發炎性疾病的人類的所有活動(治癒性治療、預防治療性治 療和預防性治療)。
如本文中所使用，術語"siRNA，，是指能夠通過裂解標靶mRNA誘導 RNA幹擾(RNAi)的短雙鏈RNA分子。如本文中所使用，術語"特異性" 或"對...具有特異性"意指僅抑制標靶基因而不影響細胞中的其它基因的能力。在本發明中，提供對Bst2具有特異性的siRNA分子。
如本文中所使用，與參考活性"相似"的活性視為如由指定活性的客觀定 義的參數所測量，大於約80%。
如本文中所使用，"小分子量化合物或調節劑"或"化合物，，是指不同於諸 如碳水化合物、多肽、核酸或脂質的生物分子的化合物。小分子化合物或 調節劑可包括(但不限於)拮抗劑、激動劑、肽模擬劑、抑制劑、配位體 和用於Bst2/Bst2 L結合的結合因子。
如本文中所使用，"變異體"是指因缺失、插入、非保守性或保守性取代 或其組合而具有不同於蛋白質的原生胺基酸序列的序列的蛋白質或其片 段。舉例來說，所屬領域中已知蛋白質和肽中的通常不改變蛋白質或肽的 活性的胺基酸交〗灸(H. Neurath, R. L, Hill， The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常發生的交換為雙向Ala/Ser、 Val/Ile、 Asp/Glu、 Thr/Ser、 Ala/Gly、 Ala/Thr、 Ser/Asn、 Ala/Val、 Ser/Gly、 Thy/Phe、 A旨ro、 Lys/Arg、 Asp/Asn、 Leu/Ile、 Leu/Val、 Ala/Glu和Asp/Gly。
如本文中所使用，描述能夠在合適宿主細胞中表達所關注蛋白質的載 體的術語"載體，，是指包含基因插入以在宿主細胞中表達的方式與其可操作 性連接的必要調控元件的基因構築體。
Bst2蛋白
Bst2在炎症期間參與細胞間粘附。在一方面中，本發明提供骨髓基質 抗原-2 (Bone Marrow Stromal Antigen-2, Bst2 )蛋白的拮抗劑以在炎症期間
本^明者i過使用((、)^C類U937單核細胞同型聚集模型來研究Bst2 對免疫細胞聚集的效用，(2) U937細胞與HUVEC之間的異型聚集模型來 研究Bst2對免疫細胞與內皮細胞之間的細胞間粘附的效用，(3) Jurkat T 細胞模型來研究Bst2對T淋巴細胞激活的效用，發現Bst2蛋白參與發炎過 程，其中白細胞遷移到發炎部位，識別細胞外基質組分以與細胞相互作用 並粘附於細胞。本發明者更發現Bst2蛋白拮抗劑有效抑制所述細胞間粘附 且因此能夠有效治療發炎性疾病。
Bst2蛋白最初在骨髓基質細胞中被鑑別出且認為參與細胞的分化和增 生。1995年克隆出編碼Bst2的cDNA，且發現BST-2基因位於人類染色體 19pl3.2上(Ishikawa等人，Ge朋m/cs 26:527-534, 1995 )。 Bst2基因由5個外 顯子和4個內含子組成。Bst2是由180個胺基酸組成的30,000至36,000道 爾頓II型3爭月莫蛋白質(Ohtomo等人,Ccwwn/". 258:583-591， 1999)。人類Bst2基因的小鼠同源物Dampl基因與人類Bst2 基因具有45%的DNA序列一致性，且如圖1中所示，與人類Bst2具有小 於40%的胺基酸序列相似性。Bst2蛋白主要表達於肝、肺、心臟和胎盤中，且以較低水平表達於胰腺、腎、骨骼肌和腦中。於成纖維細胞上的BST-2 表面表達加速鼠類骨髓來源的前B細胞的基質細胞依賴型生長。這一結果 提示Bst2調控前B細胞生長或在類風溼性關節炎中的B細胞激活中發揮關 鍵作用。Bst2也過度表達於一些類型的癌症中，包括口腔癌、乳癌、腺瘤 和宮頸癌。應注意，參考圖1，跨膜域的邊緣不限於圖示序列。橫跨膜區可 能在區域的N-末端或C-末端外加或減去5個胺基酸。
關於Bst2蛋白，已報導編碼Bst2蛋白的基因的分離和表達(EP1033401 ) 和Bst2蛋白在癌症診斷中的用途(WO01/57207和WO01/51513)。 Bst2蛋 白分為三個域細胞質域、跨膜域和細胞外域，且細胞內域包含細胞質域 和跨膜域。
發炎性疾病
本發明組合物可用於預防或治療所有類型的涉及Bst2過度表達的發炎 性疾病。實際上，Bst2在多種發炎性疾病中過度表達，包括哮喘、動脈粥 樣硬化、類風溼性關節炎、銀屑病、克羅恩氏病(Crohn's disease )、潰瘍性 結腸炎、慢性活動性胃炎、急性闌尾炎和紅斑狼瘡(圖19)。因此，可由本 發明的組合物預防或治療的疾病包括(但不限於)動脈粥樣硬化、類風溼 性關節炎、嗜喘、膿毒症、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、急性心肌梗塞、 心臟病發作、銀屑病、接觸性皮炎、骨關節炎、鼻炎、克羅恩氏病、II型 糖尿病、糖尿病性神經病、慢性阻塞性肺病、惡病質、急性胰腺炎、自體 免疫血管炎、自體免疫和病毒性肝炎、延遲型超敏反應、充血、冠狀動脈 再狹窄、腎小球腎炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、可能與角膜移植相 關的發炎性眼病、由外傷所致的腦損傷、癲癇症、出血或中風。Bst2阻斷 劑也可適用於治療鐮刀形紅細胞貧血症。鐮刀形紅細胞貧血症中存在復發 性炎症和血管病變。已證明白細胞與其它血細胞和內皮細胞的粘附造成鐮 刀形紅細胞貧血症中的血管阻塞(Okpala I. Curr Opin Hematol. 2006， Jan;13(l):40-4)。另外，近年來出現的觀念促發炎性通路的激活可為肥胖 症相關胰島素抵抗的機制(Roytblat等人，Obes Res, 2000， 8(9):673畫5; Straczkowski等人，Science. 1996， 271(5249):665-8; Hirosumi等人，Nature. 2002，420(6913):333-6)。 Bst2阻斷劑也可能對胰島素抵抗、II型糖尿病和肥 胖症有益。
其它炎症相關疾病包括年齡相關黃斑變性(AMD)、溼疹、皮炎、學習 /認知障礙、神經退化性疾病、帕金森病、阿爾茨海默病、潰瘍性結腸炎、 輻射誘發的損傷、灼燒或電誘發的損傷、引起組織死亡和免疫細胞浸潤的 中毒、藥物誘發的損傷、吸入誘發的損傷、輻射、抽吸誘發的肺損傷、由 化學治療或放射性治療引起的炎症、包括狼瘡、舍格倫病的自體免疫疾病、 包括多發性硬化症的脫髓鞘疾病、包括多發性肌炎的發炎性肌病、硬皮病、
16結節性多動脈炎、肉狀瘤病、局部和全身骨化性肌炎、包括阿爾茨海默病 的澱粉樣相關疾病、推間盤突出、脊髓和神經損傷、雷意氏症候群、細菌 性和病毒性腦炎和腦膜炎、朊病毒相關疾病、古立安-白瑞症候群、狂犬病、 脊髓灰質炎、大腦出血、顱內出血相關損傷、慢性疲勞症候群、血栓靜脈 炎、痛風、肉芽腫病、包括腎小球腎炎和間質性腎炎的腎炎、昆蟲刺過敏、 過敏性反應、再生障礙性貧血、骨髓衰竭、多發性器官衰竭、曱狀腺炎、 胰島炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和藥物誘發的肝病、胰 腺炎、缺血性腸病、急性呼吸窘迫症候群和心包炎。
Bst2誘何
Bst2蛋白或其片段或變異體的任何可溶性形式可用作誘何，誘辨會竟 爭性結合至本來與表達Bst2的免疫細胞結合將誘發炎症的分子或位點。用 作誘辨的Bst2片段不受特別限制，只要其通過抑制細胞間粘附具有發炎抑 製作用，但優選具有整個或部分細胞內域缺失的Bst2蛋白。在一例示性實 施例中，Bst2蛋白片段是包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的Bst2蛋白片段。 Dampl蛋白片段是包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列的Dampl蛋白片段。發 現Bst2蛋白片段和Dampl蛋白片段有效抑制由Bst2誘發的細胞間粘附。
在本發明的某些方面中，可使用小鼠Dampl替代Bst2且其可互換使用。 舉例來說，當使用Bst2誘倂時，也預期可使用Dampl誘餌，包括Dampl 誘斜的任何嵌合體。也預期Dampl和其變異體可與Bst2 —起用於治療或減 輕個體的炎症。因此，應了解，本申請案中所指示的Bst2的任何特定用途 也適用於Dampl且可以相同的方式主張。
本發明的範疇包括具有Bst2蛋白原生胺基酸序列的蛋白質或其片段或 變異體和能夠編碼通過抑制細胞間粘附和信號轉導而具有發炎抑制作用的 蛋白質的DNA和RNA。
另外，本發明中提供的蛋白質或其片段可呈具有原生糖鏈、與原生形 式相比糖鏈增加或與原生形式相比糖鏈減少的形式或可呈去糖基化形式。 蛋白質糖鏈的增加、減少或去除可由普通方法達成，諸如化學法、酶促法 或使用微生物的基因工程法。基因工程法包括使Bst2、 Bst2誘斜、Bst2誘 何Fc原生序列中存在的一或多個碳水化合物部分缺失和/或添加一或多個 原生蛋白質中不存在的糖基化位點。
Bst2誘辨/Bst2 i秀餅-Fc變異體
尤其小型蛋白質的過快清除可限制治療功效。所注射的蛋白質治療劑 可被血漿蛋白酶加工，與內皮細胞或血細胞上的血漿蛋白質或受體結合， 這可能導致蛋白質被吸收。逃離血管捕獲的蛋白質可隨後在肝或腎小球中 清除。在腎系統中，蛋白質將進入尿中並離開身體。腎小球屏障基於分子 尺寸和分子電荷區分蛋白質(Brenner等人，Am J Physiol., 1978, 234:F455 )。因此，分子尺寸或負電荷的增加可降低腎清除率(Wilson等人，J Gen. Physiol., 1970, 74:495 )。
改良活體內的Bst2誘鉺活性和作用持續時間的一般策略包括聚乙二醇 化、旨在降低清除率的化學修飾、與白蛋白的蛋白質交聯、多聚化、使用 DNA重組技術與白蛋白直接融合、與Fc融合等。另外，糖基工程化也適 合作為增加Bst2誘何或Bst2誘飾-Fc的活體內活性和延長其作用持續時間 的策略。使額外N-鍵聯寡糖與一致序列連接(Asn-X/Ser/Thr，其中X為除 脯氨酸以外的任何胺基酸)(Imperiali B和Shannon KL. Biochemistry, 1991, 30:4374)。也已經向諸如Epo、 Mpl配位體或甚至通常完全不含碳水化合物 的瘦體素(leptin)的蛋白質中添加N-鍵聯碳水化合物。糖基工程化蛋白質 大體上展示活體內活性和作用持續時間的增加(Elliott S.等人，Nat. Biotechnol. 2003,21:414)。
可產生以較高親和力與Bst2 L結合Bst2誘斜(Bst2誘何-Fc )變異體。 Bst2的二聚域可參與控制Bst2的配位體結合親和力。 一般認為Bst2的二聚 化在Bst2信號轉導中發揮作用。白細胞介素2、 3、 5和6和粒細胞巨噬細 胞集落刺激因子的受體含有兩個不同亞單元(Hatakeyama M，等人，Science. 1989， 244(4904):551-6; Kitamura T，等人，Cell. 1991, 66(6):1165-74 )。粒細胞 集落刺激因子受體、催乳素受體和生長激素受體的配位體結合亞單元形成 同源二聚體(Larsen A等人，J Exp Med. 1990， 172(6): 1559-70; Kelly PA等 人，Recent Prog Horm Res. 1993, 48:123-64 )。 一般認為二聚化產生高親和力 受體且提供信號轉導通路中的第一步(Cunningham BC等人，Science. 1991， 254(5033):821-5; NicolaNA, Metcalf D, Cell. 1991, 67(1):1隱4 )。
因為Bst2的同源二聚作用(homodimerization)很可能在Bst2 L ( Bst2配 位體)誘導的信號轉導中發揮作用，所以預期可通過使潛在二聚域內的氨 基酸殘基突變來產生以較高親和力結合的Bst2誘何(Bst2誘辨-Fc)變異體。
對Bst2的SMART分析預測巻曲螺旋域存在於人類Bst2的編號96-153 (或大鼠Bst2的102-149 )胺基酸區域中或存在於小鼠Damp 1的相應區域 中。Bst2的巻曲螺旋域可能參與Bst2二聚化。
確定Bst2的二聚域
細胞因子誘發的Bst2 二聚化可透過經兩種不同標籤標記的Bst2(諸如， HA-Bst2和Bst2-Flag)轉染的穩定細胞中證明或透過經標籤標記的Bst2的 表達載體瞬時轉染後證明。通過共免疫沉澱經標籤標記Bst2蛋白證明Bst2 的二聚化。可展示野生型Bst2受體的二聚化。當Bst2的二聚化得以證實時， 通過缺失分析、丙胺酸掃描突變分析和/或定點突變誘發，可獲得有關二聚 作用的關鍵殘基的信息。突變可在整個細胞外域或巻曲螺旋域中進行。當 可展示野生型受體的二聚作用時，在用於二聚作用的重要殘基中含有缺失或取代的突變體將不共免疫沉澱。當瞬時轉染到含Bst2細胞中時，二聚域 中含有缺失或取代的Bst2突變體可充當在細胞因子刺激後阻斷髮炎性反應 且抑制細胞-細胞粘附的顯性消極突變體。當在Dampl -A細胞(例如，Dampl -A小鼠胚胎成纖維細胞)中穩定表達時，這些突變體可能不能有效表現出 發炎性反應或細胞-細胞粘附。
篩選許多缺失變異體、插入變異體或取代變異體以作為高親和力Bst2 誘斜或Bst2誘辨-Fc。可將缺失、插入或取代引入如以上所述鑑別出的完整 細胞外域、巻曲螺旋域或二聚域中的標耙突變位點中。突變位點的位置可 例如位於人類Bst2、大鼠Bst2和小鼠Dampl中的低同源性區域中。可進 行標靶胺基酸殘基的缺失、鄰接標靶胺基酸殘基插入一或多個胺基酸殘基 或標靶胺基酸殘基的取代。標靶胺基酸殘基可為單個胺基酸殘基或多個氨 基酸殘基。胺基酸序列缺失或插入可由l-5個連續殘基構成，因為基團缺失 /插入可導致生物活性的完全喪失。
用於缺失、插入或取代的標靶胺基酸殘基包括如以上所述鑑別出對 Bst2 二聚化來說關鍵的殘基。所關注的其它位點包括胺基酸殘基與人類 Bst2、大鼠Bst2和小鼠Dampl中相似或一致的位點。對於取代突變誘發來 說，可進行隨機突變誘發。
篩選Bst2誘何或Bst2誘何-Fc變異體
1. 使用細胞-細胞粘附檢定篩選Bst2誘斜或Bst2誘斜-Fc變異體。具有 較高親和力的變異體比親本Bst2誘餌或Bst2誘飾-Fc蛋白更有效地抑制細 胞-細胞粘附。
2. 使用此處所述的固相檢定篩選Bst2誘辨-Fc變異體。將板塗布抗Fc 抗體並與Bst2誘斜-Fc變異體一起培育。然後用3H-胸苷方t射性標記Bst2L 的源細胞系(參見實例29-1,在鑑別Bst2 L的豐富活體外細胞源下)或U937 細胞(參見實例20 )並添加到孔中。分離和驗證Bst2 L後(參見實例28-34 ), 可放射性標記經Bst2 L的表達載體轉染的COS7細胞而且也用於檢定中。 固定後，測量經放射性標記細胞的粘附。
3. 本文中所述的方法使得所屬領域的一般技術人員能夠在不需要蛋白 質純化的情況下鑑別具有較高結合親和力的突變體。設計突變誘發Bst2 PCR引物以隨機突變誘發所選胺基酸殘基或細胞外域、巻曲螺旋域或二聚 化域中的任何隨機胺基酸。將編碼突變的PCR產物亞克隆於經消化的Bst2 表達載體中。用突變型Bst2 cDNA瞬時轉染COS7細胞。在這一方法中， 使細胞外域、巻曲螺旋域或二聚化域中含有突變的Bst2變異體表達於經轉 染細胞的表面上以便淘選。向塗有經純化Bst2 L的淘選板中添加細胞。然 後用經異硫氰酸螢光素(FITC )標記的人類Bst2 L-Fc通過間接免疫螢光或 螢光激活細胞分選技術(FACS)分析，接著進行二級抗體染色來篩選表達對Bst2 L具有較高親和力的Bst2誘飾的細胞。從附著於板上的細胞回收質 粒DNA並用於下一富集循環中。修飾Bst2誘斜或Bst2誘辨-Fc以含有所 選突變型序列。在細胞-細胞粘附檢定中測試含有所選突變的變異Bst2誘辨 或Bst2誘斜-Fc以進行功能性驗證。
產生Bst2、 Bst2誘飾、Bst2誘斜Fc蛋白、Bst2 L、這些蛋白質的一部 分或這些蛋白質的突變體
本發明的範疇包括構築Bst2、 Bst2誘何、Bst2誘何Fc蛋白、Bst2L、 這些蛋白質的一部分或這些蛋白質的突變體的表達載體的方法，表達於哺 乳動物、昆蟲、真菌、植物或細菌來源的宿主細胞中，和純化這些蛋白質 的方法。Bst2、 Bst2誘何、Bst2誘辨Fc或Bst2 L包括來源於小鼠、大鼠、 兔子、犬、靈長類動物和其它動物的Bst2和Bst2L同源物的那些蛋白質。 關於構築用於重組蛋白質製備的表達載體，將有必要化學合成具有對於各 表達系統經密碼子優化的核苷酸序列的Bst2、 Bst2誘何、Bst2誘何Fc、 Bst2 L或其突變體的相應基因或片段。
通過在可呈質粒或病毒形式的宿主細胞特異性載體中鄰接宿主細胞特 異性啟動子插入編碼Bst2、 Bst2誘斜、Bst2誘斜Fc或Bst2 L的DNA片段 構築經設計以用於在哺乳動物、昆蟲(杆狀病毒、施奈德細胞(Schneider cell))、真菌、植物或細菌細胞中表達Bst2、 Bst2誘何、Bst2誘何Fc或Bst2 L的表達載體。這些蛋白質可以經標籤標記融合蛋白質形式表達於哺乳動 物、昆蟲、真菌、植物或細菌細胞中。標籤為對抗體或經特定修飾的固體 支撐物具有高結合親和力的短蛋白質序列。標籤可包括(但不一定限於) 組氨酸、Flag、 V5、 GST和HA標籤。基於標籤對固體支撐物(諸如管柱 或珠粒)的親和力純化經標籤標記的Bst2誘何。可使用包括液相色譜的其 它步驟以增加所有Bst2相關蛋白質的純度。
必要時可通過乙酸化N-末端胺，醯胺化C-末端羧基，磷酸化絲氨酸、 酥胺酸或酪氨酸殘基，曱基化賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基的a-氨基，使 穀氨醯胺醯(glutaminyl)和天冬醯胺醯( asparaginyl)歹芙基脫醜胺化,羥 化脯氨酸和賴氨酸，生物素標記，棕櫚醯化(palmitylation)，硫酸化，法尼 基化(famesylation)和其類似方法修飾Bst2、 Bst2誘辨或Bst2 L的蛋白質 或片段。
通過抑制細胞間粘附而具有炎症抑制作用的Bst2或Bst2 L蛋白、Bst2 誘餌、其片,殳或其變異體可經天然分離或合成(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2156, 1963 )或可通過基於DNA序列的重組方法製備 (Sambrook等人,Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA,第2版，1989)。當使用基因重組技術時，可通過將編碼Bst2 或Bst2L蛋白、其片段或其變異體核酸插入合適表達載體中，用表達載體轉化宿主細胞，培養宿主細胞以表達合乎需要的蛋白質和從培養物中回收所產生的蛋白質來獲得合乎需要的蛋白質。
1.製備重組Bst2、 Bst2誘斜、Bst2誘斜Fc、 Bst2L、這些蛋白質的一部分或突變體
成功的基於重組蛋白質的方法要求可容易地擴大規模以供大量生產的產生生物學活性蛋白質的能力。上述Bst2相關蛋白質的原生基因序列與表達宿主的原生基因序列之間的密碼子使用率相容性是一個重要的考慮因素。
除Bst2誘何和Bst2誘斜Fc蛋白的治療效用外，還需要Bst2、 Bst2 decoy 、Bst2誘飾Fc、 Bst2 L、這些蛋白質的一部分或這些蛋白質的突變體的重組蛋白質以供篩選抗-Bst2抗體或抗Bst2 L抗體的變異體。
重組Bst2、 Bst2誘辨和Bst2誘辨Fc蛋白在檢定中也用於鑑別參與結合相互作用的Bst2L。 Bst2L可為Bst2本身或其它蛋白質、肽或分子。
Bst2、 Bst2誘飾、Bst2誘斜Fc和Bst2 L、其部分和突變體可用於篩選Bst2-Bst2 L相互作用的肽或小分子抑制劑或激動劑。所述篩選檢定包括適於鑑別小分子藥物候選物的高通量蛋白質-蛋白質結合檢定、基於細胞的檢定、免疫檢定或化學文庫的生物化學篩選檢定。
重組Bst2、 Bst2i秀飾、Bst2L、其部分和突變體也可適用於基於重組蛋白質的疫苗方法。
1-1.在哺乳動物細胞中表達Bst2、 Bst2資斜、Bst2誘辨Fc、 Bst2 L、這些蛋白質的一部分或這些蛋白質的突變體(各種Bst2相關蛋白質)
許多哺乳動物表達載體和宿主細胞系統可購得。哺乳動物表達系統描述於實例4中。
1-2.在杆狀病毒中表達各種Bst2相關蛋白質
除哺乳動物細胞外，糖基化Bst2、 Bst2誘鉺、Bst2L和其它Bst2相關蛋白質也可來源於無脊推動物細胞(包括昆蟲細胞，諸如果蠅S2、 Sf9)以及植物細胞。關於杆狀病毒表達，將相應Bst2或Bst2 L序列融合於經標籤標記的抗原決定基，例如經poly-his標記的杆狀病毒表達載體的上遊。Bst2誘辨Fc可在無其它標籤的情況下使用。許多杆狀病毒表達載體可購得。病毒感染禾口蛋白質表達長口 O，Reilley等人,Baculovirus expression vectors: Alaboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)所述執行。重組杆狀病毒通過將Bst2、 Bst2誘何杆狀病毒載體和BaculoGold病毒DNA(Pharmingen)共轉染到Sf9細胞(ATCC )中來產生。在28。C下培育4-5天後，收集所釋放的病毒且用於擴增。
用N產螯合物親和力色譜法純化經Poly-his標記的Bst2、 Bst2誘何或Bst2 L( Rupert等人，Nature, 362:175， 1993 )。可使用蛋白質A管柱色語法執
21行Bst2誘何Fc的純化。
1-3.在曱醇畢赤酵母(屍/c/z/a; ayton:s)中表達各種Bst2相關蛋白質
曱醇畢赤酵母是單細胞真核生物，其在克隆外來基因的簡易性以及具有於易於操作的培養物中的緊密受控可誘導表達方面與大腸桿菌(五.co//)具有許多相似性(Kocken, C. H.等人，Infect. Immun. 67:43-49. 1999 )。作為真核生物，曱醇畢赤酵母能夠進行數種翻譯後修飾，例如，能夠形成使得蛋白質能夠適當摺疊的雙硫鍵，且也已知畢赤酵母可能將蛋白質糖基化(Yadava A和Ockenhouse， Infect. Immun. 71:4961, 2003 )。
各種Bst2相關蛋白質的基因使用關於畢赤酵母密碼子使用率經優化的核苷酸序列化學合成。使用例如PicZa( Invitrogen)( —種吉歐黴素( zeocin)可選擇質粒)的曱醇畢赤酵母構築體來於曱醇畢赤酵母中克隆和表達Bst2相關蛋白質。質粒含有用於將蛋白質引導到分泌途徑中的與來自釀酒酵母(iS"cc/zarawyces cerev/w'ae )的a交酉己因子(mating factor)禹蟲合的來自曱醇畢赤酵母的醇氧化酶l啟動子。用曱醇誘導後，蛋白質在醇氧化酶1啟動子的控制下表達且分泌到培養基中。
構築各種Bst2相關蛋白質的PicZa表達載體後，用構築體轉化大腸桿菌XL-1藍細胞，且通過PCR和限制性消化篩選吉歐黴素抗性克隆的插入物。使用陽性克隆來轉化甲醇畢赤酵母。將轉化混合物塗鋪於含有吉歐黴素的酵母-蛋白腖-右旋糖-山梨糖醇板上。對於表達，使陽性克隆在經緩沖甘油培養基中生長約24小時。再過24小時，將細胞團粒化並用含有1%曱醇的新鮮培養基誘導。通過ELISA或西方印跡法(Western blotting)關於表達測試上清液以#:測各種Bst2相關蛋白質。從培養物上清液中純化畢赤酵母表達的蛋白質。
1_4.在酵母中表達各種Bst2相關蛋白質
使用密碼子優化序列構築酵母表達載體以用於細胞內產生或分泌。關於分泌，可將編碼Bst2、 Bst2誘斜、Bst2L、這些蛋白質的部分或突變體的DNA克隆到所選具有編碼ADH2/GAPDH啟動子、酵母a因子分泌信號/前導序列的DNA的質粒中。可用表達質粒轉化酵母細胞並在所選擇的發酵培養基中培養(Hsiao等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829， 1979 )。通過三氯乙酸沉澱(TCA precipitation),十二烷基石克酸鈉-聚丙烯醯胺凝力交電泳(SDS-PAGE )和考馬斯亮蘭染色(Coomassie blue staining )分析酵母上清液。可使用選定管柱色譜法從濃縮上清液中分離出重組Bst2相關蛋白質。1-5.在大腸桿菌中表達Bst2、 Bst2誘何
在某些條件下， 一些上述Bst2相關蛋白質可在大腸桿菌中產生。然而，已知不是所有在大腸桿菌中產生的可溶性蛋白質都可恰當地摺疊，且不恰當摺疊的蛋白質可能形成呈包涵體形式的不可溶聚集體(Carrio, M. M.和A. Villaverde. 2002. J. Biotechnol. 96:3-12 )。
使用含有合適限制性酶位點的PCR引物擴增編碼經選擇用於在大腸桿菌系統中表達的Bst2相關蛋白質的DNA序列。多種表達載體可購得。用限制性酶消化載體並去磷酸化。然後將PCR擴增的序列連接到載體中。隨後使用連接混合物轉化大腸桿菌菌林。選擇轉化抹且分離質粒DNA。使所選擇的克隆生長於液體培養基中，然後用於較大規模的培養，期間開啟表達啟動子。可溶解細胞團粒，且然後如果溶解的Bst2相關蛋白質從含有poly-his序列和腸激酶裂解位點的載體中表達，那麼可使用(例如)金屬螯合管柱純化所述蛋白質。
2.通過肽合成製備Bst2、 Bst2誘斜、Bst2誘辨Fc、 Bst2 L、這些蛋白質的一部分或突變體
Bst2、 Bst2誘何、Bst2誘斜Fc、 Bst2 L、其各種部分或突變體可使用固相技術或固相與液相方法的組合由直接肽合成產生(Stewart等人，SolidPhase peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, (1969); BarlosK等人，Int J Pept Protein Res. 1991; 37: 513-520; Babiker E等人，J Org Chem.1978; 43: 4196-4199)。這些Bst2相關蛋白質的各種部分可單獨化學合成和使用化學或酶促方法組合以產生全長Bst2、 Bst2誘辨、Bst2L或突變體。
肽合成方法也可能適用於產生這些蛋白質的經修飾型式(例如，磷酸化型式)。
肽可使用L型或D型胺基酸合成。具體來說，哺乳動物蛋白酶和肽酶不能降解由D-胺基酸合成的肽。D型Bst2誘餌或D型Bst2誘餌的各個部分儘管其尺寸小但在活體內將很穩定，且可於飲用水中或與食物混合、以
空氣噴霧和/或貼片形式投與。
本發明中提供的通過抑制細胞間粘附或相互作用和免疫細胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段可呈單體或多聚體形式。多聚體可由所屬領域中通常已知的各種方法形成，且形成多聚體的方法不受特別限制。
多聚體可為(但不限於)二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體等等。舉例來說，多聚體可使用誘發多聚體形成的序列製備，所述序列例如誘發三聚體形成的異亮氨酸拉鏈(isoleucine zipper， ILZ )序列或誘發十二聚體形成的表面活性劑蛋白-D (surfactantprotein-D， SP-D)。另外，多聚體可(例如)使用連接子通過接合兩個或兩個以上各以單體形式產生的多
肽製備〉。
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結構的組合。雖然認為Bst2以同源二聚體形式行使功能，但尚不知同源二聚體中各單體的定向。關於構築含有Bst2蛋白或其片段的反平行結構的多聚體的表達載體，應以密碼子優化核苷酸序列化學合成反平行結構化Bst2蛋白或其片段的編碼序列。在表達載體中，各Bst2蛋白(或片段)單元可由合成連接子連接。合成連接子包括富含Gly/Ser的合成連接子(Berezov A等人，2001, J Med Chem 44:2565 )或柔性Gly連接子(Kim等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 96:10092， 1999 )。
當Bst2片段單元足夠小從而可通過肽合成直接合成時，可產生L型與D型多聚體兩者。
可由非肽聚合物修飾通過抑制細胞間粘附或相互作用和免疫細胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段。
在另一詳述方面中，拮抗劑包括經非肽聚合物修飾的Bst2蛋白或其片段，其通過抑制細胞間粘附或相互作用和免疫細胞激活而具有炎症抑制作用。
Bst2蛋白或其片段與非肽聚合物的鍵聯包括共價鍵和所有類型的非共價鍵，諸如氫鍵、離子相互作用、範德華力(van der Waals force )和疏水性相互作用。聚合物優選通過特定反應性基團與蛋白質連接。聚合物的反應性基團的實例包括醛基、丙醛基、丁醛基、馬來醯亞胺基、酮基、乙烯碸基、硫醇基、醯肼基、羰基二咪唑(carbonyldimidazole， CDI)基、硝基苯基碳酸酯(nitr叩henyl carbonate, NPC )基、曱苯>5黃酸酯基、異氰酸酯基和琥珀醯亞胺衍生物。非肽聚合物與多肽的反應性基團反應，所述反應性基團例如胺基酸殘基的N-末端、C-末端和/或側鏈(例如，賴氨酸殘基、組氨酸殘基或半胱胺酸殘基的側鏈)。
的Bst2蛋白可與非肽聚合物以1:1至1:10、優選1:1至1:2的摩爾比連接。當Bst2蛋白或其片段經兩個或兩個以上非肽聚合物修飾時，非肽聚合物可相同或不同。通過經非肽聚合物修飾，蛋白質可具有改良的活體內穩定性和新陳代謝。
在另一方面中，本發明提供預防或治療發炎性疾病的組合物，其包含一或多種選自如以上所述通過抑制細胞間粘附或相互作用和免疫細胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段；通過抑制細胞間粘附而具有炎症抑制作用的經非肽聚合物修飾的Bst2蛋白或其片段的蛋白質。
本發明組合物可施用於發炎性疾病可通過投與Bst2而得以抑制或降低的人類以及家畜，諸如牛、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、犬和貓。在這種情況下，本發明者發現人類Bst2和小鼠Dampl具有功能相似性且作用於具有相同來源以及不同來源的細胞。
在另一詳述方面中，本發明涉及預防或治療發炎性疾病的方法，其包含向患者投與 一或多種選自通過抑制細胞間粘附或相互作用和免疫細胞激活而具有炎症抑制作用的Bst2蛋白或其片段的蛋白質。通過Fc融合使誘何蛋白質穩定
描述誘鈄Bst2與抗體Fc部分的融合。所得融合體能夠延長誘何Bst2 蛋白的治療作用，從而提供更有利的給藥時程。也展示與白蛋白的融合延 長小蛋白質的血清半衰期。類似Bst2誘斜與抗體Fc部分的融合，Bst2誘 辨與白蛋白的融合可增長Bst2誘斜的血清半衰期。
包括Bst2誘倂的許多潛在治療性蛋白質小於40,000道爾頓，且因此容 易因腎小球過濾而被腎清除。這些小蛋白質很少產生理想的醫藥品。促成 較長的血清半衰期的蛋白質的重新設計是重要的醫學和商業目標。因為蛋 白質通常必須通過注射投與，所以優選具有使蛋白質投藥頻率最小化的治 療性蛋白質。
一般來說，蛋白質的有效分子量可通過與異源載體蛋白質(諸如可有 助於純化蛋白質的白蛋白或抗體Fc區)融合來增加(Capon等人，Nature. 1989年2月9日；337(6207):525-31; Yeh P.等人，Proc. Natl Acad, Sci. USA, 89:1904-1908,1992)。異源序列可為任何序列，只要其允許所得嵌合蛋白質 保留Bst2誘何的至少一種生物活性。
認為Bst2以同源二聚體形式存在於細胞表面上(Ohtomo等人，Biochem Biophys Res Commun. 1999, 258(3):583-91 )。也認為Bst2需要二聚化以獲得 其活性。因此，優選促進Bst2誘斜單體締合形成二聚體、三聚體和更高多 聚體形式的異源序列。使用分子量小於40,000道爾頓的小蛋白質構築Fc 嵌合蛋白質使得血清半衰期顯著延長(Lo等人，PCT WO00/40615, 2000 )。 Bst2誘何-Fc是由人類Bst2的細胞外域和人類IgG的Fc區組成的重組嵌合 融合蛋白質。Bst2誘餌-Fc以二聚體形式且在一定程度上以更高多聚體形式產生。
大鼠Bst2誘斜-Fc
大鼠Bst2與人類Bst2和小鼠Dampl分別具有44%和70%的胺基酸相 似性(Kupzig等人，2003， Traffic 4(10): 694 )。推定的巻曲螺旋域存在於人類 Bst2蛋白的胺基酸96-153 (或102-149)區和大鼠Bst2蛋白和小鼠Dampl
蛋白的相應區中。
觀察到小鼠Dampl誘飾抑制人類內皮細胞與人類單核細胞U937細胞 之間的細胞-細胞相互作用，且人類Bst2誘斜在小鼠哮喘模型中具有功能指 示Bst2誘辨和Bst2誘飾-Fc以物種交叉方式行使功能。小鼠Dampl誘鉺(Fc 融合體)、大鼠Bst2誘何(Fc融合體)或人類Bst2誘辨(Fc融合體)蛋白 質的功效可在包括小鼠、大鼠、兔子、犬或靈長類動物的任何動物疾病模 型中互換研究而無物種障礙。或者，可使用來源於兔子、犬或靈長類動物 的Bst2同源物的誘飾的Fc融合體。關於小鼠中的抗體治療，可使用抗小鼠 Dampl抗體或大鼠抗Dampl抗體。關於大鼠、兔子、犬或靈長類動物中的
25抗體治療，可使用對來自這些動物的Bst2同源物具有特異性的抗體。 一種 產生針對小鼠Dampl的單克隆抗體組的方法為使用DampW-小鼠。 Dampl-A (敲除)小鼠由熟知的同源重組方法產生。
大鼠抗Dampl單克隆抗體可使用大鼠雜交瘤技術產生 (Lebacq-Verheyden等人，Hybridoma. 1983， 2(3):355-8 )。類似地，可使用小 鼠抗大鼠Bst2單克隆抗體執行大鼠中的抗體治療。 組成性Dampl-/-(敲除knock-out)小鼠
030^1-/-小鼠由同源重組方法產生。如上所指示，可使用Dampl-A小 鼠獲得小鼠抗Dampl單克隆抗體。另外，Dampl-A小鼠適用於產生有關可 用Bst2阻斷劑(Bst2 (Dampl )誘斜、抗Bst2 (Dampl ))研究的疾病才莫型 的信息。因為產生用於臨床前研究的經純化蛋白質藥物成本非常高，所以 難以嘗試很多疾病模型。另一方面，例如用於關節炎模型的膠原或佐劑治 療、用於哮喘模型的卵白蛋白治療或動物模型中常用的任何其它治療的大 部分用於動物模型的疾病誘導性治療可在無需太高成本的情況下容易地實 施。通過比較各種疾病誘導性治療後Dampl-A與野生型小鼠的症狀的嚴重 程度和疾病進展，可獲得關於何種疾病模型可用Bst2阻斷劑研究的有價值 的信息。以此方式，可產生更多使用Bst2阻斷劑的治療選項。
組織特異性Dampl-/-(敲除)小鼠
雖然Dampl或Bst2或如上所述的簡單的Dampl-/-(敲除)顯性消4 l 蛋白質的轉基因表達可能與人類疾病或發炎性/自體免疫通路相關，但特定 細胞類型中Dampl的缺失對研究Dampl/Bst2的基因功能和推斷Bst2的基 因功能同樣會很有價值。
可4吏用位點特異性重組酶系統，諸如廣泛4吏用的CreloxP系統(CreloxP system ) ( Lasko M等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5860, 1996; Orban P 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6861, 1992 )。在這一系統中，需要兩種 轉基因小鼠細胞系以促進組織特異性Dampl敲除。第一小鼠細胞系在所選 擇的組織特異性啟動子的控制下表達Cre重組酶。目前，差不多40至50 種Cre細胞系可獲得，且Cre細胞系的可用性和種類在增加。第二細胞系在 Dampl附近帶有loxP位點。雜交後，從表達Cre重組酶的細胞中除去Dampl 基因。可靶向Dampl基因中的一個或兩個拷貝以(例如)檢查Dampl基因 的劑量敏感性。
組織特異性可誘導性Dampl-/-(敲除)小鼠
疾病中Dampl基因功能的生理學相關性除組織特異性外還可能進一步 要求時序控制。 一種實現組織特異性Cre重組酶的可誘導性表達的方式是 通過使突變型雌激素受體(estrogen receptor, ER)配位體結合域與Cre的 C-末端融合使用Cre的類固醇受體配位體調控形式。這些融合蛋白質由合成雌激素拮抗劑4-OH他莫昔芬(tamoxifen)誘導但對內源性p-雌二醇不 敏感。可利用三種不同的突變型雌激素受體小鼠ERTM ( Danielian PS， Curr. Biol. 8:1323, 1998 )、人類ERT ( Logie和Stewart, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5940， 1995 )和人類ERT2 ( Feil R等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752,1997)。通過將CreER放置在組織特異性啟動子的控制下，可以組 織特異性、他莫昔芬誘導性方式產生Dampl敲除系統。第二轉基因細胞系 在Dampl附近帶有loxP位點。雜交後，以他莫昔芬誘導性方式從表達Cre 重組酶的細胞中除去Dampl基因。
在另一方法中，可使用四環素敏感性系統。四環素結合四環素激活因 子蛋白(tetracycline transactivator protein, tTA)或反式四環素S敫活因子蛋 白(reverse tetracycline transactivator protein, rtTA )。 這些複合4勿通過結合 Tet操縱子(Tet operator, tetO )阻遏或激活Dampl表達。為以組織特異性 方式達成Dampl的Tet誘導性敲除，需要三重轉基因小鼠。在第一細胞系 中，在組織特異性啟動子/強化子的控制下表達tTA或rtTA蛋白。第二細胞 系帶有Tet操縱子啟動子(tetO )和Cre重組酶。僅在tTA或rtTA存在下且 在^t用水中傳遞四環素，tetO啟動子才被激活且Cre重組酶得以表達。第 三細胞系帶有側接Dampl的loxP位點。然後，Cre重組酶以組織特異性Tet 誘導性方式切除Dampl基因。
使用shRNA通過RNAi ( RNA幹擾)獲得轉基因Dampl或Bst2敲弱 (knockdown)動物
鑑於向除小鼠以外的物種應用基因敲除技術的困難性，在使Dampl或 Bst2分別於小鼠或其它動物中的表達沉默中可^f吏用RNA幹擾(RNA interference, RNAi )。在轉基因動物中使用Dampl或Bst2 siRNA的短片段 將有可能使Dampl基因在小鼠中或Bst2同源物在其它動物中沉默。使用 RNA幹擾導致的組織特異性Dampl或Bst2敲弱可為產生功能損失模型的 替代方法。
RNA幹擾是由與沉默基因序列同源的小雙鏈RNA ( double-stranded RNA, dsRNA)介導的序列特異性轉錄後基因沉默。序列特異性信使RNA 降解的調節劑是由較長dsRNA裂解產生的21和22個核苷酸的小幹擾RNA
(small interfering RNA, siRNA ) ( Bernstein E等人，Nature 409:363， 2001; Elbashir SM等人，Nature 411:494, 2001 )。將這些siRNA併入多蛋白RNA誘 導沉默複合物(multiprotein RNA-inducing silencing complex )中。反義鏈將 沉默複合物引導到其同源標靶mRNA,從而導致裂解。已證明稱為Dicer 的細胞內部的雙《連特異性核糖核酸酶(RNase )可加工小髮夾RNA結構
(small hairpin RNA structure, shRNA),從而產生微RNA。通過抑制翻if, 微RNA可有效使基因表達沉默，從而使得有可能僅使用 一個載體靶向基因。shRNA系統可用於產生穩定地使基因表達沉默的轉基因動物。
Dampl或Bst2 siRNA:可通過合併圖9中所使用的人類Bst2 siRNA的 相應序列設計Dampl或Bst2 siRNA或可重新設計siRNA。為選擇用於產生 Dampl ( Bst2 ) shRNA的潛在Dampl ( Bst2 ) -siRNA序列，用綠色螢光蛋 白(green fluorescent protein, GFP ) -Dampl ( Bst2 )融合構築體外加針對 Dampl (Bst2)的不同siRNA共轉染諸如Cos-7細胞的哺乳動物細胞。通 過免疫印跡法分析Dampl(Bst2)-GFP融合蛋白的表達和敲弱。
構築Dampl ( Bst2 ) -shRNA表達載體使用pol III與pol II啟動子合 成用於在哺乳動物細胞和動物中敲弱基因表達的短髮夾RNA ( shRNA )。為 構築shRNA表達載體，隨後將如上所篩選的最有效siRNA克隆到shRNA 表達質粒中，其中短Dampl (Bst2)序列的有義和反義鏈在(例如)U6啟 動子的控制下以編碼Damp 1 ( Bst2 ) -shRNA的DNA序列的形式轉錄為發 夾結構，且然後由細胞內的雙鏈特異性核糖核酸酶Dicer加工為功能性 siRNA。通過將相應DNA寡核苷酸克隆到shRNA表達質粒(諸如來自 Ambion的pSilencer 1.0-U6 ) ( Austin, TX， USA )中產生shRNA表達載體。 寡核苦酸涵蓋Dampl (Bst2)的有義和反義序列和7個鹼基對之環，且退 火產物含有適當的限制性酶位點。將這一雙鏈體連接到pSilencer 1.0-U6中。 然後使用這一載體內源性在哺乳動物細胞中表達shRNA。通過插入表達與 小鼠或人類基因組中的任何已知序列具有有限同源性的siRNA的序列構築 對照RNAi載體。
產生表達Dampl或Bst2-shRNA的轉基因動物Y吏用原核注射方法， Xia等人(PLoS Genet. 2006; 2(1): e10 )能夠證明從人類Pol II啟動子(諸 如人類泛素C啟動子)轉錄的shRNA可在小鼠中介導基因沉默。通過將線 性化構築體原核注射到受精卵中製造轉基因小鼠。類似地，可使用任何種 類的與用於通過簡單原核注射產生轉基因小鼠的Dampl-或Bst2 shRNA偶 合的組織特異性啟動子。
或者，可使用表達Dampl-或Bst2 shRNA的腺相關病毒 (adeno-associated viral, AAV )載體(A. Auricchio等人,Hum. Mol. Genet. 10 (2001)，第3075-3081頁)或慢病毒載體(Golding MC等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA2006年4月4日；103(14):5285-卯)將轉基因傳遞到動物中。
表達Bst2、 Bst2L、 Bst2或Bst2L的部分或突變體的轉基因動物
過度表達完整Bst2或Bst2 L (或其任何部分)的轉基因動物(小鼠或 大鼠)適用於研發和篩選治療上適用的試劑，諸如抗Bst2、 Bst2誘飾、Bst2 誘飾Fc和抗Bst2L。轉基因細胞系可經設計以可誘導性方式、組織特異性 方式或組織特異性/可誘導性方式組成性表達Bst2或Bst2 L蛋白。
表達Bst2或Bst2 L (或其任何部分)的轉基因動物可展示與Bst2或
28Bst2 L過度表達相關的病理學病狀。可用Bst2阻斷劑治療這些動物，且與 未經治療的帶有Bst2或Bst2 L轉基因的動物相比，病理性病狀的發病率的 降低將指示潛在的治療益處。當鑑別出Bst2 ( Dampl )或Bst2 L ( Dampl L ) 的顯性消極型式(幹擾野生型蛋白質的功能的型式)時，可產生表達這些 蛋白質的顯性消極形式的轉基因動物以測試疾病過程是否受到抑制。在測 試疾病過程之前，可將表達人類Bst2的顯性消極蛋白質的轉基因動物與 Bst2敲入小鼠交配。
轉基因表達序列盒含有包括Kozak —致序列的轉錄單元、Bst2或Bst2 L、這些蛋白質的部分或突變體的編碼外顯子、終止信號(多聚-A-尾巴
(poly-A-tail))和控制轉基因表達的調控元件。很多組織-特異性啟動子/ 強化子可在文獻中獲得。可購得控制時序表達的可誘導性系統(包括四環 素或他莫昔芬誘導性系統)(參見上文，在組織特異性、可誘導性0&11^1-/-
(敲除)小鼠下)。產生轉基因小鼠或大鼠的方法已變成常規方法(美國專 利第4,736,866號和第4,870,009號)。
表達Bst2誘餅、Bst2誘斜-Fc和Bst2誘飾-白蛋白融合體的轉基因動
物
可使用表達與Fc片段或白蛋白融合的Bst2或Dampl細胞外域(或其 任何部分)或Bst2細胞外域或Dampl (或其任何部分)的轉基因動物來評 估Bst2誘飾(Fc)在病理學條件下的治療作用。可使表達這些蛋白質的轉 基因小鼠與表達Bst2的敲入小鼠交配以評估Bst2誘餌(Fc)蛋白在單一治 療或組合治療中在任何病理性條件下的治療作用。轉基因細胞系可經設計 以可誘導性方式、組織特異性方式或組織特異性/可誘導性方式組成性表達 這些蛋白質。
敲入(Knock-in)小鼠產生人類-小鼠嵌合Bst2小鼠
因為人類Bst2與小鼠Dampl/大鼠Bst2之間的氨基S臾序列同源性並不 高，所以不可能在鼠類或大鼠免疫發炎性疾病模型中測試抗人類Bst2抗體 組的功效。 一種克服這一問題的方法在於產生表達人類Bst2 (也就是表達 人類小鼠嵌合Bst2)的敲入小鼠。敲入小鼠可具有經人類置換的Dampl的 完整編碼區或僅具有經人類Bst2細胞外域置換的Dampl的細胞外域，從而 產生嵌合蛋白質。雖然可使用表達人類Bst2的轉基因小鼠達成這一目的， 但過度表達系統不是測試Bst2阻斷劑功效的理想系統。允許人類-小鼠嵌合 Bst2在生理學水平下表達的敲入方法取代轉基因方法。可根據標準敲入同 源重組方案製造表達人類-小鼠嵌合Bst2的敲入小鼠，且可使用諸如圖28 中所繪示的例示性構築體進行。處理敲入小鼠以誘發免疫發炎性病狀。投 與抗人類Bst2抗體。
這些小鼠也適用於測試具有抗人類Bst2抗體或Bst2誘飾-Fc與各種針對小鼠蛋白質標靶的大鼠抗體的組合治療的功效。舉例來說，可用膠原處
理表達人類Bst2的敲入小鼠以誘發關節炎(Andren等人，J Immunol. 2006， 63(4):282-9)，且然後用與大鼠抗小鼠TNFR ( TNFa受體I或II) (Abcam)、 大鼠抗小鼠IL陽6受體(Genzyme )、大鼠抗小鼠IL-1受體(Abcam )或鼠類 CTLA4-Ig(內部)中的任何一個因子、兩個因子、三個因子或四個因子組 合的人類Bst2誘倂-Fc或抗人類Bst2處理。已證明鼠類CTLA4-Ig抑制大 鼠中的T細胞反應(Shiraishi T等人，2002, Am J Transplant 2:223 )。 測試Bst2阻斷劑功效的動物疾病^^莫型
適用於測試Bst2阻斷劑功效的動物模型包括(但不限於)大鼠或小鼠 膠原誘發關節炎模型(Webb等人，Eur J Immunol. 1996， 26(10):2320-8; Andren等人，Scand J Immunol. 2006， 63:282 )、大鼠或小鼠佐劑誘發關節炎 模型(Haruna等人,Arthritis Rheum. 2006, 54(6):1847-1855; Hida等人，J Autoimmun. 2005年9月；25(2):93-101 )、卵清蛋白誘發嗜喘模型(Sy等人, Int Immunopharmacol. 2006, 6(7): 1053-60 )、骨關節炎模型(Averbeck等人，J Rheumatol. 2004年10月；31(10):2013-20 )、移植物抗宿主病(graft versus-host disease, GvHD )模型(Zhang等人，Blood, 2006, 107:2993-3001; Baliga等 人，Transplantation. 1994， 58(10):1082-90 )、非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠或BB ( BioBreeding )大鼠中的1型糖尿病模型(Yang Y, Santamaria P. Clin Sci. 2006, 110(6):627畫39 )、缺血/再灌注模型(Arumugam 等人，Nat Med. 2006年6月；12(6):621-3 )、膿毒性休克模型(Motobu等人, Phytother Res. 2006， 20(5):359-63 )、自體免疫葡萄膜炎模型(Yilmaz等人, Curr Eye Res. 2005， 30(9):755-62 )、為用於多發性硬化症的動物模型的小鼠 中的實驗性過壽文性月滷脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE) (Mujtaba等人，J Immunol. 2005，175(8):5077-86 )、兔子中的腦栓塞模型 (Chapman DF, Stroke. 2001,32(3):748-52 )、用於克羅恩氏病和發炎性腸病 的小鼠結腸炎模型(Yen D等人，J Clin Invest. 2006， 116(5): 1310-6)、自體免 疫或病毒性肝炎的刀豆球蛋白A ( concanavalin A )誘發肝損傷模型(Li等 人，Hepatology, 2006年6月；43(6): 1211-9 )、銀屑病模型(Gudjonsson JE， Elder JT. Eur J Hum Genet. 2006, 14(l):2-4 )和兔子中的角膜移植排斥反應模 型(Shirao E， Deschenes J， Char DH. Curr Eye Res. 1986, 5(11 ):817-22 )。已描 述研究年齡相關黃斑變性(AMD)的動物模型(Dithmar等人，Arch Ophthalmol 2001,119(11):1643-9 ; Cousins等人，Exp Eye Res. 2002， 75(5):543-53 )。
對Bst2的阻斷通過穩定所構建的動脈粥樣硬化可抑制動脈粥樣硬化的 早期加速。這一^f叚設可在鏈脲佐菌素(streptozotocin )治療的(糖尿病性) apoE-缺失小鼠或低密度脂蛋白(LDL)受體敲除小鼠(傑克遜實驗室(Jackson laboratories))中力口以觀'K式 (Bucciarelli等人，Circulation, 2002， 106(22):2827; Csaky K, Exp Eye Res, 2002, 75(5):543畫53 )。許多患有II型糖 尿病的患者出現動脈粥樣硬化。Bst2阻斷劑在II型糖尿病和動脈粥樣硬化 中的作用可在db/db apoE-缺失雙重突變型小鼠中加以測試。
最對刀通過釹口 Linsley PS， \Vallace PM， Johnson J， Gibson MG， Greene JL， Ledbetter JA， Singh C, Tepper MA. Science. 1992， 257(5071):792-5所述測量 對綿羊紅血球細胞和鑰孔螺血藍蛋白(key hole limpet hemocyanin )的抗體 反應測試幹擾Bst2作用是否對抗體介導的自體免疫疾病有益的概念。
其他自體免疫疾病模型包括狼瘡樣疾病(Finck等人，Science. 1994， 265(5176): 1225-7)和大鼠腎小球腎炎模型(Nishikawa等人，Eur J Immunol. 1994， 24(6): 1249-54 )。可使用已接受胰島細胞異種移植(pancreatic islet cell xenograft)的糖尿病小鼠測試供體特異性移植耐受性(Lenschow等人, Science, 1992， 257(5071):751 )。耐受性也可在血管化鼠類心臟同種異體移植 模型(Larsen等人，Nature, 1996， 381(6581):434-8 ; Pearson等人， Transplantation, 1995, 59(3):450 )和小鼠皮膚同種移植排異反應模型(Tepper 等人，Transplant Proc. 1994, 26(6):3151-4 )和腎移植模型(Laskowski IA. J Am SocNephrol. 2002， 13(2):519-27 )中證明。
組合治療
免疫發炎性疾病是由免疫發炎性信號轉導複雜網絡介導的複雜病症。 這些事件可能彼此密切相關，但根本細胞和分子過程可相差甚遠。因此， 免疫發炎性疾病的完全好轉可能需要組合治療。通常，已證明影響在各種 促發炎過程的能力方面可能不同的組合治療優於單一治療。
已用細胞-細胞粘附檢定使用細胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAMl)作為實例(實例25和實例26)活體外測試使用Bst2 阻斷劑的組合治療的概念。因為已證明ICAMl調控對免疫發炎性通路很重 要的許多因子且已對其在許多發炎性免疫疾病中的參與進行了廣泛研究， 所以選擇ICAML
ICAMl是表達於白細胞中的整合素亞族成員淋巴細胞功能相關抗原 LFA-1 (CDllc/CD18)的標靶細胞反受體。這兩種分子之間的相互作用為 引發細胞免疫反應的關鍵。也認為ICAM-1在同種異體移植組織的急性排 斥反應中發揮作用。ICAMl和LFA1參與抗原呈遞細胞與T細胞之間的細 胞-細胞相互作用。抗原呈遞細胞(APC)上的ICAMl可結合T細胞上的 其受體LFA1且T細胞上的ICAMl可結合APC上的LFA1 ( Mackay CR， Imhof BA, Immunol Today, 1993， 14:99 )。越來越多的證據支持先前認為是粘 附分子的數個分子也能夠傳遞用於T細胞激活的共刺激信號的觀點(LFA3、 LFA1和ICAMl ) ( Mackay CR Imhof BA, Immunol Today, 1993， 14:99 )。共刺激分子對T細胞提供使得增生啟始和增強的其它信號(Steinman RM Young JW. 1991, Curr. Opin Immunol 3:361 )。 心血管疾病的組合治療
心血管疾病的組合治療可使用士他汀(statin)、血管緊張素轉化酶 (ACE)抑制劑、(3阻斷劑、4丐離子通道阻斷劑、ReoPro、克羅匹多 (Clopidogrel)和腎素血管緊張素抑制劑實現。內皮細胞功能障礙與諸如動 脈粥樣硬化、高血壓和血管平滑肌細胞增生的心血管病症相關。Bst2表達 由諸如TNFa、幹擾素y和組胺的發炎性細胞因子誘導，這表明Bst2可能 牽涉於心血管疾病中。因此，阻斷Bst2作為單一治療或與包括士他汀、ACE 抑制劑、(3阻斷劑、鈣離子通道阻斷劑、ReoPro、克羅匹多和腎素血管緊張
此外，Bst2由平滑肌細胞中的發炎性細胞因子誘導。平滑肌細胞增生 可降低血管成形術的成功率，血管成形術是增加動脈粥樣硬化動脈(通常 冠狀動脈)的直徑的手術。阻斷Bst2可能降低平滑肌細胞增生並增加血管 成形術的成功率。
類風溼性關節炎的組合治療
用於類風溼性關節炎的與CTLA4-Ig或TNFa、 IL6或IL1的阻斷劑的 組合治療。類風溼性關節炎(Rheumatoid arthritis, RA )是以慢性滑液炎症、 骨侵蝕和軟骨破壞為特徵的發炎性病症。在臨床試驗中，阻斷單一促發炎 細胞因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNFa )有效抑制關節炎過 程。然而，僅由TNFa阻斷劑很少達成RA的病徵和病狀的完全好轉，這提 示數個促發炎通路可能獨立於TNFa起作用。已證明TNFa阻斷阻滯大量炎 症臨床病徵不展示反應的患者的骨侵蝕。TNFa對骨的作用與疾病的病徵和 症狀的臨床反應無關。因此，TNFa在關節炎症、骨侵蝕和軟骨破壞中的相 對作用可能不同。
已證明阻斷TNFa、白細胞介素-1 (IL-1 )的主要標耙分子對RA具有 一定作用。IL-1已證明其對軟骨損傷的作用，但IL-1受體拮抗劑的單一治 療並不清除大多數患者的關節炎的臨床病徵和症狀。雖然由任何單一治療、 甚至連TNF抑制也很少達成RA的病徵和症狀的完全好轉，但TNFa/IL-1 、 TNFa/RANKL或TNFa/IL-1/RANKL在實驗才莫型中的組合抑制的初步結果 提示所述治療可具有疊加效應。這些結果強化使用超過一個促發炎通路的 組合阻斷治療類風溼性關節炎的基本原理。
最近，也已證明抗IL6或細胞毒性淋巴細胞相關抗原4-Ig ( cytotoxic T lymphocyte associated-antigen 4-Ig, CTLA4-Ig )對治療關節炎有益。Bst2基 因的啟動子區具有信號轉導與轉錄激活因子(STAT3)結合位點，STAT3 介導白細胞介素-6 (interleukin-6， IL-6)應答基因表達，這提示Bst2的表達可能受IL6-STAT3通路調控(Ohtomo等人，Biochem Biophys Res Commun. 1999, 258(3):583-91 )。對為IL6下遊標耙的Bst2的阻斷可能對治 療RA有益。
細月包毒性T '淋巴細胞相關抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4， CTLA4 )是在T細胞激活後上調的T細胞受體。在大多數狀況 下，僅來自T-細胞受體(T-cell receptor, TCR)的信號不能勝任產生最佳免 疫反應，且需要第二共刺激信號來克服T細胞應答閾值。TCR信號的這一 增強主要由T細胞上的CD28提供，CD28可由表達於抗原攜帶細胞上的 B7引發。 一旦激活，T細胞就表達也可結合同一 B7分子的第二受體 CTLA-4。與CD28相反，CTLA-4抑制T-細胞反應。
CTLA4-Ig是由人類CTLA4細胞外域和人類IgGFc區組成的重組嵌合 融合蛋白(Abatacept, Bristol-Myers Squibb )。 CTLA4-Ig結合APC (抗原呈 遞細胞)B7分子，阻斷其與T細胞上CD28受體的相互作用，從而阻斷與 T細胞上CD28的共刺激相互作用(Linsley等人，J Exp Med. 1991, 174(3):561-9)。已證明CTLA4-Ig有效治療類風溼性關節炎(Moreland等人， Nat Rev Drug Discov. 2006， 5(3): 185-6 )。因此，Bst2阻斷劑與CTLA4-Ig或 TNFa、 IL6或IL1的阻斷劑的組合治療可對治療關節炎有益。
可使用大鼠膠原誘發關節炎模型或大鼠佐劑誘發模型。可與小鼠抗大 鼠TNFR、小鼠抗大鼠IL6受體或小鼠抗大鼠IL1受體單克隆抗體或與鼠類 CTLA4-Ig組合測試小鼠抗大鼠Bst2抗體、人類Bst2誘飾-Fc、大鼠Bst2 誘斜-Fc或小鼠Dampl誘何-Fc。如Lane等人(Lane等人，Immunology, 1993， 80(1):56-61 )中所報導製備的鼠類CTLA4-Ig可用於其它研究(Shiraishi等 人，Am J Transplant. 2002， 2(3):223-8 )所示的大鼠模型中。小鼠CTLA4-Ig 可由小鼠CTLA-4基因的細胞外部分與人類IgGl的恆定區的嵌合基因產 生。人類CTLA4-Ig ( Abatacept, Bristol Squibb )也可用於膠原誘發關節炎的 大鼠模型中。
也可使用表達人類Bst2的敲入小鼠。用膠原或佐劑處理敲入小鼠以誘 發關節炎病狀，且然後用抗人類Bst2抗體或人類Bst2誘斜-Fc與大鼠抗小 鼠TNFa受體(Abcam)、大鼠抗小鼠IL6受體(Genzyme )或大鼠抗小鼠 IL1受體(Abcam )單克隆抗體或與小鼠CTLA4-Ig組合處理。抗Bst2治療 也可用於治療也具有發炎性組分的更普通形式的關節炎、骨關節炎。
津喘的組合治療
描述尤其使用茶鹼、糖皮質激素、TNFa阻斷劑或抗ICAM1的譯喘組 合治療。譯喘的病理學特徵的大部分描述包括支氣管平滑肌肥大/收縮、粘 膜水腫和上皮基底膜增厚和黏膜下層組織中的發炎性細胞，尤其嗜酸性粒 細胞。認為這些事件以相繼方式出現，從而產生哮喘的病理學特徵。哮喘
33的目前治療包括抗膽鹼能藥、類固醇、腺苷竟爭性激動劑和長效和短效卩2 激動劑。Bst2阻斷劑與這些常規治療的組合治療可能對哮喘有益。此外， 我們的基因表達概況數據指示在諸如幹擾素y的發炎性刺激後在平滑肌細 胞中具有高可誘導性(圖34)。這些數據指示Bst2可能參與平滑肌細胞生 理學和Bst2阻斷劑在嗜喘治療過程期間除先前表徵的消炎反應外還可能顯 現一些其它有益作用的可能性。出於這些原因，Bst2阻斷劑與常規譯喘治 療的組合治療可具有疊加效應。
當哞喘逐漸變得更嚴重或患者不對茶鹼治療具有反應時，用皮質類固 醇治療患者。Bst2阻斷劑與皮質類固醇的組合治療可能使得皮質類固醇的 劑量減小，從而降低其副作用。
已證明ICAM1、 a4整合素和TNFa在大鼠或靈長類動物卯白蛋白誘發 的哮喘模型中的作用(Taylor等人，Am J Respir Cell Mol Biol. 1997， 17(6):757-66)。用ICAM1、 TNFa和/或a4整合素的阻斷劑對Bst2的組合 抑制可有效治療哮喘。可購得小鼠抗大鼠ICAM1抗體、大鼠抗小鼠ICAM1 抗體、小鼠抗大鼠TNFR抗體、大鼠抗小鼠TNFR抗體、小鼠抗大鼠a4整 合素抗體和大鼠抗小鼠a4整合素抗體用於使用鼠類或大鼠模型的臨床前研 究。可購得小鼠抗大鼠ICAM1抗體、大鼠抗小鼠ICAM1抗體、小鼠抗大 鼠TNFR抗體、大鼠抗小鼠TNFR抗體、小鼠或大鼠抗TNFa抗體、小鼠 抗大鼠a4整合素抗體和大鼠抗小鼠a4整合素抗體用於使用鼠類或大鼠模 型的臨床前研究。
自體免疫肝炎的組合治療
描述尤其使用皮質類固醇的自體免疫肝炎(autoimmune hepatitis, AIH) 組合治療。自體免疫肝炎是慢性進行性肝病。可能的引發因素包括病毒、 其它自體免疫病症和藥物。自體免疫肝炎的自然史展示不良預後，其中在 未經治療的患者中頻繁進展為肝硬化和肝功能不全。AIH很少經歷自發好轉。
造成發病機理的分子機制包括自體抗體抗自體抗原、細胞粘附分子 和細胞因子的反應；和出現血管生成(Medina等人，Aliment Pharmacol Ther. 2003， 17(1):1-16)。患有AIH的患者中出現細胞間粘附分子-1 (sICAM-l)、 血管細胞粘附分子-1 (sVCAM-l)、 (s)E-選擇素、(s)P-選擇素和可溶性白細 胞介素-2受體(sIL-2R )、 IL4、 LFA1 、 LFA3 、 TGFp的血清含量升高(Simpson 等人，Eur J Gastroenterol Hepatol. 1995， 7(5):455-60 )。在慢性病毒性肝炎、 自體免疫肝炎中，T細胞介導的免疫機制在組織損傷發病機理中發揮重要作 用(Bruck等人，Isr Med Assoc J. 2000， 2 Suppl:74-80 )。
所選用於AIH患者的治療是呈單 一 治療形式或與硫唑嘌呤 (azathioprine )組合的糖皮質激素(Czaja AJ， Drugs 57:49-68, 1999, Cook等人，Q J Med. 1972， 40:159; Murray-Lyon等人，Lancet, 1973， 1:735-7 )。雖然 皮質類固醇在最初治療期間降低肝硬化的發病率，但即使治療，在5-10年 內超過90%的患者也出現肝硬化(Davis等人，1984, Gastroenterology 87:1222-7)。
使用皮質類固醇治療與熟知劑量依賴型副作用相關(Summerskill等人， Gut 16:876-83, 1975, Czaja AJ,於Krawitt EL, Wiesner RH編.Autoimmune Liver Disease. New York; Raven Press, 1991:143-66中)。高血糖效應和高血壓 也很頻繁。因此，必須特別注意糖尿病患者以及患有由肝病引發的代謝骨 疾病的患者。
抗Bst2或Bst2誘何與皮質類固醇的組合治療可有益於維持疾病症狀好 轉。這一組合可使得皮質類固醇的劑量減小，從而降低其副作用並達成比 高劑量皮質類固醇更佳的效果。
可使用諸如小鼠刀豆球蛋白A誘發的肝損傷模型的模型(Kaneko等人， Biochem Biophys Res Commun. 2006， 345(1):85-92 )使用可使用DamplV畫小 鼠產生的小鼠抗Dampl抗體、大鼠抗小鼠Dampl或人類、大鼠或小鼠Bst2 (Dampl )誘何-Fc或在大鼠硫代乙醯胺誘發的肝硬化模型中(Zimmermann 等人，Gastroenterol Hepatol. 2006, 21(2):358-66 )使用小鼠抗大鼠Bst2或人 類、大鼠或小鼠Bst2 ( Dampl )誘斜-Fc研究抗Bst2或Bst2誘何的用途。
對移植的組合治療
描述尤其使用環孢黴素(cyclosporine )、雷帕黴素(rapamycin )或抗 LFA1抗體的移植組合治療。已證明粘附分子關鍵性參與移植排斥且為靶向 介入治療的顯著分子候選物。粘附分子通過控制運輸宿主白細胞進入同種 異體移植物而影響同種異體移植排斥的細胞機制。運輸細胞進入同種異體
合所介導。在同種異體:植物內，粘附分子也可參與T-細胞對標靶細胞的 識別。
免疫抑制性環孢黴素或雷帕黴素作為有效鈣調神經磷酸酶 (calcineurin)抑制劑用於移植醫學中。然而，用釣調神經磷酸酶抑制劑治 療的患者與可導致腎衰竭的腎中毒作用相關(Miller等人，J Heart Lung Transplant, 1995,14:S227; Vitko S， Viklicky O. Transplant Proc. 2004, 36(增刊 2):243S-247S )。其它副作用包括神經毒性、高鉀血症和高血壓。
Bst2誘辨或抗Bst2與亞閾值或適度劑量的環孢黴素或雷帕黴素的組合 治療可具有腎中毒可能性降低的有益協同免疫抑制作用。
測試Bst2阻斷劑的功效的移植動物模型包括小鼠皮膚同種移植排異反 應模型(Tepper等人，Transplant Proc. 1"4，26(6):3151-4)、移植物抗宿主疾 病(graft ve腦-host disease, GvHD )模型(Zhang等人，Blood, 2006,107:2993-3001; Baliga等人，Transplantation. 1994， 58(10):1082-90 )、兔子角 膜同種異體移植排斥反應模型(Shirao等人，Curr Eye Res. 1986, 5(ll):817-22 )、胰島細胞異種移植模型(Lenschow等人，Science, 1992, 257(5071):751 )、鼠類心臟同種異體移植模型(Larsen等人，Nature, 1996， 381(6581):434-8; Pearson等人，Transplantation, 1995， 59(3):450 )和腎移植模 型。
對於臨床前研究，視模型而定，將小鼠抗Dampl、大鼠抗小鼠Dampl、 小鼠抗大鼠Bst2、人類、大鼠、小鼠Bst2 (Dampl)誘斜-Fc與不同劑量的 環孢黴素或雷帕黴素組合使用。檢查移植物存活率和T細胞激活/增生。
多發性硬化症的組合治療
描述尤其使用a4整合素阻斷劑的多發性硬化症組合治療。多發性硬化 症(Multiple sclerosis, MS )是具有々支定自體免疫發炎性病因學的中樞神經 系統(central nervous system, CNS )的常見脫髓鞘和發炎性疾病。阻斷激 活T細胞與內皮細胞粘附的抗體可降低多發性硬化症斑塊的發炎性特徵。 目前治療包括針對a4整合素的單克隆抗體(那他^朱單抗(Natalizumab ))、 幹擾素卩和格拉默(glatiramer ) ( Ropper AH， 2006， N Engl J Med. 354:965; Rudick RA等人，N Engl J Med. 2006,354(9):899-910 )。
抗Bst2或Bst2誘何與針對(x4整合素的單克隆抗體的組合治療可能為 有益的。可使用小鼠實驗性過敏性腦脊隨炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE )模型使用抗Damp 1抗體、可4吏用Dampl-Z-小鼠產 生的小鼠抗小鼠Dampl、大鼠抗小鼠Dampl或人類、大鼠或小鼠Bst2 (Dampl )誘飾-Fc與大鼠抗小鼠a4整合素(Abeam )研究抗Bst2或Bst2 誘飾的用途。
最小化組織損傷的組合治療
組織損傷可因缺血、出血、外傷、腫脹、灼傷或暴露於化學品、毒素 或藥物而發生。由組織損傷的發炎性反應所致的細胞死亡通常增強組織損 傷。通過阻斷Bst2，可使組織損傷最小化。舉例來說，使用諸如糖皮質激 素的類固醇使中風後腦損傷最小化。中風期間或中風後即刻與類固醇組合 阻斷Bst2可使最終腦損傷的程度最小化。類似地，心肌梗塞期間或心肌梗 塞後即刻阻斷Bst2可降低心臟損傷的程度。
克羅恩氏病的組合治療
描述尤其使用抗a整合素抗體的克羅恩氏病組合治療。克羅恩氏病是 以嚴重T輔助細胞(helper cell， Th) 1驅動的結腸炎症為特徵的慢性虛弱 病。可使用小鼠結腸炎模型測試Bst2拮抗劑的作用(Gonzalez-Rey等人， Gastroenterology. 2006年6月；130(6): 1707-20 )。關於發炎性腸病，具有抗a4 整合素抗體的組合治療可能有益。代謝症候群的組合治療
描述尤其使用二曱雙胍(metformin), p塞唑烷二酮(TZD )、 士他汀、 NSAID、 ACE抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑的代謝症候群組合治療。
念。腫瘤壞死因子a (tCf)在肥胖齧口齒動物的脂肪組織和血液中升高,'且 對TNFa的阻斷改良胰島素敏感性。白細胞介素(IL) -6和單核細胞趨化 蛋白(monocyte chemoattmctant protein, MCP-1 )也可引起腹島素抵抗，且 已報導在糖尿病和胰島素抵抗患者中TNFa、 IL-6和IL-8的含量升高
(Roytblat等人，Obes Res. 2000， 8(9):673匿5; Straczkowski等人，J Clin Endocrinol Metab. 2002， 87(10):4602-6; Hotamisligil等人，Science. 1996, 271(5249):665-8; Sartipy P, Loskutoff DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003，100(12):7265-70; Hotamisligil等人，J Clin Invest. 1995，95(5):2409漏15 )。 另外，在患有胰島素抵抗的患者中觀察到發炎性指標C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP )的含量升高(Visser等人，JAMA. 1999, 282(22):2131-5 )。此 外，在肥胖齧齒動物中用高劑量水楊酸酯治療可抑制發炎性通路中的主要 激酶IkB激酶(IKK )且逆轉葡萄糖耐受性和胰島素抵抗(Yuan等人，Science. 2001，293(5535):1673-7)。
胰島素抵抗可促進內皮功能障礙，且抗TNF-a阻斷產生內皮功能的快 速改良。全身性炎症、胰島素抵抗和內皮功能障礙已牽涉於心血管疾病的 發展中。內皮負責維持血管體內平衡。在生理學病狀中，其通過保持血管 緊張度、血流和膜流動性起作用。代謝症候群中出現的內皮功能障礙是諸 如TNF-a的發炎性細胞因子的作用的結果。因此，代謝症候群視為伴有內 皮功能障礙的慢性炎症狀態，例如引起缺血性心血管事件發病率增加、胰 島素抵抗和高死亡率。因此，認為能夠阻斷髮炎性病狀的治療必然使歸因 於代謝症候群的心血管風險、II型糖尿病和血脂異常最小化。
以下藥物廣泛用於治療代謝症候群口服抗糖尿病藥，諸如二曱雙胍 和p塞唑烷二酮(TZD);抗高血壓藥，諸如血管緊張素轉化酶(ACE)抑制 劑和血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker, ARB);和降脂 士他汀藥物和非類固醇消炎藥(NSAID)。展示這些已證明降低2型糖尿病 和動脈粥樣硬化的發病率和/或延遲其發作的藥物具有明顯的消炎性質。
已證明二曱雙胍激活在調控能量體內平衡和代謝應激中發揮重要作用 的腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)。 二甲雙胍也劑量依賴性抑制腫瘤壞死因 子(TNF ) a誘發的NFkB激活和TNF-a誘發的IkB激酶活性(IKK )。此 外，二曱雙胍削弱多種促發炎和細胞粘附分子(諸如血管細胞粘附分子-l
(VCAM1 )、 E-選^f奪素、細胞間粘附分子-1 (ICAM1 )和單核細胞趨化蛋白 -1 (MCPl))的TNF-a誘發的基因表達。血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑(ARB)降低炎症指標並降低發展出2型糖尿 病的風險。胰島素增敏藥物逸唑烷二酮(TZD)是過氧化物酶體增殖物激 活受體Y ( peroxisome-proliferator-activated receptor gamma, PPARy)的選擇 性配位體。PPAR是轉錄因子的核激素受體超家族成員且是各種與能量代謝
(包括脂質和碳水化合物代謝)和炎症相關的生理病原性過程中的關鍵調 控劑。PPARy大量表達於脂肪組織中，且據報導PPARy信號轉導通路通過 抑制NF-kB發揮消炎作用。與這些結果一致，活體外與活體內研究提供TZD 具有消炎性質的證據。TZD抑制巨噬細胞激活並降低發炎性細胞因子在巨 噬細胞和單核細胞中的表達並釋放。活體內TZD治療降低循環單核細胞核 NF-kB含量而增加同一細胞中的抑制發炎性調節劑(諸如白細胞介素-l卩
(IL-1卩)、IL6、粘附分子、VCAM-1和P-選擇素和單核細胞)的NK-kB 抑制劑IkB的表達。
Bst2配位體(Bst2 L )
由受體蛋白Bst2的細胞外域組成的Bst2誘餌活體外抑制同型與異型細 胞-細胞相互作用。因為任何給定受體的細胞外域是與其配位體相互作用的 域，所以Bst2誘何介導的對細胞-細胞相互作用的抑制指示1)存在天然 存在的Bst2配位體(Bst2 L ), 2 )細胞-細胞粘附需要Bst2與Bst2 L之間的 相互作用，和3 ) Bst2誘何必須與天然存在的Bst2 L相互作用且在粘附檯r 定中通過中和Bst2 L抑制細胞-細胞相互作用，從而負面調控免疫發炎性反 應。
Bst2誘斜抑制U937附著於HUVEC的觀察結果指示Bst2 L存在於未 受刺激的U937細胞的細胞表面上。Bst2誘飾抑制激活T細胞或激活U937 細胞的同型聚集的另一觀察結果提示Bst2 L可能表達於激活之前和之後的 T細胞和/或U937細胞的表面上。Bst2 L表達在T細胞或U937細胞激活之 後可能上調。因此，Bst2 L可能表達於激活之前或之後(例如T細胞激活 條件或脂多糖(LPS)刺激條件)的U937細胞(或其它單細胞核細胞系)、 T細胞或初級造血細胞中。Bst2 L也可能表達於B細胞、樹突狀細胞、內 皮細胞或纖維母細胞中。
Bst2L可為蛋白質或分子。Bst2L可為膜蛋白質或可溶性蛋白質。有可 能可存在許多展示Bst2受體的不同結合特異性和功能特徵的不同Bst2 L蛋 白或分子。也涵蓋Bst2本身可為Bst2的潛在功能配位體，因為已知Bst2 形成同源二聚體。發炎細胞上的Bst2可識別浸潤白細胞和免疫細胞上的 Bst2。有可能所有Bst2 L蛋白或分子在功能或結合特徵方面可彼此完全無 關。因此，應徹底測試其是否調節發炎性或免疫反應中的限速步驟的功能 特徵以確立Bst2誘辨(Bst2誘斜-Fc )的治療標靶，且隨後研發用於預防和 /或治療發炎性病狀的治療物質。其它可能不處於發炎性通路中的限速步驟
38中的Bst2L蛋白或分子可介導不同疾病過程中的其它重要通路。
證明Bst2L的存在是本發明的顯著特徵，因為Bst2L可為與消炎分子 相互作用的標靶。針對Bst2 L的抗體可成為治療各種免疫和發炎性疾病的 治療抗體。Bst2L的細胞外域與Fc的嵌合分子也可為有益的。有可能，Bst2 L可參與(例如)T細胞激活的T細胞共刺激(或抑制)信號轉導。雖然 Bst2 L將與Bst2結合，但Bst2 L可能與T細胞或抗原呈遞細胞上的介導共 刺激或共抑制信號的許多其它受體相互作用。這些新穎種類的受體的激動 性抗體或拮抗性抗體或Fc融合蛋白可成為治療各種免疫發炎性疾病的蛋白 質治療藥物。
另外，通過使用Bst2 L,可建立直接結合檢定或結合竟爭檢定以篩選 Bst2的Bst2誘辨-(Fc)變異體或小分子調節劑。這些檢定使得本發明者能夠 篩選Bst2的Bst2誘何變異體或小分子調節劑來抑制或增強Bst2-Bst2 L相 互作用。
抗Bst2 L抗體
如果投與Bst2 L (小鼠Dampl L)增強免疫發炎性反應，那麼產生抗 Bst2 L來治療各種免疫發炎性疾病是合乎邏輯的。也涵蓋抗Bst2抗體與抗 Bst2 L抗體的組合治療。
抗Bst2抗體
常規IgG抗體為具有結合兩種抗原的能力的二價抗體。這一能力大大 增強其功能性親和力並賦予於許多細胞表面受體和抗原上的長滯留時間。 抗Bst2抗體可為分別抑制或增強免疫發炎性反應的拮抗性抗體或激動性抗 體。拮抗性與激動性抗Bst2抗體可在許多不同抗Bst2抗體才各式的以下實例 中獲得。
1.本發明的抗Bst2抗體可為人化單克隆抗體或人類單克隆抗體。當將 鼠類抗體的小部分嫁接於人類免疫球蛋白分子上以產生僅免疫球蛋白分子 的Fc部分為人類的嵌合抗體或僅免疫球蛋白的互補決定區 (complementarity determining region, CDR)為鼠類的且分子的90%至95% 為人類的人化抗體時，完全抗原性鼠類mAb變得對人類友好。在一個方面 中，完全人類單克隆抗體可在轉基因小鼠中通過釆用常規方法(諸如 HuMAb-Mouse ( GenPharm-Medarex)或XenoMouse ( Abgenix, Inc.)技術) 產生。人化抗體包括將來自接受者CDR的殘基用來自具有合乎需要的特異 性、親和力和生物功能的非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔子)的CDR殘 基置換的人類免疫球蛋白。
人類抗體也可4吏用諸如噬菌體呈現文庫的技術產生(Hoogenboom和 Winter, J. Mol. Biol, 1991， 227:381; Marks等人，J. Mol. Biol. 1991， 222:581 )。 熟知人化非人類抗體的方法。人化可按照Jones等人，Nature, 1986， 321:522;Riechmann等人，Nature, 1988, 332:323和Verhoeyen等人，Science, 1988， 239:1534中所揭示的Winter等人的方法通過用齧齒動物CDR序列或CDR 替換人類抗體的相應序列來執行。所述人化抗體為嵌合抗體(美國專利第 4,816,567號)。人化抗體通常為CDR殘基經來自齧齒動物抗體的類似位點 的殘基取代的抗體。
2. 本發明的抗Bst2抗體可為納米抗體(Nanobody)。在無輕鏈的情況 下起作用的重鏈抗體天然存在於護士鯊(nurse shark )、斑紋鬚鯊(wobbegong shark)和駱駝科(Camelidae )中(Greenberg AS.等人,1995, Nature 374:168; Nuttall SD.等人，Mol. Immunol. 2001, 38:313; Hamers-Casterman C.等人, 1993, Nature 363:446 )。其抗原結合位點經縮減為單一域VhH域。因為重鏈 抗體的可變域是分子質量僅15,000道爾頓的最小完全功能性抗原結合片 段，所以這一實體稱為納米抗體。
納米抗體可成為新穎類別的治療抗體。與經典抗體相比，納米抗體具 有優越的性質，因為其小，極為穩定，易於大量製造且易於重新設計為多 價或多特異性蛋白質。納米抗體可通過非注射方式投與。因此，納米抗體 提供具有小分子的小尺寸、穩定性和藥物動力學的抗體的結合親和力和特 異性。
納米抗體的小尺寸使得其尤其適於靶向被阻塞位置(諸如滲透臨界的 腫瘤)或常規抗體不易接近的區域中的抗原。抗Bst2納米抗體可適用於活 體外診斷免疫檢定和活體內成像應用。抗Bst2納米抗體可穿過血-腦屏障且 因此可將治療納米抗體傳遞到腦中。
抗Bst2納米抗體可使用噬菌體呈現技術獲得。納米抗體文庫如(Conrath KE.等人，Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45:2807 )所述由經免疫單峰駝 構築。然後使用噬菌體呈現文庫淘選塗布於微量滴定板上的人類Bst2。由 ELISA執行富集克隆的選擇，且對克隆進行測序。從陽性克隆純化蛋白質。
3. 本發明的抗Bst2抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體為單克隆抗 體，優選具有雙重靶向特異性的人類或人化抗體。雙特異性抗體來源於具 有不同特異性的兩種抗體的可變域的重組；因此，雙特異性抗體能夠結合 兩個其親本抗體的抗原。在抗Bst2的狀況下， 一種結合特異性可針對Bst2 且另一種可針對Bst2 L或任何其它細胞表面蛋白質，例如在發炎性或自體 免疫病狀下表達Bst2的T細胞上的受體或相同細胞表面上的其它發炎性蛋 白質。這些雙特異性抗Bst2抗體可充當拮抗性或激動性抗體。
熟知製備雙特異性抗體的方法(Traunecker等人，EMBO J, 1991， 10:3655; WO 93/08829; Suresh等人，Methods in Enzmology, 1986， 121:210; Milstein和Cuello, 1983， Nature, 305:537 )。簡言之，使具有合乎需要的結合 特異性的抗體可變域與免疫球蛋白恆定域融合。這一融合體含有免疫球蛋白重鏈恆定域(鉸鏈區的部分、CH2區和CH3區)且優選含有第一重鏈恆 定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體和免疫球蛋白輕鏈的DNA插 入單獨表達載體中並共轉染。
4. 本發明的抗Bst2抗體可為單鏈可變片段抗體(single - chain variable fragment antibody, scFV )。重組方法已促成單鏈可變片段抗體(scFv )的產 生。單體scfv具有僅約30,000道爾頓的分子質量，其以經富含Gly/Ser的 合成連接子連接的單一 VL-VH對的形式表達於多種系統中(Berezov A.等 人，2001, J Med Chem 44:2565 )。當表達於細菌或真核細胞中時，scFv摺疊 成類似於親本抗體相應區域的構形。證明其保留可比於Fab的親和力的親 和力(Kortt等人，1994, Eur J Biochem 221:151 )。 ScFv適於各種基因修飾， 諸如人化和產生融合蛋白質以增強其作為治療劑的潛能。舉例來說，已證 明與補體的C5組分結合的人化scFv培克珠單抗(Pexelizumab )在冠狀動 脈旁路移植手術期間降低心肌梗塞(Varrier等人，2004, JAMA 291:2319 )。
具有不同特異性的scFv也可連接在一起以製造結合單一或不同細胞上 的兩種不同受體的雙特異性抗體。在抗Bst2的狀況下，其可為具有抗Bst2 scFv和抗Bst2 L scFv或具有抗Bst2 scFv和任何其它細胞表面蛋白質的雙 特異性抗體樣分子，所述其它細胞表面蛋白質例如在發炎性或自體免疫病 狀下表達Bst2的T細胞上的受體或相同細胞表面上的其它發炎性蛋白質。
可使用噬菌體呈現方法製造抗Bst2 scFv。在這一方法中，從B細胞收 集抗體可變區cDNA的大型全套，且VH與VL的組合以scFv形式表達於 絲狀噬菌體表面上。將從抗原塗布板中淘選表達scFv的噬菌體。抗Bst2 scFv 的親和力可通過^f吏構築體的CDR突變，然後重複淘選工序來改良。
5. 本發明的抗Bst2抗體可為Fab、 Fab2雙特異性抗體、Fab3三特異性 抗體、二價微型抗體、三價三鏈抗體或四價四鏈抗體。
6. 本發明的抗Bst2抗體可為單克隆抗體。單克隆抗體4吏用雜交瘤方法 (諸如Kohler和Milstein (Nature, 1975, 256:495 )所述的方法)製備。用免
:有結合"異性"抗體":^細胞:在一替代)':中，可在活體外^淋^
細胞進行免疫。
針對Bst2的單克隆抗體
最近，在已確定疾病蛋白質標靶的狀況下，使用免疫治療已變得盛行。 治療抗體所允許的高度特異性靶向即使在相對較高的劑量下也幾乎不產生 副作用。這也利用抗體天然固有的血清穩定性，從而為長效治療分子提供 基礎。
抗體治療劑通常屬於不互相排斥的兩個類別中的一個。第一類別是根 據抗體的可變區(標靶蛋白質識別部分)。由抗體識別的特異性抗原決定基將允許抗體抑制標靶蛋白質與其它蛋白質的結合(抑制或拮抗效應)從而 幹擾細胞-細胞相互作用或終止通過標靶蛋白質的信號轉導，或由於其與標 靶蛋白質的結合而在不存在所需二級蛋白質的情況下產生人工信號(激活 或激動效應)，如同二聚化依賴型受體信號轉導或受體依賴型配位體模擬的 情況。第二類別根據抗體的恆定區(Fc部分)，這一恆定區決定(如果有)
何種免疫效應功能將因抗體Fc部分與存在於免疫效應細胞上的其同源Fc
受體的結合而激活。靶細胞表面上特異性標靶蛋白質的存在使得所述細胞 成為由效應功能破壞的標靶。
通過研發對Bst2具有高度特異性的抗體，我們已能夠產生共有誘何 Bst2分子的許多特徵的治療抗體，因為其能夠幹擾細胞-細胞粘附並在抑制 疾病特異性發炎性反應中充當治療蛋白質。
在涉及黏膜免疫系統的發病機制的某些狀況下，可經口或經鼻投與抗 體。黏膜免疫系統是獨特的，因為在暴露於抗原後優先誘導出耐受性，且 調控T細胞的誘導是經口耐受性的主要機制。經口^:與的抗體可被腸管相 關、淋巴糹且織(gut-associated lymphoid tissue, GALT)'決速吸4史，在;t匕處其 發揮其免疫作用。經口投與抗體可以傳遞增強T細胞調控功能的微弱但有 效的信號的方式對腸管中的T細胞傳輸信號。經口投與CD3特異性抗體已 在實鳥全'f生自體免疫'f生月滷炎(experimental autoimmune encephalitis, EAE )才莫 型中例示。這些研究證明不需要CD3特異性抗體的Fc部分。經口投與的 CD3特異性抗體的F(ab')2片段抑制EAE。
抗體工程化
i.抗體工程4b
一旦利用治療性抗Bst2抗體，下一步驟即為工程化抗原結合域(親和 力成熟，穩定性)和改變效應功能(抗體依賴型細胞毒性(antibody-d印endent cellular cytotoxicity, ADCC )、 S卜體依賴型糹田月包毒小生(complement-dependent cellular cytotoxicity, CDC)和清除率)。改良抗Bst2抗體效力的另一方法 為尋求抗體毒素接合物、雙特異性抗體和/或研究Fc受體(Fc receptor, FcR) 多態現象。
抗Bst2抗體在結合與Bst2結合的細胞後阻斷Bst2與Bst2 L之間的相 互作用從而產生對細胞信號的介入。關於抗體工程化，表徵抗Bst2抗體其 是否交聯以引發細胞凋亡的細胞內信號、內化作用後向細胞傳遞毒素或使 用效應功能殺死細胞是重要的。抗Bst2的所有這些參數在治療自體免疫/ 發炎性病狀中可為重要的。
1-1.通過工程化抗原結合域改良抗Bst2抗體
l陽l-l.抗Bst2的F(ab)片^:
當需要快速清除和短半衰期時，諸如在ReoPro (Centocor)的狀況下，可使用抗Bst2的F(ab)片段。F(ab)片段因其尺寸較小可較易穿透實體組織。 F(ab)片段可在大腸桿菌中而不是哺乳動物細胞中製造。Bst2通過二價全長 抗Bst2抗體的交聯可能引起標靶細胞的凋亡。視待治療的疾病而定，所述 細胞凋亡可能是有利或有害的。如果Bst2通過全長抗Bst2抗體的交聯是有 害的的，那麼使用F(ab)可為有利的。 1-1-2.親和力成熟
免疫球蛋白基因的體細胞超突變為活體內產生高親和力抗體的關^fc, 但其僅在免疫後發生。因此，在來自非免疫供體的噬菌體呈現文庫中，很 少發現高親和力抗體。通常需要活體外親和力成熟來改良來自所述文庫的 抗體。不管抗Bst2抗體是來源於噬菌體文庫、雜交瘤還是其它技術，抗體 親和力都可能需要改良。親和力可能不僅對有效阻斷Bst2-Bst2 L相互作用 來說重要，而且對降低劑量和成本效益來說也重要。
然而，關於抗體親和力，可能情況並不總是具有最強結合的抗Bst2抗 體將是最佳選擇。 一個抗體可能與Bst2強烈結合但僅覆蓋Bst2上Bst2 L 結合位點的部分，而另 一抗體可能與Bst2不太強烈地結合但完全覆蓋Bst2 L結合位點。後者可能是較佳選擇。在Adams等人使用抗Her2抗體的研究 中(Cancer Res. 61:4750,2001 ),最高親和力的抗體並不展現穿透實體組織/ 腫瘤的最佳穿透性。高親和力scFv片段滯留在腫瘤周圍，而中等親和力抗 體穿透整個腫瘤。視待治療的疾病而定，組織穿透性減弱可能是抗Bst2抗 體親和力成熟的潛在問題。
1-1-2-1.親和力成熟(a伍nitymaturation)的一4殳方法
在親和力成熟(Levin和Weiss, Mol. BioSyst, 2:49, 2006 )中，使用突變 誘發改變CDR中的殘基，且就改良的結合和功效篩選所得突變型抗體。已 公開數種親和力成熟方法。這些方法包括通過以下各方法進行親和力成熟 噬菌體(Gram等人，PNAS 89:3576, 1992; Lowman等人，J. Mol. Biol., 1993， 234， 564 )、核糖體呈現(Lipovsek等人，J. Immunol. Methods 290 (2004)，第 51-67頁)、酵母表面呈現(Graff等人，Protein Eng. Des. Sel. 17 (2004)，第 293-304頁)、易出錯(error-prone) PCR( Schlapschy等人，Protein Eng. Des. Sel. 17 (2004),第847-860頁)、增變基因菌抹(Low等人，J. Mol. Biol. 260:359, 1996 )、逐步聚焦突變誘發(stepwise focused mutagenesis ) ( Wu等人，PNAS 95:6037, 1998 )和々包和突變i秀髮(saturation mutagenesis ) (Nishimiya等人，J. Biol. Chem. 275:12813, 2000; Yang等人，J. Mol. Biol. 254:392， 1995; Chowdhury和PastanNat. Biotechnol. 17:568, 1999 )。其它技術通常使用丙氨 酸掃描或定點突變誘發來產生特定變異體的有限集合。
1-1-2-2.通過4青確突變(Look-Through Mutagenesis, LTM )方法親和 力成熟
43最近，Rajpal等人(Bioren, San Carlos, CA )開發了使用酵母呈現系統 優化抗體的精確突變(LTM )技術。LTM可適用於抗Bst2抗體的親和力成 熟。LTM也可適用於篩選Bst2誘鉺(或Bst2誘何-Fc )的高親和力變異體。 以下說明用於抗Bst2抗體親和力成熟的Rajpal等人的方法的簡要描述。
LTM是允許各CDR的所有位置單一胺基酸突變以快速增強親和力的 多維突變誘發方法。在LTM中，用野生型殘基或代表主要側鏈化學的9種 胺基酸(小(A)、親核(S、 H)、疏水性(L、 P)、芳族(Y)、酸性(D)、 醯胺(Q)或石鹹性(K))中的一種:f又代標靶位置。LTM在CDR內產生一系 列單一突變，其中各野生型殘基經9種所選擇的胺基酸中的一種取代。
首先，使用經優化以用於釀酒酵母與大腸桿菌的密碼子通過重疊PCR 裝配抗Bst2scFv構築體，並將其亞克隆到酵母呈現載體中。這一原始構築 體充當後續抗Bst2 LTM文庫的模板。關於抗Bst2 LTM文庫的構築，合成 個別CDR寡核香酸以編碼各CDR位置具有一個標靶胺基酸取代的突變型 CDR。使用含有LTM寡核苦酸混合物的PCR擴增LTM取代的CDR片段。 在三元CDR文庫中，組合CDR1、 CDR2和CDR3的寡核苷酸以產生具有 三種突變型CDR ( VH與VL域)的文庫。然後使相應抗體文庫呈現於酵母 細月包表面上。
陽性選擇後，對產生與Bst2結合的較高親和力的克隆進行測序，且對 那些有益的突變進行定位。為鑑別改良結合的協同突變，由混合簡併DNA 探針產生組合有益突變的文庫。合成編碼所選胺基酸突變和野生型胺基酸 的簡併寡核苷酸並裝配以產生這些文庫。關於陽性克隆選擇，生物素標記 Bst2 (或Bst2誘飾)。將細胞與經生物素標記Bst2 —起培育並與抗生蛋白 鏈菌素(Streptavidin )珠粒結合。使用用經生物素標記Bst2 (或Bst2誘餅) 來標記酵母細胞並用未標記Bst2 (或Bst2 i秀辨)追蹤的脈沖追蹤策略選擇 呈現與經生物素標記Bst2 (或Bst2誘斜)結合較強的克隆。可由螢光激活 細胞分選儀(FACS)分選這些克隆。數輪選擇後，可獲得賦予較高親和力 的突變。然後將所有scFv亞克隆於表達載體中並分泌於大腸桿菌中。通過 使用BIAcore表面等離子體共振系統(BIAcore， Switzerland)測量scFv抗 體的結合親和力。
1-1-3.未經親和力成熟的高親和力抗體
Dyax的Hoet等人已構築具有獲自人類供體的天然存在的重鏈CDR3 和輕鏈序列與重鏈CDR1和CDR2中的抗原接觸位點的合成多樣性的組合 的人類F(ab)文庫。使用Dyax F(ab)文庫就與四種人類藥物標靶的結合所選 擇的F(ab)展示比所批准的治療抗體高的親和力(Hoet等人，Nature Biotechnol. 23:344， 2005 )。所述F(ab)文庫可提供不需要親和力成熟而產生 高親和力抗Bst2抗體的有效方法。1 _ 1 _4.消除可變區域中的Asn連接糖基化
抗體可變域中的Asn連接糖基化可影響抗原結合(Leibiger等人, Biochem J. 338:529， 1999 )。如果在抗Bst2抗體可變域中觀察到Asn連接糖 基化且抗體的結合或生物活性不需要碳水化合物，那麼可通過將Asn變為 Ala、 Gln或其它胺基酸來去除可變區中的Asn。
已報導CDR中的Asn-Gly或Asp-Gly序列經歷自發異構化以形成異天 冬氨酸(isoaspartic acid ) ( Cacia等人，Biochemistry 35:1897, 1996 )。形成異 天冬氨酸鹽可削弱或消除抗體的結合。如果抗Bst2抗體中的CDR含有這些 序列，那麼用Ala、 Gin或Glu取代Asn或Asp可為有益的。可判定這些取 代是否可維持抗體結合和功效。
如果曱硫氨酸經氧化且其幹擾結合，那麼CDR中曱硫氨酸的存在也會 成為問題。如果抗Bst2抗體的情況也是如此，那麼可研究用其它胺基酸取 代曱硫氨酸。
1-1-5.通過對抗原結合域進行突變誘發增強抗Bst2穩定性 抗Bst2的穩定性可通過改變影響穩定性的特定殘基、如Angal等人 ((Mol. Immunol. 30:105, 1993 )所示將來自不穩定scFv的CDR接枝到較
穩定的構架上或如Schuurman等人(Mol. Immunol. 38:1, 2001 )所示通過引
入雙石危4建改變VH-VL界面來獲得。
1-2.通過Fc工程化改良抗Bst2抗體
不同於必須能夠結合標靶並影響其功能的小分子量藥物，治療抗體可 結合標耙並通過效應功能抗體依賴型細胞細胞毒性(ADCC)、補體依賴型 細胞毒性(CDC)和吞噬作用引導免疫系統攻擊標靶。然而，通過阻斷配 位體-受體相互作用起作用的單克隆抗體(抗Bst2抗體可能也是如此)可在 不利用效應機制的情況下起作用(Agus等人，J. Clin. Oncol. 23 (2005)，第 2534-2543頁；Wang等人，Angiogenesis 7 (2004),第335-345頁)。
儘管如此，效應功能增強在抗Bst2抗體的作用中可為有益的。舉例來 說，所有CD20引導的單克隆抗體治療歸因於效應功能產生用於治療自體免 疫發炎性病狀(尤其類風溼性關節炎)的暫時性B細胞耗盡。也已知英利 昔單抗(Infliximab )(抗TNFa )在與TNFa活體內結合後產生CDC和ADCC (Scallon等人，Cytokine, 1995 )。
關於抗Bst2抗體，重要的是決定ADCC、 CDC和/或隨後的靶細J包石皮 壞對疾病的治療是有益還是有害的。 一種評定ADCC和CDC對抗Bst2治 療功能的作用的方法是測試抗Bst2抗體在FcYR敲除小鼠中的功效。
1-2-1.使用Bst2敲入FcyR敲除(雙重突變體)來決定效應功能是有利 還是有害的
ADCC和吞噬作用通過與一組具有激活和抑制活性的密切相關Fey受體(Fc gamma receptor, FcyR)的相互作用介導；CDC通過與補體系統中 的蛋白質(例如，Clq、 C3、 C4等)的相互作用介導；且半衰期/清除率通 過抗體與新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor, FcRn )的結合介導。抗Bst2 抗體的作用機制中FcyR (和潛在ADCC )的作用可通過使用缺乏常見y鏈 的小鼠(FcyR -/-) ( Takai等人，Cell 76:519, 1994 )、缺乏激活Fc受體FcyRI 和FcyRIII的小鼠和缺乏FcyRIIB的小鼠(Takai等人，Nature 379:346， 1996 ) 來研咒。
將使用與FcYR敲除雜交的Bst2敲入小鼠。當在C57B1/9小鼠中產生 Bst2敲入時，例如4吏FcyR缺陷型品系與C57B1/6雜交並回交以建立同基因 品系。然後使這一 同基因品系與Bst2敲入小鼠交配以產生FcyR-/-/Bst2/Bst2 和FcYRIIB-/-/Bst2/Bst2小鼠。使這些雙突變型小鼠經受疾病誘導性處理， 然後用抗Bst2抗體處理小鼠。
1-2-2.通過增強效應功能和/或穩定性改良抗Bst2活性
如果抗Bst2抗體使用ADCC用於治療作用，那麼使IgG Fc工程化以 改良效應功能(通過改良與FcyR和/或樸體的結合)可有利增強治療抗體。 結合改良已通過使Fc中的殘基突變(Shields等人，J. Biol. Chem. 276:6591， 2001 )、從Fc中的保守性碳水化合物中去除海藻糖部分(Shields等人，J. Biol. Chem, 277:26733, 2002; Shinkawa等人，J. Biol. Chem. 276:3466, 2003 )和多 個Fc ( Scallon等人，Mol. Immunol. 41:73, 2004 )達成。
1-2-2-1.通過Fc的胺基酸變化
已證明改變人類IgG中胺基酸殘基增強FqR結合和效應功能。大部分 這些作用集中於鉸鏈區(殘基216-230)和下鉸鏈區(殘基231-236)。近年 來，已公開人類IgGl上人類FcRI、 FcRIIA、 FcRIIB、 FcRIIIA和FcRn受 體的結合位點的明細圖(Shields等人，J. Biol. Chem. 276:6591， 2001和其中 的參考文獻)。在這一研究中，FcRIIIA的結合改良的所選IgGl變異體展現 ADCC顯著增強。也已報導，有可能通過改變特定IgGl殘基改良Clq結合 (Idusogie等人，J. Immunol. 166 (2001),第2571-2575頁)。
新生兒Fc受體(FcRn)在治療性單克隆抗體的清除率中發揮作用 (Lencer和Bl腿berg, Trends Cell Biol, 15 (2005),第5-9頁)。與為免疫球蛋 白超家族成員的FcyR不同，FcRn在結構上與包含與a2小球蛋白非共價結 合的y鏈的I類MHC相關(Martin等人，Mol. Cell 7 (2001)，第867-877頁)。 Shields等人得出的信息將有助於設計具有改良的與FcYR的結合從而 增強效應功能的抗Bst2變異體。抗Bst2半衰期的增加可通過改變其對FcRn 的親和力獲得。
1-2-2-2.對抗Bst2抗體進行去海藻糖基化(DefUcosylation)以供增強 效應功能改良抗Bst2抗體的效應功能的另 一方法可為改變Fc域中Asn297處的 糖基化(海藻糖基化或唾液酸化)。
IgG的糖基化為與所有Fcy受體結合所必需(Jefferis和Lund， Immunol. Lett. 82:57， 2002 )。在人類IgG上，Asn297連接碳水化合物可見於Fc域中。 這一複雜碳水化合物包含含有GlcNAc (N-acetylglucosamine, N-乙醯葡糖 胺)和甘露糖的核心寡糖。核心也含有連接在一個或兩個未端N-乙醯葡糖 胺上的諸如半乳糖、海藻糖、GlcNAc和/或半乳糖-唾液酸的各種其它單糖。 在這個單一糖基化位點處已檢測到超過30種不同的共價連接多糖(Routier
等人，J. Immunol. Methods 213:113， 1998 )。
已展示海藻糖部分存在與否在與FcYR的結合中發揮重要作用。去海藻 糖基化單克隆抗體展現顯著增加的與FcyR的結合併展示增強的活體外 ADCC( Shields等人，J. Biol. Chem. 277 (2002)，第26733-26740頁；Shinkawa 等人，J, Biol. Chem, 276 (2003),第3466-3473頁；Nimmerjahn和Ravetch， Science 310:1510, 2005 ;Niwa等人，Cancer Res. 64(2004),第2127-2133頁)。
後來，建立了 a-l,6-海藻糖基轉移酶被敲除的工程化中國倉鼠卵巢細胞 系(Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol. Bioeng. 67 (2004),第614-622頁)。 GlyArt (Zurich)和BioWa (Princeton, NJ )開發了工程化細胞系以製造具 有降低的海藻糖基化的抗體的技術。用這一缺乏海藻糖的細胞系產生的抗 體和去海藻糖基化抗體展示增強的活體外ADCC (Niwa等人，Cancer Res 64:2127， 2004 )。
1-2-2-3.抗Bst2抗體的Fc唾液酸化(sialylation )改變以供增強效應功
臺匕
B匕
Fc受體感應IgG上海藻糖與唾液酸殘基的存在。最近研究展示Asn297 位點處的Fc唾液酸關於抗體活性在決定IgG與Fc受體的相互作用方面起 關鍵作用(Kaneko等人，Science 313:670， 2006),這進一步支持糖基化在免 疫反應中的作用。IgG的Asn297連接多糖的唾液酸化使得對FcyR的結合 親和力降低且使得活體內細胞毒性降低。
抗Bst2抗體的唾液酸化改變在改良抗Bst2抗體效力中可為有益的。唾 液酸對抗Bst2活性的影響可通過用神經氨酸酶處理的經唾液酸化抗Bst2抗 體和含唾液酸抗Bst2抗體執行表面等離子體共振結合分析(BIAcore分析) 來研究。富含唾液酸含量的抗Bst2抗體可通過凝集素親和力色譜法獲得。 首先應比較唾液酸化和含唾液酸抗Bst2抗體對激活或抑制性FcyR的結合 親和力。這些抗體可展示對FcyR的結合親和力的差異，而其不會展示任何 對Bst2的結合親和力的差異。然後使用動物模型測試唾液酸化(神經氨酸 酶處理)抗Bst2抗體的活體內功效並與唾液酸化抗Bst2抗體或正常的未經 處理的抗Bst2抗體的活體內功效加以比較。因為IgG寡糖的序列由糖基轉移酶或^唐苷S爭的含量確定，所以抗Bst2抗體唾液酸4t的改變可通過細力包工 程化達成。
1-2-2-4使Xencor的Fc變異體與抗Bst2 F(ab)連接
使諸如Xencor的新穎Fc變異體與抗Bst2 F(ab)連接可增強抗Bst2效力。
Xencor ( Monrovia, CA )的Lazar等人使用計算機設計算法和高通量蛋 白質篩選的組合改變Fc區中的胺基酸，從而增強或降低免疫系統的反應 (Lazar等人，PNAS 103:4005， 2006 )。 Xencor已工程化一系列FcyR親和力 和特異性經優化的Fc變異體。當使Xencor的新穎Fc與曲妥珠單抗 (trastuzumab ) ( 4赤賽')丁( Herceptin); Genentech, S. San Francisco, CA, USA ) 和利妥昔單抗(rituximab )(美羅華(Rituxan); Genentech )連接時,其在 活體外檢定中使抗體的效力改良約500倍；所改變的利妥昔單抗在猴模型 中也更有效。
1-2-3. 通過消除效應功能改良抗Bst2活性
在不同狀況下，禍 降治療的疾病而定，抗Bst2抗體的效應功能可能不 必要或甚至是有害的。舉例來說，靶向T細胞的抗CD3(Xu, M丄.等人，Cell. Immunol. 200 (2000)，第16-26頁；Carpenter等人，J. Immunol. 165 (2000)，第 6205-6213頁；Bolt等人，Eur. J. Immunol. 23 (1993)，第403-411頁)和抗CD4 (Newman等人，Clin. Immunol. 98 (2001)，第164-174頁)由於單克隆抗體 與FcYR攜帶細胞結合從而影響T細胞消耗或激活而展示有害的副作用。在 抗CD3的狀況下，FcyR結合降低的工程化變異體緩解這一問題(Herold等 人，Diabetes 54 (2005),第1763-1769頁；Carpenter等人，Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (2005)，第465-471頁)。
1-2-3-1.對於抗Bst2使用IgG4或IgG2
當不能保證抗Bst2的效應功能時，可使用人類IgG2或IgG4,因為這 兩種亞類補體結合效率低或缺乏補體結合(Presta LG, J Allergy Clin Immunol. 2005, 116(4):731 )。因為已一貫報導IgG4缺乏補體活化，所以倘 若在使用IgG2或IgG4之間選擇，那麼認為IgG4是較佳選擇。然而，特定 亞類的抗體在其效應功能功效方面可能不等效(Chan等人，Mol. Immunol. 41 (2004)，第527-538頁)。
1-2-3-2.從抗Bst2抗體去除Asn297連接糖基化
已報導，在一些狀況下，缺少連接於Fc的Asn297的碳水化合物導致 效應功能下降(Leatherbarrow等人，Mol. Immunol. 22 (1985),第407-415 頁)。此外，1型糖尿病中糖基化抗CD3的第II階段的臨床試驗的最新報導 (Keymeulen等人，N. Engl. J. Med. 352 (2005),第2598-2608頁)展示一些前景。1-2-3-3.使抗Bst2 Fc中的殘基突變以降低與FcR的結合
使用Shields等人(Shields等人，J, Biol. Chem. 276:6591,2001和其中的 參考文獻)所揭示的人類IgGl上的結合位點明細圖，有可能設計與FcyR 或FcRN的結合降低的抗Bst2變異體。
1-2-3-4.效應功能降低的抗Bst2的Fc鉸鏈變異體
當效應功能對抗Bst2抗體來說不是有利的時，可尋求抗Bst2的4交《連變 異體。交換IgG亞類之間的鉸鏈區展示鉸鏈對FcyR和Clq結合來說很重要。 鉸鏈中(Leu235Glu)或鉸鏈外部(Asp265Ala)的特定突變展示與FcyR的 結合降低(Shields等人，J. Biol. Chem. 276 (2001),第6591-6604頁；Lund 等人，FASEB J. 9 (1995),第115-119頁；Morgan等人，Immunology 86 (1995), 第318-324頁；Clynes等人，Nat. Med. 6 (2000),第443-446頁)。效應功能 削弱的鉸鏈變異型抗CD3單克隆抗體現正處於臨床試驗中(Herold等人， Diabetes 54 (2005),第1763-1769頁；Carpenter等人，Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (2005)，第465-471頁)。
1-3.通過產生雙特異性抗體改良抗Bst2
耙向Bst2和表達於相同細胞上的發炎性疾病的另一藥物標靶的雙特異 性抗體可更有效地引發ADCC和CDC。所述雙特異性Bst2抗體可能比覃巴 向單一抗原的抗體更有效。據報導靶向表皮生長因子受體和胰島素樣生長 因子受體的雙特異性抗體比靶向單一抗原的抗體更有效(Lu D. J. Biol. Chem. 279:2856, 2004 )。
1-4.通過產生抗體與毒性物質的接合物改良抗Bst2
改良抗體能力的另 一方法是使其與毒素或放射性配位體連接。抗體結 合細胞上的標耙，內化，傳遞毒素並殺死細胞。這些毒素通過使用由諸如 組織蛋白酶的胞內酶裂解的連接子與抗體連接。藥物與連接子的選^^艮關 鍵。如果連接子在細胞外部裂解，那麼毒素在血流中釋放。毒素的靶向傳 遞需要在與Bst2結合後內化的抗Bst2抗體。 一些抗Bst2抗體可能與Bst2 而不是在對內化作用來說最佳的抗原決定基處強烈結合。出於這個原因， 需要開發選擇最有效內化的抗Bst2抗體的篩選技術。已發展出篩選具有增 強的內化作用的抗體的方法(Marks JD, Methods Mol. Biol. 248:201， 2004; Neve等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (2001),第274-279頁； Heitner等人，J. Immunol. Methods 248 (2001),第17-30頁)。
1-5.通過FcR的多態現象改良抗Bst2抗體
FcR多態現象似乎在許多疾病中發揮重要作用，這些疾病包括自體免 疫疾病、感染性疾病、心血管疾病、動脈粥樣硬化和移植生物學(vanSorge 等人，Tissue Antigens 61 (2003),第189-202頁；Karassa等人，Biomed. Pha腿cother. 58 (2004)，第286-291頁；Kastbom等人，Rheumatology 44
49(2005),第1294-1298頁；van Sorge等人，J, Neuroimmunol. 162 (2005),第 157-164頁;Brouwer等人，J. Infect. Dis. 190 (2004),第1192-1198頁；Gruel 等人，Blood 104 (2004),第2791-2793頁；Gavasso等人，Atherosclerosis 180 (2005),第277-282頁；van der Meer等人,Thromb. Haemost 92 (2004),第 1273-1276頁；Pawlik等人，Transplant. Proc. 36 (2004),第1311-1313頁)。
也已報導患者的FcyR多態形式影響治療性單克隆抗體的反應，諸如利 妥昔單抗(抗CD20 )對癌症(Cartron等人，Blood 99 (2002)，第754-758頁; Carton等人，Blood 104 (2004),第2635-2642頁；Treon等人，J. Clin, Oncol. 23 (2005),第474-481頁；Ghielmini等人,Ann. Oncol. 16 (2005)，第1675-1682 頁)、利妥昔單抗對全身性紅斑狼瘡(Anolik等人，Arthritis Rheum. 48 (20(B)， 第455-459頁)和阿萊珠單抗(alemtuzumab )(抗CD52 )對慢性淋巴細胞 白血病(Lin等人，Blood 105 (2005)，第289-291頁)。
因此，在FcyR多態現象可發揮作用的疾病中，工程化與FcyR的結合 增強或降低的抗Bst2抗體可提供新穎類別的治療性抗Bst2單克隆抗體。
幹細胞擴增
也認為Bst2在細胞生長和增生中發揮促進造血細胞生長和分化的作 用。作為骨髓基質細胞抗原和粘附蛋白，Bst2可在造血和其它幹細胞的中 對關鍵細胞-細胞相互作用發揮重要作用。
許多造血細胞的活體內生長和分化需要與產生多種生長因子的基質細 胞直接接觸，且在一些系統中細胞生長和分化需要基質細胞與造血細胞之 間的直接接觸(Daniel等人，Haematol. Blood Transfus. 32:172, 1989 )。因此， 骨髓基質細胞與骨髓基質細胞抗原是細胞存活和細胞凋亡的重要調控劑。
骨髓含有各種類型的幹細胞。尤其是造血幹細胞(所有血細胞的前體) 和間充質千細胞。間充質幹細胞轉分化成許多不同細胞類型骨細胞、脂 肪細胞、軟骨細胞、腱細胞(tendocyte)、神經細胞和骨髓基質細胞。Bst2 也可調控間充質幹細胞的分化。
基質細胞在調控增生和細胞凋亡中的重要性在調控包括白血病細胞的 癌細胞的細胞存活和細胞凋亡中得到進一步例證。舉例來說，當將急性骨 髓性白血病(AML)的白血病細胞與骨髓基質細胞一起培育時，展示這些 白血病細胞被保護而免於遭受化學治療誘發的細胞凋亡(Garrido等人，Exp. Hematol 29:448, 2001; Konopleva M等人，Leukemia 16:1713, 2002 )。最近研 究證明Bst2直接介導骨髓基質細胞對白血病細胞的調控作用，從而保護白 血病細胞免於遭受化學治療誘發的細胞凋亡(Ge等人，Blood 107:1570， 2006)。與Bst2在化學敏感性中的所述作用一致，也已報導Bst2在他莫昔 芬抗性乳癌細胞中上調(Becker等人，Mol. Cancer Ther. 4:151, 2005)，這提 示Bst2在不同癌症中的潛在多種功能。所有這些研究提示Bst2是介導多種功能的多效性蛋白質。
Bst2激動劑、Bst2肽模擬劑和Bst2配位體可用於活體外刺激幹細胞生 長/增生以大量製備幹細胞。離體擴增的幹細胞可用於移植。舉例來說，可 使用活體外培養的間充質幹細胞通過重建放射性治療和/或化學治療後受損 傷的骨髓微環境增強造血幹細胞移植。
Bst2激動劑、Bst2肽模擬劑和Bst2配位體可用於離體擴增供間充質幹 細胞以用於基因治療。認為間充質幹細胞有前景作為基因轉移和治療的載 體。所培養的間充質細胞在移植後可定植到骨髓中，分化並產生完整蛋白質。
Bst2的小分子量調節劑(Modulators)
本發明的另 一方面為提供用於治療或預防多種免疫/發炎性疾病的Bst2 的小分子量(small molecular weight, m.w.)調節劑。Bst2調節劑可影響Bst2 在細胞中的功能或活性並調節或影響Bst2-Bst2 L相互作用和信號轉導。另 夕卜，Bst2調節劑在細胞中可影響由Bst2調控或與Bst2相互作用的下遊標靶 和分子。
對小分子量化合物來說主要因素是Bst2與Bst2 L之間的相互作用界面 是否足夠小以便小分子可足以破壞或增強Bst2/Bst2 L相互作用，從而產生 具有高親和力的抑制劑或激活劑。受體與配位體的蛋白質-蛋白質相互作用 通常需要大的相互作用界面。然而，在這許多殘基中，有可能僅極小區域 內的極少數殘基可對結合活性有貢獻。突變研究提示，在許多狀況下，蛋 白質-蛋白質相互作用由一小組足跡不比小分子所覆蓋的殘基顯著大的稱為 "熱點(hot spot)"的接觸殘基驅動(Clackson T, Wells JA. Science. 1995;267:383-386; DeLano WL. Curr Opin Struct Biol. 2002;12:14-20; Wells JA. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93:1-6 )。
如果Bst2通過小抗原決定基與Bst2L結合，那麼尋找小分子配位體的 可能性可能較佳。
Bst2的拮抗劑和激動劑調節劑
Bst2調節劑包括拮抗劑、激動劑、肽模擬劑、抑制劑、配位體和結合 因子。拮抗劑包括拮抗、抑制、降低、阻斷、抑止、減弱、減小或消除Bst2 蛋白在細胞Bst2-Bst2 L相互作用和/或Bst2下遊信號轉導通^各中的功能和/ 或活性的化合物、物質或藥物。Bst2的激動劑調節劑包括激動、增強、刺 激、增加、增大或擴增Bst2蛋白在細胞Bst2-Bst2 L相互作用和/或Bst2下 遊信號轉導通路中的功能和/或活性的化合物或藥物。
Bst2調節劑的效用
雖然抗Bst2抗體與Bst2誘飾(Fc)可在免疫/發炎性疾病中具有治療 作用，但具有足以阻斷Bst2與Bst2配位體的結合的親和力的小分子量抑制除免疫/發炎性疾病外，Bst2的拮抗劑調節劑對一些類型的癌症的治療
來說也具有價值。如Ge Y等人(Blood 107:1570, 2006 )的最近研究中所例 證，Bst2可能參與骨髓基質細胞與癌細胞(諸如，白血病細胞)之間的相 互作用，從而使白血病細胞存活。在諸如前列腺癌或乳癌的一些癌症中， Bst2也可能對有關腫瘤進展和侵入的基質細胞與癌細胞的相互作用起重要 作用。
Bst2激動劑、Bst2肽;漠擬劑和Bst2配位體對具有免疫缺陷的患者(包 括人類免疫缺陷病毒(HIV)患者或免疫受損患者)的治療來說可具有治療 價值。用D型胺基酸合成的Bst2肽模擬劑將在活體內穩定。與L型模擬劑 相比，這些穩定的肽可具有較高治療潛能。
Bst2激動劑、Bst2肽才莫擬劑和Bst2配位體也可在貧血或骨疾病(包括 骨質疏鬆症)的治療中發揮作用。造血系統需要從支持性基質環境中獲得 營養以維持和分化造血幹細胞(hematopoietic stem cell, HSC )。然而，在 不存在細胞因子補充的情況下，僅有限數目的這些基質細胞克隆支持造血。 Bst2激動劑、Bst2肽才莫擬劑和Bst2配位體可適用於促進造血。
Bst2激動劑、Bst2肽模擬劑和Bst2配位體可用於治療已在放射性治療 :口/或化學治療，損傷的骨髓口細胞。，通過恢復骨，微環境，這些Bst2調節劑
1.Bst2調節劑的高通量篩選(Highthroughput screening, HTS )方法 下文基於用於篩選Bst2調節劑的Bst2和/或Bst2 L的已知性質設計數
種高通量篩選(HTS )方法。由如下文所指示的數種二次檢定法進一步評估
由HTS法鑑別的化合物樣品組。
1-1.通過用螢光熱位移檢定檢測與Bst2的直接結合來高通量篩選Bst2
抑制劑
與Bst2結合的大部分小分子歸因於結合Bst2上的功能區域或位點、例 如對Bst2-Bst2 二聚體形成來說重要的Bst2 L結合位點或二聚化位點的優先 或較高親和力而可以某種方式調節Bst2活性。可使用熱位移檢定設計用於 鑑別可與Bst2或Bst2肽結合的小分子的篩選和小分子檢測檢定。關於熱位 移檢定，僅需要純Bst2蛋白和化學文庫。在活體內Bst2配位體仍未知的情 況下，基於螢光的熱位移檢定將尤其適用。
可由諸如本文中二次篩選檢定下所述的方法的方法進一步檢定這一技 術所確定的藥物或結合分子以確定這些分子是否影響或調節Bst2的功能或 活性。
1-1-1.熱位移檢定
如Pantoliano等人的美國專利第6,020,141號和第6,036,920號；J.Zimmerman, 2000， Gen. Eng. News, 20(8); Pantoliano等人，J. Bioimol Screen 6:429，2001; Lo MC等人,AnalBiochem. 332:153， 2004中所述的基於焚光的 熱4立移4企定(3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, Pa.)是乂人用於 化合物文庫鑑別標靶蛋白質的抑制劑的一般方法。Pantoliano等人描述用於 高通量藥物篩選的基於螢光的熱位移檢定設備。
在這一檢定中，使用環境敏感螢光染料監測蛋白質熱解摺疊 (unfolding ),由在化合物存在下所獲得的解摺疊溫度相對於不存在化合物 的情況下所獲得的解摺疊溫度的位移(5Tm)評定配位體結合親和力。
為監測蛋白質解摺疊，使用螢光染料，諸如寶石橙(Sypro orange )。寶 石橙是環境敏感染料。解摺疊過程暴露蛋白質的疏水性區域且使得用於監 測蛋白質解摺疊轉變的螢光大量增加。
Pantoliano等人已設計並實施全自動儀器來在微板格式中執行用於高 通量篩選化合物文庫的基於螢光的微型熱位移檢定(J. Biomol. Screen 6:429， 2謝)。
熱位移檢定也可如Lo等人(Anal Biochem. 332:153， 2004 )所述在最初 為PCR設計的iCycler iQ實時才企測系統(Real Time Detection System ) ( Bio -Rad， Hercules, CA )中進行。系統含有用於精確控制溫度的加熱/冷卻裝置 和使微板孔中的螢光變化同時成像的電荷耦合裝置(charge-coupled device, CCD)檢測器。反應含有Bst2 (約l(iM)、寶石橙、化合物(0、 10、 50、 100nM)和緩沖液。以0.5。C/分鐘的加熱速率將板從25。C加熱到89°C。以 Ex/Em:490/530 nm 測量螢光強度。根據Pantoliano等人(J. Biomol. Screen 6:429， 2001 )所揭示的等式分析螢光成像數據。通過將螢光強度擬合於等式 中，獲得各孔的轉變中點溫度Tm。
1-2.通過使用雙螢光素酶報導體檢定檢測Bst2-NFkB通路來高通量篩 選Bst2調節劑
Bst2過度表達使得哺乳動物細胞中的NFkB激活(Matsuda等人， Oncogene 22:3307, 2003 )。雖然仍不知發炎性通^各中的Bst2的詳細信號轉 導機制，但Matsuda等人的先前報導提示Bst2過度表達和激活使得通過 NFkB應答元件激活NFkB介導的轉錄。
使用Bst2的這一性質，已設計通過結合Bst2抑制或激活與螢光素酶報 導基因轉錄的調控來篩選Bst2調節劑的高通量雙螢光素酶報導體檢定 (Promega Madison， WI, Paguio等人，Cell Notes 16:22, 2006 )。
1-2-1.用於HTS雙螢光素酶檢定的DNA構築體和穩定細胞系
在這一檢定中，構築第一質粒以表達(例如)荄火蟲螢光素酶(與螢 火蟲螢光素酶上遊的串聯NFkB應答元件偶合)和選擇標記物(諸如潮黴 素(hygromycin, Promega ))。第二質粒表達Bst2和另 一螢光素酶(諸如作
53為內部對照的海腎螢光素酶)-選擇標記物(諸如新黴素(neomycin))融合 體(Promega)。雙報導體焚光素酶Bst2檢定方法具有使用海腎螢光素酶的 內置對照。使用海腎螢光素酶活性正規化各樣品的螢火蟲螢光素酶活性。
隨後獲得哺乳動物細胞和經報導體構築體轉染的細胞和雙重轉染的穩 定細胞系用於高通量篩選檢定。也獲得表達空載體的對照穩定細胞系。如 Matsuda等人(Oncogene 22:3307, 2003 )的研究中所報導，與含有海腎螢光 素酶-新黴素融合體的空載體的對照穩定細胞相比，表達Bst2的穩定細胞將 展示較高螢光素酶活性。
1-2-2. HTS雙重報導體螢光素酶Bst2檢定
使用各化合物(通常10 或更高濃度)以384孔格式執行篩選檢定。 每孔塗鋪一萬個細胞。孔的一半用化合物刺激，且一半模擬刺激。數小時 後收集細胞。^:用雙重Glo螢光素酶4僉定系統(Promega)測定螢光素酶活 性並使用光度計定量。獲得NFkB螢火蟲螢光素酶/Bst2篩選的樣品板的結 果。樣品組可定義為超過未誘發對照的平均值3至4倍抑制或激活的報導 體表達。從對照穩定細胞獲得的對照螢光素酶值將指示最高程度的抑制。 所有檢定均一式四份執行。以平均螢火蟲(NFkB)刺激發光單位(LU) / 平均模擬刺激相對發光單位(RLU)形式計算誘導或抑制。
1-2-3.-瞼i正樣品組的滴定實-瞼
在96孔板中以每孔10，000個細胞塗鋪雙重轉染的穩定NFkB應答元件 /Bst2細胞系。將各化合物1:2連續稀釋並一式四份添加到孔中。將細胞與 拮抗劑或激動劑一起培育數小時，收集並使用雙重Glo檢定系統(Promega) 分析。在GloMax 96微板光度計(Promega)上測量螢光素酶活性。
1-3.通過使用雙螢光素酶檢定監測Bst2啟動子/luc的表達來高通量篩 選Bst2表達調節劑
存在許多使用含有報導體構築體的啟動子鑑別小分子量治療劑的先 例。舉例來說，已使BMP-2、 BMP-4和BMP-1的啟動子與報導體分子卩 半乳糖苷酶或螢光素酶融合來篩選可與啟動子結合併增加報導體基因的表 達的小分子。
由使用微陣列的實驗顯然可知存在大量治療上重要的可誘導Bst2的分 子(幹擾素Y、 TNFa、組胺等)。另外，由文獻檢索顯然可知一些其它分子 也可具有相同功能。另外，(Blood 107:1570， 2006; Matsuda等人，Oncogene 22:3307， 2003; Goto等人Blood 84:1922， 1994 )已分析Bst2基因的啟動子 區。發現許多重要的位點，包括AML、 GATA1、 STAT和AP1的位點。所 有這些研究指示Bst2的轉錄調控是細胞中Bst2功能或活性的重要調控機 制。
可設計HTS檢定以鑑別與Bst2基因中的調控序列結合的化合物。使Bst2啟動子區(約1,000個鹼基對或以上)融合於螢光素酶基因的上遊。這 一檢定後所篩選出的化合物可調節Bst2基因表達量。在二次篩選檢定中， 關於Bst2的細胞-細胞粘附和發炎性功能篩選化合物的抑制或刺激活性。 1-3-1. DNA構築體和穩、定細月包系
如Ge等人(Blood 107:1570， 2006)所報導，使用含有Nhel和Xhol 限制'l"生酶^f立點的正向(5'-ttcacgctagccccctttgcagatgaagaaacaggctcaga-3' ( SEQ ID NO:75 ))和反向(5'-ttcacctcgaggcaggagatgggtgacattgcgacactc-3' ( SEQ ID NO:76 ))引物PCR擴增涵蓋翻譯起始位點上遊759個鹼基對和外顯子1的 211個鹼基對的Bst2啟動子區。為構築含有較長Bst2啟動子片段的DNA 載體，PCR擴增涵蓋l，OOO個i成基對或以上的Bst2啟動子區。用Nhel和 Xhol消化擴增產物且使其連接於表達螢火蟲焚光素酶的報導基因載體的相 應位點。對於使用螢光素酶檢定的高通量篩選使用這一構築體。
1-3-2.使用Bst2啟動子/螢光素酶融合構築體的HTS雙報導體螢光素 酶檢定
在HTS格式中，向384孔板的各孔中添加哺乳動物細胞，且使用Fugene 6試劑(Roche)用Bst2報導基因構築體和內部對照海腎螢光素酶報導體基 因共轉染。使用雙螢光素酶檢定系統(Promega)檢定螢光素酶活性並正規化。
1-4.通過使用螢光偏振技術檢測Bst2-Bst2相互作用來高通量篩選Bst2 調節劑
認為Bst2以同源二聚體形式存在於細胞表面上(Ohtomo等人，Biochem Biophys Res Commun. 1999， 258(3):583-91 )。也認為Bst2需要二聚化以獲得 其活性。為與此相一致，Bst2誘辨蛋白(Bst2的細胞外域)以二聚體形式 表達並分泌(參見圖3， B圖)。
此外，Bst2的細胞外域含有可在Bst2 二聚化中起作用的預測巻曲螺3走 區。所有這些結果"R示Bst2與Bst2相互作用。
使用Bst2同二聚化的這一性質，如下文所指示設計用於具有阻斷 Bst2-Bst2相互作用的能力的Bst2調節劑的高通量竟爭性Bst2結合檢定。
這一篩選方法利用為用於研究蛋白質-蛋白質相互作用的最靈敏高通量 方法中的一種的螢光偏振技術(Roehrl等人，Biochemistry 43:16056， 2004 ) 和HyperCyt流式細胞術平臺。在這一方法中，由偏振光激發經萸光標記的 Bst2、 Bst2誘斜、Bst2巻曲螺旋(Bst2 coiled coil， Bst2 CC )或這些蛋白質 的任何片段。可通過結合竟爭檢定以HTS格式檢測在小分子存在下Bst2與 焚光標記Bst2、 Bst2誘倂、Bst2CC或這些蛋白質的任何片段的解離。
1-4-1. HyperCyt
Hypercyt是常用自動高通量流式糹田月包術(high-throughput flowcytometry, HTFC )分析平臺，通過這一平臺從微板孔中快速抽吸細胞樣品 並將其傳遞到流式細胞儀(Edwards BS Molecular Pharmacology 68:1301， 2005; Young SM等人，(2005) J Biomol Screen 10: 374-382; Arnold LA等人 Science STKE (2006) 2006:第13頁)。這種篩選方法允許以對常規螢光板讀 取器來說將不可行的無洗滌均勻格式執行高通量蛋白質-蛋白質相互作用檢 定。已展示用於HTFC篩選的HyperCyt平臺是篩選主導化合物文庫的穩定、 靈敏且高度定量的方法(Ramirez等人，(2003) Cytometry 53A: 55-65; Kuckuck等人，(2001) Cytometry 44: 83-90 )。
1-4-2.螢光素標記Bst2試劑、重組Bst2蛋白和穩定細胞系 製備螢光素標記Bst2、 Bst2誘斜、Bst2CC或這些蛋白質的任何片段。 表達並純化Bst2、 Bst2誘辨或Bst2誘何Fc重組蛋白。產生表達Bst2的穩 定細胞系。如果可鑑別在與Bst2結合後不內化的Bst2突變體，那麼可使用 這一 Bst2突變體代替野生型Bst2來產生穩定細胞系以供篩選Bst2調節劑。 1-4-3.通過檢測Bst2-Bst2相互作用進行HTS螢光偏振檢定 螢光偏振檢定測量測試化合物與螢光Bst2、 Bst2誘何、Bst2CC或這些 蛋白質的任何片段竟爭結合細胞膜Bst2或經純化Bst2、 Bst2誘斜或Bst2 誘斜Fc的能力。
對於高通量檢定，以384孔格式篩選化學文庫。對照孔含有未標記Bst2 蛋白或僅含有緩衝液。以完全阻斷螢光標記Bst2誘倂、Bst2CC或這些蛋 白質的任何片段的結合的高出100倍的濃度添加未標記Bst2誘辨、Bst2 CC 或這些蛋白質的任何片段。也建立僅含有緩衝液的另一對照。這些陽性與 陰性對照的螢光偏振值確定為對Bst2、 Bst2誘斜、Bst2CC或這些蛋白質的
任何片^a的募集抑制0%和100%。
向孔中添加的順序如下1 )測試化合物和對照試劑(通常10nM或以 上)；2 ) Bst2穩定細胞(107個細胞/毫升)；3 )(在4。C下培育後)焚光素 標記Bst2誘辨、Bst2CC或這些蛋白質的任何片段。再在4。C下培育後，用 HyperCyt平臺以流式細胞術分析板。
在另 一格式中，可使用經純化Bst2、 Bst2誘倂或Bst2誘何Fc執行高 通量檢定。建立HTS之前，測定Bst2的結合常數和篩選濃度。在使Bst2、 Bst2誘斜或Bst2誘* Fc蛋白的連續稀釋液與螢光標記Bst2、 Bst2誘飾、 Bst2CC或這些蛋白質的任何片段結合後，測定Kd值。使用焚光偏振(在 485 nm下激發，在530 nm下發射)用板讀取器測量結合。使用諸如SigmaPlot 的程序分析數據且測定Kd值。測定Kd值後，向孔中添加測試化合物。添 加Bst2、 Bst2誘斜或Bst2誘辨Fc蛋白，且添加焚光標記Bst2、 Bst2誘辨、 Bst2CC或這些蛋白質的任何片段。建立具有過量未標記Bst2、 Bst2誘斜、 Bst2 CC或這些蛋白質的任何片段或僅具有緩衝液的陽性與陰性對照。用板讀取器測量螢光偏振和螢光強度。
如Edwards BS等人，Molecular Pharmacology 68:1301, 2005中所述按 100x[l-(MFI測試-MFI阻斷)/(MFI未阻斷-MFI阻斷)](其中MFI為含有測 試化合物的孔、阻斷對照孔和未阻斷對照孔中的細胞中值螢光強度)計算 測試化合物對螢光肽結合的抑制。
最初篩選後，使用竟爭結合檢定的劑量反應分析確定化合物的IC50值。
1-5.通過使用螢光偏振技術檢測Bst2-Bst2 L相互作用來高通量篩選 Bst2調節劑
1-5-1. Bst2L表達細胞
下文所述的HTS檢定需要Bst2 L表達細胞或經純化Bst2 L或Bst2 L 片段。 一種Bst2 L表達細胞是如我們實驗中所示的U937細胞(圖6、 7和 24 )。 Bst2誘斜抑制U937附著於經幹擾素y處理的huvec的觀察結果指 示Bst2 L存在於未經刺激的U937細胞的細胞表面上(圖7 )。 Bst2誘辨抑 制激活T細胞(圖12 )或激活U937細胞(圖6 )的同型聚集的另 一觀察結 果提示Bst2 L可能在激活之前和之後表達於T細胞和/或U937細胞的表面 上。為支持這些結果，已展示U937細胞與經純化Bst2誘餌蛋白的直接結 合(圖24 )。
當鑑別出Bst2L蛋白和核苷酸序列時，可使用經純化Bst2L或其片段 或經Bst2 L穩定轉染的中國倉鼠卵巢(CHO )細胞或COS細胞替代U937 細胞。
1-5-2.通過一全測Bst2-Bst2 L相互作用進行的HTS螢光偏振檢定
使用經純化Bst2誘何(或Bst2 )和Bst2 L表達U937細胞(或任何Bst2
L表達細胞)的相互作用，如下文所指示設計篩選Bst2調節劑的高通量結
合竟爭檢定。
這一 HTS檢定基於從諸如U937細胞的Bst2 L表達細胞上的膜Bst2 L 置換螢光標記Bst2或Bst2誘斜。螢光偏振檢定測量測試化合物與螢光Bst2 或Bst2誘何竟爭結合膜Bst2 L或經純化Bst2 L (或片段)的能力。
關於高通量衝全定，向孔中添加的順序如下
首先向孔中添加測試化合物，然後添加U937細胞。培育後，添加螢光 標記Bst2、 Bst2誘飾或其片段。再在4。C下培育後，用HyperCyt平臺以流
式細胞術分析板。
在另一格式中，可使用經純化Bst2 L或其片段和螢光標記Bst2、 Bst2 誘何或其片段執行這一 HTS檢定。向孔中添加測試化合物，添加Bst2 L或 Bst2 L片段，然後添加焚光標記Bst2、 Bst2誘何或其片段。在檢測Bst2-Bst2 L相互作用的HTS焚光偏振檢定中，如上所述建立陽性與陰性對照。用板 讀取器測量螢光偏振和螢光強度。Bst2誘斜和焚光標記Bst2 L肽執 行這一高通量4企定。向孔中添加測試化合物，添力口Bst2或Bst2誘斜，且添 加螢光標記Bst2L肽。建立陽性對照和陰性對照。用板讀取器測量螢光偏 振和焚光強度。1-6.通過使用螢光偏振技術檢測Bst2-Bst2肽4莫擬劑之間的相互作用來 高通量篩選Bst2調節劑1-6-1. Bst2肽才莫擬劑(Peptide mimetics)以高親和力與Bst2結合的小肽可充當Bst2的肽模擬劑。可如下文所述 通過噬菌體呈現鑑別所述肽。設想通過使用螢光偏振技術檢測Bst2與Bst2 肽模擬劑之間的相互作用進行Bst2調節劑的高通量結合竟爭檢定。1-6-2.通過噬菌體呈現分離以高親和力與Bst2結合的Bst2肽模擬劑 可通過噬菌體呈現篩選以高親和力與Bst2細胞外域結合的Bst2肽模擬 劑。可通過將組合合成的寡核苷酸的複雜混合物克隆於噬菌體呈現載體中 建立巨大的肽文庫。使所表達的肽呈現為與噬菌體鞘蛋白的融合體的絲狀 噬菌體呈現系統已有效用於發現肽配位體(Devlin等人，Science 249:404， 1990; Greenwood等人，J. Mol. Biol. 220:821, 1991; Scott和Smith Science 249:386， 1990)。將噬菌體池與塗有Bst2誘何蛋白的珠粒或對照珠粒一起培育，且通過 磁力分離方法選擇陽性池。使用Bst2誘斜珠粒上的噬菌體顆粒群體的親和 力純化回收具有結合活性的肽。對各捕獲噬菌體的DNA的適當區段進行測 序提供結合Bst2誘斜的肽的一級序列。在功能性檢定中進一步篩選Bst2肽 模擬劑以選擇具有刺激發炎性反應的活性的模擬劑。1-6-3.證實Bst2肽模擬劑結合Bst2的能力在經標記Bst2 L表達細胞(諸如U937細胞)與固定Bst2誘倂或Bst2 誘斜Fc蛋白的結合檢定中證實所選擇的肽是否具有結合Bst2的能力。向這 一結合檢定中添加不同濃度的Bst2肽模擬劑以測量結合竟爭。在另一4各式中，可用固定Bst2 L表達細胞(諸如U937細胞)和作為 探針的Bst2誘飾Fc或經生物素標記Bst2誘斜建立結合檢定。在另 一格式中，當鑑別Bst2 L蛋白時，可執行1251標記Bst2 L與固定 Bst2誘斜或Bst2誘飾Fc的結合檢定。1-6-4.在生物4全定中證實Bst2肽才莫擬劑活性可在許多不同檢定中評定Bst2肽模擬劑的生物功能。 一種所述檢定如 下用Bst2的表達載體或空載體轉染HUVEC。轉染48小時後，用Bst2 肽模擬劑或對照肽處理細胞。通過RT-PCR分析發炎性介體和粘附分子的基 因表達，且通過免疫印跡法測定這些基因的蛋白質表達。在Bst2表達 HUVEC中，Bst2肽模擬劑刺激發炎性反應。1- 6-5.使用Bst2肽模擬劑以焚光偏振技術來高通量篩選Bst2調節劑 以如上所述的類似方式執行HTS檢定。簡言之，以焚光標記Bst2肽模擬劑。用Bst2的表達載體穩定轉染哺乳動物細胞。如果已知在與Bst2結合 後不內化的Bst2突變體，那麼將這一Bst2突變體轉染到哺乳動物細胞中用 以篩選Bst2調節劑。關於HTS檢定，向孔中添加測試化合物。添加Bst2表達穩定細胞，然 後添加螢光標記Bst2肽模擬劑。如上用板讀取器測量螢光偏振和螢光強度。在另 一格式中，可使用經純化Bst2或Bst2誘辨替代Bst2表達穩定細 胞。評定化合物的劑量依賴型反應以驗證樣品組。2.高通量篩選後—驗證樣品組的二次一企定在任何藥物發現過程中必須使用 一 系列測評(profiling) 4全定驗i正最初 樣品組。二次檢定的樣品組驗證為確定小分子量化合物的抑制或激活是否 具有生物相關性。本文中所述的二次檢定僅是可用於驗證樣品組化合物的 可能的替代檢定的少數實例。2- 1.通過Bst2-Bst2 L結合檢定驗證樣品組量化合物的活'I";r將i生物素標記Bst2誘餌(或Bst2誘餌Fc)固定在抗 生蛋白鏈菌素塗布(或抗Fc抗體塗布)96孔板的孔中。向Bst2 L和作為 對照的不與Bst2誘斜結合的Bst2L突變體(如果可用)的溶液中添加所選 擇的主導化合物的連續稀釋液，且將其與經固定Bst2誘餌一起培育。從板 洗去未結合Bst2L。用經辣根過氧化物酶標記的抗Bst2 L抗體，接著用辣 才艮過氧化物酶顯色反應測量結合Bst2 L。2-2.通過Bst2-Bst2 L結合檢定使用Biacore表面等離子體共振技術驗 證樣品組可以溶液竟爭格式用Biacore表面等離子體共振技術分析Bst2-Bst2 L 結合。將一系列濃度的各化合物與Bst2 L—起培育，然後注射在具有捕獲 重組Bst2誘斜的晶片表面上。在平衡下測量結合，且將其計算為最大值結 合的百分率。2-3.通過穀胱甘肽巰基轉移酶釣斜檢定(Glutathione S Transferase Pull -down assay )驗證樣品組在大腸桿菌中表達GST-Bst2誘斜蛋白並純化。可通過使用TNT T7轉 錄/翻譯系統獲得放射性標記("S)-Bst2L。在DMSO中製備樣品組化合物的 連續稀釋液。向試管中添加1微升各濃度的樣品組化合物。添加含有 GST-Bst2誘斜蛋白的珠粒。然後添加放射性標記Bst2 L並培育。按照製造 商的說明書執行釣餌檢定。2-4.通過細胞-細胞粘附檢定使用焚光標記細胞驗證樣品組^口 Edwards等人(Molecular Pharmacology 68:1301, 2005 )戶斤述淨丸4亍糹田 胞粘附檢定。用紅色螢光Fura-Red (Invitrogen )標記Bst2細胞(表達Bst2 的穩定細胞)，且用綠色螢光5,6-羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺基酯 (Invitrogen )標記Bst2 L細胞(可使用表達Bst2 L的穩定細胞或U937細 胞)並維持在冰上直到實驗。將300微升Bst2細胞(lxl(^個細胞/毫升) 和300微升Bst2 L細胞(3xl(^個細胞/毫升)在37。C下在存在或不存在測 試化合物(最終濃度為lOO(iM)的情況下單獨培育5分鐘。然後組合細胞 並在流式細胞儀中分析，期間將細胞懸浮液在300轉/分和37。C下用磁性微 攪拌子連續攪拌。攪拌90秒以確定細胞粘附的基礎程度後，添加不同濃度 的化合物。Bst2細胞在流式細胞儀中被拆分成兩部分均一紅色螢光的單 態和含有紅色/綠色共焚光(co-fluorescence)的接合物(紅色螢光Bst2細 胞粘附於綠色螢光Bst2 L細胞)。在各指定時間點，以lOOx(接合物的凝: 目)/(接合物的數目+單態數目)形式計算粘附Bst2細胞的百分率。2-5.通過螢光素酶報導體檢定驗證樣品組可用螢光素酶報導體檢定使用在螢光素酶報導體上遊含有多個NFkB 位點的質粒(NFkB)n-luc證實Bst2拮抗劑或激動劑活性。用(NFkB)n-luc和 Bst2的哺乳動物表達載體轉染293T細胞。48小時後，用不同濃度的所選 化合物處理細胞。培育6小時後，執行螢光素酶檢定且使用光度計測量發 光。2-6.通過轉錄一企定-瞼i正才羊品組轉錄檢定確定小分子是否在細胞環境中抑制或增強發炎性通路中Bst2 介導的信號轉導。 一種所述檢定如下。用Bst2的表達載體或空載體轉染 HUVEC。轉染48小時後，用各種濃度的樣品組化合物處理細胞。通過 RT-PCR分析發炎性介體和粘附分子的基因表達，且通過免疫印跡法或 ELISA測定這些基因的蛋白質表達。Bst2和血管生成血管生成是新毛細血管的生長。炎症可促進血管生成，且新血管也增 強組織炎症。因此，血管生成和炎症是相互依賴的過程(Jackson等人，FASEB J 11:457， 1997),同時血管生成和炎症也可彼此獨立地發生。尤其，慢性炎 症可刺激血管生長。胚胎發生、損傷後組織修復、生長和雌性生殖周期需 要血管生成。血管生成也促成癌症和多種慢性發炎性疾病的病理學，這些 慢性發炎性疾病包括銀屑病、糖尿病性視網膜病、類風溼性關節炎、骨關 節炎、哞喘和肺纖維化。舉例來說，需要血管生成來支持大部分直徑超過 2-3毫米的實體腫瘤的生長。最近研究展示血管生成抑制劑阻斷肺瘤進展。 此外，癌症不是血管生成抑制劑的使用可產生影響的唯一疾病。血管生成 在年齡相關黃斑變性和糖尿病性視網膜病中發揮重要作用。當血管浸潤視60網膜、使其模糊並最終破壞視網膜時，這些病狀導致視力喪失。實際上， 血管阻斷劑(抗體、小分子量化合物)是對超過65歲的人的主要致盲病因的年齡相關黃斑變性的最新且最有效的治療。血管生成抑制劑可降低炎症， 且可預期慢性炎症抑制劑抑制血管生成，在此處血管生長的刺激來源於發炎性細胞(Stogard等人，J Clin Invest 103:47， 1999 )。有可能Bst2誘發血管 生成，且Bst2阻斷劑可具有抑制新血管生成的抗血管生成活性。 傳遞關於傳遞，除諸如皮下、靜脈內、肌肉內和腹膜內注射的常規投藥途 徑外，Bst2阻斷劑還可通過經皮貼片和受控釋放方法投與。諸如Bst2誘斜 或Bst2結合抗體的Bst2阻斷試劑的受控釋放可通過植入已嚢封或與可隨時 間降解或清空以在比注射長的時間內釋放Bst2阻斷試劑的固體基質結合的 Bst2阻斷試劑局部地或全身地實現。Bst2阻斷試劑也可以乳膏或軟膏形式 局部塗覆來治療皮膚病或損傷。本發明組合物可以醫藥有效量投與。如本文中所使用，術語"醫藥有效 量，，是指與適於醫學治療的合理益處/風險比相稱的足以治療疾病的量。組合 物的有效劑量的量可根據疾病類型、疾病嚴重程度、患者的年齡和性別、 藥物活性、藥物靈敏性、投藥時間、投藥途徑、藥物分泌速率、治療持續 時間、與組合物組合使用的藥物和醫學領域中已知的其它因素來確定。本 發明組合物可以個別治療劑形式或與其它治療劑組合投與，且可與常規治 療劑相繼或同時投與。這一投藥可為單次給藥或多次給藥。考慮到所有因 素，重要的是以能夠產生最大作用而無不利作用的最小劑量進行投藥，且 劑量可由所屬領域的技術人員容易地確定。本發明的範疇不受本文中所述的特定實施例限制。實際上，由前述描 述和附圖，除本文中所述的修改外，本發明的各種^爹改形式對所屬領域的 技術人員來說也將變得顯而易見。所述修改形式意欲屬於隨附權利要求書 的範疇。以下實例以說明本發明而不是限制本發明的方式提供。
A-CtlB、 Ct『CtoA-Ct。B)計算方法獲得所有值。 一式三份從 各樣品獲得各值。進行上述實驗以量化Bst2基因和白細胞介素-2的表達。 實例4-可溶性Bst2蛋白片段或Dampl蛋白片段的表達和純化 為表達以上所製備的可溶性Bst2蛋白片段或Dampl蛋白片段，將載體 DNA瞬時或永久引入特定動物細胞中。如下通過石奔酸鉤(calcium phosphate, CaP04 )沉澱執行瞬時轉染。轉染之前24小時，將7xl06個293T細胞(ATCC ) 接種於150毫米細胞培養板上並培養。轉染之前1小時，將培養基換成補 充有2%胎牛血清(FBS; Gibco-BRL )的IMDM培養基(Cambrex )。將1.5 ml含有75 DNA和250 mM鈣的TE緩衝液(1 mM Tris， 0.1 mM乙二胺 四乙酸(EDTA )， pH 8.0 )與1.5 ml 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES )緩衝液
(50 mM HEPES, 140 mM氯化鈉(NaCl )， 1.4 mM磷酸氫二鈉(Na2HP04 ), pH7.05)混合，在室溫下培育約l分鐘，且應用於預培養細胞。將細胞在 37。C下在C02培育箱中培育6小時。去除DNA/鈣溶液後，用無血清培養基 再供給細胞並再培養72小時或更長，然後回收培養基。如下使用脂質體轉 染胺(lipofectamine )和作為可選^^標記物的二氫葉酸還原酶單獨建立永久 細胞系。轉染之前48小時，將1.35xl6個CHO-DUKX-B11 ( dhfr-)細胞
(ATCC )接種於100 mm細胞培養板上並在補充有10% FBS的IMDM培 養基中培養。將0.6 ml含有18 jig DNA的無血清IMDM培養基與0.6 ml含 有54 |il脂質體轉染胺2000 (Invitrogen)的無血清IMDM培養基混合，並 在室溫下培育45分鐘。向DNA/脂質體轉染胺混合物中補充8.8 ml無血清 IMDM培養基且應用於預培養細胞。將細胞在37。C下在C02培育箱中培育 6小時。將培養基換成選擇培養基含有10%透析FBS的培養基。為分析瞬 時表達的蛋白質，將細胞再培養72小時或更長時間。然後回收培養基並橫_ 其通過0.2 iim過濾器(Millipore)。通過免疫印跡法-使用抗Bst2多克隆抗 體(Roche)或抗組氨酸抗體(Roche)分析所產生的Bst2誘何蛋白。
為大規模表達和純化可溶性Bst2蛋白片段或Dampl蛋白片段，如下選 擇穩定引入Bst2或Dampl表達載體的宿主細胞系作為製備細胞系。用表達 載體轉染缺失二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的CHO 細胞。因為表達載體帶有dhfr基因，所以使用二氫葉酸還原酶作為可選擇
63標記物。48小時後，將經轉染CHO細胞以1><103個細胞/孔的密度接種於 96孔細胞培養板上並在含有20 nM曱胺喋呤(methotrexate, MTX)的培養 基中培養以擴增DHFR基因。兩周後，回收培養基且使其經受使用抗Bst2 抗體的ELISA以比較克隆的Bst2誘斜蛋白表達量。選擇展現高表達量的克 隆且使其暴露於濃度逐漸增加的MTX (至多300 nM)中來完成基因擴增。 此後，從各克隆收集培養基且使其經受ELISA和免疫印跡法以最終選擇展 現最高蛋白質表達量的製備細胞系。因為Bst2誘飾蛋白在培養基中在無血 清的條件下產生，所以使用添加到C-末端的六組氨酸標籤從所收集的培養 基中純化所表達的蛋白質。通過氮川三乙酸(NTA)螯合色譜法使用管柱、 NTA螯合瓊脂糖CL-6B ( Peptron Inc.)執行蛋白質純化。通過電泳和ELISA 分析經純化蛋白質的純度，且通過二辛可寧酸(BCA)法(Biorad, USA) 和紫外分光光度法測定經純化蛋白質的量。
以4-20% SDS-PAGE分析如上所述純化的人類Bst2誘斜和小鼠Dampl 誘斜(圖3, A圖)。1%二硫蘇糖醇(dkhiothreitol, DTT )和N-糖苦酶F (Sigma)的處理使得Bst2誘斜成為二聚糖蛋白(圖3， B圖)。使用所制 備的誘何中的具有SEQ ID NO:l胺基酸序列的可溶性Bst2蛋白片段和具有 SEQ IDNO:2胺基酸序列的可溶性Dampl蛋白片段獲得以下實例的結果。
實例5-評估Bst2蛋白對U937細胞同型聚集的效用
實例5-1-U937細胞聚集期間Bst2表達量的變化
人類U937單核細胞聚集期間檢查Bst2蛋白的表達量。用PMA (2 ng/ml)和LPS ( 10 pg/ml)處理1,6個U937細胞24小時以誘導U937細 胞的同型細胞聚集，並在倒置相差顯微鏡(Olympus 1X71, state, USA )下 觀察同型細胞聚集的程度。為測定細胞聚集的程度，使用Adobe的Photoshop 軟體7.0版本以像素強度測量所形成的聚集體的大小。圖式中所繪示的標準 偏差值由6個隨機選擇的聚集體的平均值計算。此後，回收所有所使用的 細胞，且分離總RNA並使其經受使用一組SEQ ID NOS:3和4的引物的 RT-PCR以評定Bst2表達量。
有義寡聚物5'-TTTTCTCTTCTCAGTCTC-3' ( SEQ ID NO:3 ) 反義寡聚物5'-GCATCTACTTCGTATGAC-3' ( SEQ ID NO:4 ) 用PMA和LPS處理U937細胞以誘導同型聚集後1小時，細胞內Bst2 表達增加約3倍。這一增加的量維持24小時。這些結果指示U937細胞同 型聚集期間Bst2基因表達增加(圖4 )。
實例5-2-Bst2蛋白對U937細胞同型聚集的作用
為確定Bst2基因表達增加是否為U937細胞同型聚集所必不可少，評 定過度表達Bst2蛋白時的細胞聚集。
將&106個已在上述條件下培養的U937細胞接種於96孔細胞培養4反(NUNC )上並用PMA( 2 ng/ml, Calbiochem )和LPS( 10嗎/ml, Calbiochem) 處理24小時。然後在倒置相差顯微鏡(Olympus 1X71, state, USA)下觀 察細胞的同型細胞聚集程度。
Bst2蛋白本身不誘導U937細胞的聚集，而PMA/LPS處理刺激U937 細胞同型聚集。Bst2的瞬時過度表達使PMA/LPS刺激的U937細胞的同型 聚集增加約四倍(圖5 )。這些結果指示Bst2表達促進激活單核細胞白細胞 的同型聚集。
實例5-3-使用Bst2誘何抑制U937細胞的同型聚集
為證實Bst2基因表達增加是否為U937細胞同型聚集所必不可少，評 定Bst2蛋白的作用受到抑制時的細胞聚集。
將U937細胞用PMA和LPS預處理以誘導細胞聚集，並用含有在 CHO-S細胞中瞬時表達的Bst2誘斜的培養基(誘何培養基)的連續稀釋液 處理。發現與不表達Bst2誘何的cho-s細胞的培養物(對照培養基)相比， Bst2誘斜使PMA和LPS誘導的U937細胞聚集降低50% (圖6 )。這些結 果指示Bst2誘何抑制U937細胞的同型聚集。
實例6-評估Bst2蛋白對兩種不同細胞類型之間的異型聚集的作用 實例6-1-使用Bst2誘飾抑制U937與HUVEC之間的聚集 將HUVEC( l-5xl0"個細胞/毫升)接種於12孔細胞培養板上。1天後， 將培養基換成含有0.5% FBS的低血清培養基，且用幹擾素-y (IFN-y; Calbiochem)以10ng/mL的最終濃度預處理細胞24小時。然後，在37。C下 將預處理HUVEC與U937細胞(2xl(^個細胞/毫升，500 共培養4小 時。用磷酸鹽緩沖液洗滌共培養物3或4次，且用4%三聚曱醛固定剩餘細 胞並用顯微鏡觀察。
當向培養物中添加含Bst2誘斜培養基時，U937細胞展示與經IFNy處 理的HUVEC的結合降低。在不含Bst2誘何的對照培養基中，U937細胞與 經IFNy處理的HUVEC有效結合併形成異型細胞聚集體。對照培養基或白 蛋白的處理不影響細胞聚集(圖7)。在圖7中，未經IFN-Y預處理的"正常 培養基"HUVEC不與U937細胞結合。相反，經IFN-y處理的HUVEC與 U937細胞結合併形成異型細胞聚集。經含Bst2誘何蛋白培養基處理的從經 IFN-y預處理的培養物荻得的huvec展現與U937細胞的聚集減少。基本 培養基或白蛋白的處理不影響細胞聚集(圖7)。在圖7中，"正常培養基" 指示含FBS的一般培養基，且"對照培養基"指示不表達Bst2誘斜蛋白的細 胞培養液。另夕卜，異型細胞聚集以依賴於Bst2誘斜濃度的方式受到抑制(圖 8)。
實例6-2-^f吏用Bst2 siRNA抑制U937與HUVEC之間的聚集
構築以Bst2特異性方式起作用的各種siRNA分子(QIAGEN)。總計構築23個對Bst2具有特異性的siRNA分子。
以下測試結果^吏用由與SEQ ID NO:5序列所編碼的Bst2 mRNA互補的 反義RNA鏈和與反義RNA鏈互補的有義RNA鏈組成的siRNA獲得。
用Bst2的表達載體轉染經或未經IFN-y處理的HUVEC,然後用Bst2 siRNA轉染。評定這些細胞的U937細胞粘附。
標靶序列5'-AAGCGTGAGAATCGCGGACAA-3' ( SEQ ID NO:5 )
有義寡聚物5'-r(UUGUCCGCGAUUCUCACGC)d(TT)畫3' ( SEQ ID NO:6)
反義寡聚物5'-r(GCGTGAGAATCGCGGACAA)d(TT)畫3' ( SEQ ID NO:7)
合。Bs:2siRNA處理使得U937細胞i附I^低(圖9 )。結合圖29中所繪示 的證明Bst2 siRNA對未經轉染HUVEC與U937細胞之間的細胞粘附的抑 制效應的數據，這些結果提示Bst2在HUVEC-U937粘附中發揮作用。 實例7-評估Bst2蛋白對T淋巴細胞同型聚集和聚集活性的作用 實例7-1- Bst2過度表達對T淋巴細胞同型聚集和IL-2產生的作用 如下誘導人類JurkatT細胞以形成同型細胞聚集且激活。 當將Jurkat細胞(5xlS個細胞/毫升)在4。C下與抗CD3單克隆抗體 (OKT3: 10 jig/ml, BD Pharmingen) —起培育20分鐘，然後在37°C下與 抗小鼠免疫球蛋白多克隆抗體(25昭/ml， Zymed) —起培育1小時時，發 生細胞聚集，且細胞被激活並誘導而產生白細胞介素-2 (IL-2)(圖10和 11)。根據相同方法，當"i秀導綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP ) 過度表達時，不存在作用。相反，當用Bst2過度表達載體轉染Jurkat細胞 且被誘導而激活時，同型細胞聚集增加(圖10， A圖)。由實時RT-PCR測 量T細胞激活後的IL-2 mRNA含量(實例3 )。與GFP過度表達相比，在 Bst2過度表達下IL-2mRNA表達升高約兩倍(圖10， B圖)。
實例7-2- Bst2誘何和Bst2 siRNA對T淋巴細胞的同型聚集和IL-2產 生的作用
激活之前30分鐘將Jurkat細胞用Bst2誘辨預處理，使用抗CD3單克 隆抗體激活並評估對細胞聚集的抑制。用相對量的含有Bst2誘何的動物細 胞培養液的連續稀釋液處理細胞。以與非處理組聚集體的大小的比率表示 聚集體的大小。
激活條件下的Bst2誘斜預處理使得Jurkat細胞的聚集顯著降低。另夕卜， IL-2的因Jurkat細胞激活而增加3倍的表達經Bst2誘斜處理又降到基礎水 平(圖11和12)。
本文中所呈示的數據指示Bst2對炎症和免疫性來說是重要的。阻斷Bst2功能可減少炎症誘發的疾病。在免疫受損個體(諸如愛滋病(AIDS) 患者和免疫缺陷患者)中，增加免疫信號轉導可對其有益。包含Bst2誘斜 和可為蛋白質或化合物的另一分子Y的二價融合蛋白可充當迫使表達Bst2 配位體的細胞與表達Y受體的另一細胞之間的相互作用和信號轉導的轉接 器。參見圖35。
實例8-評估Bst2誘倂在哞喘小鼠模型中的作用
實例8-l-小鼠中的哞喘i秀髮
通過用卵白蛋白致敏小鼠(C57B6， 8周)製備哮喘小鼠模型。詳細來 說，最初連續5天通過鼻內注射卵白蛋白致敏小鼠。3周後，再次連續5天 用卯白蛋白致敏小鼠。二次致敏後l周，每24小時用卯白蛋白鼻內激發小 鼠3次以誘發哮喘。本文中，將Bst2誘何在卵白蛋白致敏之前30分鐘靜脈 內注射到小鼠中，且在第 一次致敏和最後一次卯白蛋白注射之前30分鐘注 射到小鼠中。最後一次注射後3天，從小鼠收集血清樣品、肺組織和其類 似物。
實例8-2- Bst2誘辨誘導的沉降免疫細胞的數目的變化
在用卵白蛋白致敏並經Bst2誘斜處理的小鼠中，支氣管肺泡灌洗流體 中浸潤細胞總數和各細胞類型(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞) 的數目顯著減小(圖13)。
實例8-3- Bst2誘斜對細胞因子產生的作用
當將Bst2或Dampl誘何注射到經卵白蛋白致敏和激發誘發的哮喘小鼠 模型中時，如下測量細胞因子(白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5 (IL-5 ) 和白細胞介素-13 (IL-13))的表達量。支氣管肺泡灌洗後，從小鼠切除肺 組織，且從肺組織中分離蛋白質。使用含NP-40的溶解緩沖液分離胞漿蛋 白質。以SDS-PAGE凝膠分離經分離蛋白質，並通過溼式轉移方法將其轉 移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將印跡在各數種一級抗體(抗IL-4抗體 (Setotec Inc.)、抗IL-5抗體(Santa Cruz Inc.)、抗IL-13抗體(R&D Inc.) 和抗肌動蛋白抗體(Sigma Inc.))的1:1000稀釋液中培育。使用ECL試劑 用HRP接合二級抗體(抗兔子HRP接合IgG )衝企測所結合的一級抗體。可 見諸如IL-4、 IL-5和IL-13的細胞因子的含量在具有經卵白蛋白致敏和激發 誘發的哮喘的小鼠的肺組織中增加。同時，當用Bst2誘餌蛋白注射卵白蛋 白致敏嗜喘小鼠時，細胞因子含量隨誘飾蛋白的劑量的增加而減小。這些 結果指示Bst2誘何蛋白對哮喘具有治療作用(圖14)。
實例9-評估人類Bst2蛋白與小鼠Dampl蛋白之間的功能相似性 人類Bst2蛋白與小鼠Dampl蛋白之間存在約35%的胺基酸序列相似 性。鑑於此，檢查兩種蛋白質在活體外細胞-細胞粘附檢定和活體內鼠類哮 喘模型中是否將展示功能相似性。根據與實例6中相同的方法檢查人類Bst2
67和小鼠Dampl蛋白對經IFN-y處理的HUVEC與U937細胞之間的粘附性 的抑制作用。
實例10-製備抗Bst2多克隆抗體
將經純化的表達於CHO-S細胞中的Bst2和Dampl誘斜蛋白與Ribi佐 劑以1:1比率混合，並以2周為時間間隔注射到兔子中。免疫期間，收集血 樣並檢查抗體的產生。三次免疫後，從兔子獲得血清樣品。通過親和力色 譜法使用Bst2蛋白與固定支撐物結合的管柱純化抗Bst2多克隆抗體。
實例11-製備改良Bst2誘斜代謝的PEG接合形式
實例ll-l-製備PEG接合形式
通過兩種類型的PEG: (1)醛類PEG和(2)碳酸琥珀醯亞胺基酯 (succinimidyl carbonate)PEG進行PEG接合(圖17 )。首先如下進行醛類PEG 接合。將1 mg Bst2誘辨蛋白透析於0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.5 )中，且 與 30倍摩爾比的(mPEG12000-OCH2COGly-Gly)2(2，4- 二胺基丁 酸)-PEG'-NHS混合，接著在室溫下在攪拌下培育2小時。關於碳酸酯PEG 接合，單獨地，將lmgBst2誘辨蛋白透析於0.1M磷酸鹽緩沖液(pH5.0) 中，並與20倍摩爾比碳酸琥珀醯亞胺基酯PEG混合，接著在室溫下在攪拌 下培育2小時。反應完成後，使用尺寸排阻管柱(Superdex-200， Pharmacia) 分離和純化PEG接合Bst2誘何，且透析於50 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.4 )中。
實例11-2-PEG接合形式對Bst2誘何的活體內穩定性的增強作用 將實例11-1中製備的Bst2誘斜的PEG接合形式以0.4至2mg/kg的劑 量注射到7周大雄性Sprague Dawley大鼠的尾靜脈中。用等劑量的生理鹽 水注射陰性對照組。同時，使用等劑量的Bst2誘斜蛋白作為陽性對照。在 藥物投與之前和藥物投與之後2分鐘、5分鐘、IO分鐘、30分鐘、l小時、 2小時、6小時、12小時和24小時使用套管從頸靜脈收集血樣。通過ELISA 分析所收集的血樣。在4。C下用抗Bst2誘餌抗體(於PBS中100 ng/mL ) 塗布96孔板8小時或更長時間，並在37。C下用於PBS中的白蛋白阻斷2 小時。在37。C下使板與大鼠血清或Bst2誘辨(標準樣品)的適當稀釋液反 應2小時。然後在37。C下使板與識別添加到Bst2誘斜C-末端的組胺酸標籤 的單克隆抗體(與辣根過氧化物酶接合的mAb, Roche Inc.)反應2小時。 充分洗滌後，用過氧化酶物質處理板，且在450nm下測量吸光度。使用標 準樣品執行存在於血液中的PEG接合Bst2誘辨的定量(圖18)。在圖18 中，"201B-H，，指示人類Bst2誘斜樣品，且"201B-HP，，指示醛類PEG接合人 類Bst2誘斜樣品。
實例12-Bst2在炎症相關疾病中的表達和分布
獲得具有各種發炎性疾病的患者的組織以研究Bst2的表達和分布。所獲得的組織包括哮喘患者的肺組織、動脈粥樣硬化患者的動脈血管、銀 屑病患者的皮膚病灶、克羅恩氏病患者的腸組織、潰瘍患者的腸/結腸組織、 慢性活動性胃炎患者的胃組織和急性闌尾炎患者的盲腸組織。選擇各組織 作為展示典型發炎表型的代表性病變。
關於哮喘，將通過將肺組織固定於10%甲醛並將組織包埋於石蠟中制 備的肺組織石蠟塊切成1.5 fim的厚度並固定在載玻片上。用蘇木精 (hematoxylin)和伊紅(eosin)染色載玻片以根據過敏原和藥物投藥研究 肺組織的變化。用實例10中製備的多克隆抗體執行組織染色。以類似方式 製備其它組織。與正常組織相比，Bst2蛋白在炎症相關疾病中過度表達。 在免疫細胞、血管內皮細胞和其它細胞類型中4企測到Bst2 (圖19)。
實例13-細胞培養
如實例1中所述執行細胞培養。
實例14-構築人類Bst2誘飾和Bst2誘斜Fc融合體的表達載體
基於表達載體pCDNA3.1或其它市售dhfr載體製備融合構築體。 圖20繪示Bst2誘斜和其它Fc融合體的示意圖。這些是可能融合蛋白 的示意圖。參考圖20,圖20A繪示 Bst2誘何本身，圖20B繪示與IgG重 鏈Fc的鉸鏈-CH2-CH3部分融合的Bst2誘何，其中獨立表達Bst2誘何以在 各融合蛋白的頭部形成Bst2誘何二聚體。圖20C繪示Bst2K融合體與 Bst2-IgG Fc融合體相呼應表達以在各通過天然存在的IgG K鏈-重鏈雙硫鍵 穩定的融合蛋白的頭部穩定形成Bst2誘餅二聚體的形式。圖20D繪示Bst2 誘辨-IgG Fc在無其它Bst2 二聚化對應物的情況下表達的形式。在表達IgG Fc部分的各狀況下，融合體的鉸鏈-CH2-CH3部分的二聚化歸因於這些鏈 之間天然存在的雙硫4A而發生。
圖21繪示上述Bst2誘辨-IgG Fc融合蛋白的載體圖。說明描繪IgGl 和IgG2 Fc融合體的表達載體的代表性表達載體。圖21A繪示Bst2誘何 (dBst2 )。通過PCR克隆具有N末端tPA信號肽和C末端His標籤的誘何 蛋白的起始的Xbal位點5'，接著克隆3'末端處的BamHl位點構築Bst2誘 斜表達載體，將這一插入物克隆到具有xbal和BamHl的pcDNA3.1片段 中。圖21B繪示dBst2-IgGlFc融合體。PCR克隆IgGl重鏈的鉸鏈-CH2-CH3 區並與具有5'Xho1和3'Notl位點的Bst2誘餌的C-末端融合；將這一插入 物克隆到具有Xhol和Notl的pcDNA3.1片段中。圖21C繪示dBST-K融合 體。PCR克隆IgGK輕鏈的恆定區並與具有5'Xho1和3'Notl位點的Bst2誘 辨的C-末端融合；將這一插入物克隆到具有Xhol和Notl的pcDNA3.1片 段中。(d ) dBST-IgG2HC融合體。PCR克隆IgG2重鏈的鉸鏈-CH2-CH3區 並與具有5'Xho1和3'Notl位點的Bst2誘辨的C-末端融合；將這一插入物 克隆到具有Xhol和Notl的pcDNA3.1片段中。實例15-載體構築
如下構築經組氨酸標籤標記的Bst2誘何的表達載體。
通過PCR從人類血細胞cDNA文庫(Clontech)克隆免疫球蛋白基因 片段人類IgGl重鏈的Fc區(鉸鏈、CH1和CH2區)(Genbank編號 bc089417,引物l、 2)、人類免疫球蛋白k鏈(Genbank編號BC067092， 引物3、 4)和人類IgG2重鏈的恆定區(CHl-鉸鏈-CH2-CH3 ) (Genbank 編號AJ294731，引物5、 6)。克隆片段中所使用的PCR引物的序列如下。
序列1
201-H-5': 5'陽ctc cca gga cga gcc caa atc ttg-3' ( SEQ ID NO:8 )
序列2
201-IgGl-3': 5'-ggcggccgc TCAttt acc cgg gga-3' ( SEQ ID NO:9 )
序列3
201-L-5': 5'-ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc-3' ( SEQ ID NO: 10 )
序歹'J 4
201-k-3': 5'-ggcggccgc TTA aca etc tcc cct-3' ( SEQ ID NO: 11 )
序列5
201-H2-5': 5'-ctc cca gga cgc etc cac caa ggg陽3' ( SEQ ID NO: 12 )
序歹'J 6
201-IgG2-3': 5'陽ggcggccgc TCA ttt acc cag aga-3' ( SEQ ID NO: 13 ) 實例16-人類Bst2 i秀辨-Fc融合構築體(IgGl、 2和4 ) 將人類Bst2誘何-Fc融合體的三種不同構築體克隆到表達載體 pCDNA3.1 (Invitrogen)中。通過PCR獲得編碼人類Bst2蛋白的細胞外區 的DNA片段並在N-末端與tPA的信號肽序列融合以促進表達後的細胞外 分泌。也使BST2細胞外片段在C-末端與IgGl、 IgG2和IgG4的IgGl Fc 區或k鏈的恆定區融合。用Xhol和Notl消化重疊PCR產物並克隆到載體 pcDNA3.1 (Invitrogen)中。通過重疊PCR製造這些融合片段，且引物如 下並稱為 "pcDNA-dBST2-IgGlFc" 、 "pcDNA-dBST2-k，， 和 "pcDNA-dBST陽IgG2HC，，或pcDNA畫dBST2陽IgG4Fc。 實例17-PCR克隆和融合策略
PCR克隆和融合策略陳述於圖22中。使用以下引物。 序歹'J 7
tPAsig一Xho1—Fw: 5'-cgctcgagacagccatcATGgatg-3' ( SEQ ID NO: 14 )
序歹'J 8
201-H-5': 5'-ctc cca gga cga gcc caa atc ttg-3' ( SEQ ID NO:15 )
序歹'J 9
201誦H-3': 5'-ttg ggc tcg tcc tgg gag ctg ggg畫3' ( SEQ ID NO:16 )
70序列10
201-IgGl-3': 5'畫ggcggccgc TCA ttt acc egg gga-3' ( SEQ ID NO: 17 ) 序列11
201-L-5': 5'-ctc cca gga ccg tac ggt ggc tgc-3' ( SEQ ID NO:18 ) 序列12
201國L-3': 5'-acc gta egg tec tgg gag ctg ggg-3' ( SEQ ID NO: 19 )
序列13
201-k-3': 5'-ggcggccgc TTA aca etc tec cct-3' ( SEQ ID NO:20 ) 序列14
201-H2-5': 5'-ctc cca gga cgc etc cac caa ggg-3' ( SEQ ID NO:21 ) 序列15
201陽H2-3': 5'-gtg gag gcg tec tgg gag ctg ggg-3' ( SEQ ID NO:22 ) 序列16
201-IgG2-3': 5'-ggcggccgc TCA ttt acc cag aga-3' ( SEQ ID NO:23 )
序列17
201-H4-3'; 5'-cat att tgg act cgt cct ggg agc陽3' ( SEQ ID NO:24 ) 序列18
201-H4-5'; 5'-ctc cca gga cga gtc caa ata tgg tec c扁3' ( SEQ ID NO:25 )
序列19
201-IgG4-3， ； 5'-ggc ggc cgc TCAttt acc cag aga cag g-3' ( SEQ ID NO:26 ) 實例18-表達可溶性資斜-Fc融合蛋白
如實例4中所述瞬時轉染後製備可溶性Bst2誘何-Fc融合蛋白。如實 例4中所述建立表達Bst2誘辨和Bst2誘飾Fc融合蛋白的穩定細胞系。如 實例4中所述執行大規模表達和純化。
實例19-經純化Bst2 i秀斜和其它Fc融合體的PAGE
從培養基中純化Fc融合蛋白。超濾濃縮後，使用兩步色譜分離法，包 4舌蛋白質A親和力色i普法(Amersham Biosciences, MabSelect)和尺寸4非 阻色語法(Amersham Biosciences, Superdex 200 )。
將Fc融合蛋白加載到預先經PBS緩沖液(1.06 mM磷酸二氫鉀、155.17 mM氯化鈉、2.97mM磷酸二鈉，pH 7.4 )平衡的蛋白質A填充柱上。用過 量PBS洗滌管柱以去除汙染物。用低pH值緩衝液(諸如50mM甘氨酸鹽 酸鹽)使用步進梯度洗脫所結合的抗體並用等體積1 M Tris ( pH 8.0 )中和。
再使用尺寸排阻色譜步驟去除免疫球蛋白多聚體。將經純化抗體多聚 體混合物加載於預先經PBS( pH 7.4 )平衡的Superdex 200管柱上。從50 cm/h 到150 cm/h範圍內的速率選擇緩衝液的線性流速。
圖23繪示描繪親和力純化後各種Bst2融合蛋白的經考馬斯亮蘭(Coomassie )染色的代表性PAGE凝膠(4 ~ 12%梯度凝膠，Invitrogen )。 圖23B繪示高分子量多聚形式可通過適當的尺寸排阻色譜法去除。 實例20- Bst2誘飾與免疫細胞的直接結合
在37。C下用具有碳酸氬鈉(100 mM, pH 9.5 )的Bst2誘斜塗布平底 96孔板歷時2小時。用PBS (pH7.4)洗滌板，並在25。C下使其與1%牛血 清白蛋白(BSA) —起培育。用含有1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2的PBS (pH7.4)衝洗後，向各dBst2塗布孔中添加U937細胞(1><106個/毫升)。 在37。C下培育2小時後，通過用RPMI1640培養基(Gibco-BRL )輕柔洗 滌兩次去除未結合的細胞，且將結合細胞用2%多聚曱醛固定20分鐘，洗 滌，並用0.5%結晶紫(crystal violet)染色。在25。C下30分鐘後，用PBS 洗滌板並計數所結合的細胞。
圖24繪示Bst2誘何與U937細胞的直接結合。U937細胞附著於含有 Bst2誘斜而不是BSA的孔中。
實例21-Bst2誘斜-Fc融合體的血漿半衰期
圖25繪示Bst2誘何或Fc融合體的血漿半衰期。如由與僅Bst2誘何相 比，兩種Bst2誘斜-IgGl融合體代表性藥物動力學曲線所指示，與各種穩 定IgG Fc區融合的Bst2誘斜蛋白證明增強的血清穩定性。
為測定Bst2誘辨或其它Fc融合體的血漿半衰期，將大鼠 (Sprague-Dawley雄性)外科植入靜脈內導管。後續期間，使導管與輸注 泵連接。經1分鐘通過用肝素化生理鹽水衝洗以降低凝結風險的導管輸注 蛋白質樣品。輸注結束時指定為時間0。在多個時間點從導管抽取血樣(0.4 ml )。通過離心作用分離血漿並將其應用於測定BST2誘斜或其它Fc融合蛋 白的血漿濃度的夾層ELISA檢定。用(100微升/孔)5嗎/ml兔子抗BST2 多克隆抗體於50 mM碳酸鹽緩衝液(pH 9.2 )中的溶液塗布96孔板中的孔 並用1。/。BSA/PBS阻斷。在25。C下將經稀釋到屬於標準曲線的線性範圍內 的各血漿樣品培育90分鐘。PBS洗滌後，在室溫下將孔與辣根過氧化物酶 標記山羊抗人類IgG ( 1:50,000稀釋液，Fc特異性，Sigma,目錄號A-0170 ) 一起培育1小時，然後用TMB底物(Pierce )處理。在板讀數器中在450 nm 下讀取板，且使用四參數曲線擬合程序分析數據。關於各不同蛋白質的標 準曲線，在具有適當濃度的1% BSA、 1%大鼠免疫前血清的溶液中使用各 經純化蛋白質標準物。
實例22-Bst2誘斜-Fc融合體對bst2誘何與細胞之間的結合的抑制
Bst2誘鉀-IgG Fc融合蛋白證明對U937細胞與Bst2誘何塗布細胞培養 板結合的濃度依賴性抑制，從而指示Bst2誘飾-IgG Fc融合蛋白具有功能性。
如下測量Fc融合蛋白對BST2誘何與細胞之間的結合的竟爭性抑制。 在37。C下用具有碳酸氫鈉(100mM， pH 9.5 )的Bst2誘斜(50嗎/ml)塗布平底96孔板歷時2小時。用PBS (pH7.4)洗滌板，並在25。C下將其與 1。/o牛血清白蛋白(BSA) —起培育。用含有1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2 的PBS (pH 7.4)衝洗後，向各Bst2塗布孔中添加U937細胞(^106個/ 毫升)。添加之前，在37。C下將細胞與BST2誘何-Fc融合蛋白一起預培育 2小時。如實例20中所述計數所結合的細胞。
實例23-Bst2誘斜-Fc融合體對哮喘小鼠模型的作用
如實例8-1中所述製備哮喘小鼠模型。
如實例8-2中所述評定Bst2誘辨-Fc融合體對免疫細胞浸潤的作用。當 用Bst2誘斜處理卵白蛋白致敏小鼠時，浸潤細胞總數減小，且尤其在支氣 管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL )中嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細 胞和除巨噬細胞以外的淋巴細胞的數目減小(圖27)。
在注射Bst2誘辨或Bst2誘何Fc融合蛋白後如實例8-3中所述在鼠類 哮喘模型中測量Il-4、 IL-5和IL-13的表達。這些細胞因子的含量減少，提 示Bst2誘何蛋白可能對哞喘具有治療作用(數據未圖示)。
實例24-產生人類-小鼠嵌合Bst2小鼠
使用如圖28中所例示的構築體的類型製造人類-小鼠嵌合BST2小鼠。 繪示用於在小鼠胚胎幹(embryonic stem, ES )細胞或其它小鼠細胞中同源 重組的小鼠BST2 (DAMP-1)的細胞外域和C-末端經人類BST2的細胞外 域和C-末端置換的靶向載體。適當的同源重組包括所繪示的側接臂(x )中 的同源重組，且具有適當同源重組的細胞將對選擇(例如，新黴素或G418 或所使用的其它選^t奪標記物)具有抗性。在選#^列示性標記物新黴素(G418 ) 後，通過南方印跡法(Southern blotting )或PCR篩選來選擇具有適當同源 重組的細胞。可4吏用其它選l奪標記物。為消除靶向載體中的新黴素或任何 其它標記物，可在製造嵌合小鼠之前用Cre重組酶的表達載體轉染重組ES 細胞，或可使嵌合小鼠與表達Cre重組酶的小鼠交配。可通過產生敲除、 敲入或其它類型的轉基因小鼠的標準技術使用重組ES細胞產生嵌合小鼠。 因為人類-小鼠嵌合BST2的細胞外部分與人類BST2的細胞外域一致，所 以在臨床前研究中可使用小鼠來測試人類BST2抗體。另一選擇為使用此處 所述的相同策略用人類BST2基因的編碼區(不僅為如這一 圖中所繪示的細 胞外域的編碼區)置換小鼠BST2基因的整個編碼區。
實例25-活體外組合治療的實驗程序
在轉染或不轉染Bst2 siRNA或對照siRNA6小時的情況下，在12孔才反 中培養HUVEC,然後用或不用IFNY處理24小時。在一些實驗中，用含有 Bst2誘何或小鼠抗人類ICAM1抗體的粗培養基處理細胞。用PBS (磷酸鹽 緩衝鹽水)洗滌後，將U937細胞以2xl(^個細胞/毫升再懸浮於無血清培養 基中。通過向HUVEC中添加200 (il U937細胞達到1 ml的最終體積起始檯r
73定。在37。C下4小時後，通過用PBS洗滌板三次去除未結合U937細胞。 通過添加4%於PBS中的多聚曱醛來固定結合細胞，且在不同視野下用顯微 鏡檢查計數結合細胞。以Excel執行所有統計分析，且用學生t檢-3M Student's t test)評估統計顯著性。在一些實驗中，用IFNy和/或siRNA處理後從 HUVEC獲得RNA樣品，且執行實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析。 實例26-結果
圖29繪示用IFNy刺激後內皮細胞(huvec )與單核細胞(u937 )之 間的異型聚集需要內源性Bst2。為展示內源性Bst2的阻斷對異型聚集的抑 制來說重要，在IFNy處理(10 ng/mL, 24小時)之前用Bst2 siRNA處理 HUVEC以抑制Bst2的內源性表達。圖30分別糹會示Bst2 siRNA處理或 ICAM1 siRNA處理並不影響經IFNy處理的HUVEC中的ICAM1表達或 Bst2表達。執行RT-PCR分析。
如圖29和30中所示，雖然認為Bst2與ICAM1在細胞粘附中皆發揮 作用，但尚不知這兩種蛋白質是否在重疊通路或獨立的不相重疊通路中串 擾和起作用。關於組合抗粘附治療，對兩種在眾多通路中起作用的粘附蛋 白質的組合抑制與不相重疊通路中的兩種蛋白質相比可能不太有效。當向 Bst2 siRNA反應(B+I siRNA )中添加ICAM1 siRNA時，ICAM1 siRNA並 不引起Bst2表達進一步降低，這提示Bst2表達不需要ICAM1。類似地， 向ICAM1 siRNA介導的反應(I+B siRNA)中添加Bst2 siRNA並不引起 ICAM1表達的任何進一步降低，這提示ICAM1表達不需要Bst2。這些數 據指示Bst2與ICAM1可通過不相重疊的通路介導細胞粘附。
圖31繪示Bst2 siRNA與ICAM1 siRNA的組合治療在異型粘附檢定中 展示疊加效應。且圖32繪示抗ICAM1或Bst2誘飾在異型粘附4企定中的劑 量依賴型反應，和抗icam1和Bst2誘餌的劑量依賴型反應的定量分析。
基於圖31中的siRNA實驗，在小鼠抗人類ICAM1抗體或Bst2誘餌存 在下執行細胞粘附檢定。使用含有Bst2誘何的條件培養基。通過比較 SDS-PAGE後經His標籤標記的Bst2誘斜和蛋白質標準物的色帶強度粗略 估算粗細胞上清液中Bst2誘斜的量。
圖33繪示Bst2誘斜與抗ICAM的組合治療在細胞粘附中展示疊加效 應。使用次最佳劑量的Bst2誘何(100 ng/mL )和抗ICAM1 ( 1 pg/ml )。當 使用Bst2誘斜與抗ICAMl時，細胞粘附被完全抑制到對照水平。
圖29-33中所繪示的結果提示Bst2阻斷劑與其它免疫發炎性介體的阻 斷劑的組合治療可能對治療許多免疫發炎性病症有益。可與Bst2阻斷劑一 起使用的這些阻斷劑包括CTLA4-Ig或TNFa、 IL6、 IL1、 LFA1、 a4整合 素、ICAM1或VCAM1的阻斷劑。另外，Bst2誘斜-Fc或抗Bst2與抑制免 疫發炎性反應的環孢黴素或糖皮質激素的組合治療可能分別對移植病狀或
74許多需要皮質類固醇治療的疾病有益。
關於大鼠或小鼠模型中的臨床前研究，針對許多以上所列的大鼠或小
鼠蛋白質(TNFR、 IL6R、 IL1R、 LFA1、 a4整合素、ICAM1、 VCAM1 ) 的大鼠或小鼠單克隆抗體(Abcam或其它公司)可購得。CTLA4-Ig可能須 自身產生。關於不可獲得單克隆抗體的蛋白質標靶或不希望使用單克隆抗 體的情況，對於動物模型的組合治療可使用相應蛋白質標靶的可溶性受體 i秀何蛋白質，例如，TNFR-Fc (可溶性TNFR1 )。 實例27- Bst2可為其自身配位體的可能性
已知Bst2在激活後形成同型二聚體。與此一致，似乎Bst2誘何以二聚 體或更高多聚體表達。Bst2的這種二聚化性質提示Bst2可在細胞-細胞相互 作用中充當其自身配位體的可能性。
為測試這一可能性，將U937細胞與抗Bst2抗體一起培育，且將經抗 體處理的U937細胞添加到經幹擾素處理後的HUVEC中。在另 一實^^中， 用Bst2 siRNA或對照siRNA處理U937細胞，且將經siRNA處理的U937 細胞添加到經幹擾素處理後的HUVEC中。
如果細胞-細胞相互作用需要U937細胞上的Bst2，那麼經抗Bst2或Bst2 siRNA處理的U937細胞不會與HUVEC結合。這些結果指示U937細胞上 的Bst2與HUVEC上的Bst2相互作用以供粘附，從而確定Bst2作為一種 可能的Bst2L蛋白。
實例28-使用全基因組全長cDNA ( Genome Wide Full-Length cDNA， GFC )陣列和螢光分斥斤法鑑別Bst2 L
可使用全基因組全長cDNA陣列(GFC陣列)(OriGene Technologies, Rockville, MD )篩選Bst2L。 GFC陣列是排列於一次性384孔板中的哺乳 動物表達載體pCMVsport6 (GIBCO)中的數組轉染就緒的質粒。各孔含有 62.5 ng單一凍幹cDNA,濃度經優化以供反向轉染到多種細胞中。反向轉 染的標準方案適於大部分常用的細胞類型。集合含有超過24,000個轉染就 緒全長人類cDNA克隆。GFC陣列也提供人類基因陣列的子集，諸如跨膜 蛋白和可藥物化基因(Dmggable Gene )(藥物可靶向的酶/受體的基因)的 陣列。可篩選這兩個子集陣列(或整個集合陣列)與Bst2誘餌Fc的結合活 性。
簡言之，藉助於高通量轉染方法，將個別基因轉染到諸如293T的人類 細胞、CHO細胞、COS細胞或任何其它哺乳動物細胞中。向含有62.5 ng 不同cDNA的384孔板的各孔中添加20 |il含有FuGENE 6 ( Roche )的無 血清培養基。將40微升含有293T、 CHO細胞、COS細胞或其它哺乳動物 細胞的20% FBS DMEM培養基塗鋪於各孔中。在37。C下在5% C02下48 小時後，將最佳量的Bst2誘斜Fc添加到各孔中並用經FITC標記的抗Fc抗體標記。使用微板螢光分析法(384孔格式)分析焚光。再測試計分為陽
性的各孔的Bst2誘斜Fc與對照Fc。使用GFC陣列篩選後，通過使用特定 cDNA質粒的標準轉染驗證各陽性孔。GFC陣列中的所有cDNA可單獨用 於OriGene (Rockville， MD)中。
實例29-通過表達克隆分離Bst2 L
表達克隆方法需要鑑別大量Bst2 L的活體外細胞來源以構築質粒 cDNA表達文庫。然後用淘選技術使用Bst2誘斜Fc或經生物素標記Bst2 誘何就Bst2 L篩選cDNA表達文庫。
實例29-1-鑑別大量Bst2 L的活體外細胞來源(源細胞)
使用重組Bst2誘斜-Fc融合蛋白來鑑別將Bst2 L豐富地表達於表面上 的推定細胞系或初級細胞。篩選各種細胞系和初級造血細胞。Bst2 L的可 能的細胞來源包括(但不局限於)T細胞、單核細胞/巨噬細胞細胞系，諸 如人類U937細胞、小鼠RAW 264.7細胞、初級造血細胞、B細胞、樹突狀 細胞、內皮細胞和成纖維細胞。也分別使用大鼠Bst2誘斜-Fc融合蛋白和 'J、鼠Damp 1誘何-Fc融合蛋白檢索小鼠和大鼠細胞系。
因為人類Bst2誘斜和小鼠Dampl誘何如圖15和27中所繪示在細胞粘 附檢定和活體內卯白蛋白誘發哮喘模型中可互換地起作用，所以在不考慮 所使用的細胞系或初級細胞的物種的情況下可通過小鼠Dampl誘何-Fc與 人類Bst2誘斜-Fc融合蛋白兩者來篩選源細胞系。
在用經FITC標記的人類Bst2誘辨-Fc或小鼠Dampl誘倂-Fc融合蛋白 染色，接著二級抗體(例如用山羊F(ab')抗人類IgG 二級抗體)染色後，通 過間接免疫螢光或螢光激活細胞分選儀(FACS )分析就Bst2 L的存在篩選 細胞系或初級細胞(Smith CA, Gruss HJ， Davis T, Anderson D,等人1993， Cell 73, 1349-1360 )。隨後以FACS分析細胞。
實例29-2-通過使用經FITC標記的Bst2資斜-Fc的FACS分析!Hi Bst22 L源細胞
如上鑑別出的源細胞系與對照Ig相比應展示顯著的與經FITC標記的 Bst2誘斜-Fc的特異性結合。僅二級抗體和僅純化人類IgG Fc不應與源細 胞系的表面結合。這些結果指示Bst2誘斜-Fc的結合是歸因於Bst2或Dampl 誘餅部分而不是探針的Fc部分。為進一步證明結合特異性，結合應受未接 合Bst2誘何而不是無關的對照蛋白質抑制。
實例29-3-通過使用1251- Bst2誘餅(Fc )觀測Bst2 L驗證Bst2 L源細
胞
關於驗證，在存在或不存在過量非放射性Bst2誘飾蛋白的情況下，將 源細胞與1251標記-Bst2誘何或1251標記Bst2誘^F Fc —起培育。已描述通過 乳過氧化物酶方法的石典化(Urdal等人，1988, J. Biol. Chem. 263:2870-2877 )。
76然後將細胞與交聯劑[雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯] 一起培育。將蛋白
質用1% Triton X-100混合物溶解，使其經受SDS-PAGE且通過自動射線攝 影術觀察。
當發現源細胞系且如所述(實例29-1、 29-2和29-3 )加以驗證時，在 多輪大部分亮色染色細胞來源的FACS分析後可能獲得表達增加數目的 Bst2L的變異細胞系。
實例29-4-從源細胞系構築質粒cDNA表達文庫用於淘選
關於分離Bst2 L,從如上鑑別和驗證的Bst2 L源細胞構築cDNA表達 文庫。從源細胞mRNA構築定向寡聚dT啟始質粒cDNA文庫並連4妄到哺 乳動物表達載體(Invitrogen)中。將文庫分為具有1000個克隆的池，且獲 得各池的質粒DNA。根據Seed和Aruffo的方法(Seed B, Arrufo A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:3365 )和Lacey等人的修改版(Cell, 93:165, 1988 ), 將來自個別池的DNA轉染到COS7細胞中。約48-72小時後，用人類Bst2 誘斜-Fc融合體染色細胞約1小時，洗滌，且隨後用固定多聚甲醛或戊二醛 固定。用酶聯二級抗體(諸如鹼性磷酸酶接合山羊抗人類IgG ( Fc特異性) 抗體處理培養物，且通過檢定(例如)鹼性磷酸酶活性來檢測免疫複合物。 選擇一個陽性池，製備質粒DNA用於大腸桿菌轉化。將大腸桿菌轉化抹用 於下一富集循環中。通過重複這一循環，可高度富集編碼Bst2 L蛋白的特 異性cDNA,從而得到單一cDNA克隆。
然後將所選擇的質粒DNA轉染到COS7細胞中，且用人類IgG Fc域、 人類Bst2誘訶-Fc融合蛋白或無關Fc融合蛋白，接著FITC接合二級抗體 免疫染色。在這一階段，僅人類Bst2-Fc融合蛋白應與源細胞結合。這些結 果因此指示這一源細胞(或細胞系)編碼Bst2 L並將Bst2 L呈現於其細胞 表面上。
在 一 替代方法中，用抗人類IgGl Fc多克隆抗體(Jackson Immunoresearch)塗布淘選板，且隨後用Bst2誘斜-Fc塗布。可能必需用牛 血清白蛋白阻斷。然後向板中添加如上所述轉染的COS7細胞，且通過用 EGTA和EDTA處理使粘附細胞懸浮。淘選方法的其餘部分與上述類似。
實例29-5-通過<吏用經生物素標記Bst2誘何作為探針的表達克隆和淘 選分離Bst2 L
在一替代方法中，如果源細胞含有極高含量的Bst2 L,那麼可按照 Harada等人的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. 1990, USA 87:857 )使用經生物素 標記Bst2誘斜作為探針分離Bst2 L。在這一方法中，使經生物素標記Bst2 誘飾與表達Bst2 L的細胞交聯，且通過在抗生物素抗體塗布板上淘選來富 集Bst2L表達細胞。據報導交聯是必要的，對細胞來說沒在交聯其不會附 著於淘選板上。如上所述(參見實例29-4 )執行cDNA文庫的構築和COS7細胞的瞬 時轉染。48-72小時後，通過用含有5mMEDTA的PBS培育來剝離細胞。 添加經生物素標記Bst2誘何並使其與細胞交聯。向塗布有抗生物素抗體的 淘選板中添加交聯細胞。從附著於板上的細胞回收質粒DNA並用於轉化大 腸桿菌。將擴增質粒DNA用於下一富集循環中直到其得到單一克隆。因此 經這些克隆中的一種轉染的COS7細胞將特異性結合1251標記Bst2誘斜。
實例29-6-淘選後分離Bst2 L的全長cDNA
因為在表達克隆中淘選後獲得的DNA插入物(參見實例29-4和29-5 ) 可能是較短截斷cDNA，所以需要全長cDNA克隆。首先使用選自上述程 序的短cDNA作為4罙針4全索市售cDNA文庫(Clontech )。通過^吏用短cDNA 作為探針從源細胞系篩選cDNA文庫獲得Bst2 L的全長cDNA。對來自源 細胞系的mRNA的北方印跡分析將展示Bst2 L轉錄物。也可使用市售北方 印跡(Clontech)來^見測轉錄物。
獲得全長cDNA後，執行核苷酸測序。；f全索信號肽、潛在激酶域或任 何其它關注域的序列。
如果在核苦酸序列中;f企測到信號肽，那麼測試Bst2 L是否釋放到培養 基中。Bst2L在C-末端處經抗原決定基標籤標記(例如，血球凝集素)，且 用Bst2 L標籤(HA )的表達載體轉染293T細胞。用抗標籤(HA)抗體探 測細胞抽提物或條件培養基的西方印跡。如果釋放到條件培養基中，那麼 在條件培養基中4企測到比細胞抽提物中觀察到的帶小的帶。可溶性蛋白質
的親和力純化和可溶性蛋白質的N-末端序列分析揭露裂解位點。
實例30-從大量動物組織來源(或細胞系)直接純化大鼠Bst2 L或 Dampl L且同源檢索人類Bst2 L
如果使用實例29-l中所述的方法鑑別大量人類Bst2L的源細胞系，那 麼此處所述的直接純化方法可應用於人類細胞繫膜製備。然而，細胞系(或 細胞培養物)來源可能不適宜或太貴而不能提供足夠的用於生物化學表徵 和純化的材料。因此，可探求來自動物的替代組織來源。首先可鑑別動物 Bst2 L (諸如大鼠、犬、兔子Bst2 L或Dampl L)以用於隨後的人類同源 物檢索。在鑑別大鼠、犬、兔子、小鼠或其它動物中的大量組織來源後， 可使用直接純化方法鑑別動物Bst2 L。
這一方法的第一步為鑑別大量動物Bst2 L的活體內組織來源。雖然可 使用任何動物物種，但使用大鼠說明如下所述的方法。
通過125I-Bst2誘辨-BSA或RSA (鼠血清白蛋白)的攝取研究(Yang 等人，J. Exp. Med 174:515， 1991 )檢查大鼠組織中Bst2特異性結合活性的分 布。用^I-Bst2誘斜-RSA作為結合探針說明以下方法，用於分離晚期糖基 化終端產物受體(receptor for advanced glycation end product, RAGE )的方
78法的修改形式。
一旦攝取研究證明Bst2 L的主要位點，則使用經溶解並分
級分離的膜蛋白質執行包括使用Bst2誘餌-BSA瓊脂糖4B管柱的親和力純 化步驟的直接純化。通過固相Bst2誘斜結合檢定(參見下文)分析所有管 柱洗脫份的結合活性。在純化步驟結束時，切除蛋白質帶並電泳洗脫以進 行胺基酸測序分析。此後可^f企索並複製人類同源物。 實例30-l-Bst2 i秀何結合活性的活體內組織分布
可通過測量1251標記Bst2誘何-RSA(大鼠血清白蛋白)或1251標記Bst2 誘何-BSA(牛血清白蛋白)的螯合作用鑑別Bst2L的活體內動物組織來源。 關於組織分布研究，如其它研究(Horiuchi等人，J261 :4962, 1986)中所述 通過與曱醛一起培育RSA或BSA製備經曱醛修飾的Bst2-RSA或 Bst2-BSA。然後將蛋白質放射性碘化。類似地，使正常RSA或BSA碘化 到可比比活性。用"Cr標記新鮮抽取的大鼠RBC以允許隨後修正血液相關 放射性的組織計數。
通過125I-Bst2-BSA (RSA)的攝取研究檢查大鼠組織中的Bst2特異性 結合活性的分布。將125I-Bst2-RSA (BSA)或1251-正常RSA (BSA)與51Cr 標記RBC (紅血細胞) 一起靜脈內注射到大鼠中。在數個時間間隔時抽取 血液等分試樣，且去除多個器官並計數放射性。通過在投與標記Bst2之前 用過量未標記Bst2-RSA ( BSA )注射動物評定器官中Bst2配位體攝取的特 異性。用水溶解RBC，且用20% TCA^f吏蛋白質沉澱。由如Williamson等 人，Diabetes 36:813(1987)中所述的方程式計算組織與血液的同位素比。就血 液相關計數修正整個器官的讀數。
Bst2-RSA ( BSA )的組織積累不應受先前過量未標記Bst2-RSA ( BSA) 的注射影響，而用過量未標記Bst2-RSA( BSA )預處理大鼠應減少Bst2-RSA (BSA)在這個器官中的積累。在有或無未標記竟爭物的情況下，Bst2-RSA (BSA)的攝取在所有其它主要器官中都應保持較低。當符合這些標準時， 器官代表用於分離Bst2結合蛋白的潛在富集來源。
實例30-2-通過固相結合檢定和配位體印跡檢定證實Bst2 L的活體內組 織來源
一旦攝取研究證明Bst2誘斜蛋白螯合作用的主要位點和Bst2 L的潛在 組織來源，就根據對組織或器官來說特定的標準方案製備組織的膜蛋白質。 組織提取液的結合活性可由如下所述的使用125I-Bst2誘斜的固相結合檢定 和配位體印跡一企定i正明。這些檢定證實並驗證Bst2 L的活體內組織來源。
固相結合檢定
需要固相結合檢定促進從組織中分離Bst2 L。將清潔劑溶解膜蛋白質 固定於硝化纖維上並用125I-Bst2誘何-RSA或125I-Bst2誘飾-Fc探測配位體 特異性結合活性。配位體應以可飽和且劑量依賴性方式與125I-Bst2誘辨結合，且結合應^皮針對Bst2的抗體和/或未標記Bst2誘何-Fc或Bst2誘斜阻斷。 Bst2 L在轉染細胞中的表達也應使細胞以可飽和且劑量依賴性的方式結合 ^I-Bst2誘何。使用來自其它器官的類似清潔劑溶解膜製劑，可執行相同固 相Bst2結合4僉定來證實Bst2 L的活體內來源。
觀測來自所鑑別的組織來源的Bst2 L的配位體印跡檢定 進行觀測來自所鑑別的組織來源的Bst2 L色帶的配位體印跡檢定。在 SDS-PAGE上電泳分離獲自Bst2 L的所筌別組織來源的蛋白質並在硝化纖 維膜上形成印跡，與125I-BST2-BSA (或Bst2誘斜Fc) —起培育，且由自 動射線攝影術評估配位體結合。
實例30-3-直接純化來自活體內組織來源的溶解膜製劑的Bst2L 如上所述鑑別並證實Bst2 L的活體內組織來源後，可使用作為監測 Bst2 L活性的方法的固相Bst2誘飾結合檢定(參見實例30-2 )執行Bst2 L 的直接純化。使用來自動物組織(實例30-1 )或Bst2 L源細胞系(人類或 其它物種)(實例29-1 )的膜製劑。
可使用包含管柱色譜法和親和力色譜法的數種純化步驟。希望在一或 兩個諸如DEAE管柱或Sephadex管柱的粗純化步驟後使用Bst2( Bst2誘何) -88八瓊脂糖46管柱親和力純化。洗脫與親和力管柱結合的蛋白質，濃縮 並分析125I-Bst2 (Bst2誘何)-BSA結合活性。然後執行製備型電泳。切除 蛋白質色帶並電泳洗脫以進行N-末端胺基酸測序分析。
可基於大鼠、犬或兔子Bst2 L序列或小鼠Damp 1 L序列鑑別人類同源物。
實例31-通過酵母雙雜交系統分離Bst2 L
使用依賴於在酵母釀酒酵母cerev^ae)中重構GAL4轉錄激活子 的酵母雙雜交系統分離Bst2 L (Fields S和Song OK, 1989， Nature 340:245-246)。舉例來說，可使用市售酵母雙雜交試劑盒用含有Bst2細胞 外域的訶篩選獲自激活人類T細胞(Clontech)的市售文庫。
實例32-通過活體外結合檢定驗證經分離的Bst2 L
如上分離的Bst2 L(實例28-31 )應活體外特異性結合Bst2( Bst2誘斜)。 可在許多不同4全定中測定Bst2 ( Bst2誘飾)-Bst2 L相互作用，且所述檢定 的數個實例描述如下。
在一個方面中，用含有全長cDNA的表達載體轉染COS7細胞，且在 存在或不存在過量的未標記Bst2誘辨(Bst2誘斜-Fc )或無關蛋白質(無關 蛋白質-Fc)的情況下與各種濃度的1251標記Bst2誘辨-Fc—起培育。未標 記Bst2誘何(Bst2誘何Fc )應完全阻斷放射性標記Bst2誘斜-Fc的結合。 這些結果將指示Bst2 L特異性結合生物學活性Bst2、 Bst2誘斜或Bst2誘斜 -Fc。然後如(Munson PJ， Rodbard D， 1980, Anal. Biochem.l 107:220-239 )所
80述分析結合數據以確定每個細胞的親和力和位點數。
在另 一方面中，可由FACS分析測定Bst2-Bst2 L相互作用。用Bst2 L 瞬時轉染293細胞、CHO細胞或COS細胞。24-48小時後，隨後將細胞與 重組生物素標記Bst2誘何Fc —起培育1小時。將細胞與藻紅蛋白接合抗生 蛋白鏈菌素(Gibco BRL) —起再培育30分鐘，然後由焚光激活細胞分選 (FACS)分析。
在另一方面中，可由共免疫沉澱檢定測定Bst2-Bst2 L相互作用。將經 純化Bst2 L與Bst2誘斜Fc —起培育且用蛋白質A瓊脂糖免疫沉澱。通過 SDS-PAGE解析沉澱並通過使用抗Bst2 L的免疫印跡觀測。
在另一方面中，(例如)在大腸桿菌中製造重組Bst2 L,且將1251-標記 Bst2 L暴露於Bst2、 Bst2誘辨或Bst2誘何-Fc的野生型、缺失突變體中， 且在非還原性SDS-PAGE後將對照蛋白質固定於尼龍濾器上。1251標記Bst2 L應識別Bst2蛋白。這一檢定證實Bst2-Bst2 L的活體外直接結合。當使用 Bst2、 Bst2誘辨或Bst2誘飾Fc蛋白的各種缺失突變體時，也可確定與Bst2 L結合的Bst2的結合域。
實例33-經分離Bst2L的活體外功能
經重組Bst2 L處理的細胞可引發發炎性反應。用重組Bst2L、發炎性 細胞因子(諸如幹擾素Y)或Bst2 L與細胞因子的組合處理包括HUVECS 的細胞。測量這些細胞的細胞因子產生和與這些細胞的U937粘附。預期僅 Bst2或與發炎性細胞因子的組合將增強發炎性反應和細胞-細胞粘附。Bst2 誘斜或Bst2誘辦-Fc應活體外阻斷這些作用。類似地，可使用T細胞激活 和增殖檢定測試Bst2 L的活體外功能。這些數據指示Bst2 L直接介導細胞-細胞相互作用且Bst2和Bst2 L是免疫發炎性反應的關鍵調節劑。可使用大 鼠或小鼠細胞重複這些檢定以檢查人類Bst2 L是否在大鼠或小鼠系統中起 作用。這些數據指示Bst2 L直接介導細胞-細胞相互作用且Bst2和Bst2 L 是免疫-發炎性反應的關鍵調節劑。
實例34-經分離Bst2L的活體內功能
用重組Bst2L、 Dampl L或大鼠Bst2 L注射小鼠或大鼠。注射後，評 定諸如細胞因子釋放的活體內發炎性參數。預期Bst2L (Dampl L)注射將 產生促發炎性反應。這些發炎性反應將因注射Bst2 (Dampl)誘何Fc或抗 Bst2 (Dampl)抗體而被阻斷。在另一方法中，抗Bst2 L抗體也將展示消 炎作用。因此可使用所述抗Bst2 L抗體作為阻斷Bst2-Bst2 L相互作用的另 一治療劑。
實例35- Bst2配位體的生物化學和生物學表徵 所分離的Bst2 L應符合以下生物標準。
測量全長Bst2 L蛋白的結合性質。用含有全長cDNA的表達載體轉染COS7細胞，且與各種濃度的1251標記Bst2誘何-Fc —起培育並測量細胞結合的放射性。與過量未標記Bst2或Bst2誘何-Fc而不是無關蛋白質或無關蛋白質-Fc竟爭應完全阻斷放射性標記Bst2誘斜-Fc的結合。這些結果指示Bst2 L特異性結合生物學活性Bst2、Bst2誘飾或Bst2誘斜-Fc。如Munson PJ，Rodbard D， 1980, Anal. Biochem.l 107:220-239中所述分析結合數據以測定每個細力包的親和力和卩立點悽史。
使用1251標記Bst2 L作為探針確定Bst2的配位體結合域。(例如)在大腸桿菌中製造重組Bst2 L,且如Chen等人(Chen等人，1995; J. Biol. Chem.270:2874-2878 )的研究中所述，將1251標記Bst2 L暴露於Bst2或Bst2誘何-Fc的野生型或缺失突變體中，且在非還原性SDS-PAGE後將對照蛋白質固定於尼龍濾器上。
實例36-構築Bst2/Dampl定向Fab文庫
通過注射適量的佐劑(瑞比氏(RIBI's)或弗氏(Freund's)不完全/完全)將表達於CHO細胞中的人類Bst2-誘辨或小鼠Dampl-誘飾蛋白免疫到兔子(紐西蘭白兔(New Zealand White ))中直到對Bst2/Dampl抗原具有特異性的抗體效價飽和。由酶聯免疫吸附檢定(ELISA )使用識別誘斜蛋白C-末端處的His標籤的辣根過氧化物酶(HRP)接合抗His抗體測定免疫兔子的抗體效1^介。
關於製備Fab呈現噬菌體文庫，使用TRI試劑從免疫兔子的骨髓和脾製備總RNA。通過使用Superscript II第一鏈合成系統由寡聚(dT)引物(Invitrogen )合成第 一鏈cDNA。
使用高保真度擴增PCR系統(Expand High Fidelity PCR System)(Roche Molecular System )使來自各兔子的第一鏈cDNA經受第 一輪PCR，且使用用於擴增兔子V^編碼序列的10個引物的組合和用於擴增兔子Vh編碼序列的4個引物的組合。從Fab擴增人類CK和CHl編碼序列。反義引物由為兔子Vl和VH編碼序列與人類Ck和CHI編碼序列的融合體設計的雜交兔子/人類序列組成。在第二輪PCR中，使第一輪可變區兔子Vh與人矣
恆定cm重疊，且使第一輪可變區兔子VL與人類恆定Qc重疊。在第三輪
PCR中，通過重疊擴增PCR使嵌合輕鏈產物與嵌合重鏈片段聯接。實例36-l-第一輪PCR引物組承Vk5'正向引物
RSCVK1 5' ggg ccc agg egg ccg age tcg tgm tga ccc aga etc ca 3'
(SEQ ID NO:27 )
RSCVK2 5' ggg ccc agg egg ccg age tcg atm tga ccc aga etc ca 3'
(SEQ ID NO:28 )
RSCVK3 5' ggg ccc agg egg ccg age tcg tga tga ccc aga ctg aa 3'(SEQ ID NO:29 ) 承Vic3'反向引物
RHybKl-B 5' aga tgg tgc age cac agt teg ttt gat ttc cac att ggt gcc 3' (SEQ ID NO:30 )
RHybK2-B 5' aga tgg tgc age cac agt teg tag gat etc cag etc ggt ccc 3' (SEQ ID N0:31 )
RHybK3-B 5' aga tgg tgc age cac agt teg ttt gac sac cac etc ggt ccc 3' (SEQ ID NO:32 ) * V入5'正向引物
RSCL1 5' ggg ccc agg egg ccg age teg tgc tga etc agt cgc cct c 3'
(SEQ ID NO:33 )
na3'反向引物
RHybL-B5' aga tgg tgc age cac agt teg gcc tgt gac ggt cag ctg ggt ccc 3' ( SEQ ID NO:34 ) *VH 5'正向引物
RHyVHl 5' get gcc caa cca gcc atg gcc cag teg gtg gag gag tec rgg 3'
(SEQ ID NO:35)
RHyVH25' get gcc caa caa gcc atg gcc cag teg gtg aag gag tec gag 3' (SEQ ID NO:36 )
RHyVI-13 5' get gcc caa cca gcc atg gcc cag teg ytg gag gag tec ggg
3' (SEQIDNO:37)
RHyVH4 5' get gcc caa cca gcc atg gcc cag sag cag ctg rtg gag tec
gg 3' ( SEQ ID NO:38 )
n^H3'反向引物
RHylgGCHl-B 5' cga tgg gcc ctt ggt gga ggc tga rga gay ggt gac cag ggt
gcc 3' ( SEQ ID NO:39 )
*用於擴增人類CK區的引物和來自複製人類Fab的pe舊前導序列 HKC-F (正向) 5' cga act gtg get gca cca tct gtc 3' ( SEQ ID
NO:40 )
Lead-B (反向) 5' ggc cat ggc tgg ttg ggc age 3' ( SEQ ID
NO:41 )
*用於擴增來自複製人類Fab的人類CHI鏈的引物 HIgGCHl-F (正向) 5' aga age gta gtc egg aac gtc 3' ( SEQ ID NO:42 )
dpseq (反向)5' aga age gta gtc egg aac gtc 3' ( SEQ ID NO:42 ) 實例36-2-第二輪PCR引物組RSC-F (正向) 5' gag gag gag gag gag gag gcg ggg ccc agg egg
ccg age tc 3' ( SEQ ID NO:44 )
Lead-B (反向) 5' ggc cat ggc tgg ttg ggc age 3' ( SEQ ID
NO:41 )
*用於PCR裝配兔子VH序列與人類CHI PCR產物的引物 前導VH (正向) 5' get gec caa cca gec atg gec 3' ( SEQ ID
NO:45 )
dpseq (反向)5' aga age gta gtc egg aac gtc 3' ( SEQ ID NO:46 ) 實例36-3-第三4侖PCR引物組
*用於PCR裝配嵌合輕鏈序列與嵌合重鏈(Fd )序列的引物 RSC-F (正向) 5' gag gag gag gag gag gag gcg ggg ccc agg egg
ccg age tc 3' ( SEQ ID NO:44 )
dp-EX (反向)5' gag gag gag gag gag gag aga age gta gtc egg aac gtc 3' (SEQ ID NO:47 )
將經S/ /消化的所得PCR產物連接到噬粒載體pComb3X (GenbankAF268281 )中並轉化到XL1-Blue/F'中。吸收輔助噬菌體 VSCM13,接著添加PEG和NaCl後，從整夜培養基中獲得噬菌體文庫。
實例37-淘選抗Bst2或抗Dampl抗體的Fab文庫
4丸行總計四輪淘選。關於Bst2和Dampl的高親和力抗體克隆，使用利 用所獲得的嵌合Fab噬菌體文庫的dynalbead ( DYNAL,目錄號143.01 )淘 選方法。
在37。C下用Bst2誘辨、Dampl誘飾或牛血清白蛋白(BSA)塗布 Dynalbeads M270 Epoxy歷時16-24小時。用PBS ( 1.06 mM磷酸二氫鉀， 155.17 mM氯化鈉，2.97 mM磷酸二鈉，pH 7.4 )和0.5%於PBS中的吐溫 20 (tween 20)洗滌Bst2誘何塗布微珠，且然後懸浮於0.5%於PBS中的 BSA中。關於去除非特異性結合，將Bst2噬菌體文庫與BSA塗布微珠一 起預培育。在室溫下將預清除的噬菌體池與Bst2微珠一起培育2小時，並 用0.5%於PBS中的吐溫20由磁力分離方法洗滌數次以去除非特異性結合 噬菌體。通過0.1 M檸檬酸鈉(pll 3.0, 0.45 ml)培育10分鐘兩次洗脫特 異性結合喧菌體並通過添加1 M Tris-HCl (pH 9.5, 0.1ml)中和。感染所 洗脫的噬菌體至對數性生長XL1-Blue F並由輔助噬菌體VSCM13擴增整 夜。通過用4% PEG和3% NaCl ( w/v )沉澱製備噬菌體，隨後用於PBS緩 衝液中的1% BSA和0.02% NaN3懸浮。使用抗HA辣才艮過氧化物敏Roche， 目錄號2 013 819)由噬菌體ELISA監測各輪的輸出噬菌體池。以與上述 Bst2特異性噬菌體池相同的方案選擇Dampl誘斜特異性噬菌體池。實例38-就對Bst2與Dampl具有特異性的抗體篩選Fab文庫 關於選才奪對Bst2與Dampl具有反應性的克隆，將單一噬菌體克隆接種 於含有30 jug/ml四環素、50昭/ml羧節西林(carbenicillin )和1%葡萄糖的 2xYT肉湯中，並在37"下培養整夜。將培養物上清液在96深孔板上在含 有30嗎/ml四環素、50 |ig/ml羧千西林的2xYT肉湯中亞培養並使用輔助噬 菌體VSCM13和卡那黴素(kanamycin)擴增。培養整夜後，通過在3000 rpm 下離心30分鐘獲得噬菌體上清液且用於呈ELISA格式的Bst2/dampl結合 檢定中。
在4°C下用1嗎Bst2誘斜或Dampl誘飾塗布96孔maxi-sorp板(Nunc ) 上的各孔整夜且通過在37°C下用於5%於TBS中的BSA ( 50 mM Tris-HCl， 150mMNaCl， pH7.4 )培育2小時來阻斷。隨後，在37。C下接著添加100 噬菌體上清液歷時1小時。用0.05。/。於TBS (7.4 pH)中的吐溫20洗滌各 孔，並在37。C下添加100 jil辣根過氧化物酶接合抗HA抗體歷時1小時。 如上洗滌後，添加200 pi OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽，0.4 mg/ml, Sigma)溶 液，接著添加50(al3M硫酸(50|al)作為終止溶液。結果繪示於圖36中。
實例39-所選抗體的表達
通過DNA測序分析如上獲得的陽性噬菌體克隆且基於序列比對加以 選擇。參見圖37。
關於以完整IgGl形式的表達，將各噬菌體Fab DNA片段克隆到來源 於pCDNA 3.1 (Invitrogen )的表達載體pCDH和pCDK中。
pCDH是用於表達全長IgG重鏈的中間克隆載體。從為用於表達全長 IgG重鏈的中間克隆載體的完整pCDH來PCR擴增IgG重鏈的 CH1-CH2-CH3域。從全血細胞cDNA文庫(Clontech)使用EcoRl和Notl 限制性消化後克隆到pcDNA3.1的EcoRl、 Notl位點中的引物R1-CH1和 CH3-Notl來PCR擴增IgG重鏈的CH1-CH2-CH3域。通過首先用來自如上 所使用的文庫的引物Rl-tPA5和tPA3對tPA信號肽進行PCR和用重鏈 —CH1—Rev和對可變區(Ra_Hv_Fwl到Ra—Hv—Fw9 )具有特異性的引物對 來自用於表達Fab片段的噬粒的可變區和CH1進行PCR進行重疊PCR克 隆使tPA 5'分泌信號與重鏈可變區融合來重構可分泌全長IgG重鏈；隨後通 過使用引物Rl-tPA5和重鏈—CHl一Rev的重疊PCR反應使這兩個PCR片殺: 融合，用EcoRl和Agel消化並克隆到經相同酶消化的pCDH中。
pCDK是通過用引物H3-輕鏈和輕鏈-Xbal對輕鏈進行PCR克隆，用 Hindlll和Xbal消化PCR產物並克隆到經相同酶消化的pcDNA3.1中製成 的用於表達IgG輕嗜連的中間載體。通過首先用來自如上所使用的文庫的引 物H3-tPA5和tPA3對tPA信號肽進行PCR和用對可變區(Ra—Kp_Fl到6 和Ra一Kp—Rva到d )具有特異性的引物對對來自用於表達Fab片段的噬粒的可變區和CK進行PCR來進行重疊PCR克隆使tPA 5'分泌信號與輕鏈可 變區融合來重構可分泌全長IgG輕鏈；隨後通過4吏用引物H3-tPA5和特異 性輕鏈3'引物的重疊PCR反應使這兩個PCR片段融合，用HinDIII和BsiWI 消化並克隆到經相同酶消化的pCDK中。
R1-CH1 5' cgcgaattcgcctccaccaagggcccatcg 3' ( SEQ ID NO:48 )
CH3-Notl 5' ggcggccgctcatttacccgggga 3' ( SEQ ID
NO:49 )
Rl畫tPA5 5'cgcgaattcaggacctcaccatgggatgg 3' (SEQIDNO:50)
tPA3 5' ggagtggacacctgtagct 3' ( SEQ ID NO:51 )
Heavy—CHI一Rev 5' ccacgctgctgagggagtagagtc 3' ( SEQ ID
NO:52 )
Ra—Hv一Fl:5'gc犯c3gctoc3ggtgtccactcccagcagcagctgatggag 3'(SEQ ID
NO:53 )42mer
Ra_Hv—F2:5'gcaacagctacaggtgtccactcccaggagcagctgatggagt 3'(SEQ ID
NO:54 )43mer
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NO:55 )43mer
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Ra一匿Hv一F5:5'gCMC3gCt3C3ggtgtCC3CtCCcagtcgttggaggagtccg 3'(SEQ ID
NO:57 )43mer
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Ra一—Hv一F9:5'gcaacagctecaggtgtcc3Ctcccagtcgctggaggagtcc 3'(SEQ ID
NO:61 )42mer
H3-輕4連5'gcgaagcttcgaactgtggctgcaccatct 3' ( SEQ ID NO:62 ) 輕《連-Xbal: 5'gcgtctagattaacactctcccct 3' ( SEQ ID NO:63 ) H3-tPA5: 5'gcgaagcttaggacctcaccatgggatgg 3' ( SEQ ID NO:64 ) Ra一Kp—Fl: 5'gcaacagctacaggtgtccactcc gagctcgatatgacccagac 3' ( SEQ ID NO:65 ) 44mer
Ra一Kp一F2: 5'gcaacagctacaggtgtccactcc gagctcgtgctgaaccca 3' ( SEQ ID NO:66) 42mer
86Ra—KP—F3: 5'gcaacagctacaggtgtccactcc gagctcgtgatgacccagac 3' ( SEQ ID NO:67) 44mer
Ra—Kp一F4: 5'gcaacagctacaggtgtccactcc gagctcgatctgacccagac 3' ( SEQ ID NO:68 ) 44mer
Ra—Kp—Rva: 5'cgccgtacg taggatctccagctcggtcc 3' ( SEQ ID NO:69 ) 29mer Ra—Kp一Rvb: 5'cgccgtacg tttgatttccacattggtgcc 3' ( SEQ ID NO:70 ) 30mer Ra—Kp—Rvc: 5'cgccgtacg tttgacgaccacctcggtc 3' ( SEQ ID NO:71 ) 28mer Ra—Kp一Rvd: 5'cgccgtacg taggatctccagctcggtccc 3' ( SEQ ID NO:72 ) 30mer 關於以完整IgGl形式表達，將各噬菌體Fab DNA片段克隆到表達載 體pCDNA3.1 (Invitrogen)中。
為表達如上所選擇的單克隆抗體(mAb, IgGl),將載體DNA瞬時或 穩定地引入哺乳動物細胞中。如下通過磷酸釣(CaP04 )沉澱執行瞬時轉染。 轉染前1天，將7xl6個293T細胞(ATCC)接種於150 mm細月包培養板上 並培養。轉染前1小時，將培養基換成補充有2%胎牛血清(GIBCO-BRL ) 的IMDM培養基(Cambrex )。將1.5 ml體積的含有75昭DNA和250 mM 鉤的TE緩衝液(ImM Tris， 0.1 mM EDTA, pH 8.0)與等體積的HEPES 緩沖液(50 mM HEPES ， 140 mM NaCl， 1.4 mM Na2HP04， pH 7.05 )混合。 將混合物在室溫下培育約1分鐘並應用於預培養細胞。將細胞在37。C下在 C02培育箱中培育6小時。去除DNA/4丐溶液後，向細胞中添加無血清培養 基且進一步培養72小時或更長時間，且隨後收集培養基。使用蛋白質A親 和力色譜法(amersham Biosciences, MabSelect),人培養基中純化各mAb。 將培養基加載到預先經PBS緩衝液(1.06 mM磷酸二氫鉀、155.17 mM氯 化鈉、2.97mM磷酸二鈉，pH 7.4)平衡的蛋白質A填充柱上。用PBS緩 沖液洗滌管柱以去除約20管柱體積的汙染物。用低pH值緩衝液(諸如50 mM甘氨酸鹽酸鹽)使用步進梯度洗脫結合抗體並用等體積1 M Tris (pH 8.0)中和。使經純化蛋白質樣品在4-20。/。天然PAGE ( 4-20%天然PAGE， Invitrogen)中經受凝膠電泳。關於凝膠中的經純化蛋白質，參見圖38。 實例40-竟爭性結合檢定(活體外)
如實例22中所述測量對Bst2或Dampl具有特異性的mAb在Bst2誘 餅與細胞之間的結合中的竟爭性抑制。 實例41-mAb對哮喘小鼠模型的作用
如實例8-1中所述製備孝喘小鼠模型。如實例8-2中所述評定抗 Bst2/Dampl抗體對免疫細胞浸潤的作用。在經卵白蛋白致敏並用各mAb 處理的小鼠中，經一些抗Bst2/Dampl抗體處理後，支氣管肺泡灌洗液(BAL ) 中浸潤細胞的總數減少(圖39 )。抗Dampl抗體2-15並不顯著阻斷免疫細 胞浸潤。 一種可能性為2-15單克隆抗體可與Dampl誘斜強有力結合，但可能不精確覆蓋潛在Dampl L結合位點。 實例42-測量發炎性狀態的診斷方法
在發炎性病狀中Bst2 mRNA表達增加。用定量PCR、實時PCR或北 方印跡測量從個體分離的細胞和組織中的Bst2 mRNA含量可得到關於那些 細胞和組織的炎症狀態的有用信息。通過用對Bst2具有特異性的抗體進行 免疫印跡法或使用能夠與細胞膜上的Bst2結合的螢光標記抗體的免疫螢光 顯微術和焚光激活細胞分選儀(FACS )測量Bst2蛋白含量也可得到關於那 些細胞的炎症狀態的信息。經常可使諸如Bst2的膜蛋白質裂解來製造在體 內循環的可溶性Bst2片段。可使用常用方法(諸如放射性免疫檢定 (radioimmunological assay ， RIA)和ELISA)用對循環Bst2片l殳具有特異 性的抗體量化在體液(諸如血清和尿)中循環的Bst2。對循環Bst2片段的 量化可反映宿主的炎症狀態且可適用於診斷和治療目的。
本文中所引用的所有參考文獻整體以引用的方式併入本文中。 僅僅使用常規實驗，所屬領域的技術人員將認識到或能夠探知本文中 具體描述的本發明的特定實施例的許多等價物。所述等價物意欲涵蓋在權 利要求書的範疇內。
權利要求
1.一種阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其包含使所述免疫細胞和/或所述其它細胞與包含骨髓基質抗原-2拮抗劑的組合物接觸。
2. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述其它細胞為免疫細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、腦細胞、脊髓 細胞、周圍神經細胞、心臟細胞、骨骼肌細胞、肺細胞、肝細胞、腎細胞、 血管細胞、胰腺細胞、大腸和小腸細胞、胃細胞、食道細胞、鼻咽細胞、 膜細胞或結締組織細胞。
3. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述骨髓基質抗原-2拮抗劑為骨髓基質抗原-2誘飾。
4. 根據權利要求3所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述骨髓基質抗原-2誘斜為與所述骨髓基質抗原-2蛋白相比對另一 分子或蛋白質具有類似或改良的結合的骨髓基質抗原-2片段或其變異體。
5. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述骨髓基質抗原-2拮抗劑為與穩定蛋白質融合的骨髓基質抗原-2 誘餌、骨髓基質抗原-2誘餌-Fc嵌合或融合構築體、骨髓基質抗原-2誘鉺-白蛋白嵌合或融合構築體或聚乙二醇化骨髓基質抗原-2誘辨，或與其它穩 定蛋白質融合的骨髓基質抗原-2誘飾。
6. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述骨髓基質抗原-2拮抗劑為與骨髓基質抗原-2和/或小鼠Dampl 蛋白特異性結合的單克隆抗體或抗體樣蛋白質域。
7. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述骨髓基質抗原-2拮抗劑為化學化合物。
8. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述免疫細胞和其它細胞位於發炎部位或位於遠離發炎但可傳輸發 炎性和免疫細胞因子或其它發炎性信號到發炎部位的部位。
9. 根據權利要求1所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述組合物進一步包含細胞粘附和信號傳輸抑制化合物或免疫抑制 化合物。
10. 根據權利要求9所述阻止免疫細胞與其它細胞結合的方法，其特 徵在於所述細胞粘附抑制化合物為細胞間粘附分子-1拮抗劑或淋巴細胞功 能相關抗原拮抗劑。
11. 一種具有消炎活性的骨髓基質抗原-2誘鉺。
12. —種骨髓基質抗原-2誘飾-免疫球蛋白Fc嵌合體。
13. 根據權利要求11所述具有消炎活性的Bst2誘何，其特徵在於骨髓基質抗原-2誘何-Fc融合體的所述誘辨融合於免疫球蛋白的任何域。
14. 一種單克隆抗體，其對骨髓基質抗原-2和/或骨髓基質抗原-2同源 物具有特異性。
15. 根據權利要求14所述的單克隆抗體，其包含兩個臂，其特徵在於 一個臂對除骨髓基質抗原-2或其同源物以外的蛋白質具有特異性。
16. 根據權利要求14所述的單克隆抗體，其特徵在於所述同源物為小 鼠Dampl蛋白。
17. 根據權利要求14所述的單克隆抗體，其特徵在於表達所述單克隆 抗體所結合的骨髓基質抗原-2的細胞阻止骨髓基質抗原-2配位體-骨髓基質 抗原-2相互作用或骨髓基質抗原-2-骨髓基質抗原-2相互作用。
18. —種分離骨髓基質抗原-2配位體的方法，其包含 (i)獲得與骨髓基質抗原-2結合的細胞；(ii )從所述表達所述配位體的細胞中篩選與骨髓基質抗原-2結合的配 位體，從而分離所述骨髓基質抗原-2配位體。
19. 一種轉基因小鼠，其體細胞和生殖細胞包含功能上受破壞的 Damp或骨髓基質抗原-2基因，其特徵在於所述受破壞基因在胚胎期時被引 入所述小鼠或所述小鼠的祖先中，而在所述受破壞基因純合的情況下顯示 炎症相關病症。
20. —種轉基因小鼠，其體細胞和生殖細胞包含完全或部分經骨髓基 質抗原-2基因置換的Damp基因，其特徵在於所述骨髓基質抗原-2基因在 胚胎期時被引入所述小鼠或所述小鼠的祖先中。
21. —種減輕個體中炎症的方法，其包含向發炎部位投與包含骨髓基 質抗原-2拮抗劑的組合物。
22. —種治療具有與炎症相關的疾病的症狀的個體的方法，其包含向 所述有需要的個體投與包含骨髓基質抗原-2拮抗劑的組合物。
23. 根據權利要求20所述的方法，其特徵在於所述組合物包含另一消 炎化合物。
24. 根據權利要求22所述的方法，其特徵在於所述疾病選自動脈粥 樣硬化、類風溼性關節炎、哮喘、膿毒症、潰瘍性結腸炎、I型糖尿病、白 內障、多發性硬化症、急性心肌梗塞、心臟病發作、銀屑病、接觸性皮炎、 骨關節炎、鼻炎、克羅恩氏病、自體免疫疾病、惡病質、急性胰腺炎、自 體免疫血管炎、自體免疫和病毒性肝炎、延遲型超敏反應、充血、冠狀動 脈再狹窄、腎小球腎炎、移植物抗宿主疾病、葡萄膜炎、與角膜移植相關 的發炎性眼病、由外傷所致的腦損傷、癲癇症、出血、中風、鐮刀形紅細 胞貧血症、II型糖尿病、肥胖症、年齡相關黃斑變性、溼疹、皮炎、學習/ 認知障礙、神經退化性疾病、帕金森病、阿爾茨海默病、潰瘍性結腸炎、輻射誘發的損傷、灼燒或電誘發的損傷、引起組織死亡和免疫細胞浸潤的 中毒、藥物誘發的損傷、吸入誘發的損傷、輻射、抽吸誘發的肺損傷、由 化學治療或放射性治療引起的炎症、自體免疫疾病、狼瘡、舍格倫病、包 括多發性硬化症的脫髓鞘疾病、包括多發性肌炎的發炎性肌病、硬皮病、 結節性多動脈炎、肉狀瘤病、局部和全身骨化性肌炎、包括阿爾茨海默病 的澱粉樣相關疾病、推間盤突出、脊髓和神經損傷、雷意氏症候群、細菌 性和病毒性腦炎和腦膜炎、朊病毒相關疾病、古立安-白瑞症候群、狂犬病、 脊髓灰質炎、大腦出血、顱內出血相關損傷、慢性疲勞症候群、血栓靜脈炎、痛風、肉芽肺病、包括腎小球腎炎和間質性腎炎的腎炎、昆蟲刺過^:、 過敏性反應、再生障礙性貧血、骨髓衰竭、多發性器官衰竭、曱狀腺炎、 胰島炎、肝硬化(慢性和急性肝炎)、肺栓塞、毒素和藥物誘發的肝病、胰 腺炎、缺血性腸病、急性呼吸窘迫症候群和心包炎。
25. —種檢定有效抑制骨髓基質抗原-2介導的細胞-細胞結合的化合 物的方法，其包含測定與骨髓基質抗原-2結合的化合物。
26. —種製造骨髓基質抗原-2誘何的方法，其包含在宿主細胞中重組 表達所述骨髓基質抗原-2誘何。
全文摘要
本申請案揭示一種阻止免疫細胞與其他細胞結合的方法，其包括使免疫細胞和其他細胞與包含骨髓基質抗原-2(Bst2)拮抗劑的組合物接觸。
文檔編號C07K16/00GK101516910SQ200780007011
公開日2009年8月26日 申請日期2007年6月20日 優先權日2006年6月20日
發明者具美善, 劉賢兒, 珍 張, 樸俊映, 樸商鎬, 李允碩, 李尙玟, 李朱杏, 許英美, 文 金 申請人:Isu Abxis株式會社