被二噁英樣化合物轉化的Ah受體的免疫測定的製作方法

2023-07-02 11:00:36 3

專利名稱：被二噁英樣化合物轉化的Ah受體的免疫測定的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測轉化的Ah受體，以及隨後通過檢測轉化的Ah受體而間接檢測二噁英樣化合物。
背景技術：
導言在最近的數十年裡，二噁英已成為詳細研究的熱門課題。這歸因於它們很大的毒性，以及據推測它們在環境中廣泛的存在。對二噁英的毒理學研究主要集中在通過採用動物模型和細胞培養體系對它們的生物學活性進行研究。此外，二噁英對人類健康的潛在威脅還僅是通過對已知暴露於二噁英的人群進行流行病學研究的有限方法進行。從環境角度著眼於研究二噁英的產生、釋放和降解。儘管在這些方面二噁英得到了廣泛的研究，然而它們對生物系統的毒性的確切機制以及它們在環境中的分布範圍尚不知曉。這部分是由於缺少評估生物系統暴露於二噁英及其相關化合物的簡單方法。本發明的目的是克服本領域的這種缺陷。
環境中的TCDD及其相關化學製品術語二噁英，通常為新聞媒體所採用，是2，3，7，8-四氯二苯並-對-二噁英(″TCDD″)的縮寫。TCDD僅僅是多氯化的二苯並-對-二噁英家族中的一員(即同類物)，而該家族具有75種可能的同類物，其結構隨著氯原子的數目和位置而變化。引起混淆的來源是術語″二噁英″一詞或者被用於專指TCDD，或者用於指整個多氯二苯並二噁英(PCDD)家族。從生物學上來講，TCDD是最強的PCDD；多數其它的PCDD活性要弱10到上千倍。TCDD在所有PCDD同類物中是研究得最為深入的一種。
一些芳香烴同TCDD具有相同的生物學特性，尤其是當其側向位置被氯所取代時。這些化合物中最為重要的是多氯二苯並呋喃(″PCDF″)和某些多氯聯苯家族(″PCB″)的成員。可能數目很大的PCDD(75)、PCDF(135)和PCB(20)的同類物使得環境分析變得複雜了，並且在能夠採取此類分析前需要進行複雜的清除程序。在此所使用的″二噁英樣化合物″包括所有上述所定義化合物家族的成員以及其它誘導相似細胞效應的化合物，例如偶氮苯和苯並芘。使用2，4，5-三氯苯氧基乙酸和2，4-二氯苯氧基乙酸脫葉劑，特別是通過在美國和越南所進行的森林噴灑計劃，TCDD作為其產生的一種汙染物在本世紀70年代早期引起了科學界和公眾的注意。
現有的TCDD檢測技術在過去十年中檢測二噁英樣化合物的主要方法涉及使用物理-化學分析。這類方法通常包括一步或多步樣品清除步驟以便從原始樣本中提取出分析物，經氣相色譜從與其它化合物的混合物中分離出感興趣的分析物，通過質譜進行檢測，並且與已知的合成標準物比較對分析物進行鑑定。這些步驟在R．E．Clement的「超痕量二噁英和二苯並呋喃分析30年來的進展」，分析化學，Vol．63，no．23(1991)和分析新聞(Sept／Oct 1992)中得到了綜述。儘管很靈敏，但由於其高昂的價格(即每個樣品達到2500美元)以及需要在中心實驗室由熟練的操作者進行分析，這些技術並不適合篩選大批量的樣品。此外，對二噁英樣化合物進行物理-化學分析並不適合對含二噁英樣化合物的混合物進行毒性預測，或對尚沒有合成標準物存在的二噁英樣化合物進行鑑定。
另一種檢測二噁英樣化合物的方法是採用生物檢測，即對活細胞或動物給予檢測樣品，然後分析細胞色素P450IA1活性的誘導-這種特性據認為可提示二噁英樣化合物的存在。
一系列的文獻都公開了細胞系生物檢測的方法。在D．E．Tillitt等「H4IIE大鼠肝癌細胞生物檢測作為評估環境樣品中平面滷化烴毒性強度的手段的特徵」，環境科學技術，Vol 25，no．1，pp．87-92(1991)中，利用H4IIE大鼠肝癌細胞全面評估不同二噁英樣化合物的毒性強度。當這種細胞被檢測樣品處理後，它們被採取分光螢光分析來檢測芳香烴羥化酶和乙氧基試滷靈-正-脫乙基酶活性(細胞色素P450IA1誘導的指示物)。T．Zacharewski，「體外應用芳香烴羥化酶誘導分析法確定『2，3，7，8-四氯二苯並-對-二噁英的等價物』；被熱解的溴化阻燃劑，」毒理學，51∶177-89(1986)(″Zacharewski″)總的來說與之相似。
還採用了需要利用活動物的生物檢測。在Zacharewski，大鼠注射檢測樣品並被處死。回收肝臟微粒酶部分，然後進行酶分析以檢測芳香烴羥化酶或乙氧基試滷靈-正-脫乙基酶的誘導。
雖然在文獻中生物檢測法已經被廣泛地應用，它們卻沒得到實際的商業應用。這種方法主要的不足是需要活的細胞或動物，使它們不適合於採用商業檢測試劑盒的方式。此外，P450IA1的酶檢測法不是很靈敏而且需要複雜的儀器設備。
由於存在上述與物理-化學分析和生物檢測有關的問題，人們的注意力越來越集中於用體外檢測法檢測二噁英樣化合物上。
在C．A．Bradfield等的「對2，3，7，8-四氯二苯並-對-二噁英及Ah受體相關配體的競爭結合檢測」，分子藥理學，34∶682-88(1988)中，將來自C57BL／6J小鼠肝細胞溶膠的硫酸銨級份與檢測樣品和放射性配體[I125]2-碘代-7，8-二溴二苯並-對-二噁英共同孵育。然後游離的配體經活性炭處理後去除，而結合放射活性的配體通過閃爍計數器進行測量。這種方法具有很多缺點，包括需要獲得使用放射性同位素的批准，以及需要設備用來檢測和處置這些具有放射活性的材料。另外，這種檢測只能測量與毒性無關的結合。
在M．Vanderlaan等的「環境化學-用於篩選二噁英汙染的環境樣品的免疫檢測的改進和應用」，環境毒理學和化學，vol．7，pp．859-70(1988)中，確定檢測樣品中二噁英樣化合物的水平是通過單克隆抗體與二噁英樣化合物自身結合的直接免疫檢測。同時參見M．Vanderlaan，「環境科技評論綜述-通過免疫檢測進行環境監測」，環境科技，vol．22，no．3，pp．247-54(1988)。這種檢測法並不是特別有用，因為它們不能區別結構可能相似的毒性和非毒性化學物質。
Gierthy的美國專利號4，904，595涉及一種上皮細胞系及其在體外生物檢測二噁英樣活性的應用。當暴露於二噁英時，與受致命劑量照射的3T3細胞共同培養的XBF細胞系被誘導發生形態改變，變為扁平鵝卵石樣，而與之對照的未經二噁英處理的培養細胞處於紡錠狀高密度狀態。
Vanderlaan等的美國專利號4，798，807公開了與二噁英樣化合物反應的單克隆抗體，以及使用這類抗體對這些化合物進行靈敏免疫檢測的方法。這些抗體在競爭免疫檢測中與二噁英樣化合物識別並結合。
Albro等的美國專利號4，238，472公開了一种放射免疫檢測方法，用於檢測環境樣品中的二噁英樣化合物。這種方法包括一抗與含有二噁英的樣品(經去汙劑乳化)結合，這種一抗可與二噁英和由放射活性I125標記的二噁英結合，形成抗體-I125-二噁英複合物。這使得標記的和未標記的二噁英與抗體競爭結合。複合物隨後與二抗反應形成含二噁英的沉澱，沉澱中的放射活性經分析並利用曲線確定樣品中的二噁英含量。
另一種檢測二噁英樣化合物的方法是由M．M．Stantostefano等提出的，「配體結構對大鼠細胞溶膠芳香烴受體體外轉化的影響」，生物化學和生物物理文獻，vol．297，no．1，pp．73-79(1992)。如同其論文中圖4所示，二噁英反應元件以及二噁英反應元件結合蛋白複合物的形成同應用凝膠移位分析中二噁英樣化合物的濃度是相關的。儘管這種方法具有科學意義，但它不適合於商業形式。
縱觀上述現有的檢測二噁英樣化合物的方法所存在的缺陷，仍然存在對適合商業、價廉而能準確檢測有毒的二噁英樣化合物的方法的需求。
發明概述本發明涉及一種檢測方法，即通過Ah受體的轉化檢測測試樣品中多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及表現出此類化合物生物學活性特徵的其結構類似物。該方法利用了由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白是處於無活性狀態的Ah受體。檢測樣品在一定條件下與異聚體接觸，以便使樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯等與Ah受體能有效地結合。這些配體與Ah受體的結合導致含有同配體結合的Ah受體的複合體從異聚體脫離，轉化為活性狀態。然後檢測含有結合有配體的轉化Ah受體的複合體的存在。
本發明的方法能通過任何一種已有的一些免疫檢測試劑盒形式進行操作。一種適合的形式是固相俘獲免疫檢測試劑盒，它包括異聚體、一種帶有能結合複合體區域的抗體和一種能檢測出抗體的標記物，以及固體載體。還有一種適合的形式是競爭免疫檢測試劑盒，它包括異聚體；一種結合物，其上帶有的第一區段能與固體載體結合，第二區段能與複合體結合；一種類似物，帶有能與結合物相結合的區段；一種能檢測出類似物的標記物；以及一種固體載體。另一種適合的形式是夾心免疫檢測試劑盒，它包括異聚體；一種結合物質，所具有的第一區段能與固體載體結合，第二區段能與複合體結合；一種抗體，所具有的一個區段能與帶有可被檢測的標記的複合體相結合；以及一種固體載體。
檢測能直接在野外進行，而且除了在所檢測的樣品中可能存在的外，不會有任何環境汙染物。樣品能在同一天進行檢測，許多空氣、水或泥土樣品的檢測結果能就地獲得報告。由於可以就地獲得結果，所以允許立即對補救效果進行評估。
附圖簡述

圖1為改進的固相俘獲免疫檢測試劑盒圖示。
圖2為蛋白印跡凝膠，顯示出抗MAPS抗血清321對小鼠肝細胞溶膠蛋白的識別情況。第5-11道和13道記述了在不同抗血清稀釋度下，對100k道爾頓大小無配體形式的Ah受體的抗血清識別。
圖3為蛋白印跡凝膠，顯示出抗MAPS抗血清377對小鼠肝細胞溶膠蛋白的識別情況。1、2和19道為經蛋白染色的蛋白標準，5和18道顯示經蛋白染色的細胞溶膠，而12到15道描述對100k道爾頓大小無配體形式的受體的抗血清識別。
圖4為蛋白印跡凝膠，證明對被TCDD轉化的Ah受體的特異免疫檢測。
圖5A顯示硝酸纖維素膜點雜交印跡，證明硝酸纖維素膜上TCDD-轉化Ah受體的俘獲和檢測。
圖5B為通過掃描圖5A的點雜交印跡獲得的TCDD密度對體積圖。
圖6顯示TCDD的光密度對劑量圖。
附圖和發明詳述本發明涉及一種檢測方法，即檢測測試樣品中多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及表現此類化合物生物學活性特徵的其結構類似物。該方法利用了由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白為無活性狀態的Ah受體。檢測樣品在一定條件下與異聚體接觸，以便使樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯等與Ah受體有效地結合。這些配體與Ah受體的結合導致含有同配體結合的活性Ah受體的複合體從異聚體脫離。然後檢測與配體結合的含有活性Ah受體的複合體的存在。
二噁英樣化合物與Ah受體結合以及導致活性Ah受體與配體結合從而脫離的過程稱為轉化。無活性的Ah受體作為形成細胞溶膠高分子量異聚體的至少3種蛋白之一存在。儘管異聚體的精確成分和結構尚未知曉，但據信熱休克蛋白90是另外一種組成蛋白。當配體與Ah受體結合後，Ah受體從複合體上脫離，然後經歷構象變化形成異二聚體複合體，其對陽離子交換劑和雙鏈DNA的親和力增加。這種激活Ah受體的過程基本上是不可逆的。在活細胞中，結合有配體的被激活Ah受體進入細胞核中，可能與一些基因的細胞核調控序列結合。其中一種這樣的序列已知為二噁英反應元件(″DRE″)，該元件同被激活的Ah受體間的相互作用據信可導致基因表達增強。儘管帶有二噁英樣化合物配體的Ah受體本身沒有毒性，但是這種因與二噁英反應元件結合而引起的基因表達增強，據信是對二噁英樣化合物產生毒性反應的基礎。轉化現象在G．P．Landers等的「綜述文章-Ah受體和二噁英毒性的機理」，生物化學雜誌，vol．26，pp．273-87(1991)和S．Safe的「多氯聯苯(PCBs)，二苯並二噁英(PCDDs)，二苯並呋喃(PCDFs)和相關化合物支持毒性當量係數(TEF)發展的環境和機械考慮」，毒理學，vol．21，pp．51-87(1990)中有更多的詳細討論。
對於本發明，包含Ah受體的異聚體能通過任何一種來源獲得。儘管異聚體在一些培養的人類組織和細胞中得到證實，它們包括肺、肝、腎、胎盤、B淋巴細胞和胸腺，然而更優選從其它易於獲得的哺乳動物中得到。異聚體在齧齒動物的肝臟、胸腺、肺臟、腎臟、腦、睪丸和骨骼肌細胞中均存在。特別優選的異聚體來源是哺乳動物的肝細胞細胞溶膠部分。例如，異聚體可通過分離雄性Hartley豚鼠的肝細胞溶膠而獲得，方法參照E．C．Henry等的「Ah受體多種形態的特點種屬和組織比較」，生物化學，286430-40(1989)，並且在玻璃或塑料試管中按5毫升的等份進行冷凍或凍幹。
本發明的方法用於對多種檢測樣品中二噁英樣化合物的檢測。這些檢測樣品可以是環境中分布的空氣、水或者土壤。此外，該檢測方法可以用於檢測人或動物體液(例如血液)中的二噁英樣化合物。
本檢測方法希望以任何常規的檢測試劑盒的形式實行。例如，免疫檢測可以採用固相俘獲、競爭或夾心免疫檢測。
固相俘獲免疫檢測試劑盒包括異聚體、一種能與複合體結合併帶有一種能被檢測的標記物的抗體，以及固體載體。固體載體可作為檢測試劑盒的一部分或與之分開出售。當採用本發明的檢測方法時，異聚體與檢測樣品相接觸。所產生的混合物與固體載體接觸，以便複合體與載體結合。當除去未結合的材料後，抗體同已被結合的活化Ah受體接觸。結果，抗體上面的標記就可以被檢測出來。
本發明特別優選的形式是，異聚體和檢測樣品的混合物可與親和基質接觸，以便使複合體與親和基質結合。當除去未結合的材料後，將複合體從親和基質上洗脫出來，然後與固體載體接觸並被吸收。經標記的抗體隨後同被吸收的複合體接觸以進行檢測。親和基質也可用於與複合體的結合，並因此在夾心和競爭形式中，將複合體與檢測樣品-異聚體混合物的殘餘物分開。在每種情況下，複合體可隨後從親和基質上洗脫，並且同固體載體進行接觸吸收。
競爭免疫檢測試劑盒包括異聚體；一種結合物，其上帶有的第一區段能與固體載體結合，第二區段能與複合體結合；一種類似物，帶有能與結合物的第二區段相結合的區段和一種能使類似物被檢出的標記物；以及一種固體載體。當在本發明的檢測方法中採用這種競爭免疫檢測試劑盒形式時，結合物同固體載體接觸以便前者與後者結合。然後，在導致類似物同檢測樣品和異聚體接觸所形成的複合體進行競爭的條件下，類似物與結合物相接觸而結合到結合物的第二區段上。通過這種競爭後，可進行檢測步驟。在此，複合體的出現是通過分析被標記的類似物進行間接檢測的。
夾心免疫試劑盒包括一種結合物，其上帶有的第一區段能與固體載體結合，第二區段能與複合體結合；異聚體；一種抗體，帶有能同含結合有配體的活性Ah受體的複合體相結合的區段和一種能使抗體被檢出的標記物；以及一種固體載體。在使用中，結合物與固體載體相接觸。當結合物同固體載體結合併且檢測樣品同異聚體結合後，檢測樣品和異聚體的混合物與固體載體相接觸。其結果是複合體同結合物的第二區段接觸。去除未結合的混合物後，標記抗體同已與固體載體結合的複合體相接觸。結果，抗體上的標記能被檢測出來。
在任何這些免疫檢測試劑盒形式中所使用的固體載體，可以是這類試劑盒通常所用的任何水不溶性或懸浮於水的固體材料。合適的例子有聚合膜、塑料或玻璃珠、試管、或微量滴定板。複合體中的結合物，含有結合有配體的活性Ah受體，它可通過共價結合或吸收被固體載體結合。當使用試管或微量滴定板時，這些結合發生在這些載體的內壁上。
在競爭和夾心免疫檢測試劑盒中，試劑盒可以組裝成結合物已同固體載體結合的產品。通過將結合物同固體載體連接，並且維持此類連接足夠的時間以便允許結合物上的第一區段結合到固體載體上，從而完成這類在固體載體表面的操作。一般，這類連接進行1-18個小時，優選4個小時。然後將未粘附的結合物與不可溶的結合物(即，結合到固體載體的結合物)分離，然後洗滌固體載體。
在所有這三種免疫檢測試劑盒形式中，檢測樣品和異聚體以彼此間互相接觸的方式放置，並且孵育足夠的時間以允許轉化。一般，這類轉化進行2小時。這類接觸之後讓檢測樣品和異聚體的混合物同固體載體相接觸較為理想。對於固相俘獲檢測，複合體直接同固體載體結合，而在競爭檢測或夾心免疫檢測中，複合體間接同固體載體結合(即，通過結合物)。對於本發明所有三類免疫檢測試劑盒的形式來說，當有充足時間進行孵育後，殘餘的檢測樣品和異聚體混合物從同固體載體結合的不可溶材料上脫離。隨後對不可溶的材料進行洗滌。
固相俘獲的標記抗體或者競爭免疫檢測試劑盒的標記類似物，在同結合於固體載體的不可溶材料接觸後，充分孵育維持這種接觸，以便被標記物間接結合到固體載體上。一般孵育1-18小時可充分結合，優選2小時。未結合的材料於是從不可溶的材料中分離，然後對不可溶的材料進行洗滌。
對於固相俘獲、競爭和夾心免疫檢測試劑盒的形式，需要標記的類似物或者抗體(依試劑盒而定)以檢測類似物或抗體間接結合到固體載體的程度。這種檢測優選包括標記材料的定量測定。對於固相俘獲來說，標記抗體直接同複合體相結合，從而使檢測步驟能直接確定所形成複合體的量。對於競爭免疫檢測試劑盒來說，實際檢測的標記類似物在沒有複合體的位點是不溶性的。因此，所形成的複合體的量必需通過所檢測的類似物的量間接地確定。標記物可以是與抗體或類似物結合的有色、螢光、化學發光、放射性或酶材料，或者是同第二結合物，例如結合有與複合體相互作用的結合物的抗體，結合的有色、螢光、化學發光、放射性或酶材料。
對於夾心和固相俘獲免疫檢測試劑盒，一種能結合到複合體的抗體被採用，該複合體含有結合有二噁英樣化合物配體的活性Ah受體。抗體可以是多克隆或單克隆形式。
一個特別優選的獲得檢測抗體的方法是合成下列由小鼠Ah受體N-末端修飾後的肽序列氨基-Cys-Nor-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Thr-Val-Lys-Pro-Ile-Pro-Ala-Glu-Gly-Ile-Lys-羧基SEQ．ID．NO．1注意Nor代表正亮氨酸。未純化的肽通過使用順丁烯二醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯與卵清蛋白偶聯，產物中每摩爾卵清蛋白偶聯有9到22摩爾肽。兔子隨後使用0．5到1mg量的抗原每間隔兩周進行免疫，8周後取血。從兔血中提取免疫血清。為了提純抗Ah抗體，肽(SEQ．ID．NO．1)通過其末端半胱氨酸的巰基同碘乙醯胺衍生柱共價結合。抗Ah受體N末端的抗體通過用上面提到的柱子進行親和層析而從血清中得到純化。優選的抗體標記是商用抗兔IgG鹼性磷酸酶共軛物。
對於競爭免疫檢測，一種能同結合物第二區段相結合的帶標記類似物得到採用。合適的類似物包括與鹼性磷酸酶偶聯的上述肽序列(即SEQ．ID．NO．1)。或者，類似物可以是一種抗原，具有相同免疫特性，並且在免疫學上和活化的Ah受體等價。參見Schuurs等的美國專利號Re 32，696，在此引作參考文獻。
合成標記類似物的優選方法是，採用硫代琥珀醯亞胺4-(N-順丁烯二醯甲基)環己烷-1-羧酸鹽，在肽的巰基和鹼性磷酸酶伯胺基之間將鹼性磷酸酶與肽序列(SEQ．ID．NO．1)偶聯。
在本領域中酶標記物為人熟知。這類標記物的實例包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸、β-半乳糖苷酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、尿素酶、葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、β-葡糖醛酸酶以及β-B-葡萄糖苷酶。這些標記物可通過將底物轉化為使用本領域眾所周知的設備進行比色、螢光和分光光度測量所能測量的產物進行檢測。這些儀器產生光密度值，通過與標準曲線的比較可以轉換為二噁英樣化合物的濃度。
或者，抗體或類似物能被直接標記。適宜的有色標記包括螢光、化學發光和比色。這類標記可用分光光度測定法或光密度分析法檢測。這些儀器產生的光密度值通過與標準曲線的比較可以轉換為二噁英樣化合物的濃度。
適合抗體或類似物的螢光標記包括螢光素、若丹明及其衍生物。這類標記可為螢光測定法檢測到。這些儀器產生的光密度值經過與標準曲線的比較可以轉換為二噁英樣化合物的濃度。
適合的化學發光標記包括魯米諾、異魯米諾、丫啶酯、硫酯、磺胺和菲啶酯。這類標記產生的光密度值通過與標準曲線的比較可以轉換為二噁英樣化合物的濃度。這類標記系統產生長效的發光。這種光可被光度計、光電倍增管和固態檢測儀檢測出來。
競爭和夾心免疫檢測兩者都使用結合物，它的第一區段能同固體載體結合，第二區段能同包含結合有二噁英樣化合物配體的活性Ah受體的複合體相結合。結合物優選選自抗體、二噁英反應元件和二噁英反應元件的一部分。
當結合物為抗體形式時，這類抗體可以是多克隆或單克隆的。結合物可包括被固體載體吸收或共價連接的小牛胸腺DNA，或者是被固體載體吸收或共價連接的特殊DNA。
特別優選利用二噁英反應元件或其一部分形成結合物。不同種屬細胞中二噁英反應元件的DNA序列已經得到了充分的研究。
在M．S．Dennison等的「大鼠肝細胞溶膠中轉化的Ah受體R同二噁英反應轉錄增強子的相互作用的特性」生物化學與生物物理學文獻，vol．284，pp．158-66(1991)中，以下的合成核苷序列被使用5』-GATCTGGCTCTTCTCACGCAACTCCG-3』 SEQ．ID．NO．25』-GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3』SEQ．ID．NO．3一旦被合成後，這些序列可退火形成雙鏈DNA序列。
T．A．Gasiewicz在「加速交流-α-萘黃酮通過與Ah受體形成失活的複合體作為一種2，3，7，8-四氯二苯並-對-二噁英的拮抗劑」，分子藥理學，40607-12(1991)中採用了下列的核苷序列5』-GATCCGGCTCTTCTCACGCAACTCCGAGCTCA-3』 SEQ．ID．NO．45』-GATCTGACTCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCG-3』 SEQ．ID．NO．5這些序列可退火形成Ah受體DNA結合形式的單核識別序列。採用通過下列核苷酸序列退火製備的DNA序列特別理想5』GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3』 SEQ．ID．NO．65』TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3』SEQ．ID．NO．7這兩個序列都使用DNA合成儀製備，其中後者使用5伯氨基修飾的C6-TFA進行合成。這個接頭在5』末端利用6碳間隔子提供伯胺。為了作進一步的化學修飾，這兩個核苷序列用20mM(3-[N-嗎啉代]丙磺酸緩衝液pH7．6加等摩爾量的1mM乙二胺四乙酸溶解，加熱到90℃5分鐘，冷卻至37℃過夜雜交。雜交的二噁英-反應元件然後共價偶聯到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠珠上。
其它的二噁英反應元件核苷酸序列在D．W．Nebert等的「小綜述-哺乳動物細胞色素P1-450(CYP1A1)基因的調控」，國際生物化學雜誌，vol．21，no．3，pp．243-52(1989)中被公開，在此引作參考文獻。
在本發明的固相俘獲免疫檢測的一種特別優選的方式中，採用了如圖1的裝置。這種裝置包括容器2，它帶有許多小的聚丙烯柱子4。柱子4有開放的末端並且在其每根底部都安有親和基質6。
在圖1中也顯示了固相俘獲單元8。固相俘獲單元8包含由諸如聚丙烯96孔平底板12組成的俘獲膜容器1O，平底板每個孔底部有開口。組成俘獲膜14的硝酸纖維素圓片粘合在這些孔上。帶有真空岐管出口18的容器16被設計用於安置在俘獲膜容器10的下部。
在應用時，含有包含未活化Ah受體的異聚體的細胞溶膠，與可能含有二噁英樣化合物的檢測樣品混合。當混合物孵育幾個小時後，被注入容器2中的每個柱子4中。流出物穿過柱子流到廢物容器裡(未顯示)。
當親和基質柱被檢測樣品和細胞溶膠的混合物處理後，放柱子4的架子2被放置在俘獲膜容器8的上面，每個柱子4的底端都分別伸到板12的一個孔中，如圖1所示。結合有二噁英樣化合物配體的活性Ah受體隨後被從親和基質6上洗脫，並與俘獲膜14相結合。多餘的液體經真空岐管18從俘獲膜14上抽走。標記的抗體於是能被加在俘獲膜上，以便能檢測帶有二噁英樣化合物配體的活性Ah受體的存在。
而且，親和基質6可在本發明中的夾心和競爭免疫檢測形式中應用。同上述在固相俘獲形式中描述的內容基本一致，親和基質同檢測樣品與異聚體形成的混合物接觸，以便使複合體結合到基質上。結合後的複合體然後從基質上洗脫，與固體載體接觸並被固體載體所吸收。
本發明的免疫檢測具有許多潛在的用途。這種檢測的其中一個用途是一步法確定毒性當量係數(″TEF″)。TEF用於度量Ah受體-依賴毒素的潛在毒性，並可被用於對這種化合物的危險和風險評估。該檢測可被用於篩選抗雌激素藥物，用於哺乳動物的腫瘤治療。該檢測還可被用於篩選潛在的天然或合成TCDD拮抗劑，它們可能具有作為抗促進劑或癌症預防的潛能。它可對藥物或農用化學品中二噁英樣毒性進行快速篩選。在基礎研究中，該檢測可作為研究人類細胞系中影響Ah受體轉化的細胞事件的試驗的終點，該試驗是為了了解人類對二噁英樣化合物的易感性。該檢測能被用於確定人類或動物組織和細胞對TCDD與二噁英樣化合物的暴露狀況，人類Ah受體對TCDD和PCBs的反應，以及惡性細胞中Ah受體的水平。
實施例實施例1化學製品所有的化學製品均從商業途徑購買，並且是所能獲得的最高純度。
抗原合成與抗血清生產多抗原肽合成(MAPS)如Poland等報導的以Ah受體的NH2末端部分為基礎，分子藥理學，vol．39，pp．20-26，(1990)。MAPS抗原包括人工合成的肽H2N-LYS-ARG-ARG-LYS-PRO-VAL-GLY-COOH，作為SEQ IDNO8，通過肽的羧基端結合到七賴氨酸分支上。肽與七賴氨酸的比例為8∶1。經胺基酸分析，抗原的純度按重量為38％。抗原由TAES實驗室，Entomology Department，Texas AM University，College Station，TX77843依照合約合成。
粗抗原以2mg／ml的濃度溶於磷酸鹽緩衝液中，並且按0．5ml的等份同等體積的弗氏完全佐劑(用於初次免疫接種)或弗氏不完全佐劑(用於後繼免疫接種)混合。免疫接種包括對Flemish Giant／Chinchilla雜交兔進行1ml(380μg抗原)皮下注射。免疫接種程序如下在第0，21，35和49天注射，第63天採血。免疫接種和採血由Cornell動物資源研究部，Cornell University，Ithaca，NY 14853按合約實行。
血液在10℃凝固過夜，並且血清在IEC centra-7離心機中經2次2900 RPM 20分鐘離心得到分離。以1ml的等份在-80℃冷凍備用。
小鼠肝細胞溶膠從雌性C57BL／6小鼠中製備。小鼠由Jackson實驗室(Bar Harbor，ME)獲得。實驗使用4到6周齡、體重大約16到20克的雌性小鼠進行。小鼠以Prolab RMH 1000大鼠、小鼠、倉鼠食物(Agway，Cortland，NY)餵養並隨意接受管道供水。所有小鼠每個籠子放養3到5隻而且維持12小時的光照周期。小鼠被處死後肝臟灌注含1．15％KCL的MENG緩衝液。肝細胞溶膠部分通過在3倍體積的MENG緩衝液(Poland等，分子藥理學，vol．39，20-26(1990)，在此引作參考文獻)中將肝臟勻漿進行製備。隨後9000xg離心20分鐘，上清(S-9)在100，000xg離心60分鐘，所產生細胞溶膠部分仔細移出然後迅速放於-80℃凍存。
免疫印跡十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳的方法依照Laemmli，U．K．，1970，嗜菌體T4頭部裝配時結構蛋白的切割，自然227680-685。溶解蛋白轉移到聚二氟乙烯膜是依照(Towbin等，1979，蛋白從聚丙烯醯胺凝膠到硝酸纖維素試紙的電泳轉移方法與一些應用。美國國家科學院院刊764350-4354)。對聚二氟乙烯膜上抗原蛋白的免疫檢測是依據Poland等．(1990)。
結果在圖2中1-3道和20-22道代表經蛋白染色的蛋白標準。標準(從上到下)為116、97．4、66和45k道爾頓。4和19道為染色前的蛋白標準，從上到下分別為205，116．5，80和49．5k道爾頓。細胞溶膠總蛋白染色顯示在5和18道。所有其它的道為抗血清進行的免疫染色。
使用以下抗血清(經稀釋)。抗-MAPS 321-1(1∶1)在6和7道，抗-熱休克蛋白90(HSP90，Source)(1∶500)在8道，抗-MAPS 321-2(1∶11)在10和11道，抗-MAPS 321-2(1∶50)在12和13道，抗-MAPS 321-2(1∶250)在14和15道，抗-MAPS 321-2(1∶1000)在16和17道。結果顯示，第二次採血的兔321產生的抗體能在1∶50滴度時識別100k道爾頓的未轉化狀態的Ah受體。
圖3中1、2和19道代表經蛋白染色的蛋白標準。所代表的分子量為116、97．4、66和45k道爾頓。在3和18道染色前的標準代表的分子量為205、116．5、80和49．5k道爾頓。經蛋白染色的細胞溶膠在4和17道。所有其它道為抗血清的免疫染色。使用以下抗血清(經稀釋)抗-MAPS 377-2(1∶250)在6和8道，抗-MAPS 377-2(1∶50)在9和10道，抗-MAPS 377-2(1∶11)在11和16道，抗-MAPS 377-1(1∶11)在13道，以及抗-HSP90(1∶500)在14和15道。這些結果表明，在第二次採血時，兔377產生的抗體能在1∶250滴度時識別100k道爾頓未轉化狀態的Ah受體。
抗血清321-2和377-2針對Ah受體N末端的胺基酸序列，它們都能識別同TCDD或二噁英樣化合物相互作用前所存在的Ah受體。通過對空氣、水或土壤環境提取物中所存在的未轉化Ah受體進行定量分析，這類抗血清能被於檢測二噁英樣化合物。定量可通過以前所描述的方法採用ELISA技術完成。
實施例2本實施例參見圖1。
抗-043多克隆抗血清是通過SEQ．ID．NO．1的肽經順丁烯二醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯與卵清蛋白偶聯，產物中載體上偶聯有9到22摩爾肽，然後接種兔子進行製備。兔子用0．5到1mg抗原，以每兩周間隔進行接種，8周後採血。免疫血清從兔血中獲得，並在經SEQ．ID．NO．1的肽同碘乙醯胺衍生凝膠珠結合形成的親和柱上得到純化。
二噁英反應元件(DREs)通過寡核苷酸SEQ．ID．NO．6(166nmoles)與5』末端含有N-TFA-C6接頭的序列7雜交產生。這些寡核苷酸溶於20mM(3-[N-嗎啉代]丙磺酸緩衝液pH7．6加1mM乙二胺四乙酸中，加熱至90℃5分鐘，然後冷卻至37℃過夜雜交。雜交產生的二噁英反應元件於是按照下面的方法同溴化氰活化的瓊脂糖凝膠珠共價結合。幹珠子(1．14克)置於連接於真空吸出器的閃爍玻璃管道中。這些珠子隨後經洗滌而膨脹，洗滌時依次使用冰冷的250ml 1mM HCL，冷的300ml去離子水，以及冷的40ml 10mM磷酸鉀緩衝液pH8．0。載有DREs的珠子然後在室溫下輕柔振蕩孵育16小時。這些珠子隨後用200ml水和100ml1M乙醇胺pH8洗滌，重新懸浮於5．6ml乙醇胺緩衝液中，室溫振蕩孵育6小時。珠子接著用100ml水、100ml 10mM磷酸鉀緩衝液pH8．0、100ml1M磷酸鉀pH8．0，100ml 1M KCl以及100ml 10mM含0．3M NaCl、1mM乙二胺四乙酸、0．02％疊氮化鈉的Tris(羥甲基)氨基甲烷-HCl(pH7．6)進行洗滌。所產生的親和基質在10ml注射器筒中形成兩個2．4ml柱床體積的開放柱，並且在4℃保存。
雄性Hartley豚鼠(300-350克)獲自Charles River。肝臟用冰冷的含有1．15％KCl的HEDG緩衝液(25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N』-[2-乙烷磺酸]，1．5mM乙二胺四乙酸，1．0mM二硫蘇糖醇，pH7．6)灌注，並且用5倍體積(重量／體積)的HEDG緩衝液在冰上勻漿。肝臟被勻漿，然後提取物12，500xg離心20分鐘。接著上清以100，000xg再次離心60分鐘，然後將上清(肝細胞溶膠)在-80℃冷凍。
來自豚鼠的細胞溶膠(5ml)用5μl含有10μM的2，3，7，8-四氯二苯並-對-二噁英(TCDD)的二甲基亞碸(終濃度=10nM)或5μl二甲基亞碸處理，在室溫下孵育2小時。細胞溶膠接著用500μl含活性炭(10％)／右旋糖苷(1％)的HEDG緩衝液在冰上孵育15分鐘，以去除未結合的TCDD。活性炭／右旋糖苷通過將細胞溶膠穿過0．45μm聚碸濾膜得到濾除。過濾後的細胞溶膠接著穿過親和基質柱，隨後是2x4ml HEDG、2x4ml HEDG加350mM NaCl以及2x4ml HEDG加600mM NaCl。最後的洗滌物被收集，同時分別添加含有800μg牛血清蛋白的800μl水，隨後是8．8ml 20％的冰冷三氯乙酸。蛋白在冰上沉澱30分鐘，然後在臨床離心機上離心30分鐘。棄去上清，將沉澱溶於100μl 1M TRIS pH8．0、400μl水和500μl2x樣品緩衝液中(5mM Tris，0．05％溴酚藍，2％巰基乙醇，2％十二烷基硫酸鈉，10％甘油，pH6．8)。被溶解的蛋白通過煮沸5分鐘進行變性，每100μl經十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(Laemmli，1970)並依據Towbin等(1979)在聚二氟乙烯膜上進行印跡分析。蛋白標準跑相鄰的泳道。含有蛋白標準的泳道用含0．1％醯胺黑10B的7％醋酸染色，然後用7％的醋酸脫色。含有柱子洗脫液的泳道在封閉緩衝液(含5％脫脂奶粉的TBST(50mM TRIS，150mM NaCl，0．02％吐溫20，pH7．5))中孵育。孵育條件為50ml和1小時。印跡然後用40ml抗043抗血清(在封閉緩衝液中佔0．1％)進行探針檢測1小時。接著在100ml TBST中洗3遍，每次5分鐘，然後同40ml含0．1％抗兔IgG／鹼性磷酸酶共軛物的封閉緩衝液孵育一小時，用100ml TBST洗2次，每次5分鐘，用100ml無吐溫20的TBST洗一次，5分鐘，並用鹼性磷酸酶顯影緩衝液(5．5克Trizma鹼，0．8克Trizma-HCL，2．9克NaCl，5．1克MgCl2-6H2O)短暫衝洗。印跡用含3．3mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸和6．6mg氮藍四唑的20ml鹼性磷酸酶顯影緩衝液顯影5分鐘，用水洗滌數遍，然後進行乾燥。
在圖4中，A道加載來自溶劑處理後的細胞溶膠的親和基質洗脫液。B道加載10nM TCDD處理後的細胞溶膠的親和基質洗脫液。C道加載分子量標準，在垂直欄中標為kD。
其結果如圖4所示，證明抗043抗血清檢測出柱洗脫液中一條單獨的蛋白帶。該蛋白的出現依賴於TCDD，因為它在TCDD處理的樣品中出現，而在溶劑處理的樣品中不出現。所估計的分子量(大約105kD)與豚鼠Ah受體相同。它同二噁英反應元件結合，如同對轉化的Ah受體所預測的那樣。它可被所製備的哺乳動物Ah受體中特殊保守序列的抗血清所識別。因此，這些結果證明，用二噁英樣化合物處理細胞溶膠，然後分離並對轉化的Ah受體進行免疫檢測，能夠檢測二噁英樣化合物的存在。進一步，對單條TCDD反應帶的免疫檢測提示，該方法對檢測轉化的Ah受體是特異的，並且能改進為簡單的免疫檢測試劑盒，而不需要分辨無關的免疫反應蛋白。
實施例3本實施例參見圖5。除以下改變外，在方法學上與實施例2相同。來自親和基質的8ml等份的(每份2ml，TCDD和溶劑處理的樣品)、600mMNaCl洗脫液用0．5ml甲醇稀釋。平行的0，50，100，200或400μl樣品在硝酸纖維素膜上點印跡，並用真空管使液體穿過膜。該膜隨後用抗043抗血清進行探針檢測，然後依照實施例2進行顯影。膜隨後被Microtek 600ZS型掃描儀以300dpi、亮度-18％和對比度0％的條件掃描。光密度測量是在Macintosh Iisi計算機上使用BioSoft，Cambridge，United Kingdom的Scan Analysis 2．21軟體進行。
在圖5中，所給體積與原始細胞溶膠製品體積相同。(-)溶劑處理細胞溶膠，(+)10nM TCDD處理細胞溶膠。圖5A表示硝酸纖維素膜經染色顯示出轉化的Ah受體。圖5B為通過掃描圖5A的點印跡獲得的平均密度數值。網格柱溶劑對照。實心柱10nM TCDD處理。
結果表明，硝酸纖維素有效地俘獲轉化的Ah受體，並且背景低。增加TCDD處理樣品的體積產生可被肉眼看到的增強顯色，而增加溶劑處理樣品的體積沒有顯示出或顯示出極小的染色。在50到200μl上樣量的範圍內，可以看到很好的敏感性和線性俘獲。這些結果表明，應用硝酸纖維素作固體載體，並用真空管使樣品穿透膜，這種固相俘獲檢測形式是可行的。此外，該方法快速並容易顯現出膜上的不溶性持久顯色，這提示它不需要分光光度設備，對於現場快速半定量檢測是一種適合的方式。
實施例4本實施例參見圖6。除以下改變外，在方法學上與實施例2相同。親和基質柱依照實施例2所描述的方法製備，但是在1ml結核菌素注射器筒中是形成多個100μl柱床體積的柱子。細胞溶膠(500μl)轉化使用不同的量(0，0．016，0．08，0．4，2，10nM；分別對應於0，13，64，320，1600pg的TCDD)。當樣品加載到小柱子中後，用2x160μlHEDG、2x160μlHEDG加350mM NaCl以及2x160μl HEDG加600mM NaCl進行洗滌。收集最後的洗滌物，加入32μg牛血清白蛋白和350μl 20％的三氯乙酸，蛋白沉澱經分離並用前述的SDS-PAGE和印跡法分析。印跡按以前的方法進行探針檢測，直到最後一步檢測。此時，Ah受體位置的條帶由印跡處切離，放在檢測試管中。另外，同樣的對照條帶也被切下(只加載樣品緩衝液的道)。對每個條帶，加入300μl含1mg／ml對硝基苯磷酸的二乙醇胺緩衝液(1mM MgCl2-6H2O，50mM二乙醇胺，0．02％NaN3，pH9．8)，均在室溫孵育1小時。有色溶液隨後吸入96孔ELISA板中，在405nm波長讀取O．D值。數據減去對照值。
圖6顯示TCDD的劑量效應。誤差棒代表標準差(除了13pg處理的樣品為n=2外，所有的樣品均為n=3)。
結果指出，1)小體積的細胞溶膠和小的親和基質柱子可以用於檢測，2)可溶的鹼性磷酸酶對硝基苯磷酸能夠用於檢測，以便定量檢測反應能夠利用ELISA讀數儀實行。此外，本實驗的檢測極限為0．08nM或13pg，此處檢測反應已經飽和超出。
實施例5除了每個樣品所處理細胞溶膠的體積從500μl增加到800μl，並且TCDD的劑量範圍採用0，0．0032，0．016，0．08，0．4和2nM，在方法學上與實施例3相同。顯示不同TCDD濃度的光密度的結果數據列於下表1。
表1nM TCDDO．D．@405nmx10002．0 214±52．1 *0．4 156±69．5 *0．08 166±84．1 *0．016 132±45．2 *0．0032 54±25．10-53±79．6*同0nM劑量存在顯著差異，雙尾t檢驗@p=0．05，n=3結果顯示，與實施例3相似，該反應基本上在0．08和2nM之間飽和。然而，增加細胞溶膠的量可以檢測到0．016nM或5pg的TCDD。
雖然為闡述本發明本文已作了詳細介紹，但應當理解這種細節僅為介紹目的，本領域的技術人員可在不背離本發明的精神和範圍的前提下對其加以變通，本發明的範圍由所附權利要求書限定。
序列表
(1)一般資料(i)申請人Cornell Research Foundation，Inc．(ii)發明名稱被二噁英樣化合物轉化的Ah受體的免疫測定(iii)序列數目8(iv)通信地址(A)收件人Nixon，Hargrave，DevansDoyle LLP(B)街道Clinton Square，P．O．Box 1051(C)城市Rochester(D)州New York(E)國家U．S．A．(E)郵編14603(v)計算機可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS／MS-DOS(D)軟體PatentIn Release #1．0，Version #1．25(vi)當前申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師／代理人資料(A)姓名Goldman Mr．，Michael L．(B)登記號30，727(C)參考／摘要號19603／00013(ix)電訊資料(A)電話(716)263-1304(B)傳真(716)-263-1600(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特性(A)長度22胺基酸(B)類型胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Xaa Arg Lys Arg Arg Lys Pro Val Gly Lys Thr Val Lys Pro1 5 10 15Ile Pro Ala Glu Gly Ile Lys20(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特性(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2GATCTGGCTC TTCTCACGCA ACTCCG 26(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特性(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCCGGAGT TGCGTGAGAA GAGCCA 26(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特性(A)長度32鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCCGGCTC TTCTCACGCA ACTCCGAGCT CA 32(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特性(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCTGACTC GGAGTTGCGT GAGAAGAGCC G 31(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特性(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6GATCCGGAGT TGCGTGAGAA GAGCCA26(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特性(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構未知(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7TGGCTCTTCT CACGCAACTC CGGATC 26(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特性(A)長度7胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Arg Arg Lys Pro Val Gly1權利要求
1．一種用於檢測測試樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物的方法，包括提供一種由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白為無活性狀態的Ah受體；檢測樣品在一定條件下與異聚體接觸，使樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物作為配體與Ah受體有效地結合，從而導致含有同配體結合的活性Ah受體的複合體從異聚體脫離；並且檢測所出現的含有同配體結合的活性Ah受體的複合體。
2．根據權利要求1的方法，其中異聚體為固相俘獲免疫檢測試劑盒的一部分，該試劑盒包括一種固體載體；所述異聚體，其中從所述的異聚體脫離的含有同配體結合的活性Ah受體的複合體能夠結合到所述的固體載體上；以及一種帶有能結合複合體的區段的抗體，其中所述的抗體帶有一種能在所述檢測中檢測出所述抗體的標記物，其中所述的方法進一步包括使複合體同所述的固體載體相接觸，藉此複合體結合到所述固體載體上，並且將所述抗體同與所述固體載體結合的複合體相接觸。
3．根據權利要求1的方法，其中異聚體為競爭免疫檢測試劑盒的一部分，該試劑盒包括一種固體載體；一種結合物，其上帶有的第一區段能與所述固體載體結合，第二區段能與含有同配體結合的活性Ah受體的複合體相結合；所述異聚體；以及一種類似物，所帶的一個區段能同所述結合物的第二區段相結合，其中所述類似物帶有一種能在所述檢測中檢測出所述類似物的標記物，其中所述方法進一步包括使所述結合物同所述的固體載體相接觸，藉此所述結合物結合到所述固體載體上，並且在導致所述類似物與複合體競爭從而結合到結合物的第二區段的條件下，將所述類似物同與所述固體載體結合的所述結合物相接觸，其中所述檢測在所述類似物與所述結合物結合後進行。
4．根據權利要求1的方法，其中異聚體為夾心免疫檢測試劑盒的一部分，該試劑盒包括一種固體載體；一種結合物，其上帶有的第一區段能與所述固體載體結合，第二區段能與含有同配體結合的活性Ah受體的複合體相結合；所述異聚體；以及一種抗體，所帶的一個區段能與包含結合有配體的活性Ah受體的複合體相結合，其中所述的抗體帶有一種能在所述檢測中檢測出所述抗體的標記物，其中所述方法進一步包括使所述結合物同所述的固體載體相接觸，藉此所述結合物結合到所述固體載體上，使複合體與同所述固體載體結合的所述結合物相接觸，並且在進行所述檢測前，使所述抗體同結合到結合物第二區段的複合體相接觸。
5．根據權利要求4的方法，其中所述結合物為一種抗體。
6．根據權利要求4的方法，其中所述結合物為二噁英反應元件或其一部分。
7．根據權利要求1的方法，其中所述檢測提供對複合體的定量測量。
8．根據權利要求1的方法，其中檢測樣品為一種選自空氣、水和土壤的環境基質。
9．根據權利要求1的方法，其中複合體由結合有配體的活性Ah受體組成。
10．根據權利要求1的方法，其中異聚體存在於哺乳動物肝細胞的細胞溶膠部分。
11．一種夾心免疫檢測試劑盒，用於檢測測試樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物，包括一種結合物，具有能結合固體載體的第一區段和能結合複合體的第二區段，該複合體所含的活性Ah受體結合有選自多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯或者能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物的配體；一種由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白為無活性狀態的Ah受體，其中所述的異聚體同含有選自多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物的配體的檢測樣品接觸時，經過轉化，藉此配體與Ah受體結合，導致含有結合有配體的活性Ah受體的複合體從異聚體脫離；以及一種抗體，其一個區段能同包含結合有配體的活性Ah受體的複合體相結合，其中所述的抗體帶有一種能檢測出所述抗體的標記物。
12．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，其中所述的結合物是一種抗體。
13．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，其中所述的結合物為二噁英反應元件或其一部分。
14．根據權利要求13的夾心免疫檢測試劑盒，其中所述二噁英反應元件通過將下列核苷酸序列退火而製備5』GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3』 SEQ．ID．NO．65』TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3』 SEQ．ID．NO．7
15．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，其中複合體由結合有配體的活性Ah受體組成。
16．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，其中異聚體存在於哺乳動物肝細胞的細胞溶膠部分。
17．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，其中標記物為與所述抗體結合的有色、螢光、化學發光、放射性或酶材料。
18．根據權利要求11的夾心免疫檢測試劑盒，進一步包括一種固體載體。
19．根據權利要求18的夾心免疫檢測試劑盒，其中所述的結合物與所述固體載體結合。
20．一種競爭免疫檢測試劑盒，用於檢測測試樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物，包括一種結合物，具有能結合固體載體的第一區段和能結合複合體的第二區段，該複合體所含的活性Ah受體結合有選自多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯或者能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的結構類似物的配體；一種由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白為無活性狀態的Ah受體，其中所述的異聚體在與含有選自多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物的配體的檢測樣品接觸時，經過轉化，藉此配體與Ah受體結合，導致含有結合有配體的活性Ah受體的複合體從異聚體脫離；以及一種類似物，其一個區段能同所述的結合物相結合，其中所述的類似物帶有一種能檢測出所述類似物的標記物。
21．根據權利要求20的競爭免疫檢測試劑盒，其中異聚體存在於哺乳動物肝細胞的細胞溶膠部分。
22．根據權利要求20的競爭免疫檢測試劑盒，其中複合體由結合有配體的活性Ah受體組成。
23．根據權利要求20的競爭免疫檢測試劑盒，其中標記物為與所述抗體結合的有色、螢光、化學發光、放射性或酶材料。
24．根據權利要求20的競爭免疫檢測試劑盒，進一步包括一種固體載體。
25．根據權利要求24的競爭免疫檢測試劑盒，其中所述結合物同所述固體載體相結合。
26．根據權利要求20的競爭免疫檢測試劑盒，其中所述結合物選自一種抗體、一種二噁英反應元件和二噁英反應元件的一部分。
27．根據權利要求26的競爭免疫檢測試劑盒，其中所述二噁英反應元件通過將下述核苷酸序列退火而製備5』GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3』SEQ．ID．NO．65』TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3』SEQ．ID．NO．7
28．一種固相俘獲免疫檢測試劑盒，用於檢測測試樣品中的多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物，包括一種由多種蛋白形成的異聚體，其中一種蛋白為無活性狀態的Ah受體，其中所述的異聚體在與含有選自多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃、多氯聯苯及能表現多氯二苯並二噁英、多氯二苯並呋喃和多氯聯苯生物學活性特徵的其結構類似物的配體的檢測樣品接觸時，經過轉化，藉此配體與Ah受體結合，導致含有結合有配體的活性Ah受體的複合體從異聚體脫離，其中複合體能結合到固體載體上；以及一種抗體，它的一個區段能同複合體相結合，其中所述抗體帶有一種能檢測出所述抗體的標記物。
29．根據權利要求28的固相俘獲免疫檢測試劑盒，其中異聚體存在於哺乳動物肝細胞的細胞溶膠部分。
30．根據權利要求28的固相俘獲免疫檢測試劑盒，其中複合體由結合有配體的活性Ah受體組成。
31．根據權利要求28的固相俘獲免疫檢測試劑盒，其中標記物為與所述抗體結合的有色、螢光、化學發光、放射性或酶材料。
32．根據權利要求28的固相俘獲免疫檢測試劑盒，進一步包括一種固體載體。
33．根據權利要求32的固相俘獲免疫檢測試劑盒，進一步包括一種多孔平板，每個孔底都有所述固體載體，其中所述固體載體是滲透性的膜。
34．根據權利要求33的固相俘獲免疫檢測試劑盒，進一步包括多個親和柱，帶有開放的埠，並且每根柱子在埠之間都具有由一種結合材料構成的親和層，其中柱子的安放使其一端位於所述平板的一個孔中，從而使由親和層洗脫的物質進入孔中。
全文摘要
本發明涉及一種在檢測樣品中檢測出二噁英樣化合物的方法。檢測樣品與一種由多種蛋白形成的異聚體接觸,其中一種蛋白是活性Ah受體。如果檢測樣品中存在二噁英樣化合物,它們將與Ah受體結合,導致後者脫離異聚體,形成含有活性Ah受體與二噁英樣化合物配體結合的複合體。然後檢測複合體的存在。本發明的方法可通過利用固相俘獲、競爭和夾心免疫檢測試劑盒的形式進行。
文檔編號G01N33/538GK1205035SQ95198008
公開日1999年1月13日 申請日期1995年10月31日 優先權日1995年10月31日
發明者G·D·維羅克, J·G·巴比斯 申請人:康乃爾研究基金會有限公司