調節腫瘤壞死因子α的組合物和方法

2023-06-02 17:13:56 1

專利名稱：調節腫瘤壞死因子α的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及與白介素-18可誘導的細胞因子有關的組合物和方法，該細胞因子稱為腫瘤壞死因子α誘導因子(TAIF)或白介素-32(IL-32)。具體地說，本發明部分地通過調節腫瘤壞死因子α表達，提供治療自身免疫病和癌症的組合物和方法。
背景技術：
類風溼性關節炎(RA)是一種常見的慢性炎性關節炎，侵襲著全世界約1％的成年人，女性佔大多數，高峰期出現在生命中的第4個十年(參見Firestein，「Rheumatoid Arthritis，」載於Scientific AmericanMedicine，2000；和Cohen，「Systemic Autoimmunity，」載於Paul(編輯)Fundamental Immunology，Lippincott-Raven PublishersPhiladelphia，1067-1088頁，1999)。重度炎症出現在滑膜關節，滑膜受到單核吞噬細胞、淋巴細胞和中性白細胞的浸潤，引起顯著的關節疼痛。另外，RA患者一般在關節附近出現軟骨和骨丟失，導致活動性下降。
儘管RA的成因還未準確界定，但該病的各種特徵表明了RA病因學的自身免疫成分。具體地說，巨噬細胞和成纖維細胞衍生的細胞因子在類風溼性關節中大量表達(Firesteinet al.，J Immunol，1443347，1994)。腫瘤壞死因子α(TNFα)和白介素-1(IL-1)似乎是主要病因，因為二者可誘導滑膜細胞增殖、膠原酶產生和前列腺素釋放，同時過表達可在動物模型中誘導關節炎(Firestein，出處同上，2000)。IL-18還存在於RA關節中，可直接活化巨噬細胞，以產生促炎細胞因子(Gracieetal.，J Clin Invest，1041393，1999)。
目前的RA療法專注於止痛、控制炎症和改變病程。現在經常採用更積極的治療方法，RA患者需要快速地將非甾族抗炎藥物(NSAID)轉換為二線藥物如氨甲蝶呤。不幸的是，單獨的氨甲蝶呤在多數患者中不足以控制RA，促使醫生選擇附加療法或一系列單藥(Firestein，出處同上，2000)，例如來氟米特、柳氮磺吡啶或TNF抑制劑。在RA治療方面取得了一些成績的已用TNF抑制劑包括TNF-反應性單克隆抗體(英夫利昔單抗/REMICADE和阿達木單抗/HUMIRA)和可溶性TNF-受體/免疫球蛋白融合蛋白(依那西普/ENBREL)。但是，需要為臨床醫師提供單獨使用或作為雞尾酒療法的其它療法，以終止該衰老性疾病的發展。
發明概述本發明涉及與白介素-18可誘導的細胞因子有關的組合物和方法，該細胞因子稱為腫瘤壞死因子α誘導因子(TAIF)或白介素-32(IL-32)。具體地說，本發明部分地通過調節腫瘤壞死因子α表達，提供治療自身免疫病和癌症的組合物和方法。
本發明提供純化的核酸，其含有的序列與SEQ ID NO15至少80％相同，其中所述序列編碼白介素-32(IL-32)，其中所述序列含大致緊密相連的IL-32的外顯子3和外顯子4。在某些優選實施方案中，IL-32是含SEQ ID NO7列出的胺基酸序列的α同種型；含SEQ IDNO8列出的胺基酸序列的β同種型；或含SEQ ID NO10列出的胺基酸序列的δ同種型。在其它實施方案中，該序列沒有IL-32的內含子4，而在特別優選的實施方案中，該序列與SEQ ID NO15至少90％相同。本發明還提供純化的核酸，其含有選自SEQ ID NO3、SEQ IDNO4和SEQ ID NO6的序列。在某些實施方案中，該序列與異源啟動子有效連接。在優選實施方案中，核酸包含在載體中。而且，本發明提供含該載體的宿主細胞。
另外，本發明提供由核酸編碼的純化蛋白，所述核酸含有的序列與SEQ ID NO15至少80％相同，其中所述序列編碼白介素-32(IL-32)，其中所述序列含大致緊密相連的IL-32的外顯子3和外顯子4。在某些優選實施方案中，IL-32是含SEQ ID NO7列出的胺基酸序列的α同種型；含SEQ ID NO8列出的胺基酸序列的β同種型；或含SEQ ID NO10列出的胺基酸序列的δ同種型。在其它實施方案中，IL-32不是γ同種型，而在優選實施方案中，IL-32不含SEQ ID NO14列出的胺基酸序列。在某些優選實施方案中，IL-32是在選自細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞的細胞中表達的重組蛋白。在這些實施方案的子方案中，重組蛋白為融合蛋白。
本發明還提供結合IL-32的抗體。在某些優選的實施方案中，抗體為單克隆抗體，而在其它實施方案中，提供單克隆抗體的Fab片段。在某些實施方案中，單克隆抗體(mAb)選自但不限於32-4和32-9。生產32-4單克隆抗體的雜交瘤細胞保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209。同樣，生產32-9單克隆抗體的雜交瘤細胞也保藏於ATCC。另外，在某些優選實施方案中，單克隆抗體選自但不限於嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體和人單克隆抗體。在實施方案的子方案中，單克隆抗體抑制IL-32誘導的靶細胞生產TNFα、抑制靶細胞中的IL-32誘導的IκB降解和/或抑制靶細胞中的IL-32誘導的p38 MAPK快速磷酸化。
而且，本發明提供誘導TNFα產生的方法，其包括在適於誘導TNFα產生的條件下使至少一種細胞與IL-32蛋白接觸。在優選實施方案中，IL-32蛋白選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型。在某些實施方案中，至少一種細胞包括白細胞，而在這些實施方案的子方案中，白細胞選自單核細胞和巨噬細胞。
本發明還提供治療受試者的方法，其包括提供受試者和結合IL-32的抗體；和將抗體給予受試者。在優選實施方案中，IL-32選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型。在特別優選的實施方案中，受試者患有、疑似患有自身免疫病，或具有自身免疫病風險。在某些實施方案中，自身免疫病選自但不限於多發性硬化、重症肌無力、自身免疫性神經病、自身免疫性葡萄膜炎、Crohn病、潰瘍性結腸炎、原發性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自身免疫性血小板減少、1型糖尿病、Grave病、Hashimoto甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、顳動脈炎、抗磷脂綜合症、血管炎、Behcet病、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、脊椎關節病、Sjogren綜合症、牛皮癬、皰疹樣皮炎、尋常型天皰瘡和白癜風。本發明提供抗體，其選自但不限於人單克隆抗體和人源化小鼠單克隆抗體。在優選實施方案中，在適於減輕自身免疫病的至少一種症狀的條件下進行給予。
而且，本發明提供篩選IL-32抑制劑的方法，其包括提供IL-32蛋白和至少一種藥物侯選物；分析該藥物侯選物對IL-32蛋白的至少一種活性的作用。在某些實施方案中，IL-32蛋白是選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型的重組蛋白。在優選實施方案中，藥物候選物選自但不限於IL-32反應性單克隆抗體和顯性失活IL-32變體。在特別優選的實施方案中，IL-32蛋白的至少一種活性包括上調TNFα表達。
本發明還提供治療受試者的方法，其包括提供受試者和IL-32蛋白；和給予受試者IL-32蛋白。在優選實施方案中，IL-32蛋白為選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型的重組蛋白。在特別優選的實施方案中，受試者患有、疑似患有癌症或具有癌症風險。
本發明還提供檢測受試者血清中IL-32濃度的方法和試劑盒，其包括提供受試者血清和IL-32反應性抗體，在適於定量IL-32的條件下用抗體篩選血清。在某些實施方案中，受試者為自身免疫病患者，而在其它實施方案中，受試者為膿毒病患者。在某些優選實施方案中，利用電化學發光實驗完成篩選，而在其它實施方案中，利用酶聯免疫吸附測定完成篩選。在某些實施方案中，IL-32反應性抗體選自但不限於多克隆兔和人IL-32抗體以及單克隆小鼠抗人IL-32抗體。
附圖描述

圖1顯示了功能性IL-18Rβ鏈在人A549肺癌細胞中的表達和活性。圖A提供了轉染和野生型A549細胞中IL-18Rβ表達的RT-PCR分析結果。圖B和C提供的圖分別表明，在IL-18(50ng/ml)刺激作用下，16小時後轉染A549細胞分泌IL-6和IL-8，但野生型A549細胞不分泌IL-6和IL-8(N＝7)。圖D顯示了在有和無IL-18的情況下轉染細胞中NK4(IL-32)RNA表達的誘導。
圖2圖示了在多粘菌素B存在下，用重組IL-32α(TAIF)處理小鼠Raw 264.7巨噬細胞對TNFα表達的誘導。圖A顯示了在離子交換層析級分中的重組IL-32(α的水平，其與處理細胞分泌的TNFα水平相關。在10％SDS-PAGE後考馬斯藍染色，顯示每種離子交換層析級分。圖B表明在細菌中表達的重組IL-32α以劑量依賴方式誘導TNFα表達。圖C表明在哺乳動物細胞中表達的重組IL-32α也誘導TNFα表達。通過免疫印跡評價重組IL-32α的量。
圖3提供了4種IL-32剪接變體的可讀框的DNA序列比對(IL-32α公開為SEQ ID NO3、IL-32β公開為SEQ ID NO4、IL-32γ公開為SEQID NO5、IL-32δ公開為SEQ ID NO6)。比對用ClustalW程序(可由EMBnet的Swiss節點的web站點獲得)進行，並人工校對。Myr和Gly分別表示潛在的N-豆蔻醯化或N-糖基化位點。
圖4在圖A中提供了4種人IL-32剪接變體的比對(IL-32α公開為SEQ ID NO7、IL-32β公開為SEQ ID NO8、IL-32γ公開為SEQ IDNO9、IL-32δ公開為SEQ ID NO10)，以及幾種哺乳動物物種的IL-32β蛋白序列的比對(人序列公開為SEQ ID NO8、馬公開為SEQ IDNO16、牛公開為SEQ ID NO17)。比對用可由EMBnet的Swiss節點的web站點獲得的程序進行，並人工校對。
圖5表示在染色體16p13.3上的人IL-32基因的結構，外顯子以點框表示。IL-32基因示意圖上方和下方的數字描繪了8個外顯子，而該5kb基因組片段的序列在本文以SEQ ID NO11公開。還顯示了4種IL-32變體(α、β、γ和δ)的剪接。
圖6表明rIL-32在巨噬細胞(Raw)和單核細胞(THP-1)中均誘導促炎細胞因子。圖A表明在大腸桿菌中生產的rIL-32α以劑量依賴性方式誘導MIP-2和TNFα兩者的分泌。IL-32濃度在X軸上以單位/ml表示。圖B表明IL-32α(10U/ml)和IL-32β(10U/ml)變體都活化小鼠Raw 264.7巨噬細胞。圖C提供了由各種來源的IL-32β誘導的人和鼠TNFα的圖。用1U/ml Anjou65和Cos-7S或2U/ml Cos7-T處理Raw細胞和PMA分化的THP-1細胞。在大腸桿菌中生產的IL-32α和在哺乳動物細胞中生產的IL-32β以劑量依賴性方式在PMA分化的THP-1細胞中誘導TNFα表達。圖E表明高濃度的大腸桿菌rIL-32α(20U/ml)或哺乳動物rIL-32β(Anjou65，10U/ml)在未分化的THP-1細胞中誘導IL-8分泌。
圖7表明大腸桿菌rIL-32α和哺乳動物rIL-32β活性被抗IL-32 Fab(32-4)處理中和(3個獨立實驗的平均值±SEM)。圖A表明在大腸桿菌rIL-32α(3U/ml)和抗IL32 Fab存在下培養的小鼠Raw細胞劑量依賴性降低TNFα分泌。圖B表明哺乳動物(Cos7-S)rIL-32β(2U/ml)誘導的mTNFα分泌受到抗IL-32 Fab(40ng/ml)的抑制。
圖8表示IL-32在mRNA和蛋白水平上的內源性表達。圖A顯示了根據RNA印跡測定的IL-32 mRNA在各種人組織中的表達。左側的數字表示mRNA大小。圖B表明，根據蛋白質印跡測定，在細胞培養上清液中存在可溶性IL-32。如所說明的在有IL-18(50ng/ml)或IL-1β(10ng/ml)、無FCS時刺激穩定的A549-Rβ克隆48小時。收集上清液，用親合純化的抗IL-32α抗體探測。
圖9顯示細胞裂解物中IL-32的檢測結果。顯示了在用IFNγ(100U/ml)、IL-18(50ng/ml)或IL-1β(10ng/ml)刺激時Wish細胞(圖A)、A549-Rβ細胞(圖B)和A549-WT細胞(圖C)的IL-32生產。數據代表4個單獨實驗中的一個。通過免疫印跡檢測在用IL-32α和IL-32βcDNA瞬時轉染Cos7細胞時在細胞培養上清液(圖D)和細胞裂解物(圖E)中的IL-32表達。圖F提供了通過ECL檢測的上清液和裂解物中的IL-32濃度的對比。數據代表5個獨立實驗的平均值±SEM。
圖10表示利用電化學發光(ECL)的內源性IL-32檢測結果。在圖A中，通過ECL實驗檢測用於圖9B免疫印跡的相同樣品的IL-32。在圖B中，在用IL-12、IL-18或IL-12+IL-18處理後檢測人NK細胞系上清液中的IL-32。數據表示4個獨立實驗的平均值±SEM。在圖C中，檢測人PBMC的上清液和裂解物中的ConA誘導的IL-32(N＝7)。
圖11表示在IL-32α(20U/ml)處理小鼠Raw 264.7巨噬細胞後IL-32α誘導的IκB降解(圖A)和p38 MAPK磷酸化(圖B)。為標準化目的，用山羊抗肌動蛋白或兔抗p38 MAPK探測膜。
圖12在圖A和C中分別提供了馬IL-32α(SEQ ID NO18)和IL-32β(SEQ ID NO16)的胺基酸序列，在圖B和D中分別提供了馬IL-32α(SEQ ID NO19)和IL-32β(SEQ ID NO20)的cDNA序列。
圖13在圖A和C中分別提供了牛IL-32β(SEQ ID NO17)和IL-32γ(SEQ ID NO22)的胺基酸序列，在圖B和D中分別提供了牛IL-32β(SEQ ID NO21)和IL-32γ(SEQ ID NO23)的cDNA序列。
圖14在圖A和B中分別提供了綿羊IL-32α的胺基酸序列(SEQ IDNO24)和cDNA序列(SEQ ID NO25)。還在圖C和D中分別提供了豬IL-32α的胺基酸序列(SEQ ID NO26)和cDNA序列(SEQ IDNO27)。
定義為利於理解本發明，下文定義了若干術語和短語術語「基因」指含生產多肽或前體或RNA(例如tRNA、siRNA、rRNA等)所必需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全長編碼序列編碼，或者可由編碼序列的任何部分編碼，只要保留了全長或片段的所需活性或功能特性(例如酶活性、配體結合、信號轉導等)。該術語還包括結構基因編碼區和位於接近編碼區的5′和3′末端的序列，使得該基因對應於全長mRNA的長度。位於編碼區5′並存在於mRNA上的序列稱為5′非翻譯序列。位於編碼區3′或下遊並存在於mRNA上的序列稱為3′非翻譯序列。術語「基因」同時包括cDNA和基因組形式的基因。基因組形式或克隆的基因包含編碼區，其可由稱為「內含子」或「間斷區」或「間斷序列」的非編碼序列間斷。內含子由核或初始轉錄物中去除或「切出」，因此在信使RNA(mRNA)轉錄物中不存在。mRNA在翻譯過程中起確定新生多肽中的胺基酸序列或順序的作用。
具體地說，術語「TAIF」和「IL-32基因」指全長IL-32核苷酸序列。但是，該術語還有意包括IL-32核苷酸序列的片段以及全長IL-32核苷酸序列中的其它結構域(例如功能結構域)。而且，術語「IL-32基因」、「IL-32核苷酸序列」和「IL-32多核苷酸序列」包括DNA、cDNA和RNA序列。
本文使用的術語「質粒」指小的、可獨立複製的DNA部分。同樣，術語「裸質粒」指缺少通常用於影響轉染的外來物質的質粒DNA。本文使用的「裸質粒」指基本沒有磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、脂質體和/或多胺的質粒。
本文使用的術語「純化的」指由其天然環境取出的、分離的或單獨的分子(多核苷酸或多肽)。「大致純化的」分子沒有至少50％與其天然共存的其它組分，優選沒有至少75％，更優選沒有至少90％。
術語「重組DNA」指由利用分子生物學技術相互連接的DNA節段組成的DNA分子。同樣，術語「重組蛋白」指由重組DNA表達的蛋白分子。
本文使用的術語「融合蛋白」指通過表達組合兩個基因序列所製備的雜合基因而形成的蛋白。通常，這可通過將cDNA以符合現有基因的讀框克隆入表達載體中實現。融合蛋白可起報告基因(例如βgal)的作用，可提供用於分離目的的工具(例如GST)，或者可在體內增加蛋白的半衰期(例如IgG Fc)。
適於生產重組蛋白的系統包括但不限於原核生物(例如大腸桿菌)、酵母(例如釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))、昆蟲(例如杆狀病毒)、哺乳動物(例如中國倉鼠卵巢細胞)、植物(例如紅花)和無細胞系統(例如兔網織紅細胞)。
本文使用的術語「編碼區」指編碼由於mRNA分子翻譯而存在於新生多肽中的胺基酸序列的核苷酸。編碼區在真核生物中有邊界，5′側為編碼起始子甲硫氨酸的核苷酸三聯體「ATG」，3′側為指定終止密碼子的三種三聯體中(即TAA、TAG和TGA)的一個。
當在本文中提及有關天然蛋白分子的胺基酸序列時，術語「胺基酸序列」或類似的術語如「多肽」或「蛋白」無意將胺基酸序列限於與所提及蛋白分子相關的完整天然胺基酸序列。
術語「野生型」指一種基因或基因產物，當其與天然來源分離時，具有該基因或基因產物的特徵。野生型基因就是在群體中最常見的基因，因此可隨意設計「正常」或「野生型」形式的基因。
本文使用的術語「突變體」、「多態性」和「變體」在與基因或基因產物關聯時，指與野生型基因或親代基因產物相比在序列和/或功能特性上的改變(即不同特徵)。在某些優選實施方案中，術語突變體指由於突變而與親代基因或基因產物不同的基因或基因產物。要指出的是，天然或誘導的突變體可分離；這些突變體可通過以下事實鑑別其與野生型基因或親代基因產物相比具有改變的特徵。另外，突變基因可在實驗室人工(例如定點誘變)或合成產生。
本文使用的術語「白介素-32」、「IL-32」、「TAIF」、「腫瘤壞死因子-α誘導因子」、「NK4」和「天然殺傷細胞轉錄物4」指人IL-32基因(例如智人(Homo sapiens)-SEQ ID NO11)及其基因產物(例如野生型α、β、γ和δ同種型及其變體)。與野生型IL-32序列殘基的不同少於20％(優選10％或更少，更優選5％或更少，最優選1％或更少)的IL-32變體也適用於本發明的方法和組合物(其包括但不限於對應於SEQ ID NO12所公開的鼠cDNA片段的基因產物)。相反，本文使用的術語NK4、TAIF和IL-32不是指肝細胞生長因子(HGF)的內部片段，該片段稱為HGF/NK4(或者也將N-端肝素結構域和隨後的4個Kringle結構域簡稱為NK4)，其是HGF的特異性拮抗劑(Dateet al.，FEBS Lett，4201-6，1997)。
本文使用的術語「雜交」用於表示互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核酸間結合的強度)受例如以下的因素影響核酸間互補的程度、所涉及條件的嚴格性、所形成雜合體的Tm以及核酸中的G∶C比率。
本文使用的術語「Tm」用於表示「解鏈溫度」。解鏈溫度是一群雙鏈核酸分子變成一半解離為單鏈的溫度。計算核酸Tm的公式在本領域眾所周知。如標準參考文獻所指出的，當核酸在1 M NaCl水溶液中時，可利用公式Tm＝81.5+0.41(％G+C)計算Tm值的簡單估測值(參見例如Anderson and Young，「Quantitative Filter Hybridization，」載於Nucleic Acid Hybridization，1985)。其它的參考文獻包括考慮結構以及序列特徵來計算Tm的更複雜的計算方法。
本文使用的術語「嚴格性」用於表示進行核酸雜交時的溫度、離子強度和存在其它化合物如有機溶劑的條件。本領域技術人員會認識到，可單獨或協同地改變剛剛描述的參數來改變「嚴格」條件。在「高嚴格」條件下，核酸鹼基配對僅在具有高頻率互補鹼基序列的核酸片段之間發生(例如「高嚴格」條件下的雜交可在具有約85-100％同一性(優選約70-100％同一性)的同源物之間發生)。在中等嚴格條件下，核酸鹼基配對將在具有中等頻率互補鹼基序列的核酸之間發生(例如「中等嚴格」條件下的雜交可在具有約50-70％同一性的同源物之間發生)。因此，對於來源於遺傳不同的生物的核酸，經常需要「弱」或「低」嚴格性的條件，因為互補序列的頻率經常很低。
術語「高嚴格條件」和「嚴格條件」當用於關聯核酸雜交時，其包括等同於以下的條件當使用約500個核苷酸長度的探針時，在由5X SSPE(43.8g/kl NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中於42℃結合或雜交，接著在含0.1XSSPE、1.0％SDS的溶液中於42℃漂洗。
「中等嚴格條件」當用於關聯核酸雜交時，其包括等同於以下的條件當使用約500個核苷酸長度的探針時，在由5X SSPE(43.8g/lNaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.5％SDS、5X Denhardt試劑和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中於42℃結合或雜交，接著在含1.0X SSPE、1.0％SDS的溶液中於42℃漂洗。
「低嚴格條件」包括等同於以下的條件當使用約500個核苷酸長度的探針時，在由5X SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調節至7.4)、0.1％SDS、5X Denhardt試劑[50X Denhardt每500ml含5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中於42℃結合或雜交，接著在含5X SSPE、0.1％SDS的溶液中於42℃漂洗。
本文使用的術語「RNA印跡」指將變性RNA轉移至固體支持體上的方法，用於隨後的雜交實驗。通常在瓊脂糖凝膠中電泳總RNA或富含polyA的RNA，轉移至膜，並用放射性標記的DNA或RNA片段探測，以檢測特異性RNA序列。在本領域常規應用RNA印跡(參見例如Thomas，Proc Natl Acad Sci USA 775201-5205，1980；和Ausubelet al.(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，Inc.，New York，1994)。
本文使用的術語「DNA印跡」指將通過瓊脂糖電泳分離的變性DNA轉移至固體支持體上的方法，用於隨後的雜交實驗。這些方法通常需要用合適的限制酶消化基因組DNA，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，將DNA轉移至膜，並與放射性標記的DNA或RNA片段溫育，以檢測特異性DNA序列。在本領域常規應用DNA印跡(參見Southern，J Mol Biol 98503-517，1975；和Ausubel et al.，出處同上，1994)。
本文使用的術語「聚合酶鏈反應(PCR)」指增加DNA混合物中的靶序列節段的濃度的方法，無需克隆和純化(參見例如美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,965,188，其通過引用結合到本文中)。該擴增靶序列的方法包括將大大過量的兩種寡核苷酸引物導入到含所需靶序列的DNA混合物中，接著在DNA聚合酶存在下進行精確順序的熱循環。兩個引物與雙鏈靶序列的其對應鏈互補。為實施擴增，將混合物變性，然後將引物與靶分子中的其互補序列退火。在退火後，用聚合酶延伸引物，以便形成一對新的互補鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可重複多次(即變性、退火和延伸構成一個「循環」)，以獲得高濃度的所需靶序列的擴增節段。所需靶序列的擴增節段的長度通過引物彼此之間的相對位置確定，因此，該長度是可控參數。鑑於該方法的重複方面，該方法稱為「聚合酶鏈反應」(後文稱為「PCR」)。因為在混合物中靶序列的所需擴增節段變成了優勢序列(就濃度而言)，所以其是「PCR擴增的」。當模板為RNA時，在擴增循環前完成逆轉錄(RT)步驟。因此，該變化稱為「RT-PCR」。
術語「抗體」指多克隆和單克隆抗體。由於對目的蛋白或其片段的免疫反應而在動物中形成的多克隆抗體，可容易地使用眾所周知的方法由血液中分離，並可通過例如柱層析純化。還可以使用已知方法製備單克隆抗體(參見例如Winter and Milstein，Nature，349，293-299，1991)。本文使用的術語「抗體」包括重組製備和修飾的抗體及其抗原結合片段，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性或寡特異性抗體、單鏈抗體和F(ab)或F(ab)2片段。術語「反應性」在用於關聯抗體時，表示抗體能夠結合目的抗原。例如，IL-32反應性抗體是結合IL-32或IL-32片段的抗體。
術語「顯性失活突變體」指沒有野生型活性的分子，但其與野生型分子有效競爭底物、受體等，因此抑制野生型分子的活性。在優選實施方案中，術語「IL-32顯性失活突變體」指與野生型IL-32蛋白競爭IL-32受體的IL-32突變蛋白，但其不能誘導下遊作用，例如降解IκB、磷酸化p38 MAPK和生產TNFα。合適的顯性失活IL-32變體可選自隨機IL-32突變體文庫，或者可合理設計，這些已述於TNF系統(Steed etal.，Science，3011895-1898，2003)。
術語「部分」當用於關聯核苷酸序列時指該序列的片段，其大小在10個核苷酸至整個核苷酸序列減一個核苷酸的範圍內。
本文使用的術語「生物活性」指具有野生型IL-32分子的結構、調節功能和生化功能的分子。在某些情況下，生物活性分子是哺乳動物IL-32分子的同系物，而在其它情況下生物活性分子是哺乳動物IL-32分子的一部分。其它可用於本發明的組合物和方法的生物活性分子包括但不限於突變哺乳動物IL-32分子(例如具有至少一個缺失、插入或置換的變體)。生物活性如實驗實施例所述通過體外檢測TNF-α誘導測定。
本文使用的術語「動物」指動物界的任意成員，其包括所具有的細胞在沒有細胞壁和葉綠素以及自發運動方面與植物細胞不同的生物。本發明的優選實施方案主要涉及動物界的脊椎動物(脊椎或脊索)成員。
術語「患者」或「受試者」指為接受藥物治療的候選者的哺乳動物(人或動物)。
術語「對照」指為實驗受試者或樣品的對比提供基礎的受試者或樣品。例如，使用對照受試者或樣品允許對實驗方法的有效性做出判斷。在某些實施方案中，術語「對照受試者」指接受模擬品治療(例如單獨的PBS或正常兔IgG的鹽水溶液)的動物。
術語「樣品」和「樣本」在其最廣意義上使用。一方面，其含義包括樣本或培養物。另一方面，其含義包括生物或環境樣品。這些術語包括得自人和其它動物的所有類型的樣品，包括但不限於體液，如尿、血、糞便物、腦脊液、精液、唾液和傷口滲出液，以及固體組織。但是，這些實例不能被解釋為限制可應用於本發明的樣品類型。
本文使用的術語「白細胞」指叫做白血球的細胞，其幫助機體對抗感染和其它疾病，包括例如粒細胞(例如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞)、單核吞噬細胞和淋巴細胞(例如B細胞、T細胞、天然殺傷細胞)。
本文使用的術語「單核細胞」指在血液中循環的單核吞噬細胞，其後來遷移至組織中，並分化成巨噬細胞。術語「巨噬細胞」指哺乳動物組織中來源於血液單核細胞的相對長壽命的吞噬細胞。不同部位的巨噬細胞具有截然不同的特性。主要類型是腹膜巨噬細胞和塵細胞、組織巨噬細胞(組織細胞)、肝巨噬細胞和破骨細胞。巨噬細胞在殺死某些細菌、原生動物和腫瘤細胞方面、釋放刺激免疫系統其它細胞的物質方面以及提呈加工過的抗原至T淋巴細胞方面起重要作用。
本文使用的術語「炎症」指對損傷的組織反應，其特徵在於增加血液流動，淋巴細胞進入組織中，產生腫脹、發紅、體溫升高和疼痛。
本文使用的術語「症狀」指疾病或患者生理狀況的任何主觀徵兆(例如預示著某些身體和精神狀態的患者生理狀況的變化)。
例如，在炎性腸病(IBD)情況下，短語「炎症症狀」在本文中被定義為包括但不限於例如以下的症狀腹痛、腹瀉、直腸出血、體重下降、發熱、食慾下降和其它更嚴重的併發症，例如脫水、貧血和營養不良。這種症狀有許多要進行定量分析(例如體重下降、發熱、貧血等)。某些症狀易於由血檢確定(例如貧血)，或者易於由檢測血液存在的檢查確定(例如直腸出血)。
同樣，在IBD情況下，短語「在使症狀減輕的條件下」指在IBD的可檢測症狀中任何程度的定性或定量減輕，包括但不限於對疾病康復速率的可檢測影響(例如體重增加速率)，或減輕至少一種以下症狀腹痛、腹瀉、直腸出血、體重下降、發熱、食慾下降、脫水、貧血、發脹、纖維化、腸發炎和營養不良。
術語「自身免疫病」包括但不限於以下疾病多發性硬化、重症肌無力、自身免疫性神經病(例如Guillain-Barré)、自身免疫性葡萄膜炎、Crohn病、潰瘍性結腸炎、原發性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自身免疫性血小板減少、1型糖尿病、Grave病、Hashimoto甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、顳動脈炎、抗磷脂綜合症、血管炎(例如Wegener肉芽腫病)、Behcet病、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、脊椎關節病(例如強直性脊椎炎)、Sjogren綜合症、牛皮癬、皰疹樣皮炎、尋常型天皰瘡和白癜風。
本文使用的術語「類風溼性關節炎」和「RA」指其中存在關節破壞的慢性炎性疾病。RA被認為是一種自身免疫病，其中在關節中形成免疫複合物，並激發炎症反應(複合物介導的過敏)。還發生細胞介導的(IV型)過敏，使得巨噬細胞累積，導致對滑膜襯裡的破壞。
本文使用的術語「IBD」和「炎性腸病」是通用術語，其包括幾種疾病過程，最常見的是潰瘍性結腸炎和Crohn病。
本文使用的術語「Crohn病」指胃腸道的炎症疾病。常見症狀包括反覆的腹痛、發熱、噁心、嘔吐、體重下降和偶爾出血的腹瀉。
術語「化合物」和「藥物候選物」指任何可用於治療或預防疾病或身體功能障礙的化學或生物實體(例如包括藥物、藥品等)。化合物同時包括已知的和潛在的治療化合物。可通過例如使用本發明的篩選方法進行篩選，確定為治療性的化合物。「已知治療化合物」指已經表明(例如通過動物實驗或先前的給予人的經驗)在這種治療或預防中有效的治療性化合物。
本文使用的術語「激動劑」指模擬「天然」化合物作用的分子或化合物。激動劑可與這些天然化合物在構象、電荷或其它特徵上類似。因此，激動劑可由在細胞表面上表達的受體識別。這種識別可在細胞中產生生理和/或生化變化，使得細胞可以和天然化合物存在時一樣的方式與存在的激動劑反應。激動劑可包括蛋白、核酸、碳水化合物或任何與IL-32結合蛋白結合或相互作用的其它分子。
本文使用的術語「拮抗劑」和「抑制劑」指抑制「天然」化合物作用的分子或化合物。拮抗劑可與這些天然化合物在構象、電荷或其它特徵上類似或不類似。因此，拮抗劑可由激動劑識別的相同或不同受體識別。拮抗劑可具有防止激動劑作用(例如防止天然IL-32結合IL-32受體)的變構效應。與激動劑相反，拮抗化合物在細胞中不產生生理和/或生化變化，使得細胞可以和天然化合物存在時一樣的方式和存在的拮抗劑反應。拮抗劑和抑制劑可包括蛋白、核酸、碳水化合物或任何與IL-32結合蛋白結合或相互作用或防止形成功能性IL-32多聚體的其它分子。
本文使用的術語調節指生物活性的變化或改變。調節可為蛋白活性的增加或降低、結合特徵的改變或在與蛋白或其它目的結構活性相關的生物學特性、功能特性或免疫學特性方面的任何其它改變。
發明描述白介素-18(IL-18)是一種多功能細胞因子，在先天免疫應答和獲得性免疫應答中都起作用。已經研究了IL-18在廣譜的Th1或Th2相關性自身免疫病中的作用(Okamura et al.，Nature，37888-91，1995，Nakanishi et al.，Cytokine Growth Factor Rev，1253-72，2001；和Okamura et al.，Adv Immunol，70281-312，1998)。IL-1和IL-18屬於IL-1家族，共同具有結構相似性，需要胱天蛋白酶-1加工(Bazan et al.，Nature，379591，1996；和Gu et al.，Science，275206-209，1997)。IL-18還觸發相似的信號轉導途徑，包括募集IL-1受體相關性激酶(IRAK)，與腫瘤壞死因子(TNF)受體相關性因子-6形成IRAK複合物，以及活化IκBα/NF-κB級聯(Kojima et al.，Biochem Biophy Res Commun，244183-186，1998；Matsumoto et al.，Biochem Biophys Res Comnnun，234454-457，1997；和Robinson et al.，Immunity，7571-581，1997)。IL-1細胞因子家族成員被認為在自身免疫和炎性疾病中起病理學作用，因為封閉IL-1和IL-18活性減輕了類風溼性關節炎和全身性炎症受試者中的疾病嚴重性(Arend，Adv Immunol，54167-227，1993；Diuarello，Blood，872095-2147，1996；Novick et al.，Immunity，10127-136，1999；和Banda et al.，J Immunol，1702100-2105，2003)。但是，研究IL-18可誘導基因存在一個障礙，因為僅有少數細胞系對IL-18有反應，例如人NK和KG-1細胞系。另外，儘管這些細胞系響應IL-18，但它們為了表現出IL-18反應性，分別需要共刺激因子，例如IL-2、IL-12或IL-15(Ahn et al.，J Immunol，1592125-2131，1997，Ohtsuki et al.，Anticancer Res，173253-3258，1997；Lauwerys et al.，J Immunol，1651847-1853，2000；和Hoshino et al.，J Immunol，16251-59，1999)。需要共刺激因子阻礙了對IL-18誘導基因表達的獨立評價。
IL-18還具有兩個已知的受體鏈配體結合IL-18Rα鏈和信號轉導IL-18Rβ鏈。IL-18受體的兩個鏈都屬於IL-1受體家族，在胞外區由3個Ig樣結構域組成(Kato et al.，Nat Struct Biol，10966-971，2003；和Yamamoto et al.，Biochem Biophys Res Commun，317181-186，2004)。其它參與IL-18調節的組分為IL-18結合蛋白(IL-18BP)。IL-18BP不是IL-18信號轉導複合物的一部分，而是拮抗IL-18活性(Kimet al.，Proc Natl Acad Sci USA，971190-1195，2000；和Novick et al.，Immunity，10127-136，1999)。IL-18BP是一種分泌性受體樣分子，由單個Ig樣結構域組成。IL-18BP與病毒蛋白具有顯著同源性，中和人IL-18的生物活性(Xiang and Moss，Virology，257297-302，1999；Reading and Smith，J Virol，779960-9968，2003；Esteban and Buller，Virology，323197-207，2004；和Esteban et al.，J Gen Virol，851291-1299，2004)。
在沒有共刺激物時，由於IL-18Rβ鏈基本不表達或不表達，所以非免疫性細胞對IL-18無反應(Thomassen et al.，J Interferon CytokineRes，181077-1088，1998；和Chandrasekar et al.，Biochem Biophys ResCommun，3031152-1158，2003)。因此，必須生產表達IL-18Rβ鏈的穩定克隆，因為該受體組分是傳送IL-18信號所必需的(Thomassen et al.，出處同上，1998；和Kim et al.，J Immunol，166148-154，2001)。在人肺癌A549細胞(A549-Rβ)中實現IL-18Rβ鏈的穩定表達，其使這些細胞甚至在沒有共刺激的情況下也對IL-18有反應。使用穩定的A549-Rβ克隆，通過微陣列分析鑑別IL-18誘導型基因。微陣列研究描述於實施例1，結果揭示，IL-18誘導的細胞因子樣分子在12年前被描述為天然殺傷細胞轉錄物4或簡稱為NK4(Dahl et al.，J Immunol，148597-603，1992)。應當指出的是，術語NK4目前用於描述肝細胞生長因子變體(Martin et al.，J Cell Physiol，192268-275，2002)。肝細胞生長因子變體和NK4/IL-32轉錄物之間沒有序列同源性。新近，已經報導在接受高劑量IL-12治療惡性黑色素瘤的患者的PBMC中，NK4表達增加(Panelli et al.，Genome Biol，3(7)RESEARCH0035，2002)，但直至本發明開發時為止，NK4的功能仍然未知。
如實驗性實施例詳述，已經通過微陣列分析A459-Rβ細胞鑑別出一種新型的炎性細胞因子，稱為白介素-32(IL-32)或腫瘤壞死因子α誘導性因子(TAIF)。另外，已闡明了IL-32的基因結構、表達譜和功能。在開發本發明之前，IL-32的單種同種型(TAIFγ/NK4)被描述成功能未知的淋巴細胞轉錄物(Dahl et al.，J Immunol，148597-603，1992)，其在家族性地中海熱基因座中或與其鄰接由人染色體16p13.3轉錄(Bernot et al.，Genomics，50147-160，1998)。如本文所示，儘管IL-32與已知細胞因子家族沒有序列同源性，但鑑於其誘導TNFα分泌和通過已知促炎細胞因子的經典途徑信號轉導的能力，其無疑是一種細胞因子。而且，由於在IL-32調節上的相似性以及沒有明顯的信號肽，故預期IL-32是IL-1細胞因子家族一員(Ghayur et al.，Nature，386619-623，1997；Cerretti etal.，Science，25697-100，1992，和Kuida etal.，Science，2672000-2003，1995)。另外，與IL-1和IL-18一樣，IL-32主要由受刺激的細胞分泌。正如本文首次闡明，IL-32觸發典型的促炎細胞因子信號途徑NFκB和p38 MAPK，由此誘導促炎細胞因子TNFα產生。同樣，IL-1β、IL-18和LPS誘導IL-32表達，和NK4在活化NK或T細胞中的原始轉錄物不同，在各種器官中觀察到遍在的IL-32表達。IL-32表達模式類似於IL-15，其也由各種各樣的組織生產。這與IL-2相反，IL-2僅由活化T細胞生產(Bamford et al.，ProcNatl Acad Sci USA，932897-2902，1996；和Grabstein et al.，Science，264965-968，1994)。
IL-32誘導TNFα表明，該細胞因子在自身免疫/炎性疾病病理學中起重要作用。在開發本發明之前，還沒有文件證明在某些膿毒病患者的循環系統中觀察到高水平的IL-32(和在健康個體血清中的觀測結果相比)。因此，預期阻斷IL-32活性對於各種自身免疫病是高度有效的治療方法，類似於成功的TNFα阻斷策略(Davis et al.，AnnRhem Dis，59Supplli41-3，2000；和Shanahan and St Clair，ClinImmunol，103231-242，2002)。還預期基於IL-32的組合物可用於治療癌症，以及用於誘導細胞死亡或凋亡(包括TNFα生產)是有益的其它疾病。
另外，預期小鼠Raw 264.7巨噬細胞系表達IL-32受體，其在與IL-32結合時被活化(胞外IL-32功能)。但是，還預期IL-32具有胞內功能，因為還在細胞裂解物中檢測到IL-32。因此，預期IL-32類似於IL-1α(Stevenson etal.，Proc Natl Acad Sci USA，94508-513，1997)和高速泳動族蛋白-1(Wang et al.，Science，285248-251，1999)，作為胞內和胞外蛋白都有活性。
IL-32的在沒有明顯信號肽的情況下分泌是幾個細胞因子家族的特徵(Cerretti et al.，Science，25697-100，1992；Kuida et al.，Science，2672000-2003，1995；和Ghayur et al.，Nature，386619-623，1997)。與IL-1β和IL-18類似，IL-32作為可溶性蛋白分泌在受刺激的初級細胞以及細胞系的細胞培養基中。一級序列分析表明，IL-32不具有潛在的胱天蛋白酶-1切割位點，儘管已經發現了新的剪接變體，但沒有一個在N-端具有典型的疏水信號肽。
在多個物種中存在IL-32證明其是預期在炎症調節中有重要功能的進化保守分子。在其它哺乳動物物種中鑑別出較少的IL-32同種型，儘管該結果可反映出這些物種相對缺乏EST。同樣，對小鼠IL-32同源性的廣泛研究是不成功的。但是，推定的鼠IL-32基因與人基因具有非常低的同源性是有可能的，因為馬和牛IL-32同源物與人IL-32共有的序列同一性僅為31.8-28.1％。
在以下章節描述了本發明的一些優選實施方案(1)IL-32多核苷酸；(II)IL-32多肽；(III)IL-32抗體；(IV)含IL-32多核苷酸、多肽和抗體的藥物組合物；和(V)鑑別IL-32抑制劑的方法。
I.IL-32多核苷酸本發明提供編碼IL-32蛋白、同源物、變體和突變體的核酸(例如SEQ ID NO3、4、6)。在某些實施方案中，本發明提供能夠在高嚴格條件下與SEQ ID NO3、4、6雜交的多核苷酸序列，只要能夠雜交的多核苷酸序列編碼的蛋白保留天然IL-32基因的TNFα誘導活性。在某些實施方案中，保留天然IL-32的TNFα誘導活性的蛋白與野生型IL-32 80％同源，優選與野生型IL-32 90％同源，更優選與野生型IL-32 95％同源，最優選與野生型IL-32 99％同源。在特別優選的實施方案中，保留IL-32生物活性的蛋白包括的核酸序列編碼連續胺基酸序列LKARMHQAIERFYDKMQNAESGRGQV(SEQ IDNO13)，其與野生型IL-32(IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ)99％同源。在某些優選實施方案中，核酸序列不編碼SEQ ID NO14列出的胺基酸序列。在這些實施方案的子方案中，核酸序列包含SEQ IDNO15中提出的序列(鄰接外顯子4的外顯子3)。在優選實施方案中，雜交條件基於核酸結合複合物的解鏈溫度(Tm)，並賦予如上定義部分所釋的定義「嚴格性」。
在本發明的其它實施方案中，提供IL-32的等位基因。在優選實施方案中，等位基因由突變(即核酸序列中的改變)產生，一般產生其結構或功能可改變或不改變的改變mRNA或多肽。任何給定基因都可沒有、有一種或多種等位基因形式。常見的產生等位基因的突變一般歸因於核酸的缺失、添加或置換。這些類型的改變中的每一種都可在給定序列中單獨或與其它改變組合以一次或多次的頻率發生。
在本發明的再其它實施方案中，由於各種原因要改變IL-32編碼序列，為此可工程改造本發明的核苷酸序列，其包括但不限於修飾克隆、加工和/或表達基因產物的改變。例如，可使用本領域眾所周知的技術導入突變(例如定點誘變，以插入新位點、改變糖基化模式、改變密碼子偏倚等)。
例如，可通過置換、缺失或添加生產其中編碼多肽的核苷酸序列已改變的修飾肽。在某些優選實施方案中，這些修飾不顯著改變修飾IL-32的TNFα誘導活性(例如IL-32激動劑)，而在其它優選實施方案中，這些修飾消除了修飾IL-32的TNFα誘導活性(例如IL-32拮抗劑)。換句話說，可從定義的功能上而不是結構上評價任何給定構建物，以確定其是否是本發明的修飾或變體IL-32類別中的一員。在優選的實施方案中，通過實施例2描述的方法(TNFα誘導)評價變體或突變IL-32的活性。
而且，如上所述，還預期變體形式的IL-32與本文更詳細列出的肽和DNA分子等同。例如，預期用異亮氨酸或纈氨酸單獨取代亮氨酸、用穀氨酸單獨取代天冬氨酸、用絲氨酸單獨取代蘇氨酸或用結構相關胺基酸類似地取代胺基酸(即保守突變)對所得分子的生物活性沒有大的影響。因此，本發明的某些實施方案提供了含保守取代的本文公開IL-32的變體。保守取代發生在其側鏈相關的胺基酸家族中。遺傳編碼的胺基酸可分為4個家族(1)酸性(天冬氨酸、穀氨酸)；(2)鹼性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)非極性(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；和(4)不帶電極性(甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時被共同分類為芳香族胺基酸。以類似方式可將全部胺基酸分組為(1)酸性(天冬氨酸、穀氨酸)；(2)鹼性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；(3)脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)，絲氨酸和蘇氨酸任選單獨分組為脂肪族-羥基；(4)芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)醯胺(天冬醯胺、穀氨醯胺)；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(例如Stryer ed.，Biochemistry，17-21頁，第2版，WH Freeman and Co.，1981)。通過評價變體肽以類似於野生型蛋白的方式起作用的能力，可容易地確定肽胺基酸序列中的變化是否產生功能同系物。以相同的方式可容易地測試具有超過一個取代的肽。
更罕有的是，變體包括「非保守」改變(例如色氨酸取代甘氨酸)。類似的小變化還可包括胺基酸缺失或插入，或同時包括這二者。可使用電腦程式(例如LASERGENE軟體，DNASTAR Inc.，Madison，WI)尋找確定哪個胺基酸殘基可被置換、插入或缺失而不破壞生物活性的指引。
II.IL-32多肽在其它實施方案中，本發明提供編碼IL-32多肽序列的IL-32多核苷酸序列。IL-32多肽(例如SEQ ID NO7、8、10)描述於圖4。本發明的其它實施方案提供這些IL-32蛋白的片段、融合蛋白或功能等同物。在本發明的再其它實施方案中，對應於這些不同的IL-32同源物和突變體的核酸序列可用於產生指導IL-32同源物和突變體在合適宿主細胞中表達的重組DNA分子。在本發明的某些實施方案中，多肽可為天然純化產物，在其它實施方案中，其可為化學合成方法的產物，在再其它實施方案中，其可通過使用原核或真核生物宿主(例如，利用培養的細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)的重組技術生產。在某些實施方案中，根據在重組生產方法中使用的宿主，本發明的多肽可糖基化或可非糖基化。在其它實施方案中，本發明的多肽還可包括起始的甲硫氨酸胺基酸殘基。
在本發明的一個實施方案中，由於遺傳密碼固有的簡併性，SEQID NO3、4和6多核苷酸序列以外的DNA序列編碼大致相同或功能等同的胺基酸序列，它們可用於克隆和表達IL-32。
A.生產IL-32的載體可使用本發明的多核苷酸通過重組技術生產多肽。因此，例如，多核苷酸可包含在用於表達多肽的各種表達載體的任一種中。在本發明的某些實施方案中，載體包括但不限於染色體、非染色體和合成DNA序列(例如SV40衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA；杆狀病毒、酵母質粒、得自質粒和噬菌體DNA組合的載體，以及病毒DNA，例如痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病)。預期可使用任一種載體，只要其在宿主中可複製和存活。
具體地說，本發明的某些實施方案提供含一種或多種如上概述序列的重組構建物(例如SEQ ID NO3、4、6)。在本發明的某些實施方案中，構建物含載體，例如質粒或病毒載體，本發明的序列以正向或反向插入其中。在再其它實施方案中，外源結構序列在合適的階段與翻譯起始和終止序列組裝。在本發明的優選實施方案中，使用任何各種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，通過本領域已知的方法將DNA序列插入到合適的限制性核酸內切酶位點中。
大量的合適載體是本領域技術人員已知的，可由市場購買。這種載體包括但不限於以下的載體1)細菌-pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；和2)真核生物-pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、PXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。任何其它的質粒或載體都可使用，只要其在宿主中可複製和存活。在本發明的某些優選實施方案中，哺乳動物表達載體包含複製起點、合適的啟動子和增強子，還包括任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、翻譯終止序列和5′側翼非轉錄序列。在其它實施方案中，DNA序列來源於SV40剪接，聚腺苷酸化位點可用於提供需要的非轉錄遺傳元件。
B.生產IL-32的宿主細胞在其它實施方案中，本發明提供含上述構建物的宿主細胞。在本發明的某些實施方案中，宿主細胞是高等真核細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)。在本發明的其它實施方案中，宿主細胞是低等真核細胞(例如酵母細胞)。在本發明的再其它實施方案中，宿主細胞可為原核細胞(例如細菌細胞)。宿主細胞的具體實例包括但不限於大腸桿菌(Escherichia coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和假單胞菌(Pseudomonas)、鏈黴菌(Streptomyces)和葡萄球菌(Staphylococcus)屬中的各種物種，以及釀酒酵母(Saccharomycees cerivisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyceespombe)、果蠅(Drosophila)S2細胞、夜蛾(Spodoptera)Sf9細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴腎成纖維細胞COS-7系、C127、3T3、293、293T、HeLa和BHK細胞系。
宿主細胞中的構建物可以常規方式用於生產重組序列編碼的基因產物。在某些實施方案中，可通過磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導的轉染或電穿孔將構建物導入到宿主細胞中。或者，在某些實施方案中，使用常規肽合成儀生產IL-32多肽。
C.純化IL-32本發明還提供由重組細胞培養物回收和純化IL-32的方法，其包括但不限於硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親合層析、羥磷灰石層析和凝集素層析。在本發明的其它實施方案中，在完成成熟蛋白構型時，可根據需要使用蛋白重摺疊步驟。在本發明的再其它實施方案中，最終純化步驟可使用高效液相層析(HPLC)。
本發明進一步提供其編碼序列按照讀框與標記序列融合的多核苷酸，這使得可以純化本發明的多肽。標記序列的非限制性實例是六組氨酸尾，其可由載體提供，優選為pQE-9載體，其在細菌宿主情況下提供融合至標記的多肽的純化，或者，例如當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記序列可為血凝素(HA)尾。
D.IL-32融合蛋白本發明還提供摻入全部或部分IL-32的融合蛋白。因此，在本發明的某些實施方案中，多肽的編碼序列可作為融合基因的一部分摻入，包括編碼不同多肽的核苷酸序列。預期該類型的表達系統可在生產IL-32蛋白的免疫原性片段的理想條件下使用。
除了使用融合蛋白增強免疫原性以外，廣為認可的是融合蛋白還可利於蛋白表達，例如本發明的IL-32蛋白。因此，在本發明的某些實施方案中，IL-32可與穀胱甘肽-S-轉移酶(即GST融合蛋白)一起生產。預期這種GST融合蛋白能夠使IL-32易於純化，例如通過使用穀胱甘肽衍生的基質。在本發明的另一個實施方案中，編碼純化前導序列的融合基因，例如在IL-32的需要部分N端的聚-(His)/腸激酶切割位點序列，可允許通過使用Ni2+金屬樹脂的親合層析，純化表達的IL-32融合蛋白。在本發明的再另一個實施方案中，純化的前導序列隨後可通過用腸激酶處理去除。
E.IL-32變體本發明的再其它實施方案提供突變或變體形式的IL-32。為了例如增強治療或預防效力或穩定性(例如體外保質期和/或體內蛋白水解抗性)的目的，有可能修飾具有IL-32活性的肽結構。這種修飾肽被認為是具有本文定義的題述IL-32蛋白活性的肽的功能等同物。例如通過胺基酸置換、缺失或添加，可生產其中胺基酸序列改變的修飾肽。在某些實施方案中，優選的IL-32變體包括IL-32激動劑(例如具有TNFα誘導活性的IL-32變體)，而其它優選的IL-32變體包括IL-32拮抗劑(例如不具有TNFα誘導活性並抑制野生型IL-32蛋白的TNFα誘導活性的IL-32變體)。
III.IL-32抗體可生產抗體，以允許檢測IL-32蛋白。可使用各種免疫原製備抗體。在一個實施方案中，免疫原是人IL-32肽，以生產識別人IL-32的抗體。這種抗體包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達庫。
可使用本領域已知的各種方法生產抗IL-32的多克隆抗體。為生產抗體，可通過注射對應於IL-32表位的肽來免疫各種宿主動物，這些動物包括但不限於兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個優選實施方案中，肽綴合至免疫原性載體(例如白喉類毒素、牛血清白蛋白或匙孔嘁血藍蛋白)。根據宿主物種，可使用各種佐劑增強免疫應答，其包括但不限於弗氏佐劑(完全佐劑和不完全佐劑)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油性乳濁液、二硝基酚和潛在有用的人佐劑，例如卡介苗)。
為製備抗IL-32的單克隆抗體，預期任何通過連續細胞系培養生產抗體分子的技術都可用於本發明(參見例如Harlow and Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。這些技術包括但不限於雜交瘤技術(Khlerand Milstein，Nature 256495-497，1975)以及三瘤技術、人B細胞雜交瘤技術(參見例如Kozbor et al.，Immunol Today，472，1983)和生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole et al.，載於Monoclonal Antibodiesand Cancer Tgerapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁，1985)。
另外，預期描述用於生產單鏈抗體的技術(美國專利No.4,946,778，其通過引用結合到本文中)可用於生產IL-32特異性單鏈抗體。本發明的其它實施方案使用描述用於構建Fab表達庫的技術(Huse et al.，Science，2461275-1281，1989)，以允許快速容易地鑑別具有所需IL-32特異性的單克隆Fab片段。
預期任何適於生產抗體片段的技術都可用於生產含抗體分子獨特型(抗原結合區)的抗體片段。例如，這種片段包括但不限於可通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab′)2片段、可通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵產生的Fab′片段，以及可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產生的Fab片段。
在生產抗體時，預期利用本領域已知的技術可實現對目標抗體的篩選，所述技術例如為放免實驗、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾心」免疫測定、免疫放射定量檢測、凝膠擴散沉澱反應、免疫擴散實驗、原位免疫檢測(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標記)、蛋白質印跡、沉澱反應、凝集實驗(例如凝膠凝集實驗、血凝集實驗等)、補體結合實驗、免疫螢光實驗、A蛋白檢測和免疫電泳實驗等。
在一個實施方案中，通過檢測一抗上的標記檢測抗體結合。在另一個實施方案中，通過檢測二抗或試劑與一抗的結合檢測一抗。在再一個實施方案中，標記二抗。本領域已知許多在免疫實驗中檢測結合的方法，其屬於本發明的範圍。正如本發明所周知的，應當提供用於任何免疫方案的沒有載體分子的免疫原性肽。例如，如果肽綴合至KLH，則在篩選實驗中其可綴合至BSA，或直接使用。
前述抗體可用於本領域已知的與IL-32定位和結構相關的方法(例如蛋白質印跡)、檢測其在合適的生物樣品中的水平等。抗體可用於檢測個體生物樣品中的IL-32。生物樣品可為生物流體，例如但不限於含細胞的血液、血清、血漿、組織液、尿、腦脊髓液等。
然後，可使用合適的策略(例如ELISA或放免實驗)和形式(例如微孔、診斷試紙(Dipstick)等)直接測試生物樣品中是否存在人IL-32。或者，樣品中的蛋白可按大小分離，例如利用有或沒有十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，並利用免疫印跡(蛋白質印跡)檢測IL-32存在與否。一般來說，免疫印跡技術採用針對對應於蛋白表位的肽產生的抗體更有效，因此，其特別適合於本發明。
本發明特別優選的實施方案包括用於治療自身免疫病如類風溼性關節炎的IL-32抗體。預期中和IL-32的TNFα誘導活性的IL-32反應性抗體減輕至少一種RA病症，在特別優選的實施方案中，預期其減慢RA病程演進。另外，預期可應用於IL-32系統的有關治療性抗體的生產和使用的教導可見於涉及治療性TNF反應性抗體的美國專利No.6,277,969和美國專利No.6,448,380(都通過引用結合到本文中)。
IV.含IL-32核酸、肽或抗體的藥物組合物本發明進一步提供可包含IL-32多核苷酸序列、IL-32多肽、IL-32生物活性抑制劑或拮抗劑(包括抗體)的全部或部分的藥物組合物，其可為單獨的或與至少一種其它物質組合，例如穩定化合物，其可在任何無菌的生物可相容藥用載體中給予，所述載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖和水。
本發明的方法可用於治療自身免疫病和癌症。肽可在藥物可接受載體(例如生理鹽水)中靜脈內給予患者。可使用胞內傳遞肽的標準方法(例如經脂質體傳遞)。這種方法是本領域普通技術人員周知的。本發明的製劑可用於胃腸外給予，例如靜脈、皮下、肌內和腹膜內給予。使用基因治療也可以實現多肽的胞內治療性給予。
正如醫藥領域所周知的，任何一個患者的劑量都取決於許多因素，包括患者大小、體表面積、年齡、要給予的具體化合物、性別、給予時間和途徑、整體健康情況以及和同時給予的其它藥物的相互作用。
因此，在本發明的某些實施方案中，IL-32核苷酸和IL-32胺基酸序列可單獨給予患者，或與其它核苷酸序列、藥物或激素組合給予患者，或在藥物組合物中與賦形劑或其它藥物可接受載體混合給予患者。在本發明的一個實施方案中，藥物可接受載體是藥學惰性物質。在本發明的另一個實施方案中，IL-32多核苷酸序列或IL-32胺基酸序列可單獨給予易感或罹患疾病的個體。
在其它實施方案中，可使用本領域眾所周知的藥物可接受載體，以適於口服給予的劑量，配製本發明的藥物組合物。這種載體能夠將藥物組合物配製成片劑、丸劑、膠囊、液體製劑、凝膠、糖漿、淤漿、懸浮劑等，由待治療的患者經口或鼻攝取。
適用於本發明的藥物組合物包括其中包含有效量的活性成分以實現計劃目的的組合物。例如，IL-32的有效量可為誘導TNFα產生的量。有效量的確定完全在本領域技術人員的能力範圍之內，尤其是按照本文提供的公開內容。
對於用於本發明方法的任何化合物，都可先由細胞培養實驗估計治療有效量。然後，優選地，可用動物模型(具體地說是鼠模型)制訂劑量，以獲得調節TNFα水平的理想循環濃度範圍。
治療有效劑量指改善病症(例如癌症)的至少一種症狀的IL-32量，或指改善病症(例如自身免疫病，如類風溼性關節炎)的至少一種症狀的IL-32抗體或拮抗劑的量。這種化合物的毒性和治療效力可通過細胞培養或實驗動物中的標準藥學方法確定(LD50，群體50％致死的劑量；和ED50，群體50％治療有效的劑量)。毒性和治療作用之比是治療指數，其可表示為LD50/ED50的比率。優選具有大的治療指數的化合物。由這些細胞培養實驗和另外的動物研究獲得的數據可用於制定人用劑量範圍。這種化合物的劑量優選處於包含ED50而基本沒有或沒有毒性的循環濃度範圍內。在該範圍內的劑量變化取決於使用的劑量形式、患者敏感性以及給予途徑。根據給予途徑，正常劑量可在0.1-100,000μg之間變化，總劑量最高可達約1g。
V.使用IL-32的藥物篩選本發明提供使用IL-32作為靶來篩選可改變促炎細胞因子反應(例如TNFα生產)的藥物的方法和組合物。
藥物篩選技術提供了對與IL-32肽具有適宜結合親合性的化合物的高通量篩選，該技術詳述於WO 84/03564，其通過引用結合到本文中。簡單地說，在固體基質如塑料盤或某些其它表面上合成大量的不同小肽測試化合物。然後，使肽測試化合物與IL-32肽反應並清洗。接著，用本領域眾所周知的方法檢測結合的IL-32肽。
另一種技術使用如上所述產生的IL-32抗體。能夠特異性結合IL-32肽的該抗體與測試化合物競爭結合IL-32。以此方式可使用該抗體檢測具有IL-32肽的一個或多個抗原決定簇的任何肽的存在情況。
本發明設想了許多其它的化合物篩選方法。以上提供的實例僅僅是為了闡述可應用的技術範圍。本領域一般技術人員會認識到，可使用許多其它篩選方法。
具體地說，本發明設想使用用IL-32及其變體或突變體轉染的細胞系來篩選化合物活性，具體的說是高通量篩選組合庫的化合物(例如含104種以上化合物的庫)。本發明的細胞系可用於各種篩選方法。在某些實施方案中，細胞可用於監測細胞表面受體活化後的信號轉導的第二信使檢測。在其它實施方案中，細胞可用於在轉錄/翻譯水平上監測細胞反應的報告基因檢測。
在第二信使檢測中，優選如上所述用編碼IL-32或其變體或突變體的載體轉染宿主細胞。然後用一種或多種化合物(例如來自組合庫的化合物)處理宿主細胞，並檢測有無反應。預期組合庫中的至少某些化合物可用作一種或多種載體編碼蛋白的激動劑、拮抗劑、活化劑或抑制劑。還預期組合庫中的至少某些化合物可用作一種或多種蛋白激動劑、拮抗劑、活化劑或抑制劑，其中所述蛋白在信號轉導途徑中在載體編碼蛋白的上遊或下遊起作用。
細胞還可用於報告基因檢測。報告基因檢測包括使用由編碼核酸的載體轉染的宿主細胞，其中所述核酸包含靶基因的轉錄控制元件(即控制疾病靶的生物表達和功能的基因)，該元件剪接至報告基因的編碼序列。因此，靶基因的活化導致報告基因產物的活化。
實施例提供以下的實施例是為了證明和進一步闡述本發明的某些優選實施方案和方面，不應被解釋為限制其範圍。
在隨後的實施例公開內容中，應用以下的縮寫eq(當量)、M(摩爾)、μM(微摩爾)、N(正常)、mol(摩爾)、mmol(毫摩爾)、μmol(微摩爾)、nmol(納摩爾)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、ng(納克)、1或L(升)、ml(毫升)、μl(微升)、cm(釐米)、mm(毫米)、μm(微米)、nm(納米)、℃(攝氏度)、U(單位)、mU(毫單位)、min.(分鐘)、sec.(秒)、％(百分率)、kb(千鹼基)、bp(鹼基對)、PCR(聚合酶鏈反應)。
另外，使用以下的細胞和生物檢測。人NK細胞系得自Dr.HansKlingerman(Rush Medical Center，Chicago，IL)，將其在含10％FCS、IL-2(50pg/ml)和IL-15(200pg/ml)(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的RPMI1640培養基中培養。小鼠巨噬細胞Raw 264.7細胞、人A549肺癌細胞、猴Cos7腎細胞、Anjou65(人成纖維細胞293T系的亞克隆)、人上皮Wish細胞和人單核細胞THP-1細胞系得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，並按照提供的說明書保持。生物檢測在96孔板中進行。
簡單地說，將Raw細胞(5×105/ml、0.1ml/孔)、A549-Rβ細胞(2×105/ml、0.1ml/孔)和人NK細胞(5×105/ml、0.1ml/孔)接種在96孔板中並培養，直至細胞粘附至板。對於Raw細胞測定，去除用過的培養基，在存在5μg/ml多粘菌素B(Bedford Laboratories，Bedford，OH)的情況下，用含各種濃度rIL-32的新鮮培養基(0.2ml)刺激細胞。對於A549-Rβ細胞測定，去除用過的培養基，用含IL-18(如Kim et al.，JImmunol，166148-154，2001所述生產)的新鮮培養基(0.2ml)刺激細胞。對於NK細胞測定，用IL-12(Peprotech)或IL-18或兩種細胞因子刺激細胞。在沒有FCS的情況下將THP-1細胞(5×105/ml、0.1ml/孔)接種在96孔板中，然後用各種來源的rIL-32刺激細胞。對於12-豆蔻醯佛波醇13-乙酸酯(PMA)THP-1分化檢測，將THP-1細胞(0.25×105/ml、0.1ml/孔)接種在24孔板中，然後用100ng/ml PMA(Sigma，St Louis，MO)刺激48小時，之後用無FCS的培養基清洗細胞，並用rIL-32處理細胞。將平板放置在細胞培養箱中達16-20小時，然後收集培養上清液進行細胞因子檢測。
在使用Combined Colorado Investigational Review Board批准的Histopaque(Sigma，一種含聚蔗糖和泛影鈉的溶液)對健康供者機採血小板之後，由殘餘的白細胞中分離人外周血單核細胞(PBMC)。將PBMC(1.5×107)接種在6孔平板中的含10％FCS的3ml RPMI中，然後用20μg Con A(Sigma)刺激。將平板放置在細胞培養箱中60小時，此後收集培養上清液和細胞裂解物進行IL-32檢測。
按照生物活性單位評價IL-32，因為大腸桿菌生產的rIL-32和哺乳動物細胞生產的rIL-32在活性水平上存在差異，而且因為不同批次之間的活性水平有差異。1單位IL-32被定義為在上述實驗條件下，分別在PMA分化的THP-1細胞和小鼠Raw細胞中誘導2倍的人或小鼠TNFα的IL-32量。1單位大腸桿菌rIL-32的近似濃度相當於20ng/ml，而1單位哺乳動物rIL-32的近似濃度相當於0.1ng/ml(通過ECL和蛋白質印跡計算)。
實施例1鑑別IL-18可誘導基因，包括NK4/IL-32野生型人A549肺癌細胞(A549-WT)表達IL-18Rα，但不表達IL-18Rβ。因此，為了在A549細胞中表達功能性IL-18受體，用IL-18Rβ鍊表達載體轉染A549細胞。簡單地說，在轉染前一天將人肺癌A549細胞(3×105/孔)接種在6孔板中。然後用2ml Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)清洗細胞，並在1ml新鮮培養基中溫育25分鐘。通過將5μl Lipofectamine 2000混合在100μl Opti-MEM中，接著在組織培養箱中溫育5分鐘，製備每孔的轉染混合物溶液。接著，加入2μg質粒DNA、pTARGET/huIL-18Rβ(Kim et al.，J Immunol，166148-154，2001)，隨後是20分鐘的溫育期。向孔中加入轉染混合物溶液，將平板於37℃再溫育4小時。通過向每孔中加入2ml含10％FCS的細胞培養基終止轉染。第二天，胰蛋白酶化細胞，並轉移至15cm平板。在細胞粘附至平板後，用含800μg/ml新黴素(G418，Invitrogen)的新鮮培養基置換培養基。每3天用新鮮培養基更換選擇培養基，直至出現單個集落(約10-14天)。將3MM圓形小紙片滅菌，用胰蛋白酶潤溼，然後用於挑取單個集落。將集落轉移至每孔含1ml選擇培養基的24孔板中。培養單個克隆，直至獲得106個細胞，然後通過RT-PCR檢測每個克隆轉染基因的表達情況，以及在IL-18刺激24小時後以生物測定檢測細胞培養基中的IL-6和IL-8。3個克隆經RT-PCR和生物測定檢測均為陽性。為獲得單個克隆，製備有限稀釋培養物。
如圖1的圖A所示，據RT-PCT測定，用IL-18Rβ(A549-Rβ)構建物(Kim et al.，J Immunol，166148-154，2001)轉染的A549細胞同時表達IL-18Rα和IL-18Rβ鏈。在IL-18(100ng/ml)刺激16小時後，測試穩定克隆(A549-Rβ)誘導IL-8的情況。當A549細胞表達IL-18Rβ時，A549-Rβ細胞在沒有通過產生IL-6和IL-8共刺激的情況下對IL-18起反應，而A549親代細胞系(A549-WT)仍對IL-18無反應(參見圖1的圖B和圖C，N＝7)。
然後，使用A549-Rβ細胞通過微陣列研究IL-18可誘導基因的表達。簡單地說，在實驗前1天，將A549-Rβ細胞以2×106接種在9cm平板中。然後用IL-18(50ng/ml)刺激細胞6小時，此時收集處理的細胞和對照。用Tri-Reagent分離總RNA，並用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化。然後按照Affymetrix的說明使用總RNA進行微陣列分析。使用Superscript II RT(Invitrogen)將總RNA(10μg/ml)轉變成cDNA首鏈。使用T4 DNA聚合酶I合成cDNA第二鏈。在第二鏈合成後，用GeneChip提供的試劑盒清洗反應混合物。使用RNA轉錄物標記試劑盒進行cRNA合成，以產生生物素標記的cDNA。片段化生物素化cDNA，然後雜交。將樣品與Affymetrix GeneChip HG-U133雜交，在Colorado大學健康科學中心的微陣列核心實驗室分析數據。
微陣列數據揭示，IL-18誘導幾種細胞因子基因，包括IL-6和IL-8。先前已知其表達是IL-18可誘導的幾種趨化因子，包括幹擾素-β2和IL-1β，屬於觀察到在IL-18處理作用下表達增加3倍以上(對數底為2)的組別(參見顯示了兩個獨立實驗的數據的表1)。令人感興趣的是，天然殺傷細胞轉錄物4(NK4)也被高度誘導(5.3倍)。最初，NK4基因被描述成活化的NK或T細胞產物(Dahl et al.，J Immunol，148597-603，1992)，儘管還沒有收集到該基因的功能數據。還使用和用於微陣列研究相同的總RNA，通過RT-PCR檢測NK4 mRNA的表達。使用Invitrogen的SuperScript II(Carlsbad，CA)由約1μg總RNA合成cDNA首鏈。用有義引物5′-CTGTCCCGAGTCTGGACTTT-3′(SEQ ID NO1)和反義引物5′-GCAAAGGTGGTGGTCAGTATC-3′(SEQ ID NO2)，以94℃、45秒；70℃、2分鐘；59℃、1分鐘；30個循環進行PCR反應。在IL-18處理的A549-Rβ細胞中檢測到NK4轉錄物，而在未刺激的A549-Rβ細胞中未檢測到NK4轉錄物(參見圖1的圖D)。
表1.通過微陣列分析鑑別的IL-18可誘導基因
還檢測了NK92細胞系中的NK4基因表達(Hoshino et al.，JImmunol，16251-59，1999)。當該細胞系保持在同時含IL-2和IL-15的條件培養基中時，NK4基因在該細胞系中組成型高表達。預期條件培養基中的IL-2有助於在NK92細胞系中觀察到的NK4基因高水平表達。
實施例2重組NK4/IL-32誘導TNFα為確定此極少描述的基因產物的功能，將來自NK92細胞的NK4cDNA(參見圖3，IL-32α)(Dahl et al.，出處同上，1992，其通過引用整體結合到本文中)克隆入pGEMT-Easy(Promega)中進行測序，然後將插入物轉移至pPROEX/Hta(Invitrogen)，以在大腸桿菌中表達，或轉移至pTARGET(Promega)，以在哺乳動物細胞中表達。在大腸桿菌中表達重組NK4，並通過在重組蛋白N端導入His6尾用TALON親合柱(Invitrogen)純化。對TALON親合純化蛋白進行大小排阻層析(Superdex 75，AKTAFPLC)，並用菸草蝕紋病毒(Invitrogen)於4℃消化16小時，以去除His6尾。在磷酸緩衝液(20mM，pH 9)中透析切下的重組蛋白。隨後對該物質進行離子交換層析(HiTrapQFF，AKTAFPLC)。使用三個連續步驟(His-尾親合層析、大小排阻層析和離子交換層析)純化的重組NK4蛋白在10％SDS-PAGE凝膠中跑出約20kDa的均一條帶，隨後用考馬斯藍染色(參見圖2的圖A)。
然後，通過檢測多粘菌素B(100U/ml)存在時小鼠Raw 264.7巨噬細胞的TNFα分泌情況，測試三次純化的重組NK4蛋白的生物活性。小鼠Raw 264.7巨噬細胞對重組NK4有反應，產生大量TNFα，與由離子交換柱上洗脫下的蛋白峰組分相一致(參見圖2的圖A)。按照新發現的NK4生物活性，將該分子重命名為IL-32/TNFα-誘導因子(TAIF)。如圖2的圖B所示，IL-32α在低至400pg/ml(根據IL-32α的理論分子量14.8kDa，為27pmol)的IL-32α濃度下誘導顯著量的TNFα，並以劑量依賴方式增加TNFα生產。眾所周知，TNFα具有多種炎性特性，其在眾多炎性和自身免疫病中起病因作用(Beutler et al.，Blood Cells Mol Dis，24216-230，1998)。
另外，用DEAE-葡聚糖技術，通過用pTARGET/IL-32β表達載體瞬時轉染Cos-7細胞(8×106)，在哺乳動物細胞中生產重組IL-32α(Sompayrac et al.，Proc Natl Acad Sci USA，787575-7578，1981)。如圖2的圖C所示，由IL-32α轉染細胞的濃縮上清液獲得的重組IL-32α(100pg/ml)誘導TNFα生產，而模擬轉染細胞的濃縮上清液不能。利用ECL和免疫印跡評價Cos-7上清液中重組IL-32α的濃度。另外，發現在哺乳動物細胞中生產的IL-32α具有比細菌細胞生產的重組IL-32α更高的TNFα誘導活性。
實施例3鑑別IL-32基因組結構和剪接變體分析IL-32基因的結構及其在人基因組中的定位。另外，通過RT-PCR由人NK92細胞系克隆IL-32，並在IL-2(50pg/ml)和IL-15(200pg/ml)存在下培養。為此，使用以下引物有義引物5′-CTGTCCCGAGTCTGGACTTT-3′(SEQ ID NO1)和反義引物5′-GCAAAGGTGG TGGTCAGTATC-3′(SEQ ID NO2)。如圖3和5所示，由得自NK92細胞的RNA鑑別IL-32的三種剪接變體(作為SEQ IDNO3公開的IL-32α，GENBAN檢索號No.AY495331，作為SEQ IDNO4公開的IL-32β，GENBAN檢索號No.AY495332，以及作為SEQID NO5公開的IL-32δ，GENBANK檢索號No.AY495333)，而不同的剪接變體(作為SEQ ID NO6公開的IL-32γ，GENBANK檢索號No.BK004065)先前已報導為NK4轉錄物(GENBANK檢索號NoNM_004221)。因此，由於可變mRNA剪接，IL-32表達為至少4種變體。
使用NCBI網站的Blast程序確定IL-32基因位於染色體16p13.3。由180kb的人染色體16序列骨架(GENBANK檢索號No.AC108134)鑑別出含IL-32基因的約5kb序列(以SEQ ID NO11列出，GENBANK檢索號No.AY495334)。通過對比剪接變體序列和基因組序列，發現IL-32基因含8個小外顯子，第二個和第三個外顯子具有ATG起始密碼子。IL-32γ在其N端具有另外46個胺基酸(SEQ IDNO14)，因為外顯子3和4之間沒有剪接。但是，在IL-32δ中，沒有第二個外顯子，導致在第三個外顯子中使用ATG起始密碼子，而不是第二個外顯子中的ATG。IL-32α是最豐富的cDNA克隆，因此，該同種型用於本文描述的許多實驗。由於外顯子7和8之間的剪接，IL-32α在其C端缺失57個胺基酸殘基，這與具有單個大外顯子編碼其C端的其它變體相反。IL-32胺基酸序列分析揭示，存在3個潛在的N-豆蔻醯化位點和1個潛在的N-糖基化位點(參見圖4A)。
使用Blast程序檢索NCBI資料庫的IL-32同源物。以此方式，鑑別出馬、牛、綿羊和豬IL-32的表達序列標籤(EST)克隆。馬IL-32β蛋白序列(GENBANK檢索號No.CD469554和BI961524)與人序列具有最高的同源性(31.8％同一性)，接著是牛(GENBANK檢索號No.CK834399和CK832489)、綿羊(GENBANK檢索號No.C0202364)和豬(GENBANK檢索號No.CB287292)序列。人、馬和牛IL-32β蛋白序列的比對示於圖4B。具體地說，已鑑別出綿羊和豬的同種型A，而在馬中已鑑別出了A和B兩種同種型，在母牛中已鑑別出同種型B和C。馬IL-32β和牛IL-32γ的序列每個都由兩個EST克隆組合，可讀框由組合序列推斷。
實施例4IL-32表達分析通過RNA印跡檢測IL-32在各種人組織中的表達。簡而言之，使用合適的限制酶由質粒載體中切出IL-32α和肌動蛋白cDNA插入片段，按大小分離，用GeneCleau II試劑盒(Q-BIO gene，Carlsbad，CA)純化。使用Klenow酶(New England Biolabs，Beverly，MA)通過隨機引發用32P-dCTP(NEN Life Science，Boston，MA)標記cDNA。將含來自不同組織的人poly(A)+RNA的膜(人MTN Blot II)與cDNA探針溫育，通過放射自顯影檢測其結合。如圖8A所示，在大多數組織中檢測到1.2kb的IL-32轉錄物，和其它細胞類型相比，在免疫細胞中檢測到的IL-32水平較高。通過用肌動蛋白片段再探測印跡表明，IL-32 mRNA在免疫組織中高表達不是由於載荷差異。
還在蛋白水平上檢測內源IL-32表達。簡而言之，將A549-Rβ細胞以106細胞/孔接種在6孔板中。在細胞粘附至板後，去除F12K培養基，並用無血清培養基置換，在某些孔中其含IL-18(50ng/ml)、IL-1β(100ng/ml)或LPS(500ng/ml)。48小時後，收集上清液，並用Centricon濃縮器濃縮10倍。如圖8B所示，通過採用親合純化的兔抗人IL-32α多克隆抗體的免疫印跡，檢測對應於內源IL-32的約30kDa的物質。預期大腸桿菌rIL-32和內源性IL-32之間分子量的差異是由於內源性分子的翻譯後修飾，因為胺基酸序列分析揭示存在潛在的N-聯糖基化和豆蔻醯化位點。IL-32分泌到用IL-18(100ng/ml)、IL-1β(100ng/ml)或LPS(500ng/ml)處理的細胞的細胞培養基中，但未刺激細胞(對照)不分泌。檢測細胞培養基中為分泌性分子的IL-32，儘管IL-32在其N端不具有典型的疏水信號肽。IL-18誘導IL-32表達的程度高於IL-1β或LPS。還觀測到60kDa條帶(未列出)，預期其為IL-32的二聚體形式。和單體一樣，在處理細胞的上清液中觀測到60kDa條帶，但未刺激細胞沒有該條帶。
還檢測了IFNγ處理的人上皮Wish細胞中IL-32誘導情況，因為Wish細胞常用於抗病毒檢測和評價IFNγ的其它生物活性。對於IL-32生產的時程，將Wish、A549-WT和A549-Rβ細胞以5×104細胞/孔接種在6孔板中，過夜溫育，然後用IFNγ(100U/ml)、IL-18(50ng/ml)或IL-1β(10ng/ml)刺激。使用親合純化的兔抗IL-32α通過免疫印跡檢測細胞培養基中的IL-32。使用增強的化學發光(NEN Life Science)，使用綴合過氧化物酶的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)顯色印跡。對於通過電化學發光(ECL)檢測IL-32，用生物素標記一等份的親合純化的抗IL-32α抗體，另一等份按照生產商說明(Igen，Gaithersburg，MD)用釕標記。使用重組IL-32α，用生物素和釕標記的抗體建立標準曲線。使用液相ECL法檢測細胞培養基和血清樣品中的各種細胞因子。使用Origen分析儀(Igen)檢測電化學發光的量。
如圖9A所示，在人上皮細胞裂解物中IL-32以時間依賴方式被誘導，46小時後減弱，而未刺激細胞中的IL-32未被誘導。同樣，IL-18和IL-1β以時間依賴方式增加內源性IL-32在A549-Rβ細胞裂解物中的表達(圖9B)，而在A549-WT細胞中IL-32僅被IL-1β誘導(圖9C)。另外，還觀察到IFNγ在A549-WT細胞裂解物中誘導IL-32(數據未列出)。
為了測定在哺乳動物細胞中由IL-32α和β的cDNA表達的重組蛋白是否與內源性IL-32相當，用IL-32α和β的cDNA瞬時轉染Cos7細胞。如圖9D和9E所示，通過免疫印跡測定轉染細胞的細胞培養基和裂解物中存在重組IL-32α和IL-32β。在免疫印跡中重組哺乳動物IL-32的分子大小與圖8B所示的內源性IL-32的分子大小相同。ECL測定揭示，IL-32α和IL-32β在培養基和裂解物中的分布相似，儘管與主要為細胞結合性的IL-32α相比，IL-32β似乎更有效地分泌。
通過含固定在瓊脂糖珠(Affi-gel 15)上的IL-32α的柱，親合純化多克隆抗人IL-32抗體。由Jackson ImmunoResearch獲得綴合過氧化物酶的抗兔免疫球蛋白二抗。因為抗人IL-32抗體特異性識別內源性IL-32，所以通過ECL檢測人受試者(健康個體和膿毒病患者)血清中的IL-32水平。儘管在健康個體血清中檢測到IL-32(42個樣本中的5個)，但IL-32水平低於70pg/ml。相反，膿毒病患者血清中的平均IL-32水平是健康個體血清IL-32水平的35倍高。在開發本發明的過程中首次表明，IL-32是響應細菌感染(直接或間接)產生的炎性細胞因子。另外，在活性類風溼性關節炎患者中檢測到IL-32，這表明其在自身免疫中也起作用。
為檢測對IL-32生產的調節，檢測不同細胞系的細胞培養基以及人PBMC中的IL-32。在IL-18或IL-1β刺激後的A549-Rβ細胞的細胞培養基中檢測到IL-32，但在對照培養基中未檢測到(圖10A)。因為NK4(IL-32)基因分離自IL-2活化的NK細胞，所以用IL-12加IL-18的組合刺激人NK細胞系。如圖10B所示，在NK細胞中IL-12或IL-18顯著誘導IL-32，這兩種細胞因子組合的作用似乎是累積的。通過比較，當該細胞系受到IL-12或IL-18刺激時，基本沒有或沒有誘導IFNγ，而IL-12加IL-18的組合生產IFNγ是高度協同性的(Kim etal.，J Biol Chem，27710998-11003，2002)。在中和性抗IFNγ抗體存在的情況下，通過用IL-12和IL-18刺激NK細胞檢測IL-32的誘導(憑藉IFNγ)。該組合對IL-32誘導沒有作用(數據未列出)。人外周血單核細胞(PBMC)主要含T細胞，單核細胞和B細胞的數量很少。用LPs或ConA刺激新鮮製備的PBMC，收集上清液和裂解物，並檢測IL-32濃度。60小時後，在LPS刺激的PBMC的上清液或裂解物中沒有可檢測的IL-32(數據未列出)。但是，ConA始終誘導IL-32，IL-32存在於上清液和裂解物中。如圖10C所示，裂解物含有的IL-32多於上清液。
實施例5鑑別IL-32反應性信號轉導途徑本實施例提供了評價細胞因子IL-32對κB信號轉導分子抑制劑(IκB)和p38有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的作用的實驗細節。簡而言之，在5μg/ml多粘菌素B(Bedford Lab，Bedford，OH)存在下，用IL-32α(50ng/ml)刺激小鼠RAW 264.7巨噬細胞指定的時間(分鐘)。用激酶裂解緩衝液(Han et al.，J Biol Chem，27747167-47174，2002)裂解細胞。在10％SDS-PAGE凝膠中分離細胞內容物，並轉移至硝酸纖維素膜，該膜隨後用3％BSA封閉。用兔抗IκB探測膜，用山羊抗肌動蛋白(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)標準化。如圖11A所示，IL-32α以時間依賴方式誘導IκB降解，在處理後15分鐘開始，45分鐘時達到最大水平，接著在90分鐘後恢復。
另外，用兔抗磷酸化p38 MAPK探測膜，並用兔抗-p38 MAPK(Cell Signaling，Beverly，MA)標準化。如圖10B所示，在IL-32α刺激後5分鐘磷酸化p38 MAPK急劇增加，然後，在此後的15分鐘至30分鐘下降。令人感興趣的是，在第45分鐘觀察到p38 MAPK磷酸化第二次增加，其下降得更緩慢。
實施例6鑑別IL-32結合蛋白在大腸桿菌中表達重組IL-32α(或IL-32β、IL-32δ和IL-32γ)，並如實施例2所述使用三個連續步驟純化。將約5mg純化的IL-32α固定在Affi-gel 15瓊脂糖珠(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。將各種潛在的受體源上樣於IL-32α親合柱(例如人血清或在IL-32α作用下分泌TNFα的細胞(如Raw 264.7細胞)的裂解物)。徹底清洗IL-32α親合柱，然後用洗脫緩衝液(例如50mM檸檬酸、100mM NaCl、pH 2.5)洗脫IL-32受體。洗脫的級分立即用2 M三羥甲基氨基甲烷(Tris base)中和。以此方式分離的IL-32結合蛋白通過化學分析(例如通過Edman降解和/或質譜分析進行肽序列分析)和生物測定(例如測試純化或重組的受體封閉IL-32α誘導Raw 264.7細胞分泌TNFα的能力)進一步表徵。預期真正的IL-32結合蛋白能夠抑制IL-32生物活性(與用TNFBP觀察到的類似)。還預期其它類型的真正IL-32結合蛋白能夠增強IL-32生物活性(與用IL-6配體結合鏈觀察到的類似)。
實施例7IL-32抗體和IL-32抑制劑在鼠關節炎模型中的治療作用本實施例提供評價IL-32抗體和IL-32拮抗劑(例如可溶性IL-32受體、顯性失活IL-32變體、小分子抑制劑等)作為治療劑在小鼠中治療膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)的作用的實驗細節。簡單地說，如本領域所知(Banda et al.，Arthritis Rheum，463065，2002)，通過皮內注射II型牛膠原蛋白(CII)，在8-10周齡DBA/1J小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)中誘導CIA。在第0天和第21天，每隻小鼠都接受100μl注射，注射液在弗氏不完全佐劑中含200μg CII和200μg滅活結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(Difco，Detroit，MI)。在第21天至第42天之間，每3天以經IP注射給予三種療法中的一種以治療小鼠正常兔IgG，2mg/小鼠；使用HiTrap Protein G HP(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)製備的中和性兔抗IL-32，2mg/小鼠；以及重組IL-32拮抗劑(例如IL-32受體-IgG1 Fc融合蛋白或顯性失活IL-32變體)，2mg/小鼠。在第42天通過麻醉和頸椎脫臼法處死小鼠(每組5隻和5隻未治療小鼠)。
在第21天至第42天之間，每隔一天由盲觀察者對每隻爪使用三點評分法，評價CIA臨床疾病活動狀態0＝正常關節；1＝輕微炎症和發紅；2＝嚴重紅斑和腫脹，影響整隻爪，使用受限；和3＝畸形爪或關節，關節僵硬、關節剛性和功能喪失。臨床疾病活動狀態的總評分基於全部四隻爪，每隻小鼠的最大得分是12。在處死後，在第42天手術切除前爪和右肢，固定在10％緩衝福馬林中，如本領域所知製備組織樣品和組織學分析(Bendele et al.，Arthritis Rheum，432648，2000)。熟練觀察者(對治療處於盲態)對爪、踝和膝的組織學觀察結果評分。數據基於0-5的等級，表示為炎症、血管翳、軟骨損傷和骨損傷的平均評分以及總評分。
使用公開的方法(Banda et al.，J Immunol，1702100-2105，2003)檢測各種免疫參數，其包括但不限於脾細胞和淋巴結細胞的CII特異性增殖、抗膠原蛋白抗體的產生、CII誘導的脾細胞分泌細胞因子(例如使用TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-IRa和IL-10 ELISA)以及關節中的穩態細胞因子mRNA水平(例如TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-IRa、IL-6、I1-18、MIF、TNFβ、LTβ、TGFβ1、TGFβ2)。本發明的某些優選實施方案包含將臨床疾病活動狀態評分和關節損傷的組織學評分降低至少50％(更優選至少75％，最優選至少90％)的IL-32抗體或IL-32拮抗劑。其它的優選實施方案包含將CII誘導的淋巴細胞增殖和/或膠原蛋白結合IgG抗體的血清水平降低至少50％(更優選至少75％，最優選至少90％)的IL-32抗體或IL-32拮抗劑。特別優選的實施方案包含將離體關節中TNFα、IFNγ和/或IL-1β的穩態mRNA水平降低至少50％(更優選至少75％，最優選至少90％)的IL-32抗體或IL-32拮抗劑。重要的是，預期包含本文所述IL-32抗體或IL-32拮抗劑的優選實施方案可用於治療人類風溼性關節炎患者，使用的方法類似於給予TNF-反應性抗體(英夫利昔單抗/REMICADE和阿達木單抗/HUMIRA)和可溶性TNF-受體/免疫球蛋白融合蛋白(依那西普/ENBREL)所用的方法。
實施例8重組IL-32的生物活性如圖6A所示，IL-32α誘導顯著量的TNFα和MIP-2，並以劑量依賴方式增加兩種細胞因子的生產。然後，將IL-32α的生物活性與具有全長C端的IL-32β的生物活性對比。IL-32β在小鼠巨噬細胞Raw細胞系中誘導的TNFα和MIP-2水平和IL-32α類似(圖6B)。儘管所有的實驗都是在多粘菌素B(5μg/ml)存在下進行，但在大腸桿菌中生產的重組蛋白汙染內毒素的可能性仍不能排除。
還在哺乳動物系統中生產重組IL-32，以避免內毒素汙染。rIL-32β產自三種不同的哺乳動物細胞來源Anjou65穩定克隆、Cos7穩定克隆(Cos7-S)和Cos7瞬時轉染體(Cos7-T)。將瞬時和穩定克隆細胞於0.5％FCS中培養4天，然後收穫。因為哺乳動物rIL-32β的最大產量僅為1ng/ml，IL-32α低於100pg/ml的濃度，所以在疊氮化鈉(0.2％)存在下，通過將抗IL-32β單克隆抗體固定在瓊脂糖珠(Affi-Gel Ha，Bio-Rad)上製備親合柱，使用該親合柱純化各種無內毒素的哺乳動物rIL-32β，以防止純化過程中的微生物汙染。在用於生物檢測前，於4℃將純化的rIL-32對含青黴素/鏈黴素(10μg/ml)的RPMI過夜透析。所有三種哺乳動物rIL-32β製品都分別在人PMA分化的THP-1細胞和小鼠Raw細胞中誘導TNFα(圖6C)。大腸桿菌rIL-32α和哺乳動物rIL-32β以劑量依賴方式增加PMA分化的THP-1細胞中的人TNFα產物(圖6D)。而且，高單位的大腸桿菌rIL-32α和哺乳動物Anjou 65rIL-32β製品在未分化的THP-1細胞中誘導人IL-8，而模擬的Anjou65轉染物不能(圖6E)。
實施例9生產抗IL-32單克隆抗體的中和性Fab片段用20μg在弗氏完全佐劑(Sigma)中乳化的rIL-32β抗原免疫5周齡雌性Balb/c小鼠。在第14天和第21天，靜脈內或腹膜內注射給予小鼠在弗氏不完全佐劑(Sigma)中乳化的抗原。三次注射後，處死小鼠，無菌收集脾臟，製備用於融合的脾細胞。簡而言之，使用聚乙二醇1500(Roche Applied Science.Indianapolis，IN)融合1×107脾細胞和1×106NS-1小鼠骨髓瘤細胞(ATCC)。將融合細胞以1×106細胞/ml重懸浮在含10％FCS和HAT的雜交瘤生長培養基中，並接種在96孔平板中。在2周後，以間接ELISA滴定雜交瘤培養上清液。使用IMMUNO-TYPE小鼠單克隆抗體同種型試劑盒(BD Bioscience，SanDiego，CA)，按照生產商的說明確定單克隆抗體類別和亞類。
將約5×106的兩種雜交瘤32-4(IgG1)和32-9(IgG1)細胞腹膜內注射入8周齡的雌性Balb/c小鼠中。1周後，使用無菌皮下注射針收集腹水液。使用A蛋白Sepharose柱(Bio-Rad)純化腹水上清液的抗體，並用0.1M甘氨酸-HCl、pH 2.7洗脫。洗脫的mAb在PBS中透析，並使用Centricon濃縮器(YM-50，Life Sciences，Ann Arbor，MI)濃縮純化的抗體。通過檢測280nm的吸光度確定純化抗體的濃度。
因為抗rIL-32β的親合純化單克隆抗體(32-4)誘導高本底水平的mTNFα，所以製備該單克隆抗體(mAb)的Fab片段。簡而言之，通過與固定化胃蛋白酶(pIERCE，Rockford，IL)於37℃溫育4小時，產生純化的抗IL-32mAb(32-4)的Fab片段。使用G蛋白Sepharose(Amersham Biosciences，Uppsla，Sweden)去除Fc片段和殘餘的未切斷mAb。將Fab片段對PBS於4℃過夜透析，並進行SDS-PAGE，以確認切割完成。在去除Fc片段後本底水平急劇降低，這使得可以評價抗rIL-32βmAb的IL-32中和活性。如圖7A所示，32-4mAb(50ng/ml)的Fab抑制大腸桿菌rIL-32α的生物活性超過70％。如圖7B所示，相同的Fab抑制親合純化的Cos7-S rIL-32β的生物活性超過65％。在這些實驗中，較高濃度的Fab片段沒有進一步抑制IL-32誘導的TNFα生產。
實施例10IL-32抗體和IL-32抑制劑在鼠炎性腸病模型中的治療作用本實施例提供評價IL-32抗體和IL-32拮抗劑(例如可溶性IL-32受體、顯性失活IL-32變體、小分子抑制劑等)作為治療劑在小鼠中治療硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的結腸炎的作用的實驗細節。
簡單地說，如本領域所知(Sivakumar et al.，Gut，50812-820，2002)，在隨意飲水的情況下由第0天至第7天給予2％(重量/體積)硫酸葡聚糖鈉(DSS，分子量40,000，得自ICN Biochemicals)，接著恢復正常飲水，由此在8-10周齡雌性C57BL/6小鼠(TaconicLaboratories)中誘導結腸炎。由第0天開始每天對小鼠稱重，記錄重量變化，直至第13天為止。如下計算每隻小鼠的重量變化百分率重量變化百分率＝(特定日重量-第0天重量)/第0天重量×100。用以下物質治療各組小鼠對照蛋白(50μg或500μg)；鼠抗IL-32mAb(50μg或500μg)；和重組IL-32拮抗劑(例如50μg或500μg的IL-32受體-IgG1 Fc融合蛋白或顯性失活IL-32變體)，每種物質每次均注射200μl體積(無內毒素的PBS)。由第0天至第7天IP注射小鼠。在開始DSS處理後的第0、2、4、6或8天通過麻醉和頸椎脫臼法處死小鼠，使用本領域已知的方法取出組織(例如大腸、淋巴結)並處理，以進行RNA提取、組織病理學和細胞因子分析。預期給予IL-32拮抗劑適於在小鼠中減弱DSS誘導結腸炎病程中的炎症，中和IL-32活性有益於改善與腸病相關的炎症。
實施例11IL-32抗體和IL-32抑制劑在鼠肝炎模型中的治療作用本實施例提供了評價IL-32抗體和IL-32拮抗劑(例如可溶性IL-32受體、顯性失活IL-32變體、小分子抑制劑等)作為治療劑在小鼠中治療LPS誘導的肝損傷的作用的實驗細節，該小鼠用熱失活瘡皰丙酸桿菌(Propioibacterium acnes)致敏(Fas/FasL介導的肝病模型)。
簡單地說，通過IV給予500μg/小鼠的熱失活瘡皰丙酸桿菌(RibiImmuno-Chem Research)，在8-10周齡的雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver Laboratories)中誘導肝炎，12天後如本領域所知(Faggioni et al.，JImmunol，1675913-5920，2001)用50μg/kg LPS IV攻擊小鼠。用以下物質治療各組小鼠對照蛋白(50μg或500μg)；鼠抗IL-32mAb(50μg或500μg)；和重組IL-32拮抗劑(例如50μg或500μg的IL-32受體-IgG1 Fc融合蛋白或顯性失活IL-32變體)，每種物質每次均注射200μl體積(無內毒素的PBS)。在給予瘡皰丙酸桿菌時或LPS攻擊前10分鐘IP注射小鼠。監測小鼠的存活率，或處死收集肝臟，以使用本領域已知的方法進行組織學檢查、mRNA和趨化因子檢測，並收集血液進行IFN-γ和轉氨酶檢測。預期當在LPS攻擊前10分鐘給予時，給予IL-32拮抗劑適於在瘡皰丙酸桿菌致敏小鼠中預防LPS誘導的肝臟損傷以及IFN-γ和Fas配體表達。另外，預期當在用瘡皰丙酸桿菌致敏時給予時，給予IL-32拮抗劑適於降低瘡皰丙酸桿菌誘導的肉芽腫形成、巨噬細胞-炎性蛋白-1α和巨噬細胞-炎性蛋白-2產生。因此，預期肝病(如HCV誘導的肝炎、自身免疫性肝炎和原發性膽汁性肝硬變)患者將由含IL-32拮抗劑的治療方案中獲益。
實施例12IL-32抗體和IL-32抑制劑在鼠缺血性疾病模型中的治療作用本實施例提供了評價IL-32抗體和IL-32拮抗劑(例如可溶性IL-32受體、顯性失活IL-32變體、小分子抑制劑等)作為治療劑在缺血性損傷作用下刺激組織新血管形成的作用的實驗細節。
簡而言之，使用本領域已知的方法(Mallat et al.，Circ Res，91441-448，2002)對雄性C57BL/6J小鼠進行手術，以誘導單側後肢缺血。通過吸入異氟烷麻醉動物。對接近隱靜脈和腿彎動脈分叉處0.5cm的右股動脈進行結紮，然後在常規條件下圈養3或28天。用以下物質治療各組小鼠對照蛋白(50μg或500μg)；鼠抗IL-32mAb(50μg或500μg)；和重組IL-32拮抗劑(例如50μg或500μg的IL-32受體-IgG1 Fc融合蛋白或顯性失活IL-32變體)，每種物質每次均注射200μl體積(無內毒素的PBS)。在第0天和第7天IP注射小鼠。在第3天和第10天，通過用微血管造影術檢測血管密度，定量血管生成程度，並利用雷射都卜勒灌流成像監測缺血誘導的血管形成變化。預期給予IL-32拮抗劑適於在缺血損傷作用下刺激組織新血管生成。
在以上說明書中提及的所有出版物和專利都通過引用結合到本文中。所描述的本發明方法和系統的各種修飾和變化對本領域技術人員是顯而易見的，其並不偏離本發明的精神和範圍。儘管已結合具體的優選實施方案描述了本發明，但應當理解的是，要求保護的本發明不應過度不當地限於這種具體的實施方案。實際上，所描述的本發明實施方式的各種修改對分子生物學、遺傳學、免疫學或相關領域的技術人員是顯而易見的，其屬於權利要求書的範圍。
序列表110The Regents of the University of Colorado，a Body Corporate120調節腫瘤壞死因子α的組合物和方法130UTC 08870140PCT/US2004/0375781412004 11 1216027170PatentIn version 3.2210121120212DNA213人工序列220
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1.一種純化的核酸，所述核酸含有的序列與SEQ ID NO15至少80％相同，其中所述序列編碼IL-32，並且其中所述序列含有大致緊密相連的IL-32的外顯子3和外顯子4。
2.權利要求1的核酸，其中所述IL-32是含SEQ ID NO7列出的胺基酸序列的α同種型。
3.權利要求1的核酸，其中所述IL-32是含SEQ ID NO8列出的胺基酸序列的β同種型。
4.權利要求1的核酸，其中所述IL-32是含SEQ ID NO10列出的胺基酸序列的δ同種型。
5.權利要求1的核酸，其中所述序列沒有IL-32的內含子4。
6.權利要求1的核酸，其中所述序列與SEQ ID NO15至少90％相同。
7.權利要求1的核酸，其中所述序列選自SEQ ID NO3、SEQ IDNO4和SEQ ID NO6。
8.權利要求1的核酸，其中所述序列有效連接至外源啟動子。
9.權利要求8的核酸，其中所述核酸包含在載體中。
10.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求9的載體。
11.一種純化蛋白，所述蛋白由權利要求1的核酸編碼。
12.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32是含SEQ ID NO7列出的胺基酸序列的α同種型。
13.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32是含SEQ ID NO8列出的胺基酸序列的β同種型。
14.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32是含SEQ ID NO10列出的胺基酸序列的δ同種型。
15.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32不是γ同種型。
16.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32不包含SEQ ID NO14列出的胺基酸序列。
17.權利要求11的蛋白，其中所述IL-32是在選自細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞的細胞中表達的重組蛋白。
18.權利要求17的蛋白，其中所述重組蛋白是融合蛋白。
19.一種抗體，所述抗體結合權利要求11的蛋白。
20.權利要求19的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
21.一種權利要求20的單克隆抗體的Fab片段。
22.權利要求20的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體選自32-4和32-9。
23.權利要求20的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是人源化單克隆抗體。
24.權利要求20的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體抑制IL-32誘導的靶細胞生產TNFα。
25.權利要求20的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體在靶細胞中抑制II-32誘導的IκB降解。
26.權利要求20的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體在靶細胞中抑制IL-32誘導的p38 MAPK快速磷酸化。
27.一種誘導TNFα產生的方法，所述方法包括在適於誘導TNFα產生的條件下使至少一種細胞與IL-32蛋白接觸。
28.權利要求27的方法，其中所述IL-32蛋白選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型。
29.權利要求27的方法，其中所述至少一種細胞包括白細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述白細胞選自單核細胞和巨噬細胞。
31.一種治療受試者的方法，所述方法包括a)提供受試者和結合IL-32的抗體；和b)將所述抗體給予所述受試者。
32.權利要求31的方法，其中所述IL-32選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型。
33.權利要求31的方法，其中所述受試者患有、疑似患有自身免疫病，或具有自身免疫病風險。
34.權利要求33的方法，其中所述自身免疫病選自多發性硬化、重症肌無力、自身免疫性神經病、自身免疫性葡萄膜炎、Crohn病、潰瘍性結腸炎、原發性膽汁性肝硬變、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自身免疫性血小板減少、1型糖尿病、Grave病、Hashimoto甲狀腺炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、顳動脈炎、抗磷脂綜合症、血管炎、Behcet病、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、脊椎關節病、Sjogren綜合症、牛皮癬、皰疹樣皮炎、尋常型天皰瘡和白癜風。
35.權利要求31的方法，其中所述抗體選自人單克隆抗體和人源化小鼠單克隆抗體。
36.權利要求33的方法，其中所述給予在適於減輕自身免疫病的至少一種症狀的條件下進行。
37.權利要求31的方法，其中所述受試者為膿毒病患者。
38.一種篩選IL-32抑制劑的方法，所述方法包括a)提供權利要求11的IL-32蛋白和至少一種藥物候選物；和b)分析所述藥物候選物對所述IL-32蛋白的至少一種活性的作用。
39.權利要求38的方法，其中所述IL-32是選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型的重組蛋白。
40.權利要求38的方法，其中所述藥物候選物選自IL-32反應性單克隆抗體和顯性失活IL-32變體。
41.權利要求38的方法，其中所述IL-32蛋白的至少一種活性包括上調TNFα表達。
42.一種治療受試者的方法，所述方法包括a)提供受試者和權利要求11的IL-32蛋白；和b)將所述IL-32蛋白給予所述受試者。
43.權利要求42的方法，其中所述IL-32是選自α同種型、β同種型、γ同種型和δ同種型的重組蛋白。
44.權利要求42的方法，其中所述受試者患有、疑似患有癌症，或具有癌症風險。
全文摘要
本發明涉及與白介素－18可誘導的細胞因子有關的組合物和方法，該細胞因子稱為腫瘤壞死因子α誘導因子(TAIF)或白介素－32(IL－32)。具體地說，本發明部分地通過調節腫瘤壞死因子α表達，提供治療自身免疫病和癌症的組合物和方法。
文檔編號C07K19/00GK101018808SQ200480040092
公開日2007年8月15日 申請日期2004年11月12日 優先權日2003年11月12日
發明者S·-H·金, C·A·迪納雷洛, T·阿扎姆 申請人:科羅拉多州大學評議會