用於在木黴屬的蛋白酶缺陷突變體中產生多肽的方法

2023-05-26 02:50:26

專利名稱：用於在木黴屬的蛋白酶缺陷突變體中產生多肽的方法
技術領域：
本發明涉及在蛋白酶缺陷的木黴屬(Trichoderma)突變體菌株中產生多肽的方法，涉及所述蛋白酶缺陷的木黴屬突變體菌株，並涉及獲得所述蛋白酶缺陷的木黴屬突變體菌株的方法。
背景技術：
已顯示木黴屬可用作宿主細胞以供重組產生具有生物活性的多肽(W096/00787，WO 97/26330)。具有所需的蛋白表達和分泌增加的性狀的木黴屬宿主不一定具有對於成功的發酵最需要的特徵。由於生物物質例如酶的產生對感興趣的具體多肽的產生、回收或應用有害，發酵可能不是最佳的。Martinez 等，2008, Nature Biotechnology 26:553-560描述了生物質降解真菌裡氏木黴(Trichoderma reesei)的基因組測序和分析。Dienes等，2007,Enzyme and Microbial Technology 40:1087-1094公開了從裡氏木黴QM9414鑑定膜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。Eneyskaya 等，1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:226-231 描述了來自裡氏木黴的酸性蛋白酶。Haub等，1990, J。Biotechnology 16:187-198公開了從裡氏木黴 QM9414 形成胞外蛋白酶。Hagspiel 等，1989,Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:6
1-67公開了來自裡氏木黴QM9414選擇體(selectant)的蛋白酶活性和纖維素酶的蛋白水解修飾。W02006/073839公開了真菌酸性蛋白酶。WO 2007/045248描述了真菌突變體用於表達異源多肽的用途。本發明涉及改善的木黴屬宿主，其結合了表達商業量的感興趣的多肽的能力，而在可使得所述多肽的回收和下遊加工複雜化的蛋白酶的產生方面有缺陷。

發明內容
本發明涉及親本木黴屬菌株的突變體，其包含編碼多肽的多核苷酸，和一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一種或多種(幾種)基因經修飾，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本發明還涉及產生多肽的方法，包括(a)在用於產生所述多肽的培養基中培養親本木黴屬菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸，和一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一種或多種(幾種)基因經修飾，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相t匕，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和(b)從所述培養基回收所述多肽。本發明進一步涉及獲得親本木黴屬菌株的突變體的方法，包括(a)修飾一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和·(b)鑑定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述一種或多種(幾種)選自下組的基因經修飾第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。


圖I顯示pDM156. 2的限制圖。圖2顯示pEmY21的限制圖。圖3顯示pEmY23的限制圖。圖4 顯示 pWTY1470-19-07 的限制圖。圖5顯示pWTY1515-2-01的限制圖。圖6 顯示 pJaL504_[Bam HI]的限制圖。圖7 顯示 pJaL504_[BglII]的限制圖。圖8顯示PJaL574的限制圖。圖9 顯示 pWTY1449-02-01 的限制圖。圖10 顯示 pJfyS1540-75_5 的限制圖。圖11 顯示 pJfyS1579-l_13 的限制圖。圖12 顯示 pJfyS1579-8-6 的限制圖。圖13 顯示 pJfyS1579-21_16 的限制圖。圖14顯示pAlLo 1492-24的限制圖。圖15 顯示 pJfyS1579-35_2 的限制圖。圖16 顯示 pJfyS1579-41_ll 的限制圖。圖17顯示pDAtwl8的限制圖。圖18顯示pSaMe-AaXYL的限制圖。圖19顯示pAgJgl 11的限制圖。
圖20顯示pAgJgl 16的限制圖。圖21顯示pAgJgll5的限制圖。圖22顯示pAgJgll7的限制圖。圖23顯示pAgJgl 18的限制圖。圖24顯示來自裡氏木黴AgJgl 17-3-10A和裡氏木黴AgJgl 18-02-2E的培養液在40°C兩周相對於相同條件下的親本菌株的培養液的殘餘纖維素酶活性。圖25顯示pJfyS 152的限制圖。圖26顯示pJfyS 153的限制圖。定義枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶術語「枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶」意指具有類似於枯草桿菌蛋白酶的底物特異性、使用絲氨酸殘基以供催化肽和蛋白中肽鍵的水解的蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶(枯草桿菌酶)是通過三個胺基酸天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸組成的催化三聯體表徵的絲氨酸蛋白酶。這些催化殘基的安排類似於來自地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)的原型枯草桿菌蛋白酶(Siezen 和 Leunissen, 1997,Protein Science6:501-523)。就本發明而言,枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性根據實施例13中所述的步驟確定。天冬氨酸蛋白酶術語「天冬氨酸蛋白酶」意指使用天冬氨酸殘基以供催化肽和蛋白中肽鍵水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶類為使用天冬氨酸殘基以供催化其肽底物的蛋白酶家族。一般而言，它們在其活性位點具有兩個高度保守的天冬氨酸，並任選地在酸性pH有活性(Szecsi, 1992, Scand. J. Clin. Lab. In vest. Suppl. 210:5 - 22)。就本發明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根據Aikawa等，2001，J. Biochem. 129:791-794所述的步驟確定。胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶術語「胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶「意指具有類似於胰蛋白酶的底物特異性、使用絲氨酸殘基以供催化肽和蛋白中肽鍵的水解的蛋白酶。就本發明而言，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性根據由Dienes等，2007，上文，或實施例20所述的步驟確定。缺陷術語「缺陷」意指在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比較，不產生一種或多種(幾種)選自下組的酶的可檢測的活性的木黴屬突變體菌株第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶，或者，在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比較產生優選少至少25%，更優選少至少50%，甚至更優選少至少75%，並且最優選少至少95%的一種或多種(幾種)選自下組的酶的木黴屬突變體菌株第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。由本發明的木黴屬突變體菌株產生的蛋白酶的水平可使用本文中所述或本領域中已知的方法來確定。分離的或純化的術語「分離的」或「純化的」意指從與其天然結合(naturallyassociated)的至少一種成分移出的多肽或多核苷酸。舉例而言，多肽如通過SDS-PAGE確定的，可為至少1%純，例如，至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純，而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳確定的，可為至少 1%純，例如，至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純。成熟多肽術語「成熟多肽」意指在翻譯和任何翻譯後修飾如N端加工，C端截短，糖基化，磷酸化等之後以其最終形式存在的多肽。在一個方面，基於預測SEQ ID N0:2的胺基酸 I 至 19 為信號妝的 SignalP 程序(Nielsen 等，1997, Protein Engineering 10:1-6)，所述成熟多肽為SEQ ID NO:2的胺基酸20至882。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO:4的胺基酸I至20為信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽為SEQ ID NO:4的胺基酸21至407。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO:6的胺基酸I至19為信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽為SEQ ID NO:6的胺基酸20至259。在另一個方面，基於預測SEQ ID NOilOO的胺基酸I至15為信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽為SEQ ID NO: 100的胺基酸16至540。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO: 108的胺基酸I至17為信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽為SEQ ID NO: 108的胺基酸18至395。成熟多肽編碼序列術語「成熟多肽編碼序列」意指編碼具有酶活性的成熟多肽的 多核苷酸。在一個方面，基於預測SEQ IDN0:3的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上文)，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: I的核苷酸58至2774。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO: I的核苷酸I至60編碼信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID N0:3的核苷酸61至1299。在另一個方面，基於預測SEQ IDNO: 5的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 5的核苷酸58至930。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO:99的核苷酸I至45編碼信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO:99的核苷酸46至1681。在另一個方面，基於預測SEQ ID NO: 107的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序，所述成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 107的核苷酸52至1339。同一性兩個胺基酸序列間或兩個核苷酸序列間的相關性由參數」同一性」所描述。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟體組(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite), Rice 等，2000, Trends in Genetics 16:276-277)的 Needle 程序，優選為 3. 0. 0 版或之後的版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 Wunsch, 1970, J0 Mol。Biol。48 :443-453)確定。所用的可選參數為缺口開放罰分(gap open penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty) O. 5，和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用標記為「最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性並計算如下(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS :歐洲分子生物學開放軟體組(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite), Rice等,2000,見上)的Needle程序,優選為3. 0. 0版或之後的版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,見上)確定。所用的可選參數為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標記為」最長同一性」的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性並計算如下
(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口總數)多肽片段術語「多肽片段」意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(幾個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性，例如枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或絲氨酸蛋白酶活性。在一個方面，所述片段含有SEQ ID N0:2的成熟多肽或其同源序列的至少740個胺基酸殘基，例如至少780個胺基酸殘基或至少820個胺基酸殘基。在另一個方面，所述片段含有SEQ ID N0:4的成熟多肽或其同源序列的至少320個胺基酸殘基，例如至少340個胺基酸殘基或至少360個胺基酸殘基。在另一個方面，所述片段含有SEQ ID N0:6的成熟多肽或其同源序列的至少210個胺基酸殘基，例如至少220個胺基酸殘基或至少230個胺基酸殘基。在另一個方面，所述片段含有SEQ ID NO: 100的成熟多肽或其同源序列的至少460個胺基酸殘基，例如至少480個胺基酸殘基或至少500 個胺基酸殘基。在另一個方面，所述片段含有SEQ ID NO: 108的成熟多肽或其同源序列的至少320個胺基酸殘基，例如至少340個胺基酸殘基或至少360個胺基酸殘基。亞序列術語「亞序列(subsequence) 」意指從成熟多肽編碼序列的5』和/或3』端缺失了一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有酶活性，例如枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或絲氨酸蛋白酶活性的多肽片段。在一個方面，亞序列含有SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列，或它們的同源序列的至少2220個核苷酸，例如至少2340個核苷酸或至少2460個核苷酸。在另一個方面，亞序列含有SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列，或它們的同源序列的至少960個核苷酸，例如至少1020個核苷酸或至少1080個核苷酸。在另一個方面，亞序列含有SEQID NO: 5的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列，或它們的同源序列的至少630個核苷酸，例如至少660個核苷酸或至少690個核苷酸。在另一個方面，亞序列含有SEQ ID NO:99的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列，或它們的同源序列的至少1380個核苷酸，例如至少1440個核苷酸或至少1500個核苷酸。在另一個方面，亞序列含有SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列，或它們的同源序列的至少960個核苷酸，例如至少1020個核苷酸或至少1080個核苷酸。等位變體(allelic variant):術語「等位變體」意指佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術語「編碼序列」意指直接指定多肽胺基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成的或其組合。cDNA :術語「cDNA」意指能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體,其通過一系列的步驟包括間接進行加工然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。核酸構建體術語「核酸構建體」意指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有表達編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(control sequence):術語「調控序列」意指包括編碼多肽的多核苷酸表達所必需的所有組分。各個調控序列對於編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區的連接。可操作地連接術語「可操作地連接」意指這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽的編碼序列的表達。表達術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
表達載體術語「表達載體」意指線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，並與供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞術語「宿主細胞」意指任何細胞類型，所述細胞類型對於用包含多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。術語「宿主細胞」涵蓋由於在複製過程中發生的突變而與親本細胞不完全相同的親本細胞的任何後代。修飾術語「修飾」意指在基因或其轉錄或表達所需的調控序列中導入、取代或去除一個或多個(幾個)核苷酸，或基因破壞，基因轉換，基因缺失，或基因的隨機或特異性誘變，所述基因例如第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因，或其組合。所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和/或第二天冬氨酸蛋白酶基因中的一種或多種(幾種)的缺失可為部分的或完全的。所述修飾導致所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因，或其組合的表達的減少或消除(失活)。在一個優選的方面，所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二天冬氨酸蛋白酶基因中的一種或多種(幾種)失活。
具體實施例方式本發明涉及親本木黴屬菌株的突變體，其包含編碼多肽的多核苷酸，和一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一種或多種(幾種)基因經修飾，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本發明還涉及產生多肽的方法，包括(a)在用於產生所述多肽的培養基中培養親本木黴屬菌株的突變體，其中所述突變體菌株包含編碼所述多肽的多核苷酸，和一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一種或多種(幾種)基因經修飾，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和(b)從所述培養基回收所述多肽。本發明進一步涉及獲得親本木黴屬菌株的突變體的方法，包括(a)修飾一種或多種(幾種)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和(b)鑑定來自步驟(a)的突變體菌株，其中所述一種或多種(幾種)基因經修飾，使得突變體菌株在相同條件下培養時，與親本木黴屬菌株相比，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和·第二天冬氨酸蛋白酶。本發明的優點在於消除或減少了一種或多種(幾種)酶活性，其可對感興趣的具體多肽的產生，下遊加工例如回收，和/或應用是有害的。在本發明的方法中，未本木黴屬菌株可為任何木黴屬菌株，如野生型木黴屬菌株或其突變體。親本木黴屬菌株可為哈茨木黴(Trichoderma harzianum)、康寧木黴(Trichoderma koningii)、長枝木黴(Trichoderma Iongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)或綠色木黴(Trichoderma viride);或其可替換的有性形式，即肉座菌屬(Hypocrea)。在另一個方面,親本木黴屬菌株是哈茨木黴。在另一個方面，親本木黴屬菌株是康寧木黴。在另一個方面，親本木黴屬菌株是長枝木黴。在另一個方面，親本木黴屬菌株是裡氏木黴。在另一個方面，親本木黴屬菌株是綠色木黴。在另一個方面，親本裡氏木黴菌株是裡氏木黴RutC30。在另一個方面，親本裡氏木黴菌株是裡氏木黴TV10。在另一個方面，親本裡氏木黴菌株是裡氏木黴的突變體。在另一個方面，親本裡氏木黴菌株是裡氏木黴的形態突變體(參見WO 97/26330)。蛋白酶缺陷的木黴屬突變體菌株可通過使用本領域公知的方法，如插入、破壞、替代或缺失來減少或消除一種或多種(幾種)選自下組的基因的表達來構建第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。可修飾一部分基因，如編碼區或編碼區表達所需的調控區。基因的此種調控序列可為啟動子序列或其功能性部分，即足以影響基因表達的部分。舉例而言，可使得啟動子序列失活，導致無表達，或可用較弱的啟動子替代天然啟動子序列以減少編碼序列的表達。可修飾的其他調控序列包括但不限於前導序列，前肽序列，信號序列，轉錄終止子和轉錄激活子。所述木黴屬突變體菌株可通過消除或減少基因表達的基因缺失技術來構建。基因缺失技術使得可以部分或全部去除基因，從而消除其表達。在此類方法中，基因的缺失通過使用經構建連續地含有基因側翼的5』和3』區的質粒進行同源重組來實現。所述木黴屬突變體菌株亦可通過在基因或其轉錄或翻譯所需的其調控序列中導入、取代和/或去除一個或多個(幾個)核苷酸來構建。舉例而言，可插入或去除核苷酸以供導入終止密碼子，去除起始密碼子，或使得開讀框移碼。此種修飾可依照本領域已知技術通過定點誘變或PCR生成的誘變來實現。參見，例如Botstein和Shortle，1985，Science 229:4719;Lo 等，1985, Proceedings of National Academy of Sciences USA81:2285;Higuchi 等，1988, Nucleic AcidsResearch 16:7351;Shimada,1996, Meth。Mol Biol。 57:157;Ho 等，1989， Gene 77:61;Horton 等，1989， Gene 77:61;以及 Sarkar 和Sommer,1990, BioTechniques 8:404。所述木黴屬突變體菌株亦可通過基因破壞技術來構建，即將包含與基因同源的核酸片段的破壞性核酸構建體插入所述基因，這會構建同源區的重複，並在重複的區之間併入構建體DNA。若插入的構建體使得基因啟動子與編碼區分開，或打斷編碼序列使得產生非功能性基因產物，則此種基因破壞可消除基因表達。破壞構建體可簡單地為伴以同源於基因的5』和3』區的選擇性標記基因。所述選擇性標記基因使得能夠鑑定含有破壞的基因的 轉化體。所述木黴屬突變體菌株亦可通過基因轉換的工藝構建(參見，例如Iglesias和Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189:73-76)。舉例而言，在基因轉換方法中，在體外對對應於基因的核苷酸序列進行誘變，以產生缺陷的核苷酸序列，然後將其轉化入木黴屬菌株以產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷的核苷酸序列取代了內源基因。可為理想的是所述缺陷的核苷酸序列亦包含標記以供選擇含有缺陷基因的轉化體。所述木黴屬突變體菌株亦可通過已確立的使用互補於基因核苷酸序列的核苷酸序列的反義技術來構建(Parish 和 Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters154:151-157)。更具體而言，木黴屬菌株的基因表達可通過導入互補於基因核苷酸序列、可在菌株中轉錄並能夠雜交於菌株中產生的mRNA的核苷酸序列來減少或失活。在允許互補性反義核苷酸序列雜交於mRNA的條件下，由此減少或消除了翻譯的蛋白的量。所述木黴屬突變體菌株亦可通過已確立的RNA幹擾(RNAi)技術來構建(參見，例如 WO 2005/056772 和 WO 2008/080017)。所述木黴屬突變體菌株亦可進一步通過使用本領域中公知方法的隨機或特異性誘變(包括但不限於化學誘變)來構建(參見，例如Hopwood, Isolation of Mutants inMethods in Microbiology (J. R。Norris 和 D. W。Ribbons 編)pp. 363-433，Academic Press,New York，1970)。對基因的修飾通過對親本菌株進行誘變，並篩選其中基因表達減少或失活的突變體菌株來進行。可為特異性或隨機的誘變可通過例如使用合適的物理或化學誘變齊IJ，使用合適的寡核苷酸，或對DNA序列進行PCR生成的誘變來進行。此外，誘變可通過使用任何這些誘變方法的組合來進行。適於本發明目的的物理或化學誘變劑的實例包括紫外(UV)輻照，羥胺，N-甲基-N』 -硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，N-甲基-N』 -亞硝基胍(NTG)，O-甲基羥胺，亞硝酸，甲磺酸乙酯(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸，和核苷酸類似物。當使用此類試劑時，誘變通常通過在所選誘變劑存在下在合適條件下溫育待誘變的親本菌株，並選擇呈現基因表達減少或無表達的突變體來進行。
在一個方面，修飾導致一個或多個(幾個)選自下組的基因的失活第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一個方面，修飾導致一個或多個(幾個)選自下組的基因的表達的減少第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨 酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一個方面，修飾導致一個或多個(幾個)選自下組的基因的表達的減少，失活，或其組合第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第一天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。在另一個方面，突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因和第二天冬氨酸蛋白酶基因。 在一個方面，所述枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，其包含或組成為與SEQ ID NO:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼包含或組成為SEQID N0:2的具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼包含或組成為SEQ ID NO: 2的成熟多肽的具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: I或其成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID N0:1。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:1 ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列；
(iii)(i)或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii)或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為與SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID NO:2。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID NO:2的成熟多肽。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO: I。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:1 ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列
(i)或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii)或(iii)的全長互補鏈。 在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為與SEQ ID NO: 4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID N0:4。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID N0:4的成熟多肽。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: 3或其cDNA序列，或其成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQ ID N0:3。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID N0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或組成為與SEQ ID N0:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96 %，至少97 %，至少98 %，至少99 %，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID N0:4。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID N0:4的成熟多肽。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID N0:3。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID N0:3 ；(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為與SEQ ID N0:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID N0:6。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID N0:6的成熟 多肽。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為SEQID N0:5。在另一個方面,胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸,所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO:5的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或
(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為與SEQ ID N0:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ IDN0:6。在另一個方面，第一天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID N0:6的成熟多肽。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID N0:5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQID N0:5。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO:5的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為與SEQ ID N0:100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID NO: 100。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因編碼具有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID NO: 100的成熟多肽。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID N0:99或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%,例如，至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的 核苷酸序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQID N0:99。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQ IDNO:99的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽編碼序列，
(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為與SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID NO: 100。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID NO: 100的成熟多肽。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO:99或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID N0:99o在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID NO:99的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽編碼序列，
(111)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為與SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%,至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個
方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID NO: 108。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因編碼具有天冬氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽包含或組成為SEQ ID NO: 108的成熟多肽。 在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%,至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQ ID N0:107。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含或組成為SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶基因包含多核苷酸，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID N0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或
(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或組成為與SEQ ID N0:108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的胺基酸序列。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID N0:108。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶包含或組成為SEQ ID N0:108的成熟多肽。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為與SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性的核苷酸序列。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ ID N0:107。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含或組成為SEQ IDNO: 107的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，第二天冬氨酸蛋白酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常低嚴格條件，低嚴格條件，中等嚴格條件，中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID N0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈。本文中公開的核苷酸序列或其亞序列，及其胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株鑑定和克隆如上所述的基因的同源DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑑定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14，例如至少25，至少35，或至少70個核苷酸。優選地，所述核酸探針是至少100個核苷酸長度，例如，至少200個核苷酸，至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，至少500個核苷酸，至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸長度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。因此，可從由這些其它生物體製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選與上述探針雜交的DNA。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它生物體的基因組DNA或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。為了鑑定與本文中公開的核苷酸序列或其亞序列同源的克隆或DNA,將所述載體材料優選用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應本文中公開的核苷酸序列，其互補鏈，或其亞序列。使用X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42°C，在5X SSPE、0. 3%SDS、200 μ g/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴格性為25%的甲醯胺、對於中和中-高嚴格性為35%的甲醯胺、或對於高和非常高嚴格性為50%的甲醯胺,根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。使用 2X SSC、0. 2%SDS在45。。(非常低嚴格性)，在50°C (低嚴格性)，在55°C (中嚴格性)，在60°C (中-高嚴格性)，在65°C (高嚴格性)，並且在70°C (非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比根據 Bolton 和 McCarthy 計算法(1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA48:1390)得出的 Tm低大約 5 °C 至大約 10 °C，在 O. 9M NaCl,O. 09M Tris-HCl ρΗ7· 6，6mM EDTA，O. 5%NP_40，I XDenhardt 溶液，ImM 焦憐酸鈉(sodium pyrophosphate), ImM 憐酸二氫鈉(sodiummonobasic phosphate), O. ImM ATP 和 O. 2mg 每 ml 的酵母 RNA 中，根據標準的 Southern 印跡步驟進行預雜交和雜交最佳12至24小時。將所述載體材料在6X SSC加O. 1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，並用6XSSC在比計算的Tm低5°C至I (TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。同源於或互補於本文中所述的基因的核苷酸序列可使用來自其他微生物來源的以修飾所選的木黴屬菌株中的相應基因。在另一個方面，木黴屬突變體菌株中基因的修飾去除選擇性標記。選擇性標記基因的去除可通過在反選擇培養基上培養突變體來實現。在選擇性標記基因含有在其5』和3』端側翼的重複時，當對突變體菌株進行反選擇時，重複會協助選擇性標記基因通過同源重組的環出(looping out)。選擇性標記基因亦可通過同源重組去除，即將包含缺陷基因的5』和3』區、但缺乏選擇性標記基因的核酸片段導入突變體菌株，然後在反選擇培養基上選擇。通過同源重組，用缺乏選擇性標記基因的核酸片段替代了含有選擇性標記基因的缺陷基因。亦可使用其他本領域中已知的方法。應理解本發明的方法並不特別限於獲得木黴屬突變體菌株的特定順序。可在構建用於產生感興趣的多肽的菌株中的任意步驟向親本菌株導入基因的修飾。優選木黴屬突變體菌株在此種構建之前已經製成蛋白酶缺陷的。在本發明的進一步的方面，木黴屬菌株的突變體可含有對可編碼有害於感興趣的多肽的產生、回收或應用的物質的其他基因的其他修飾，例如缺失或破壞。
在一個方面，木黴屬菌株進一步包含一個或多個(幾個)編碼選自下組的蛋白水解活性的基因的修飾，例如破壞或缺失氨肽酶，二肽基氨肽酶，三肽基氨肽酶，羧肽酶，金屬蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，和液泡蛋白酶。在另一個方面，木黴屬菌株進一步包含編碼氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶的一種或多種(幾種)其他基因的修飾，例如破壞或缺失。在另一個方面，木黴屬菌株進一步包含編碼選自下組的酶的一種或多種(幾種)其他基因的修飾，例如破壞或缺失α -澱粉酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，糖酶，過氧化氫酶，纖維二糖水解酶，纖維素酶，甲殼酶，環糊精糖基轉移酶，角質酶，環糊精糖基轉移酶，脫氧核糖核酸酶，內切葡聚糖酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，葡糖腦苷脂酶，葡糖氧化酶，α-葡糖苷酶，β_葡糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，滷素過氧化物酶，半纖維素酶，轉化酶，異構酶，漆酶，連接酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，變聚糖酶(mutanase),氧化酶,果膠分解酶,過氧化物酶，磷脂酶，肌醇六磷酸酶，酚氧化酶，多酚氧化酶，核糖核酸酶，α -I, 6-轉糖苷酶，轉穀氨醯胺酶，尿激酶，木聚糖酶，和木糖苷酶。
在另一個方面，木黴屬菌株進一步包含編碼選自下組的酶的一個或多個(幾個)其他基因的修飾，例如破壞或缺失內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。在本發明的方法中，木黴屬突變體菌株在相同產生條件下培養時，優選產生與相應的親本木黴屬菌株至少相同量的感興趣的生物活性多肽。在另一個方面，突變體菌株在相同產生條件下培養時，與相應的親本木黴屬菌株相比產生優選多至少5%，更優選多至少10%,更優選多至少25%，更優選多至少50%，甚至更優選多至少75%，且最優選多至少100%生物活性多肽。將木黴屬突變體菌株在營養培養基中使用本領域已知方法培養以供產生感興趣的多肽。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。分泌的多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，可從細胞裂解物(lysate)獲得。感興趣的多肽可使用對於多肽具特異性的本領域中已知方法來檢測。這些檢測方法可包括使用特異性抗體，高效液相色譜，毛細管色譜，酶產物的形成，酶底物的消失，或SDS-PAGE。舉例而言,可使用酶測定來確定酶活性。對於許多酶,確定酶活性的步驟在本領域中是已知的(參見，例如D. Schomburg和M. Salzmann (編)，Enzyme Handbook,Springer-Verlag, New York,1990)。可通過本領域中已知的方法來分離所得的多肽。舉例而言，感興趣的多肽可從培養基通過常規方法分離，所述方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。然後，分離的多肽可進一步通過多種本領域中已知的方法來純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦(IEF))、差示溶解度(例如,硫酸銨沉澱)、或提取(參見,例如，Protein Purification, J.-C. Janson和 Lars Ryden編，VCH Publishers, New York, 1989)。感興趣的多肽可為任何對於木黴屬菌株是天然或外源(異源)的多肽。所述多肽可由單個基因或兩個或更多個基因編碼。術語「編碼多肽的多核苷酸」應理解為涵蓋涉及多肽產生的一個或多個(幾個)基因。術語「異源多肽」在本文中定義為對於宿主菌株並非天然的多肽，其中進行了結構修飾以改變天然多肽(例如天然多肽的蛋白序列)的天然多肽；或由於通過重組DNA技術(例如，較強的啟動子，編碼多肽的DNA的多拷貝)操縱多核苷酸或宿主菌株的結果其表達發生數量上變化的天然多肽。因此，本發明在術語「異源多肽」的範圍內還涵蓋天然多肽的重組產生，只要此種表達涉及使用對於木黴屬菌株並非天然的基因元件(genetic element)，或使用經操縱以不同於宿主株中正常發生的方式發揮功能的天然元件。在一個方面，多肽是對於木黴屬菌株的天然多肽。在另一個方面，多肽是對於木黴屬菌株的異源多肽。所述多肽可為任何具有感興趣的生物活性的多肽。術語多肽在本文中並不意指特定長度的編碼產物，因此，涵蓋肽、寡肽和蛋白質。術語「多肽」亦涵蓋組合以形成編碼產物的兩個或更多個多肽。多肽還包括融合多肽，其包含由至少兩個不同多肽獲得的部分或完整的多肽序列的組合，其中一種或多種(幾種)對於木黴屬菌株可為異源的。多肽進一步包括上述提及的多肽的天然出現的等位變體和工程改造變體，和雜合多肽。 在一個方面，多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、免疫擴張劑(immunodiIator)、神經遞質、受體、報導蛋白、結構蛋白或轉錄因子。在另一個方面,多肽是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。在另一個方面，多肽是乙醯甘露聚糖酯酶、乙醯木聚糖酯酶、氨肽酶、α -澱粉酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、香豆酸酯酶、環糊精糖基轉移酶、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、具有纖維素分解增強活性的GH61多肽、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖腦苷酯酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、齒素過氧化物酶、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧還酶、果膠水解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、α -I, 6-轉糖苷酶、轉穀氨醯胺酶、尿激酶、木聚糖酶或木糖苷酶。在另一個方面，多肽是白蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在另一個方面，多肽是內切葡聚糖酶。在另一個方面，多肽是纖維二糖水解酶。在另一個方面，多肽是β -葡糖苷酶。在另一個方面，多肽是具有纖維素分解增強活性的GH61多肽。在另一個方面，多肽是木聚糖酶。在另一個方面，多肽是β_木糖苷酶。在另一個方面，多肽是乙醯木聚糖酯酶。在另一個方面，多肽是阿魏酸酯酶。在另一個方面，多肽是阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一個方面，多肽是葡糖醛酸糖苷酶。在另一個方面，多肽是乙醯甘露聚糖酯酶。在另一個方面，多肽是阿拉伯聚糖酶。在另一個方面，多肽是香豆酸酯酶。在另一個方面，多肽是半乳糖苷酶。在另一個方面，多肽是葡糖醛酸酯酶。在另一個方面，多肽是甘露聚糖酶。在另一個方面，多肽是甘露糖苷酶。在本發明的方法中，木黴屬菌株的突變體是重組菌株，其包含編碼異源多肽的多核苷酸，並有利地用於多肽的重組產生。菌株優選用包含編碼異源多肽的多核苷酸的載體轉化，接著將載體整合入染色體。「轉化」意指將包含多核苷酸的載體導入宿主株，使得載體作為染色體整合物或作為自主複製的染色體外載體維持。整合一般認為是有利的，因為多核苷酸更可能在菌株中穩定維持。載體對染色體的整合可通過同源重組、非同源重組或轉座進行。編碼異源多肽的多核苷酸可從任何原核、真核或其他來源例如古菌(archaeabacteria)獲得。就本發明而言，術語「從…獲得」用於本文中與給定來源相聯意指多肽是由所述來源產生的，或由插入來自所述來源的基因的菌株產生的。在本發明的方法中，多肽亦可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合於本發明多肽的N端或C端。所述融合多肽是通過將編碼另一個多肽的多核苷酸融合於本發明的多核苷酸來產生的。用於產生融合多肽的技術在本領域是已知的，並包括連接編碼所述多肽的編碼序列，從而使得其符合讀框，且融合多肽的表達處於相同啟動子和終止子調控之下。融合多肽亦可使用內蛋白(intein)技術來構建，其中融合體在翻譯後構建(Cooper 等，1993，EMBO J. 12:2575-2583;Dawson 等，1994，Science 266:776-779)。融合多肽可進一步在兩個多肽之間包含切割位點。在融合蛋白分泌之後，該位點受切割，釋放所述兩個多肽。切割位點的實例包括但不限於Martin等，2003，J.Ind. Microbiol. Biotechnol. 3:568-576 ;Svetina 等，2000，J.Biotechnol. 76:245-251 ；Rasmussen-ffiIson 等，1997，Appl.Environ.Microbiol. 63:3488-3493 ；ffard等，1995，Biotechnology 13:498-503 ；以及 Contreras 等，1991，Biotechnology9:378-381 ； Eaton 等，1986，Biochemistry 25 : 505-512 ； Co 11ins-Rac i e等，1995, Biotechnology 13:982-987 ；Carter 等，1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6:240-248 ;以及Stevens, 2003，Drug Discovery World 4:35-48 中公開的位點。
在本發明的方法中，本發明的突變體木黴屬菌株亦可用於重組產生對於木黴屬菌株是天然的多肽。天然多肽可通過重組方式產生，即，例如將編碼多肽的基因置於不同啟動子的調控之下以增強物質的表達，通過例如使用信號序列加速其從菌株輸出，或增加編碼木黴屬菌株通常產生的多肽的基因的拷貝數。用於分離或克隆編碼感興趣的多肽的多核苷酸的技術在本領域是已知的，並包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)實現從此種基因組DNA克隆此種多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:A Guide toMethods and Application, Academic Press, New York。克隆方法可涉及將包含編碼多妝的多核苷酸的所需的核酸片段切出並分離，將片段插入載體分子，並將重組載體併入本發明的突變體木黴屬菌株，其中會複製多核苷酸的多重拷貝或克隆。多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或其任意組合。可以以多種方式操縱編碼異源多肽的分離的多核苷酸以提供多肽在本發明的突變體木黴屬菌株中的表達。取決於表達載體，在將多核苷酸序列插入載體之前對其進行操縱可為期望的或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術在本領域是公知的。可將包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構建體可操作地連接於一個或多個(幾個)調控序列，所述調控序列能夠在與調控序列相容的條件下指導編碼序列在本發明的突變體木黴屬菌株中的表達。所述調控序列可為合適的啟動子序列，其為由本發明的突變體木黴屬菌株識別、用於表達編碼多肽的多核苷酸的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄調控序列。啟動子可為任何在突變體木黴屬菌株中顯示轉錄活性的核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並可從編碼對突變體木黴屬菌株天然或異源(外源)的胞外或胞內多妝的基因獲得。用於在本發明的方法中指導核酸構建體轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO 00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W0 00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W0 96/00787)、裡氏木黴β -葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其包含在麴黴屬中編碼中性α-澱粉酶的基因，其中未翻譯的前導序列由在麴黴屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構酶的基因的未翻譯的前導序列所替代；非限制性實例包括修飾的啟動子，其包含在黑麴黴中編碼中性α-澱粉酶的基因，其中未翻譯的前導 序列由在構巢麴黴或米麴黴中編碼丙糖磷酸異構酶的基因的未翻譯的前導序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，其由本發明的突變體木黴屬菌株識別以終止轉錄。所述終止子序列與編碼異源多肽的核苷酸序列的3』末端可操作地連接。可以將在木黴屬菌株中有功能的任何終止子用在本發明中。優選的終止子從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。調控序列還可以是合適的前導序列，其為對於本發明的突變體木黴屬菌株的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼異源多肽的核苷酸序列的5』-末端。可在本發明中使用在突變體木黴屬菌株中有功能的任何前導序列。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3』末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，突變體木黴屬菌株將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA的信號。可在本發明中使用在突變體木黴屬菌株中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。調控序列還可以是信號肽編碼區，其編碼與多肽的氨基端相連的胺基酸序列，並且指導編碼多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5』端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌的多肽的編碼序列的區段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5』端可含有對於所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，可在本發明中使用指導表達的多肽進入突變體木黴屬菌株的分泌途徑，即分泌至培養基的任何信號肽編碼序列。對於突變體木黴屬菌株有效的信號肽編碼區是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質黴脂肪酶。調控序列還可以是前肽編碼區，其編碼位於多肽N端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟、活性多肽。可以從釀酒酵母α因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區。
當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基端時，將前肽序列置於緊接著(next to)多肽氨基端，並且將信號肽序列置於緊接著前肽序列的氨基端。所述核酸構建體亦可包含一個或多個(幾個)編碼一個或多個(幾個)因子的多核苷酸，所述因子有利於指導異源多肽的表達，例如，轉錄激活子(例如，反式作用因子)，分子伴侶，和加工蛋白酶。任何在突變體木黴屬菌株中起作用的因子可用於本發明。編碼一種或多種(幾種)這些因子的核酸並不需要與編碼異源多肽的核苷酸序列串聯。同樣理想的是添加調節或調控序列，其允許相對於突變體木黴屬菌株的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。絲狀真菌中的調節系統如TAKAa-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子可用作調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些調節序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(with heavy metal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調節序列可操作地連接。在本發明的方法中，包含核苷酸序列、啟動子和轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體可用於重組產生感興趣的多肽。多種核酸和本文中所述的調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是，可以通過在適當的用於表達的載體中插入核苷酸序列或包含所述序列的核酸構建體來表達所述核苷酸序列。在表達載體的製備中，將編碼序列置於載體中，從而將該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠達成核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於其與將引入該載體的突變體木黴屬菌株的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入突變體木黴屬菌株中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此夕卜，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入突變體木黴屬菌株基因組的完整DNA (total DNA),或可以使用轉座子(transposon)。所述載體優選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化的突變體木黴屬菌株。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophy to auxotrophs)等。用於突變體木黴屬菌株的選擇性標記的實例包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar (草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hpt (潮黴素磷酸轉移酶)、niaD (硝酸還原酶)(nitrate reductase)、pyrG (乳清酸核苷_5』_磷酸脫羧酶)(orotidine-5』-phosphate decarboxylase)、sC (硫酸腺苷酸轉移酶)和 trpC (鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它們的等同物。優選用於突變體木黴屬菌株的是構巢麴黴的amdS基因和吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。所述載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立於基因組的自主複製。為了整合入突變體木黴屬菌株的基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額 外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入突變體木黴屬菌株基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至
10,000鹼基對，優選400至10，000鹼基對，和最優選800至10，000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與突變體木黴屬菌株基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到突變體木黴屬菌株的基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含複製起點，其使載體能夠在突變體木黴屬菌株中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(replicator),其在細胞中發揮功能。術語「複製起點」或「質粒複製子」在本文中定義為能夠使質粒或載體體內複製的核苷酸序列。可用於突變體木黴屬菌株的複製起點的實例是AMAl和ANSI (Gems等，1991，Gene98:61-67 ;Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15:9163-9175 ；W0 00/24883)。分離AMAl基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開於WO 00/24883中的方法完成。用於連接本文中所述元件以構建重組表達載體的方法對本領域技術人員是公知的(參見，例如，J. Sambrook, E. F. Fritsch,和 T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning,Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。包含核苷酸序列的載體可通過例如轉化導入突變體木黴屬菌株，使得所述載體作為染色體整合物或作為自主複製的染色體外載體維持。整合一般認為是有利的，因為核苷酸序列更可能穩定維持於菌株中。載體整合入染色體通過同源重組、非同源重組或轉座發生。將表達載體導入突變體木黴屬菌株可涉及包括原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁再生的本身已知的過程。用於轉化木黴屬菌株的合適方法描述於Malardier等，1989,Gene 78:147-156，和 WO 96/00787。本發明通過下述實施例進一步描述，其不應視作對本發明範圍的限制。實施例菌株裡氏木黴菌株981-0-8 (D4)是裡氏木黴 RutC30(ATCC 56765;Montenecourt 和Eveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181:289-301)的誘變菌株。培養基和緩衝溶液LB培養基包含IOg的胰蛋白腖，5g的酵母提取物，和5g的氯化鈉，和去離子水加至I升。LB平板包含IOg的胰蛋白腖，5g的酵母提取物，5g的NaCl，15g的Bacto瓊脂，和去離子水加至I升。PDA平板包含39g的Potato Dextrose Agar (Difco)和去離子水加至I升。NZY頂層瓊脂糖包含5g的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的NZ胺，2g的MgSO4, 7g的瓊脂糖，和去離子水加至I升。
YEG培養基包含5g的酵母提取物，20g的葡萄糖，和去離子水加至I升。2X YT瓊脂平板包含16g的胰蛋白腖，IOg的酵母提取物，5g的氯化鈉，15g的Bacto瓊脂,和去離子水加至I升。木黴屬基本培養基平板包含30g的蔗糖，20ml的COVE鹽溶液，O. 6g的CaCl2 ·2Η20，6g的(NH4)2SO4, 25g的Noble瓊脂,和去離子水加至I升。COVE平板包含每升342. 3g的蔗糖，25g的Noble瓊脂，20ml的COVE鹽溶液，IOmM乙醯胺，和15或20mM CsCl0在高壓滅菌之前，將溶液調整至pH 7.0。C0VE2平板包含30g的蔗糖，20ml的COVE鹽溶液，IOmM乙醯胺，25g或30g的Noble瓊脂，和去離子水加至I升。COVE 鹽溶液包含 26g 的 KCl，26g 的 MgSO4 · 7H20, 76g 的 KH2PO4, 50ml 的 COVE 痕量金屬溶液，和去離子水加至I升。COVE 痕量金屬溶液包含 O. 04g 的 NaB4O7 · IOH2O, O. 4g 的 CuSO4 · 5H20,1. 2g 的FeSO4 · 7H20,0. 7g 或 Ig 的 MnSO4 · H2O, O. 8g 的 Na2MoO2 · 2H20, IOg 的 ZnSO4 · 7H20,和去離子水加至I升。COVE頂層瓊脂糖包含342. 3g的蔗糖，20ml的COVE鹽溶液，IOmM乙醯胺，IOg的低熔點瓊脂糖，和去離子水加至I升。纖維素酶誘導培養基包含20g的Arbocel-天然纖維素纖維(J. Rettenmaier USALP, Schoolcraft, MI, USA), IOg 的玉米浸潰固形物(corn steep solids) (Sigma ChemicalCo.，St. Louis, MO, USA), I. 45g 的(NH4)2SO4, 2. 08g 的 KH2PO4,0. 28g 的 CaCl2,0. 42g 的MgSO4 · 7H20,0. 42ml的痕量金屬溶液,2滴Pluronic Acid,和去離子水加至I升。在高壓滅菌之前，將pH用ION NaOH調整至6. O。搖瓶培養基包含20g的右旋糖，IOg的玉米浸潰固形物，I. 45g的(NH4)2SO4, 2. 08g的 KH2PO4,0. 36g 的 CaCl2,0. 42g 的 MgSO4 · 7H20，和 0. 42ml 的痕量金屬溶液。發酵分批培養基包含每升30g的纖維素，4g的右旋糖，IOg的玉米浸潰固形物，3. 8g 的(NH4)2SO4, 2. 8g 的 KH2PO4, 2. 64g 的 CaCl2,1. 63g 的 MgSO4 · 7H20，I. 8ml 的消泡劑，0. 66ml的痕量金屬溶液，和去離子水加至I升。發酵補料培養基包含右旋糖。痕量金屬溶液包含216g 的 FeCl3 *6H20,58g 的 ZnSO4 *7H20,27g 的 MnSO4 ·Η20，IOg的CuSO4 · 5H20, 2. 4g的H3BO3, 336g的檸檬酸，和去離子水加至I升。YP培養基包含IOg的酵母提取物，20g的Bacto蛋白腖，和去離子水加至I升。
YP+2%葡萄糖培養基包含去離子水中的1%酵母提取物，2%蛋白腖和2%葡萄糖。YP+2%麥芽糊精培養基包含去離子水中的2%蛋白腖，2%麥芽糊精，和1%酵母提取物。DAP-2C-1培養基包含去離子水中的2%葡萄糖，I. 1%硫酸鎂，I. 0%麥芽糖，O. 52%磷酸三鉀，O. 2%檸檬酸，O. 1%磷酸二氫鉀，O. l%Dowfax 63N10，O. 05%酵母提取物，和O. 05%的痕量元素溶液(I. 39%硫酸亞鐵，O. 845%硫酸錳，O. 68%氯化鋅，O. 3%檸檬酸，O. 25%硫酸銅，和O. 013%氯化鎳)。PEG 緩衝液包含 500g 的 PEG 4000, IOmM CaCl2, IOmM Tris-HCl pH7. 5，和去離子水加至I升；並過濾滅菌。STC 包含(λ 8M 或 IM 山梨醇，IOmM 或 25mM CaCl2，和 IOmM 或 25mM Tris-HCl，pH7. 5或pH 8 ;並過濾滅菌。
TE 緩衝液包含 IM Tris pH 8. O 和 O. 5M EDTA pH 8. O20X SSC包含175. 3g NaCl，88. 2g的檸檬酸鈉，和去離子水加至I升。實施例I :質粒pDM156. 2的構建粗糙脈孢菌乳清苷核苷-5』-單磷酸脫羧酶(pyr-4)基因(SEQ ID NO: 7為DNA序列，而SEQ ID N0:8為推導的胺基酸序列)的探針使用如下所述的引物通過PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-標記的脫氧尿苷-三磷酸(dUTP)來製備。引物(有義)5，-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3，(SEQ ID NO:9)引物(反義)5，-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3，(SEQ ID NO: 10)將質粒pFB6 (Buxton 等，1983, Molecular and General Genetics 190:403-405)用Hind III消化並將消化物通過使用40mM Tris鹼_20mM乙酸鈉-ImM 二鈉鹽EDTA(TAE)緩衝液的1%瓊脂糖凝膠電泳純化。將I. Ikb pyr-4片段從凝膠切出並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc. , Valencia CA, USA)依照生產商提出的實驗方案提取。擴增反應物(50μ1)包含IX Taq DNA聚合酶緩衝液(New England BiolabsInc. ,Ipswich,MA,USA),5 μ I的PCR DIG Labeling Mix(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis, IN, USA)，IOng 的 I. Ikb Hind III pyr-4 片段，IOpmol 的有義引物，IOpmol的反義引物，和 I 單位的 Taq DNA 聚合酶(New England Biolabs Inc. , Ipswich,MA,USA)。將反應物在ROBOCYCLER (StrataGene，La Jolla, CA，USA)中溫育，程序如下1 個循環在95°C進行3分鐘，接著35個循環，每個在95°C進行30秒，55°C進行I分鐘，和72 °C進行I分鐘。在72 °C進行最終延伸5分鐘。擴增反應產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化。將大約0. 78kb的異羥洋地黃毒苷配基(DIG)標記的探針從凝膠切出並使用QIAQUlCK GelExtraction Kit 提取。生成鑲片鐮孢菌株A3/5的基因組DNA文庫並克隆入λ載體EMBL4，如WO99/60137中所述。將DIG標記的探針用於篩選克隆入λ載體EMBL4的鑲片鐮孢A3/5DNA的基因組文庫。將λ卩遼菌體與大腸桿菌Κ802細胞(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)鋪板於含NZY頂層瓊脂糖的 LB 平板上。使用 Sambrook等(Molecular Cloning, Laboratory Manual,第 2 版；J. Sambrook, E. F. Fritsch,和 T. Maniatis; Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)的技術將卩遼菌斑轉印至HYBOND N尼龍膜(Amersham Biosciences,Buckinghamshire，UK)。DNA 通過使用 UVSTRATALINKER (StrataGene, La Jolla, CA, USA)的UV交聯結合於膜。然後將濾紙與0.78kb DIG標記的粗糙脈孢菌pyr-4探針雜交。pyrG克隆的雜交和檢測依照GENIUS System User’s Guide (Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)在42°C用包含5X SSC, 35%甲醯胺，0. 1%L_月桂醯肌氨酸，0. 02%SDS，和1%封閉劑(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)的雜交溶液進行。使用的DIG-標記的探針的濃度為2. 5ng每ml的雜交溶液。雜交DNA用鹼性磷酸酶綴合的抗異輕洋地黃毒苷配基抗體(Boehringer Hammheim,Manheim,Germany)免疫檢測並用 Lumiphos 530, 一種化學發光底物(Boehringer Hammheim, Manheim, Germany)顯影。DNA製備物從推定的陽性λ克隆使用 Lambda Midi Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)製備。來自上述鑑定的克隆的λ DNA用Eco RI消化並對其進行TAE緩衝液中的1%的瓊月旨糖凝膠電泳。將3. 9kb片段切出並使用QiAEX Gel Extraction Kit (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA)提取。然後將片段克隆入 pUC18 (Viera 和 Messing，1987，Methods in Enzymology 153 :3-11)的 Eco RI 位點，並用 2 μ I 的克隆反應物轉化 ONE SHOT TOPlO感受態細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。將來自八個所得的轉化體的質粒DNA通過DNA測序進行分析。選擇一個具有所需序列的克隆，並命名為pDM156.2(圖I)。pyrG片段攜帶整個編碼區加上I. 3kb的啟動子和I. 5kb的終止子。實施例2 :質粒pEmY21的構建將大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因(SEQ ID NO: 11為DNA序列，而SEQ IDNO: 12 為推導的胺基酸序列)從質粒 pPHTI (Cummings 等，1999, Current Genetics 36:371-382)使用下述引物擴增正向引物5』 -GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3』 (SEQ ID NO:13)反向引物5』 -GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3』 (SEQ ID NO: 14)將由下劃線序列表示的限制性酶位點Bst BI (正向引物)和EC047III(反向引物)通過工程引入引物以供克隆。PCR反應物(用於擴增hpt基因)包含IX ThermoPol反應緩衝液(New EnglandBiolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，各 200 μ M 的 dNTP, 50 pmol 的正向和反向引物，100 pg 的pPHTI, I 單位的VENT' DNA 聚合酶(NewEngland Biolabs Inc. , Ipswich, MAUSA),和滅菌蒸餾水，總體積為100μ I。擴增反應使用ROBOCYCLER 進行，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；25個循環，每個在95°C進行I分鐘，51°C進行I分鐘，和72°C進行2分鐘；和I個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過TAE緩衝液中的1%瓊脂糖凝膠電泳分離。將I. 8kb片段從凝膠切出並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取。然後將凝膠純化的片段使用TOPO Blunt Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)克隆入 pCR; -BluntII-TOPO(il!(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。所得質粒命名為 pEmYlO。然後將 Eco RI 位點從pEmYlO 中的 hpt 基因的編碼序列使用QUIKCHANGE Site-Directed MutagenesisKit (StrataGene, La Jolla, CA, USA)依照生產商的指示使用如下所示的引物去除,其中小寫字母代表靶Eco RI位點的未突變的核苷酸，而下劃線字母代表突變的核苷酸。所得質粒命名為pBK3。正向引物5』-GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3』 (SEQ ID NO:15)反向引物5， -CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3， (SEQ ID NO:16)將所得的不含Eco RI位點的hpt基因使用如下所示的正向和反向引物從pBK3PCR 擴增。正向引物5，-GGggtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3，(SEQ ID NO:17)反向引物5』 -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO:18)下劃線部分代表導入的用於克隆的KpnI位點。米麴黴pyrG基因的部分用於生成直接重複並使用下述弓I物從pS02 (W098/12300)PCR擴增重複I :正向引物5，-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO: 19)反向引物5』 -GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3 (SEQ ID NO :20)重複2:正向引物5，-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3，(SEQ ID NO:21)反向引物5，-TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3，(SEQ ID NO :22)下劃線部分代表導入的用於克隆的限制位點Sma I (cccggg)或KpnI (ggtacc)。將三個片段(hpt，重複#1和重複#2)在不同反應中擴增(各50 μ I)，所述反應物包含IX ThermoPol反應緩衝液，200 μ M dNTP,各O. 25 μ M的引物，50ng的模板DNA,和I單位的VENT DNA聚合酶。擴增反應使用ROBOCYCLER 進行，程序如下I個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行I分鐘，61°C進行I分鐘，和72°C進行2分鐘；和I個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過TAE緩衝液中的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約2kb擴增的hpt片段和大約O. 2kb重複片段從凝膠切出並使用MINELUTE GelExtraction Kit (QIAGENInc. , Valencia, CA, USA)提取。將兩個pyrG重複片段用KpnI消化,用小牛腸磷酸酶(NewEngland Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)脫憐酸，和用MINELUTE. Reaction CleanupKit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA，USA)依照生產商的指示處理。然後將攜帶重複#1和hpt的片段使用 QUICKLIGATION Kit (New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA, USA)依照生產商的指示連接在一起，並用MINELUTE Reaction Cleanup Kit處理，並將所得連接物使用TOPO Blunt Cloning Kit克隆入pCR II Blunt。序列分析確認一個克隆，其中重複#1和hpt片段在pCR⑧II Blunt中連接在一起。該質粒命名為pEmY18。為了將第二重複克隆入pEmY18，將pEmyl8用Eco RV消化並將消化物通過TAE緩衝液中的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化。將5. 6kb片段從凝膠切出並使用QIAQUICK GelExtraction Kit提取。將O. 2kb重複2片段(如上所述)和消化的pEmY18使用QUICKLIGATION Kit連接在一起。將連接混合物用於轉化SOLOPACIC G0ld Supercompetent細胞(StrataGene,La Jolla,CA,USA)。序列分析鑑定了其中三個組分(重複#1,hpt和重複#2)處於所需順序和取向，且沒有PCR錯誤的質粒。所得質粒命名為pEmY20。為了確保PEmY20用EcoRI的後續消化會釋放單一片段，使用QUIKCHANGE 位點-Directed Mutagenesis Kit和如下所示的正向和反向引物依照生產商的指示去除Eco RI位點。在序列驗證之後將所得質粒命名為pEmY21 (圖2)。
正向引物5』-GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3』 (SEQ ID NO :23)反向引物5』-CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3』 (SEQ ID NO :24)實施例3 :質粒pEmY23的構建將鑲片鐮孢pyrG編碼序列(2，678bp)從pDM156. 2(實施例I)通過用EcoRV和StuI限制內切酶消化而切出，並將剩餘的4，398bp載體使用QIAQUICK (id ExtractionKit依照生產商的指示凝膠純化。將pEmY21的Sma I片段分離並使用QIAQUICK GelExtraction Kit凝膠純化,並將兩個凝膠純化的片段連接在一起。對其就插入取向進行篩選，就錯誤存在與否進行測序，並選擇一個具有正確插入序列的克隆，並命名為pEmY23(圖3)。實施例4 :質粒pWTY1470-19-07的構建將攜帶鑲片鐮孢單端孢黴烯合酶(tri5)基因(SEQ ID NO:25為DNA序列，而SEQ ID NO: 26為推導的胺基酸序列)的5』和3』側翼序列的質粒pJRoy40 (美國專利號7，332，341)用作模板以供擴增5’tri5基因側翼序列的部分。PCR反應含有200 μ M dNTPs,IX Taq DNA聚合酶緩衝液，125pg的pJRoy40DNA，50pmol的各下述引物，和I單位的Taq DNA聚合酶，最終體積為50 μ I。正向引物5 -GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3 (SEQ ID NO:27)反向引物5，-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3，(SEQ ID NO :28)(下劃線核苷酸指示導入的BglII位點)。擴增反應物在ROBOCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行3分鐘；10個循環，每個在95°c進行30秒，52 °C進行45秒，和7°C進行2分鐘；20個循環，每個在95°C進行30秒，52°C進行45秒，和72°C進行5分鐘；和I個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TBE緩衝液的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約600bp的片段從凝膠切出並使用MINELUTE Gel Extraction Kit提取。將片段使用TOPO TACloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)插入 pCR_ 2. I (Invitrogen, Carlsbad,CA，USA)，並將ONE SHOT TOPlO感受態細胞用2pl的TOPO TA克隆反應液轉化。將來自八個所得轉化體的質粒DNA用Eco RI和Bgl II在不同反應中消化，並通過DNA測序確證三個具有正確限制消化樣式的轉化體的插入。選擇一個具有所需序列的克隆並命名為pffTY1470-09-05o將攜帶tri5基因5』重複的608bpBlII片段從pWTY1470-09_05通過用BglII消化釋放，通過使用TBE緩衝液的1.0%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用MINELUTE Gel Extraction Kit 提取。將質粒pJRoy40通過用Bgl II消化而直鏈化，之後將其使用蝦鹼性磷酸酶(RocheDiagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)依照生產商的指示脫磷酸，並使用QIAQlJ ICK PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)純化。將直鏈化的pJRoy40和凝膠純化的BglII片段使用T4DNA連接酶(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA)依照生產商的指示連接在一起。大腸桿菌SURE⑧化學感受態細胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)的轉化依照生產商的指示進行。一個轉化體通過DNA測序確認含有所需載體，即，攜帶tri5 5』和3』側翼序列和部分5』側翼序列的重複。所得質粒命名為 pWTY1470-19-07(圖 4)。實施例5 :質粒pWTY1515-02-01的構建對質粒pWTY1470-19_07 使用 QUIKCHANGE Site-Directed MutagenesisKit和如下所示的正向和反向引物依照生產商的指示進行體外誘變。正向引物5』-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3』 (SEQ ID NO :29)反向引物5』-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3』 (SEQ ID NO :30)誘變去除在1779bp的Bgl II位點，並使得在2386bp的Bgl 11位點稱為獨特的，並可用於後續操縱以插入攜帶胸腺嘧啶激酶(tk)和潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因盒的片段。將誘變反應用於依照生產商提出的實驗方案轉化試劑盒提供的大腸桿菌XL lO-GOLD Ultra-感受態細胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)。通過序列分析驗證，一個轉化體攜帶如上所示的突變，將其命名為pWTY1515-2-01(圖5)並在實施例8中用作骨架。實施例6 :質粒pJaL574的構建質粒pDV8 (美國專利號6，806，062)攜帶單純皰疫病毒(Herpes simplex virus)類型I胸腺嘧啶激酶(HSV1-TK ;tk)基因(SEQ ID NO: 31為DNA序列，而SEQ ID NO: 32為推導的胺基酸序列)作為插入構巢麴黴甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)啟動子的l.OkbXho Ι/BglII片段和攜帶三功能性構巢麴黴吲哚甘油磷酸合酶、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構酶和穀氨醯胺醯胺基轉移酶(trpC)轉錄終止子的1.8kb Bam HI/Hind III片段之間的I. 2kbBgl 11/Bam HI片段。將質粒pDV8用Bam HI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉澱，然後使用Klenow聚合酶(StrataGene, La Jolla, CA, USA)填充。將消化的質粒使用QUICK LIGATION Kit遵循生產商的實驗方案重新連接，用MINELUTE. GelExtractionKit處理，並將所得連接產物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生產商的指示克隆入pCR 4Blunt-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。將克隆反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞。從八個所得轉化體使用BIOROBOT 9600 (QIAGEN Inc, Valencia, CA, USA)提取質粒 DNA 並通過使用 Xho I/Bam HI 和 Xho I/Hind III的限制性消化篩選。來自兩個具有正確的限制性消化樣式的轉化體的質粒DNA的DNA測序確證兩者均攜帶所需序列。將一個命名為pJaL504-[BamHI](圖6)。將質粒PJaL504_[Bam HI]用Bgl II消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉澱，然後使用Klenow聚合酶填充。將消化的質粒使用QUICK LIGATION Kit遵循生產商的實驗方案重新連接，用MINELUTE Reaction Cleanup Kit處理，並將所得連接物使用TOPO Blunt Cloning Kit依照生產商的指示克隆入pCR 4Blunt-TOPO 。將克隆反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態大腸桿菌T0P10細胞。從八個所得轉化體使用BIOROBOT 9600提取質粒DNA，並通過使用Xho I/Bgl 11和Xho I/Hindi 11的限制性消化篩選。來自兩個具有正確的限制性消化樣式的轉化體的質粒DNA的DNA測序確認兩者均攜帶所需序列。將一個命名為 pJaL504-[BglII](圖 7)。Punt 等(1990,Gene 3 =101-109)之前顯示可缺失構巢麴黴gpdA啟動子的364 bp而不影響啟動子強度。基於這些研究者的 觀察，設計了如下所示的引物#172450以截短構巢麴黴gpdA啟動子並減小載體大小。引物172450:5，-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3， (SEQ ID NO:33)下劃線序列對應於gpdA啟動子序列。剩餘的序列為攜帶以下限制性位點的柄(handle) Eco RI, XbaI, BglII, Xho I,和 Hind III。為了截短構巢麴黴trpC終止子(同樣用於減少載體大小)，將如下所示的引物#172499設計為攜帶Eco RI柄。引物172499 :5，-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3，(SEQ ID NO:34)下劃線序列對應於trpC終止子序列。使用引物172499和172450的擴增將啟動子截短364bp並將trpC終止子序列截短239bp。用上述兩個引物使用pJaL504_[BlII]作為模板進行PCR以生成包含截短型式的構巢麴黴gpdA啟動子，HSVl-TK基因的編碼序列，和截短型式的構巢麴黴trpC終止子的2，522bp 片段。擴增反應物由5μ I 的 IOX 緩衝液(Promega Corporation, Madison, WI, USA),各O. 4μ I 的 25mM dNTP, I. 25 μ I 的引物 172450 (lOOng/μ I)，I. 25 μ I 的引物 172499 (lOOng/μ I) ,0. 5μ I 的 pJaL504-[Bgl II] (lOOng/μ I) ,2 μ I 的 PfuDNA 聚合酶(PromegaCorporation, Madison, WI, USA) (2. 5U/ μ I),和 39. 6μ I 的滅菌蒸懼水組成。將擴增反應物在ROBOCYCLER 中溫育，程序如下I個循環在95°C進行45秒；和28個循環，每個在95°C進行45秒，57 °C進行45秒，和72°C進行5分鐘。在72 °C進行最終延伸10分鐘。對擴增反應物進行使用50mM Tris_50mM硼酸-ImMEDTA 二鈉鹽(TBE)緩衝液中的低熔點瓊脂糖的1%的瓊脂糖凝膠電泳。將2，522bp片段從凝膠切出並使用Q1AQUICK Gel Extraction Kit 提取。然後將凝膠純化的 DNA 使用TOPO Blunt Cloning Kit 依照生產商的指示插入pCR 4Bhmt-TOPO 。將克隆反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT 化學感受態TOPlO細胞。從八個所得轉化體使用BIOROBOT 9600提取質粒DNA並通過使用Eco RI和BglII的限制性消化篩選。來自兩個具有正確的限制性消化樣式的轉化體的質粒DNA的DNA測序確認兩者均攜帶所需序列。將一個命名為pJaL574 (圖8)。實施例7 :質粒pWTY1449-02-01的構建將質粒PJaL574遵循生產商推薦的實驗方案轉化 入感受態大腸桿菌SCS110細胞(StrataGene, La Jolla, CA，USA)。從二十四個所得轉化體使用BIOROBOT 9600 提取質粒DNA，然後對其進行使用Eco RI和BglII的分析性消化。後續DNA序列分析導致鑑定出具有正確的序列的克隆，其命名為PWTY1449-02-01 (圖9)。實施例8 tri5缺失載體pJfyS1579-21_16的生成將大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因盒使用ADVANTAGE GCGenomicPCR Kit(Clontech，Palo Alto, CA，USA)和如下所示的基因特異性正向和反向引物從質粒pEmY23PCR擴增。反向引物中的下劃線部分引物為用於克隆的BlII位點。正向引物5』-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3』 (SEQ ID NO :35)反向引物5，-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3，(SEQ ID NO :36)擴增反應物含有362ng的pEmY23作為DNA模板，各200 μ m的dNTP，I. ImM乙酸鎂，0·4μΜ 引物，IX GC 反應緩衝液(Clontech，Palo Alto, CA, USA), 0. 5M GC Melt (Clontech,Palo Alto,CA，USA)，和 IX GC Genomic Polymerase Mix(Clontech,Palo Alto,CA，USA),最終體積為 50μ I。將擴增反應物在EPPENDOR.F MASTERCYCLE.R (Eppendorf,Munich, Germany)中溫育,程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；25個循環，每個在94°C進行30秒和66°C進行3分鐘；和I個循環在66°C進行3分鐘；和維持在4°C。通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。將大約I. 9kb的片段從凝膠切出並使用MINIELUTE Gel Extraction Kit提取。將片段使用TOPO TACloning Kit依照生產商的指示克隆入pCR 2. I。ONE SHOT T0P10感受態細胞用2 μ I的TOPO TA反應物轉化。來自8個轉化體的質粒DNA的序列分析確認與預期序列無偏差，並將質粒命名為pJfyS1540-75-5(圖10)。將hpt插入物通過用Bam HI和Bgl II消化從pJfyS1540-75_5釋放並通過TAE緩衝液中的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化。將I. 9kb的片段切出並使用MINiELUTE GelExtraction Kit提取。使用Rapid DNA Ligation Kit將該片段連接至使用小牛腸磷酸酶脫磷酸的Bgl II-直鏈化的空tri5缺失載體pWTY1515-2-01 (實施例5)。大腸桿菌SURE 化學感受態細胞用連接反應物轉化，並將來自24個所得轉化體的質粒DNA通過用Eco RI的限制消化分析以確證插入物的取向。選擇一個攜帶具有所需取向的插入物的轉化體，並命名為 pJfyS1579-l-13(圖 11)。使用pWTY1449-02-01作為模板和如下所示的基因特異性正向和反向引物PCR擴增單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因(SEQ ID NO: 31為DNA序列，而SEQ ID NO: 32為推導的胺基酸序列)。粗體序列代表導入的BglII位點。正向引物
5』-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3』 (SEQ ID NO :37)反向引物5，-CAGATAACGA AGATCT (;AGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3，(SEQ ID NO :38)擴增反應物含有IX HERCULASE_ 反應緩衝液(StrataGene，La Jolla, CA，USA)，各 200 μ M 的 dNTP, 55ng 的 pffTY1449-02-01,0. 2 μ M 引物，2%DMS0,和 2· 5 單位的HERCULASE 丨)NA 聚合酶(StrataGene, La Jolla, CA，USA)，最終體積為 50 μ I。將擴增反M物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行I分鐘；25個循環，每個在94°C進行30秒，60°C進行30秒，和68°C進行2分45秒；和I個循環在68°C進行2分45秒；和維持在4°C。將PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約2. 8kb的片段從凝膠切出並使用MINIELUTE Gel Extraction Kit純化。將片段使用TOPO TA Cloning Kit 克隆入 pCR 2. I。ONE SHOT T0P10 感受態細胞用 2μ I 的 TOPO TA反應物轉化。來自一個轉化體質粒DNA的序列分析鑑定出tk編碼序列(C1621G)中導致甘氨酸至丙氨酸的胺基酸變化的突變。使用QUIKCHANGE II XL Site-DirectedMutagenesis Kit (StrataGene, La Jolla, CA,USA)和如下所示的正向和反向引物依照生產商的指示校正該突變。小寫字母指示所需變化。16個克隆的序列分析導致選擇一個克隆，將其命名為pJfyS1579-8-6(圖12)。正向引物5』-CCCTGTTTCGGGGCCCCGAGTTGCTGG-3』 (SEQ ID NO :39)反向引物5，-CCAGCAACTCGGGGCCCCGAAACAGGG-3』 (SEQ ID NO :40)將質粒pJfyS1579-8_6用Bam HI和BglII消化以釋放2. 8kbtk片段，並將該片段如上所述進行純化。將該片段使用QUICK LIGATION Kit連接至pJfyS1579-l_13，其經用BglII直鏈化和用小牛腸磷酸酶處理，並用於依照生產商的實驗方案轉化大腸桿菌SURE 化學感受態細胞。所得質粒命名為pJfyS1579-21-16(圖13)並用作tri5缺失盒。實施例9 :攜帶胸腺嘧啶激酶(tk)陰性選擇標記和潮黴素磷酸轉移酶(hpt)陽性選擇標記的通用缺失載體的構建構建攜帶胸腺嘧啶激酶(tk)和潮黴素磷酸轉移酶(hpt)標誌物兩者的通用缺失載體以促進後續缺失質粒的裝配。對於靶向缺失的基因的5』和3』區的側翼序列可在用Pme I或Asc I (對於5』側翼序列)和SbfI或Swa I (對於3』側翼序列)消化載體之後，方便地連接至該載體。為了 PCR擴增來源於鑲片鐮孢pyrG基因的5』側翼區的直接重複，將50皮摩爾的如下所示的引物用於兩個PCR反應，反應物含有50ng的pDM156. 2，1X Pfx AmplificationBuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 6 μ I 的 dNTP IOmM 混合物，2. 5 單位的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)，和 I μ I 的 50mM MgSO4,總體積為50 μ I0引物重複#1有義引物
5』 -GTTTAAACGGCGCGCC CGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3』 (SEQ ID NO:41)反義引物5』 -TTGTCGCCCGGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3，(SEQ ID NO :42)重複#2有義引物5』 -AGTATTCCCGGG CGACAAAACAAGGCTACTGCA-3』 (SEQ ID NO :43)反義引物5』 -ATTTAAATCCTGCAGG AATACTCCAACTAGGCCTTG-3J (SEQ ID NO :44) 將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，其程序如下。對
於重複#1 :1個循環在98°C進行2分鐘；和5個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行30秒，和68°C進行I分鐘。接著進行35個循環，每個在94°C進行30秒，59°C進行30秒，和68°C進行I分鐘。對於重複#2，循環參數為I個循環在98°C進行2分鐘；和5個循環，每個在94°C進行30秒，55°C進行30秒，和68°C進行I分鐘。接著進行35個循環，每個在94°C進行30秒，56°C進行30秒，和68°C進行I分鐘。在35個循環之後，將兩個反應(即重複#1和#2)在68°C溫育10分鐘然後在10°C冷卻直至進行進一步處理。將來自兩個反應的PCR產物通過使用TAE緩衝液的O. 8%GTG_瓊脂糖(CambrexBioproducts, East Rutherford, NJ, USA)凝膠電泳分離。對於重複#1和重複#2,將大約O. 26kb 的片段從凝膠切出和使用 Ultrafree -DA 旋轉杯(Mi 11 ipore，Billerica，MA，USA)依照生產商的指示純化。然後將十微升的各純化的重複用於單個重疊PCR反應，其含有IXPfx Amplification 緩衝液，6 μ I 的 dATP, dTTP, dGTP,和 dCTP 的 IOmM 混合物，2. 5 單位的PLATINUM Pfx DNA聚合酶，和I μ I的50mM MgSO4,總體積為50 μ I。將擴增反應物在EPPENDORF⑧MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在98°C進行2分鐘；和5個循環，每個在94°C進行30秒，50°C進行30秒，和68°C進行I分鐘。然後將反應物與預溫熱的溶液混合，所述溶液含有50皮摩爾的對於重複#1的有義引物和50皮摩爾的對於重複#2的反義引物，IX Pfx Amplification緩衝液，6μ I的IOmM dNTP，2.5單位的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，和 I μ I 的 50mM MgSO4,最終體積為 50 μ I。將新的100μ I擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER' 中溫育，程序如下35個循環，每個在94°C進行30秒，58 °C進行30秒，和68°C進行I分鐘。在35個循環之後，將反應在68°C進行溫育10分鐘然後在10°C冷卻直至進一步加工。0. 5kb PCR產物(攜帶重複裝配物)如上所述通過0.8%GTG-瓊脂糖凝膠電泳分離。將質粒pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)用作載體骨架的來源以供通用缺失載體的構建。為了去除PCR4DNA的非必需部分，將2. 5yg的質粒pTter61C(W02005/074647)用Bsp LUllI和Bst XI順序消化。然後將消化的載體用南極磷酸酶(Antarctic phosphatase) (New England Biolabs Inc. , Ipswich, MA, USA)處理。將 3. Ikb消化的骨架如上所述通過0. 8%GTG-瓊脂糖凝膠電泳分離。然後將純化的重複裝配物連接至用 Rapid Ligation Kit (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA)純化的載體骨架。連接反應物組成為75ng的純化的載體骨架和3μ I的純化重複裝配物。將一微升的該連接反應物用於使用生產商的實驗方案轉化化學感受態SOLOPACK Super感受態細胞(StrataGene, Carlsbad, CA, USA)。將二十四個轉化體通過Nco I/Pme I限制消化分析。二十四個轉化體中的二十三個具有預期的限制消化樣式。隨機選擇克隆pFvRs#10用於測序以確證無PCR誘導的錯誤。測序分析顯示克隆pFvRs#10中的重複裝配物具有預期的序列，並將其命名為pAlLo 1492-24(圖14)。攜帶潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因的盒使用如下所示的基因-特異性正向和反向引物從pEmY23PCR擴增。下劃線序列代表Xma I位點，而粗體字母代表BglII位點。在各5 『端的四個「a」允許PCR產物末端的後續消化。正向引物5』 -aaaacccgggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3』 (SEQ ID NO:45)反向引物5』 -aaaacccggg AC ATCT ACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3 (SEQ ID NO:46)擴增反應物含有60ng的pEmY23，各200 μ m的dNTP，ImM乙酸鎂，O. 4 μ M引物，IXPfx Amplification 緩衝液，O. 5Μ GC Melt，和 2. 5 單位的 PLATINUM Pfx DNA 聚·合酶，最終體積為50μ I。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°c進行2分鐘；10個循環，每個在94°C進行30秒，60°C進行30秒，和68°C進行I分50秒；和I個循環在68°C進行7分鐘接著維持在4°C。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離。將大約I. 8kb的片段從凝膠切出並使用MINIELUTE Gel Extraction Kit提取。將凝膠純化的PCR產物接著用Xma I消化，並在1%瓊脂糖凝膠上運行，並如上所述再次進行凝膠純化。將QUICKLIGATION Kit用於將hpt PCR產物連接至Xma I-直鏈化的、經小牛腸磷酸酶處理的PAlLol492-24。所得質粒命名為pJfyS1579-35_2 (圖15)，並用作供胸腺嘧啶激酶基因插入的受體。單純皰疹病毒tk盒的來源是質粒pJfyS1579-8_6 (實施例8)，將插入通過用BarnHI和Bgl II消化從其釋放。通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離消化產物，將對應於2.8kb tk基因插入物的片段切出並使用MINELUTE Gel ExtractionKit提取。將QUICK LIGATION Kit用於將tk基因盒連接至Bgl II-直鏈化、經小牛腸磷酸酶處理的 pJfyS1579-35-2。所得質粒命名為為 pJfyS1579-41_ll (圖 16)。實施例10 :裡氏木黴菌株981-0-8基因組DNA提取將裡氏木黴菌株981-0-8在帶擋板的搖瓶中的50ml的YEG培養基中在28°C以200rpm 振蕩生長 2 日。將菌絲體通過使用MIRACLOTH (Calbiochem, La Jolla, CA，USA)的過濾來收穫，去離子水中洗滌兩次，並在液氮下凍結。將凍結的菌絲體通過杵和研缽磨碎至細微粉末，且使用DNEASY(S)Plant Maxi Kit (QIAGEN Inc. , Valencia, CA, USA)分離總DNA。實施例11 :裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失質粒pDAtwl8的構
建為了構建裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失盒，將裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因(SEQ ID NO: I為DNA序列，而SEQ ID NO: 2為推導的胺基酸序列)的下遊非編碼區的I. 4kb片段使用如下所示的寡核苷酸067375和067376進行PCR擴增。引物067375:5， -AAAAAACCTGCAGGGATGTAAGAGGGTTTCTTGAGGGGT-3， (SEQ ID NO:47)
引物067376:5J -AAAAAACCTGCAGG GCGGCCG CTGATAGTAGACATGATACTG-3J (SEQ ID NO :48)下劃線字母代表添加至有義和反義引物以促進克隆擴增片段的Sbf I位點，而粗體區代表導入用於後續限制性消化以去除β_內醯胺酶基因以供真菌轉化的Not I位點。擴增反應物包含300ng的裡氏木黴菌株981_0_8基因組DNA (實施例10)，各300μΜ 的 dNTP，50pmol 的引物 067375，50pmo I 的引物 067376，IX 反應緩衝液，ImM MgSO4和 2. 5 單位的 PLATINUM Pfx DNA 聚合酶(Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA, USA)。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333 (Eppendorf Scientific, Inc.，Westbury, NY, USA)中溫育,其程序如下1個循環在98°C進行5分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，58°C進行30秒，和72°C進行I. 6分鐘；和I個循環在72°C進行15分鐘。將1442bp PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠切出，並使用MINELUTE Gel Extraction Kit 提取。將 1442bp PCR 產物克隆入pCR 2· I TOPO (InvitrogenCorp. ,Carlsbad,CA,USA)並依照生產商的指示轉化入化學感受態大腸桿菌細胞。在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2X YT瓊脂平板上選擇轉化體，並在37°C進行溫育16小時。克隆片段的DNA序列通過用M13正向和反向引物的DNA測序驗證。所得質粒命名為pClonelO。類似地，將裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因(SEQ ID N0:1為DNA序列，而SEQ ID NO:2為推導的胺基酸序列)的上遊非編碼區的I. 5kb片段使用如下所示的引物067377和067374進行PCR擴增。引物067377:5J -AAAAAAGGCGCGCC GCGGCCGC AATGGATAGCTAATAATCAA-3J (SEQ ID NO: 40)引物067374:5， -AAAAAAGGCGCGCCACTGTGGGAGGGCTGTATGGACA-3， (SEQ ID NO:50)下劃線字母代表添加至有義和反義引物以協助克隆擴增片段的Asc I位點，而粗體區代表Not I位點PCR擴增在如上所述的相同條件下進行，但是使用引物067377和067374。將1530 bp PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，從凝膠切出，並使用MlNELUTE Gel Extraction Kit 提取。將 I53Obp 擴增片段克隆入 pCR 2· I TOPO 載體並依照生產商的指示轉化入化學感受態大腸桿菌細胞。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2X YT瓊脂平板上選擇，並在37°C溫育16小時。克隆片段的DNA序列通過用M13正向和反向引物的DNA測序驗證。所得質粒命名為pClonel。將質粒pClonel用Asc I消化並將消化物通過TAE緩衝液中的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化。將含有裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因片段的上遊非編碼區的1415bp片段從凝膠切出並使用MINELUTE GelExtraction Kit提取。將該插入物使用QUICK LIGATION Kit (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)依照生產商提出的實驗方案連接至經Asc I消化並經小牛小腸磷酸酶(CIP)脫磷酸的pJfyS1579-41-ll (實施例
9)。使用限制分析鑑定含有具所需取向的插入物的轉化體，並進行序列分析確證無PCR錯誤。所得質粒命名為pClonel4。構建最終裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失盒，pDAtwl8 (圖17)，即用Sbf I消化pClonelO以釋放裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因片段的I. 5kb下遊非編碼區，然後將其使用QUICKLIGATION Kit依照生產商提出的實驗方案連接至經SbfI消化並經小牛小腸磷酸酶(CIP)脫磷酸的pClonel4。然後可通過用Not I消化生成含有TrSp Δ :hpt/tk等位基因的直鏈7. 7kb片段。實施例12 :裡氏木黴原生質體生成和轉化原生質體製備和轉化使用Penttila等，1987, Gene 61 :155_164的修飾的實驗方案進行。簡言之，將裡氏木黴菌株981-0-8在25ml的補充2%(w/v)葡萄糖和IOmM尿苷的YP培養基在27°C以90rpm輕柔攬拌17小時。菌絲體通過使用Millipore Vacuum DrivenDisposable Filtration System (Mi 11 ipore, Bedford, MA, USA)過濾來收集，並用去離子水洗滌兩次和用I. 2M山梨醇洗滌兩次。生成原生質體，即，將經洗滌菌絲體在34°C以90rpm輕柔振蕩懸於含有 15mg每ml 的GLUCANEX 200G (Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)和 O. 36 單位每 ml 的殼多糖酶(Sigma Chemical Co. ,St。Louis, MO, USA)的 20ml 的 I. 2M 山梨醇中15-25分鐘。通過在400x g離心7分鐘並用冷I. 2M山梨醇洗滌兩次來收集原生質體。將原生質體使用血細胞計數器計數，並重懸於STC中至最終濃度為Ix IO8個原生質體/ml。將過量的原生質體在-80°C儲藏於Cryo I°C Freezing Container (Nalgene,Rochester, NY, USA)。將大約各10 μ g的下文實施例中所述的缺失盒用Not I (實施例13和20)或HindIII/Bgll (實施例17)消化。將每個消化反應物通過TAE緩衝液中的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，將DNA條帶從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit提取。將所得純化DNA添加至100 μ I的原生質體溶液，並輕柔地混合。添加PEG緩衝液(250 μ I)，混合，並在34°C溫育30分鐘。然後添加STC (3ml)，混合，並鋪板於補充IM蔗糖的PDA培養基。在28°C溫育16小時之後，將15ml的補充100 μ g每ml的潮黴素B的覆層PDA培養基添加至各平板，將平板在28°C溫育4-6日。實施例13 :枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失裡氏木黴菌株DAtwl8_97的生成將裡氏木黴菌株981-0-8原生質體使用實施例12中所述的方法用Not I-直鏈化的pDAtwl8轉化以缺失枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮黴素B的PDA平板上選擇一百六十六個轉化體。將轉化體傳代培養至PDA平板以生成孢子。將每個轉化體在含有25ml的纖維素酶誘導培養基pH 6. O的125ml帶擋板的搖瓶中培養，並在28°C以200rpm振蕩溫育7日。運行裡氏木黴菌株981-0-8作為對照。在接種後7日移出培養液樣品，在微離心機中以15，700xg離心5分鐘，並將上清轉移至新管。對上述上清進行使用合成底物N-琥珀醯-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基苯胺(AAPF) (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)蛋白酶測定法以確定是否有任何轉化體缺失枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。底物最初溶解於濃度為100mg/ml的二甲亞碸。然後將溶解底物50倍稀釋於IOOmM NaCl-IOOmM MOPS pH 7.0。通過在平底96孔板(Corning Inc. , Acton, MA, USA)中將各10 μ I的轉化上清添加至100 μ I的稀釋底物來起始反應。將反應平板在50°C溫育3小時，然後使用SPECTRAMAX Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)測量在 405nm 的吸光度。將裡氏木黴 DAtwl8 轉化體的蛋白酶活性與親本株裡氏木黴菌株981-0-8的相比較。
然後通過Southern分析來分析與裡氏木黴菌株981_0_8相比較顯示較低胞外蛋白酶活性的十五個轉化體。如實施例11中所述提取來自15個轉化體的基因組DNA，並取各 2 μ g 用 20 單位的 Nco I-HF (New England Biolabs, Inc. , Ipswich, MA, USA)在 37°C 消化16小時。將消化的DNA通過使用TAE緩衝液的O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分級4小時，並使用 TURBOBLOTTER (Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)遵循生產商的推薦印跡於 NYTRAN SuperCharge 膜(Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)進行16小時。將膜與502bp異羥洋地黃毒苷配基標記的枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因探針雜交，所述探針通過藉由使用如下所示 的引物067911(有義)和067912(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。引物067911(有義)GCGGTCATTTACAGTGCCTCGAATA(SEQ ID NO:51)引物996117(反義)CTGCTCTGTTAGCAATCCTCAAGCA(SEQ ID NO:52)擴增反應物(50μ I)包含 IX ThermoPol Reaction 緩衝液，5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix，IOng 的 pDAtwl8，O. 3 μ M 引物 067911，O. 3 μ M 引物 067912，和 2. 5 單位的Taq DNA聚合酶。反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，程序如下30個循環，每個在95°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行40秒(15分鐘延伸)。將五微升的PCR產物通過使用TAE緩衝液的I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進行大小選擇，用溴乙錠染色，並在UV透照器下顯色。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量增加指示。雜交在DIG Easy Hyb 緩衝液(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis,IN，USA)中在42°C進行17小時。然後將膜在高嚴格條件下在2X SSC加O. 1%SDS中在室溫洗滌5分鐘，接著在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗滌兩次各15分鐘。通過化學發光測定法(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生產商的指不檢測探針-革巴雜合物。Southern分析表明所有15個轉化體在枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因基因座中含有缺失盒的單個整合，而在其他基因座不含缺失片段的任何其他整合。選擇一個命名為裡氏木黴DAtwl8-97的菌株用於後續轉化。實施例14 :質粒pSaMe-AaXYL的構建構建質粒pSaMe-AaXYL以包含裡氏木黴纖維二糖水解酶I基因啟動子和終止子和棘孢麴黴GHlO木聚糖酶編碼序列。棘孢麴黴木聚糖酶的克隆大致遵循H. Dalb0ge等，1994，Mol. Gen. Genet. 243 :253-260概述的總體表達克隆實驗方案。從棘孢麴黴CBS 101. 43菌絲體分離RNA。將Poly (A) +RNA從總RNA通過寡聚(dT)纖維素上的層析分離。如 Maniatis 等(Molecular cloning :laboratory manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1982)所述合成雙鏈 cDNA。在合成之後，將 cDNA 用綠豆核酸酶處理，用T4DNA聚合酶平端化，並連接於非回文的Bst XI銜接頭(Invitrogen,Carlsbad, CA，USA)。將cDNA通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳進行大小分級，其中將600bp至4000bp範圍的片段用於文庫構建。將DNA在GALl啟動子和異_1_細胞色素c終止子之間連接入BstXI-消化的pYES 2. 0，並轉化入大腸桿菌MC1061細胞(StrataGene，La Jolla, CA，USA)。將文庫鋪板於LB平板並在37°C溫育過夜。將菌落從平板刮取，並重懸於補充IOOyg每ml的氨節青黴素的LB培養基。使用Plasmid Midi Kit (QIAGEN Inc.,Valenicia, CA, USA)分離質粒DNA。將純化的質粒DNA匯集。將純化的質粒DNA混合物轉化入釀酒酵母W3124細胞(MATa;ura 3-52 ;leu
2-3,112 ;his 3-D200 ;pep 4-1137 ；prcl::HIS3；prbl: LEU2 ；cir+ ；van denHazel 等，1992，Eur. J. Biochem. 207 :277-283)。培養、轉化和培養基如 Guthrie 等，1991，Meth.Enzymol. Vol 194, Academic Press所述。將轉化細胞在30°C鋪板於含有2%葡萄糖的合成完全瓊脂3日，在3日之後,將菌落複製鋪板至含2%半乳糖的SC培養基(Sherman,2002, Methods Enzymol. 350 :3-41),並在30 °C溫育4日。表達木聚糖酶的菌落通過含 O. 1%AZCL-Birch-Xylan 的 1% 瓊脂糖覆層在 pH 4. 5 鑑定(D Dalb0ge, 2006，FEMSMicrobiology Reviews 21 :29_42)。表達木聚糖酶活性的菌落有藍色區圍繞。從陽性克隆拯救的質粒DNA含有大約I. 3kb的DNA插入物。分離的基因片段的測序揭示了 1218bp開讀框，其編碼具有43. OkDa的理論分子量的多肽。將cDNA片段亞克隆入用Bam HI和Xho
I消化的麴黴屬表達載體 pHD464(D Dalb0ge和 Heldt-Hansen, 1994, Mol. Gen. Genet. 243, 253 - 260)，即用 Bam HI 和Xho I 切割克隆，並分離 I. 2kb cDNA插入物(Christgau等，1996，Biochem. J 319:705-712)以生成質粒 pA2X2。對棘孢麴黴GHlO木聚糖酶編碼序列使用質粒pA2x2作為模板和如下所示的引物153505和153506使用標準方法進行PCR擴增以得到大約I. 2kb片段。將I. 2kb片段用BamHI和Xho 1(已導入PCR引物)消化，並克隆入載體pCaHj527(W0 2004/099228)。所得質粒命名為pMT2155，其中cDNA處於來自黑麴黴的中性澱粉酶11 (NA2)啟動子和來自黑麴黴的AMG終止子的轉錄調控之下。引物153505:5， -TCTTGGATCCACCATGGTCGGACTGCTTTCAATCACC-3』 (SEQ ID NO:53)引物153506:5， -TTAACTCGAGTCACAGACACTGCGAGTAATAGTC-3』 (SEQ ID NO:54)設計兩個如下所示的合成寡核苷酸引物以從質粒pMT2155PCR擴增棘孢麴黴GHlO基因，並將用於插入的側翼區導入表達載體PMJ09 (W0 2005/056772)。粗體字母代表編碼序列，而剩餘的序列與PMJ09的插入位點同源。正向引物5，-cggactgcgcaccatggt.CggactgCttt.caat -3，(SEQ ID NO :55)反向引物5，-tcgccacggagcttattcacagacactgcgagtaat-3，(SEQ ID NO:56)擴增反應物包含50皮摩爾的上述各引物，50ng的pMT2155，I μ I的IOmM的dATP，dTTP, dGTP 和 dCTP 的混合物，5 μ I 的 10Χ ACCUTAQ DNA 聚合酶緩衝液(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)，和 5 單位的 ACCUTAQ DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich，St. Louis,MO, USA)，最終體積為 50 μ I。將EPPENDORF , MASTERCYCLER 5333 用於擴增 DNA 片段，其程序如下1個循環在95°C進行3分鐘；和30個循環，每個在94°C進行45秒，55°C進行60秒，和72°C進行I分30秒。在30個循環之後將反應物在72°C進行溫育10分鐘然後冷卻至4°C直至進一步加工。反應產物通過使用TAE緩衝液的I. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將I. 2kb產物條帶從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示純化。然後將片段使用IN-FUSION Cloning Kit (Clontech, Inc.，Palo Alto, CA, USA)克隆入PMJ09。將載體用Nco I和Pac I消化並通過如上所述的瓊脂糖凝膠電泳純化。將I. 2kb基因片段和消化的載體在反應中連接在一起得到表達質粒pSaMe-AaXYL，其中家族GHlO基因的轉錄處於裡氏木黴cbhl啟動子的調控之下。連接反應物(50 μ I)包含IXIN-FUSI0N 緩衝液(Clontech, Inc.，Palo Alto, CA, USA)，IX BSA, I μ I 的 IN-FUSION 酶(I : 10 稀釋)(Clontech, Inc. , Palo Alto, CA, USA), IOOng 的用 Nco I 和 Pac I 消化的pAlLo2，和IOOng的棘孢麴黴GHlO木聚糖酶純化的PCR產物。將反應物在室溫溫育30分鐘。將一 μ I的反應物用於依照生產商轉化大腸桿菌XLlO SOLOPACK. Gold細胞(StrataGene, La Jolla, CA, USA)。含有pSaMe-AaXYL(圖18)的大腸桿菌轉化體通過限制酶消化檢測，並使用BIOROBOT 9600製備質粒DNA。來自pSaMe-AaXYL的棘孢麴黴GHlO基因的DNA測序使用染料終止子化學(Giesecke等，1992, Journal of Virology Methods38 :47-60)和引物步移策略進行。實施例15 :枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺陷菌株DAtwl8_97中的棘孢麴黴GHlO木聚糖酶表達原生質體依照實施例12中描述的步驟從枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺陷菌株裡氏木黴DAtwl8-97生成，並用含有棘孢麴黴GHlO木聚糖酶編碼序列的裡氏木黴表達構建體PSaMe-AaXYL(實施例14)轉化以確定由裡氏木黴DAtwl8_97表達的棘孢麴黴木聚糖酶GHlO的穩定性。通過將大約3 μ g的經Pme I消化並經凝膠純化的pSaMe-AaXYL添加至100 μ I的原生質體溶液並輕柔地混合來進行轉化。添加PEG緩衝液(250 μ I)、混合，並在37°C溫育30分鐘。然後添加STC (3ml)，混合，並鋪板於COVE平板。將平板在28°C溫育7-10日。在C0VE2平板上的單輪孢子純化之後，將20個轉化體在含有25ml的纖維素酶誘導培養基的小規模搖瓶中在28°C生長5日，之後通過在微離心機中在15，700xg離心10分鐘來收集上清。棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的表達使用8_16%CRITERI0N Tris-HCl凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules, CA,USA)與CRITERION Cell (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，USA)進行分析。將5 μ I的第5日樣品懸於2Χ濃度的Laemmli Sample緩衝液(Bio-RadLaboratories, Hercules, CA, USA),並在5%β -巰基乙醇的存在下在95°C加熱5分鐘。將所有樣品加載於CRITERION Tris-HCl凝膠，並在IX Tris/Glycine/SDS運行緩衝 液(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)中進行電泳。將所得凝膠用 BI0-SAFE Coomassie Stain (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)染色。培養物的 SDS-PAGE概貌顯示主要是全長棘孢麴黴GHlO木聚糖酶蛋白的存在，但亦有以較低量存在的較小片段。結果表明用於產生棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的缺失並未完全阻止蛋白質的蛋白水解。實施例16 :裡氏木黴天冬氨酸蛋白酶基因缺失質粒PAgJglll的構建構建缺失載體pAgJglll以破壞裡氏木黴42kDa天冬氨酸蛋白酶(SEQ ID NO: 3為DNA序列，而SEQ ID NO: 4為推導的胺基酸序列)在裡氏木黴菌株981-0-8中的表達。首先通過使用如下所示的引物066694(有義)和066695(反義)擴增天冬氨酸蛋白酶編碼區加減編碼區的上遊和下遊600bp來生成質粒pAgJgllO。
引物066694(有義)ACGAATGGTCAAAGGACTATGTATCAT(SEQ ID NO :57)引物066695(反義)CACATACCCAGAGTCAGGCCCTGCG(SEQ ID NO :58)天冬氨酸蛋白酶區通過PCR在反應中擴增，反應物包含316ng的裡氏木黴菌株981-0-8 基因組 DNA (實施例 10), I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶(StrataGene,LaJolla, CA, USA) ,50pmo I 的引物 066694，50pmo I 的引物 066695，5μ I 的 10 mM dNTP, 5 μ I的 5Χ Herculase II 反應緩衝液(StrataGene, LaJolla, CA, USA)，和 35 μ I 的水。將反應物在EPPENDORF MAST_ERCYCLE.R 5333中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，60°C進行20秒，和72°C進行I分30秒；I個循環在72°C進行3分鐘；和4°C維持。將2. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液1%的瓊脂糖 凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中對片段添加3』 A-懸突，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol緩衝液(New EnglandBiolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，0. 5 μ I 的 IOmM dNTP, 0· 5 μ I 的 Taq DNA 聚合酶，和3μ1的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將天冬氨酸蛋白酶基因片段依照生產商的指示克隆入pCR 2.1-TOPO 以生成pAgJgllO。克隆反應物包含2μ I的天冬氨酸蛋白酶 PCR 片段，I μ I 的鹽溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 μ I 的水，和 I μ I 的pCR 2.1-TOPO 。為了構建質粒pAgJglll，將pAgJgllO在反應中用Bmg I和BstEII消化，反應物包含 5μ g 的 pAgJgllODNA，3y I 的 Bmg I，3 μ I 的 BstEII，10 μ I IOXNEB Buffer 3 (NewEngland Biolabs, Inc, Ipswich,MA,USA), I μ I IOOX BSA,和 53 μ I 的水。將pAgJgllO 的消化物在37°C溫育I小時，然後在60°C溫育I小時。然後通過添加各10 μ I的IOmM dNTP，和12. 5 單位的 DNA聚合酶 I,大(Klenow)片段(New England Biolabs, Inc, Ipswich,MA,USA)將消化的PAgJgllO平端化。將反應物在37°C溫育15分鐘。將消化的、平端化的pAgJgllO通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳來純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將質粒pHT (Cummings 等，1999, Current genetics 36 :371-382)在反應中用 HindIII 和 Ava I 消化，反應物包含 I. 86 μ g 的pHT DNA，3yl 的 Hind ΙΙΙ，3μ1 的 Ava Ι,ΙΟμ I的 IOX NEB BUFFER 2 (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA)，和 51 μ I 的水，在37°C進行2. 5小時，然後通過添加10 μ I的IOmMdNTP和12. 5 μ I單位的DNA聚合酶I，大(Klenow)片段和在37°C溫育15分鐘來平端化。將消化的、平端化的pHT通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，並將I. 9kb片段從凝膠切出並使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。在反應中使用T4DNA Ligase將來自pAgJgllO和pHT的所得片段連接在一起以形成PAgJglll (圖19)，反應物包含88ng的pHT片段，106ng的pAgJgllO片段，I. 5 μ I的IOX T4DNA Ligase Buffer(New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA), I μ I 的 T4DNALigase (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),和 0·5μ1 的水。
實施例17 :天冬氨酸蛋白酶基因缺失裡氏木黴菌株AgJgl 11-50的生成使用實施例12中所述的方法用Hind II I/Bgl I-直鏈化的pAgJglll轉化裡氏木黴菌株981-0-8原生質體以缺失天冬氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮黴素B的PDA平板上選擇了九十個轉化體。將轉化體傳代培養至PDA平板以生成孢子。在天冬氨酸蛋白酶基因座中含有pAgJglll缺失載體，由此破壞天冬氨酸蛋白酶的表達的裡氏木黴菌株981-0-8的可能候選物，是通過使用Suzuki等,2006,J. Bioscience and Bioengineering 102 :572-574 的修飾的實驗方案的 Fungal ColonyPCR進行篩選的。將來自各候選物的少量孢子懸於25μ I的TE緩衝液，並在微波爐中以高檔位和加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選天冬氨酸蛋白酶缺失。反應物包含1μ I的孢子懸液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2Χ ADVANTAGE⑧ GC-Melt LA 緩衝液(Clontech，Mountain View, CA, USA) ,25pmol 的引物 066694(16)，25pmol 的引物 066695(實施例 16),1. 25 單位的 ADVANTAGE GCGenomic LAPolymerase Mix (Clontech, Mountain View, CA, USA),和 9. 25 μ I 水。將反應 物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行4分30秒；I個循環在72°C進行5分鐘；和4°C維持。用於該篩選的引物起初用於擴增天冬氨酸蛋白酶區。若將缺失載體插入天冬氨酸蛋白酶基因座，擴增的PCR片段應大於野生型片段，因為其含有用於破壞天冬氨酸蛋白酶基因的hph盒。對在第一 Fungal Colony PCR篩選中顯示一個較大條帶的候選物使用如下所示的引物進行第二 PCR篩選。引物068331(有義)ATATCTCTCTCGAGGCCTGCTTATT(SEQ ID NO:59)引物067947(反義)CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA(SEQ ID NO:60)引物068331在缺失菌株中含有的天冬氨酸蛋白酶基因的5』區上遊，且引物067947在hph盒中。僅那些含有天冬氨酸蛋白酶破壞的候選物會產生PCR片段。擴增反應包含1μ I的來自候選物的基因組DNA(依照實施例10提取)，各Iy I的IOmM dNTP,12. 5μ I的 2XADVANTAGE_ (;C-Melt LA Buffer, 25pmoI 的引物 068331，25pmol 的引物 067947，0. 25μ I I. 25 單位的ADVANTAGE GC Genomic LA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 的水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER. 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行2分鐘；1個循環在72°C進行5分鐘；和4°C維持。進行了 Southern印跡分析以確證通過質粒pAgJglll的天冬氨酸蛋白酶基因破壞。基因組DNA從缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8如實施例10中所述提取。將兩μ g的來自缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8的基因組DNA，以及Ing的來自pAgJglll的質粒DNA用Nco I和PvuII消化。將裡氏木黴菌株981-0-8和pAgJglll包括在Southern印跡中作為對照。基因組DNA消化反應物包含2 μ g的基因組DNA，I μ I的Nco I，I μ I的PvuII，5μ I的10ΧΝΕΒ BUFFER 2，和水至50 μ I。將兩種基因組DNA消化物在37°C溫育大約14-16小時。將質粒PAgJglll在反應中消化，反應物包含Ing的pAgJglllDNA，0. 5μ I的Nco I，O. 5μ I的ΡνιιΙΙ，2μ I的10Χ NEB BUFFER 2，和水至20μ I。將消化物在37°C溫育大約I小時。對消化物進行使用TAE緩衝液的O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳，並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜進行14-16小時。將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴42kDa天冬氨酸蛋白酶探針雜交，所述探針通過藉由使用如下所示的引物068128(有義)和068129(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。引物068128(有義)AGTCAGGTTCAGCAGATCGCCAGGGATGG(SEQ ID NO:61)引物O68I29 (反義)GTGGTTCTCCAACGCCGCCAGCAGC(SEQ ID NO:62)
擴增反應物包含5μ I的IOX ThermoPol Reaction緩衝液，2. 5 μ I的PCRDIG Labeling Mix，2ng 的 pAgJglll，50pmol 的引物 068128，50pmol 的引物068129，2. 5 μ I的IOmM dNTP, 5單位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。將反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，其程序如下1個循環在95°C進行
2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行40秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將PCR反應產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。雜交在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行15_17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65 °C在O. 5XSSC加O. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生產商的指示進行。含有天冬氨酸蛋白酶缺失的菌株命名為裡氏木黴AgJgl11-50。實施例18 :天冬氨酸蛋白酶缺陷菌株AgJgl 11-50中的棘孢麴黴GHlO木聚糖酶表達為了確定42kDa天冬氨酸蛋白酶的缺失是否有效地消除了棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的降解，將含有棘孢麴黴GHlO木聚糖酶編碼序列的質粒pSaMe-AaXYL (實施例14)轉化入裡氏木黴AgJgl 11-50。裡氏木黴AgJgl 11-50的原生質體如實施例12中所述生成，並用質粒pSaMe-AaXYL轉化。從COVE平板隨機選擇含有棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的二十個轉化體，並在含有25ml的纖維素酶誘導培養基pH 6. O的125ml搖瓶中培養，所述搖瓶用轉化體孢子接種，並在28°C在200rpm振蕩溫育5日。運行裡氏木黴菌株981-0-8和裡氏木黴AgJglll-50兩者作為對照。在接種後5日移出培養液樣品，在微離心機中在15，700xg離心10分鐘，並將上清轉移至新管。通過使用8-16%CRITERI0N Tris-HCl 凝膠與 CRITERION Cell 的 SDS-PAGE 分析上清。將五μ I的第5日樣品懸於2Χ濃度的Laemmli Sample Buffer,並在5%β -巰基乙醇存在下在95°C進行加熱5分鐘。將所有樣品加載於SDS-PAGE凝膠上，並在IX Tris/Glycine/SDS運行緩衝液中進行電泳。將所得凝膠用BI0-SAFE Coomassie Stain染色。SDS-PAGE分析表明用於產生棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的天冬氨酸蛋白酶基因缺失並未完全阻止蛋白質的蛋白水解。天冬氨酸蛋白酶缺失菌株裡氏木黴AgJglll-50並未展示任何蛋白的任何不尋常的表達樣式，並與親本株裡氏木黴菌株981-0-8表現類似。實施例19 :裡氏木黴胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失質粒pAgJgll6的構建構建缺失載體pAgJgll6以破壞裡氏木黴25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因(SEQ ID NO: 5為DNA序列，而SEQ ID NO:6為推導的胺基酸序列)的表達。首先通過擴增5』和3』側翼區並將其克隆入載體pCR 2.1-TOPO 來生成質粒pAgjgiie。5』側翼區包含25kDa絲氨酸蛋白酶編碼區上遊的區，和25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶編碼區的一部分。5』側翼區使用如下所示的引物067518(有義)和067519(反義)擴增。將引物067518工程改造為在引物5』端含有Asc I和Not I位點。將引物067519工程改造為在引物5』端含有Asc I位點。引物067518(有義)AAAGGCGCGCCGCGGCCGCGAAGAAGAAGAAGAACGTGAAAGAG(SEQ IDN 0:63)引物O675I9 (反義)
·
AAAGGCGCGCCCGGTCGAGCCGGCCACGGGGTCGGA(SEQ ID NO:64)胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的5』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組DNA (實施例10) , I μ I的Herculase II Fusion DNA聚合酶，50pmol 的引物 067518，50pmol 的引物 067519，各 5μ I 的 IOmM dNTP, 5 μ I 的 5ΧHerculase II 反應緩衝液(StrataGene, LaJolla, CA, USA),和 31 μ I 的水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，60°C進行20秒，和72°C進行45秒；1個循環在72°C進行3分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QlAQUICIC Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含 5 μ I 的純化 PCR 片段，I μ I 的 IOX Thermopol 緩衝液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的5』區在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO ,反應物包含2. 5μ I的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶5』區PCR片段，I μ I的鹽溶液，I. 5 μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得質粒命名為5』 SP-TOPO0將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的3』區使用如下所示的引物067520(有義)和067521 (反義)克隆入pCR 2.- ΡΟ ,,將引物067520工程改造為在引物5』端含有SbfI位點。將引物067521工程改造為在引物5』端含有SbfI和Not I位點。引物067520(有義)AAACCTGCAGGTCACCACCGCTGGCTGGTAAGCATCATC(SEQ ID NO:65)引物O6752U 反義)AAACCTGCAGGCGGCCGCACAAAGCTAGGAGTCTTGACGTGAT(SEQ ID NO:66)將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的3』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175yg的裡氏木黴基因組DNA(實施例10)，1μ1的Herculase II Fusion DNA聚合酶，50pmol 的引物 067520，50pmoI 的引物 067521，5 μ I 的 IOmM dNTPs, 5 μ I 的 5Χ Herculase
II反應緩衝液，和31 μ I的水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，60°C進行20秒，和72°C進行45秒；1個循環在72°C進行3分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAC5UICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOXThermopol緩衝液，O. 5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的5』區依照生產商的指示在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO ,反應物包含2. 5 μ I的5』胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶區PCR片段，I μ I的鹽溶液，I. 5μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得質粒命名為3』 SP-TOPO0將質粒5』 SP-TOPO用AscI消化並在反應中克隆入AscI消化的質粒pJfyS1579-41-ll(實施例9)，反應物包含12. 4 μ g的消化的5，SP-TOPO質粒DNA, 5 μ I的AscI,10 μ I 的 IOX NEB BUFFER 4 (New England Biolabs，Inc，Ipswich，MA，USA)，和 55 μ I的水。將限制性酶消化物在37°C溫育2小時。將消化物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，其中將I. 5kb片段從凝膠切出並使用QIAQU丨CK Gel ExtractionKit依照生產商的指示提取。將AscI消化的5』 SP-TOPO片段在反應中連接至AscI消化 的 pJfyS1579-49-ll，反應物包含 282ng 的 AscI 消化的 5』SP-TOPO，120ng 的 Asc I 消化的pJfyS1579-49-ll,2 μ I 的 Quick Ligase(New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),15 μ I 的 2X Quick Ligase Buffer(New England Biolabs,Inc,Ipswich,MA,USA),和 2 μ I的水。將連接反應物在室溫溫育15分鐘。所得質粒命名為pJfyS1579+5』 SP。為了構建質粒pAgJgll6，將質粒 3』SP-T0P0 和 pJfyS1579+5』SP 用 SbfI 消化。消化物包含 7. 5μ g 的 P JfyS 1579+5』SP 或 12. 5μ g 的 3，SP_T0P0，5y I 的 SbfI, 10 μ I 的 10ΧNEB BUFFER 4，和55 μ I的水。將兩種消化反應物在37°C溫育過夜。將兩μ I的小牛小腸鹼性磷酸酶(CIP)添加至pJfyS1579+5』 SP消化反應物並在37°C再溫育一小時。將來自pJfyS1579+5SP/Sbf I 的 9. 5kb 片段和來自 3SP_T0P0/SbfI 的 I. 5kb 片段通過使用 TAE 緩衝液的0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳純化,從凝膠切出，並使用Q丨AQUICK. Gel ExtractionKit依照生產商的指示提取。將SbfI消化的3』SP-T0P0片段在反應中連接至SbfI消化的PJfyS1579+5』SP 片段，反應物包含 767ng 的 Sbf I 消化的 3』SP-T0P0, 380ng 的 Sbf I 消化的 pJfyS1579+5』SP，2y I 的 Quick Ligase, 15 μ I 的 2Χ Quick Ligase Buffer，和 1μ I 的水。將連接反應物在室溫溫育20分鐘。所得質粒命名為pAgJgll6(圖20)。實施例20 :胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失裡氏木黴菌株AgJgl 16-19的生成用Not I-直鏈化的PAgJgll6使用實施例12中所述的方法轉化裡氏木黴菌株981-0-8原生質體以缺失胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。在含有25yg每ml的潮黴素B的PDA平板上選擇九十個轉化體。將轉化體傳代培養至PDA平板以生成孢子。將含有缺失載體pAgJgll6的裡氏木黴菌株981-0-8的轉化體在含有25ml的纖維素酶誘導培養基pH 6. O的125ml搖瓶中培養，所述搖瓶用轉化體的孢子接種並在28°C在200rpm振蕩溫育5日。運行裡氏木黴菌株981-0-8作為對照。在接種後5日移出培養液樣品，在微離心機中在15，700xg離心10分鐘，並將上清轉移至新管。對各轉化體的上清使用合成底物Val-Leu-Lys 4_硝基苯胺(Bachem AG，Bubendorf, Switzerland)測定蛋白酶活性。首先將底物以100mg/ml的濃度溶解於二甲亞碸。然後將溶解的底物用IOOmM NaCl-IOOmM MOPS pH 7. O稀釋200倍。通過將10 μ I的各轉化體上清添加至平底96孔板中的100 μ I的稀釋底物來起始反應。將反應平板在50°C溫育30分鐘，然後使用SPECTRAMAX Microplate Reader測量405nm的吸光度。使用如下所示的引物對展示很少至沒有蛋白酶活性的轉化體進行PCR篩選。引物068155(有義)GCTGTTTGGCCCTCGAAACTGCCGG(SEQ ID NO:67)引物067947(反義)CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA(SEQ ID NO:68)引物068155在缺失菌株中含有的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的5』區上遊，而引物067947在hph盒中。僅那些含有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶破壞的候選物會產生PCR片段。PCR篩選通過Fungal Colony PCR依照實施例17中所述的修飾的實驗方案進行。將 來自各候選物的少量孢子懸於25 μ I的TE緩衝液中，並在微波爐中以高檔位加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選天冬氨酸蛋白酶缺失。反應物包含I μ I 的孢子懸液，各 I μ I 的 IOmM dNTP, 12. 5μ I 的 2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 緩衝液，25pmol 的引物 068155，25pmoI 的引物 067947,1. 25 單位的ADVANTAGE GC GENOMELA POLYMERASE Mix，和9· 25 μ I 水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下I個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行2分30秒；1個循環在72°C進行5分鐘；和4°C維持。進行了 Southern印跡分析以確證通過載體pAgJgll6的25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的破壞。從缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8依照實施例10提取基因組DNA。將來自缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8的兩μ g的基因組DNA，以及Ing的來自pAgJgll6的質粒DNA用Nco I和Sac I消化。裡氏木黴菌株981-0-8和pAgJgll6包括在Southern印跡中作為對照。將基因組DNA在反應中消化，反應物包含2 μ g的基因組DNA，I μ I的NcoΙ, μ 的Sac Ι，5μ1 的 10Χ NEB BUFFER I (New England Biolabs, Inc, Ipswich, MA, USA),0. 5 μ I的IOOX BSA，和水，反應體積為50 μ I。將兩種消化物在37°C溫育大約14-16小時。將質粒pAgJgll6在反應中消化，反應物包含Ing的PAgJgll6DNA，0. 5 μ I的Nco Ι，0· 5 μ I的 Sac Ι，2μ I 的 10Χ NEB BUFFER 1，(λ 2μ I 的 100Χ BSA，和水，反應體積為 20 μ I。將消化物在37 °C溫育大約I小時30分鐘。對消化物進行使用TAE緩衝液的0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳，並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜14-16小時。將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶探針雜交，所述探針通過在使用如下所示的引物068128(有義)和068129(反義)的PCR過程中併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。引物068233(有義)CAACCCAAAGATATCGCCAGATCCA(SEQ ID NO:69)引物068234(反義)ACGATAAACTCCCCCACGGCTGAAG(SEQ ID NO:70)擴增反應物包含5 μ I 的 10X ThermoPol Reaction 緩衝液，2. 5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix，2ng 的 pAgJgll6，50pmol 的引物 068233，50pmol 的引物 068234，2. 5μ I的IOmM dNTPs, 5單位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育,程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個循環在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行40秒；I個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將PCR產物通過使用TAE緩衝液I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進行大小選擇，從凝膠切出，並使用QIAQUlCK(S)Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15-17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗滌5分鐘接著在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗滌兩次各15分鐘。探針-靶雜合物的檢測是遵循生產商的指示通過化學發光測定法進行的。確證數個轉化體含有胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺失。選擇一個轉化體並命名為裡氏木黴Agjgll6-19。實施例21 :胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺陷菌株Agjgll6_19中的棘孢麴黴GHlO木聚糖酶表達為了確定25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的缺失是否有效地阻止重組表達 的棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的降解，將包含棘孢麴黴GHlO木聚糖酶編碼序列的質粒pSaMe-AaXYL(實施例14)轉化入裡氏木黴Agjgll6_19菌株。如實施例12中所述生成裡氏木黴AgJgl 16-19的原生質體，並用質粒pSaMe-AaXYL轉化。從COVE平板隨機選擇三十六個含有棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的轉化體，並在含有25ml的纖維素酶誘導培養基pH 6. O的125ml搖瓶中培養，所述搖瓶用轉化體的孢子接種並在28°C在200rpm振蕩溫育5日。運行裡氏木黴菌株981-0-8和裡氏木黴Agjgll6-19兩者作為對照。在接種後5日移出培養液樣品，在微離心機中在15，700x g離心10分鐘，並將上清轉移至新管。上清通過使用8-16%CRITERI0N Tris-HCl 凝膠與 CRITERION Cell 的 SDS-PAGE分析。將五μ I的第5日樣品懸於2Χ濃度的Laemmli Sample Buffer,在5% β -巰基乙醇存在下在95°C進行加熱5分鐘。將所有樣品加載於SDS-PAGE凝膠上並在IX Tris/Glycine/SDS運行緩衝液中進行電泳。將所得凝膠用BIO-SAFE Coomassie Stain染色。SDS-PAGE分析表明所有表達棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的轉化體均未產生任何木聚糖酶降解的痕跡。同樣，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺失菌株裡氏木黴AgJgl 16-19並未展示任何蛋白的任何不尋常的表達樣式，並與親本株裡氏木黴菌株981-0-8表現類似。顯示裡氏木黴菌株981-0-8中25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的缺失有效地消除了棘孢麴黴GHlO木聚糖酶的降解。實施例22 :裡氏木黴ku70基因缺失質粒pAgJgll5的構建構建缺失載體PAgJgll5以破壞裡氏木黴ku70基因。需要破壞ku70以增加裡氏
木黴中基因靶向的效率。首先通過擴增5』和3』側翼區並將其克隆入載體pCR 2.1-TOPO 來生成質粒pAgJgll5。1.5kb 5』側翼包含ku70基因上遊的區以及ku70編碼序列的一部分。使用如下所示的引物067491(有義)和067492(反義)擴增5』側翼區。將引物067491工程改造為在引物5』端含有Asc I和Not I位點在。將引物067492工程改造為在引物5』端含有Asc I位點。引物067491(有義)5』 -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCCCATGGTGAGAAGCCGGGTTCGGGAG-3』 (SEQ ID NO:71)
引物067492(反義)5，-AAAGGCGCGCC AGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCC-3，(SEQ ID NO :72)ku70基因的5』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組 DNA, I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶，50pmol 的引物 067491, 50pmol 的引物067492，5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 5Χ Herculase II Reaction 緩衝液(StrataGene)JP31 μ I的水。將反應物在EPPENDORF⑧MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，61°C進行20秒，和72°C進行45秒；1個循環在72°C進行3分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用Q丨AQLMCK. Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化 PCR 片段，I μ I 的 IOX Thermopol 緩衝液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, I μ I 的 Taq DNA 聚合酶，和3μ1的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將ku70片段的5』區在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反應物包含2. 5μ I的5』側翼ku70PCR片段，1μ I的鹽溶液， μ 的水，和1μ I的pCR 2.1-TOPO ，並將2μ I的反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT T0P10 化學感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen，Inc.，Carlsbad, CA，USA)。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素2X YT瓊脂平板上選擇，並在37°C溫育16小時。所得質粒命名為5』 ku70-T0P0o將ku70片段的3』區使用如下所示的引物067493(有義)和067494(反義)克隆入pCR 2.1-TOPO 。將引物067493工程改造為在引物5』端含有Sbf I位點。將引物067494工程改造為在引物5，端含有SbfI和Not I位點。引物067493(有義)5， -AAACCTGCAGGACAACATTGTGCATCGGCAAACGCC-3』 (SEQ ID NO:73)引物067494(反義)5』 -AAACCTGCAGGCGGCCGCAAAGTGCCGGGGGTGCCCCAAGTCG-3』 (SEQ ID NO:74)將ku70基因的3』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組 DNA, I μ I 的 Herculase II Fusion DNA 聚合酶，50pmol 的引物 067493, 50pmol 的引物067494，5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 5Χ HerculaseII Reaction 緩衝液，和 31 μ I 的水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，61°C進行20秒，和72°C進行45秒；1個循環在72°C進行3分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用Ql AQU丨CK· Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化 PCR 片段，I μ I 的 10Χ Thermopol 緩衝液，各 O. 5 μ I 的 IOmM dNTP, I μ I 的 Taq DNA聚合酶，和3μ1的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將ku70片段的3』區在反應中克隆入pCR⑧2.1-TOPO⑧，反K、/:物包含2. 5μ I的3』側翼ku70PCR片段，I μ I的鹽溶液， μ 的水，和1μ I的pCR 2.1-TOPO ，並將2μ I的反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT T0P10化學感受態大腸桿菌細胞。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2XYT瓊脂平板上選擇，並在37°C溫育16小時。所得質粒命名為3』 ku70_T0P0。將質粒5 』 ku70-T0P0用Asc I消化以供在反應中克隆入Asc I消化的質粒pJfyS1579-41-ll(實施例 9)，反應物包含 14. 6 μ g 的 5，ku70_T0P0 質粒 DNA，5 μ I 的 AscI，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。將限制性酶消化物在37°C溫育大約14-16小時。將消化物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，其中將I. 5kb片段從凝膠切出並使用Q丨AQU1CK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將Asc I消化的5』 ku70-T0P0片段在反應中連接至AscI消化的pJfyS1579_49_ll，反應物包含329. 6ng的AscI 消化的 5』ku70-T0P0，120ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579_49_ll，2 μ I 的 Quick Ligase,15μ I的2Χ Quick Ligase Buffer，和2μ I的水。將連接反應物在室溫溫育15分鐘，並將4 μ I的連接反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT T0P10化學感受態大腸桿菌細胞。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2X YT瓊脂平板上選擇，並在37°C溫育16小時。所得質粒命名為pJfyS1579+5ku70。為了構建質粒pAgJgll5，將質粒 3』ku70-T0P0 和 pJfyS1579+5ku70 用 SbfI 消化。 pJfyS1579+5ku70 的消化物包含 3. 98 μ g 的 pJfyS1579+5ku70, 5 μ I 的 SbfI, 30 μ I 的 IOXNEB BUFFER 4，和 165 μ I 的水。3』ku70_T0P0 的消化物包含 13. 8 μ g 的 3』ku70_T0P0, 5 μ I的Sbfl，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。將兩種消化反應物在37°C溫育4小時。將來自 pJfyS1579+5ku70/SbfI 的 9. 5kb 片段和來自 3，ku70-T0P0/SbfI 的 I. 5kb 片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用Q1AQUICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。將SbfI消化的3』ku70_T0P0片段在反應中連接至SbfI消化的pJfyS1579+5ku70片段，反應物包含335. 8ng的Sbf I消化的3』ku70_T0P0，69. 76ng 的 Sbf I 消化的 pJfyS1579+5ku70，2 μ I 的 Quick Ligase, 20 μ I 的 2Χ QuickLigase Buffer,和2 μ I的水。將連接反應物在室溫溫育20分鐘，並將5 μ I的連接反應物依照生產商的指示轉化入ONE SHOT T0P10化學感受態大腸桿菌細胞。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2XYT瓊脂平板上選擇，並在37°C溫育16小時，所得質粒命名為 pAgJgll5(圖 21)。實施例23 :在裡氏木黴中生成ku70基因破壞用Not I-直鏈化的PAgJgll5使用之前在實施例12中描述的方法轉化裡氏木黴菌株981-0-8原生質體。將轉化體鋪板於PDA+1M蔗糖上，然後用含有PDA+10mM尿苷+潮黴素(100yg/ml)的薄層覆蓋。將一百二十九個轉化體傳代培養至PDA平板上以生成孢子。在ku70基因座含有PAgJgl 15缺失載體，由此破壞ku70基因的裡氏木黴菌株981-0-8的可能候選物，通過真菌孢子PCR使用Suzuki等,2006,見上文的經修飾的實驗方案進行篩選。將來自各候選物的少量孢子懸於25μ I的TE緩衝液，並在微波爐中以高檔位加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選絲氨酸蛋白酶缺失。反應物包含1μ I的孢子懸液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 緩衝液，25pmol 的引物 067946，25pmol 的引物 067947，I. 25 單位的ADVANTAGE GC GEN0MELA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行2分30秒；I個循環在72°C進行5分鐘；和4°C維持。引物067946位於5』側翼區的上遊，而引物067947位於hpt標誌物中；僅在正確的基因座中具有缺失盒的菌株會生成PCR產物。鑑定出了裡氏木黴菌株Agjgll8_02,其中ku70基因已破壞。引物067946(有義)5， -GCCAGG TGTCTGGCATGGCTGGCAAGCTGCGAC-3， (SEQ ID NO:75)引物067947(反義)5，-CTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGA-3』 (SEQ ID NO:76)對八個候選通過Southern印跡分析進行進一步衡量以確證裡氏木黴ku70基因的破壞。從缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8如實施例10中所述提取基因組DNA。將兩yg的來自缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8的基因組DNA，以及Ing的來自PAgJgll5的質粒DNA用Hind III和Bam HI消化。將裡氏木黴菌株981-0-8和pAgJgll5包括在Southern印跡中作為對照。基因組DNA消化反應物包含2 μ g的基因組DNA，I μ I的Hind III，I μ I的 Bam ΗΙ，5μ I 的 IOX NEBBUFFER 2,0. 5μ I 的 100Χ BSA，和水至 50 μ I。將兩種基因組DNA消化物在37°C溫育大約14-16小時。將質粒pAgJgll5在反應中消化，反應物包含Ing的 pAgJglllDNA，0· 5μ I 的 HindIII，O. 5 μ I 的 BamHI, 2 μ I 的 10ΧΝΕΒ BUFFER2，0. 2μ I 的IOOX BSA，和水至20 μ I。將消化物在37°C溫育大約I小時。對消化物進行使用TAE緩衝液的O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳，並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAM Supercharge印跡膜14-16小時。將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴ku70基因探針雜交，所述探針通過藉由使用如下所示的引物068067(有義)和068068(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ll_dUTP來合成。引物068067(有義)5，-CATCCACTCGGAGATGCTGA-3』 (SEQ ID NO:77)引物O68O68 (反義)5，-CGGAACTTGGTCTTTTCTGT-3』 (SEQ ID NO:78)擴增反應物包含5μ I的IOX ThermoPol Reaction緩衝液，2. 5 μ I的PCRDIG Labeling Mix，2ng 的 pAgJgll5，50pmol 的引物 068067，50pmol 的引物068068,2. 5μ I的IOmM dNTPs，5單位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。將反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，55 °C進行30秒，和72°C進行40秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將PCR反應產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用Q丨AQLi丨CK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15-17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生產商的指示進行的。含有ku70基因破壞的菌株命名為裡氏木黴Agjgll5-104。破壞構建體PAgJgll5包含側翼為直接重複的單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因。插入直接重複以促進hpt和tk選擇性標誌物的切出。將來自裡氏木黴AgJgl 15-104的孢子以Ix IO5和Ix IO6濃度鋪板於含有I μ M5-氟_2』 -脫氧尿苷(FdU)的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。將十五個分離物傳代培養於含有IuM FdU的木黴屬基本培養基平板並在28°C溫育。然後對該十五個分離物測試對潮黴素的敏感性，即將其傳代培養於含25 μ g/ml潮黴素的PDA平板，並在28°C溫育。這些分離物均無法在潮黴素平板上生長，表明hpt和tk標誌物已從菌株切出。為了確證裡氏木黴菌株Agjgll5_104缺乏tpt和tk標誌物,通過Southern印跡衡量了兩個分離物。從不含標誌物的破壞菌株和裡氏木黴菌株981-0-8如實施例10中所述提取基因組DNA。將兩μ g的來自缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8的基因組DNA用HindIII和Bam HI消化。將裡氏木黴菌株981-0-8包括在Southern印跡中作為對照。基因組DNA消化反應物包含2 μ g的基因組DNA，ly I的Hind ΙΙΙ，1μ1的Bam ΗΙ，5μ1的IOX NEBBUFFER 2，O. 5 μ I的100Χ BSA，和水至50 μ I。將兩種基因組DNA消化物在37°C溫育大約14-16小時 對消化物進行使用TAE緩衝液的O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳，並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜14-16小時。如上所述將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴ku70基因探針雜交。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15_17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65 °C在O. 5XSSC加O. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生產商的指示進行的。將含有ku70基因破壞、不含標誌物的菌株命名為裡氏木黴AgJgl 15-104-7B1。實施例24 :單蛋白酶缺失裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30-22的生成用Not I-直鏈化的pDAtwl8 (實施例11)使用實施例12中所述的方法轉化裡氏木黴KU70-缺陷菌株AgJgl 15-104-7B1原生質體以缺失裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。在含有10 μ g每ml的潮黴素B的PDA平板上選擇三十六個轉化體。將轉化體傳代培養至PDA平板以生成孢子。將使用Suzuki等,2006,見上文的經修飾的實驗方案的Fungal孢子PCR用於篩選攜帶推定缺失的轉化體，其中使用設計在枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因5』 -UTR中的有義引物(067871)和在3』 -UTR內的反義引物(067872)。引物067871(有義引物)5，-ACTTCGGGGGATGGAAGTACATAAACTG-3，(SEQ ID NO:79)引物067872(反義引物)5』-CTCGATTCGCCATTAGATGTTTTATACCTG-3』 (SEQ ID NO:80)僅當在枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因基因座中發生精確的基因取代時會生成5kb PCR產物。若盒整合在基因組其他位置，則會導致野生型3Kb枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的擴增。將來自各候選物的少量孢子懸於25 μ I的TE緩衝液，並在微波爐中以高檔位加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失。反應物包含1μ I的孢子懸液，各1μ I的IOmM dNTP，12. 5μ1的2X ADVANTAGE GC-Melt LA 緩衝液，25pmol 的引物 067871，25pmol 的引物 067872，I. 25 單位的ADVANTAGE GCGENOME LA POLYMERASE Mix，和 9· 25μ I 水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在94°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行5分30秒；I個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30鑑定為缺失枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。缺失構建體pDAtwl8包含側翼為直接重複的陽性選擇性潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因和其他編碼陰性選擇性胸腺嘧啶激酶(tk)基因。插入直接重複以促進hpt和tk選擇性標誌物的切出和生成不含標誌物的菌株，從而可將其用作宿主以缺失第二蛋白酶基因。將來自裡氏木黴SMai-TrSP-30的孢子以Ix IO5和Ix IO6的濃度鋪板於含有I μ M5-氟_2』 -脫氧尿苷(FdU)的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。將二十三個分離物 傳代培養於含有I μ M FdU的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。然後對所有23個分離物通過真菌孢子PCR以實施例26中所述相同的方式篩選hpt和tk標誌物的缺乏。進行了 Southern印跡分析以確證枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk標誌物的缺乏。如之前實施例10中所述從缺失菌株和裡氏木黴ku70缺失菌株AgJgl 15-104-7B1提取基因組DNA，並將各2 μ g用20單位的Nco I-HF 在37°C消化16小時。將消化的DNA通過使用TAE緩衝液的O. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分級4小時，並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN SuperCharge膜16小時。將膜與502bp異羥洋地黃毒苷配基標記的枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因探針雜交，所述探針通過如上所述藉由使用引物067911(有義)和067912(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。擴增反應物(50μ I)包含 IX ThermoPol Reaction Buffer, 5 μ I 的 PCR DIGLabeling Mix, IOng 的 pDAtwl8，0. 3 μ M 引物 067911，0· 3 μ M 引物 067912，和 2. 5 單位的Taq DNA聚合酶。將反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，程序如下30個循環，每個在95°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行40秒(15分鐘最終延伸)。將五微升的PCR產物通過使用TAE緩衝液I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳進行大小選擇，用溴乙錠染色，並在UV透照器下顯示。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb 緩衝液(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN,USA)中在42°C進行雜交17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65°C在0. 5X SSC加0. 1%SDS中洗滌兩次各15分鐘。探針-靶雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生產商的指示進行的。將含有枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失、不含標誌物的菌株命名為裡氏木黴SMai-TrSP-30-22。實施例25 :裡氏木黴胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失質粒PAgJgll7的構建構建缺失載體pAgJgll7以缺失裡氏木黴25kDa胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因。首先通過擴增5』和3』側翼區並將其克隆入載體pCR_ 2.1-TOPO_ 生成質粒pAgJgll7。5』側翼區包含25kDa絲氨酸蛋白酶編碼區上遊的1.5kb區。5』側翼區使用如下所示的引物068616(有義)和068617(反義)擴增。將引物068616工程改造為在引物5』端含有AscI和Not I位點。將引物068617工程改造為在引物5』端含有Asc I位點。引物068616(有義)5， -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCAAAACACACACAATAACCAACCCCCA-3』 (SEQ ID NO:81)引物O686I7 (反義)5』 -AAAGGCGCGCC TGCGATGGAGGAAAAGCTGCGAGGGATGA-3』 (SEQ ID NO:82)將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的5』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組DNA，ly I的PLAT丨NUM Pfx DNA聚合酶，50pmol的引物068616，50pmol 的引物 068617，各 L 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOXPfx Amplification 緩衝液，和33. 5μ I的水。將反應物在EPPE.NDORF iV1ASTERCYCLE.R 中溫育，程序如下1個循環在98°C進行3分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩 衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUiCK Gel ExtractionKit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol緩衝液，各O. 5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的5』區在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反應物包含3μ I的5』胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶區PCR片段，1μ I的鹽溶液，Iy I的水，和Iy I的pCR_ 2.1-ΤΟΡΟ_ 。所得質粒命名為 5』 Serine。將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的3』區使用如下所示的引物068618(有義)和068619(反義)克隆入pCR 2.1-TOPO 。將引物068618工程改造為在引物5』端含有SbfI位點。將引物0668619工程改造為在引物5』端含有Sbf I和Not I位點。引物068618(有義)5』 -AAACCTGCAGGGCGATTCCCTGTGTTGGCAACCAAA-3』 (SEQ ID NO:83)引物068619(反義)5， -AAACCTGCAGGCGGCCGCAAGAAATACTCAGGAAAGGTGCCCA-3， (SEQ ID NO:84)通過PCR在反應中擴增胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的3』區，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組DNA，ly I的PLATINUM Pfx DNA聚合酶，50pmol的引物068618，50pmol 的引物 068619，各 I. 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOXPfx Amplification 緩衝液，和33. 5μ I的水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下I個循環在98°C進行3分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。將I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1°/。的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel ExtractionKit依照生產商的指示提取。將凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』 A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol緩衝液，
O.5 μ I的IOmM dNTP, O. 5 μ I的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶片段的3』區在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO 及應物包含3μ I的5』胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶區PCR片段，1μ I鹽溶液，Iy I的水，和Iy I的pCR_ 2.1-TOPO 。所得質粒命名為 3』 Serine0將質粒5』 Serine用Asc I消化以供在反應中克隆入Asc I消化的質粒pJfyS1579-41-ll(實施例 9)，反應物包含 12.4yg 的 5』 Serine 質粒 DNA，5 μ I 的 Asc I,10μ I的IOX NEB BUFFER 4，和55 μ I的水。將限制性酶消化物在37°C溫育2小時。將消化物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，其中將I. 5kb片段從凝膠切出並使用QIAQU丨CK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將Asc I消化的5』Serine片段在反應中連接至Asc I消化的pJfyS1579-49-ll，反應物包含233. 7ng的Asc I消化的5』 SP-TOPO, 160ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579-49-ll, 3 μ I 的 Quick Ligase, 25 μ I 的 2ΧQuick Ligase Buffer，和3μ I的水。將連接反應物在室溫溫育15分鐘。所得質粒命名為5， Serine+pJfyS15790為了構建質粒 pAgJgll7,將質粒 3』Serine 和 5』Serine+pJfyS1579 用 Sbf I 消化。消化物包含 3. 96μ g 的 5』Serine+pJfyS1579 或 8. 85 μ g 的 3』Serine，4 μ I 的 SbfI, 10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和56 μ I的水。將兩種消化反應物在37°C溫育兩小時。將一 μ I的小牛小腸鹼性磷酸酶(CIP)添加至5』Serine+pJfyS 1579消化反應，並在37°C再溫育一小時。將來自 5』Serine+pJfyS1579/SbfI 的 9. 5kb 片段和來自 3SP_T0P0/Sbf I 的 I. 5kb 片段通過使用TAE緩衝液的O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。將SbfI消化的3』 Serine片段在反應中連接至 SbfI 消化的 5』Serine+pJfyS1579 片段，反應物包含 486ng 的 SbfI 消化的 3』Serine，252ng的 SbfI 消化的 5』 Serine+pJfyS1579,1 μ I 的 Quick Ligase, 10 μ I 的 2Χ Quick LigaseBuffer,和I. 5 μ I的水。將連接反應物在室溫溫育20分鐘。所得質粒命名為pAgJgll7 (圖22)。實施例26 :雙重蛋白酶基因缺失裡氏木黴菌株AgJgl 17-3-10A的生成生成裡氏木黴枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因缺失菌株SMai-TrSP-30-22原生質體並用Not I-直鏈化的PAgJgll7使用之前在實施例12中描述的方法轉化，並鋪板於PDA+1M蔗糖+10 μ g/ml的潮黴素。將六個轉化體傳代培養於PDA平板以生成孢子。在25kDa絲氨酸蛋白酶基因座含有pAgJgll7缺失載體，由此缺失絲氨酸蛋白酶的裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30-22的可能候選物，通過真菌孢子PCR使用Suzuki等，2006，見上文的經修飾的實驗方案篩選。將來自各候選物的少量孢子懸於25μ I的TE緩衝液，並在微波爐中以高檔位加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選絲氨酸蛋白酶缺失。反應物包含I μ I的孢子懸液，各I μ I的IOmM dNTP, 12. 5 μ I的2Χ ADVANTAGE GC-MeltLA 緩衝液，25pmol 的引物 068980，25pmol 的引物 067556，I. 25 單位的ADVANTAGE GC GENOME LA POLYMERASE Mix，和 9. 25 μ I 水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在95°C進行30秒，55°C進行30秒，和72°C進行5分45秒；I個循環在72°C進行15分鐘jP4°C維持。用於該篩選的引物起初用作測序引物；引物067556位於5』側翼區的末端而引物068980位於在3』側翼區的起始。若缺失載體插入絲氨酸蛋白酶基因座，則擴增的PCR片段應大於野生型片段，因為其包含用於缺失絲氨酸蛋白酶基因的hpt和tk盒。鑑定出了裡氏木黴菌株AgJgll7-3,其中絲氨酸蛋白酶已缺失。引物067556(有義)5』 -CTTCTCTTTCTGGCATTGAC-3』 (SEQ ID NO:85)引物O6898O (反義)
5』-CTCGGAATCCTGCGGTTGCC-3』 (SEQ ID NO :86)缺失構建體PAgJgll7包含側翼為直接重複的單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因。插入直接重複以促進hpt和tk選擇性標誌物的切出和生成不含標誌物的菌株，從而可將其用作宿主以缺失第三蛋白酶基因。將來自AgJgl 17-3的孢子以Ix IO5和Ix IO6的濃度鋪板於含有I μ M5-氟_2』 -脫氧尿苷(FdU)的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。將十七個分離物傳代培養於含有I μ M FdU的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。在十七個分離物中，僅七個形成了孢子；然後將這七個傳代培養於PDA平板並在28°C溫育。然後對七個分離物通過真菌孢子PCR以上述相同的方式篩選hpt和tk標誌物的缺乏。進行了 Southern印跡分析以確證25kDa絲氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk標誌物的缺乏。從缺失菌株和裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30-22如之前實施例10中所述提 取基因組DNA。將兩μ g來自缺失菌株，裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30-22，和裡氏木黴菌株981-0-8的基因組DNA分別用Hind III和Nco I消化。將裡氏木黴菌株981-0-8和裡氏木黴菌株SMai-TrSP-30-22包括在Southern印跡中作為對照。基因組DNA消化反應物包含2μ g 的基因組 DNA，I μ I 的 Nco I, I μ I 的 Hind 111,3. 5μ I 的 IOX NEB BUFFER 2，和水至35 μ I。將兩種基因組DNA消化物在37°C溫育大約3. 5小時。對消化物進行使用TAE緩衝液的O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳和遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜大約5小時。將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴25kDa絲氨酸蛋白酶探針雜交，所述探針通過藉由如下所示的使用引物069279(有義)和069280(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。引物069279(有義)5， -GGCGCCTCAATCCAGAAGGTCGCAC-3， (SEQ ID NO:87)引物O6928O (反義)5， -GTGTATGTAGTGAAACGAAGCATTCG-3』 (SEQ ID NO:88)擴增反應物包含5μ I 的 IOX ThermoPol Reaction 緩衝液，2. 5 μ I 的 PCRDIGLabeling Mix,Ing 的 pAgJgll7,50pmol 的引物 069279,50pmol 的引物 069280,各2. 5 μ I的IOmM dNTP, 5單位的Taq DNA聚合酶，和35. 5 μ I的水。將反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，55 °C進行30秒，和72°C進行40秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。PCR反應產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QlAQLK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15_17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在洗滌2X SSC加0. 1%SDS中5分鐘，接著在65°C在0. 5X SSC加0. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indiana μ olis, IN, USA)遵循生產商的指示進行的。將含有25kDa絲氨酸蛋白酶缺失的菌株命名為裡氏木黴AgJgl 17-3-10A。實施例27 :裡氏木黴天冬氨酸蛋白酶基因缺失質粒PAgJgll8的構建
構建缺失載體pAgJgll8以缺失裡氏木黴42kDa天冬氨酸蛋白酶基因。通過首先擴增5』和3』側翼區並將其克隆入載體pCR 2.1-TOPO 來生成質粒PAgJgll8。5』側翼區包含42kDa天冬氨酸蛋白酶編碼區的上遊I. 5kb區。使用如下所示的引物068620 (有義)和068621(反義)擴增5』側翼區。引物068620工程改造為在引物5』端含有Asc I和Not I位點。引物068621工程改造為在引物5』端含有Asc I位點。引物068620(有義)5』 -AAAGGCGCGCCGCGGCCGCTCGCTGTAACGAACTTCTGTCCGCA-3』 (SEQ ID NO:89)引物068621(反義)5， -AAAGGCGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGTTGCTCACGG-3』 (SEQ ID NO:90)天冬氨酸蛋白酶基因的5』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏 木黴基因組 DNA，I μ I 的PLATINUM Pfx DNA 聚合酶，50pmol 的引物 068620，50pmol的引物 068621，I. 5μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOX PfxAmplification 緩衝液，並 33. 5 μ I的水。將反應物在EPPENDORF MASTE.RCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在98°C進行3分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用Q1AQUICK GelExtraction Kit依照生產商的指示提取。凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOX Thermopol緩衝液，O. 5 μ I的IOmM(1ΝΤΡ，1μ1的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將天冬氨酸蛋白酶片段的5』區在反應中克隆入pCR_ 2.1-TOPO ，反應物包含3μ I的5』天冬氨酸蛋白酶區PCR片段，I μ I的鹽溶液，I μ I的水，和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得質粒命名為 5』 Aspartic。使用如下所示的引物068622(有義)和068623(反義)將天冬氨酸蛋白酶片段的3』區克隆入pCR_ 2.1-TOPO 。引物068622工程改造為在引物5』端含有SbfI位點。弓I物068623工程改造為在引物5』端含有SbfI和Not I位點。引物068622(有義)AAACCTGCAGGGCGGCGATGGTGGACTTGTTTATGA-3』 (SEQ ID NO:91)引物068623(反義)AAACCTGCAGGCGGCCGCAGCAAGTGAGTATCGAGTTTGTAGG-3』 (SEQ ID NO:92)天冬氨酸蛋白酶基因的3』區通過PCR在反應中擴增，反應物包含175 μ g的裡氏木黴基因組 DNA，I μ I 的PLATINUMS Pfx DNA 聚合酶，50pmol 的引物 068622，50pmol 的引物 068623，I. 5 μ I 的 IOmM dNTP, 10 μ I 的 IOX PfxAmplification 緩衝液，和 33. 5 μ I的水。將反應物在:EPPENDORF MASTERCYCLER. 中溫育，程序如下1個循環在98°C進行3分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；1個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。I. 5kb PCR片段通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。凝膠純化的PCR片段用Taq DNA聚合酶處理以在反應中將3』A-懸突添加至片段，反應物包含5 μ I的純化PCR片段，I μ I的IOXThermopol緩衝液，O. 5 μ I的IOmM(1ΝΤΡ，1μ1的Taq DNA聚合酶，和3 μ I的水。將反應物在72°C溫育15分鐘。將天冬氨酸蛋白酶片段的3』區在反應中克隆入pCR 2.1-TOPO ，反應物包含3μ I的3』天冬氨酸蛋白酶區PCR片段，I μ I的鹽溶液，I μ I的水,和I μ I的pCR 2.1-TOPO 。所得質粒命名為 3』 Aspartic。用Asc I消化質粒5』 Aspartic以在反應中克隆入Asc I消化的質粒pJfyS1579-41-ll(實施例 9)，反應物包含 6. 45 μ g 的 5，Aspartic 質粒 DNA，5y I 的 AscI，10 μ I的IOX NEB BUFFER 4，和61 μ I的水。限制性酶消化物在37°C溫育4小時。消化物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，其中將I. 5kb片段從凝膠切出並使用QIAQUIC K 1 Ge I Extraction Kit依照生產商的指不提取。將Asc I消化的5』Aspartic片段在反應中連接至Asc I消化的pJfyS1579-49-ll，反應物包含307. 2ng的Asc I消化的 5，Aspartic, 160ng 的 Asc I 消化的 pJfyS1579-49_ll, 3 μ I 的 Quick Ligase, 25 μ I 的2Χ Quick Ligase Buffer，和3 μ I的水。連接反應物在室溫溫育15分鐘。所得質粒命名為 5， Aspartic+pJfyS15790為了構建質粒pAgJgll8,將質粒 3』 Aspartic 和 5』 Aspartic+pJfyS1579 用 SbfI 消化。消化物包含 3· 5μ g 的 5』 Aspart ic+pJfyS1579 或 5· 3μ g 的 3』 Aspartic, 4 μ I 的 SbfI, 10μ I的IOX NEB BUFFER 4，和56 μ I的水。將兩種消化反應物在37°C溫育I. 5小時。將一 μ I的小牛小腸鹼性磷酸酶(CIP)添加至5』Aspartic+pJfyS1579消化反應物並在37°C再溫育一小時。來自 5』Aspartic+pJfyS1579/SbfI 的 9. 5kb 片段和來自 3』Aspartic/SbfI的I. 5kb片段通過使用TAE緩衝液的O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQUICK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。將SbfI消化的3』Aspartic片段在反應中連接至SbfI消化的5』 Aspartic+pJfyS1579片段，反應物包含349. 5ng的SbfI 消化的 3，Aspartic, 122. 35ng 的 SbfI 消化的 5，Aspartic+pJfyS1579, 2 μ I 的 QuickLigase, 20 μ I的2Χ Quick Ligase Buffer，和3μ I的水。連接反應物在室溫溫育20分鐘並將3μ I的連接反應物依照生產商的指示轉化入SOLOPACK Gold Ultra感受態大腸桿菌細胞。轉化體在補充100 μ g每ml的氨苄青黴素的2X YT瓊脂平板上選擇並在37°C溫育16小時。所得質粒命名為pAgJgll8(圖23)。實施例28 :三重蛋白酶基因缺失裡氏木黴菌株AgJgl 18-02-2E的生成用Not I-直鏈化的PAgJgll8使用之前在實施例12中描述的方法轉化裡氏木黴雙重蛋白酶缺失菌株AgJgll7-3-10A原生質體，並鋪板於含10μ g每ml的潮黴素的PDA平板加IM蔗糖。將六個轉化體傳代培養入PDA平板以生成孢子。在42kDa天冬氨酸蛋白酶基因座含有pAgJgll8缺失載體，由此缺失天冬氨酸蛋白酶的裡氏木黴菌株AgJgll7-3-10A的可能候選物,通過真菌孢子PCR使用Suzuki等,2006,見上文的經修飾的實驗方案篩選。將來自各候選物的少量孢子懸於25μ I的TE緩衝液，並在微波爐中以高檔位加熱I分鐘。將經微波處理的孢子懸液在PCR反應中用作模板以篩選絲氨酸蛋白酶缺失。反應物包含I μ I的孢子懸液，各I μ I的IOmM dNTP, 12. 5 μ I的2Χ ADVANTAGE GC-Melt LA 緩衝液，25pmol 的引物 069858，25pmol 的引物 069859，
I.25 單位的ADVANTAGE Ge GENOME LA POLYMERASEMix，和 9· 25 μ I 水。將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行10分鐘；35個循環，每個在95°C進行30秒，60°C進行30秒，和72°C進行5分30秒；I個循環在72°C進行15分鐘；和4°C維持。引物069858位於5』側翼區的末端而引物069859位於3』側翼區的起始。若缺失載體插入天冬氨酸蛋白酶基因座，則擴增的PCR片段應大於野生型片段，因其包含用於缺失絲氨酸蛋白酶基因的hpt和tk盒。鑑定出了裡氏木黴AgJgll8-02，其中天冬氨酸蛋白酶已缺失。引物069858(有義)5， -TCGGGGAGGATGGCGCAAACCGACCTTCCTAAA-3』 (SEQ ID NO:93)引物069859(反義)5， -GCACCTTACCCCTACGGACCACGAT-3， (SEQ ID NO:94)
缺失構建體PAgJgll8包含側翼為直接重複的單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因和大腸桿菌潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因。插入直接重複以促進切出hpt和tk選擇性標誌物和生成42kDa天冬氨酸蛋白酶的完整(clean)缺失。將來自裡氏木黴AgJgl 18-02的孢子以Ix IO5和Ix IO6的濃度鋪板於含有I μ M5-氟_2』 -脫氧尿苷(FdU)的木黴屬基本培養基平板，並在28°C溫育。將十個分離物傳代培養入PDA平板並在28°C溫育。然後對十個分離物通過真菌孢子PCR以上述相同的方式篩選hpt和tk標誌物的缺乏。進行了 Southern印跡分析以確證42kDa天冬氨酸蛋白酶基因的缺失和hpt和tk標誌物的缺乏。從缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8如之前在實施例10中所述提取基因組DNA。將兩μ g的來自缺失菌株和裡氏木黴菌株981-0-8的基因組DNA用Nco I消化。將裡氏木黴菌株981-0-8包括在Southern印跡中作為對照。基因組DNA消化反應物包含2yg的基因組DNA，ly I的Nco Ι，5μ1的IOX NEB BUFFER 3，和水至50 μ I。將兩種基因組DNA消化物在37°C溫育大約14-16小時。對消化物進行使用TAE緩衝液的O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳和遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜大約12-16小時。將膜與500bp異羥洋地黃毒苷配基標記的裡氏木黴42kDa天冬氨酸蛋白酶探針雜交，所述探針通過藉由使用如下所示的引物069860(有義)和069861(反義)的PCR併入異羥洋地黃毒苷配基-ΙΙ-dUTP來合成。引物069860(有義)5』-CTTCTATCTTGGGATGCTTCACGATACGTGA-3』 (SEQ ID NO:95)引物069861(反義)5， -CGCGCCCTTGAATATCGGAGAAGGT-3， (SEQ ID NO:96)擴增反應物包含5 μ I 的 IOX Taq 緩衝液，2. 5 μ I 的 PCR DIG Labeling Mix, 5ngWpAgJgl 18, IOpmol 的引物 069860，IOpmol 的引物 069861，各 2. 5 μ I 的 IOmM dNTP，5 單位的 Taq DNA 聚合酶，和 36. 5μ I 的水。將反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 5333中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，56 V進行30秒，和72 °C進行40秒；I個循環在72 °C進行15分鐘；和4°C維持。將PCR反應產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，並使用QIAQU1CK Gel Extraction Kit依照生產商的指示提取。異羥洋地黃毒苷配基的併入通過分子量的增加指示。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15_17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在洗滌2X SSC加0. 1%SDS中5分鐘，接著在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN,USA)遵循生產商的指示進行的。含有天冬氨酸蛋白酶缺失的菌株命名為裡氏木黴AgJgl 18-02-2E。實施例29 :裡氏木黴AgJgl 17-3-10A和裡氏木黴AgJgl 18-02-2E的發酵將來自PDA平板的裡氏木黴AgJgl 17-3-10A和裡氏木黴AgJgl 18-02-2E的孢子接種入含有IOOml的搖瓶培養基的500ml搖瓶。在相同條件下運行裡氏木黴菌株981-0-8作為對照。將燒瓶置入定軌振蕩器在28°C進行大約48小時，此時將50ml的培養物添加至包含1.8升的發酵分批培養基的八[*^3^{<0凡 三升玻璃夾套發酵器(three liter glassjacketed fermentor) (Applikon Biotechnology, Inc.，Foster City CA USA)。發酵補料培養基以O至4g/l/小時的速率添加185小時的時間。將發酵容器維持在28°C的溫度，並使用 APPL丨KX)N_ 1030 控制系統(Applikon Biotechnology, Inc. ,Foster City CAUSA)將pH控制在4. 5+/-0. I的設定點。將空氣以Ivvm的速率添加至容器，並通過以1100至1300rpm旋轉的Rushton葉輪攪拌培養液。在發酵結束時，將全培養液從容器收穫，並在3000x g離心以去除生物質。將上清過濾滅菌，並儲藏在5至10°C。實施例30 :棘孢麴黴菌株CBS 186. 67GH3 β -木糖苷酶的製備依照以下步驟重組製備棘孢麴黴菌株CBS 186. 67GH3 β -木糖苷酶。為了生成用於PCR擴增的基因組DNA，將棘孢麴黴CBS 186. 67通過在26°C生長 7日在PDA瓊脂平板上繁殖。將從PDA平板收穫的孢子接種入帶擋板的搖瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培養基，並在26°C在200rpm振蕩溫育48小時。基因組DNA分離依照修飾的FastDNA SPIN實驗方案(Qbiogene，Inc.，Carlsbad, CA, USA)進行。簡言之，將FastDNA SPIN Kit for Soil (Qbiogene, Inc.,Carlsbad, CA, USA)用於 JFastPrep 24Homogenization System (MPBiosciences, SantaAna,CA,USA)中。兩ml的真菌材料通過在14，OOOx g離心2分鐘來收穫。去除上清並將沉澱重懸於500 μ I的去離子水。將懸液轉移至Lysing Matrix E FastPl』epC!<」管(Qbiogene,Inc.，Carlsbad, CA，USA)並將 790 μ I 的磷酸鈉緩衝液和 100 μ I 的來自FastDNA SPINKit的MT緩衝液添加至管。然後將樣品放置在FastPrep' Instrument (Qbiogene, Inc.,Carlsbad, CA, USA)中，並在5. 5m/秒的速度處理60秒。然後將樣品在14，OOOx g離心2分鐘，並將上清轉移至乾淨的EPPENDORF 管。添加來自FastDNA SPIN Kit的250 μ I體積的PPS試劑，然後將樣品通過倒置輕柔地混合。然後將樣品再次在14，OOOxg離心5分鐘。將上清轉移至15ml管，接著加入Iml的來自FastDNA SPIN Kit的Binding Matrix懸液，然後通過倒置混合兩分鐘。將樣品放置在固定的管架中，並允許二氧化矽基質沉降3分鐘。移除並棄去500 μ I體積的上清，然後將剩餘樣品重懸於基質。然後將樣品轉移至來自FastDNA SPIN Kit的SPIN過濾管，並在14，OOOx g離心I分鐘。清空接收管(catchtube)，並將剩餘的基質懸液添加至SPIN過濾管。再次離心樣品(14，000xg，l*#)。將來自FastDNA SPIN Kit的500 μ I體積的SEWS-M溶液添加至SPIN過濾管，並將樣品在相同速度離心I分鐘。清空接收管，並將SPIN過濾器重新置於(replace)接收管中。將該單元在14000xg離心2分鐘以「乾燥」殘餘SEWS-M洗滌溶液的基質。將SPIN過濾器置於新鮮的接收管，並允許在室溫風乾5分鐘。用移液尖將基質輕柔地重懸於100μ I的DES(不含DNase/致熱原的水)中。將該單元離心(14，OOOx g，I分鐘)以洗脫基因組DNA，接著通過在14000xg重新離心I分鐘用100 μ I的IOmM Tris, O. ImM EDTA，pH 8. O洗脫，並合併洗脫物。從接收管收穫的DNA的濃度通過UV分光光度計在260nm測量。棘孢麴黴木糖苷酶基因通過PCR使用如下所示的兩個克隆引物GH3_101f和GH3-101r分離，所述引物基於公眾可獲得的棘孢麴黴xyl2全長序列(GenBankAB462375. I)設計以供使用IN-FUSI0N 策略進行直接克隆。引物GH3-101f:5，-acacaactggggatccaccatggctgtggcggctcttgctctgctgg-3，(SEQ ID NO :97)引物GH3_101r:5，-agatctcgagaagcttaCTCATCCCCCGCCACCCCCTGCACCTCC-3，(SEQ ID NO :98)
用從棘孢麴黴CBS 186.67製備的基因組DNA進行PCR反應以擴增全長基因。PCR反應物包含1μ I的基因組DNA，0. 75 μ I的引物GH3-101· lf(10yM),0. 75 μ I的引物 GH3-101. Ir (10 μ Μ)，3 μ I 的 5Χ HF 緩衝液(Finnzymes 0y, Finland)，O. 25 μ I 的 50mMMgCl2,0. 3 μ I 的 IOmM dNTP, O. 15 μ I 的PHUS丨ON DNA 聚合酶(New England Biolabs,Ipswich, MA, USA)，和 PCR-級水加至 15 μ I。PCR 反應使用 DYAD PCR 儀(Bio-RadLaboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)進行,程序如下在98°C進行2分鐘,接著是在98°C進行15秒，700C (-I0C /循環)進行30秒，和72°C進行2分30秒的10個降落循環；和25個循環，每個在98°C進行15秒，60°C進行30秒，72°C進行2分30秒，和在72°C進行5分鐘。反應產物通過使用TAE緩衝液的I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將大約2. 4kbPCR產物條帶從凝膠切出並使用GFX PCR DNA和Gel Band Purification Kit (GEHealthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)依照生產商的指不純化。將對應於棘孢麴黴β -木糖苷酶基因的DNA使用IN-FUSION Dry-Down PCRCloning Kit (BDBiosciences,Palo Alto,CA,USA)依照生產商的指示克隆入用Bam HI和Hind III直鏈化的表達載體 pDAul09 (W0 2005042735)。將2. 5 μ I體積的稀釋的連接混合物用於轉化ONE SHOT 化學感受態T0P10細胞。在含有100 μ g每ml的氨苄青黴素的LB瓊脂平板上選擇三個菌落，並在補充100 μ g每ml的氨節青黴素的3ml的LB培養基中培養過夜。使用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit (OmegaBio-Tek, Inc. , Norcross, GA, USA)依照生產商的指示純化質粒DNA。在異源表達之前,通過Sanger測序驗證棘孢麴黴β -木糖苷酶基因序列。編碼序列為2454bp，包含終止密碼子。基因不含內含子。編碼的預期蛋白為817個胺基酸。使用 SignalP program (Nielsen 等，1997, Protein EngineeringlO 1-6)預測出17個殘基的信號肽。預期的成熟蛋白包含800個胺基酸。米麴黴MT3568的原生質體如WO 95/02043中所述製備。米麴黴MT3568是米麴黴JaL355(W0 2002/40694)的amdS(乙醯胺酶)破壞的基因衍生物，其中pyrG營養缺陷型通過用PyrG基因破壞米麴黴乙醯胺酶(amdS)基因而得到恢復。將一百微升的原生質體懸液與2. 5-15 μ g的麴黴屬表達載體混合，並添加250 μ I的60%PEG 4000, IOmM CaCl2,和IOmM Tris-HCl pH 7. 5並輕柔地混合。將混合物在37°C溫育30分鐘，並將原生質體鋪於補充 IOmM 乙醯胺和 15mM CsCl 的 COVE 蔗糖(IM)平板(Cove, 1996,Biochim0 Biophys0Acta 133 :51-56)上以供轉化體選擇。在37°C溫育4_7日之後，將幾個轉化體的孢子接種於YP-2%麥芽糊精培養基上。在30°C培養4日之後，分析培養液以基於其產生大量活性棘孢麴黴β -木糖苷酶的能力鑑定最佳轉化體。篩選是基於通過SDS-PAGE確定的對應於異源表達蛋白的條帶強度，和如下所示的酶對4-硝基苯基-β -D-木糖批喃糖苷(4-nitrophenyl-beta-D-xylopyranoside,pNPX)的活性。將十 μ I 的培養液與含有 10 μ I 的 O. 1%TWEEN 20，10 μ I 的 IM 檸檬酸鈉 pH 5，4 μ I 的溶解於 DMSO 的 IOOmM 的 ρΝΡΧ 底物(Sigma Aldich,St. Louis,MO, USA)(儲液中0. 4%的最終體積)和過濾水的90 μ I的測定試劑混合。測定在37°C進行30分鐘，並在添加100 μ I的IM碳酸鈉pH 10之前和之後在405nm確定吸光度。將在405nm最高的吸光度值關聯於SDS-PAGE數據以供選擇最佳轉化體。將命名為米麴黴EXP3611的最佳轉化體的孢子鋪於含有O. 01%TRr[ON X-100的COVE平板上以供分離單菌落。鋪板在補充IOmM乙醯胺和15mM CsCl的含有IM蔗糖和IOmM硝酸鈉的COVE蔗糖培養基(Cove, 1996,Biochim0 Biophys0 Acta 133 :51-56)上總共重複兩次。然後在 30°C在250ml燒瓶中使用DAP-4C-1培養基在IOOrpm振蕩進行發酵4日。發酵液使用標準方法過濾。蛋白濃度使用 Microplate BCA Protein Assay Kit (Thermo Fischer Scientific,Waltham, MA, USA)確定，其中使用牛血清白蛋白作為蛋白標樣。
實施例31 :來自裡氏木黴AgJgl 17-3-10A和裡氏木黴AgJgl 18-02-2E的培養液在高溫的儲藏穩定性對裡氏木黴AgJgl 17-3-10A、裡氏木黴AgJgl 18-02-2E和裡氏木黴菌株981-0-8(對照)的培養液衡量在升高溫度的儲藏穩定性，並將其與親本株的穩定性相比較。將從實施例29獲得的發酵液過濾滅菌(O. 2μ M注射器式濾器，聚醚碸膜，GEHealthcare, Piscataway, NJ, USA),等分入 I. 8mL Nunc CRY0TUBE 小瓶(Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA)並在液氮中驟凍(flash freeze)。然後將小瓶儲藏在40°C或-80°C (作為對照)兩周。在溫育之後，對樣品測定PCS水解活性。PCS 的水解使用 2. 2ml 深孔板(Axygen, Union City, CA, USA)以 I. 0ml 的總反應體積進行。水解用50mg的PCS每ml的含有ImM硫酸鎂的50mM乙酸鈉pH 5. O緩衝液進行，並獲得蛋白酶缺失菌株和親本株(2，4，8和12mg每克纖維素)的劑量應答。每個反應以5%添加補充棘孢麴黴葡糖苷酶的蛋白(實施例30)。水解測定在50°C以三次重複進行72小時。在水解之後，將樣品用0. 45 μ m Multiscreen 96孔過濾板(MiIlipore, Bedford,MA,USA)過濾，並如下所示就糖含量分析濾過物。在通過含0. 05%w/w苯甲酸的0. 005M H2SO4以0. 6mL/分鐘的流速從4. 6x250mm AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)洗脫之後，稀釋於0.005M H2SO4的樣品的糖濃度以通過由通過純糖樣品校正的折光率檢測器(C'HEMSTATION ，AGILENT⑧ 1100HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖和纖維二糖信號的積分的定量來測量。將所得的當量用於計算各反應的纖維素轉化百分率。纖維素轉化程度使用以下方程計算%轉化=[葡萄糖濃度+1. 053x(纖維二糖濃度)]/[(葡萄糖濃度+1. 053x限制消化中的(纖維二糖濃度)]。對於纖維二糖的I. 053因子考慮了當纖維二糖轉化為葡萄糖時質量的增加。使用六十mg的裡氏木黴纖維素分解蛋白製備物每g纖維素以供限制消化。顯示於圖24的結果說明來自裡氏木黴AgJgl 17-3-10A和裡氏木黴AgJgl 18-02-2E的培養液在40°C兩周之後殘餘纖維素酶活性相對於在相同條件下的裡氏木黴菌株981-0-8的培養液較優。為了達到80%的底物轉化，對於親本株，在40°C溫育的樣品相對於在_80°C溫育的對照樣品需要蛋白加載量增加至I. 76倍。在相同條件下，對於三重和雙重蛋白酶缺失的菌株培養液，蛋白加載量分別增加至I. 43和I. 61倍。因此，三重蛋白酶缺失菌株培養液在40°C兩周的儲藏穩定性方面顯示19%的改善。雙重蛋白酶缺失培養液當在40°C儲藏兩周時顯示8. 5%的改善。實施例32 :枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺失載體pJfyS152的生成將裡氏木黴981-0-8枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(p印C)基因(SEQ ID NO:99為DNA序列，而SEQ ID NO: 100為推導的胺基酸序列)5』側翼序列使用PHUSION HotStat High-Fidelity DNA 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich,MA,USA)和如下所不的基因-特異性正向和反向引物擴增。下劃線部分為導入供克隆的Asc I位點，而斜體區代表對應於IN-FUSION_ Cloning (Clontech，Palo Alto, CA，USA)所需的載體插入的位點的同源區的導入的延伸。
正向引物5』 - icacai^iitaaac ggcgcgccGGTACTATATTAGAAAGGGGTTCC-3 (SEQ ID NO: 101)反向引物5』 - cmccll0/!l0cz ggcgcgccGAAGAAGAGAAGAGGAGGAGGATG-3』 (SEQ ID NO: 102)擴增反應物含有150ng的裡氏木黴981_0_8基因組DNA，各200 μ m的dNTP,0. 4μΜ 引物，I X PHUS 丨 ON (;C 緩衝液(New England Biolabs, Ipswich,MA, USA)，和2單位的PHUSION DNA聚合酶，最終體積為50μ I。將擴增反應在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在98°C進行2分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，57°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；和一個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，並將2. 2kb片段切出，使用NUCLEOSPIN ExtractII Kit (Machery-Nagel, Dueren, Germany)依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。將2. 2kb PCR產物使用IN-FUSION ADVANTAGE PCR Cloning Kit (Clontech, Palo Alto, CA, USA)依照生產商的實驗方案插入 Asc I-消化的pJfyS1579-41-ll(實施例9)。IN-FUSION 反應物在10 μ I反應體積中含有1XIN-FUSION 反應緩衝液(Clontech，Palo Alto, CA, USA)，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 產物，和 I μ I 的IN-FUS丨ON Enzyme (Clontech，Palo Alto, CA, USA)。將反應物在37°C溫育15分鐘和並在50°C溫育15分鐘。向反應物添加40 μ I的TE。將兩個2 μ I用於依照生產商的實驗方案轉化ONE SHOT T0P10感受態細胞。轉化體通過測序篩選，並鑑定出一個含有不具PCR錯誤的插入物的克隆，並命名為pJfyS152A，將質粒pJfyS152A用於插入PepC基因的3』側翼。將3』 P印C側翼序列從裡氏木黴981-0-8基因組DNA(實施例13)使用PHUS丨ON Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶和如下所示的基因-特異性正向和反向引物擴增。下劃線部分為導入供克隆的SbfI位點，而斜體區代表對應於IN-FUSION Cloning所需的載體插入的位點的同源區的導入的延伸，且粗體部分為導入供之後去除質粒的細菌繁殖部分的Pme I位點。正向引物
5』 - Cd收"奴收KUt cctgcaggTCTATCTCTTTTGAGTAGTCCCCA-3』 (SEQ ID NO: 103)反向引物5』 - (ggccaiaiuaaat cctgcagg gttoaac AGCTAGTGACTCGCGATTTATCGT-3』 (SEQ IDNO:104)擴增反應物含有150ng的裡氏木黴981_0_8基因組DNA，各200 μ m的dNTP，0.4「] 引物，含51111 MgCl2 的 lXPHUSION HF 緩衝液(New England Biolabs, Ipswich,MA，USA)，和2單位的PHUSION DNA聚合酶，最終體積為50 μ I。將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 111溫育，程序如下1個循環在98°C進行2分鐘；30個循環，每個在98°C進行30秒，56°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；和一個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將2. 2kb片段切出，並使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。 的實驗方案插入Sbf I-消化的pJfyS152A。IN-FUSION 反應物在10 μ I反應體積中含有 IX IN-FUSION Reaction 緩衝液，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 產物，和I μ I的IN-FUSION Enzyme。將反應物在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。向反應物添加40 μ I的TE，並將2μ I用於依照生產商的實驗方案轉化ONE SHOT Τ0Ρ10感受態細胞。轉化體通過測序篩選，並鑑定出一個含有不具PCR錯誤的插入物的克隆，並命名為pJfyS152(圖25)。將質粒pJfyS152用於缺失p印C基因。實施例33 :枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶缺失的裡氏木黴菌株JfyS152_l的生成將用Pme I-消化的並凝膠純化的pJfyS152依照實施例12中描述的步驟轉化的裡氏木黴AgJgl 15-104-7B1 (實施例23)的六個轉化體，從轉化平板用滅菌接種環轉移至新的含有PDA培養基的平板，並在28°C生長7日。然後所有6個轉化體通過Southern分析進行分析。將來自6個轉化體的每一個的基因組DNA如實施例21中所述提取，並將各2. 5 μ g用20單位的Nsi II和20單位的BglII消化16小時。對消化物進行0. 9%的瓊脂糖凝膠電泳並遵循生產商的推薦使用TURBOBLOTTER 印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜大約12-16小時。雜交於P印C基因的3』側翼序列的PCR探針，使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit依照生產商的實驗方案用以下正向和反向引物生成正向引物5， -TGATTTCGTGGACAGCGTTTCTCGC-3， (SEQ ID NO:105)反向引物5』-TTGCCTTACAGCTGGCAACAATGGCGTC-3』 (SEQ ID NO:106)將擴增反應物EPPENDORF MASTERCYCLER 在中溫育，程序如下1
個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在94°C進行30秒，59°C進行30秒，和72°C進行40秒，和一個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，並將0. 3kb片段切出，並使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。異羥基洋地黃毒苷元的併入通過在大約0. 5kb運行的標記探針的分子量變動來確證。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15_17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加O. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65°C在O. 5X SSC加O. 1%SDS中洗滌兩次各15分鐘。探針-祀雜合物的檢測是通過化學發光測定(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis, IN, USA)遵循生產商的指示進行的。Southern分析表明6個轉化體中的3個以單拷貝攜帶缺失盒。含有pepC缺失的菌株命名為裡氏木黴JfyS152-l。實施例34 :胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶缺失載體pJfyS153的生成將裡氏木黴981-0-8胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基因(SEQ ID N0:107為DNA序列，而SEQ ID NO: 108為推導的胺基酸序列)的5』側翼序列使用PHUSION Hot StartHigh-Fidelity DNA 聚合酶 New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)和如下所不的基因-特異性正向和反向引物擴增。下劃線部分為導入供克隆的Asc I位點，而斜體區代表同源於丨N-FUSION 的插入位點的載體。正向引物 5 - tcacaimdaaac ggcgcgccTTCCGGCTTCTTTTTATGTATACCT-3 (SEQ ID NO: 109)反向引物5』 - Cl^Cdt tnmcz ggcgcgccAAGCTAGGAACCAGCCTCTTTGTA-3，(SEQ ID NO: 110)擴增反應物含有150ng的裡氏木黴981-0-8基因組DNA，各200 μ m的dNTP，0. 4 μ M引物，IX PHUSION Ge 緩衝液(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)和 2 單位的PHUSION 丨)NA 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)，最終體積為 50 μ L·將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，57°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；和一個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，並將2. 2kb片段切出，並使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。將2. 2kb PCR 產物使用IN-FUSION ADVANTAGE l)CR Cloning Kit 依照生產商的實驗方案插入Asc I-消化的pJfyS1579-41-ll。IN-FUSION .反應物在10 μ I反應體積中含有 1XIN-FUSION Reaction緩衝液，150ngpJfyS1579-41_ll，IOOng PCR產物和I μ I IN-FUSION Enzyme0將反應物在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。向反應物添加40 μ I的TE，並將2 μ I用於依照生產商的實驗方案轉化ONE SHOT TOP 10感受態細胞。轉化體通過測序篩選，鑑定出一個含有不具PCR錯誤的插入物的克隆並命名為pJfyS153A，並將其用作質粒以插入胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基因的3』側翼。將胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基因的3』側翼序列從裡氏木黴981-0-8基因組DNA(實施例 13)使用PHUSION Hot Start High-Fidelity DNA 聚合酶(New EnglandBiolabs, Ipswich,MA,USA)和如下所示的基因-特異性正向和反向引物擴增。下劃線部分為導入供克隆的SbfI位點，而斜體區代表同源於丨N-FUSION 的插入位點的載體，且粗體部分為導入以供之後去除質粒的細菌繁殖部分的Pme I位點。5，- ctagttggagtatt cctRcaRga GCCGAGCTCCTGMCGCTGAGATT- 3，(SEQ IDNO :111)反向引物5，- tggccatatttaaati c c t g c a g QTTTAMCGAGGGMMGGGCCGCTGCACGAT-3』 (SEQIDN0:112)
擴增反應物含有150ng的裡氏木黴981-0-8基因組DNA，各200 μ m的dNTP，O. 4 μ M引物，含5mM MgCl2的IXPHUSION HF緩衝液，和2單位的PHUSION DNA聚合酶，最終體積為50 μ I0將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1
個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行30秒，59°C進行30秒，和72°C進行I分30秒；和一個循環在72°C進行7分鐘。PCR產物通過使用TAE緩衝液的1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，將I. 5kb片段切出，並使用NUCLEOSPIN Extract II Kit依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。將1.5kb PCR產物使用iN-FUSiON ADVANTAGE PCR Cloning Kit 依照生產商的實驗方案插入Sbf I-消化的pJfyS153A。IN-FUSION 反應物在10 μ I反應體積中含有 IX IN-FUS丨ON Reaction 緩衝液，150ng 的 pJfyS1579-41_ll，IOOng 的 PCR 產物，和I μ I的IN-FUSION Enzyme。將反應物在37°C溫育15分鐘和在50°C溫育15分鐘。 向反應物添加40 μ I的TE,並將2 μ I用於依照生產商的實驗方案(Invitrogen, Carlsbad,CA，USA)轉化ONE SHOT TOP 10感受態細胞。轉化體通過測序篩選，並鑑定出一個含有不具PCR錯誤的插入物的克隆，並命名為PJfyS153 (圖26)，並將其用於缺失胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基因。實施例35 :胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶缺失裡氏木黴菌株JfyS153_6的生成當用Pme I-消化的並凝膠純化的pJfyS152依照實施例12中描述的步驟轉化原生質體時，獲得了裡氏木黴Agjgll5-104-7B1(描述於實施例23)的十六個轉化體。將所有16個用滅菌接種環從轉化平板轉移至含有PDA培養基的新平板，並在28°C生長4日。將16轉化體通過真菌孢子PCR依照實施例23中所述的方法用下述引物進行分析正向引物5』-CGCGGAGGTGAGGTGTTGATGATG-3』 (SEQ ID NO:113)反向引物1(野生型)5』-CGGCGGTCTTTAAGGTGATGTCGC-3』 (SEQ ID NO:114)反向引物2(缺失的)5』-GTTTCAGGCAGGTCTTGCAACG-3』 (SEQ ID NO:115)將反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1個循
環在98°C進行5分鐘；35個循環，每個在98°C進行20秒，53°C進行30秒，和72°C進行3分30秒；1個循環在72°C進行7分鐘；和4°C維持。對PCR反應物進行TAE緩衝液中的1%的瓊脂糖凝膠電泳。設計PCR引物使得若野生型基因是完整的，則正向和反向引物I會退火，得到
2.5kb片段，而若基因缺失，則正向和反向引物2會退火，得到3. 5kb片段。真菌孢子PCR表明16個轉化體中僅一個含有僅顯示3. 5kb片段的缺失。接著通過Southern分析來分析該菌株。如實施例21中所述提取基因組DNA，並將2 μ g用21. 4單位的Nco I和21. 4單位的BII消化16小時。對消化物進行TAE緩衝液中的0. 9%的瓊脂糖凝膠電泳並遵循生產商的推薦印跡於NYTRAN Supercharge印跡膜使用TURBOBLOTTER 大約12-16小時。雜交於胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基因的3』側翼序列的PCR探針使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit 依照生產商的實驗方案(Roche Diagnostics, Indianapolis, ID)用以下正向和反向引物生成正向引物5』-GAAGACAGTCCTACTGCTGCGGAG-3』 (SEQ ID NO:116)反向引物5』-GTAGCTCTCCCCGTATAATGCAGG-3』 (SEQ ID NO:117)將擴增反應物在EPPENDORF MASTERCYCLER 中溫育，程序如下1
個循環在95°C進行2分鐘；30個循環，每個在95°C進行20秒，57°C進行30秒，和72°C進行40秒；和一個循環在72°C進行7分鐘。 PCR產物通過使用TAE緩衝液的I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，並將O. 6kb片段切出，並使用Nucleospin Extract II(R)Kit依照生產商的實驗方案提取瓊脂糖。異羥基洋地黃毒苷元的併入通過在大約0. 6kb運行的標記探針的分子量變動來確證。在DIG Easy Hyb緩衝液中在42°C進行雜交15-17小時。然後將膜在室溫在高嚴格條件下在2X SSC加0. 1%SDS中洗滌5分鐘，接著在65 °C在0. 5XSSC加0. 1%SDS中洗漆兩次各15分鐘。探針-IE雜合物的檢測是通過化學發光測定法(Roche MolecularBiochemicals, Indianapolis, IN, USA)遵循生產商的指不進行的。Southern分析表明菌株以單拷貝在意圖的基因座攜帶缺失盒。將含有胃蛋白酶樣蛋白酶缺失的菌株命名為裡氏木黴JfyS153-6。通過以下編號的段落進一步描述本發明[I] 一種親本木黴屬菌株的突變體，其包含編碼多肽的多核苷酸，和一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一個或多個(幾個)基因經修飾使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[2]段I的突變體，其包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[3]段I或2的突變體，其包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[4]段1-3任一項的突變體，其包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[5]段1-4任一項的突變體，其包含第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[6]段1-5任一項的突變體，其包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[7]段1-6的突變體，其包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[8]段1-7任一項的突變體，其中所述多肽對木黴屬菌株是天然或外源的。[9]段1-8任一項的突變體,其中所述木黴屬菌株選自下組哈茨木黴,康寧木黴，長枝木黴，裡氏木黴，和綠色木黴。[10]段1-9任一項的突變體，其中所述木黴屬菌株是裡氏木黴。
[11]段1-10任一項的突變體，當其在相同條件下培養時,相對於親本木黴屬菌株，產生少至少25%的一種或多種(幾種)選自下組的酶第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[12]段1-10任一項的突變體，當其在相同條件下培養時,相對於親本木黴屬菌株，在一種或多種(幾種)選自下組的酶方面完全缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[13]段1-12任一項的突變體，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴ 或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[14]段1-13任一項的突變體，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽組成。[15]段1-14任一項的突變體，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[16]段1-15任一項的突變體，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽組成。[17]段1-16任一項的突變體，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組
(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDN0:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽編碼序列，(iii)包含於⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)的(i)，(ii)，或(iii)全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一1丨生。[18]段1-17任一項的突變體，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽組成。[19]段1-18任一項的突變體，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[20]段1-19任一項的突變體，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽組成。[21]段1-20任一項的突變體，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQIDN0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)
(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一'I"生。[22]段1-21任一項的突變體，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽組成。[23] 一種產生多肽的方法,其包括在用於產生多肽的培養基中培養親本木黴屬菌株的突變體，其中突變體菌株包含編碼多肽的多核苷酸，和一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一個或多個(幾個)基因經修飾使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株,分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶；和從培養基回收所述多肽。[24]段23的方法，其中所述突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。
[25]段23或24的方法，其中所述突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[26]段23-25任一項的方法，其中所述突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[27]段23-26任一項的方法，其中所述突變體包含第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[28]段23-27任一項的方法，其中所述突變體包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[29]段23-28任一項的方法，其中所述突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[30]段23-29任一項的方法，其中所述多肽對於木黴屬菌株是天然或外源的。
[31]段23-30任一項的方法,其中木黴屬菌株選自下組哈茨木黴,康寧木黴,長枝木黴，裡氏木黴，和綠色木黴。[32]段23-31任一項的方法，其中所述木黴屬菌株是裡氏木黴。[33]段23-32任一項的方法，其中所述突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，產生少至少25%的一種或多種(幾種)選自下組的酶第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[34]段23-32任一項的方法，其中所述突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，在一種或多種(幾種)選自下組的酶方面完全缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[35]段23-34任一項的方法，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[36]段23-35任一項的方法，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽組成。[37]段23-36任一項的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID NO: 3 ；(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[38]段23-37任一項的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽組成。[39]段23-38任一項的方法，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組
(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽編碼序列，(iii)包含於⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)的全長互補鏈，或(iii);和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[40]段23-39任一項的方法，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽組成。[41]段23-40任一項的方法，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列具有與SEQID NO: 100或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[42]段23-41任一項的方法，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽組成。[43]段23-42任一項的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDN0:107 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)
(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一'I"生。[44]段23-43任一項的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽組成。[45] 一種用於獲得親本木黴屬菌株的突變體的方法，其包括修飾一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和鑑定來自步驟(a)的突變體菌株，其中一個或多個(幾個)選自下組的基因經修飾第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[46]段45的方法，其中所述突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基 因的修飾。[47]段45或46的方法，其中所述突變體包含第一天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[48]段45-47任一項的方法，其中所述突變體包含胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[49]段45-48任一項的方法，其中所述突變體包含第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因的修飾。[50]段45-49任一項的方法，其中所述突變體包含第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[51]段45-50任一項的方法，其中所述突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。[52]段45-51任一項的方法，其中所述多肽對於木黴屬菌株是天然或外源的。[53]段45-52任一項的方法,其中所述木黴屬菌株選自下組哈茨木黴,康寧木黴，長枝木黴，裡氏木黴，和綠色木黴。[54]段45-53任一項的方法,其中所述木黴屬菌株是裡氏木黴。[55]段45-54任一項的方法,其中所述突變體菌株當在相同條件下培養時,相對於親本木黴屬菌株，產生少至少25%的一種或多種(幾種)選自下組的酶第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[56]段45-54任一項的方法,其中所述突變體菌株當在相同條件下培養時,相對於親本木黴屬菌株，在一種或多種(幾種)選自下組的酶方面完全缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。[57]段45-56任一項的方法，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID NO: I ；(ii)SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[58]段45-57任一項的方法，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO:2或其成熟多肽或由SEQ ID NO:2或其成熟多肽組成。[59]段45-58任一項的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:4或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少 中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID NO: 3 ；
(ii)SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[60]段45-59任一項的方法，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID N0:4或其成熟多肽或由SEQ ID N0:4或其成熟多肽組成。[61]段45-60任一項的方法，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO:6或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽編碼序列，(iii)包含於⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，
(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[62]段45-61任一項的方法，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ IDNO:6或其成熟多肽或由SEQ ID NO:6或其成熟多肽組成。[63]段45-62任一項的方法，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQ IDNO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID N0:99 ；(ii)SEQ ID N0:99的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列具有與SEQID NO: 100或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。[64]段45-63任一項的方法，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 100或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 100或其成熟多肽組成。[65]段45-64任一項的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因選自下組(a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQIDN0:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序 列同一'I"生。[66]段45-65任一項的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 108或其成熟多肽或由SEQ ID NO: 108或其成熟多肽組成。本文描述和要求保護的本發明並不局限於本文公開的具體方面的範圍內，因為這些方面旨在作為本發明幾個方面的說明。旨在將任何等同的方面包含於本發明的範圍內。實際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發明的多種修改對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權利要求的範圍內。在衝突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準。本文中引用了多種參考文獻，其公開通過全文提述併入本文。
權利要求
1.一種親本木黴屬(Trichoderma)菌株的突變體，其包含編碼多肽的多核苷酸和一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中所述一個或多個(幾個)基因經修飾使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，分別在選自下組的一種或多種(幾種)酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
2.權利要求I的突變體，其包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。
3.權利要求I或2的突變體，其中所述多肽對於木黴屬菌株是天然或外源的。
4.權利要求1-3任一項的突變體，其中所述木黴屬菌株選自下組哈茨木黴(Trichoderma harzianum),康寧木黴(Trichoderma koningii),長枝木黴(TrichodermaIongibrachiatum)，裡氏木黴(Trichoderma reesei)，和綠色木黴(Trichoderma viride)。
5.權利要求1-4任一項的突變體，其中所述木黴屬菌株是裡氏木黴。
6.權利要求1-5任一項的突變體，當其在相同條件下培養時,相對於親本木黴屬菌株，完全缺陷或產生少至少25%的選自下組的一種或多種(幾種)酶第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
7.權利要求1-6任一項的突變體，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQID N0:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO: I ； (ii) SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
8.權利要求1-7任一項的突變體，其中所述第一天冬氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO:4或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生; (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
9.權利要求1-8任一項的突變體，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO:6或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO:5 ；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽編碼序列，(iii)包含於⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i), (ii),或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
10.權利要求1-9任一項的突變體，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQID NO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少95%,或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO:99 ；(ii)SEQ ID NO:99的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
11.權利要求1-10任一項的突變體，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
12.—種產生多肽的方法，其包括(a)在用於產生多肽的培養基中培養權利要求1-11任一項的突變體；和 (b)從培養基回收所述多肽。
13.一種用於獲得親本木黴屬菌株的突變體的方法，其包括 (a)修飾一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因；和 (b)鑑定來自步驟(a)的突變體菌株，其中一個或多個(幾個)選自下組的基因經修飾第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，和胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
14.權利要求13的方法，其中所述突變體包含第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因的修飾。
15.權利要求13或14的方法，其中所述突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株,完全缺陷或產生少至少25%的一種或多種(幾種)選自下組的酶第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。
16.權利要求13-15任一項的方法，其中所述第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQID N0:2或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO: I ； (ii) SEQ ID NO: I的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: I或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
17.權利要求13-16任一項的方法，其中第一天冬氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO:4或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO: 3 ； (ii) SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv) (i),(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 3或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
18.權利要求13-17任一項的方法，其中所述胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO:6或其成熟多肽具有至少60%,例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一 I"生； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，高嚴格條件，或非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ ID NO:5 ；(ii)SEQ ID NO: 5的成熟多肽編碼序列，(iii)包含於⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)⑴，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 5或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
19.權利要求13-18任一項的方法，其中所述第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列或由胺基酸序列組成，所述胺基酸序列與SEQID NO: 100或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%,至少95%,或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO:99 ；(ii)SEQ ID NO:99的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 100或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
20.權利要求13-19任一項的方法，其中所述第二天冬氨酸蛋白酶基因選自下組 (a)多肽，其包含胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQID NO: 108或其成熟多肽具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性； (b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少低嚴格條件，至少中等嚴格條件，至少中-高嚴格條件，至少高嚴格條件，或至少非常高嚴格條件下與以下雜交(i) SEQ IDNO:3 ；(ii)SEQ ID NO: 107的成熟多肽編碼序列，(iii)⑴或(ii)的cDNA序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的全長互補鏈；和 (c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQID NO: 107或其cDNA，或它們的成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或100%序列同一性。
全文摘要
本發明涉及親本木黴屬菌株的突變體，其包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼多肽和一個或多個(幾個)選自下組的基因第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第一天冬氨酸蛋白酶基因，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因，和第二天冬氨酸蛋白酶基因，其中一個或多個(幾個)基因經修飾使得突變體菌株當在相同條件下培養時，相對於親本木黴屬菌株，分別在一種或多種(幾種)選自下組的酶的產生方面有缺陷第一枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第一天冬氨酸蛋白酶，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，第二枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，和第二天冬氨酸蛋白酶。本發明還涉及產生此類突變體中的多肽的方法，和用於產生此類突變體的方法。
文檔編號C12N9/58GK102762714SQ201080063993
公開日2012年10月31日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月18日
發明者A.詹, E.阿巴特, J.沙斯基, K.布朗, S.梅宇蘭, S.梅裡諾 申請人:諾維信股份有限公司