糖蛋白質組合物的製造方法

2023-07-04 01:47:21 2

專利名稱：糖蛋白質組合物的製造方法
技術領域：
本發明涉及一種其中被導入了能夠抑制酶功能的RNA的細胞，上述酶催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應；糖蛋白質的製造方法，該方法包括使用所述的細胞；用於製備該細胞的RNA；與RNA對應的DNA；和包括DNA及其互補DNA的載體。另外，本發明還涉及一種細胞，該細胞中被導入了能夠抑制糖鏈(其中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)修飾相關酶的功能的RNA，以及能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶蛋白質功能的RNA，或者能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA；以及糖蛋白質的製造方法，該方法包括使用所述的細胞。而且，本發明涉及包括與能夠抑制糖鏈(其中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA，和對應於能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶蛋白質功能的RNA或者能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA的DNA及其互補DNA；包括該DNA的載體；導入了該載體的細胞；導入了包括與能夠抑制糖鏈(其中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體，和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶蛋白質功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體的細胞；和使用該細胞製造糖蛋白質組合物的方法。
背景技術：
由於基因工程或細胞工程技術的迅速發展，在活體中以痕量存在的生理活性蛋白質可以大量地和穩定地提供至醫療部位，使得它們可以用於治療許多患者。這些蛋白質藥物可以作為基因工程藥物或細胞培養藥物來進行製造和銷售。這些蛋白質藥物可以分成簡單蛋白質藥物(其中糖鏈與其藥理活性無關)和糖蛋白質藥物(其中糖鏈在其生理活性中發揮重要的作用)。
促紅細胞生成素是一個典型的糖蛋白質藥物的例子，其中糖鏈在其藥理活性中發揮重要的作用。促紅細胞生成素證實有多種糖鏈結構，已知它有三種複合型N-糖苷-連接的四天線糖鏈(其中巖藻糖與三個核心結構相連)和一種O-糖苷-連接的糖鏈。糖鏈結構與促紅細胞生成素的體內生理學活性密切相關，去除O-糖苷-連接的糖鏈不影響其生理活性(非專利參考文獻1和2)，但是去掉N-糖苷-連接的糖鏈後則喪失其生理活性(非專利參考文獻3)。而且，將唾液酸添加至N-糖苷-連接的糖鏈上和糖鏈結構的差異如支鏈結構均影響其藥理活性(非專利參考文獻4、5和6)。此外，還顯示糖鏈結構中巖藻糖被修飾的蛋白質通常在血液中半衰期較短(非專利參考文獻7)。
就抗體而言，已知藥理活性極大地受糖鏈結構的影響。
在IgG型抗體分子的Fc區，存在兩個N-糖苷-連接糖鏈結合位點。在血清IgG中，複合型糖鏈具有多個分支，其中唾液酸或平分型(bisecting)N-乙醯氨基葡萄糖以很低的比例結合在糖鏈結合位點上。在複合型糖鏈的非還原末端上添加半乳糖和在還原末端上添加N-乙醯氨基葡萄糖是相異的(非專利參考文獻8)。糖鏈結構(即巖藻糖添加在與抗體Fc區結合的N-糖苷-連接糖鏈還原末端中的N-乙醯氨基葡萄糖上)在抗體的效應器功能中發揮著重要作用，例如依賴抗體的細胞介導細胞毒性活性(下文中稱為「ADCC活性」)和依賴補體的細胞毒性活性(下文中稱為「CDC活性」)(專利參考文獻1和2，和非專利參考文獻9和10)。
許多被認為用作藥物的糖蛋白質通過重組DNA技術來產生，通過使用動物細胞如CHO細胞(來源於中國倉鼠卵巢組織)作為宿主細胞來製造。但是，通過使用重組DNA技術產生的糖蛋白質的糖鏈結構取決於宿主細胞的不同而有所不同(非專利參考文獻10和11)。因此，糖鏈常常不添加至由重組DNA技術產生的糖蛋白質上，以便發揮適當的藥理活性。
已經考慮使用糖鏈修飾相關酶的抑制劑作為控制細胞中糖鏈修飾相關酶的活性和修飾所產生的糖蛋白質糖鏈結構的方法。但是，由於抑制劑的特異性很低，很難充分地抑制靶酶，因此確實很難控制所產生抗體的糖鏈結構。
而且，已經有人考慮通過導入編碼糖鏈修飾相關酶的基因來修飾所產生的糖蛋白質的糖鏈結構(非專利參考文獻12和13)。當使用導入了β1，4-N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶III(GnTIII)的CHO細胞來表達抗體時，抗體的ADCC活性比用親代細胞表達的抗體高16倍(非專利參考文獻11和專利參考文獻3)。但是，由於已有報導稱GnTIII或β-1，4-N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶V(GnTV)的過量表達顯示出對CHO細胞的毒性，因此它不適合用於生產治療用抗體。
已經報導了糖蛋白質的多個製造實施例，其中通過使用其中突變體作為宿主細胞改變所產生糖鏈的結構，上述突變體中編碼糖鏈修飾相關酶的基因的活性被改變。已經獲得了其中糖鏈修飾相關酶的活性被改變的突變體，例如，作為對凝集素如WGA(來源於百裡香(T.vulgaris)的麥芽凝集素)、ConA(來源於矮生刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白質A)、RIC(來源於蓖麻(R.communis)的毒素)、L-PHA(來源於菜豆(P.vulgaris)的白細胞凝集素)、LCA(來源於兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素)、PSA(來源於豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)表現出抗性的克隆(非專利參考文獻14)。已經報導了一種情形，其中通過使用這種糖鏈修飾相關酶的活性被改變的突變體作為宿主細胞來生成糖鏈結構被改變的糖蛋白質。具體例子包括一則報告，該報告關於使用其中N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶I(GnTI)的活性被缺失的CHO細胞突變克隆來產生具有高甘露糖型糖鏈結構的抗體(非專利參考文獻15)。另外，還有一則報導是關於使用CMP-唾液酸轉運子-或UDP-半乳糖轉運子缺陷克隆來表達具有其中唾液酸未添加到糖鏈非還原末端的糖鏈結構的抗體或其上未添加半乳糖的抗體，但是表達效應器的活性提高，適合用於藥物應用的抗體尚未成功(非專利參考文獻15)。
在這種情況下，最近有報導稱適合用於醫療用途、ADCC活性高的抗體可以通過使用GDP-甘露糖4，6-脫水酶(下文中亦稱「GMD」)活性降低的克隆作為宿主細胞來產生，上述的酶在細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖的從頭合成途徑中催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應(專利參考文獻1，和非專利參考文獻9和10)。在這些報導中，使用對識別糖鏈結構(該糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)的凝集素有抗性的克隆作為宿主細胞，例如對AAL(來源於橙黃網胞盤菌(Aleuria aurantia)的凝集素)有抗性的克隆CHO-AAL、對LCA(來源於兵豆的扁豆凝集素)有抗性的克隆CHO-LCA、或克隆Lec 13。除這些之外，也已經知道確定為小鼠白血病來源的克隆BW5147的PSA(來源於豌豆的豌豆凝集素)-抗性突變體的PLR1.3是GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性降低的克隆(非專利參考文獻16)。
但是，由於這些克隆中的每一種均不是完全的基因缺陷克隆，因此很難使抗體攜帶導致抗體顯示高ADCC活性的糖鏈結構，即，很難完全阻止巖藻糖添加到N-糖苷-連接糖鏈中還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖上。另外，由於突變體如PLR1.3和Lec13也通過用誘變劑處理隨機導入突變而獲得，因此它們不適合用作生產藥學製劑的克隆。
如上所述，對於在宿主細胞中控制糖鏈修飾相關酶或蛋白質的活性以便修飾所產生糖蛋白質的糖鏈結構，已經進行了許多的嘗試。但是，由於糖鏈的修飾機制很多且很複雜，糖鏈的生理學功能也尚未完全揭曉，目前仍在反覆進行試驗。尤其是，儘管已經生成了已經獲得催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶活性的克隆和效應器活性很高的抗體組合物，但是仍不能充分地控制活性。
作為在宿主細胞中僅控制糖鏈修飾相關酶或蛋白質活性的一個例子，已知有一種使用siRNA(小幹擾RNA)控制特定基因功能的方法(專利參考文獻4)。另外，有一則報導是設計用於抑制基因功能的RNA分子的方法(非專利參考文獻17)。但是，通過這種方法設計的RNA分子並不一定是可以有效抑制靶基因功能的分子(非專利參考文獻18)，設計對特定基因顯示有效功能夠抑制效應的RNA分子仍在反覆試驗中。
另外，也顯示使用其中導入有能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA的細胞(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，可以控制對巖藻糖與添加到已產生的糖蛋白質上的糖鏈結合的修飾(專利參考文獻2和4)。這些報導顯示，通過將能夠抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶功能的RNA導入產生抗體分子的細胞系中，可以增加結合已產生的抗體分子的糖鏈當中未結合巖藻糖的糖鏈的比例。
專利參考文獻1WO00/61739專利參考文獻2WO02/31140專利參考文獻3WO99/54342專利參考文獻4WO03/85118非專利參考文獻1Biochemistry，31，9872(1992)非專利參考文獻2J.Biol.Chem.，267，7703(1992)非專利參考文獻3J.Biol.Chem.，265，12127(1990)非專利參考文獻4Blood，73，84，(1989)非專利參考文獻5Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，7819(1989)非專利參考文獻6British J.Cancer，84，3，(2001)非專利參考文獻7Science，295，1898(2002)非專利參考文獻8Biochemistry，36，130(1997)非專利參考文獻9J.Biol.Chem.，277，26733(2002)非專利參考文獻10J. Biol.Chem.，278，3466(2003)非專利參考文獻11Glycobiology，5，813，(1995)非專利參考文獻12J.Biol.Chem.，261，13848(1989)非專利參考文獻13Science，252，1668(1991)非專利參考文獻14Somatic Cell Mol Genet.，12，51(1986)非專利參考文獻15J.Immunol.，160，3393(1998)非專利參考文獻16J.Biol.Chem.，255，9900(1980)非專利參考文獻17Nature Biotech.，22，326(2004)非專利參考文獻18Current Opinion in Molecular Therapeutics，6，129(2004)發明內容本發明要解決的問題本發明的一個目的是提供一種細胞，其中導入了能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶的功能的RNA；使用該細胞製造蛋白質組合物的方法；用於製備該細胞的RNA；與該RNA對應的DNA；和包括所述DNA及其互補DNA的載體。
另外，本發明的一個目的是提供一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶蛋白質的功能的RNA，或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體相關蛋白質的功能的RNA；以及使用該細胞製造糖蛋白質組合物的方法。
而且，本發明的一個目的是提供一種DNA，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(其中上述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA，或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA；包括該DNA的載體；導入該載體的細胞；導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(其中上述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)的載體，和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶蛋白質的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA，或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體的細胞；和使用該細胞製造糖蛋白質組合物的方法。
解決問題的方式本發明涉及下列的(1)至(71)(1)一種細胞，其中導入了包括選自下列(a)或(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的活性的RNA。
(2)根據(1)的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖脫水反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
(3)根據(2)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下列(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(4)根據(2)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
(5)一種雙鏈RNA，其包括選自下列(a)或(b)的RNA及其互補RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的活性的RNA。
(6)與(5)中所述的RNA對應的DNA及其互補DNA。
(7)一種載體，其包括與(5)中所述的RNA對應的DNA。
(8)一種細胞，其中導入了(7)中所述的載體。
(9)一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶的功能的RNA，或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA。
(10)一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA。
(11)根據(9)或(10)的細胞，其中所述的細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶是催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶。
(12)根據(9)至(11)中任意一項的細胞，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
(13)根據(12)的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
(14)根據(12)的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下列(a)至(1)的蛋白質(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(j)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(1)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
(15)根據(9)至(14)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)至(d)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
(16)根據(9)至(14)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接
(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
(17)根據(11)至(16)中任意一項的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
(18)根據(17)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
(19)根據(17)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
(20)根據(11)至(19)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)至(c)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
(21)根據(11)至(19)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
(22)一種DNA，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA，或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA。
(23)一種DNA，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA。
(24)根據(22)或(23)的DNA，其中所述的細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶是催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶。
(25)根據(22)至(24)中任意一項的DNA，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
(26)根據(25)的DNA，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
(27)根據(25)的DNA，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下面(a)至(l)的蛋白質
(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(j)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(1)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
(28)根據(22)至(27)中任意一項的DNA，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是選自下列(a)至(d)的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
(29)根據(22)至(27)中任意一項的DNA，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是選自下列(a)和(b)的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
(30)根據(24)至(29)中任意一項的DNA，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
(31)根據(30)的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
(32)根據(30)的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；
(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
(33)根據(24)至(32)中任意一項的DNA，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是選自下列(a)至(c)的RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
(34)根據(24)至(32)中任意一項的DNA，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是選自下面(a)和(b)的RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
(35)一種載體，其包括(22)至(34)中任意一項中所述的DNA。
(36)根據(35)的載體，其包括SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ ID NO92所示的DNA。
(37)根據(35)的載體，其包括SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ ID NO92所示的DNA。
(38)根據(35)的載體，其包括SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA。
(39)根據(35)的載體，其包括SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA。
(40)一種細胞，其中導入了(35)至(39)中任意一項的載體。
(41)一種細胞，其中導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體，或包括與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體。
(42)一種細胞，其中導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體。
(43)根據(41)或(42)的細胞，其中所述的能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶蛋白質功能的RNA是能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA。
(44)根據(41)至(43)中任意一項的細胞，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
(45)根據(44)的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
(46)根據(44)的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下列(a)至(1)的蛋白質(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；
(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(j)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(l)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
(47)根據(41)至(46)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)至(d)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
(48)根據(41)至(46)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；
(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
(49)根據(43)至(48)中任意一項的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
(50)根據(49)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
(51)根據(49)的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；
(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
(52)根據(43)至(51)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)至(c)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
(53)根據(43)至(51)中任意一項的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
(54)根據(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(53)中任意一項的細胞，其對識別如下糖鏈結構的凝集素有抗性在N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
(55)根據(54)的細胞，其中所述的凝集素選自下列(a)至(d)(a)兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(來源於兵豆的扁豆凝集素)；(b)豌豆(P.sativum)凝集素PSA(來源於豌豆的豌豆凝集素)；(c)蠶豆(Vicia faba)凝集素VFA(來源於蠶豆的凝集素)；(d)橙黃網胞盤菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(來源於橙黃網胞盤菌的凝集素)。
(56)根據(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(55)中任意一項的細胞，其為選自酵母、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞的細胞。
(57)根據(56)的細胞，其中所述的動物細胞選自下列(a)至(k)(a)來源於中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞；(b)大鼠骨髓瘤細胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；(c)小鼠骨髓瘤細胞系NS0細胞；(d)小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14細胞；(e)來源於敘利亞倉鼠腎組織的BHK細胞；(f)產生抗體的雜交瘤細胞；(g)人白血病細胞系Namalwa細胞；(h)人白血病細胞系NM-F9細胞；(i)人胚胎視網膜細胞系PER.C6細胞；(j)胚胎幹細胞；(k)受精卵細胞。
(58)根據(1)至(4)、(8)至(21)和(40)至(57)中任意一項的細胞，其包括編碼糖蛋白質的基因。
(59)根據(58)的細胞，其中所述的糖蛋白質是抗體分子。
(60)根據(59)的細胞，其中所述的抗體分子選自下列(a)至(d)(a)人抗體；(b)人源化抗體；(c)包括(a)或(b)的Fc區的抗體片段；(d)包括(a)或(b)的Fc區的融合蛋白質。
(61)根據(59)或(60)的細胞，其中所述的抗體分子屬於IgG型。
(62)一種糖蛋白質組合物的製造方法，其包括使用(58)中所述的細胞。
(63)一種糖蛋白質組合物的製造方法，其包括將(58)中所述的細胞在培養基中培養，在培養物形成並積聚糖蛋白質組合物；和從培養物中回收和純化糖蛋白質組合物。
(64)一種抗體組合物的製造方法，其包括使用(59)至(61)中任意一項中所述的細胞。
(65)一種抗體組合物的製造方法，其包括將(59)至(61)中任意一項所述的細胞在培養基中培養，在培養物形成和積聚抗體組合物；和從培養物中回收和純化抗體組合物。
(66)根據(64)或(65)的方法，其中所述的抗體組合物是依賴抗體的細胞介導細胞毒性活性高於其親代細胞產生的抗體組合物的抗體組合物。
(67)根據(66)的方法，其中所述的依賴抗體的細胞介導細胞毒性活性較高的抗體組合物中，糖鏈還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖未結合巖藻糖的糖鏈在與抗體組合物Fc區結合的全部複合型N-糖苷-連接糖鏈當中的比例高於其親代細胞產生的抗體組合物。
(68)根據(67)的方法，其中所述的未結合巖藻糖的糖鏈是在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位不與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結合的糖鏈。
(69)通過(62)或(63)中所述的方法產生的糖蛋白質組合物。
(70)通過(64)至(68)中任意一項所述的方法產生的抗體組合物。
(71)一種藥物，其包括(69)或(70)所述的組合物作為活性成分。
本發明的效果本發明提供一種其中被導入了能夠抑制酶功能的RNA的細胞，上述酶催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應；使用所述細胞製造糖蛋白質的方法；用於製備該細胞的RNA；與該RNA對應的DNA；和包括該DNA及其互補DNA的載體。另外，本發明還提供一種細胞，該細胞中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，以及能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶蛋白質功能的RNA，或者能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA；以及使用所述細胞製造糖蛋白質的方法。而且，本發明提供一種包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和對應於能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA或者能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA的DNA及其互補DNA；包括該DNA的載體；導入了該載體的細胞；導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接的糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體的細胞；和使用所述細胞製造糖蛋白質組合物的方法。
下面對本發明進行詳細說明。本申請要求於2004年8月5日提交的日本專利申請第2004-228928號、於2004年8月31日提交的日本專利申請第2004-252682號和於2005年5月9日提交的日本專利申請第2005-136410號的優先權，在此引入這些申請的說明書和附圖作為參考。


圖1顯示了質粒pBS-U6term的構建。
圖2顯示了質粒pPUR-U6term的構建。
圖3顯示了質粒pPUR/GMDshB的構建。
圖4顯示了每個克隆中GMD mRNA的量。橫坐標表示假設親代克隆32-05-12的量為100時GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色條表示未導入siRNA的親代克隆，空心條表示單獨導入GMD-靶向siRNA表達載體的克隆。
圖5顯示了克隆32-05-12AF(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)、和抗凝集素克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF(通過無血清流加式培養向其中導入了GMD-靶向siRNA表達質粒)活細胞密度的變化。橫坐標和縱坐標分別表示培養天數和活細胞密度。在圖中，實心三角、空心圓圈和實心圓圈分別表示克隆32-05-12AF、克隆12-GMDB-2AF和克隆12-GMDB-5。
圖6顯示了克隆32-05-12AF(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)、和導入GMD-靶向siRNA表達質粒的抗凝集素克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF的無血清流加式培養的培養上清液中積累的抗體數量的變化。橫坐標和縱坐標分別表示培養天數和所積累抗體的量。在圖中，實心三角、空心圓圈和實心圓圈分別表示克隆32-05-12AF、克隆12-GMDB-2AF和克隆12-GMDB-5。
圖7顯示了質粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR和FUT8shRNA/lib3/pPUR的構建。
圖8顯示了質粒FT8libB/pBS和FT8lib3/pBS的構建。
圖9顯示了質粒FT8libB/pAGE和FT8lib3/pAGE的構建。
圖10顯示了在導入GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體或者單獨導入GMD-靶向siRNA表達載體的每個克隆中以及親代克隆中GMD mRNA的量。橫坐標表示當假設親代克隆32-05-12的量為100時GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示沒有導入siRNA的親代克隆和單獨導入GMD-靶向siRNA表達載體的克隆。
圖11顯示了在導入GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體或者單獨導入GMD-靶向siRNA表達載體的每個克隆中以及親代克隆中FUT8 mRNA的量。橫坐標表示當假設親代克隆32-05-12的量為100時FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示沒有導入siRNA的親代克隆和單獨導入GMD-靶向siRNA表達載體的克隆。
圖12顯示了克隆32-05-12AF(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)、和在無血清流加式培養中導入GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的抗凝集素克隆Wi23-5AF活細胞密度的變化。橫坐標和縱坐標分別表示培養天數和活細胞密度。在圖中，虛線和實線分別表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
圖13顯示了克隆32-05-12AF(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)、和導入GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的抗凝集素克隆Wi23-5AF的無血清流加式培養培養上清液中積累的抗體的量的變化。橫坐標和縱坐標分別表示培養天數和所積累抗體的量。在圖中，虛線和實線分別表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
圖14顯示了標準樣品的shFcγRIIIa結合活性，該標準品中抗CCR4嵌合抗體的巖藻糖(-)％是已知的。橫坐標和縱坐標分別表示巖藻糖(-)％和顯示shFcγRIIIa結合活性的490nm處的吸光度。
圖15顯示了由克隆32-05-12AF(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)或導入GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的抗凝集素Wi23-5AF克隆的無血清流加培養基中培養上清液中所含抗CCR4嵌合抗體的shFcγRIIIa結合活性計算的巖藻糖(-)％。橫坐標和縱坐標分別表示培養天數和巖藻糖(-)％。在圖中，虛線和實線分別表示32-05-12AF和Wi23-5AF克隆。
圖16顯示了質粒pCR/GMDshB和pCR/GMDmB的構建。
圖17顯示了質粒FT8libB_GMDB/pAGE、FT8lib3_GMDB/pAGE、FT8libB_GMDmB/pAGE和FT8lib3_GMDmB/pAGE的構建。
圖18顯示了通過將GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆32-05-12(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的GMD mRNA的相對量。橫坐標表示當假設親代克隆32-05-12的量為100時GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆32-05-12的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的GMD mRNA的相對量。
圖19顯示了通過將GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆32-05-12(其為來源於CHO/DG44細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的FUT8 mRNA相對量。橫坐標表示當假設親代克隆32-05-12的量為100時，FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的FUT8 mRNA的相對量。
圖20顯示了質粒pPUR/GMDmB的構建。
圖21顯示了通過將小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆KM968(其為來源於SP2/0細胞的產生抗GM2抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的GMD mRNA的相對量。橫坐標表示當假設親代克隆KM968的量為100時，GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆KM968的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的GMD mRNA的相對量。
圖22顯示了通過將小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆KM968(其為來源於SP2/0細胞的產生抗GM2抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的FUT8 mRNA的相對量。橫坐標表示當假設親代克隆KM968的量為100時，FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆KM968的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的FUT8 mRNA的相對量。
圖23顯示了通過將小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆NS0/2160(其為來源於NS0細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的GMD mRNA的相對量。橫坐標表示當假設親代克隆NS0/2160的量為100時，GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆NS0/2160的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的GMD mRNA的相對量。
圖24顯示了通過將小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入克隆NS0/2160(其為來源於NS0細胞的產生抗CCR4抗體的克隆)獲得的每個克隆中表達的FUT8 mRNA的相對量。橫坐標表示當假設親代克隆NS0/2160的量為100時，GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，縱坐標表示每個克隆。在圖中，黑色和空心條分別表示當假設親代克隆NS0/2160的量為100時，親代克隆和通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的每個克隆的FUT8 mRNA的相對量。
具體實施例方式
在本發明中，細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶(下文中亦稱為「GDP-巖藻糖合成酶」)可以是任何酶，只要它是與細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關的酶，在細胞中為糖鏈提供巖藻糖來源。另外，本發明中的GDP-巖藻糖合成酶還包括對細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有影響的酶和類似物。
細胞內GDP-巖藻糖由從頭合成途徑或補救(salvage)合成途徑提供。因此，所有與合成途徑相關的酶和蛋白質均包括在GDP-巖藻糖合成酶中。
與從頭合成途徑有關的GDP-巖藻糖合成酶包括催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶、催化GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖轉化為GDP-巖藻糖的反應的酶、和類似物。
在本發明中，作為催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶，優選使用催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的脫水反應的酶。催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖脫水反應的酶包括GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
在本發明中，催化GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖轉化為GDP-巖藻糖的反應的酶包括催化GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-巖藻糖的反應的酶、催化GDP-酮-6-脫氧-GDP-巖藻糖4-位的還原反應的酶、和類似酶。具體的例子包括GDP-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶、具有催化GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-巖藻糖的反應和催化GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-巖藻糖4-位上的還原反應的酶活性的4-還原酶、和類似酶。
與補救合成途徑有關的GDP-巖藻糖合成酶包括GDP-β-L-巖藻糖焦磷酸化酶、巖藻糖激酶(fucokinase)和類似酶。
作為對細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成有影響的酶，也包括對上述GDP-巖藻糖合成酶的活性有影響的酶和對作為酶底物的物質的結構有影響的酶。
在本發明中，與細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體有關的蛋白質可以是任何蛋白質，只要它涉及細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的轉運。具體例子包括GDP-巖藻糖轉運子和類似物。
在本發明中導入了能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA的細胞可以是任何細胞，只要它是被導入了能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶(下文中亦稱為「GDP-甘露糖轉化酶」)的活性或表達的RNA的細胞。
在本發明中，GDP-甘露糖4，6-脫水酶優選地用作GDP-甘露糖轉化酶。
在本發明中，GDP-甘露糖4，6-脫水酶包括由下面(a)至(f)中的DNA編碼的蛋白質、下列(g)至(o)中的蛋白質和類似物(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(g)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(h)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；
(i)包括由SEQ IDNO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(j)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(k)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(l)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(m)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(n)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(o)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
另外，編碼GDP-甘露糖4，6-脫水酶胺基酸序列的DNA還包括包括SEQ ID NO8至10中任意一個所示的核苷酸序列的DNA、在嚴格性條件下與SEQ ID NO8至10中任意一個所示的核苷酸序列組成的DNA雜交並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的胺基酸序列的DNA和類似物。
另外，本發明還涉及一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA，或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA。
在本發明中，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA、或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞可以是任何細胞，只要它是導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的活性或表達的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的活性或表達的RNA、或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的活性或功能的RNA的細胞。優選導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶的活性或表達的RNA、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的活性或表達的RNA的細胞，更優選導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶活性或表達的RNA、和能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶(GDP-甘露糖轉化酶)活性或表達的RNA的細胞。
在本發明中，α1，6-巖藻糖修飾酶包括任何酶，只要它是糖鏈修飾相關酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
α1，6-巖藻糖修飾酶的具體例子包括α1，6-巖藻糖基轉移酶、α-L-巖藻糖苷酶和類似物。
α1，6-巖藻糖基轉移酶包括由下列(a)至(h)中的DNA編碼的蛋白質、下列(i)至(t)中的蛋白質、和類似物(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；
(i)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(j)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(k)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(l)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(m)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(n)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(o)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(p)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(q)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(r)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(s)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(t)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
另外，編碼α1，6-巖藻糖基轉移酶胺基酸序列的DNA還包括包括SEQ ID NO1至4中任意一個所示核苷酸序列的DNA、在嚴格條件下與由SEQ ID NO1至4中任意一個所示核苷酸序列組成的DNA雜交並且編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的胺基酸序列的DNA、和類似物。
在本發明中，可以在嚴格條件下雜交的DNA是指使用例如具有SEQ ID NO1-4和4-8中任意一個所示核苷酸序列的DNA或其部分片段作為探針，通過諸如集落雜交、噬菌斑雜交、或DNA印記雜交的方法獲得的DNA，具體地，包括通過進行下列雜交鑑定的DNA在存在0.7至1.0mol/L氯化鈉的情況下，使用其上固定有來自集落或噬菌斑的DNA的濾膜，然後在65℃下用0.1至2×SSC溶液(1×SSC溶液包括150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)洗滌濾膜。可以根據下列文獻所述的方法進行雜交Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition(分子克隆，實驗手冊，第二版)，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)(下文稱為「Molecular Cloning，第二版」)、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物學實驗方法)，John Wiley Sons，1987-1997(下文稱為「Current Protocols in MolecularBiology」)；DNA Cloning 1 Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition(DNA克隆1核心技術，實踐方法，第二版)，OxfordUniversity(1995)；和類似文獻。可雜交的DNA包括與SEQ ID NO1-4和8-10中任意一個所示核苷酸序列的同源性為至少60％或更高、優選70％或更高、更優選80％或更高、進一步優選90％或更高、尤其優選95％或更高、最優選98％或更高的DNA。
在本發明中，包括SEQ ID NO5-7和84中任意一個所示胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質，或者包括SEQ ID NO11-13中任意一個所示胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質，均可以通過下列方法獲得例如，通過位點定點誘變將位點定點突變引入編碼具有SEQ ID NO5-7和84中任意一個或SEQ IDNO11-13中任意一個所示胺基酸序列的蛋白質的DNA，其描述可參見例如，Molecular Cloning，第二版；Current Protocols in MolecularBiology；Nucleic Acids Research，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)；Gene，34，315(1985)；NucleicAcids Research，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82，488(1985)等。被缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸的數目是一個或多個，不進行具體限定，但是在通過已知方法如位點定向誘變可能實現的缺失、取代或添加的數目。例如，它為1至數十個，優選1至20，更優選1至10，進一步優選1至5。
在本發明中，包括與SEQ ID NO11至13中任意一個所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質是與SEQ ID NO11至13中任意一個所示胺基酸序列的同源性為至少80％或更高、優選為85％或更高、更優選為90％或更高、進一步優選為95％或更高、特別優選為97％或更高、最優選為99％或更高、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
另外，在本發明中，包括與SEQ ID NO5-7和48中任意一個所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質是與SEQ ID NO5-7和48中任意一個所示胺基酸序列的同源性為至少80％或更高、優選為85％或更高、更優選為90％或更高、進一步優選為95％或更高、特別優選為97％或更高、最優選為99％或更高、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
除非另外說明，本發明中所述的同源性數目可以是通過已知的同源性搜索程序計算的數目。就核苷酸序列而言，可以通過在BLAST[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]或類似程序中使用預設參數來計算該數目，就胺基酸序列而言，可以通過在BLAST2[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)；Genome Res.，7，649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]或類似程序中使用預設參數來計算該數目。
作為預設參數，核苷酸序列的G[起始開放空位(cost to open gap)]為5，胺基酸序列的G為11；核苷酸序列的-E[起始延伸空位(cost toextend gap)]為2，胺基酸序列的-E為1；-q(核苷酸錯配罰分)為-3；-r(核苷酸匹配補償)為1；-e(期望值)為10；核苷酸序列的-W(字長)是11個殘基，胺基酸序列的-W是3個殘基；blastn的-y[blast延伸的X閾值(dropoff)，以位計算]為20，blastn之外的程序為7；-X[空位聯配X閾值(dropoff value)，以位計算]為15；blastn的-Z[最終的空位聯配X閾值(dropoff value)，以位計算]為50，blastn之外的程序為25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。另外，胺基酸序列的分析軟體還包括FASTA[Methods in Enzymology，183，63(1990)]和類似程序。
在本發明中使用的細胞可以是任何細胞，只要它可以表達糖蛋白質如抗體分子。例子包括酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞以及類似物，優選為動物細胞。動物細胞中的優選實施例包括來源於中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞、大鼠骨髓瘤細胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、小鼠骨髓瘤細胞系NS0細胞、小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14細胞、來源於敘利亞倉鼠腎組織的BHK細胞、產生抗體的雜交瘤細胞、人白血病細胞系Namalwa細胞、胚胎幹細胞、受精卵細胞、以及類似細胞。
在本發明中，其中導入了能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA的細胞，或者其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞(下文中統稱為「本發明的細胞」)對識別糖鏈結構的凝集素有抗性，所述糖鏈結構中在N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接的糖鏈結構。其中未導入RNA的親代細胞對凝集素沒有抗性。
因此，在本發明中，本發明的細胞包括可以產生糖蛋白質組合物、並對識別糖鏈結構的凝集素有抗性的細胞(所述糖鏈結構中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，例如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞。例子包括雜交瘤細胞、產生人抗體或人源化抗體的宿主細胞、產生轉基因非人動物(其生成人抗體)的胚胎幹細胞和受精卵細胞、產生轉基因植物(其生成人抗體)的植物愈傷組織細胞、骨髓瘤細胞、來源於轉基因非人動物的細胞和對識別糖鏈結構的凝集素有抗性的類似細胞(所述糖鏈結構中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)。骨髓瘤細胞可以用作產生雜交瘤細胞的融合細胞。另外，雜交瘤細胞還可通過用抗原對轉基因非人動物進行免疫，使用產生抗體的細胞如動物脾細胞來產生。
對凝集素有抗性的細胞是向培養基中加入有效濃度的凝集素來進行細胞培養時，其生長不受抑制的細胞。
在本發明中，不抑制生長的凝集素有效濃度可以取決於用作親代細胞的細胞系進行調節，其通常為10μg/ml至10.0mg/ml，優選為0.5至2.0mg/ml。當能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA被導入親代細胞時，或者當能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質的功能的RNA被導入親代細胞時，凝集素的有效濃度是親代細胞不能正常生長的濃度或比其高的濃度，該濃度優選為與親代細胞不能正常生長的濃度相同，更優選為比親代細胞不能正常生長的濃度高2至5倍、進一步更優選至少10倍、最優選至少20倍。
親代細胞是指在導入能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA之前的細胞，或者是在導入能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA之前的細胞。
儘管親代細胞沒有具體限定，仍以下列細胞作為例子。
NS0細胞的親代細胞包括下列文獻所述的NS0細胞例如BIO/TECHNOLOGY，10，169(1992)和Biotechnol.Bioeng.，73，261(2001)。另外，它還包括登記於RIKEN Cell Bank，The Institute of Physical andChemical Research的細胞系NS0(RCB 0213)、通過將這些細胞系在各種其可生長的培養基中適應性生長得到的亞系(sub-line)以及類似物。
SP2/0-Ag14細胞的親代細胞包括下列文獻所述的SP2/0-Ag14細胞例如，J.Immunol.，126，317(1981)；Nature，276，269(1978)和Human Antibodies and Hybridomas，3，129(1992)所述的。而且，其還包括登記於ATCC的SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL-1581)、通過將這些細胞系在各種其可以生長的培養基中適應性生長得到的亞系(ATCCCRL-1581.1)以及類似物。
來源於中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞的親代細胞包括下列文獻所述的CHO細胞例如，Journal of Experimental Medicine，108，945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275(1968)；Genetics，55，513(1968)；Chromosoma，41，129(1973)；Methods in Cell Science，18，115(1996)、Radiation Research，148，260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)；Proc.Natl.AcadSci.USA，60，1275(1968)；Cell，6，121(1975)；和Molecular Cell Genetics，附錄I，II(第883-900頁)。而且，其還包括登記於ATCC的細胞系CHO-K1(ATCC CCL-61)、細胞系DUXB11(ATCC CRL-9096)和細胞系Pro-5(ATCC CRL-1781)、市售的細胞系CHO-S(Lifetechnologies的Cat#11619)，將這些細胞系在其可生長的各種培養基中適應性生長得到的亞系及類似物。
大鼠骨髓瘤細胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞的親代細胞包括從Y3/Ag1.2.3細胞建立的細胞系(ATCC CRL-1631)，例如文獻例如J.CellBiol.，93，576(1982)和Methods Enzymol.，73B，1(1981)所述的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞。而且，其包括登記於ATCC的YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL-1662)、將這些細胞系在各種其可生長的培養基中適應性生長得到的亞系、及類似物。
除上述細胞之外，用於本發明中的親代細胞包括人白血病細胞系NM-F9細胞(DSM ACC2605，WO05/17130)、人胚胎視網膜細胞系PER.C6細胞(ECACC No.96022940，US6855544)、將這些細胞系在各種其可生長的培養基中適應性生長得到的亞系、及類似物。
識別其中在複合型N-糖苷連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接的糖鏈結構的凝集素可以是任何凝集素，只要其可以識別該糖鏈結構。具體的例子包括兵豆(Lensculinaris)凝集素LCA(來源於兵豆的扁豆凝集素)、豌豆(Pisumsativum)凝集素PSA(來源於豌豆的豌豆凝集素)、蠶豆(Vicia faba)凝集素VFA(來源於蠶豆的凝集素)和橙黃網胞盤菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(來源於橙黃網胞盤菌的凝集素)、和類似物。
在本發明中，能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA、或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA可以是任何RNA，只要它包括RNA及其互補RNA，分別是能夠降低α1，6-巖藻糖修飾酶mRNA的量的雙鏈RNA、和能夠降低細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的mRNA的量或者將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體相關的蛋白質mRNA的量的雙鏈RNA。就RNA的長度而言，其例子為10至40、優選10至30、更優選15至30的連續RNA。
能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA、或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA優選為能夠降低GDP-甘露糖轉化酶的mRNA的量的RNA。
例子包括(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
優選的例子包括(1)包括SEQ ID NO37所示的核苷酸序列的RNA；(2)由在SEQ ID NO37所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的活性的RNA；(1)包括SEQ ID NO37所示的核苷酸序列的RNA；(2)由在SEQ ID NO37所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的活性的RNA；(3)包括SEQ ID NO57所示的核苷酸序列的RNA；(4)由在SEQ ID NO57所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的活性的RNA；
(5)包括SEQ ID NO58所示的核苷酸序列的RNA；(6)由在SEQ ID NO58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的活性的RNA。
在上述(a)至(c)和(1)至(6)的RNA中，優選(a)、(1)和(2)中的RNA用於來源於倉鼠的親代細胞，(b)、(3)和(4)中的RNA用於來源於人的親代細胞，(c)、(5)和(6)中的RNA用於來源於小鼠的親代細胞，作為能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA。
在本發明中，能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA優選為能夠降低α1，6-巖藻糖修飾酶mRNA數量的RNA。RNA的長度為，例如，10至40、優選10至30、更優選15至30。
例子包括(d)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(e)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(f)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(g)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
優選的例子包括(7)包括SEQ ID NO14所示的核苷酸序列的RNA；(8)由在SEQ ID NO14所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(9)包括SEQ ID NO15所示的核苷酸序列的RNA；(10)由在SEQ ID NO15所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(11)包括SEQ ID NO16所示的核苷酸序列的RNA；
(12)由在SEQ ID NO16所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(13)包括SEQ ID NO17所示的核苷酸序列的RNA；(14)由在SEQ ID NO17所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(15)包括SEQ ID NO18所示的核苷酸序列的RNA；(16)由在SEQ ID NO18所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(17)包括SEQ ID NO19所示的核苷酸序列的RNA；(18)由在SEQ ID NO19所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(19)包括SEQ ID NO20所示的核苷酸序列的RNA；(20)由在SEQ ID NO20所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(21)包括SEQ ID NO21所示的核苷酸序列的RNA；(22)由在SEQ ID NO21所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(23)包括SEQ ID NO22所示的核苷酸序列的RNA；(24)由在SEQ ID NO22所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(25)包括SEQ ID NO23所示的核苷酸序列的RNA；(26)由在SEQ ID NO23所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；
(27)包括SEQ ID NO24所示的核苷酸序列的RNA；(28)由在SEQ ID NO24所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(29)包括SEQ ID NO25所示的核苷酸序列的RNA；(30)由在SEQ ID NO25所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(31)包括SEQ IDNO26所示的核苷酸序列的RNA；(32)由在SEQ ID NO26所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(33)包括SEQ ID NO27所示的核苷酸序列的RNA；(34)由在SEQ ID NO27所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(35)包括SEQ ID NO28所示的核苷酸序列的RNA；(36)由在SEQ ID NO28所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(37)包括SEQ ID NO29所示的核苷酸序列的RNA；(38)由在SEQ ID NO29所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(39)包括SEQ ID NO30所示的核苷酸序列的RNA；(40)由在SEQ ID NO30所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(41)包括SEQ ID NO31所示的核苷酸序列的RNA；(42)由在SEQ ID NO31所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(43)包括SEQ ID NO32所示的核苷酸序列的RNA；(44)由在SEQ ID NO32所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(45)包括SEQ ID NO33所示的核苷酸序列的RNA；(46)由在SEQ ID NO33所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(47)包括SEQ ID NO34所示的核苷酸序列的RNA；(48)由在SEQ ID NO34所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(49)包括SEQ ID NO35所示的核苷酸序列的RNA；(50)由在SEQ ID NO35所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(51)包括SEQ ID NO85所示的核苷酸序列的RNA；(52)由在SEQ ID NO85所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(53)包括SEQ ID NO86所示的核苷酸序列的RNA；(54)由在SEQ ID NO86所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(55)包括SEQ ID NO87所示的核苷酸序列的RNA；(56)由在SEQ ID NO87所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(57)包括SEQ ID NO88所示的核苷酸序列的RNA；(58)由在SEQ ID NO88所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA；(59)包括SEQ ID NO89所示的核苷酸序列的RNA；(60)由在SEQ ID NO89所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的活性的RNA。
在上述(d)至(g)和(7)至(60)的RNA中，優選地，(d)和(7)至(26)的RNA用作來源於倉鼠的親代細胞，(e)、(11)、(12)、(23)至(28)、(33)至(39)、(41)、(42)、(45)、(46)、(51)、(52)、(57)和(58)的RNA用作來源於小鼠的親代細胞，(f)、(7)、(8)、(11)、(12)、(19)、(20)、(23)至(26)、(33)、(34)、(39)至(42)、(49)、(50)、(55)和(56)的RNA用作來源於大鼠的親代細胞，(g)、(23)至(26)、(29)至(34)、(37)、(38)、(43)、(44)、(47)、(48)、(53)、(54)、(59)和(60)的RNA用作來源於人的親代細胞，作為能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA。
其中一個或多個核苷酸被缺失、取代、插入和/或添加的核苷酸序列是，例如，在SEQ ID NO14-37、57、58和85-89中任意一個所示核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列。通過缺失、取代、插入和/或添加核苷酸形成的雙鏈RNA可以是僅在一條鏈上缺失、取代、插入和/或添加核苷酸的RNA。即，雙鏈RNA並不一定是完全互補的鏈，只要其能獲得本發明的效果。
另外，本發明還涉及一種載體，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA；和包括該DNA的載體。
在本發明中，包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA可以是任何DNA，只要它是包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA。優選為包括與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶的活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA，更優選為包括與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶的活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA、和與能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶活性或表達的RNA對應的DNA及其互補DNA的DNA。
本發明的載體可以是任何載體，只要它是包括本發明中上述DNA的載體，所述DNA包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA。
本發明的載體可以通過下列方法構建例如，將上述DNA插入市售的siRNA表達載體，所述的DNA包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA。
本發明的載體可以通過以下方法構建成一個載體將與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA插入載體(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)，以便被各自獨立的啟動子轉錄，將與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA插入載體，以便被各自獨立的啟動子轉錄。但是，為了容易形成雙鏈RNA，優選地，製備其中與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA，將DNA插入載體，以便被獨立的啟動子轉錄，製備其中與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關的酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA、或其中與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA，將該DNA插入載體，以便被獨立的啟動子轉錄，從而將本發明的載體構建成一個載體。
而且，其中與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA、和其中與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA或其中與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA可以在一個啟動子的控制下插入載體，以便轉錄成一條連續的RNA。
兩個獨立的啟動子是相同類型的啟動子或不同類型的啟動子。兩個獨立啟動子的方向是相同的方向或相反的方向。作為本發明載體中的兩個獨立啟動子，優選不同類型啟動子的位置朝著相同的方向。
啟動子可以是任何啟動子，只要它是能夠在親代細胞中發揮作用的啟動子。例如，當使用動物細胞作為親代細胞時，可以使用聚合酶III啟動子，如U6啟動子、H1啟動子和tRNA啟動子。
用作連接子的核苷酸序列可以是任何序列，只要它是用於形成雙鏈RNA的序列。優選能夠表達髮夾型(hairpin-type)siRNA的序列，其中RNA及其互補RNA通過大約2至10個核苷酸的環連接，從而形成雙鏈RNA。
其中與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA通過連接子序列連接的DNA包括選自SEQ ID NO90、91、94和95所示核苷酸序列的DNA。
其中與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA優選是其中與能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA。其中與能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA是選自SEQ ID NO92、93和96所示核苷酸序列的DNA。
在本發明的載體中，其中與能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA，和其中與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA，或其中與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA及其互補RNA對應的DNA及其互補DNA分別通過連接子序列連接的DNA，優選地根據要導入的親代細胞的動物種屬選擇成有效的組合。具體地，當親代細胞來源於倉鼠時，優選使用SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ IDNO92所示的DNA的組合，或者SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ IDNO92所示的DNA的組合。
當親代細胞來源於小鼠時，優選使用SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA的組合，或者SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA的組合。
當親代細胞來源於人時，優選使用SEQ ID NO94所示的DNA和SEQ ID NO96所示的DNA的組合，或者SEQ ID NO95所示的DNA和SEQ ID NO96所示的DNA的組合。
其中導入了本發明載體的細胞包括在本發明的細胞中。
另外，本發明的細胞還包括通過下列方法獲得的細胞將上述與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA插入兩種獨立的載體，將兩種獨立的載體共同導入細胞。
本發明的細胞能夠產生具有無巖藻糖的糖鏈結構、且生理學活性很高的糖蛋白質。即，本發明可以提供生理學活性高於它的親代細胞所產生的糖蛋白質的糖蛋白質的製造方法。
由於具有無巖藻糖的糖鏈結構而生理學活性很高的糖蛋白質的例子包括由於具有無巖藻糖的糖鏈結構而與受體的親合性提高的糖蛋白質、血液中半衰期提高的糖蛋白質、給藥至血液中後組織分布改變的糖蛋白質、和表達藥學活性所必須的蛋白質相互作用提高的糖蛋白質。
因此，本發明中的糖蛋白質可以是任何糖蛋白質，只要它是當由親代細胞產生時，所產生的蛋白質具有與巖藻糖結合的糖鏈結構的糖蛋白質。例子包括抗體、促紅細胞生成素、血小板生成素、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶原、血栓調節蛋白質、抗凝血酶III、C蛋白質、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、促性腺激素、促甲狀腺激素、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、角質形成細胞生長因子、激活蛋白質、骨形態發生因子、幹細胞因子(SCF)、幹擾素-α、幹擾素-β、幹擾素-γ、白細胞介素-2、白細胞介素-6、白細胞介素-10、白細胞介素-11、可溶性白細胞介素-4受體、腫瘤壞死因子-α、DNase I、半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶和類似物。
由於不結合巖藻糖的糖鏈結構而生理學活性顯著提高的糖蛋白質的例子包括抗體組合物。
即，本發明的細胞可以產生ADCC活性高於親代細胞所產生抗體組合物的抗體組合物。
而且，本發明的細胞可以產生一種抗體組合物，所述抗體組合物中，抗體組合物中與Fc區結合的全部複合型N-糖苷-連接糖鏈中，巖藻糖不與糖鏈還原末端N-乙醯氨基葡萄糖結合的糖鏈比例高於親代細胞產生的抗體組合物。
在本發明中，抗體組合物是包括Fc區具有複合型N-糖苷-連接糖鏈的抗體分子的組合物。
抗體是四聚體，其中兩條多肽鏈每一條的兩個分子重鏈和輕鏈(下文中分別稱為「H鏈」和「L鏈」)分別連接在一起。每條H鏈N-端大約四分之一和L鏈N-端的一半(均多於100個胺基酸)稱為可變區(下文中稱為「V區」)，其變異很大，且與抗原結合直接相關。V區之外較大的部分稱為恆定區(下文中稱為「C區」)。根據與C區的同源性，抗體分子分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE類。
另外，IgG類進一步根據C區的同源性分成IgG1至IgG4的子類。
H鏈分成四個免疫球蛋白質功能區，從其N-末端為抗體H鏈V區(下文中稱為「VH」)、抗體H鏈C區1(下文中稱為「CH1」)、抗體H鏈C區2(下文中稱為「CH2」)和抗體H鏈C區3(下文中稱為「CH3」)，可高度變形的肽區稱為鉸鏈區(hinge region)，鉸鏈區存在於CH1和CH2之間，以分隔CH1和CH2。在鉸鏈區下遊包括CH2和CH3的結構單位稱為Fc區，該區與複合型N-糖苷-連接糖鏈結合。Fc區是Fc受體、補體和類似物結合的區域(Immunology Illustrated，the Original，第5版，2000年2月10日出版，Nankodo；Handbook of AntibodyTechnology(Kotai Kogaku Nyumon)，第一版，1994年1月25日，ChijinShokan)。
根據與蛋白質部分的結合形式將糖蛋白質如抗體的糖鏈大致分為兩類，即與天冬醯胺結合的糖鏈(N-糖苷-連接糖鏈)和與絲氨酸、蘇氨酸或類似物結合的糖鏈(O-糖苷-連接糖鏈)。N-糖苷-連接糖鏈具有下式(I)所示的基本通用核心結構[Biochemical Experimentation Method23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化學實驗方法23-糖蛋白質糖鏈的研究方法)(Gakujutsu Shuppan Center)，ReikoTakahashi主編(1989)]式(I)
在式(I)中，與天冬醯胺結合的糖鏈末端稱為還原末端，相反的一側稱為非還原末端。
N-糖苷-連接糖鏈可以是任何N-糖苷-連接糖鏈，只要它包括式(I)的核心結構。例子包括高甘露糖型(其中甘露糖單獨與核心結構的非還原末端結合)；複合型(其中核心結構的非還原末端側包括一個或多個半乳糖-N-乙醯氨基葡萄糖(下文中稱為「Gal-GlcNAc」)平行分支，Gal-GlcNAc的非還原末端側還包括唾液酸、平分型N-乙醯氨基葡萄糖或類似的結構)；雜合型(其中核心結構的非還原末端側包括高甘露糖型和複合型兩種類型的分支)；和類似類型。
由於抗體分子中的Fc區包括與N-糖苷-連接糖鏈單獨結合的區域，因此每一個抗體分子結合兩條糖鏈。由於與抗體分子結合的N-糖苷-連接糖鏈包括任何具有式(I)所示核心結構的糖鏈，因此與抗體結合的兩條N-糖苷-連接糖鏈有許多種糖鏈的組合。
因此，在本發明中，通過使用其中導入了能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA的細胞而製備的抗體組合物，或通過使用導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞而製備的抗體組合物可包括糖鏈結構相同的抗體分子或糖鏈結構不同的抗體分子，只要其可以獲得本發明的效果。
在與抗體組合物中所含的Fc區結合的全部複合型N-糖苷-連接糖鏈當中，糖鏈中還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖不與巖藻糖結合的糖鏈比例(下文中稱為「本發明的糖鏈比例」)是其中巖藻糖不與糖鏈還原末端N-乙醯氨基葡萄糖連接的糖鏈數目與結合於組合物中所含Fc區的複合型N-糖苷-連接糖鏈總數目的比例。
複合型N-糖苷-連接糖鏈中還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖不與巖藻糖結合的糖鏈是在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖不與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖通過α-鍵連接的糖鏈。具體來說，提到了在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖不與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖通過α-鍵連接的糖鏈。
本發明的糖鏈比例越高，則抗體組合物的ADCC活性越高。ADCC活性較高的抗體組合物包括本發明的糖鏈比例優選為20％或更高、更優選30％或更高、再優選40％或更高、特別優選50％或更高、最優選100％的抗體組合物。
而且，本發明涉及ADCC活性高於其親代細胞產生的抗體組合物的製造方法。
當本發明的糖鏈比例高於其親代細胞產生的抗體組合物時，抗體組合物的ADCC活性高於其親代細胞產生的抗體組合物。
ADCC活性是一種細胞毒活性(其中抗體與活體中腫瘤細胞上細胞表面抗原結合)，其通過抗體Fc區與效應細胞表面上存在的Fc受體結合來活化效應細胞，從而損傷腫瘤細胞和類似物[MonoclonalAntibodiesPrinciples and Applications(單克隆抗體原理和應用)，Wiley-Liss，Inc.，Chapter 2.1(1995)]。效應細胞包括殺傷細胞、天然殺傷細胞、活化的巨噬細胞和類似細胞。
組合物(其包括在Fc區具有複合型N-糖苷-連接糖鏈的抗體分子)中所含的糖鏈中，還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖不與巖藻糖結合的糖鏈的比例可以通過下列方法測定用已知的方法如肼解作用和酶解作用從抗體分子中釋放出糖鏈[Biochemical Experimentation Methods23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(生物化學實驗方法23-研究糖蛋白質糖鏈的方法)(Japan Scientific Societies Press)，ReikoTakahashi主編(1989)]，對釋放出的糖鏈進行螢光標記或放射性同位素標記，通過色譜分離出標記的糖鏈。另外，釋放的糖鏈可通過HPAED-PAD法進行分析確定[J.Liq.Chromatogr.，6，1577(1983)]。
抗體分子可以是任何抗體分子，只要它包括抗體Fc區。例子包括抗體、抗體片段、包括Fc區的融合蛋白質、和類似物。
抗體的例子包括有以抗原免疫的動物脾細胞製備的雜交瘤細胞分泌的抗體；通過基因工程技術製備的抗體(即將插入抗體基因的抗體表達載體導入宿主細胞獲得的抗體)；和類似物。具體的例子包括雜交瘤產生的抗體、人源化抗體、人抗體和類似物。
雜交瘤是一種通過用抗原免疫非人哺乳動物獲得的B細胞和來源於小鼠、大鼠或類似動物的骨髓瘤細胞之間進行細胞融合獲得的細胞，其可以產生具有目標抗原特異性的單克隆抗體。
人源化抗體包括人嵌合抗體、人CDR-移植抗體和類似物。
人嵌合抗體是一種包括抗體VH和抗體L鏈V區(下文中稱為「VL」)(兩者都是非人動物的抗體)、人抗體H鏈C區(下文中亦稱為「CH」)和人抗體L鏈C區(下文中亦稱為「CL」)的抗體。非人動物可以是任何動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔，只要可以從其製備雜交瘤。
人嵌合抗體可以通過下列方法產生從產生單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA，將其插入包括編碼人抗體CH和人抗體CL的基因的宿主細胞表達載體，從而構建人嵌合抗體表達載體，然後將載體導入宿主細胞中，表達抗體。
可以使用任何CH作為人嵌合抗體的CH，只要它屬於人免疫球蛋白質(下文中稱為「hIg」)，優選使用屬於hIgG的類型，可以使用屬於hIgG類型的任何一種亞型，例如，可以使用hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。可以使用任何CL作為人嵌合抗體的CL，只要它屬於hIg類型，可以使用屬於κ類或λ類的CL。
人CDR-移植抗體是將非人動物抗體VH和VL的CDR胺基酸序列移植於人抗體VH和VL適當位置的抗體。
人CDR-移植抗體可以通過下列方法產生構建編碼V區的cDNA(其中將非人動物抗體VH和VL的CDR胺基酸序列移植到人抗體VH和VL的CDR胺基酸序列中)，將其插入包括編碼人抗體CH和人抗體CL的基因的宿主細胞表達載體中，從而構建人CDR-移植抗體表達載體，然後將表達載體導入宿主細胞，表達人CDR-移植抗體。
可以使用任何CH作為人CDR-移植抗體的CH，只要它屬於hIg，優選hIg類，優選使用屬於hIgG的類型，可以使用屬於hIgG類型的任何一種亞型，例如，可以使用hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。可以使用任何CL作為人CDR-移植抗體的CL，只要它屬於hIg類型，可以使用屬於κ類或λ類的CL。
人抗體最初是人體中天然存在的抗體，但是它還包括從人抗體噬菌體文庫、產生人抗體的轉基因動物、或產生人抗體的轉基因植物獲得的抗體(其根據遺傳工程、細胞工程和胚胎學工程技術的最新進展而製備)。
人體中存在的抗體可以通過下列方法製備例如，分離人外周血淋巴細胞，通過用EB病毒或類似物感染使其無限增值化(永生化)，然後將其克隆，從而獲得能夠產生抗體的淋巴細胞，培養由此獲得的淋巴細胞，從培養物中純化抗體。
人抗體噬菌體文庫是通過將從人B細胞製備的抗體的編碼基因插入噬菌體基因中、抗體片段如Fab和單鏈抗體在噬菌體表面上表達的文庫。表達具有所需抗原結合活性的抗體片段的噬菌體可以使用其與固定抗原底物結合的活性作為標記從文庫中回收。抗體片段可以通過遺傳工程技術進一步轉變成包括兩條完整H鏈和兩條完整L鏈的人抗體分子。
產生人抗體的轉基因非人動物是將人抗體基因導入細胞的動物。具體來說，產生人抗體的轉基因非人動物可以通過以下方法製備將人抗體基因導入小鼠的ES細胞，將ES細胞移植到其它小鼠的早期胚胎中，然後使其發育。通過將人抗體基因導入受精卵並使其發育，也可以製備產生人抗體的轉基因非人動物。從產生人抗體的轉基因非人動物中製備人抗體可以通過以下方法進行通過在非人哺乳動物中通常實施的雜交瘤製備法獲得產生人抗體的雜交瘤，將獲得的雜交瘤培養，在培養物中積累人抗體。
轉基因非人動物包括牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、家禽、猴、兔和類似動物。
在本發明中，作為抗體，優選識別腫瘤相關抗原的抗體、識別變態反應或炎症相關抗原的抗體、識別心血管疾病相關抗原的抗體、識別自身免疫疾病相關抗原的抗體、或識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體，優選屬於IgG類的人抗體。
抗體片段是包括抗體Fc區的片段。抗體片段可以是任何片段，只要它包括上述抗體的Fc區。抗體片段包括H鏈單體、H鏈二聚體和類似物。
包括Fc區的融合蛋白質是將包括抗體或抗體片段Fc區的抗體與蛋白質(如酶或細胞因子)融合而得到的蛋白質。
以下對本發明進行詳述。
1.本發明的細胞的製備(1)製備導入了能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA的細胞本發明中導入了能夠抑制GDP-甘露糖轉化酶功能的RNA的細胞，例如，可以通過以下方法製備。
製備GDP-甘露糖轉化酶的cDNA或基因組DNA。
確定所製備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。
根據已確定的DNA序列，設計長度合適的包括GDP-甘露糖轉化酶編碼區或非編碼區的RNAi基因的構建物。
為了在細胞中表達RNAi基因，通過以下方法製備重組載體將已製備的DNA的片段或全長插入合適的表達載體的啟動子下遊。
通過將重組載體導入適用於表達載體的宿主細胞，獲得轉化體。
本發明的細胞可以通過根據被導入GDP-甘露糖轉化酶的活性或所產生抗體分子或細胞表面上糖蛋白質的糖鏈結構選擇轉化體而獲得。
可以使用任何細胞作為宿主細胞，如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有酶向GDP-甘露糖轉化酶的基因。實例包括下面第2項中描述的宿主細胞。
可以使用如下載體作為表達載體在宿主細胞內可自主複製的載體，或者可以整合到染色體中、並在設計的RNAi基因可被轉錄的位置處包括啟動子的載體。實例包括由聚合酶III轉錄的表達載體、或下面第2項中描述的表達載體。
作為將基因導入各種宿主細胞的方法，可以使用下面第2項中所述的導入適合於各種宿主細胞的重組載體的方法。
作為獲得GDP-甘露糖轉化酶的cDNA或基因組DNA的方法，下列的方法作為實例。
cDNA的製備方法
從各種宿主細胞中製備全RNA或mRNA。
從已製備的全RNA或mRNA中製備cDNA文庫。
根據GDP-甘露糖轉化酶的已知胺基酸序列(如人類酶的胺基酸序列)產生簡併引物，使用所製備的cDNA文庫作為模板，通過PCR獲得編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因片段。
使用所得到的基因片段作為探針，對cDNA文庫進行篩選，得到GDP-甘露糖轉化酶的cDNA。
各種宿主細胞的mRNA可以是市售產品(例如，由Clontech製造)，或者如下從各種宿主細胞中製備。從各種宿主細胞中製備總mRNA的方法包括硫氰酸胍-三氟醋酸銫法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]、酸性硫氰酸胍酚氯仿(AGPC)法[Analytical Biochemistry，162，156(1987)；Experimental Medicine(Jikken Igaku)，9，1937(1991)]和類似方法。
而且，從全RNA製備poly(A)+RNA的mRNA的方法包括oligo(dT)固定纖維素柱法(Molecular Cloning，第二版)。
另外，可以使用試劑盒如Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen製造)或Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia製造)製備mRNA。
從已製備的各種宿主細胞的mRNA製備cDNA庫。製備cDNA庫的方法包括Molecular Cloning，第二版；Current Protocols in MolecularBiology；A Laboratory Manual，第二版(1989)等文獻中所述的方法，以及使用市售試劑盒的方法，如cDNA合成和質粒克隆用的SuperscriptPlasmid System(Life Technologies製造)和ZAP-cDNA合成試劑盒(STRATAGENE製造)。
可以使用任何載體作為製備cDNA庫的克隆載體，如噬菌體載體和質粒載體，只要它們可以在大腸桿菌(Escherichia coli)K12中進行自主複製。例子包括ZAP Express[STRATAGENE製造；Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、Lambda ZAP II(STRATAGENE製造)、λgt10、λgt11[DNACloning，A Practical Approach，1，49(1985)]、λTriplEx(Clontech製造)、λExCell(Pharmacia製造)、pT7T318U(Pharmacia製造)、pcD2[Mol CellBiol，3，280(1983)]和pUC18[Gene，33，103(1985)]、和類似載體。
可以使用任何微生物作為製備cDNA庫用的宿主微生物，優選使用大腸桿菌。例子包括大腸桿菌XLl-Blue MRF′[STRATAGENE製造；Strategies，5，81(1992)]、大腸桿菌C600[Genetics，39，440(1954)]、大腸桿菌Y1088[Science，222，778(1983)]、大腸桿菌Y1090[Science，222，778(1983)]、大腸桿菌NM522[J.Mol. Biol.，166，1(1983)]、大腸桿菌K802[J.Mol.Biol.16，118(1966)]和大腸桿菌JM105[Gene，38，275(1985)]、和類似物。
cDNA庫還可以用於下列分析。另外任選地，為了通過降低不完整cDNA的比例而有效地獲得全長cDNA，下列分析中可以使用採用Sugano等人cDNA文庫可以在隨後的分析中使用，但是為了通過降低非全長cDNA的比例而儘可能有效地獲得全長cDNA，下列分析中可以使用根據Sugano等人發展的oligo cap法製備的cDNA庫[Gene，138，171(1994)；Gene，200，149(1997)；Protein，Nucleic Acid，Koso(Tanpakushitu，Kakusan，Koso)，41，603(1996)；Experimental Medicine(Jikken Igaku)，11，2491(1993)；eDNA Cloning(Yodo-sha)(1996)；Methods for Preparing Gene Libraries(Yodo-sha)(1994)]。
根據GDP-甘露糖轉化酶的胺基酸序列，製備對預測編碼胺基酸序列的核苷酸序列的5』-端和3』-端核苷酸序列有特異性的簡併引物，使用已製備的cDNA文庫作為模板，通過PCR擴增DNA[PCR Protocols，Academic Press(1990)]，獲得編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因片段。
通過採用的方法如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]，或者使用例如ABI PRISM 377 DNA測序儀(PE Biosystems製造)的核苷酸測序儀對核苷酸進行分析，可以確認所得到的基因片段是編碼GDP-甘露糖轉化酶的DNA。
編碼GDP-甘露糖轉化酶的DNA可從cDNA或cDNA文庫獲得，所述cDNA或cDNA文庫是使用上述基因片段作為探針通過集落雜交或噬菌斑雜交從各種宿主細胞中所含的mRNA合成的(MolecularCloning，第二版)。
另外，還可以用從多種宿主細胞中所含mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，使用獲得編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因片段用的引物，通過PCR進行篩選，獲得編碼GDP-甘露糖轉化酶的cDNA。
所得到的編碼GDP-甘露糖轉化酶的DNA的核苷酸序列從其末端進行分析，通過通常採用的方法如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]，或者使用例如ABI PRISM 377 DNA測序儀(PE Biosystems製造)的核苷酸測序儀進行測定。
使用同源性搜索程序如BLAST，根據測出的cDNA核苷酸序列對核苷酸序列資料庫如GenBank、EMBL或DDBJ進行搜索，也可以從資料庫中的基因中確定編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因。
通過上述方法得到的編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因的核苷酸序列包括由SEQ ID NO8-10中任意一個所示的核苷酸序列。
還可以根據測出的DNA序列，採用phosphoamidite法用392型DNA合成儀(Perkin Elmer製造)通過化學合成來得到GDP-甘露糖轉化酶的cDNA。
作為GDP-甘露糖轉化酶基因組DNA製備方法的例子，下述方法作為實例。
基因組DNA的製備方法基因組DNA的製備方法包括Molecular Cloning，第二版；CurrentProtocols in Molecular Biology等文獻所述的已知方法。另外，GDP-甘露糖轉化酶的基因組DNA還可以使用Genomic DNA Library ScreeningSystem(Genome Systems製造)或Universal Genome WalkerTM試劑盒(CLONTECH製造)或類似試劑盒來分離。
下面的方法作為例子說明根據GDP-甘露糖轉化酶的活性選擇轉化體的方法。
選擇轉化體的方法其中的GDP-甘露糖轉化酶活性降低的細胞的選擇方法包括下列文獻所述的生物化學方法或基因工程技術New BiochemicalExperimentation Series 3-Saccharides I，Glycoprotein(Tokyo KagakuDojin)，Japanese Biochemical Society編著(1988)；Cell Engineering，Supplement，Experimental Protocol Series，Glycobiology ExperimentalProtocol，Glycoprotein，Glycolipid and Proteoglycan(Shujun-sha)，Naoyuki Taniguchi，Akemi Suzuki，Kiyoshi Furukawa和KazuyukiSugawara編著(1996)；Molecular Cloning第二版；Current Protocols inMolecular Biology；及類似文獻。生物化學方法包括使用酶特異性底物評價酶活性的方法。基因工程技術包括Northern分析、RT-PCR和類似技術，其中對編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因的mRNA的量進行測定。
而且，根據GDP-甘露糖轉化酶活性降低所引起的形態變化來選擇細胞的方法包括根據所產生糖蛋白質分子的糖鏈結構選擇轉化體的方法、根據細胞表面上糖蛋白質的糖鏈結構選擇轉化體的方法、和類似方法。使用所產生糖蛋白質分子的糖鏈結構選擇轉化體的方法包括下面第5項中所述的方法。使用細胞表面上糖蛋白質糖鏈結構選擇轉化體的方法包括選擇對識別糖鏈結構的凝集素有抗性的克隆的方法(所述糖鏈中在N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)。例子包括Somatic Cell Mol.Genet.，12，51(1986)中所述的使用凝集素的方法。
可以使用任何凝集素作為上述凝集素，只要其為識別其中在複合型N-糖苷連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接的糖鏈結構的凝集素。例子包括兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(來源於兵豆的扁豆凝集素)、豌豆(Pisum sativum)凝集素PSA(來源於豌豆的豌豆凝集素)、蠶豆(Vicia faba)凝集素VFA(來源於蠶豆的凝集素)和橙黃網胞盤菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(來源於橙黃網胞盤菌的凝集素)、和類似物。
具體來說，本發明的細胞可以通過以下方法選擇在含有濃度為10μg/ml至10mg/ml濃度、優選0.5至2mg/ml的上述凝集素的培養基中將細胞培養1天至2周、優選3天至1周，將存活的細胞繼代培養或將集落挑出，將其轉移至培養容器中，隨後繼續在含有凝激素的培養基中培養。
抑制編碼GDP-甘露糖轉化酶的基因的mRNA數量的RNAi基因可以通過通用方法或使用DNA合成儀進行製備。
RNAi基因的構建可以根據下列文獻中的描述進行設計Nature，391，806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，15502(1998)；Nature，395，854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，5049(1999)；Cell，95，1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，13959(1998)；Nature CellBiol.，2，70(2000)和類似文獻。
另外，本發明的細胞還可以不使用表達載體、通過直接將根據GDP-甘露糖轉化酶核苷酸序列設計的雙鏈RNA導入宿主細胞而獲得。
雙鏈RNA可以採用通用方法或通過使用DNA合成儀而製備。具體來說，可以基於GDP-甘露糖轉化酶cDNA和基因組DNA的互補RNA核苷酸序列當中具有10至40個鹼基、優選10至30個鹼基、更優選15至30個鹼基的相應序列的寡核苷酸的序列信息，通過合成與寡核苷酸互補序列對應的寡核苷酸(反義寡核苷酸)對其進行製備。寡核苷酸和反義寡核苷酸可以單獨合成，或者可以通過不妨礙雙鏈RNA形成的間隔區核苷酸連接起來。
寡核苷酸包括寡聚RNA和寡核苷酸的衍生物(下文中稱為「寡核苷酸衍生物」)。
寡核苷酸衍生物包括寡核苷酸中磷酸二酯鍵轉變成磷酸硫酯鍵(phosophorothioate bond)的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中磷酸二酯鍵轉變為N3′-P5′磷酸醯胺鍵(phosphoamidate bond)的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖-磷酸二酯鍵轉變為肽-核酸鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中尿嘧啶被C-5噻唑基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中胞嘧啶被吩嗪修飾的胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中核糖被2′-O-丙基核糖取代的寡核苷酸衍生物、和寡核苷酸中核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的寡核苷酸衍生物[Cell Technology(Saibo Kogaku)，16，1463(1997)]。
(2)製備其中導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA和能夠抑制GDP-巖藻糖合成酶功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞下文說明其中導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA和能夠抑制GDP-巖藻糖合成酶功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞的產生方法，以下述細胞作為例子其中導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA、和能夠抑制GDP-巖藻糖合成酶功能的RNA。類似地，可以製備其中導入了能夠抑制α1，6-巖藻糖修飾酶功能的RNA、和能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA的細胞。
製備α1，6-巖藻糖修飾酶和GDP-巖藻糖合成酶的每一種的cDNA或基因組DNA。
確定已製備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。
根據已確定的DNA序列，設計長度合適的包括α1，6-巖藻糖修飾酶和GDP-巖藻糖合成酶的編碼區或非編碼區的RNAi基因的構建物。
為了在細胞中表達RNAi基因，通過如下方法製備重組載體將所製備DNA的片段或全長插入合適的表達載體的啟動子的下遊。
通過將重組載體導入適於表達載體的宿主細胞，獲得轉化體。
本發明的細胞可以通過如下方法獲得根據被導入的α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖合成酶的活性或所產生抗體分子或細胞表面上糖蛋白質的糖鏈結構，對轉化體進行選擇。
可以使用任何細胞作為宿主細胞，如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要其具有靶向α1，6-巖藻糖修飾酶和GDP-巖藻糖合成酶的基因。例子包括下面第2項中所述的細胞。
可以使用如下載體作為表達載體在宿主細胞內可自主複製的載體，或者可以整合到染色體中、並在設計的RNAi基因可被轉錄的位置處包括啟動子的載體。例子包括由聚合酶III轉錄的表達載體、或下面第2項中描述的表達載體。
作為將基因導入各種宿主細胞的方法，可以使用下面第2項中所述的導入適合於各種宿主細胞的重組載體的方法。
例如，可以採用與(1)中所述的方法相同的方式獲得α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖合成酶的cDNA和基因組DNA。
作為根據α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖合成酶的活性選擇轉化體的方法，以下列方法作為例子。
轉化體的選擇方法選擇其中α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖合成酶的活性降低的細胞的方法包括上文(1)中所述的生物化學法和遺傳工程法。
另外，根據由α1，6-巖藻糖修飾酶或GDP-巖藻糖合成酶活性降低引起的形態改變選擇細胞的方法包括上文(1)中所述的方法。
抑制α1，6-巖藻糖修飾酶基因或GDP-巖藻糖合成酶基因的mRNA數量的RNAi基因可以通過通用方法或使用DNA合成儀進行製備。
可以採用與上文(1)中所述方法相同的方式設計RNAi的構建物。
另外，本發明的細胞還可以不使用表達載體、直接通過將根據α1，6-巖藻糖修飾酶核苷酸序列設計的雙鏈RNA、和根據GDP-巖藻糖合成酶核苷酸序列設計的雙鏈RNA導入宿主細胞而獲得。
雙鏈RNA可以採用與上文(1)中所述方法相同的方式製備。
2.糖蛋白質的製造方法(以抗體組合物為例)。
下文參考抗體組合作為例子，說明使用本發明的細胞製造糖蛋白質的方法。
抗體組合物可以在本發明的細胞中表達，通過下列文獻中所述的方法獲得例如，Molecular Cloning，第二版；Current Protocols inMolecular Biology；Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988(下文中稱為「Antibodies」)；Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，第三版，Acad.Press，1993(下文中稱為「Monoclonal Antibodies」)；或Antibody Engineering，A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press(下文中稱為「AntibodyEngineering」)，如下文。
製備編碼抗體分子的cDNA。
根據已製備的抗體分子的全長cDNA，如果需要，製備長度合適的包括蛋白質編碼區的DNA片段。
通過將DNA片段或全長cDNA插入合適表達載體啟動子的下遊而製備重組載體。
通過將重組載體導入適合於表達載體的宿主細胞，可以獲得產生抗體分子的轉化體。
在本發明中，可以使用任何細胞作為產生抗體組合物的宿主細胞，如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要其為上文第1項中製備的本發明的細胞、可以表達目標基因。優選動物細胞。
通過遺傳工程技術導入了與抗體分子Fc區結合的N-糖苷-連接糖鏈修飾相關酶的細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞也可以用作宿主細胞。
可以使用如下載體作為表達載體在宿主細胞內可自主複製的載體，或者可以整合到染色體中、並在編碼抗體分子的基因可被轉錄的位置處包括啟動子的載體。
根據上文第1項中描述的「cDNA的製備方法」，可以使用對目標抗體分子具有特異性的探針引物從人或非人動物組織或細胞中製備cDNA。
使用酵母作為宿主細胞時，表達載體包括YEP13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)或類似物。
可以使用任何啟動子作為啟動子，只要其可以在酵母中發揮作用。啟動子的例子包括糖酵解途徑基因如己糖激酶的啟動子、PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白質啟動子、MFαt1啟動子和CUP 1啟動子和類似物。
宿主細胞包括屬於酵母(Saccharomyces)屬、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬、絲孢酵母(Trichosporon)屬和許旺酵母(Schwanniomyces)屬、和類似屬的酵母，例如，為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、出芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、alluvius許旺酵母(Schwanniomyces alluvius)。
可以使用任何方法作為導入重組載體的方法，只要其可以將DNA導入酵母。例子包括電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生質球法[Proc.Natl Acad.Sci.USA，84，1929(1978)]、醋酸鋰法[J.Bacteriology，153，163(1983)]、和Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)所述的方法。
當使用動物細胞作為宿主細胞時，表達載體包括pcDNAI、pcDM8(可獲自Funakoshi)、pAGE107[日本公開未審查專利申請第22979/91號；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3(日本公開未審查專利申請第227075/90號)、pCDM8[Nature，329，840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen製造)、pREP4(Invitrogen製造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210、和類似表達載體。
可以使用啟動子作為啟動子，只要其可以在動物細胞中發揮作用。例子包括巨細胞病毒(CMV)IE(極早期)基因啟動子、SV40早期啟動子、逆轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白質啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、和類似啟動子。另外，人CMV的IE基因增強子可以與啟動子結合使用。
宿主細胞包括人的細胞(例如Namalwa細胞、NM-F9細胞和PER.C6細胞)、猴細胞(如COS細胞)、中國倉鼠細胞(如CHO細胞、HBT5637)(日本公開未審查專利申請第299/88號)、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、來源於敘利亞倉鼠腎的細胞、胚胎幹細胞、受精卵細胞和類似細胞。
可以使用任何方法作為導入重組載體的方法，只要其可以將DNA導入進動物細胞中。例子包括電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(公開未審查的日本專利第227075/90號)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]、注射法(Manipulating the MouseEmbryo，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1994)，下文中亦稱為「Manipulating the Mouse Embryo，ALaboratory Manual，第二版」)、使用粒子槍的方法(基因槍)(日本專利第2606856號、日本專利第2517813號)、DEAE-葡聚糖法[Biomanual Series 4 Gene Transfer and Expression Analysis(Yodosha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主編(1994)]、病毒載體法(Manipulatingthe Mouse Embryo，第二版)、和類似方法。
當使用昆蟲細胞作為宿主細胞時，可以通過Current Protocols inMolecular Biology，Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual.W.H.Freeman and Company，New York(1992)；Bio/Technology，6，47(1988)或類似文獻中所述的方法來表達蛋白質。
即，將重組的基因導入載體和杆狀病毒共同導入昆蟲細胞，在昆蟲細胞的培養物上清液中得到重組病毒，然後用重組病毒感染昆蟲細胞，從而可以對蛋白質進行表達。
該方法中使用的基因導入載體包括pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII(均由Invitrogen製造)、和類似載體。
杆狀病毒包括感染夜蛾(Barathra)科昆蟲的病毒——苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)。
昆蟲細胞包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵母細胞Sf9和Sf21[Current Protocols in Molecular Biology，Baculovirus ExpressionVectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)]和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)卵母細胞High 5(Invitrogen)、和類似細胞。
製備重組病毒用的將上述重組基因導入載體和上述杆狀病毒共同導入昆蟲細胞的方法包括磷酸鈣法(公開未審查的日本專利申請第227075/90號)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]和類似方法。
使用植物細胞作為宿主細胞時，表達載體包括Ti質粒、菸草花葉病毒載體或類似物。
可以使用任何啟動子作為啟動子，只要其可以在植物細胞中發揮作用。例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、水稻actin1啟動子、和類似啟動子。
宿主細胞包括諸如菸草、馬鈴薯、番茄、胡蘿蔔、大豆、油菜、紫花苜蓿、水稻、小麥、大麥、和類似物的植物細胞。
可以使用任何方法作為導入重組載體的方法，只要其可以將DNA導入植物細胞。例子包括使用土壤桿菌(Agrobacterium)的方法(公開未審查的日本專利申請第140885/84號和公開未審查的日本專利申請第70080/85號，WO94/00977)、電穿孔法(公開未審查的日本專利申請第251887/85號)和使用粒子槍(基因槍)的方法(日本專利第2606856號和第2517813號)、和類似方法。
作為表達抗體基因的方法，除直接表達之外，還可以根據MolecularCloning第二版或類似文獻中所述的方法，進行分泌性生產、融合蛋白質的表達和類似過程。
在培養基中對由此獲得的轉化體進行培養，在培養物中形成並積累抗體分子，從培養物中回收抗體組合物，可以產生抗體組合物。培養轉化體的方法可以通過常規的宿主細胞培養方法來進行。
對於使用真核生物如酵母作為宿主得到的轉化體的培養，可以使用任何天然培養基或合成培養基，只要該培養基包括可被生物體吸收、並能有效地對轉化體進行培養的物質，如碳源、氮源、無機鹽和類似物。
可以使用可被生物體吸收的碳源作為碳源。例子包括碳水化合物，如葡萄糖、果糖、蔗糖及含有它們的糖漿、澱粉和澱粉水解產物；有機酸，如醋酸和丙酸；醇，如乙醇和丙醇；以及類似物。
氮源包括氨水、無機酸或有機酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨和磷酸銨；其它含氮化合物；腖；肉汁；酵母提取物；玉米漿；酪蛋白質水解產物；大豆餅；大豆餅水解產物；各種發酵細胞及其水解產物；以及類似物。
無機鹽包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣和類似物。
通常在通氣條件下進行培養，例如通過搖瓶培養或通風條件下的浸沒旋動培養。培養溫度優選為15至40℃，培養時間通常為16小時至7天。培養過程中pH保持在3至9。使用有機酸或無機酸、鹼溶液、尿素、碳酸鈣、氨水等進行pH調節。
如果需要的話，培養過程中培養基中可以加入抗生素，如氨苄青黴素或四環素。
當對用誘導型啟動子作為啟動子獲得的重組載體轉化的酵母進行培養時，如果需要的話，培養基中可以加入誘導物。例如，當對用lac啟動子獲得的重組載體轉化的酵母進行培養時，培養基中可以加入異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷，當對用trp啟動子得到的重組載體轉化的酵母進行培養時，可以向培養基中加入吲哚丙烯酸。
當培養使用動物細胞作為宿主細胞獲得的轉化體時，培養基包括通常使用的RPMI1640培養基[The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967)]、Eagle′s MEM培養基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco’s改良MEM培養基[Virology，8，396(1959)]、199培養基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]、和Whitten培養基[Developmental Engineering ExperimentationManual-Preparation of Transgenic Mice(Kodansha)，Motoya Katsuki主編(1987)]，以及通過在這些培養基中加入胎牛血清得到的培養基，和類似培養基。
培養通常在pH為6至8、溫度為30至40℃、存在5％CO2的條件下進行1至7天。也可使用諸如流加培養或中空纖維培養的方法培養1天至數月。
如果需要的話，在培養過程中培養基中可以加入抗生素，如卡那黴素或青黴素。
使用昆蟲細胞作為宿主細胞獲得的轉化體的培養中使用的培養基包括通常使用的TNM-FH培養基(Pharmingen製造)、Sf-900 II SFM培養基(Life Technologie製造)、ExCell 400和ExCell 405(均由JRHBiosciences製造)、Grace′s昆蟲培養基[Nature，195，788(1962)]、和類似培養基。
培養通常在pH6至7、溫度25至30℃的條件下培養1至5天。
如果需要的話，在培養過程中培養基中可以加入抗生素，如慶大黴素。
使用植物細胞作為宿主細胞得到的轉化體可以細胞形式培養，也可以在分化成植物細胞或植物器官後培養。用於培養轉化體的培養基包括通常使用的Murashige-Skoog(MS)培養基和White培養基，以及通過在這些培養基中加入植物激素如生長素和細胞分裂素得到的培養基、以及類似培養基。
培養通常在pH為5至9、溫度20至40℃的條件下培養3至60天。
另外，如果需要的話，培養過程中培養基中可以加入抗生素，如卡那黴素和潮黴素。
因此，可以通過如下方法產生抗體組合物根據常用的培養方法培養來源於酵母、動物細胞或植物細胞的轉化體(上述轉化體包括插入有編碼抗體分子的DNA的重組載體)，從而產生並積累抗體組合物，然後從培養物中回收抗體組合物。
產生抗體組合物的方法包括在宿主細胞中進行細胞內表達的方法、從宿主細胞進行細胞外分泌的方法、和在宿主細胞外包膜上產生的方法。通過改變所用宿主細胞的種類或所產生抗體分子的結構，可以對方法進行選擇。
當抗體組合物在宿主細胞中或在宿主細胞外膜上產生時，可以根據如下方法，使其肯定被分泌至細胞外Paulson等人的方法[J.Biol.Chem.，264.17619(1989)]；Lowe等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)；Genes Develop.，4，1288(1990)]；公開未審查的日本專利申請第336963/93號；公開未審查的日本專利申請第823021/94號中所述的方法；和類似方法。
即，可以通過下列方法目標抗體分子肯定被分泌至細胞外使用基因重組技術將編碼抗體分子的DNA和編碼適於表達抗體分子的信號肽的DNA插入到表達載體中，將表達載體導入宿主細胞，表達抗體分子。
另外，還可以根據公開未審查的日本專利申請第227075/90號中所述的方法，使用二氫葉酸還原酶基因或類似物，採用基因擴增系統增加產量。
此外，抗體組合物還可以使用導入了基因的動物或植物細胞的再分化構建的導入了基因的動物個體(非人轉基因動物)或植物個體(轉基因植物)來產生。
當轉化體是動物個體或植物個體時，抗體組合物可以通過下列方法產生以通常的方法對其進行飼養或培育，從而產生並積累抗體組合物，然後從動物或植物個體中回收抗體組合物。
使用動物個體產生抗體組合物的方法包括如下方法根據已知方法[American Journal of Clinical Nutrition，63，639S(1996)；AmericanJournal of Clinical Nutrition，63，627S(1996)；Bio/Technology，9，830(1991)]在導入基因構建的動物中產生目標抗體組合物。
在動物個體的情況下，抗體組合物可以通過下列方法產生飼養導入了編碼抗體分子的DNA的轉基因非人動物，從而在動物中產生並積累抗體組合物，然後從動物中回收抗體組合物。抗體組合物形成和積累的部位包括動物的乳汁(日本公開未審查專利申請第309192/88)、卵。在這種情況下，可以使用任何啟動子作為啟動子，只要其可以在動物中發揮功能。優選的例子包括乳腺細胞特異性啟動子，如α-酪蛋白質啟動子、β-酪蛋白質啟動子、β-乳球蛋白質啟動子和乳清酸性蛋白質啟動子、和類似啟動子。
使用植物個體製造抗體組合物的方法包括如下方法培養根據已知方法導入了編碼抗體分子的DNA的轉基因植物[Tissue Culture(Soshiki Baiyo)，20(1994)；Tissue Culture(Soshiki Baiyo)，21(1995)；Trends in Biotechnology，15，45(1997)]，使抗體組合物在植物中形成並積累，然後從植物中回收抗體組合物。
關於其中導入了編碼抗體分子的基因的轉化體所產生的抗體組合物的純化，例如，當抗體組合物在細胞中以溶解狀態表達時，通過離心回收培養後的細胞，將其懸浮在緩衝水溶液中，之後使用超聲波破碎機、弗式高壓細胞破碎機(French press)、Manton Gaulin勻漿器、戴諾磨(Dynomill)或類似裝置將其破碎，得到無細胞提取物，對其進行離心，獲得上清液，對上清液通過常用的酶分離和純化技術進行處理拉，獲得抗體組合物的純化製劑，上述技術例如溶劑提取、用硫酸銨等進行鹽析、脫鹽、用有機溶劑沉澱、使用樹脂如二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖和DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical)的陰離子交換色譜、使用樹脂如S-瓊脂糖FF(Pharmacia製造)的陽離子交換樹脂、使用樹脂如丁基瓊脂糖或苯基瓊脂糖的疏水色譜、使用分子篩的凝膠過濾、親合力色譜、色譜聚焦和電泳如等電聚焦；和可以單獨使用或結合使用的類似方法。
當抗體組合物在細胞內通過形成包涵體表達時，以相同的方式對細胞進行回收、破碎和離心，回收作為沉澱部分的抗體組合物包涵體。將回收的抗體組合物包涵體用蛋白質變性劑溶解。將溶解的抗體溶液稀釋或透析，從而使抗體組合物具有正常的三維結構，然後通過與上文所述相同的分離純化步驟得到抗體組合物的純化製劑。
當抗體組合物分泌在細胞外時，可以從培養物上清液中回收抗體組合物。即，通過與上述相同的技術(如離心)對培養物進行處理，得到可溶部分，通過與上文所述相同的分離和純化方法，可以從可溶部分中獲得抗體組合物的純化製劑。
由此獲得的抗體組合物包括抗體、抗體片段、包括抗體Fc區的融合蛋白質和類似物。
當宿主細胞已經具有表達抗凝血酶III分子的能力時，可以採用上述1的方法製備能夠表達抗凝血酶III分子的細胞，培養細胞，從培養液中提純目標抗凝血酶III組合物，從而製備抗凝血酶III組合物。
作為獲得抗體組合物的例子，下文對人源化抗體組合物和Fc融合蛋白質的產生方法進行詳細描述，但是根據上文提及的方法和所述本發明的方法也可獲得其它的抗體組合物。
A.製備人源化抗體組合物(1)構建表達人源化抗體的載體表達人源化抗體的載體是其中插入了編碼人抗體CH和CL的基因的動物細胞表達載體，其通過將編碼人抗體CH和CL的每條基因克隆到動物細胞表達載體中而構建。
人抗體的C區可以是任何人抗體的CH或CL。例子包括人抗體H鏈中屬於IgG1亞型的C區(下文中稱為「hCγ1」)、人抗體L鏈中屬於κ型的C區(下文中稱為「hCκ」)、和類似物。
作為編碼人抗體CH和CL的基因，可以使用包括外顯子和內含子的染色體DNA，也可使用cDNA。
可以使用任何載體作為動物細胞的表達載體，只要可以向其中插入編碼人抗體C區的基因並使其在其中表達。例子包括pAGE107[Cytotechnology，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，22，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.AcadSci.USA，78，1527(1981)、pSG1βd2-4[Cytotechnology，4，173(1990)]和類似載體。動物細胞表達載體中的啟動子和增強子包括SV40早期啟動子和增強子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]、免疫球蛋白質H鏈啟動子[Cell，41，479(1985)]和增強子[Cell，33，717(1983)]和類似物。
人源化抗體的表達載體可以是編碼抗體H鏈和L鏈的基因存在於不同載體上的類型，也可以是兩條基因存在於相同載體上的類型(下文中稱為「串聯型」)。就構建人源化抗體表達載體的容易度、導入動物細胞的容易度、和抗體H和L鏈在動物細胞中的表達量而言，更優選串聯型人源化抗體表達載體[J.Immunol.Methods，167，271(1994)]。
可以使用構建的人源化抗體表達載體在動物細胞中表達人嵌合抗體和人CDR-移植抗體。
(2)獲得編碼非人動物抗體V區的cDNA通過以下方式可以獲得編碼非人動物抗體(如小鼠抗體)VH和VL的cDNA。
由產生目標小鼠抗體的雜交瘤細胞中提取的mRNA合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載體(如噬菌體或質粒)中，得到cDNA文庫。使用現有小鼠抗體的C區部分或V區部分作為探針，將各個包括編碼VH的cDNA的重組噬菌體或重組質粒和包括編碼VL的cDNA的重組噬菌體或重組質粒從文庫中分離。確定重組噬菌體或重組質粒上目標小鼠抗體VH和VL的全核苷酸序列，從核苷酸序列推導出VH和VL的全長胺基酸序列。
可以使用任何動物作為非人動物，只要可以由此製備雜交瘤細胞，例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔。
從雜交瘤細胞製備全RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]和類似方法，從全RNA製備mRNA的方法包括oligo(dT)固相纖維素柱法(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press New York(1989)和類似方法。此外，用於從雜交瘤細胞製備mRNA的試劑盒包括FastTrack mRNA分離試劑盒(Invitrogen製造)、Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia製造)、和類似試劑盒。
合成cDNA和製備cDNA文庫的方法包括常用的方法[MolecularCloning g，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press NewYork(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34]，以及使用市售試劑盒如cDNA合成和質粒克隆用的Superscript PlasmidSystem(GIBCO BRL製造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene製造)的方法和類似方法。
在cDNA文庫的製備中，其中插入了使用從雜交瘤細胞中提取的mRNA作為模板合成的cDNA的載體可以是任何載體，只要可以插入cDNA。例子包括ZAP Express[Strategies，5，58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λZAP II(Stratagene製造)、λgt10和λgt11[DNA Cloning，APracticalApproach，1，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech製造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia製造)、pcD2[Mol Cell Biol，3，280(1983)]、pUC18[Gene，33，103(1985)]、和類似物。
可以使用任何大腸桿菌作為其中導入了從噬菌體或質粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌，只要cDNA文庫可以得以導入、表達和保留。例子包括XLl-Blue MRF′[Strategies，5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088和Y1090[Science，222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol，16，118(1966)]、JM105[Gene，38，275(1985)]、和類似物。
作為從cDNA文庫選擇編碼非人動物抗體VH和VL的cDNA克隆的方法，可以使用採用同位素-或螢光-標記探針的菌落雜交或噬菌斑雜交[Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，Press New York(1989)]。還可以使用從mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，通過製備引物並進行聚合酶鏈式反應(下文中稱為「PCR」；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLab.，Press New York(1989)；Current protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34)來製備編碼VH和VL的cDNA。
可以通過如下方法確定cDNA的核苷酸序列用合適的限制性內切核酸酶對消化選擇的cDNA，將片段克隆到質粒如pBluescript SK(-)(Stratagene製造)中，進行通常用於胺基酸序列分析方法的反應(例如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]或類似方法)，然後使用自動核苷酸序列分析儀如A.L.F.DNA測序儀(Pharmacia製造)或類似物對克隆進行分析。
從測定的核苷酸序列推導VH和VL的全長胺基酸序列，並將其與已知抗體VH和VL的全長胺基酸序列進行比較，可以確認所得的cDNA是否編碼含有分泌信號序列的抗體VH和VL全長胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。
(3)分析非人動物抗體V區的胺基酸序列就包括分泌性信號序列的抗體VH和VL的全長胺基酸序列而言，通過將其與已知抗體VH和VL的全長胺基酸序列進行比較，可以推導出分泌性信號序列和N-端胺基酸序列的長度，也可以發現其所屬的亞型[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。此外，通過與已知抗體VH和VL的胺基酸序列進行比較，還可以發現VH和VL每個CDR的胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]。
(4)人嵌合抗體表達載體的構建在第2(1)項中所述的人源化抗體的表達載體中，通過將編碼非人動物抗體VH和VL的cDNA克隆到編碼人抗體CH和CL的基因上遊，可以構建人嵌合抗體表達載體。例如，通過將編碼非人動物抗體VH和VL的每個cDNA與合成DNA(其包括非人動物抗體VH和VL的3′-端核苷酸序列、人抗體CH和CL的5′-端核苷酸序列、還有兩端均具有適當限制性內切酶識別序列)連接在一起，並以使之可以合適的形式得以表達的方式，將其克隆到第2(1)項中所述的人源化抗體表達載體中所含的人抗體CH和CL編碼基因的上遊，從而構建人嵌合抗體表達載體。
(5)編碼人CDR-移植抗體V區的cDNA的構建可以如下構建編碼人CDR-移植抗體VH和VL的cDNA。首先，選擇人抗體VH和VL框架的胺基酸序列(下文中稱為「FR」)，用於移植目標非人動物抗體VH和VL的CDR。可以使用任何胺基酸序列作為人抗體VH和VL的FR胺基酸序列，只要其來源於人抗體。例子包括登記於資料庫如Protein Data Bank的人抗體VH和VL的FR胺基酸序列、人抗體VH和VL的每個FR亞組中常見的胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dep.Health andHuman Services(1991)]和類似序列。為了產生具有足夠活性的人CDR-移植抗體，優選地，選擇與目標非人動物抗體VH和VL的胺基酸序列的同源性儘可能高(至少為60％或更高)的胺基酸序列。
下一步，將目標非人動物抗體VH和VL的CDR胺基酸序列移植到所選擇的人抗體VH和VL的FR胺基酸序列上，設計人CDR-移植抗體VH和VL的胺基酸序列。考慮抗體基因核苷酸序列中發現的密碼子使用頻率，將設計的胺基酸序列轉變成DNA序列[Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Dep.Health and Human Services(1991)]，設計編碼人CDR-移植抗體VH和VL的胺基酸序列的DNA序列。基於設計的DNA序列，合成長度為大約100個鹼基的數種合成DNA，使用它們進行PCR。在這種情況下，考慮到PCR的反應效率和要被合成的DNA的長度，在每條H鏈和L鏈中優選設計6種合成DNA。
另外，通過將適當限制性酶的識別序列導入兩個末端上存在的合成DNA的5′-端，也可以很容易地將它們克隆到載體中以表達第2(1)項中所述的人源化抗體。PCR後，將擴增產物克隆到質粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene製造)中，通過第2(2)項中的方法確定核苷酸序列，從而獲得具有編碼所需人CDR-移植抗體VH和VL胺基酸序列的DNA序列的質粒。
(6)人CDR-移植抗體V區胺基酸序列的修飾已知當僅簡單地將非人動物抗體VH和VL中的CDR移植至人抗體VH和VL的FR中製備人CDR移植抗體時，其抗原結合活性低於原始非人動物的抗體[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。考慮其原因在於是FR而不是CDR的幾個胺基酸殘基與原始非人動物抗體VH和VL中的抗原活性直接或間接相關，它們被改變成人抗體VH和VL中FR的幾個不同胺基酸殘基。為了解決該問題，在人CDR-移植抗體中，在人抗體VH和VL的FR胺基酸序列當中，鑑定出與抗原結合直接相關的胺基酸殘基或者與抗原結合間接相關(通過與CDR中的胺基酸殘基相互作用、或保持抗體的三維結構)的胺基酸殘基，將其修飾成原始非人動物抗體中發現的胺基酸殘基，從而增加已經被降低的抗原結合活性[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。
在人CDR-移植抗體的製備中，最重要的是有效鑑定FR中與抗原結合活性相關的胺基酸殘基。為了鑑定與抗體-抗原結合活性相關的FR胺基酸殘基，構建抗體的三維結構，並通過X-射線晶體學[J.Mol.Biol.，112，535(1977)]、計算機模擬[Protein Engineering，7，1501(1994)]或類似方法進行分析。儘管抗體的三維結構信息已經用於人CDR-移植抗體的產生，但是仍然沒有建立可用於所有抗體的產生人CDR-移植抗體的方法。因此，目前必須進行各種嘗試，例如產生每種抗體的數種修飾抗體，並考察各種修飾抗體與其抗體結合活性之間的關係。
採用第2(5)項中所述的PCR方法，使用多種用於修飾的合成DNA，可以修飾人抗體VH和VL中的FR胺基酸序列。對於通過PCR獲得的擴增產物，根據第2(2)項中所述的方法測定核苷酸序列，從而證實是否已經進行了目標修飾。
(7)人CDR-移植抗體表達載體的構建將第2(5)和(6)項中構建的編碼人CDR-移植抗體VH和VL的cDNA克隆至第2(1)項中所述的人源化抗體表達載體中編碼人抗體CH和CL的基因上遊，可以構建人CDR-移植抗體表達載體。例如，人CDR-移植抗體表達載體可以通過如下方法構建以被克隆將合適的限制性酶的識別序列導入第2(5)項中使用的用於構建人CDR-移植抗體VH和VL的合成DNA當中位於兩個末端處的合成DNA的5′-端，使得它們以適當的形式在第2(1)項中所述的人源化抗體表達載體中編碼人抗體CH和CL的基因的上遊進行表達。
(8)人源化抗體的穩定產生通過將2(4)和(7)中所述的人源化抗體表達載體導入合適的動物細胞，可以獲得能夠穩定地產生人嵌合抗體和人CDR-移植抗體(下文中將二者均稱為「人源化抗體」)的轉化體。
將人源化抗體表達載體導入動物細胞的方法包括電穿孔法[已公開未審查的日本專利申請第257891/90號，Cytotechnology，3，133(1990)]和類似方法。
可以使用任何細胞作為導入了人源化抗體表達載體的動物細胞，只要它是上文第1項中產生的本發明的細胞和可以產生人源化抗體的動物細胞。
例子包括小鼠骨髓瘤細胞如NS0細胞和SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞如CHO/dhfr-細胞和CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤細胞如YB2/0細胞和IR983F細胞、來源於敘利亞倉鼠腎的BHK細胞、人骨髓瘤細胞如Namalwa細胞和類似細胞。優選中國倉鼠卵巢細胞CHO/DG44細胞和大鼠骨髓瘤YB2/0細胞。
導入人源化抗體表達載體後，根據已公開未審查的日本專利申請第257891/90號公開的方法，使用包括如G418硫酸鹽(下文中稱為「G418」；SIGMA製造)的試劑和類似物的用於動物細胞培養的培養基，可以選擇能夠穩定地產生人源化抗體的轉化體。培養動物細胞的培養基包括RPMI 1640培養基(Nissui Pharmaceutical製造)、GIT培養基(Nihon Pharmaceutical製造)、EX-CELL 302培養基(JRH製造)、IMDM培養基(GIBCO BRL製造)、雜交瘤-SFM培養基(GIBCO BRL製造)、向這些培養基中加入各種添加物如胎牛血清(下文中稱為「FBS」)獲得的培養基、以及類似培養基。將獲得的轉化體在培養基中培養，可以在培養上清液產生並積聚人源化抗體。在培養上清液中人源化抗體的生成量和抗原結合活性可以通過諸如酶聯免疫吸附測定法[下文中稱為「ELISA」；AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Chapter 14(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciplesand Practice，Academic Press Limited(1996)]或類似方法進行測定。另外，根據已公開未審查的日本專利申請第257891/90號公開的方法，可以使用DHFR基因擴增系統增加轉化體產生的人源化抗體的量。
使用蛋白質A柱，可以從轉化體培養上清液中純化人源化抗體[AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 8(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press Limited(1996)]。此外，還可以使用純化蛋白質通用的純化方法。例如，可以通過凝膠過濾、離子交換色譜、超濾和類似方法的組合進行純化。經純化的人源化抗體H鏈、L鏈或整個抗體分子的分子量可以通過如下方法測定例如，聚丙烯醯胺凝膠電泳[下文中稱為「SDS-PAGE」；Nature，227，680(1970)]、蛋白質印跡法[AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter 12(1988)；Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，Academic Press Limited(1996)]、或類似方法。
B.Fc融合蛋白質的製備(1)Fc融合蛋白質表達載體的構建Fc融合蛋白質表達載體是其中插入了編碼人抗體Fc區和待融合蛋白質的基因的動物細胞表達載體，其可以通過將編碼人抗體Fc區和待融合蛋白質的基因克隆到動物細胞表達載體中構建。
人抗體Fc區除包含CH2和CH3區的區域之外，還包括包含部分鉸鏈區和/或CH1的區域。另外，它可以是任何Fc區，只要CH2或CH3的至少一個胺基酸可被缺失、取代、添加或插入，並基本具有結合Fcγ受體的活性。
作為編碼人抗體Fc區和待融合蛋白質的基因，可以使用包括外顯子和內含子的染色體DNA，也可以使用cDNA。將這些基因與Fc區連接的方法包括使用這些基因序列的每一種作為模板的PCR法(Molecular Cloning，Second Edition；Current Protocols in MolecularBiology，Supplement 1-34)。
可以使用任何載體作為動物細胞表達載體，只要編碼人抗體C區的基因可以插入其中並在其中表達。例子包括pAGE107[Cytotechnology，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，27，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，1527(1981)、pSG1βd2-4[Cytotechnology，4，173(1990)]和類似物。動物細胞表達載體中的啟動子和增強子包括SV40早期啟動子和增強子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒LTR啟動子[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]、免疫球蛋白質H鏈啟動子[Cell，41，479(1985)]和增強子[Cell，33，717(1983)]、和類似物。
(2)製備編碼人抗體Fc區和待融合蛋白質的DNA可以通過以下方法獲得編碼人抗體Fc區和待融合蛋白質的DNA。
由從表達待與Fc融合的目標蛋白質的細胞或組織中提取的mRNA合成cDNA。將合成的cDNA克隆到載體(如噬菌體或質粒)中，得到cDNA文庫。使用目標蛋白質一部分的基因序列作為探針，將包括編碼目標蛋白質的cDNA的重組噬菌體或重組質粒從文庫中分離。測定重組噬菌體或重組質粒上目標蛋白質的全核苷酸序列，從核苷酸序列推導出全長胺基酸序列。
可以使用任何動物作為非人動物，只要從其可以分離細胞獲組織，例如小鼠、大鼠、倉鼠、或兔。
從細胞或組織製備全RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]和類似方法，從全RNA製備mRNA的方法包括oligo(dT)固相纖維素柱法(Molecular Cloning，Second Edition)和類似方法。此外，用於從細胞或組織製備mRNA的試劑盒包括Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen製造)、Quick PrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia製造)、和類似試劑盒。
合成cDNA和製備cDNA文庫的方法包括常用的方法[MolecularCloning，Second Edition；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-34]，以及使用市售試劑盒如cDNA合成和質粒克隆用的Plasmid System SuperscriptTM(GIBCO BRL製造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene製造)的方法和類似方法。
在cDNA文庫的製備中，其中插入了使用從細胞或組織中提取的mRNA作為模板合成的cDNA的載體可以是任何載體，只要可以插入cDNA。例子包括ZAP Express[Strategies，5，58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λZAP II(Stratagene製造)、λgt10和λgt11[DNA Cloning，A PracticalApproach，1，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech製造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia製造)、pcD2[Mol Cell Biol，3，280(1983)]、pUC18[Gene，33，103(1985)]、和類似物。
可以使用任何大腸桿菌作為其中導入了從噬菌體或質粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌，只要cDNA文庫可以得以導入、表達和保留。例子包括XLl-Blue MRF′[Strategies，5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088和Y1090[Science，222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol，16，118(1966)]、JM105[Gene，38，275(1985)]、和類似物。
作為從cDNA文庫選擇編碼目標蛋白質的cDNA克隆的方法，可以使用採用同位素-或螢光-標記探針的菌落雜交或噬菌斑雜交[Molecular Cloning，Second Edition]。還可以通過製備引物並以從mRNA合成的cDNA或cDNA文庫為模板，根據PCR來製備編碼目標蛋白質的cDNA。
將所關注的蛋白質與人抗體Fc區融合的方法包括PCR法。例如，在所關注蛋白質編碼基因序列的5′-端和3′-端設計任何合成的寡DNA(引物)，進行PCR，製備PCR產物。以相同的方式，為待融合的人抗體Fc區的編碼基因序列設計任何引物，以製備PCR產物。此時，以下列方式設計引物待融合蛋白質PCR產物的3′-端和Fc區PCR產物的5′-端之間存在相同的限制性酶位點或相同的基因序列。當需要連接位點周圍對胺基酸進行修飾時，使用其中導入突變的引物來導入突變。使用獲得的兩種PCR片段進一步進行PCR，將基因連接起來。另外，還可以通過在用相同的限制性酶處理後進行連接，將它們連接起來。
可以通過如下方法測定dNA的核苷酸序列用合適的限制性酶消化通過上述方法連接的基因序列，將這些片段克隆到質粒如pBluescriptSK(-)(Stratagene製造)中，使用通用的核苷酸序列分析方法如Sanger等人的雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]或自動核苷酸序列分析儀如A.L.F.DNA測序儀(Pharmacia製造)進行分析。
從測定的核苷酸序列推算Fc融合蛋白質的全長胺基酸序列，並將其與目標胺基酸序列進行比較，可以確認得到的cDNA是否編碼包含分泌性信號序列的Fc融合蛋白質的全長胺基酸序列。
(3)Fc融合蛋白質的穩定產生通過將2.B.(1)中所述的Fc融合蛋白質表達載體導入合適的動物細胞，可以獲得能夠穩定地產生Fc融合蛋白質的轉化體。
將Fc融合蛋白質表達載體導入動物細胞的方法包括電穿孔法[已公開未審查的日本專利申請第257891/90號，Cytotechnology，3，133(1990)]和類似方法。
可以使用任何細胞作為導入了融合蛋白質表達載體的動物細胞，只要它是上文第1項中產生的本發明的細胞和可以產生Fc融合蛋白質的動物細胞。
例子包括小鼠骨髓瘤細胞如NS0細胞和SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞如CHO/dhfr-細胞和CHO/DG44細胞、大鼠骨髓瘤細胞如YB2/0細胞和IR983F細胞、來源於敘利亞倉鼠腎的BHK細胞、人骨髓瘤細胞如Namalwa細胞和類似細胞。優選中國倉鼠卵巢細胞CHO/DG44細胞和大鼠骨髓瘤YB2/0細胞。
導入Fc融合蛋白質表達載體後，根據已公開未審查的日本專利申請第257891/90號公開的方法，使用包括如G418硫酸鹽和類似物的試劑的用於動物細胞培養的培養基，可以選擇能夠穩定地產生Fc融合蛋白質表達載體的轉化體。培養動物細胞的培養基包括RPMI 1640培養基(Nissui Pharmaceutical製造)、GIT培養基(Nihon Pharmaceutical製造)、EX-CELL 302培養基(JRH製造)、IMDM培養基(GIBCO BRL製造)、雜交瘤-SFM培養基(GIBCO BRL製造)、向這些培養基中加入各種添加物如胎牛血清獲得的培養基、以及類似培養基。將獲得的轉化體在培養基中培養，可以在培養上清液產生並積聚Fc融合蛋白質。培養上清液中Fc蛋白質的生成量和抗原結合活性可以通過諸如ELISA法的方法進行測定。另外，根據已公開未審查的日本專利申請第257891/90號公開的方法，可以使用dhfr基因擴增系統增加轉化體產生的Fc融合蛋白質的量。
使用蛋白質A柱或蛋白質G柱，可以從培養轉化體的培養上清液中純化Fc融合蛋白質[Antibodie，Chapter 8；Monoclonal Antibodies]。此外，還可以使用純化蛋白質通用的純化方法。例如，可以通過凝膠過濾、離子交換色譜、超濾和類似方法的組合進行純化。經純化的Fc融合蛋白質分子的整體分子量可以通過SDS-PAGE[Nature，227，680(1970)]、蛋白質印跡法[Antibodie，Chapter 12；Monoclonal Antibodies]或類似方法測定。
因此，使用動物細胞作為宿主細胞產生抗體組合物的方法已經如上進行了描述，但是，抗體組合物也可以如上所述由酵母、昆蟲細胞、植物細胞、動物個體或植物個體產生。
當宿主細胞具有能夠在宿主細胞中表達糖蛋白質如抗體分子的基因時，根據第1項所述的方法製備宿主細胞，培養細胞，從培養物中純化目標糖蛋白質，獲得糖蛋白質。
3.糖蛋白質活性評價通過如下文獻所述的已知方法測定純化糖蛋白質的量、其受體親和性、血液內半衰期、給藥至血液中的組織內分布、和表達藥理學活性所需蛋白質之間相互作用的變化Current Protocols In Protein Science，John Wiley Sons Inc.，(1995)；New Biochemical Experimentation Series19-Animal Experimental Test，Tokyo Kagaku Dojin，Japanese BiochemicalSociety編著(1991)；New Biochemical Experimentation Series8-Intracellular Information and Cell Response，Tokyo Kagaku Dojin，Japanese Biochemical Society編著(1990)；New BiochemicalExperimentation Series 9-Hormone I，Peptide hormone，Tokyo KagakuDojin，Japanese Biochemical Society編著(1991)；Experimental BiologicalCourse 3-Isotope Experimental Test，Maruzen(1982)；MonoclonalAntibodiesPrincipes and Applications，Wiley-Liss，Inc.，(1995)；Enzyme-Linked Immuno Adsorbent Assay，第三版，Igaku Shoin(1987)；Revised Enzyme Immunoassay，Gakusai Kikaku(1985)；和類似文獻。
具體的例子包括如下方法將純化的糖蛋白質用諸如放射性同位素的化合物標記，定量測定標記糖蛋白質或相互作用蛋白質的受體結合活性。而且，還通過使用多種儀器如Biacore製造的BIAcore Series測定蛋白質間相互作用[J.Immnunol.Methods，145，229(1991)；Experimental Medicine Supplement，Biomanual UP Series，ExperimentalTest of Intermolecular Interaction Experimental Test，Yodo-sha(1996)]。
通過將標記的糖蛋白質給予活體，可以觀察給予活體後的血液內半衰期和組織內分布。優選地，通過一定的檢測方法對標記體進行檢測，在所述檢測方法中，標記物質檢測方法與使用對待檢測糖蛋白質有特異性的抗體的抗原-抗體反應結合使用。
4.抗體組合物活性評價作為測定蛋白質量、抗原親和性、和純化抗體組合物效應器功能的方法，可以使用Monoclonal Antibodies，Antibody Engineering和類似文獻中所述的已知方法。
作為例子，當抗體組合物為人源化抗體時，可以通過ELISA、免疫螢光法或類似方法測定與抗原結合的活性和與抗原陽性培養細胞克隆結合的活性[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]。對抗原陽性培養細胞克隆的細胞毒活性可以通過測定CDC活性、ADCC活性和類似測定來評價[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]。
此外，抗體組合物在人體中的安全性和治療作用可以使用合適的與人相近的動物種屬模型如食蟹猴(Macaca fascicularis)進行評價。
5.糖蛋白質中糖鏈的分析宿主細胞中表達的糖蛋白質的糖鏈結構可以根據糖蛋白質糖鏈結構的常規分析方法進行分析。例如，與IgG分子結合的糖鏈包括中性糖如半乳糖、甘露糖、或巖藻糖；氨基糖如N-乙醯氨基葡萄糖；和酸性糖如唾液酸，通過糖組成分析、二維糖鏈作圖法、或類似方法，可以根據例如糖鏈結構分析法的方法進行分析。
下文中對抗體組合物中糖鏈的分析方法進行具體說明，但是通過相同的方式也可以分析其它糖蛋白質。
(1)中性糖和氨基糖的組成分析抗體組合物中糖鏈的組成可以通過用酸(如三氟乙酸)酸水解釋放出中性糖或氨基糖並分析組成比例來進行分析。
例子包括使用Dionex製造的糖組成分析儀(BioLC)的方法。BioLC是通過HPAEC-PAD(高效陰離子交換色譜-脈衝電流檢測)分析糖組成的儀器[J.Liq.Chromatogr.，6，1577(1983)]。
組成比例也可以通過使用2-氨基吡啶的螢光標記法進行分析。具體地說，組成比例可以根據以下已知方法計算將酸水解樣品用2-氨基吡啶化進行螢光標記，然後通過HPLC來分析組成[Agric.Biol.Chem.，55(1)283-284(1991)]。
(2)糖鏈結構分析抗體分子中糖鏈的結構可以通過二維糖鏈作圖法進行分析[Anal.Biochem.，171，73(1988)；Biochemical Experimentation Methods 23-Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains，(Japan ScientificSocieties Press)Reiko Takahashi主編(1989)]。二維糖鏈作圖法是一種推斷糖鏈結構的方法，例如，分別以反相色譜中糖鏈的保留時間或洗脫位置為X軸、以正相色譜中糖鏈的保留時間或洗脫位置為Y軸作圖，並將它們與已知糖鏈的結果進行比較。
具體地說，通過對抗體進行肼解，從抗體中釋放出糖鏈，用2-氨基吡啶(下文稱為PA)對其進行螢光標記[J.Biochem.，95，197(1984)]，然後通過凝膠過濾將其從過量PA處理試劑中分離，對其進行反相色譜。然後，對糖鏈的每個峰進行正相色譜。將得到的結果在二維糖鏈圖譜上作圖，並將其與糖鏈標準物(Takara Shuzo)的點或文獻中的數據進行比較，可以推斷糖鏈的結構[Anal.Biochem.，171.73(1988)]。
通過二維糖鏈作圖推斷的結構可以通過對每個糖鏈進行質譜分析如MALDI-TOF-MS來進一步確認。
6.導入的RNA的副作用分析導入的RNA除抑制靶酶的功能之外，還可能影響到同源性很高的基因的表達、翻譯等水平[Nature Biotechnol.，21，635(2003)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，1892(2004)]。因此，當產生糖蛋白質如抗體組合物時，應當分析轉化體的生長或所產生糖蛋白質的表達是否受到RNA導入副作用的影響。
具體來說，就糖蛋白質如抗體組合物的表達細胞而言，同時培養未導入本發明RNA的親代細胞和導入RNA的細胞，以確認細胞生長曲線和糖蛋白質表達水平沒有變化。通過分析所產生糖蛋白質的各種特性，確認了除由於糖鏈結構不同引起的生物學活性之外，所產生的糖蛋白質沒有差異。
通過上文第5項中所述的方法可以分析所產生糖蛋白質的糖鏈結構。通過任何已知的蛋白質分析方法可以分析糖蛋白質的各種特性。蛋白質分析方法包括物理化學分析如電泳、凝膠過濾、等電點和胺基酸序列分析、抗原親和性(當所產生的糖蛋白質是抗體時)、酶活性(當所產生的糖蛋白質是酶時)、和分別的配體或受體親和性(當糖蛋白質是配體或受體時)。
7.糖蛋白質的應用糖蛋白質如抗體組合物具有巖藻糖未修飾的糖鏈結構，並且生物活性很高，使得預計其具有如下作用例如，與其受體的親和性提高、血液內半衰期提高、給藥至血液後組織內分布改善、以及表達藥理學活性所需蛋白質之間的相互作用改善。特別是，抗體組合物的效應器功能很高，即，依賴抗體的細胞介導細胞毒活性很高。生理活性很高的糖蛋白質或ADCC活性很高的抗體組合物可用於預防和治療多種疾病，所述疾病包括癌症、炎性疾病、免疫疾病如自身免疫性疾病和變態反應、心血管疾病和病毒或細菌感染。
在癌症即惡性腫瘤的情況下，癌細胞大量生長。通常的抗腫瘤藥抑制癌細胞的生長。相反，ADCC活性很高的抗體可以通過其細胞殺傷作用損傷癌細胞來治療癌症，因此，它是一種較一般抗腫瘤藥更有效的治療藥物。目前，在癌症的治療藥物中，抗體藥物單獨的抗腫瘤作用在許多情況下並不充分，因此已經進行了與化療結合的治療[Science，280，1197(1998)]。如果發現單獨使用本發明抗體組合物的抗腫瘤作用更高，則對化療的依賴性將降低，副作用將減少。
在免疫疾病如炎性疾病、自身免疫性疾病和變態反應中，免疫細胞釋放的介質分子誘發疾病的體內反應，因此，使用ADCC活性很高的抗體消滅免疫細胞可以抑制變態反應。
心血管疾病包括動脈硬化和類似疾病。目前使用氣囊式導管來治療動脈硬化，但是在使用ADCC活性很高的抗體後，可以通過抑制再狹窄部位中動脈細胞的生長來預防和治療心血管疾病。
使用ADCC活性很高的抗體，可以通過抑制被病毒或細菌感染的細胞的增殖來預防和治療包括病毒和細菌感染的多種疾病。
以下舉例說明識別腫瘤相關抗原的抗體、識別變態反應-或炎症-相關抗原的抗體、識別心血管疾病相關抗原的抗體、識別自身免疫性疾病相關抗原的抗體、或識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體。
識別腫瘤相關抗原的抗體包括抗-CA125抗體、抗-17-1A抗體、抗整聯蛋白質αvβ3抗體、抗-CD33抗體、抗-CD22抗體、抗-HLA抗體、抗-HLA-DR抗體、抗-CD20抗體、抗-CD19抗體、抗-EGF受體抗體[Immunology Today，21，403(2000)]、抗-CD 10抗體[American Journalof Clinical Pathology，113，374(2000)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，4386(1982)]、抗-GD2抗體[Anticancer Res.，13，331(1993)]、抗-GD3抗體[Cancer Immunol.Immunother.，36，260(1993)]、抗-GM2抗體[Cancer Res.，54，1511(1994)]、抗-HER2抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，4285(1992)]、抗-CD52抗體[Nature，332，323(1988)]、抗-MAGE抗體[British J.Cancer，83，493(2000)]、抗-HM1.24抗體[MolecularImmunol，36，387(1999)]、抗-甲狀旁腺激素相關蛋白質(PTHrP)抗體[Cancer，88，2909(2000)]、抗-FGF8抗體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，9911(1989)]、抗鹼性成纖維細胞生長因子抗體、抗-FGF8受體抗體[J.Biol.Chem.，265，16455(1990)]、抗鹼性成纖維細胞生長因子受體抗體、抗胰島素樣生長因子抗體、抗胰島素樣生長因子受體抗體[J.Neurosci.Res.，40，647(1995)]、抗-PMSA抗體[J.Urology，160，2396(1998)]、抗血管內皮細胞生長因子抗體[Cancer Res.，57，4593(1997)]、抗血管內皮細胞生長因子受體抗體[Oncogene，19，2138(2000)]和類似抗體。
識別變態反應-或炎症-相關抗原的抗體包括抗-IgE抗體、抗-CD23抗體、抗-CD11a抗體[Immunology Today，21，403(2000)]、抗-CRTH2抗體[J.Immunol，162，1278(1999)]、抗-CCR8抗體(WO99/25734)、抗-CCR3抗體(US6207155)、抗白細胞介素6抗體[Immunol.Rev.，127，5(1992)]、抗白細胞介素6受體抗體[Molecular Immunol，31，371(1994)]、抗白細胞介素5抗體Immunol.Rev.，127，5(1992)]、抗白細胞介素5受體抗體、抗白細胞介素4抗體[Cytokine，3，562(1991)]、抗白細胞介素4受體抗體[J.Immunol.Meth.，217，41(1998)]、抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma，13，183(1994)]、抗腫瘤壞死因子受體抗體[Molecular Pharmacol，58，237(2000)]、抗-CCR4抗體[Nature，400，776(1999)]、抗趨化因子抗體[J.Immuno.Meth.，174，249(1994)]、抗趨化因子受體抗體[J.Exp.Med，186，1373(1997)]和類似抗體。
識別心血管疾病相關抗原的抗體包括抗-GpIIb/IIIa抗體[J.Immunol.，152，2968(1994)]、抗血小板衍生生長因子抗體[Science，253，1129(1991)]、抗血小板衍生生長因子受體抗體[J.Biol.Chem.，272，17400(1997)]、抗凝血因子抗體[Circulation，101，1158(2000)]和類似抗體。
識別自身免疫性疾病(如銀屑病、類風溼性關節炎、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡和多發性硬化症)相關抗原的抗體包括抗自身-DNA抗體[Immunol.Letters，72，61(2000)]、抗CD11a抗體、抗-ICAM 3抗體、抗-CD80抗體、抗-CD2抗體、抗-CD3抗體、抗-CD4抗體、抗整聯蛋白質α4β7抗體、抗-CD40L抗體、抗-IL-2受體抗體[Immunology Today，21，403(2000)]和類似抗體。
識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體包括抗-gp120抗體[Structure，8，385(2000)]、抗-CD4抗體[J.Rheumatology，25，2065(1998)]、抗-CCR5抗體和抗-Vero毒素抗體[J.Clin.Microbiol.，37，396(1999)]和類似抗體。
這些抗體可以獲自公共機構如ATCC(The American Type CultureCollection)、The Institute of Physical and Chemical Research and NationalInstitute of Bioscience and Human Technology(物理和化學研究協會和國家生物科學和人類科技協會)的RIKEN基因庫、Agency of IndustrialScience and Technology(工業科學技術研究院)或私人試劑銷售公司如Dainippon Pharmaceutical、RD SYSTEMS、PharMingen、Cosmo Bio和Funakoshi。
下面對本發明的Fc區融合蛋白質的例子進行描述。
炎性疾病和免疫疾病如自身免疫性疾病和變態反應的相關結合蛋白質與抗體Fc區的融合蛋白質的例子包括etanercept(USP5605690，其為sTNFRII與Fc區的融合蛋白質)、alefacept(USP5914111，其為抗原遞呈細胞上表達的LFA-3與Fc區的融合蛋白質)、細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)與Fc區的融合蛋白質[J.Exp.Med，181，1869(1995)]、白細胞介素15與Fc區的融合蛋白質[J.Immunol，160，5742(1998)]、VII因子與Fc區的融合蛋白質[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，12180(2001)]、白細胞介素10與Fc區的融合蛋白質[J.Immunol，154，5590(1995)]、白細胞介素2與Fc區的融合蛋白質[J.Immunol，146，915(1991)]、CD40與Fc區的融合蛋白質[Surgery，132，149(2002)]、Flt-3蛋白質(fms樣酪氨酸激酶)與抗體Fc區的融合蛋白質[Acta.Haemato.，95，218(1996)]、OX40與抗體Fc區的融合蛋白質[J.Leu.Biol，72，522(2002)]、和類似蛋白質。另外，已經報導了許多融合蛋白質，如多種人CD分子[CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD 106(VCAM-1)、CD137]、粘附分子[ALCAM(活化的白細胞細胞粘附分子)、鈣粘著蛋白質、ICAM(細胞間粘附分子)-1、ICAM-2、ICAM-3]、細胞因子受體(下文中「受體」稱為「R」)、(白細胞介素-4R、白細胞介素-5R、白細胞介素-6R、白細胞介素-9R、白細胞介素-10R、白細胞介素-12R、白細胞介素-13Rα1、白細胞介素-13Rα2、白細胞介素-15R、白細胞介素-21R)、趨化因子、細胞死亡誘導信號分子[B7-H1、DR6(死亡受體6)、PD-1(程序性死亡因子-1)、TRAIL R1]、共刺激分子[B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(可誘導的共刺激分子)]、生長因子(ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化誘導因子(B7-H3)、活化因子(NKG2D)、信號轉移分子(gp130)、或這些結合蛋白質與抗體Fc區的受體或配體。
包括糖蛋白質如抗體組合物的藥物可以作為治療藥物單獨給藥，但通常優選將其通過藥劑學技術領域中公知的合適方法與至少一種藥學可接受的載體混合製成藥物劑型。
優選選擇在治療中最為有效的給藥途徑。例子包括口服給藥和胃腸外給藥，如口內給藥、氣管內給藥、直腸內給藥、皮下給藥、肌肉內給藥或靜脈內給藥。在糖蛋白質製劑的情況下，優選靜脈內給藥。
劑型包括噴霧劑、膠囊、片劑、顆粒劑、糖漿、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏劑、膠帶和類似劑型。
適於口服給藥的藥物製劑包括乳劑、糖漿、膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑和類似劑型。
液體製劑如乳劑和糖漿可以使用水；糖類如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇如聚乙二醇和丙二醇；油類如芝麻油、橄欖油和豆油；防腐劑如對羥基苯甲酸酯；香料如草莓香料、薄荷油和類似物作為添加劑而製造。
膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑或類似劑型可以使用填料如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇；崩解劑如澱粉和藻酸鈉；潤滑劑如硬脂酸鎂和滑石；粘合劑如聚乙稀醇、羥丙基纖維素和明膠；表面活性劑如脂肪酸酯；增塑劑如甘油和類似物作為添加劑而製造。
適於胃腸外給藥的藥物製劑包括注射劑、栓劑、噴霧劑、和類似劑型。
注射劑可以使用例如鹽溶液、葡萄糖溶液或其二者混合物的載體而製備。另外，還可以通過根據常規方法凍幹糖蛋白質並向其中加入氯化鈉而製成粉末注射劑。
栓劑可以使用載體如可可脂、氫化油脂、或羧酸而製備。
噴霧劑可以使用糖蛋白質或將其與不刺激患者口腔或氣道黏膜的載體一起使用而製備，可以通過將糖蛋白質分散成細粒而促進其吸收。
載體包括乳糖、甘油和類似物。根據糖蛋白質和載體的特性，可以製造例如氣霧劑和乾粉的製劑。此外，製備胃腸外製劑時，也可加入上述的口服製劑添加劑。作為口服製劑添加劑例舉的成分也以加入到胃腸外製劑中。
儘管給藥的劑量和頻率根據目標治療效果、給藥方法、治療周期、年齡、體重和類似情況而改變，但是，其通常為每個成人每天10μg/kg至20mg/kg。
另外，作為考察抗體組合物對各種腫瘤細胞的抗腫瘤作用的方法，體外試驗包括CDC活性檢測法、ADCC活性檢測法和類似方法，體內試驗包括使用試驗動物如小鼠的腫瘤系統的抗腫瘤試驗。
CDC活性、ADCC活性和抗腫瘤試驗可以根據文獻中描述的方法[Cancer Immunology Immunotherapy，36，373(1993)；Cancer Research，54，1511(1994)]和類似方法進行。
以下基於實施例對本發明進行詳細描述；但是這些實施例僅僅用來進行描述，本發明的範圍不限於此。
實施例1通過導入GMD-靶向小幹擾RNA(siRNA)表達質粒製備凝集素抗性CHO/DG44細胞1.構建GM D-靶向siRNA表達載體
(1)克隆「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒(cassette)根據以下方法獲得「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒(圖1)。
首先，設計正向引物和反向引物，正向引物中限制性酶HindIII和EcoRV的識別序列加入到與人U6啟動子序列[GenBank Acc.No.M14486]結合的核苷酸序列的5′-端(下文中稱為「hU6p-F-HindIII/EcoRV」，表示為SEQ ID NO59)，反向引物中限制性酶XbaI和EcoRV的識別序列(與終止子序列對應的6個連續腺嘌呤鹼基)和用於插入不同合成寡核苷酸DNA的限制性酶KpnI和SacI的識別序列加入至與人U6啟動子序列結合的核苷酸序列5′-端(下文中稱為「hU6p-R-term-XbaI/EcoRV」，表示為SEQ ID NO60)。
然後，製備50μL含有40ng U6_FUT8_B_puro質粒(WO03/085118的實施例12中說明)作為模板的反應溶液[KOD緩衝液#1(TOYOBO製造)，0.1mmol/L dNTPs、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L引物hU6p-F-HindIII/EcoRV、和0.4μmol/L引物hU6p-R-term-XbaI/EcoRV]之後，使用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO製造)進行聚合酶鏈式反應(下文中稱為「PCR」)。在94℃下加熱2分鐘後，進行30次PCR循環，一個循環為94℃下反應15秒、65℃下反應5秒、74℃下反應30秒。
PCR之後，反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHIP(TAKARABIO製造)回收特異性擴增的片段(大約300bp)。將DNA片段溶解在30μL NEBuffer 2(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶XbaI(New England Biolabs製造)和HindIII(New EnglandBiolabs製造)在37℃下消化2小時。通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉澱純化反應溶液，用限制性酶消化回收的DNA片段溶解在20μL無菌水中。
另外，將1μg質粒pBluescript II KS(+)(STRATAGENE製造)溶解在30μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs製造)的NEBuffer 2(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶HindIII和XbaI(New England Biolabs製造)在37℃下消化8小時。消化反應後，向反應溶液中加入22μL無菌水、6μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液和1單位鹼性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收來自質粒pBluescript II KS(+)的HindIII-XbaI片段(大約2.9 kb)。
然後，將如上獲得的8μL DNA片段(大約300 bp)和2μL來自質粒pBluescript II KS(+)的HindIII-XbaI片段(大約2.9 kb)與10μLLigation High(TOYOBO製造)混合，在16℃下反應2小時。將E.coliDH5α(TOYOBO製造)用反應溶液進行轉化，使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒。下文中質粒稱為「pBS-U6term」。
(2)「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒與pPUR的連接將上文(1)中獲得的質粒pBS-U6term中的「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒切斷，並根據如下方法將其與表達載體pPUR(CLONTECH製造)連接(圖2)。
首先，將1μg上文(1)中製備的質粒pBS-U6term溶解在20μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs製造)的NEBuffer 2(NewEngland Biolabs製造)中，並用10單位限制性酶EcoRV(New EnglandBiolabs製造)在37℃下消化2小時。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHIP(TAKARABIO製造)回收含有「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒的DNA片段(大約350bp)。
另外，將6μg質粒pPUR(CLONTECH製造)溶解在20μL NEBuffer2(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶PvuII(NewEngland Biolabs製造)在37℃下消化2小時。反應後，向反應溶液中加入5μL無菌水、3μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液、和1單位鹼性磷酸酶E.coli C75(TAKARABIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收來自質粒pPUR的PvuII片段(大約4.3 kb)。
然後，將8μL如上得到的含有人U6啟動子-克隆位點-終止子序列表達盒的DNA片段(大約350 bp)和2μL來自質粒pPUR的PvuII片段(大約4.3 kb)與10μL Ligation High(TOYOBO製造)混合，在16℃下反應3小時。將E.coli DH5α(TOYOBO製造)用反應溶液進行轉化，使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒DNA。將大約0.5μg質粒DNA溶解在10μL NEBuffer 2(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶SacI和HindIII(New England Biolabs製造)在37℃下消化2小時。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，以確認所插入目標片段的存在和插入方向。此外，使用377型DNA測序儀(Perkin Elmer製造)和BigDyeTerminator v3.0循環測序試劑盒(Applied Biosystems製造)，根據生產廠商的說明書測定插入到每個質粒中的DNA的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO61)和pPUR PvuII-seq-R(SEQ IDNO62)作為序列分析引物，以確認插入的DNA片段具有與GenBankAcc.No.M14486相同的人U6啟動子序列，並且用於擴增「人U6啟動子-克隆位點-終止子」序列表達盒的引物位點序列和連接位點序列是正確的，從得到的質粒中選擇其中插入的hU6啟動子與嘌呤黴素抗性基因表達單位方向相同的質粒。下文中該質粒稱為「pPUR-U6term」。
(3)選擇靶序列、設計合成寡DNA形成含有針對中國倉鼠卵巢CHO/DG44細胞GMD基因的siRNA靶序列的雙鏈DNA盒的合成寡DNA如下進行製備。
首先，從來源於中國倉鼠的GMD cDNA序列(GenBank Acc.No.AF525364；SEQ ID NO8)中選擇符合下述條件的7條靶序列。選擇的靶序列表示為SEQ ID NO36-42。
條件1包括由「NAR(N17)YNN」組成的共有序列，其中分別地，N代表A、G、U或C；R代表A或G，Y代表U或C。
條件2滿足條件1，且不包括連續3個或更多個相同鹼基的序列。
條件3滿足條件1和2，GC含量更優選35-45％，優選45-55％。
條件429個鹼基的序列(其中6個鹼基添加到滿足條件1-3的23個鹼基的5′-或3′-端)滿足條件2。
條件5滿足條件4，GC含量更優選35-45％，優選45-55％。
此外，根據如下方法為所選擇的靶序列設計雙鏈DNA盒。從5』-端，雙鏈DNA盒依次具有用限制性酶SacI消化產生的3′-粘性末端、與SEQ ID NO36-42對應的有義DNA、由10個鹼基組成的人miR-23-前體-19微小RNA的環狀序列(loop sequence)(GenBank Acc.No.AF480558)、與SEQ ID NO36-42的DNA序列互補的反義DNA、和限制性酶KpnI產生的3′-粘性末端。雙鏈DNA的5』-端被磷酸化。
根據SEQ ID NO36所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈(sense strand)的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-A-F」)由SEQ ID NO43表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-A-R」)由SEQ ID NO44表示；根據SEQ ID NO37所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-B-F」)由SEQ ID NO45表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-B-R」)由SEQ ID NO46表示；根據SEQ ID NO38所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-C-F」)由SEQ ID NO47表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-C-R」)由SEQ ID NO48表示；根據SEQ IDNO39所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-D-F」)由SEQ ID NO49表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-D-R」)由SEQ ID NO50表示；根據SEQ ID NO40所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-E-F」)由SEQ ID NO51表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-E-R」)由SEQ ID NO52表示；根據SEQ ID NO41所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-F-F」)由SEQ ID NO53表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-F-R」)由SEQ ID NO54表示；根據SEQ ID NO42所示的靶序列設計的合成寡DNA有義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-F-F」)由SEQ ID NO55表示；反義鏈的核苷酸序列(下文中稱為「GMD-dsRNA-F-R」)由SEQ IDNO56表示。根據常規方法合成設計的合成寡DNA(Moleculer Cloning，Second Edition)。
(4)將合成的寡DNA插入質粒pPUR-U6term將上文(3)中合成的合成寡DNA插入上文(2)中獲得的pPUR-U6term的克隆位點(圖3)。
首先，根據如下方法將合成寡DNA退火。在10μL退火緩衝液[10mmol/L Tris(pH7.5)-50mmol/L NaCl-1mmol/L EDTA]中，溶解200pmol合成寡DNA的每條正義和反義鏈，然後煮沸2分鐘。然後，在大約3小時的時間內逐漸冷卻至室溫。隨後，將退火的合成寡DNA用無菌水稀釋15倍。
另外，將3μg質粒pPUR-U6term溶解在40μL含有100μg/mLBSA(New England Biolabs製造)的NEBuffer 1(New England Biolabs製造)中，用20單位限制性酶KpnI和SacI(New England Biolabs製造)在37℃下消化4小時。消化反應後，向反應溶液中加入12μL無菌水、6μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液和1單位鹼性磷酸酶E.coli C75(TAKARABIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHEP(TAKARA BIO製造)回收來自質粒pPUR-U6term的KpnI-SacI片段(大約4.5kb)。
然後，將如上獲得的1μL雙鏈合成寡聚溶液和1μL來自質粒pPUR-U6term的KpnI-SacI片段與8μL無菌水和10μL Ligation High(TOYOBO製造)混合，並在16℃下反應過夜。將E.coli DH5α(TOYOBO製造)用反應溶液轉化，用QIAprep spin Mini prep試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒DNA。
使用377型DNA測序儀(Perkin Elmer製造)和BigDye Terminatorv3.0循環測序試劑盒(Applied Biosystems製造)，根據生產廠商的說明書，測定插入每個質粒中的DNA的核苷酸序列。將質粒DNA煮沸大約1分鐘，迅速冷卻後用作模板，使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ IDNO61)、hU6p Tsp45I/seq-F(SEQ ID NO63)和pPUR PvuII-seq-R(SEQID NO62)作為序列分析引物，以確認插入的合成寡DNA的序列和連接位點。在下文中，其中導入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-A-F和GMD-dsRNA-A-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshA」；其中導入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-B-F和GMD-dsRNA-B-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshB」；其中導入了由合成寡DNAGMD-dsRNA-C-F和GMD-dsRNA-C-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshC」；其中導入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-D-F和GMD-dsRNA-D-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshD」；其中導入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-E-F和GMD-dsRNA-E-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshE」；其中導入了由合成寡DNAGMD-dsRNA-F-F和GMD-dsRNA-F-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshF」；其中導入了由合成寡DNA GMD-dsRNA-G-F和GMD-dsRNA-G-R組成的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDshG」。
2.通過導入GMD-靶向siRNA表達載體獲得和培養凝集素抗性克隆(1)通過導入GMD-靶向siRNA表達載體獲得凝集素抗性克隆將本實施例第1項中構建的每個質粒pPUR/GMDshA、pPUR/GMDshB、pPUR/GMDshC、pPUR/GMDshD、pPUR/GMDshE、pPUR/GMDshF和pPUR/GMDshG導入來源於CHO/DG44細胞的產生抗-CCR4嵌合抗體的克隆——克隆35-02-12(下文中稱為「克隆32-05-12」)，該克隆通過與WO03/85118的參考實施例1中所述相同的方法獲得，如下文所述獲得識別糖鏈結構且對凝集素扁豆凝集素(下文中稱為「LCA」)有抗性的克隆(所述糖鏈結構中在N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)。
根據以下方法通過電穿孔法將多個siRNA表達載體質粒轉染到克隆32-05-12中[Cytotechnology，3，133(1990)]。首先，將10μg各種siRNA表達載體質粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶FspI(New England Biolabs製造)在37℃下消化過夜進行線性化。使用一部分反應溶液通過瓊脂糖凝膠電泳確認被線性化的質粒後，將剩餘反應溶液通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉澱純化，回收的線性化質粒溶解在10μL無菌水中。
另外，將克隆32-05-12以8×106細胞/mL溶解在K-PBS緩衝液(137mmol/L KC 1、2.7mmol/L NaCl、8.1mmol/L Na2HPO4、1.5mmol/KH2PO4和4.0mmol/L MgCl2)中。將200μL細胞懸液(1.6×106)與10μL上述線性化的質粒溶液混合後，將所有的細胞/DNA混合物轉移至GenePulser Cuvette(電極間隔2mm)(BIO-RAD製造)，在脈衝電壓350V、電容250μF的條件下使用細胞融合裝置Gene Pulser(BIO-RAD製造)進行轉染。轉染後，將細胞懸液懸浮在基礎培養基[Iscove′s ModifiedDulbecco′s Medium(下文中稱為「IMDM」，Invitrogen製造)，其含有10％胎牛透析血清(Invitrogen製造)、50μg/mL慶大黴素(Nacalai Tesque製造)和500nmol/L MTX(SIGMA製造)]中，並接種到4個10cm-培養皿中進行粘附細胞培養(Falcon製造)。在5％CO2和37℃的條件下培養24小時後，去掉培養上清液，向其中加入補充有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基，然後繼續培養7天。隨後，從其中一皿中去除培養上清液，向其中加入含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基，然後繼續培養6至8天，對出現的嘌呤黴素抗性集落進行計數。另外，從剩餘的培養皿中去掉培養上清液，向其中加入添加了12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR製造)的基礎培養基，然後繼續培養7天。結果，當導入pPUR/GMDshB時，獲得了凝集素抗性克隆。
(2)凝集素抗性克隆的擴大培養根據以下方法對上文(1)中通過導入pPUR/GMDshB獲得的凝集素抗性克隆進行擴大培養。
首先，對每個培養皿中出現的集落數目進行計數。然後，將凝集素抗性集落刮下，在立體顯微鏡的觀察下用pipetteman(GILSON製造)吸取，收集在用於粘附細胞的U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS製造)上。進行胰蛋白質酶處理後，將每個克隆分配至用於粘附細胞的平底96孔板(Greiner製造)上，在5％CO2和37℃的條件下在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中培養1周。培養後，將10個克隆在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中進行擴大培養。擴大培養中使用的克隆分別命名為「12-GMDB-1」、「12-GMDB-2」、「12-GMDB-3」、「12-GMDB-4」、「12-GMDB-5」、「12-GMDB-6」、「12-GMDB-7」、「12-GMDB-8」、「12-GMDB-9」和「12-GMDB-10」，並用於下文第3項中說明的分析。克隆12-GMDB-5也已經於2004年7月1日保藏專利生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)，獨立行政法人產業技術綜合研究所(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，編號為FERMBP-10051。
3.測定導入了GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆中GMDmRNA的量(1)製備全RNA根據以下方法從克隆32-05-12和本實施例第2項中獲得的凝集素抗性克隆中製備全RNA。以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將凝集素抗性克隆懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將它們以4ml接種在6cm-粘附細胞用培養皿(Falcon製造)中。將細胞在5％CO2和37℃的條件下靜置培養3天，胰蛋白質酶處理後收集各種細胞懸液，以1,000rpm在4℃下離心5分鐘，去掉上清液。將細胞懸浮在Dulbecco′s PBS緩衝液(Invitrogen製造)、並再次在1,000rpm和4℃下離心5分鐘去掉上清液之後，使用RNeasy(QTAGEN製造)提取全RNA。根據生產廠商的說明書實施該方法，將製備的全RNA溶解在40μL無菌水中。
(2)合成單鏈cDNA採用SUPERSCRIPTTMPreamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen製造)，根據生產廠商的說明書，使用寡(dT)引物在20μL反應系統中通過逆轉錄反應從第(1)項中獲得的各種全RNA合成單鏈cDNA。隨後，將反應溶液用RNase處理，最終的反應體積調整至40μL。另外，各種反應溶液用無菌水稀釋50倍，並用於下述基因轉錄量的測定。
(3)通過SYBR-PCR測定基因轉錄量根據以下方法使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCRVersion(TAKARA BIO製造)測定從GMD基因和β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。
關於這一點，使用WO02/31140的實施例15所述的含有來源於CHO細胞的GMD cDNA的質粒pAGE249GMD(各稀釋為0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL的濃度)作為GMD測定的內參照；使用WO02/31140的實施例9所述的β-肌動蛋白質標準質粒(各稀釋為1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作為β-肌動蛋白質測定的內參照。作為PCR引物，使用SEQ ID NO64和65分別所示的正向和反向引物來擴增GMD，使用SEQ ID NO66和67分別所示的正向和反向引物來擴增β-肌動蛋白質基因。
然後，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO製造)製備含有5μL(2)中製備的單鏈cDNA或各種濃度的內參照質粒溶液的20μL反應溶液[R-PCR緩衝液(TAKARABIO製造)、用於R-PCR的2.5mmol/L Mg2+溶液(TAKARABIO製造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARABIO製造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀釋SYBR GreenI、1單位TaKaRa Ex TaqR-PCR]。將製備的反應溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon製造)上的每孔中，並將板用Plate Sealer(Edge Biosystems製造)密封。使用ABI PRISM 7700型序列檢測系統進行PCR和分析，根據生產廠商的說明書測定GMD mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量。
根據內參照質粒的測量結果製作標準曲線，將GMD mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。另外，假設從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量在克隆之間都是相同的，計算並比較GMDmRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量，結果示於圖4。
經顯示，在通過導入GMD-靶向siRNA表達質粒獲得的所有克隆中，GMD mRNA的量減少至親代細胞的8％至50％。
實施例2使用其中導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性CHO/DG44細胞生產抗體組合物1.獲得其中導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆所產生的抗體組合物根據以下方法獲得由實施例1中得到的導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和克隆12-GMDB-5產生的抗-CCR4嵌合抗體。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將它們以15mL接種在T75粘附細胞用培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養6天後，去掉培養上清液，用10mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen製造)衝洗兩次後，加入20mL EXCELL301培養基(JRH Bioscience製造)。在5％CO2和37℃的條件下培養7天後，回收培養上清液，使用MabSelectcolumn(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-CCR4嵌合抗體。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/LKH2PO4緩衝液更換後，使用孔徑0.22mm的Millex GV(MILLIPORE製造)對從各個克隆培養上清液中純化的抗-CCR4嵌合抗體進行無菌過濾。
2.由導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆產生的抗體組合物的單糖組成分析根據已知的方法對在本實施例第1項中獲得的抗-CCR4嵌合抗體進行單糖組成分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
表1

從每個抗體的單糖組成比例計算出的未結合巖藻糖的複雜型糖鏈在全部複雜型糖鏈中的組成比例顯示於表1。在親代克隆32-05-12(用來導入GMD-靶向siRNA表達載體)產生的抗體組合物中，未結合巖藻糖的糖鏈比例為3％，而其中導入了siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5則分別為78％和79％，證明相比於親代細胞，未結合巖藻糖的糖鏈比例大為增加。
以上結果證明，宿主細胞產生的抗體中α1，6-巖藻糖的含量可以通過導入GMD-靶向siRNA來控制。
實施例3
導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性CHO/DG44細胞的無血清流加培養1.導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性CHO/DG44細胞對無血清培養基的適應根據以下方法，使導入載體前的親代克隆32-05-12、實施例1中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5對無血清培養基進行適應。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，每個克隆以5mL接種在T75粘附細胞用培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，通過胰蛋白質酶處理獲得細胞懸液，在1,000rpm下離心5分鐘回收細胞。以5×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在含有500nmol/L MTX(SIGMA製造)、6mmol/L L-穀氨醯胺(Invitrogen製造)、50μg/mL慶大黴素(Nacalai Tesque製造)和100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(SIGMA製造)的EX-CELL302培養基(JRH製造)(下文中稱為「無血清培養基」)，克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的無血清培養基中，將15mL細胞懸液接種到125mL錐形瓶(Corning製造)中。在用5％CO2向培養瓶中通氣(至少培養容器體積的4倍)並將培養瓶密封后，在90-100rpm和在35℃下進行懸浮旋轉培養。以3至4天的間隔傳代，最後，獲得了在無血清培養基中生長的克隆。之後，適應了無血清培養基的克隆32-05-12稱為「32-05-12AF」，適應了無血清培養基的12-GMDB-2和12-GMDB-5分別稱為「12-GMDB-2AF」和「12-GMDB-5AF」。
2.導入了GMD-靶向siRNA表達質粒、並適應無血清培養基的凝集素抗性CHO/DG44細胞的無血清流加培養(1)錐形瓶中的無血清流加培養根據以下方法使用本實施例第1項中對無血清培養基適應的克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF進行無血清流加培養。
使用含有500nmol/L MTX(SIGMA製造)、6mmol/L L-穀氨醯胺(Invitrogen製造)、100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(SIGMA製造)、0.1％Pluronic F-68(Invitrogen製造)和5,000mg/L D(+)-葡萄糖(Nacalai Tesque製造)的EX-CELL302培養基(JRH製造)(下文中稱為「無血清流加培養基」)進行流加培養，含有以較通常添加量更高的濃度製備的胺基酸(0.177g/L L-丙氨酸、0.593g/L L-精氨酸鹽酸鹽、0.177g/L L-天冬醯胺一水合物、0.212g/L L-天冬氨酸、0.646g/L L-胱氨酸二鹽酸鹽、0.530g/L L-穀氨酸、5.84g/L L-穀氨醯胺、0.212g/L甘氨酸、0.297g/L L-組氨酸鹽酸鹽二水合物、0.742g/L L-異亮氨酸、0.742g/L L-亮氨酸、1.031g/L L-賴氨酸鹽酸鹽、0.212g/L L-蛋氨酸、0.466g/L L-苯丙氨酸、0.283g/L L-脯氨酸、0.297g/L L-絲氨酸、0.671g/L L-蘇氨酸、0.113g/L L-色氨酸、0.735g/L L-酪氨酸二鈉二水合物和0.664g/L L-纈氨酸)、維生素(0.0918mg/L d-生物素、0.0283g/L D-泛酸鈣、0.0283g/L氯化膽鹼、0.0283g/L葉酸、0.0509g/L肌醇、0.0283g/L煙醯胺、0.0283g/L鹽酸吡哆醛、0.00283g/L核黃素、0.0283g/L鹽酸硫胺、和0.0918mg/L氰鈷胺)和0.314g/L胰島素的培養基(下文中稱為「飼養培養基(feed medium)」)作為飼養用培養基。
以3×105細胞/mL的密度將克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF懸浮在無血清流加培養基中，將每種細胞懸液40mL接種至250mL錐形瓶(Corning製造)中。在用5％CO2向培養瓶中通氣(至少為培養容器體積的4倍)並將培養瓶密封后，在90-100rpm和35℃下進行懸浮旋轉培養。在開始培養後的第3、6、9和12天，加入3.3mL飼養培養基以補充胺基酸和類似物的消耗，以5,000mg/L的終濃度加入20％(w/v)的葡萄糖溶液以調整葡萄糖濃度。在開始培養後的第0、3、6、9、12和14天，每種培養物收集2-4mL，用於第(2)至(4)項中所述的分析。另外，在開始培養後第14天完成流加培養，收集全部培養物，用於第(4)項中所述的分析。
(2)測定活細胞數目通過臺盼藍(trypan blue)染色測定在開始培養後第0、3、6、9、12和14天收集的第(1)項中培養物的活細胞數目和活力。克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF開始培養後每個時間點的活細胞數目顯示於圖5。與克隆32-05-12AF相比，克隆12-GMDB-2生長得較慢，即使在第14天仍然保持很高的活力。另外，開始培養後每個時間點克隆12-GMDB-5AF的活細胞數目與克隆32-05-12相似。因此，證明GMD-靶向siRNA的靶序列對細胞生長沒有顯著影響。
(3)測定抗體濃度根據以下方法測定第(1)項中獲得的開始培養後第0、3、6、9、12和14天培養上清液中所含抗體的濃度。
在750mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen製造)中，溶解1mL抗-人IgG(H+L)抗體(American Qualex製造)，將混合物以50μl分配至ELISA板的每個孔中。在4℃下過夜後，去掉溶液，向每孔中加入100μL含有1％BSA(牛血清白蛋白質)的PBS(下文中稱為「BSA-PBS」)，測定板在室溫下靜置大約1小時，在-20℃下儲存。在測定抗體量的過程中，使測定板在室溫下復溫，除去孔中的BSA-PBS後，向每孔中加入50μL用BSA-PBS稀釋的培養上清液。使測定板在室溫下靜置1至2小時後，用含有0.05％Tween 20TM的PBS(下文中稱為「Tween-PBS」)衝洗各孔。除去衝洗液體後，向每孔中加入50μL用BSA-PBS稀釋2000倍的羊抗人IgG(HL)-HRP(American Qualex製造)作為第二抗體。測定板在室溫下靜置1至2小時後，用Tween-PBS衝洗各孔，然後樹脂水衝洗。衝洗後，向每孔中加入50μL添加有0.1％H2O2的ABTS底物溶液
進行顯色。測定板在室溫下靜置大約15分鐘後，當適當顯色時，向每孔加入50μL5％SDS溶液終止反應。使用酶標儀以415nm處的吸收作為參比，測定490nm處的吸光度。使用純化抗體製劑標準品製作的標準曲線中S形曲線的線性區域計算每個稀釋樣品的抗體濃度。將得到的稀釋樣品抗體濃度乘以稀釋度，便可計算出每個培養上清液的抗體濃度。克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF開始培養後每個時間點培養上清液抗體濃度的測定結果顯示於圖6。在克隆32-05-12AF、12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF當中，開始培養後培養上清液中的抗體組合物濃度是相似的。因此，證明GMD-靶向siRNA序列不影響細胞的抗體產率。
(4)抗體組合物的糖鏈結構分析使用MabSelect column(Amersham Biosciences製造)根據生產廠商的說明書，從第(1)項獲得的克隆32-05-12AF的第14天無血清流加培養上清液和克隆12-GMDB-2AF、12-GMDB-5AF無血清流加培養第6、12和14天的培養上清液純化抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/L KH2PO4緩衝液換液後，將從各個克隆的培養上清液中純化的抗-CCR4嵌合抗體組合物用孔徑0.22mm的Millex GV(MTLLIPORE製造)進行無菌過濾。根據已知方法對從每個克隆適應無血清培養基的培養上清液獲得的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行單糖組成分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。從每個抗體組合物單糖組成比例計算出來的全部複雜型糖鏈當中未結合巖藻糖的糖鏈比例(下文中稱為「巖藻糖(-)％」)示於表2。
表2

在第14天當培養結束時，克隆32-05-12AF所產生抗體組合物的巖藻糖(-)％為7％，而導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2AF、12-GMDB-5AF則為81至85％。因此，證明了在無血清流加培養基中，導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆也可產生巖藻糖(-)％高於親代克隆的抗體組合物。另外，由克隆12-GMDB-2AF和12-GMDB-5AF產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％在第6、12和14天顯示的數值大致恆定。因此，證明了通過導入GMD-靶向siRNA表達質粒來抑制α1，6-巖藻糖加入到抗體組合物複雜型糖鏈上的作用在無血清流加培養中是穩定的。
實施例4使用α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)-靶向siRNA表達載體文庫篩選有效獲得凝集素抗性克隆的siRNA靶向序列並構建有效的FUT8-靶向siRNA表達載體1.構建α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)-靶向siRNA表達載體文庫(FUT8shRNAlib/pPUR)(1)獲得源於CHO細胞的α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)cDNA序列根據WO00/61739所述的方法，從由來源於中國倉鼠卵巢的CHO/DG44細胞製備的單鏈cDNA克隆編碼α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)的cDNA。
首先，根據小鼠FUT8 cDNA的核苷酸序列(GenBank Acc.No.AB025198)設計5′-未翻譯區特異性正向引物(SEQ ID NO68)和3′-未翻譯區特異性反向引物(SEQ ID NO69)。
然後，製備25μL含有1μLCHO/DG44細胞來源的單鏈cDNA的反應溶液[ExTaq緩衝液(TaKaRa製造)、0.2mmol/L dNTP、4％DMSO和0.5μmol/L上述特異性引物(SEQ ID NO68和69)]之後，使用DNA聚合酶ExTaq(TaKaRa製造)進行PCR。在94℃下加熱1分鐘後，進行30次PCR循環，一個循環組成為在94℃下反應30秒，在55℃下反應30秒，在72℃下反應2分鐘，然後在72℃下反應10分鐘。
PCR後，對反應溶液進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，回收特異擴增的片段(大約2kb)。使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen製造)根據生產廠商的說明書，將DNA片段與質粒pCR2.1連接，並將E.coli DH5α用連接反應溶液轉化。在得到的卡那黴素抗性集落當中，根據已知方法從8個克隆中分離插入cDNA的質粒DNA。
使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready反應試劑盒(Applied Biosystems製造)根據生產廠商的說明書進行反應後，使用Applied Biosystems製造的ABI PRISM 377型DNA測序儀對每個質粒中插入的cDNA的序列進行分析。通過這種方法，證實所有質粒中插入的cDNA均為編碼全長中國倉鼠FUT8 ORF的cDNA。在質粒DNA中插入的序列經測定的cDNA當中，選擇PCR產生的核苷酸沒有讀碼錯誤(readout error)的質粒DNA。下文中，該質粒稱為「CHfFUT8-pCR2.1」。以這種方式測定的中國倉鼠FUT8 cDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO1表示。
(2)製備FUT8-靶向siRNA表達載體文庫根據WO03/46186實施例13中的方法，使用第(1)項中獲得的CHfFUT8-pCR2.1構建人tRNA-val啟動子型FUT8-靶向siRNA表達載體文庫。另外，使用限制性酶BamHI的識別序列作為反義和正義DNA之間的loop序列，使用pPUR(CLONTECH製造)作為載體。下文中，製得的文庫稱為「FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B」。
對siRNA表達載體文庫FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B進行擴增，製備質粒載體。使用無菌培養皿[243mm×243mm×18mm(Nalgenunc製造)]製備含有100μg/mL氨苄青黴素的LB瓊脂培養基，每皿接種50μL FUT8shRNAlib/pPUR/DH10B甘油母液。在37℃下靜止培養過夜後，用無菌水將平皿中的大腸桿菌收集在懸液中，根據已知方法回收質粒DNA。下文中，將回收的質粒稱為「FUT8shRNAlib/pPUR」。
2.獲得導入了α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)-靶向siRNA表達文庫的凝集素抗性克隆將本實施例第1項中獲得的FUT8-靶向siRNA表達文庫質粒FUT8shRNAlib/pPUR導入克隆32-05-12，如下分離對特異性識別α1，6-巖藻糖的凝集素LCA有抗性的克隆。
將本實施例第1項中獲得的質粒FUT8shRNAlib/pPUR用限制性酶FspI(New England Biolabs製造)消化進行線性化，通過電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]將10μg線性化的質粒FUT8shRNAlib/pPUR導入1.6×106細胞的克隆32-05-12後，將細胞懸浮在基礎培養基[含有10％胎牛血清(Invitrogen製造)、50μg/mL慶大黴素(NacalaiTesque製造)和500nmol/L MTX(SIGMA製造)的IMDM(Invitrogen製造)]中，以8mL接種在3個粘附細胞培養用10cm培養皿中(Falcon製造)。另外，在相同條件下轉染10次，細胞培養在共計30個10cm培養皿中。在5％CO2孵箱中在37℃下培養24小時後，用8mL含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基更換培養基。在5％CO2孵箱中在37℃下培養7天後，用8mL含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR製造)的基礎培養基更換培養基，繼續培養6至8天，分離凝集素抗性克隆。
3.分析α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)-靶向siRNA表達質粒的靶序列(1)在凝集素抗性克隆的基因組DNA中分離siRNA表達盒如下從本實施例第2項中獲得的凝集素抗性克隆的基因組DNA中分離siRNA表達盒(圖7)。
根據已知方法[Gene Targeting，Oxford University Press(1993)]，將凝集素抗性克隆收集在粘附細胞用平底培養皿(Greiner製造)中，在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中在5％CO2孵箱中在37℃下培養1周。
培養後，將皿中的每個克隆用胰蛋白質酶處理，並分配至2個粘附細胞用平底96孔板(Greiner製造)上。一塊板用作複製板，另一塊作為母板凍存。複製板在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中在5％CO2孵箱中在37℃下培養1周後，根據已知方法從每個克隆中製備基因組DNA[Analytical Biochemistry，201，331(1992)]，並各自在30μLTE-RNase緩衝液(pH8.0)[10mmol/LTris-HCl、1mmol/L EDTA和200μg/mL RNase A]中溶解過夜，然後用無菌水稀釋為0.05μg/μL。
另外，為FUT8-靶向siRNA表達質粒FUT8shRNAlib/pPUR分別設計與siRNA表達盒tRNA-val啟動子區上遊結合的正向引物(SEQ IDNO70)和與siRNA表達盒終止子序列下遊結合的反向引物(SEQ IDNO71)。
使用從每個克隆製備的基因組DNA作為模板，採用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO製造)進行聚合酶鏈式反應(PCR)。為每個克隆製備含有5μL上述基因組DNA溶液的反應溶液(50μL)[KODBuffer1(TOYOBO製造)、0.2mmol/L dNTP、1mmol/L MgCl2和0.4umol/L上述引物(SEQ ID NO70和71)]，在94℃下加熱1分鐘後，進行25次PCR循環，一個循環組成為在97℃下反應10秒，在68℃下反應30秒。PCR後，反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收含有siRNA表達盒區的擴增片段(大約300 bp)。
另外，將2μg質粒pPUR(CLONTECH製造)用限制性酶PvuII(New England Biolabs製造)在37℃下消化過夜。消化反應後，反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收被消化的DNA片段(大約4.3 kb)。
使用Ligation High(TOYOBO製造)對以上獲得的PCR-擴增片段(大約300 bp)和來自質粒pPUR的PvuII片段進行連接。將Ecoli DH5α用反應溶液轉化。根據已知的方法從若干獲得的氨苄青黴素抗性集落中分離質粒DNA。
(2)分析在siRNA表達單位中所含的靶序列對第(1)項中獲得的質粒的siRNA表達盒中包含的FUT8-靶向序列進行分析。
首先，在用BigDye Terminator v3.0 Cycle測序試劑盒(AppliedBiosystems製造)根據生產廠商的說明書進行反應後，使用ABI PRISM377型DNA測序儀(Applied Biosystems製造)對插入到第(1)項中獲得的每個質粒DNA中的siRNA表達盒的核苷酸序列進行分析。在159個克隆的測定核苷酸序列中，靶序列對FUT8的同源性與CHO細胞FUT8 cDNA的序列(SEQ ID NO1)進行比較，與SEQ ID NO1對應的每條靶序列的起點和終點顯示於表3中。
表3




在159個克隆的靶序列當中，與代表性靶區域對應的RNA序列由SEQ ID NO14至23所示。
(3)搜索與siRNA表達單位所含靶序列同源的小鼠、大鼠和人序列在小鼠、大鼠和人FUT8序列中如下搜索第(2)項中獲得的SEQID NO14至23所示的與靶序列對應的序列。
SEQ ID NO2、3和4分別顯示小鼠、大鼠和人FUT8序列。在這些序列當中，搜索第(2)項中獲得的SEQ ID NO14至23所示的與靶序列對應的序列。在該項搜索中，排除完全匹配的序列。
以下顯示了所選序列的各個序列號。與SEQ ID NO14對應的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO85表示；與SEQ ID NO14對應的人FUT8序列由SEQ ID NO86表示；與SEQ ID NO15對應的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO24表示；與SEQ ID NO15對應的人FUT8序列由SEQID NO25表示；與SEQ ID NO15對應的大鼠FUT8序列由SEQ IDNO87表示；與SEQ ID NO16對應的人FUT8序列由SEQ ID NO26表示；與SEQ ID NO17對應的人、小鼠和大鼠FUT8序列由SEQ IDNO27表示；與SEQ ID NO18對應的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO28表示；與SEQ ID NO18對應的人FUT8序列由SEQ ID NO29表示；與SEQ ID NO18對應的大鼠FUT8序列由SEQ ID NO30表示；與SEQID NO19對應的小鼠和大鼠FUT8序列由SEQ ID NO31表示；與SEQID NO19對應的人FUT8序列由SEQ ID NO32表示；與SEQ ID NO20對應的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO33表示；與SEQ ID NO20對應的人FUT8序列由SEQ ID NO34表示；與SEQ ID NO21對應的小鼠FUT8序列由SEQ ID NO88表示；與SEQ ID NO21對應的人FUT8序列由SEQ ID NO89表示；與SEQ ID NO22對應的大鼠FUT8序列由SEQ IDNO35表示。
4.構建高效的α1，6-巖藻糖基轉移酶(FUT8)-靶向siRNA表達載體在本實施例第3項中獲得的FUT8-靶向siRNA的靶區中，根據以下方法構建靶向SEQ ID NO15或16中所含序列的siRNA表達載體(圖7、8和9)在本實施例第3(1)項中獲得的含有siRNA表達盒的質粒當中，選擇如下質粒含有SEQ ID NO72所示的DNA序列(該序列是與表1所示的克隆No.31相同的包含在SEQ ID NO15中的靶序列)作為正義DNA、和與SEQ ID NO72所示DNA序列互補的核苷酸序列作為反義DNA的質粒(下文中稱為「FUT8shRNA/lib2B/pPUR」)；和含有與表3所示的克隆No.72相同的與SEQ ID NO16對應的DNA序列作為正義DNA、與SEQ ID NO16對應的DNA序列互補的核苷酸序列作為反義DNA的質粒(下文中稱為「FUT8shRNA/lib3/pPUR」)(圖7)。
首先，將1μg FUT8shRNA/lib2B/pPUR或FUT8shRNA/lib3/pPUR質粒溶解在30μL用於EcoRI的NEBuffer(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶EcoRI和XhoI(New England Biolabs製造)在37℃下消化3小時之後，對反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收含有人tRNA-val啟動子-短髮夾型RNA-終止子序列表達盒的DNA片段(大約250 bp)。
另外，將1μg質粒pBluescript II KS(+)溶解在30μL用於EcoRI的NEBuffer(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶EcoRI和XhoI(New England Biolabs製造)在37℃下消化2小時。反應後，向反應溶液中加入13μL無菌水、5μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液和1單位鹼性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應，對反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收來自質粒pBluescript II KS(+)的EcoRI-XhoI片段(大約2.9 Kb)。
然後，將8μL上述EcoRI-XhoI DNA片段(大約250 bp)、2μL來自質粒pBluescript II KS(+)的EcoRI-XhoI片段(大約2.9 Kb)和10μLLigation High(TOYOBO製造)混合，在16℃下反應2小時。將E.coliDH5α(Invitrogen製造)用反應溶液轉化，使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒。之後，在上述質粒中，分別將插入來自FT8libB/pPUR和FT8lib3/pPUR的DNA片段(大約250bp)的質粒稱為「FT8libB/pBS」和「FT8lib3/pBS」。
將1μg質粒FT8libB/pBS或FT8lib3/pBS溶解在20μL NEBuffer 4(New England Biolabs製造)中，並用10單位限制性酶SmaI(NewEngland Biolabs製造)在25℃下消化5小時後，在65℃下加熱20分鐘，使限制性酶SmaI滅活。向反應溶液中加入14.6μL無菌水、4μL10×NEBuffer 2(New England Biolabs製造)、0.4μL 100×BSA(NewEngland Biolabs製造)和10單位限制性酶XhoI(New England Biolabs製造)，在37℃下消化過夜，然後對反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收含有人tRNA-val啟動子-短髮夾型RNA-終止子序列表達盒的DNA片段(大約250bp)。
另外，將1μg質粒pAGE249溶解在30μLNEBuffer 1(New EnglandBiolabs製造)中，並用10單位限制性酶NaeI和XhoI(New EnglandBiolabs製造)在37℃下消化6小時。消化反應後，向反應溶液中加入22μL無菌水、6μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液和1單位鹼性磷酸酶E.coliC75(TAKARABIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARA BIO製造)回收來自質粒pAGE249的NaeI-XhoI片段(大約4.4 Kb)。另外，pAGE249是pAGE248的衍生物[J.Biol.Chem.，269，14730(1994)]，即從中用SphI限制性酶消化去掉含有二氫葉酸還原酶(dhfr)基因表達單元的2.7Kb片段的pAGE248載體。
然後，將10μL上述DNA片段(大約250bp)、5μL來自質粒的NaeI-XhoI片段(大約4.4Kb)和15μL Ligation High(TOYOBO製造)混合，在16℃下反應過夜。將E.coli DH5α(Invitrogen製造)用反應溶液轉化，使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒DNA。使用377型DNA測序儀(Perkin Elmer製造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle測序試劑盒(Applied Biosystems製造)，根據生產廠商的說明書測定各個質粒中插入的DNA的核苷酸序列。使用pAGE249-seq FW(SEQ ID NO73)和pAGE249-seq RV(SEQ ID NO74)作為測序引物，確認插入的DNA序列與對應於EcoRI-XhoI片段的序列(其為質粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR或FUT8shRNA/lib3/pPUR中所含的人tRNA-val啟動子-短髮夾型RNA表達單位)一致。之後，在上述質粒中，分別將其中插入了來自質粒FUT8shRNA/lib2B/pPUR和FUT8shRNA/lib3/pPUR的DNA片段(大約250bp)的質粒稱為「FT8libB/pAGE」和「FT8lib3/pAGE」。
實施例5在L-巖藻糖的存在下通過將FUT8-靶向siRNA表達質粒共同導入已導入GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆製備凝集素抗性CHO/DG44細胞1.在L-巖藻糖的存在下通過將FUT8-靶向siRNA表達質粒導入已導入GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆獲得和培養凝集素抗性克隆(1)在L-巖藻糖的存在下通過導入FUT8-靶向siRNA表達載體獲得凝集素抗性克隆在加有L-巖藻糖的培養條件下，將FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE、實施例2構建的FUT8-靶向siRNA表達載體導入實施例1中獲得的已導入GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆12-GMDB-2或12-GMDB-5中，獲得凝集素抗性克隆。
通過與實施例1中2(1)相同的方法將質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE轉染到克隆12-GMDB-2或12-GMDB-5中。
轉染之後，將細胞懸液懸浮在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，並接種在4個粘附細胞用10cm培養皿中。在37℃和5％CO2的條件下培養24小時後，去掉培養上清液，向其中加入含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基，然後繼續培養8天。隨後，從其中一皿中去掉培養上清液，向其中加入含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基，然後繼續培養6至8天，對出現的潮黴素抗性集落進行計數。另外，從其餘的皿中也去掉培養上清液，向其中加入含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)、3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)、100μmol L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR製造)的基礎培養基，接著繼續培養9天，在100μmol/L L-巖藻糖的存在下獲得凝集素抗性克隆，即共同導入FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆。
(2)凝集素抗性克隆的擴大培養根據以下方法對第(1)項中通過共同導入FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體獲得的凝集素抗性克隆進行擴大培養。
首先，對每個皿中出現的集落數進行計數。然後，將凝激素抗性集落刮下，在立體顯微鏡的觀察下用pipetteman(GILSON製造)吸取，收集在粘附細胞用U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS製造)中。胰蛋白質酶處理後，將每個克隆接種在粘附細胞用平底96孔板(Greiner製造)中，在5％CO2和37℃的條件下在含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中培養過夜。培養後去掉培養上清液，將細胞在含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)、3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)、100μmol L-巖藻糖(NacalaiTesque製造)和0.5mg/mL LCA(VECTOR製造)的基礎培養基中繼續培養6天。培養後，上述皿中的每個克隆在含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中進行擴大培養。下文中，用於擴大培養的克隆當中，通過將FT8libB/pAGE導入克隆12-GMDB-2獲得的凝集素抗性克隆分別稱為「12-GB2/FB-1」、「12-GB2/FB-2」、「12-GB2/FB-3」、「12-GB2/FB-4」和「12-GB2/FB-5」；將FT8lib3/pAGE導入克隆12-GMDB-2獲得的克隆分別稱為「12-GB2/F3-1」、「12-GB2/F3-2」、「12-GB2/F3-3」、「12-GB2/F3-4」和「12-GB2/F3-5」；將FT8libB/pAGE導入克隆12-GMDB-5獲得的克隆分別稱為「12-GB5/FB-1」、「12-GB5/FB-2」、「12-GB5/FB-3」、「12-GB5/FB-4」和「12-GB5/FB-5」；將FT8lib3/pAGE導入克隆12-GMDB-5獲得的克隆分別稱為「12-GB5/F3-1」、「12-GB5/F3-2」、「12-GB5/F3-3」、「12-GB5/F3-4」和「12-GB5/F3-5」。另外，克隆12-GB5/FB-1和12-GB5/F3-2已經於2004年7月1日保藏於專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，獨立行政法人產業技術綜合研究所(National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(Tsukuba Central 6，1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，編號分別為FERM BP-10049和FERMBP-10050。
2.測定在L-巖藻糖的存在下導入了GMD-靶向表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆中GMD mRNA和FUT8 mRNA的量(1)製備全RNA根據以下方法從導入載體之前的親代克隆32-05-12、實施例1中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及本實施例第1項中獲得的共同導入了GMD-靶向表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆製備全RNA。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將導入了FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆懸浮在含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，每種4mL接種在粘附細胞用6cm-培養皿(Falcon製造)中。將細胞在5％CO2和37℃的條件下培養3天，通過胰蛋白質酶處理以及在1,000rpm 4℃下離心5分鐘回收每種細胞懸液。將回收的細胞懸浮在Dulbecco′s PBS緩衝液(Invitrogen製造)後，再次通過在1,000rpm 4℃下離心5分鐘對細胞進行回收，使用RNeasy(QIAGEN製造)提取全RNA。根據生產廠商的說明書實施該方法，將製備的全RNA溶解在40μL無菌水中。
(2)合成單鏈cDNA採用SUPERSCRIPTTMPreamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen製造)根據生產廠商的說明書，通過在20uL反應系統中與寡聚(dT)引物進行逆轉錄反應，從3μg第(1)項中獲得的每種全RNA合成單鏈cDNA。隨後，將反應溶液用RNase處理，並將最終反應體積調整至40μL。此外，將每種反應溶液用無菌水稀釋50倍，用於測定下述的基因轉錄量。
(3)通過SYBR-PCR測定GMD基因的轉錄量如下所述對從GMD基因和β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量進行定量。另外，使用WO02/31140實施例15中描述的含有來源於CHO細胞的質粒pAGE249GMD(各稀釋成濃度為0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL)作為GMD測定的內參照，使用WO02/31140實施例9中描述的β-肌動蛋白質標準質粒(各稀釋成濃度為1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作為β-肌動蛋白質測定的內參照。而且，分別使用SEQ ID NO64和65所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增GMD，分別使用SEQ ID NO66和67所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增β-肌動蛋白質。
然後，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO製造)製備20μL含有5μL第(2)項中製備的單鏈cDNA溶液或每種濃度內參照質粒溶液的反應溶液[R-PCR緩衝液(TAKARA BIO製造)、2.5mmol/L用於R-PCR的Mg2+溶液(TAKARABIO製造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARABIO製造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀釋SYBR GreenI、1單位TaKaRaEx Taq R-PCR]。將製得的反應溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon製造)的每個孔中，並將板用Plate Sealer(Edge Biosystems製造)密封。使用ABI PRISM 7700型測序檢測系統進行PCR和分析，根據生產廠商的說明書測定GMD mRNA和β-肌動蛋白質mRNA的量。
根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將GMD mRNA和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。另外，假設從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量在這些克隆之間都是相同的，對GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量進行計算和比較，結果示於圖10。在共同導入FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體的所有克隆中，與親代克隆32-05-12相比，GMD mRNA的量減少至約10％。
(4)通過SYBR-PCR測定FUT8的基因轉錄量如下所述測定從FUT8基因和β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。另外，使用WO02/31140實施例9中所述的FUT8標準質粒(各稀釋成濃度為0.0512fg/μL、0.256fg/μL、1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL和160fg/μL)作為FUT8測定的內參照；使用WO02/31140實施例9中所述的β-肌動蛋白質標準質粒(各稀釋成濃度為1.28fg/μL、6.4fg/μL、32fg/μL、160fg/μL、800fg/μL和4,000fg/μL)作為β-肌動蛋白質測定的內參照。而且，分別使用SEQ ID NO75和76所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增FUT8，分別使用SEQ ID NO66和67所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增β-肌動蛋白質。
然後，使用For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version(TAKARA BIO製造)製備20μL含有5μL第(2)項中製備的單鏈cDNA溶液或每種濃度的內參照質粒溶液的反應溶液[R-PCR緩衝液(TAKARA BIO製造)、2.5mmol/L用於R-PCR的Mg2+溶液(TAKARABIO製造)、0.3mmol/L dNTP混合物(TAKARA BIO製造)、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、2×10-5稀釋SYBR GreenI、1單位TaKaRaEx Taq R-PCR]。將製得的反應溶液分配至96孔聚丙烯PCR板(Falcon製造)的每個孔中，並將板用Plate Sealer(Edge Biosystems製造)密封。使用ABI PRISM 7700型測序檢測系統進行PCR和分析，根據生產廠商的說明書測定GMD mRNA和β-肌動蛋白質mRNA的量。
根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將FUT8 mRNA和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。另外，假設從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量在這些克隆之間都是相同的，對FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量進行計算和比較，結果示於圖11。在共同導入FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體得到的所有克隆中，與親代克隆32-05-12相比，FUT8 mRNA的量減少至約10％。
實施例6使用導入了GMD-靶向siRNA表達質粒和FUT8-靶向siRNA表達質粒的CHO/DG44細胞製造抗體組合物1.在不存在L-巖藻糖的條件下培養獲得抗體組合物根據以下方法，獲得由導入載體之前的親代克隆32-05-12、實施例1中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及實施例3中獲得的共同導入了FUT8-靶向siRNA表達載體和GMD-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4所產生的抗-CCR4嵌合抗體組合物。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在含有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4懸浮在含有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，並將其以15mL接種在粘附細胞用T75培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養6天後，去掉培養上清液，用10mL Dulbecco′s PBS(Invitrogen製造)衝洗後，加入20mL EXCELL301培養基(JRH Bioscience製造)。在5％CO2和37℃的條件下培養7天後，回收培養上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)更換為10mmol/L KH2PO4緩衝液後，將從各種克隆的培養上清液純化的抗-CCR4嵌合抗體組合物通過孔徑0.22μm的Millex GV(MTLLIPORE製造)進行無菌過濾。
2.在L-巖藻糖的存在下培養獲得抗體組合物根據下面的方法獲得由導入載體之前的親代克隆32-05-12、實施例1中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5、以及實施例3中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達質粒和FUT8-靶向siRNA表達質粒的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4在存在L-巖藻糖的培養條件下所產生的抗-CCR4嵌合抗體組合物將克隆32-05-12在基礎培養基中培養，以3×105細胞/mL的密度，將克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5懸浮在添加有12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4懸浮在添加有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，將其以15mL接種在粘附細胞用T75培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，去掉培養上清液，用添加有500μmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)的基礎培養基為克隆32-05-12換液，用添加有500μmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)和12μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基為克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5換液，用添加有500μmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)、400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基為克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4換液。在5％CO2和37℃的條件下繼續培養3天後，去掉培養上清液，用10mLDulbecco′s PBS(Invitrogen製造)衝洗後，加入20mL添加有500μmol/LL-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)的EXCELL301培養基(JRH Bioscience製造)。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，向每個培養瓶中加入1mL 10mmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)，然後繼續培養4天。培養後，回收培養上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)更換為10mmol/L KH2PO4緩衝液後，通過孔徑0.22μm的Millex GV(MTLLIPORE製造)對從各個克隆的培養上清液純化的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行無菌過濾。
3.抗體組合物的單糖組成分析根據已知方法對本實施例第1和2項中獲得的每種抗-CCR4嵌合抗體組合物進行單糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
表4每個克隆產生的抗-CCR4-嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％


從每種抗體組合物的單糖成分比例計算的糖鏈中複雜型N-糖苷-連接糖鏈中還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖未結合巖藻糖的抗體比例顯示在表4中。
在不存在L-巖藻糖的條件下培養時，用於導入GMD-靶向siRNA表達載體的親代克隆32-05-12所產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為3％，而導入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5則分別為78％和79％，這證明與親代細胞相比，其抗體組合物中的巖藻糖(-)％顯著增加。另外，共同導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4產生的抗體組合物中的巖藻糖(-)％為91至98％，進一步證明與單獨導入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆相比，其抗體組合物中巖藻糖(-)％進一步增加。
另外，在不存在L-巖藻糖的條件下培養時，用於導入GMD-靶向siRNA表達載體的親代克隆32-05-12所產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為6％，而導入了GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GMDB-2和12-GMDB-5則分別為6％和8％。另一方面，共同導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4產生的抗體組合物中巖藻糖(-)％為66至81％，證明與單獨導入GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆相比，其抗體組合物中巖藻糖(-)％顯著增加。
如上所述，在存在或不存在L-巖藻糖的條件下培養時，共同導入了GMD-靶向和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％均高於單獨導入GMD-靶向siRNA的凝集素抗性克隆高，因此，無論L-巖藻糖存在與否，共同導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA來抑制α1，6-巖藻糖加入至細胞產生的抗體組合物的複雜型糖鏈上的作用高於單獨導入GMD-靶向siRNA。
此外，共同導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的凝集素抗性克隆產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％在不存在L-巖藻糖的條件下培養時要高於在存在L-巖藻糖的條件下培養(此時升高GMD-靶向siRNA的巖藻糖(-)％的作用喪失)，顯示共同導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA對α1，6-巖藻糖加入至細胞產生的抗體組合物複雜型糖鏈上的抑制作用要高於單獨導入GMD-靶向siRNA。
實施例7導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的CHO/DG44細胞的無血清流加培養1.導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的CHO/DG44細胞對無血清培養基的適應根據下面的方法使導入載體之前的親代克隆32-05-12、實施例3中獲得的導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4對無血清培養基進行適應。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4懸浮在添加有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的基礎培養基中，每種克隆以15mL接種在粘附細胞用T75培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，通過胰蛋白質酶處理使細胞懸浮，在1,000rpm下離心5分鐘回收細胞。以5×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在含有500nmol/L MTX(SIGMA製造)、6mmol/L L-穀氨醯胺(Invitrogen製造)、50μg/mL慶大黴素(Nacalai Tesque製造)和100nmol/L 3，3，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(SIGMA製造)的EX-CELL302培養基(JRH製造)(下文中稱為「無血清培養基」)中，將克隆12-GB2/FB-1、12-GB2/FB-3、12-GB2/F3-3、12-GB2/F3-5、12-GB5/FB-1、12-GB5/FB-2、12-GB5/F3-2和12-GB5/F3-4懸浮在添加有400μg/mL潮黴素(WAKO製造)和3μg/mL嘌呤黴素(SIGMA製造)的無血清培養基中，將15mL細胞懸液接種在125mL錐形瓶(Corning製造)中。在用5％CO2向培養瓶中通氣(至少4倍於培養容器體積)並將培養瓶密封后，在90-100rpm和35℃下進行懸浮旋轉培養。以3至4天的間隔傳代，最後，獲得了可以在無血清培養基中生長的克隆。下文中，分別將適應無血清培養基的克隆32-05-12稱為「32-05-12AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB2/FB-1稱為「克隆Wi2B-1AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB2/FB-3稱為「Wi2B-3AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB2/F3-3稱為「Wi23-3AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB2/F3-5稱為「Wi23-5AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB5/FB-1稱為「Wi5B-1AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB5/FB-2稱為「Wi5B-2AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB5/F3-2稱為「Wi53-2AF」；適應無血清培養基的克隆12-GB5/F3-4稱為「Wi53-4AF」。
2.使用導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體、並適應無血清培養基的CHO/DG44細胞進行無血清流加培養根據下面的方法使用本實施例第1項中的適應無血清培養基的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF進行無血清流加培養使用無血清流加培養基和飼養培養基(feed medium)進行流加培養。
將克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1 AF以3×105細胞/mL的密度懸浮在無血清流加培養基中，將40mL每種細胞懸液接種在250mL錐形瓶(Corning製造)中。在用5％CO2向培養瓶中通氣(至少4倍於培養容器體積)並將培養瓶密封后，在90-100rpm和在35℃下進行懸浮旋轉培養。在開始培養後的第3、6、9和12天，加入3.3mL飼養培養基以補充胺基酸和類似物的消耗，以5,000mg/L的終濃度加入20％(w/v)葡萄糖溶液以調節葡萄糖濃度。在開始培養後的第0、3、6、9、12和14天，每種培養物收集2-4mL，通過臺盼藍染色測定活細胞數目和活力，並通過本實施例第3(1)項中所述的ELISA法測定每種培養上清液中所含抗體的濃度。在開始培養克隆32-05-12AF和Wi23-5AF後，各個時間點的活細胞數目和培養上清液中抗體組合物的濃度分別顯示於圖12和13。開始培養後每個時間點的活細胞數目和培養上清液中抗體組合物的濃度在克隆32-05-12AF和Wi23-5AF之間是相似的。因此，證明GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的靶序列對細胞的生長和抗體的產生沒有顯著影響。
3.使用與可溶性人FcγRIIIa的結合活性作為標誌物測定糖鏈中巖藻糖的1-位未與還原末端N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接的抗體使用WO03/85119實施例10中所述的結合可溶性人FcyRIIIa(下文中稱為「shFcyRIIIa」)的活性作為標誌物，根據下面的方法對本實施例第2項中獲得的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF的無血清流加培養上清液中所含的抗-CCR4嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％進行測定。
(1)通過ELISA測定抗體濃度以與實施例3第2(3)項相同的方式測定培養上清液中的抗體濃度。
使用以純化抗體製劑標準品製作的標準曲線S形曲線的線性區域，對每種稀釋樣品的抗體濃度進行計算，將獲得的稀釋樣品抗體濃度乘以稀釋度，計算每種培養上清液的抗體濃度。
(2)製備不同巖藻糖(-)％的標準品使用WO03/85119實施例4中所述的抗-CCR4嵌合抗體、來源於YB2/0細胞的KM2760-1和來源於CHO/DG44細胞的KM3060製備不同巖藻糖(-)％的標準品。通過實施例4第3項中所述的單糖成分分析對共計11個標準樣品(包括KM2760-1、KM3060、和將KM2760-1和KM3060混合而製備的9個標準樣品)進行巖藻糖(-)％測定；KM2760-1為90％；KM3060為10％；製備的9個標準製劑樣品分別為82％、74％、66％、58％、50％、42％、34％、26％和18％。
(3)評價抗體與shFcyRIIIa的結合活性以與WO03/85119實施例4第2項中所述的方法相同的方式，製備具有SEQ ID NO77所示胺基酸序列、並與抗-CCR4嵌合抗體發生反應的人CCR4細胞外區肽與BSA的共軛物。
將製得的濃度1μg/mL的人CCR4細胞外區肽與BSA的共軛物以50μL/孔分配至96孔ELISA板(Greiner製造)，將混合物放置4℃過夜進行吸附。用PBS衝洗後，加入100μL/孔BSA-PBS，在室溫下反應1小時，以封閉剩餘的活性基團。每孔用Tween-PBS衝洗後，以50μL/孔加入用BSA-PBS稀釋的抗-CCR4嵌合抗體樣品，根據第(1)項中描述的ELISA測定的抗體濃度為2.5μg/mL，在室溫下反應1小時。每孔用Tween-PBS衝洗後，向其中以50μL/孔加入用BSA-PBS稀釋為5μg/mL的shFcyRIIIa溶液，在室溫下反應1小時。每孔用Tween-PBS衝洗後，以50μL/孔加入用BSA-PBS製備的濃度0.1μg/mL的HRP-標記小鼠抗體Penta-His HRP共軛物(QIAGEN)，混合物在室溫下反應1小時。用Tween-PBS衝洗後，以50μL/孔加入ABTS底物溶液，通過與第(2)項中的方法相似的方式顯影后，使用酶標儀以415nm處的吸光度作為參比，測定490nm的吸光度。
第(2)項中製備的巖藻糖(-)％已知的每種抗-CCR4嵌合抗體標準製劑與shFcγRIIIa的結合活性顯示於圖14。結合shFcγRIIIa的活性與巖藻糖(-)％成比例增加，基於此獲得標準曲線。另外，在測定中，製作各個96孔ELISA板的標準曲線。
使用標準曲線，從490nm處的吸光度可以獲得培養上清液中包含的抗-CCR4嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％，上述吸光度顯示的是本實施例第2項中獲得的無血清流加培養上清液中所含的各種抗-CCR4嵌合抗體組合物與shFcyRIIIa的結合活性。克隆32-05-12AF和Wi23-5AF的結果顯示於圖15。
32-05-12AF的培養上清液中所含的抗體組合物顯示出的與培養物中shFcγRIIIa的結合活性很低，其巖藻糖(-)％大約為10％。另外，克隆Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF培養上清液中所含抗體組合物顯示出的與培養物中shFcγRIIIa的結合活性很高，其巖藻糖(-)％為75至90％或更高。因此，證明GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA的靶序列可以在不影響細胞生長和抗體產生的情況下穩定地產生巖藻糖(-)％很高的抗體組合物。
4.無血清流加培養結束時所產生抗體組合物的糖鏈結構分析(1)在無血清流加培養完成時獲得純化抗體使用MabSelect柱(Amersham Biosciences製造)根據生產廠商的說明書，從本實施例第2項中獲得的克隆32-05-12AF、Wi23-3AF、Wi23-5AF、和Wi5B-1AF無血清流加培養第14天的培養上清液中純化每種抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/L KH2PO4緩衝液換液後，使用孔徑0.22μm的Millex GV(MILLIPORE製造)對每種純化的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行無菌過濾。
(2)抗體組合物單糖成分分析根據已知方法對從第(1)項中的適應無血清培養基的克隆的培養上清液獲得的每種抗-CCR4嵌合抗體組合物進行單糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
從每種抗體組合物單糖成分比例計算出巖藻糖(-)％顯示於表5。
表5每種克隆產生的抗-CCR4-嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％

克隆32-05-12AF產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為7％，而共同導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆Wi23-3AF、Wi23-5AF和Wi5B-1AF為大約80至90％，與親代克隆的比較證明，即使在培養結束時，共同導入了GMD-靶向siRNA表達載體和FUT8-靶向siRNA表達載體的凝集素抗性克隆中仍然保持著抑制α1，6-巖藻糖加入至抗體組合物複雜型糖鏈上的作用。
實施例8
使用導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的CHO/DG44細胞產生抗體組合物1.構建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體(1)構建人U6啟動子下遊中的GMD-靶向siRNA表達單位根據下面的方法，使用實施例1第1項中構建的pPUR/GMDshB構建人U6啟動子下遊的GMD-靶向siRNA表達單位(圖16)首先，設計具有XhoI限制性酶的識別序列的PUR-FW-XhoI正向引物(SEQ IDNO78)(其與pPUR/GMDshB的人U6啟動子序列上遊連接)、和PUR-RV-XhoI反向引物(SEQ ID NO79)(其與siRNA表達盒的終止序列下遊連接)。
以pPUR/GMDshB為模板，使用DNA聚合酶KOD聚合酶(TOYOBO製造)進行PCR。然後，製備20μL含有10ng質粒pPUR/GMDshB的反應溶液[KOD buffer 1(TOYOBO製造)、0.2mmol/LdNTP、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L上述引物(SEQ ID NO78和79)和1U KOD聚合酶]，在98℃下加熱1分鐘後，進行25個PCR循環，一個循環組成為98℃下反應15秒、65℃下反應5秒，74℃下反應30秒。PCR後，反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收人U6啟動子下遊中含有GMD-靶向siRNA表達盒的擴增片段(大約600bp)。
使用Ligation High(TOYOBO製造)將上述PCR-擴增片段(大約使用600bp)與pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen製造)連接。將E.coliDH5α用反應溶液轉化。使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的卡那黴素抗性克隆中獲得質粒DNA。下文中，該質粒稱為「pCR/GMDshB」。
(2)構建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體根據下面的方法，使用第(1)項中構建的質粒pCR/GMDshB和實施例4第4項中構建的質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE構建GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體(圖17)。
首先，將質粒pCR/GMDshB溶解在40μL含有100μg/mL BSA(NewEngland Biolabs製造)的NEBuffer 2(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶XhoI(New England Biolabs製造)在37℃下消化過夜。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHEP(TAKARA BIO製造)回收在人U6啟動子下遊含有GMD-靶向siRNA表達盒的DNA片段(大約600bp)。
另外，將1μg質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE溶解在40μL含有100μg/mL BSA(New England Biolabs製造)的NEBuffer 2(NewEngland Biolabs製造)中，用10單位限制性酶XhoI(New England Biolabs製造)在37℃下消化過夜。反應後，向20μL反應溶液中加入15μL無菌水、4μL 10×鹼性磷酸酶緩衝液和1單位鹼性磷酸酶E.coli C75(TAKARA BIO製造)，在37℃下進行1小時脫磷酸化反應。反應溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用RECOCHTP(TAKARABIO製造)回收來自質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE的XhoI片段(大約4.7kb)。
將上面獲得的5μL在人U6啟動子下遊含有GMD-靶向siRNA表達盒的DNA片段(大約600bp)和5μL來自質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE的XhoI片段(大約4.7kb)與10μL Ligation High(TOYOBO製造)混合後，使混合物在16℃下反應過夜。將E.coli DH5α(TOYOBO製造)用反應溶液轉化，使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(Qiagen製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒DNA。使用377型DNA測序儀(Perkin Elmer製造)和BigDye Terminator v3.0Cycle測序試劑盒(Applied Biosystems製造)，根據生產廠商的說明書確認每種質粒的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO61)、pPUR PvuII-seq-R(SEQ ID NO62)、hu6pTsp45I/seq-F(SEQ ID NO63)、pAGE249-seqFW(SEQ ID NO73)和pAGE249-seqRV(SEQ ID NO74)作為序列分析引物。出於序列分析的結果，選擇siRNA表達盒正確、且人U6啟動子下遊的GMD-靶向siRNA表達盒和人tRNA-val啟動子下遊的FUT8-靶向siRNA表達盒方向相同的克隆。下文中，將在人hU6啟動子下遊插入GMD-靶向siRNA表達盒的質粒FT8libB/pAGE和FT8lib3/pAGE分別稱為「FT8libB_GMDB/pAGE」和「FT8lib3_GMDB/pAGE」。
2.通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得並培養凝集素抗性克隆CHO/DG44(1)通過導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得凝集素抗性克隆CHO/DG44根據以下方法將本實施例第1項中構建的GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE導入克隆32-05-12，獲得凝集素抗性克隆。
以與實施例1第2(1)項相同的方式將質粒FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE轉染到克隆32-05-12中。
轉染後，將細胞懸液懸浮在基礎培養基中，並接種在10個粘附細胞培養用10cm培養皿(Falcon製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養24小時後，去掉培養上清液，加入含有500μg/mL潮黴素(WAKO製造)的基礎培養基(下文中稱為「Hyg500-IMDM培養基」)，然後繼續培養8天，對出現的潮黴素抗性集落進行計數。而且，從一些培養皿中去掉培養上清液，加入LCA-IMDM培養基[含有5％胎牛血清(Invitrogen製造)、50μg/mL慶大黴素(Nacalai Tesque製造)、500nmol/L MTX(SIGMA製造)、1mmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)和500μg/mL LCA(VECTOR製造)的IMDM培養基(Invitrogen製造)]，然後繼續培養7天。結果，通過導入質粒FT8libB_GMDB/pAGE或FT8lib3_GMDB/pAGE，凝集素抗性克隆的獲得率很高。
(2)凝集素抗性克隆的擴大培養根據下面的方法對在第(1)項中獲得的導入了GMD-靶向和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆進行擴大培養。
首先，對每個皿中出現的集落數目進行計數。然後將凝激素抗性集落刮下，在立體顯微鏡的觀察下用pipetteman(GILSON製造)吸取，並收集在粘附細胞用U形底96孔板(ASAHI TECHNOGLASS製造)中。進行胰蛋白質酶處理後，將每個克隆接種在粘附細胞用平底96孔板(Greiner製造)中，在5％CO2和37℃的條件下在LCA-IMDM培養基中培養過夜。培養後，去掉培養液，向其中添加新的Hyg500-IMDM培養基，然後繼續培養9天。培養後，對培養皿中的每個克隆在Hyg500-IMDM培養基中進行擴大培養。下文，分別將質粒FT8libB_GMDB/pAGE導入克隆32-05-12獲得的凝集素抗性克隆稱為「克隆iBcho-H1」、「克隆iBcho-H2」、「克隆iBcho-H3」、「克隆iBcho-H4」或「克隆iBcho-H5」；將質粒FT8lib3_GMDB/pAGE導入克隆32-05-12獲得的克隆稱為「克隆i3cho-H1」、「克隆i3cho-H2」、「克隆i3cho-H3」、「克隆i3cho-H4」、「克隆i3cho-H5」、「克隆i3cho-H6」、「克隆i3cho-H7」或「克隆i3cho-H8」。
3.測定導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆CHO/DG44中GMD mRNA和FUT8 mRNA的量(1)製備全RNA根據下面的方法，從克隆32-05-12和本實施例第2項中獲得的導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆iBcho-H1、iBcho-H2、iBcho-H3、iBcho-H4、iBcho-H5、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8中製備全RNA。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將克隆iBcho-H1、iBcho-H2、iBcho-H3、iBcho-H4、iBcho-H5、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8懸浮在Hyg500-IMDM培養基中，並以2mL接種在粘附細胞用6孔板(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，用胰蛋白質酶處理使各細胞懸浮，在1,000rpm和4℃下離心5分鐘進行收集。將細胞懸浮在Dulbecco′s PBS緩衝液(Invitrogen製造)並在1,000rpm和4℃下再次離心5分鐘收集細胞後，使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN製造)根據生產廠商的說明書提取每種克隆的全RNA。將製得的全RNA溶解在40μL無菌水中。
(2)合成單鏈cDNA採用SuperScriptIII First-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen製造)根據生產廠商的說明書，使用寡聚(dT)引物在20μL反應系統中通過逆轉錄反應從3μg第(1)項中獲得的各種全RNA合成單鏈cDNA。將合成的單鏈cDNA用RNase處理，最終的反應體積調節至40μL。另外，每種反應溶液用無菌水稀釋50倍，用於下述的基因轉錄量的分析。
(3)通過SYBR-PCR測定GMD基因的轉錄量根據實施例5第2(3)項中所述的方法從測定GMD轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。分別使用SEQ IDNO80和81所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增GMD，使用SEQ ID NO66和67所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增β-肌動蛋白質。
根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將GMD mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。假設克隆32-05-12中GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，GMDmRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖18。與親代克隆32-05-12相比，導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的所有克隆中，GMD mRNA的量減少至約10％。
(4)通過SYBR-PCR測定FUT8基因的轉錄量根據實施例5第2(4)項中所述的方法從測定FUT8基因轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。分別使用SEQID NO75和76所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增FUT8，使用SEQ ID NO66和67所示的正向和反向引物作為PCR引物，用於擴增β-肌動蛋白質。
假設克隆32-05-12中GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖19。與親代克隆32-05-12相比，導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的所有克隆中，FUT8 mRNA的量減少至約5％。
4.使用導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆CHO/DG44產生並分析抗體組合物(1)使用導入了GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆CHO/DG44產生抗體組合物根據下面的方法，對克隆32-05-12和本實施例第2項中獲得的導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆iBcho-H2、iBcho-H3、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8所產生的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行純化。
以3×105細胞/mL的密度，將克隆32-05-12懸浮在基礎培養基中，將克隆iBcho-H2、iBcho-H3、i3cho-H1、i3cho-H2、i3cho-H3、i3cho-H4、i3cho-H5、i3cho-H6、i3cho-H7和i3cho-H8懸浮在Hyg500-IMDM培養基中，並以10mL接種在粘附細胞用T75培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養5天後，去掉培養上清液，用10mLDulbecco′s PBS(Invitrogen製造)衝洗2次後，加入24mL EXCELL301培養基(JRH Bioscience製造)。在5％CO2和37℃的條件下培養7天後，回收各培養上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/L KH2PO4緩衝液換液後，使用孔徑0.22μm的Millex GV(MILLIPORE製造)對從各個克隆的培養上清液中純化的抗-CCR4嵌合抗體進行無菌過濾。
(2)抗體組合物單糖成分分析根據已知方法對本實施例第4(1)項中獲得的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行單糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
從每種抗體的單糖成分比例計算出的巖藻糖(-)％示於表6。另外，當檢測不到巖藻糖產生的峰時，巖藻糖(-)％被視為100％。
表6每種克隆產生的抗-CCR4-嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％

克隆32-05-12產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為4％，而通過將GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體導入親代克隆32-05-12獲得的的凝集素抗性克隆產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為98至100％，與親代克隆相比顯示出顯著的增加。這些結果證明，導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體可以將CHO/DG44細胞轉變成產生巖藻糖含量低的抗體組合物的細胞。
實施例9使用導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的SP2/0細胞產生抗體組合物1.構建小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體(1)構建人U6啟動子下遊的小鼠GMD-靶向siRNA表達載體根據以下方法構建小鼠GMD基因-靶向siRNA表達載體(圖20)首先，選擇與證實在中國倉鼠卵巢來源CHO/DG44細胞中有效的GMD-靶向siRNA表達載體(pPUR/GMDshB)的靶序列(SEQ IDNO37)對應的小鼠序列(SEQ ID NO58)作為靶序列。然後，以與實施例1第1(3)項相同的方式針對所選擇的靶序列設計雙鏈DNA盒。設計的合成寡DNA的正義鏈(下文中稱為「mGMD-B-F」)和反義鏈(下文中稱為「mGMD-B-R」)分別由SEQ ID NO82和83表示。
此外，以與實施例1第1(4)項相同的方式，使用377型DNA測序儀(Perkin Elmer製造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle測序試劑盒(Applied Biosystems製造)根據生產廠商的說明書，對通過將合成寡DNA退火得到的雙鏈DNA插入實施例1第1(2)項中獲得的pPUR-U6term中構建的質粒DNA的核苷酸序列進行測定。使用pPURPvuII-seq-F(SEQ ID NO6 1)和pPUR PvuII-seq-R(SEQ ID NO62)作為序列分析引物，確認插入的合成寡DNA的序列和連接位點。下文中，將插入了合成寡DNA(mGMD-B-F和mGMD-B-R)退火得到的雙鏈DNA的質粒稱為「pPUR/GMDmB」。
(2)獲得人U6啟動子下遊的小鼠GMD-靶向siRNA表達單位通過與實施例6第1(1)項相同的方法，使用第(1)項中構建的pPUR/GMDmB獲得人U6啟動子下遊的小鼠GMD-靶向siRNA表達盒(圖16)。
使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(QIAGEN製造)從若干卡那黴素抗性集落中分離質粒DNA。下文中，該質粒稱為「pCR/GMDmB」。
(3)構建小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體通過與實施例6第1(2)項相同的方式，使用第(2)項中構建的質粒pCR/GMDmB和實施例2第4項中構建的質粒FT8libB/pAGE或FT8lib3/pAGE構建小鼠GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體(圖17)。
使用QIAprep spin Mini製備試劑盒(QIAGEN製造)從得到的氨苄青黴素抗性克隆中分離質粒DNA。使用377型DNA測序儀(PerkinElmer製造)和BigDye Terminator v3.0 Cycle測序試劑盒(AppliedBiosystems製造)根據生產廠商的說明書確認每種質粒的核苷酸序列。使用pPUR PvuII-seq-F(SEQ ID NO61)、pPUR PvuII-seq-R(SEQ IDNO62)、hu6pTsp45I/seq-F(SEQ ID NO63)、pAGE249-seqFW(SEQ IDNO73)、和pAGE249-seqRV(SEQ ID NO74)作為序列分析引物。
出於序列分析的結果，選擇siRNA表達盒正確、且人U6啟動子下遊的GMD-靶向siRNA表達盒和人tRNA-val啟動子下遊的FUT8-靶向siRNA表達盒插入方向相同的克隆。下文中，分別將在人hU6啟動子下遊插入GMD-靶向siRNA表達盒的質粒FT8libB/pAGE稱為「FT8libB_GMDmB/pAGE」，在人U6啟動子下遊插入小鼠GMD-靶向siRNA表達盒的FT8lib3/pAGE稱為「FT8lib3_GMDmB/pAGE」。
2.通過導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得和培養凝集素抗性細胞系SP2/0根據下面的方法，將本實施例1第1項中獲得的小鼠GMD-靶向和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體FT8libB_GMDmB/pAGE或FT8lib3_GMDmB/pAGE導入克隆KM968[下文中稱為「克隆KM968」，它是已公開未審查的日本專利申請第205694/94號的實施例1中所述的產生抗-GM2嵌合抗體的小鼠骨髓瘤SP2/0細胞(ATCC CRL-1581)的轉化體]，獲得凝集素抗性克隆。
根據以下方法通過電穿孔法將多種siRNA表達載體質粒轉染到克隆KM968中[Cytotechnology，3，133(1990)]首先，將10μg每種siRNA表達載體質粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶FspI(New EnglandBiolabs製造)在37℃下消化過夜進行線性化。使用一部分反應溶液通過瓊脂糖凝膠電泳確認被線性化的質粒後，通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉澱對剩餘反應溶液進行純化，將回收的線性化質粒溶解在10μL無菌水中。
另外，將克隆KM968以1.6×107細胞/mL的密度溶解在K-PBS緩衝液中。將200μL細胞懸液(3.2×106)與10μL上述的線性化質粒溶液混合後，將所有細胞/DNA混合物轉移至Gene Pulser Cuvette(電極間隔2mm)(BIO-RAD製造)，使用細胞融合裝置Gene Pulser(BIO-RAD製造)在脈衝電壓200V、電容250μF的條件下進行轉染。
轉染後，將細胞懸液懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培養基[含有10％胎牛血清(Invitrogen製造)和500nmol/L MTX(SIGMA製造)的RPMI1640(Invitrogen製造)]中，並接種在懸浮培養用T75培養瓶(ASAFII TECHNOGLASS製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養24小時後，以500μg/mL的最終濃度加入潮黴素(WAKO製造)，細胞繼續培養3天。培養後，在800rpm下離心5分鐘收集細胞，並將其以0.5-1×104活細胞/mL的密度懸浮在含有500μg/mL潮黴素的RPMI-FBS(10)-MTX(500)培養基[下文中稱為「RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基」]中，以100μL接種在96-孔培養板(Greiner製造)中。隨後，細胞繼續培養2周，期間每2-3天用新的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基以一半的體積例行更換1次培養上清液。
培養後，將96孔培養板中每孔中的細胞分至兩塊96孔培養板中；一塊為母板，另一塊為複製板。將母板和複製板分別在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基和含有1mmol/L L-巖藻糖(Nacalai Tesque製造)、500μg/mL LCA(VECTOR製造)的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基中各培養3天。結果，確認了對應於顯示出良好生長的母板孔的複製板孔中大約30％在LCA的存在下顯示出良好的生長。
對與顯示良好生長的複製板孔對應的母板孔中的細胞在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基中進行擴大培養。下文中，在擴大培養中使用的克隆當中，分別將導入FT8libB_GMDmB/pAGE獲得的克隆稱為「克隆968iB-1」、「克隆968iB-2」、「克隆968iB-3」、「克隆968iB-4」、「克隆968iB-5」、「克隆968iB-6」和「克隆968iB-7」；將導入FT8lib3_GMDmB/pAGE獲得的克隆稱為「克隆968i3-1」、「克隆968i3-2」、「克隆968i3-3」、「克隆968i3-4」、「克隆968i3-5」、「克隆968i3-6」、「克隆968i3-7」、「克隆968i3-8」、「克隆968i3-9」和「克隆968i3-10」。
3.測定導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性SP2/0細胞中GMD mRNA的量和FUT8 mRNA的量(1)製備全RNA根據下面的方法，從克隆KM968和本實施例第2項中獲得的導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性細胞系SP2/0的克隆968iB-1、968iB-2、968iB-3、968iB-4、968iB-5、968iB-6、968iB-7、968i3-1、968i3-2、968i3-3、968i3-4、968i3-5、968i3-6、968i3-7、968i3-8、968i3-9和968i3-10製備全RNA。
以1×105細胞/mL的密度，將克隆KM968懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培養基中，將導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性細胞系SP2/0懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基中，並接種在懸浮細胞用T75培養瓶(ASAHI TECHNOGLASS製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，對細胞進行計數，以5×105細胞/mL收集每種細胞。在800rpm下離心5分鐘回收細胞。將回收的細胞懸浮在Dulbecco′sPBS緩衝液(Invitrogen製造)中後，在800rpm下再次離心5分鐘，回收細胞，使用RNeasy Micro Kit(QIAGEN製造)根據生產廠商的說明書提取每種克隆的全RNA。將製得的每種全RNA溶解在14μL無菌水中。
(2)合成單鏈cDNA採用SuperScriptIII First-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen製造)根據生產廠商的說明書，使用寡聚(dT)引物在20μL反應系統中通過逆轉錄反應從3μg第(1)項中獲得的各種全RNA合成單鏈cDNA。將合成的每種單鏈cDNA用RNase處理，最終的反應體積調節至40μL。另外，每種反應溶液用無菌水稀釋50倍，用於下述的基因轉錄量的分析。
(3)通過SYBR-PCR測定小鼠GMD基因的轉錄量根據實施例8第3(3)項中所述的方法測定從GMD基因轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將GMD mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。
假設克隆KM968中GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖21。與親代克隆KM968相比，導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的所有克隆中，GMDmRNA的量減少至約10％。
(4)通過SYBR-PCR測定FUT8基因的轉錄量根據實施例8第3(4)項中所述的方法測定從FUT8轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將FUT8 mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。
假設克隆KM968中FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖22。與親代克隆KM968相比，導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的所有克隆中，FUT8mRNA的量減少至約10％。
4.使用導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性細胞系SP2/0產生和分析抗體組合物(1)使用導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性細胞系SP2/0產生抗體組合物根據下面的方法，對克隆KM968和本實施例第2項中獲得的導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性克隆968i3-2和968i3-3所產生的抗-GM2嵌合抗體組合物進行純化。
以1×105細胞/mL的密度，將克隆KM968懸浮在SP-HSFM培養基[含有5％UltraLow-IgG FBS(Invitrogen製造)、500nmol/L MTX(SIGMA製造)的雜交瘤-SFM培養基]中，將克隆968i3-2和968i3-3懸浮在含有500μg/mL潮黴素(WAKO製造)的SP-HSFM培養基中，並以50mL接種在懸浮培養用T225培養瓶(Greiner製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養7天後，去掉培養上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-GM2嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/LKH2PO4緩衝液換液後，使用孔徑0.22μm的Millex GV(MILLIPORE製造)對從各個克隆的培養上清液中純化的抗-GM2嵌合抗體進行無菌過濾。
(2)抗體組合物單糖成分分析根據已知方法對本實施例第4(1)項中獲得的抗-GM2嵌合抗體組合物進行單糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
從每種抗體的單糖成分比例計算出的巖藻糖(-)％示於表7。
表7每種克隆產生的抗-GM2嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％

克隆KM968產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為3％，而導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的凝集素抗性克隆968i3-2和968i3-3所產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為大約60％，與親代克隆KM968相比顯示出顯著增加。這些結果證明導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體將SP2/0細胞轉變成產生巖藻糖含量低的抗體組合物的細胞。
實施例10使用導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的NS0細胞產生抗體組合物1.獲得和培養導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的細胞系NS0根據下面的方法，將實施例7第1項中獲得的小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體FT8libB_GMDmB/pAGE或FT8lib3_GMDmB/pAGE導入來源於小鼠骨髓瘤NS0細胞(RCB0213)的產生抗-CCR4嵌合抗體的克隆NS0/2160(下文中稱為「克隆NS0/2160」，其通過與WO03/85118實施例1第(2)項相同的方式獲得)，獲得轉化體。
根據下面的方法通過電穿孔法將多種siRNA表達載體質粒轉染到克隆NS0/2160中[Cytotechnology，3，133(1990)]。
首先，將10ug每種siRNA表達載體質粒溶解在30μL NEBuffer 4(New England Biolabs製造)中，用10單位限制性酶FspI(New EnglandBiolabs製造)在37℃下消化過夜進行線性化。使用一部分反應溶液通過瓊脂糖凝膠電泳確認被線性化的質粒後，將剩餘反應溶液通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉澱純化，回收的線性化質粒溶解在10μL無菌水中。
另外，將克隆NS0/2160以1×107細胞/mL溶解在K-PBS緩衝液中。將200μL細胞懸液(1.6×106)與10μL線性化質粒溶液混合後，將所有的細胞/DNA混合物轉移至Gene Pulser Cuvette(電極間隔2mm)(BIO-RAD製造)，在脈衝電壓200V、電容250μL的條件下使用細胞融合裝置Gene Pulser(BIO-RAD製造)進行轉染。
轉染後，將細胞懸液懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培養基中，並接種到懸浮培養用T75培養瓶(ASAFII TECHNOGLASS製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養24小時後，以500μg/mL的最終濃度加入潮黴素(WAKO製造)，細胞繼續培養2天。培養後，在800rpm下離心5分鐘收集細胞，並將其以0.5-1×104活細胞/mL的密度懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)中，以100μL接種在96-孔培養板(Greiner製造)中。隨後，每2-3天用新的RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基以一半的體積例行更換1次培養上清液，將細胞培養2-3周。
培養後，收集96孔培養板每孔中的培養上清液，通過實施例7第3項中所述的方法評價每種培養上清液中所含的抗-CCR4嵌合抗體組合物與shFcγRIIIa結合的活性。對每種載體在80孔中分析的結果是，與親代克隆NS0/2160相比，90％或更多孔中培養上清液的抗體組合物與shFcγRIIIa的結合活性得以增加，這證明各個孔中的細胞被轉變成產生巖藻糖含量低的抗體組合物的細胞。
在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基中對顯示出與shFcγRIIIa的結合活性增加的5個孔中的細胞進行擴大培養。下文中，在用於擴大培養的克隆當中，分別將導入FTRlibB GMDmB/pAGE獲得的克隆稱為「克隆NS0/2160iB-1」、「克隆NS0/2160iB-2」、「克隆NS0/2160iB-3」、「克隆NS0/2160iB-4」和「克隆NS0/2160iB-5」；將導入FT8lib3_GMDmB/pAGE獲得的克隆稱為「克隆NS0/2160i3-1」、「克隆NS0/2160i3-2」、「克隆NS0/2160i3-3」、「克隆NS0/2160i3-4」和「克隆NS0/2160i3-5」。
2.測定導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性NS0細胞中GMD mRNA的量和FUT8 mRNA的量(1)製備全RNA根據以下方法從克隆NS0/2160和本實施例第1項中獲得的導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的細胞系NS0(克隆NS0/2160iB-1、NS0/2160iB-2、NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-4、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-2、NS0/2160i3-3、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5)中製備全RNA。
以1×105細胞/mL的密度，將克隆NS0/2160懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)培養基中，將導入了小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的細胞系NS0懸浮在RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培養基中，將它們接種在懸浮培養用T75培養瓶(ASAHI TECHNOGLASS製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養3天後，對細胞進行計數，每種收集5×105個細胞。將細胞懸浮在Dulbecco′s PBS緩衝液(Invitrogen製造)、並再次在800rpm下離心5分鐘之後，回收細胞。使用RNeasy Micro試劑盒(QIAGEN製造)根據生產廠商的說明書提取各全RNA。將製得的全RNA溶解在14μL無菌水中。
(2)合成單鏈cDNA採用SUPERSCRIPTTMPreamplification System for First StrandcDNA Synthesis(Invitrogen製造)，根據生產廠商的說明書，使用寡(dT)引物在20μL反應系統中通過逆轉錄反應從第(1)項中獲得的各種全RNA合成單鏈cDNA。將合成得單鏈cDNA用RNase處理，最終的反應體積調整至40μL。然後，將各種反應溶液用無菌水稀釋50倍，並用於下述基因轉錄量的測定。
(3)通過SYBR-PCR測定GMD基因的轉錄量根據實施例8第3(3)項中所述的方法測定從GMD基因轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將GMD mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。
假設克隆NS0/2160中GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，GMD mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖23。與親代克隆NS0/2160相比，導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體獲得的所有克隆中，GMD mRNA的量減少至約20％。
(4)通過SYBR-PCR測定FUT8基因的轉錄量根據實施例8第3(4)項中所述的方法測定從FUT8基因轉錄的mRNA的量和從β-肌動蛋白質基因轉錄的mRNA的量。根據內參照質粒的測量結果獲得標準曲線，將FUT8 mRNA的量和β-肌動蛋白質mRNA的量轉變成數字形式。
假設克隆NS0/2160中FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量為100時，FUT8 mRNA相對於β-肌動蛋白質mRNA的相對量的比較結果示於圖24。與親代克隆KM968相比，通過導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體得到的所有克隆中，FUT8 mRNA的量減少至約10％。
3.使用導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的凝集素抗性細胞NS0產生和分析抗體組合物(1)通過導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體、產生巖藻糖含量低的抗體的細胞系NS0產生抗體組合物根據下面的方法，對克隆NS0/2160和本實施例第1項中的導入小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體的細胞系NS0(克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5)所產生的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行純化。
以2×105細胞/mL的密度，將克隆NS0/2160懸浮在NS-HSFM培養基[含有0.2％胎牛血清(Invitrogen製造)、500nmol/L MTX(SIGMA製造)的雜交瘤-SFM培養基]中，將克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5懸浮在含有500μg/mL潮黴素(WAKO製造)的NS-HSFM培養基中，並以40mL接種在懸浮培養用T225培養瓶(ASAHI TECHNOGLASS製造)中。在5％CO2和37℃的條件下培養7天後，去掉各個培養上清液，使用MabSelect柱(Amersham Bioscience製造)根據生產廠商的說明書純化抗-CCR4嵌合抗體組合物。使用Econo-Pac 10DG(Bio Rad製造)用10mmol/LKH2PO4緩衝液換液後，使用孔徑0.22μm的Millex GV(MILLIPORE製造)對從各個克隆的培養上清液中純化的抗CCR4-嵌合抗體組合物進行無菌過濾。
(2)抗體組合物單糖成分分析根據已知方法對本實施例第3(1)項中獲得的抗-CCR4嵌合抗體組合物進行單糖成分分析[Journal of Liquid Chromatography，6，1577(1983)]。
從每種抗體的單糖成分比例計算出的巖藻糖(-)％示於表8。
表8每種克隆產生的抗-CCR4嵌合抗體組合物的巖藻糖(-)％


克隆NS0/2160產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為28％，，而通過將小鼠GMD-靶向siRNA和小鼠FUT8-靶向siRNA共表達載體導入親代克隆NS0/2160獲得的克隆NS0/2160iB-3、NS0/2160iB-5、NS0/2160i3-1、NS0/2160i3-4和NS0/2160i3-5所產生的抗體組合物的巖藻糖(-)％為大約90％，與親代細胞相比顯示出顯著增加。這些結果證明導入GMD-靶向siRNA和FUT8-靶向siRNA共表達載體可以將NS0細胞轉變成產生巖藻糖含量低的抗體組合物的細胞。
工業應用性本發明提供了一種其中導入了能夠抑制酶功能的RNA的細胞(上述酶催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應)；使用該細胞產生糖蛋白質的方法；一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA(所述糖鏈中在複雜型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接)、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶蛋白質功能的RNA、或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA；使用該細胞產生糖蛋白質的方法；和類似物。通過本發明的方法產生的抗體組合物具有很高的效應器活性，可用作藥物。
序列列表的自由文本SEQ ID NO14-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO15-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO16-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO17-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO18-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO19-人造序列的描述合成RNASEQ ID NO20-人造序列的描述合成RNA
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序列表110協和發酵工業株式會社120糖蛋白組合物的製造方法13011708W01150P2004-2289281512004-08-05150P2004-2526821512004-08-31150P2005-1364101512005-05-0916096170PatentIn Ver.2.021012112008212DNA213中國倉鼠(Cricetulus griseus)4001aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660
acagagctgg tccagcggag aataacatat ctgcagaatc ccaaggactg cagcaaagcc 720agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg gatgtcaact ccatcatgtg 780gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt 1980gaagggctgc tgtgccctca agcccatg20082102
2113052212DNA213小鼠(Mus musculus)4002ggctgtcagc cgctgcctgg ctcgcgccgc cttgcgcttt ccctcagtca gtggcgccga 60aggctccgtt aagcggcggc cgcggttcct gtttccgttt cttcctctcc cttcagtcgg 120gagtagcatc ctccacccca gcacccctcc cactctcccg ccgcggccag ctgcagctgg 180aggcagcggc ggcggcgacg ggggacggcg ccgaccgcct cgctcccgcc tcgggttggt 240gttctggctg aggccatcta tggccctggt agtgttttca ttcaagacaa agtccattcc 300atctttattt attagctgag caaattcagc taataatttt caagacccag attcaagcaa 360taaaacattt ctctgcaata ccatgtggtt ttcttcaaca tcataattct atggggagga 420agcatgtagg atccatgaag cacaggacat tcaagcctcc cgcccgcgtc accaggaaga 480tctctttgta agaataacca caggattgat ttccagagag attagcctgt ctgaagcatt 540atgtgttgaa gcaaaagaaa cctattttct tgtgtggcta actagaacca gagtacaatg 600tttccagttc tttgagctcc aggaagatag aggacagagt tgaaactctg aaaatgcggg 660catggactgg ttcctggcgt tggattatgc tcattctttt tgcctggggg accttgttat 720tttatatagg tggtcatttg gttcgagata atgaccaccc tgatcactcc agcagagaac 780tctccaagat tcttgcaaag cttgaacgct taaaacagca aaatgaagac ttgaggcgaa 840tggctgagtc tctccgaata ccagaaggcc ccattgacca ggggacagct acaggaagag 900tccgtgtttt agaagaacag cttgttaagg ccaaagaaca gattgaaaat tacaagaaac 960aagctagaaa tggtctgggg aaggatcatg aaatcttaag aaggaggatt gaaaatggag 1020ctaaagagct ctggtttttt ctacaaagcg aactgaagaa attaaagcat ttagaaggaa 1080atgaactcca aagacatgca gatgaaattc ttttggattt aggacaccat gaaaggtcta 1140tcatgacaga tctatactac ctcagtcaaa cagatggagc aggggattgg cgtgaaaaag 1200aggccaaaga tctgacagag ctggtccagc ggagaataac atatctccag aatcctaagg 1260actgcagcaa agccaggaag ctggtgtgta acatcaataa aggctgtggc tatggttgtc 1320
aactccatca cgtggtctac tgtttcatga ttgcttatgg cacccagcga acactcatct 1380tggaatctca gaattggcgc tatgctactg gtggatggga gactgtgttt agacctgtaa 1440gtgagacatg tacagacaga tctggcctct ccactggaca ctggtcaggt gaagtaaatg 1500acaaaaacat tcaagtggtc gagctcccca ttgtagacag cctccatcct cggcctcctt 1560acttaccact ggctgttcca gaagaccttg cagaccgact cctaagagtc catggtgacc 1620ctgcagtgtg gtgggtgtcc cagtttgtca aatacttgat tcgtccacaa ccttggctgg 1680aaaaggaaat agaagaagcc accaagaagc ttggcttcaa acatccagtt attggagtcc 1740atgtcagacg cacagacaaa gtgggaacag aagcagcctt ccaccccatc gaggagtaca 1800tggtacacgt tgaagaacat tttcagcttc tcgcacgcag aatgcaagtg gataaaaaaa 1860gagtatatct ggctactgat gatcctactt tgttaaagga ggcaaagaca aagtactcca 1920attatgaatt tattagtgat aactctattt cttggtcagc tggactacac aatcggtaca 1980cagaaaattc acttcggggt gtgatcctgg atatacactt tctctcacag gctgactttc 2040tagtgtgtac tttttcatcc caggtctgtc gggttgctta tgaaatcatg caaaccctgc 2100atcctgatgc ctctgcgaac ttccattctt tggatgacat ctactatttt ggaggccaaa 2160atgcccacaa tcagattgct gtttatcctc acaaacctcg aactgaagag gaaattccaa 2220tggaacctgg agatatcatt ggtgtggctg gaaaccattg ggatggttat tctaaaggta 2280tcaacagaaa acttggaaaa acaggcttat atccctccta caaagtccga gagaagatag 2340aaacagtcaa gtatcccaca tatcctgaag ctgaaaaata gagatgaagt agaagagatt 2400aacaacagaa ctcacttcag accatctcgg ccaagcagaa gacgcagact aacacgtggt 2460tcattgatag acacgctcca caccaagagc aagcgggaac cctcagatgc tgcactggtg 2520gaacgcctct ttatgaaggg ctgtggtgcc ctcaagccca tacacagtac aataatgtac 2580tcacacataa cacgcaaagg gattattttc tactttgccc ctttaaatat tatgtcccca 2640ttgaacaaac actgccacat tgtgtaattt aagtgacaca gacattttgt gtgagactta 2700aaacatggtg cctatatctg agagacctct gtgacttacc gagaagatgt gaacagctcc 2760cttctctggg gaagctggtg gtggtgtggc cactgaattc actccagtca acagattcaa 2820
aatgagaatg gatgtttttc ctttatatgg ttgtctggat ttttttttaa gtaatttcat 2880cagttcagtt tatccacctc atcattaata aatgaaggat gcatcaataa aataaaatga 2940aatattcact ctccattagg aagttttgta aaacaatgcc atgaacaaat tctttagtac 3000tcaatgtttc tggacattct ctttgataac aaaaaaataa atttcaaaaa gg 305221032111728212DNA213大鼠(Rattus norvegicus)220
400 3atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60ttgttgtttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactctagc 120agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacaacaaaa tgaagacttg 180aggcgaatgg ctgagtctct acgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacggctacg 240ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300aagaaacaag ccagaaatgg tctggggaag gatcatgaac tcttaaggag gaggattgaa 360aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagtgaac tgaagaaatt aaagcatcta 420gaaggaaatg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acaccatgaa 480aggtctatca tgacggatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg ggattggcgt 540gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataactta tctccagaat 600cccaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaggg ctgtggctat 660ggttgccaac tccatcacgt ggtctactgt ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggtg gatgggagac tgtgtttaga 780cctgtaagtg agacatgcac agacagatct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840gtgaatgaca aaaatattca agtggtggag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg 900cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag atcgactcgt aagagtccat 960ggtgatcctg cagtgtggtg ggtgtcccag ttcgtcaaat atttgattcg tccacaacct 1020
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223人造序列的描述合成DNA
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40084Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe1 5 10 15Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp20 25 30Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala35 40 45Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala50 55 60Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr65 70 75 80Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln85 90 95Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His100 105 110Glu Leu Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe115 120 125Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu130 135 140Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu145 150 155 160Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala165 170 175Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln180 185 190Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg
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223人造序列的描述合成DNA40085ggacagaguu gaaacucuga aaaugcgggc auggacuggu 402108621140212RNA213人造序列220
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223人造序列的描述合成DNA
40087gaggcgaaug gcugagucuc uacgaauacc a 312108821131212RNA213人造序列220
223人造序列的描述合成DNA40088ugcacuggug gaacgccucu uuaugaaggg c 312108921131212RNA213人造序列220
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223人造序列的描述合成DNA40090agaatggctg agtctctccg aataccggat ccggtattcg gagagactca gccattct 582109121172212DNA213人造序列220
223人造序列的描述合成DNA40091aaatccaaaa gaatttcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaaat 60tcttttggat tt 722109221168212DNA
213人造序列220
223人造序列的描述合成DNA40092tataagaatc cacaggctca tattgaaggc ttcctgtcac cttcaatatg agcctgtgga 60ttcttata 682109321168212DNA213人造序列220
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223人造序列的描述合成DNA40094cgaatggccg aatctctccg gataccggat ccggtatccg gagagattcg gccattcg 582109521172212DNA213人造序列220
223人造序列的描述合成DNA40095aaatccaaaa gaaattcatc tgcatgtctt tggggatccc caaagacatg cagatgaatt 60tcttttggat tt 722109621168212DNA213人造序列220
223人造序列的描述合成DNA
40096tataagaatc cccaggctca cattgaaggc ttcctgtcac cttcaatgtg agcctgggga 60ttcttata 68
權利要求
1.一種細胞，其中導入了包括選自下列(a)或(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制酶功能的活性的RNA，所述的酶催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應。
2.根據權利要求1所述的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖脫水反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
3.根據權利要求2所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下列(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
4.根據權利要求2所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
5.一種雙鏈RNA，其包括選自下列(a)或(b)的RNA及其互補RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制酶功能的活性的RNA，所述的酶催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應。
6.一種與權利要求5所述的RNA對應的DNA及其互補DNA。
7.一種載體，其包括與權利要求5所述的RNA對應的DNA。
8.一種細胞，其中導入了權利要求7所述的載體。
9.一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA、和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
10.一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA和能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
11.根據權利要求9或10所述的細胞，其中所述的細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶是催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶。
12.根據權利要求9-11中任意一項所述的細胞，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
13.根據權利要求12所述的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
14.根據權利要求12所述的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下列(a)至(1)的蛋白質(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ IDNO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(j)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(1)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
15.根據權利要求9-14中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)至(d)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
16.根據權利要求9-14中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
17.根據權利要求11-16中任意一項所述的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
18.根據權利要求17所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ IDNO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
19.根據權利要求17所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
20.根據權利要求11-19中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)至(c)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
21.根據權利要求11-19中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
22.一種DNA，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、或與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
23.一種DNA，其包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA、和與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
24.根據權利要求22或23所述的DNA，其中所述的細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶是催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶。
25.根據權利要求22-24中任意一項所述的DNA，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
26.根據權利要求25所述的DNA，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自以下(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
27.根據權利要求25所述的DNA，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下面(a)至(1)的蛋白質(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(1)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
28.根據權利要求22-27中任意一項所述的DNA，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是選自下列(a)至(d)的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
29.根據權利要求22-27中任意一項所述的DNA，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是選自下列(a)和(b)的RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
30.根據權利要求24-29中任意一項所述的DNA，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
31.根據權利要求30所述的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
32.根據權利要求30所述的DNA，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自下列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
33.根據權利要求24-32中任意一項所述的DNA，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是選自下列(a)至(c)的RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
34.根據權利要求24-32中任意一項所述的DNA，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是選自下面(a)和(b)的RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
35.一種載體，其包括權利要求22-34中任意一項所述的DNA。
36.根據權利要求35所述的載體，其包括SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ ID NO92所示的DNA。
37.根據權利要求35所述的載體，其包括SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ ID NO92所示的DNA。
38.根據權利要求35所述的載體，其包括SEQ ID NO90所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA。
39.根據權利要求35所述的載體，其包括SEQ ID NO91所示的DNA和SEQ ID NO93所示的DNA。
40.一種細胞，其中導入了權利要求35-39中任意一項所述的載體。
41.一種細胞，其中導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體、和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體、或包括與能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
42.一種細胞，其中導入了包括與能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體、和包括與能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶的功能的RNA對應的DNA及其互補DNA的載體，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
43.根據權利要求41或42所述的細胞，其中所述的能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP-巖藻糖合成相關酶蛋白質功能的RNA是能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA。
44.根據權利要求41-43中任意一項所述的細胞，其中所述的糖鏈修飾相關酶是α1，6-巖藻糖基轉移酶，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
45.根據權利要求44所述的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是由選自(a)至(h)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的DNA；(d)包括由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO1所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(g)在嚴格條件下與由SEQ ID NO3所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA；(h)在嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質的DNA。
46.根據權利要求44所述的細胞，其中所述的α1，6-巖藻糖基轉移酶是選自下列(a)至(1)的蛋白質(a)包括SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括SEQ ID NO7所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)包括SEQ ID NO84所示的胺基酸序列的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(g)由在SEQ ID NO7所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(h)由在SEQ ID NO84所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO5所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(j)由與SEQ ID NO6所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(k)由與SEQ ID NO7所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質；(1)由與SEQ ID NO84所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有α1，6-巖藻糖基轉移酶活性的蛋白質。
47.根據權利要求41-46中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)至(d)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)與包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(b)與包括SEQ ID NO2所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(c)與包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA；(d)與包括SEQ ID NO4所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列的DNA對應的RNA。
48.根據權利要求41-46中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制糖鏈修飾相關酶的功能的RNA是包括選自下列(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA，所述糖鏈中在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接(a)包括SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO14-35或85-89中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制α1，6-巖藻糖基轉移酶活性功能的活性的RNA。
49.根據權利要求43-48中任意一項所述的細胞，其中所述的催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶是GDP-甘露糖4，6-脫水酶。
50.根據權利要求49所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是由選自下面(a)至(f)的DNA編碼的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列的DNA；(b)包括由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；(c)包括由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列的DNA；(d)在嚴格條件下與由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(e)在嚴格條件下與由SEQ ID NO9所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA；(f)在嚴格條件下與由SEQ ID NO10所示的核苷酸序列組成的DNA雜交、並編碼具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質的DNA。
51.根據權利要求49所述的細胞，其中所述的GDP-甘露糖4，6-脫水酶是選自列(a)至(i)的蛋白質(a)包括由SEQ ID NO11所示的胺基酸序列的蛋白質；(b)包括由SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白質；(c)包括由SEQ ID NO13所示的胺基酸序列的蛋白質；(d)由在SEQ ID NO11所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(e)由在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(f)由在SEQ ID NO13所示的胺基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(g)由與SEQ ID NO11所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(h)由與SEQ ID NO12所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質；(i)由與SEQ ID NO13所示胺基酸序列的同源性為80％或更高的胺基酸序列組成、並具有GDP-甘露糖4，6-脫水酶活性的蛋白質。
52.根據權利要求43-51中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)至(c)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)與由SEQ ID NO8所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(b)與由SEQ ID NO9所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA；(c)與由SEQ ID NO10所示核苷酸序列中10至40個連續鹼基的序列所示的核苷酸序列組成的DNA對應的RNA。
53.根據權利要求43-51中任意一項所述的細胞，其中所述的能夠抑制催化GDP-甘露糖轉化為GDP-4-酮，6-脫氧-GDP-甘露糖的反應的酶功能的RNA是包括選自下面(a)和(b)的RNA及其互補RNA的雙鏈RNA(a)包括SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列的RNA；(b)由在SEQ ID NO37、57或58中任意一個所示的核苷酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、並具有抑制GDP-甘露糖4，6-脫水酶功能的活性的RNA。
54.根據權利要求1-4、8-21和40-53中任意一項所述的細胞，其對識別如下糖鏈結構的凝集素有抗性在N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵連接。
55.根據權利要求54所述的細胞，其中所述的凝集素選自下列(a)至(d)(a)兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(來源於兵豆的扁豆凝集素)；(b)豌豆(P.sativum)凝集素PSA(來源於豌豆的豌豆凝集素)；(c)蠶豆(Viciafaba)凝集素VFA(來源於蠶豆的凝集素)；(d)橙黃網胞盤菌(Aleuria aurantia)凝集素AAL(來源於橙黃網胞盤菌的凝集素)。
56.根據權利要求1-4、8-21和40-55中任意一項所述的細胞，其為選自酵母、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞的細胞。
57.根據權利要求56所述的細胞，其中所述的動物細胞選自下列(a)至(k)(a)來源於中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞；(b)大鼠骨髓瘤細胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；(c)小鼠骨髓瘤細胞系NS0細胞；(d)小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14細胞；(e)來源於敘利亞倉鼠腎組織的BHK細胞；(f)產生抗體的雜交瘤細胞；(g)人白血病細胞系Namalwa細胞；(h)人白血病細胞系NM-F9細胞；(i)人胚胎視網膜細胞系PER.C6細胞；(i)胚胎幹細胞；(k)受精卵細胞。
58.根據權利要求1-4、8-21和40-57中任意一項所述的細胞，其包括編碼糖蛋白質的基因。
59.根據權利要求58所述的細胞，其中所述的糖蛋白質是抗體分子。
60.根據權利要求59所述的細胞，其中所述的抗體分子選自下列(a)至(d)(a)人抗體；(b)人源化抗體；(c)包括(a)或(b)的Fc區的抗體片段；(d)包括(a)或(b)的Fc區的融合蛋白質。
61.根據權利要求59或60所述的細胞，其中所述的抗體分子屬於IgG型。
62.一種糖蛋白質組合物製造方法，其包括使用權利要求58所述的細胞。
63.一種糖蛋白質組合物製造方法，其包括將權利要求58所述的細胞在培養基中培養，以在培養物中形成並積聚糖蛋白質組合物；和從培養物中回收和純化糖蛋白質組合物。
64.一種抗體組合物製造方法，其包括使用權利要求59-61中任意一項所述的細胞。
65.一種抗體組合物製造方法，其包括將權利要求59-61中任意一項所述的細胞在培養基中培養，以在培養物中形成和積聚抗體組合物；和從培養物中回收和純化抗體組合物。
66.根據權利要求64或65所述的方法，其中所述的抗體組合物是依賴抗體的細胞介導細胞毒活性高於其親代細胞產生的抗體組合物的抗體組合物。
67.根據權利要求66所述的方法，其中所述的依賴抗體的細胞介導細胞毒活性較高的抗體組合物中，在與抗體組合物Fc區結合的全部複合型N-糖苷-連接糖鏈當中，巖藻糖未與糖鏈還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖結合的糖鏈的比例高於其親代細胞產生的抗體組合物。
68.根據權利要求67所述的方法，其中所述的未結合巖藻糖的糖鏈是在複合型N-糖苷-連接糖鏈中巖藻糖的1-位未與還原末端的N-乙醯氨基葡萄糖的6-位通過α-鍵結合的糖鏈。
69.一種糖蛋白質組合物，其通過權利要求62或63所述的方法製造。
70.一種抗體組合物，其通過權利要求64-68中任意一項所述的方法製造。
71.一種藥物，其包括權利要求69或70所述的組合物作為活性成分。
全文摘要
本發明涉及一種導入了能夠抑制催化GDP－甘露糖轉化為GDP－4－酮，6－脫氧－GDP－甘露糖的反應的酶功能的RNA的細胞；使用該細胞產生糖蛋白質的方法；一種細胞，其中導入了能夠抑制糖鏈修飾相關酶功能的RNA、和及能夠抑制細胞內糖核苷酸GDP－巖藻糖合成相關酶蛋白質功能的RNA或能夠抑制將細胞內糖核苷酸GDP－巖藻糖轉運至高爾基體的相關蛋白質功能的RNA，所述糖鏈中在複合型N－糖苷－連接糖鏈中巖藻糖的1－位與還原末端的N－乙醯氨基葡萄糖的6－位通過α－鍵連接；使用該細胞產生糖蛋白質組合物的方法等。
文檔編號C12N15/63GK101023172SQ200580030460
公開日2007年8月22日 申請日期2005年8月5日 優先權日2004年8月5日
發明者西谷春江, 佐藤光男, 森勝弘 申請人:協和發酵工業株式會社