Hiv藥物疫苗的製作方法

2023-06-16 01:11:01 2

專利名稱：Hiv藥物疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含HIV抗原的多肽，尤其涉及包含突變的HIV序列的多肽，該突變序列保留了它們天然的CD8+表位。而且本發明涉及引入了附加的輔助T細胞表位的突變HIV序列。
背景技術：
人類免疫缺陷病毒(HIV)是一種致病病毒，可以導致虛弱和致死的免疫缺陷，例如，愛滋病。儘管有一些可以延長預期壽命，增加感染個體的生命質量的療法，例如對於愛滋病，但是此疾病通常是致命的。
消滅或者控制HIV感染病人體內的病毒是一個難題。
預防HIV感染是一個難題，迄今大部分仍無法為社會所解決，例如限制性行為和/或者加強皮下注射針的使用者採用滅菌操作。
藥物預防HIV感染仍然是一個先進的研究領域。需要有效的HIV免疫對策被發現。
即使產生了針對HIV病毒粒子某些單元的免疫反應，但仍然存在一些可改善免疫反應的問題，包括優勢免疫，病毒逃逸和病毒蛋白的遞呈。顯然，HIV病毒粒子應用於疫苗是非常危險的。此外，如果與天然蛋白相同的蛋白具有不良的效果，那麼它們的應用本身也是有問題的。而且，這些蛋白本身具有免疫抑制性和/或者缺乏足夠的CD8+T細胞表位，不能引起合適的強或廣的免疫反應。
由CD8+T細胞的突變，尤其是優勢免疫的CD8+T細胞表位的突變能引起病毒逃逸，病毒逃逸是病毒免疫中的一個重要難題。當前的疫苗不能夠募集輔助T細胞，因此產生的免疫反應範圍窄和/或者弱。天然的病毒序列受體內進化壓力影響也許含相對較少的免疫顯著表位。此外，優勢免疫效應能夠改變某些CD8+T細胞表位的臨床價值，使免疫反應集中於這些表位。很明顯地，這足以強調優勢免疫的問題，例如導致在該表位突變的病毒系的亞選擇，可以導致潛在的致死的病毒逃逸(例如，見Barouch et al.2002 Nature415 p.335)。
申請WO02/32943(Nabel and Huang)揭示HIV基因ENV，GAG和POL的修飾能夠增強基因免疫的免疫原性。尤其是，這些修飾集中在ENV的糖基化，集中在編碼delta CFI HIV ENV的核酸構建體。此外，ENV切割位點和融合區的特異性缺失，及7個重複基因1和2的間隔也被揭示。還描述了用編碼GAG或編碼GAG-POL的DNA質粒進行免疫，用GAG-POL質粒免疫的效果最好。申請WO02/32943的大部分內容是關於揭示列於表1和WO02/32943的權利要求的特定質粒。還要求保護這些質粒不同部分的類似物，及至少95％的序列一致性的片段。為了破壞Nef的功能，例如申請WO02/32943中限制I類主要組織相容性複合物(MHC)和/或CD4的表達，在HIV-1PV22的nef基因中引入點突變。PV22與HXB2參考序列(見實施例8)在突變位點上一致。因此可以看出申請WO02/32943中的突變破壞了天然表位。例如，在構建VRC4301中Nef多肽的胺基酸替代物為P69A、P72A、P75A、P78A、D174A和D175A。在這6個突變中每一個均位於實施例8中的一個特定表位，因此在修飾的Nef基因中沒有保留天然表位。構建VRC4306、VRC4309、VRC4310、VRC4311、VRC4312和申請WO02/32943中的相似構建中，逆轉錄酶突變(D771H)存在於YMDD基序中(見表位圖RT 183-186)，此基序含有許多記錄表位。因此在現有技術中的構建體中沒有保留這些表位。此外，通過如VRC 4312和相似構建體中所描述的截短融合，產生了申請WO02/32943中所揭示的合成的gag/pol/nef基因。參照VRC4312，合成的gag基因與編碼合成nef基因的序列連接，其5』端51個胺基酸缺失；pol多聚蛋白5』端77個胺基酸缺失，然後與缺失tag終止密碼子的nef的3』端連接。這些pol和nef的截短引起表位缺失，因此天然表位沒有以全長gag/pol/nef基因的形式保留。
申請WO02/022080(Merckand Co.)揭示了HIV1-Gag、Pol和Nef的修飾。其中描述的主要修飾是gag基因、Pol和Nef的密碼子優化。沒有提到Gag多肽的突變，只是編碼的核苷酸密碼子進行了優化。申請WO02/022080中的實施例17提出了蛋白Pol的不同突變；提出了9個點突變，其中有3個突變分別位於此蛋白的逆轉錄酶、RNA酶和整合酶區。至少HIV-1 Pol的突變D112A，D187A，D188A，D445A和D500A位於人的表位中，因此沒有保留天然表位。至少FHV-1和IRV-1中Nef的突變『LLAA』(例如L164A，、L165A雙突變)位於人的表位中，因此在突變的Nef多肽中沒有保留天然表位。
申請WO03/025003揭示了不同改變的gag基因構建體，也提到了nef基因和pol的構建體。nef基因構建體是從nef的N端截短去除了表位。gag基因構建體沒有被突變。
本發明找到了解決上述討論的一些問題的方法。
發明概述本發明是基於HIV來源的CD8+T細胞表位的顯著有效遞呈的設計而完成。該方式能夠產生最強和最廣的免疫反應。
本發明通過改變含有表位的多肽序列來實現。這樣可以破壞病毒多肽的天然生物學功能，而有利於使它們安全應用於疫苗，同時謹慎地保留了現有技術已知將被破壞的天然表位。
本發明中，將補充的(例如，非天然的)輔助T細胞表位也引入到抗原多肽中，從而更有利地增強和擴大免疫反應。
因此，一方面本發明提供了一種重組多肽，其包含的胺基酸序列來源於下面其中至少一種(i)HIV gag基因產物；(ii)HIV基因pol產物；或者(iii)HIVnef基因產物，其中胺基酸序列與上述基因產物的天然序列相比較被突變並且基本上保留了如詳述於實施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1-440和nef的基因產物的相應部分的全部天然CD8+T細胞表位。
另一方面，本發明涉及一種如上面所述的重組多肽，其包含來源於(i)、(ii)和(iii)中至少兩種的胺基酸序列。當多肽僅包含來源於(i)、(ii)和(iii)中兩種的胺基酸序列時，優選地來源於(i)和(iii)，即gag和nef。
另一方面，本發明涉及一種如上面所述的重組多肽，其包含來源於(i)、(ii)和(iii)的胺基酸序列。
優選地，重組多肽包含的(i)、(ii)和(iii)來源的每個序列與該基因產物的天然序列相比較都產生了突變。優選每個序列基本上保留了全部天然CD8+T細胞表位，更優選的是保留了所有的所述表位。
另一方面，本發明涉及如上面所述的一種重組多肽，其中來源於(i)和/或(ii)和/或(iii)的胺基酸序列從多肽的N端到C端以(i)-(ii)-(iii)的順序排列。
另一方面，本發明涉及一種重組多肽，其包含的胺基酸序列來源於(i)HIV gag基因的產物；(ii)HIV pol基因的產物；和(iii)HIV nef基因的產物，其中胺基酸序列與該基因產物的天然序列相比較被突變並且基本上保留了如詳述於實施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1-440和nef的所述基因產物的全部天然CD8+T細胞表位，該多肽所含的胺基酸序列與SEQ ID NO9至少有75％的一致性。優選地，該多肽所含的胺基酸序列與SEQ ID NO9至少有95％的一致性。
另一方面，序列一致性是指表位間的序列的一致性。這就是說表位與天然序列或參考序列的表位具有100％的序列相同，而所引用的序列一致性是針對序列中其餘的非表位區，也就是說它是針對表位間的區域而言。優選地，目前所有的表位間區域的一致性是可以計算的。優選地，「表位」是指表位已被作圖的線性胺基酸序列，優選關於實施例8中已被作圖的表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其包含SEQ ID NO9，或者與其至少有95％一致性的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其進一步包含一個抗體識別標籤。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中所述標籤是一個含SEQ ID NO8中所示序列的HA標籤。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其進一步包含一個CD8+T細胞表位的標籤。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中所述標籤是一個gp160來源的標籤，其包含SEQ ID NO7所示的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，該多肽所包含如SEQID NO1所示的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，該多肽包含來源於HIVnef基因產物的胺基酸序列，所述重組多肽序列被突變以破壞nef序列的功能，所述nef序列進一步包含一個或多個天然nef基因中並不存在的輔助T細胞表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其包含一個或多個輔助T細胞表位，這些表位在天然nef序列中並不存在，所述表位在圖3A顯示。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其進一步包含如實施例8中的基本上全部的天然nefCD8+T細胞表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其進一步包含如詳述於實施例8中的基本上全部的天然nef輔助T細胞表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO6所示的序列，或者與其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，該多肽包含來源於HIVpol基因產物的胺基酸序列，該重組多肽序列被突變以破壞pol序列的逆轉錄酶活性，其中所述重組多肽中基本上保留了如詳述於實施例8所示的RT(pol)的胺基酸1-440的天然pol序列的全部CD8+T細胞表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中pol序列的逆轉錄酶活性通過天然pol基因核心區來源的內部序列的重複及所述pol序列的氨基端和羧基端的交換被突變。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中該重複的內部序列包含TPDKKHQKEPPF(SEQ ID NO4)。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中該多肽包含如SEQ ID NO12所示的序列，或者與其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，該多肽包含來源於HIVgag基因產物的胺基酸序列，該重組多肽序列被突變以破壞gag基因產物的加工，該gag序列進一步包含一個被破壞的豆蔻醯化位點，其中在所述重組多肽中基本上保留了如詳述於實施例8所示的p17和p24(gag)的天然gag序列的全部CD8+T細胞表位。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中通過p17和p24功能域(domains)的交換來破壞gag的加工，通過將第二個甘氨酸突變成丙氨酸來破壞豆蔻醯化位點。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO13所示的序列，或者與其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種重組多肽，其中HIV是HIV分化體B(clade B)。
另一方面，本發明涉及編碼上述多肽的重組核酸。
另一方面，本發明涉及一種重組核酸序列，其包含SEQ ID NO11，或者與其遺傳密碼不同的僅在於沉默突變的序列，或者與其至少有95％的一致性的序列。
另一方面，本發明涉及編碼上述多肽的一種病毒載體。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種病毒載體，其中所述病毒載體是MVA或來源於MVA的載體。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種病毒載體，其中所述載體是禽痘或來源於禽痘的載體。
另一方面，本發明涉及如上所述的一種病毒載體，其中所述載體是FP9禽痘載體。關於這個載體的詳細說明可以從申請WO03/047617中獲得，將其作為參考併入本文。
另一方面，本發明涉及上述多肽在藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及上述多肽在製備治療或預防HIV感染的藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及上述多肽在製備抗HIV感染免疫藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及上述核酸在藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及上述核酸在製備治療或預防HIV感染的藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及上述核酸在製備抗HIV感染免疫藥物中的應用。
另一方面，本發明涉及一種免疫受試者獲得抵抗HIV感染的方法，其包括給受試者施用上述多肽或核酸。
另一方面，本發明涉及上述多肽或核酸在基礎-加強(prime-boost)免疫方案中作為引發劑(primingagent)或者加強劑(boostingagent)的應用。基礎加強免疫是公知的技術，其詳細說明可以從WO98/056919獲得，同時將其作為參考合併入本文。
另一方面，本發明涉及上述多肽或核酸在誘導免疫反應中的應用。該免疫反應可以是例如細胞免疫反應如CD8+或CD4+反應，或者體液(抗體)反應。而且本發明提供了在受試者中引發免疫反應的方法，其包括給需要治療的受試者施用本文所述的多肽、核酸或載體。
另一方面，本發明涉及一種核酸載體，其包含上述核酸序列或者編碼上述多肽的核酸序列。
另一方面，本發明涉及腺病毒載體，其包含上述核酸序列或編碼上述多肽的核酸序列。
另一方面，本發明涉及包含上述核酸序列或者編碼上述多肽的核酸序列的載體，該載體是基於水泡性口炎病毒(VSV)，腺伴隨病毒(AAV)，α病毒，仙臺病毒或單純皰疹病毒。
另一方面，本發明涉及包含上述核酸序列或者編碼上述多肽的核酸序列的痘病毒載體。
另一方面，本發明涉及一種質粒，其選自p29D.gpn，pOPK6.gpn和pSG2.gpn。
發明詳述定義本文使用的術語「腺病毒」包括腺病毒科(Adenoviridae)的多個成員。該科依次包含三個屬哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)，禽類腺病毒屬(Aviadenovirus)和鳥類腺病毒屬(ATadenovirus)。本發明尤其考慮採用綿羊的腺病毒(ovine adenovirus)(一種鳥類腺病毒屬)。
「CD8+T細胞表位」是指一段胺基酸序列，它是可以被通常與I類主要組織相容性複合物相結合的CD8+T細胞所識別的肽。尤其是，所述的「所有」CD8+T細胞表位和/或「所有已知的」CD8+T細胞表位是指目前已知的表位，如在例8、HIV分子免疫2002通過蛋白繪製細胞毒性T淋巴細胞的表位位置圖；理論生物學和生物物理學，Los Alamos國家實驗室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL Epitope LocationsPlotted by Protein；Theoretical Biology Biophysics，Los Alamos NationalLaboratory，Agust 7，2003)中詳細說明的表位。根據本發明，在修飾的多肽中保留了基本上所有的人的CD8+T細胞表位；然而，其它哺乳動物種相關的CD8+T細胞表位，例如鼠的CD8+T細胞表位則可能被缺失。CD8+T細胞與CTLs(細胞毒性T淋巴細胞)同義。
同樣，「輔助T細胞表位」也是指一種可被通常與II類主要組織相容性複合物相結合的輔助T細胞所識別的肽；「所有的」和/或「所有已知的」輔助T細胞表位如在實施例8、HIV分子免疫2002通過蛋白繪製細胞毒性T淋巴細胞的表位位置圖；理論生物學和生物物理學，LosAlamos國家實驗室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL EpitopeLocations Plotted by Protein；Theoretical Biology Biophysics，Los AlamosNational Laboratory，Agust 7，2003)中詳細說明的表位。根據本發明，在修飾的多肽中保留了基本上所有的人的輔助T細胞表位；然而，其它哺乳動物種相關的輔助T細胞表位，例如鼠的輔助T細胞表位則可能被缺失。輔助T細胞與T輔助細胞同義。「基本上所有」是指至少99％；優選地，它是指至少98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％或者85％。在一個選擇性的實施方案中，「基本上所有」是指除一個以外的全部，除兩個以外的全部，除三個以外的全部，除四個以外的全部，除五個以外的全部，除六個以外的全部，除七個以外的全部，除八個以外的全部，除九個以外的全部，除十個以外的全部，除十一個以外的全部，除十二個以外的全部，除十三個以外的全部，除十四個以外的全部，除十五個以外的全部。
如果被作圖的肽序列發生突變，例如參考實施例8，那麼表位被認為「缺失」或者「破壞」或者「沒有保留」。優選地，保留所有的表位，參見實施例8所示。
本文所用的「天然」序列或「參考」序列是指原始序列，要求保護的多肽或核酸序列是根據此原始序列所設計或來源於此原始序列。無論何處此術語都應當採用其通常的意思，就是指自然界存在的病毒中的相應基因的序列。然而，在自然界沒有發現單一的HIV病毒，而是存在著許多不同的分化體和在這些分化體中的許多不同的分離群或克隆體，這對本領域專業人員是顯而易見的。因此，當本發明的特定序列是根據特定的克隆體或分離群而設計或衍生時，那麼「天然」或「參考」序列是指該特定克隆體或分離群本身的序列。然而，在本領域已經形成了許多已知的共有序列，共有序列實際上通過許多不同的分離或克隆的序列的比較或累積有時被更新，這些分離或克隆的序列可能在一個或多個核酸或胺基酸序列位點上是趨異進化的。當本發明的構建體是根據這樣的共有序列來設計或衍生時，則這些共有序列將被認為是天然或者參考序列。
優選地，本文所述的「全長」g/p/n基因產物的所有表位都被保留下來。優選地，即使包含於基因產物中的非表位區域被截短或缺失，所有所述表位仍保留下來。
天然或參考序列應該優選在逐個基因的基礎上進行考慮。例如本發明的構建體應包含gag基因、nef基因和pol基因。這些基因每個均含天然或參考序列。每個基因有同樣的來源，例如，同樣的全部共有序列，或者每個基因的天然或參考序列有不同的來源，例如，gag和pol參考序列來源於2001分化體B(clade B)共有序列，而nef參考序列則來源於2000分化體B共有序列，反之亦然。參考序列(共有的和克隆的)可以從本文所討論的Los Alamos資料庫中找到(HIV分子免疫2002通過蛋白繪製細胞毒性T淋巴細胞的表位位置圖；理論生物學和生物物理學，Los Alamos國家實驗室，2003年8月7日(HIV Molecular Immunology 2002Maps of CTL Epitope Locations Plotted byProtein；Theoretical Biology Biophysics，Los Alamos National Laboratory，August 7，2003))。2001分化體B共有序列可以在http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/ALIGN 02/ALIGN-INDEX.html上找到，而2000分化體B共有序列可以在http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/ALIGN_01/ALIGN-INDEX.html上找到。
「HIV」是人類免疫缺陷病毒，它通過侵犯體內CD4+細胞來引起免疫缺陷。本文使用的術語「HIV」包括任何人類免疫缺陷病毒，其包括HIV-1和HIV-2的全部類別和亞型(分化體)，例如HIV-1M和HIV-1 O類；本發明包括每個已知的分化體；優選的是HIV-1分化體B。Gag，pol和nef基因產物是本領域公知的並且也詳述於實施例8。
對本發明的不同分化體的應用指導也可在下述文獻中找到HIV序列概要，2002，Kuiken C，Foley B，Freed E，HahnB，Marx P，McCutchan F，Mellors J，Wolinsky S，and Korber B，編輯，由理論生物學和生物物理學組，Los Alamos國家實驗室出版，LA-UR號03-3564.(HIV Sequence Compendium 2002 KuikenC，Foley B，Freed E，HahnB，Marx P，McCutchan F，Mellors J，Wolinsky S，andKorber B，editors.Published by the Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos National Laboratory，LA-UR number 03-3564)，將其作為參考合併於此。尤其是HIV-1分化體A，B，C和D及許多分離體的共有序列資料可以在此書的第490-550頁中找到；HIV-2分化體A，B，C和D及許多分離體的共有序列數據可以此書的在第554-578頁中找到。優選地，HIV是HIV-1或HIV-2，最優選的是HIV-1。優選地，HIV是分化體A，B，C和D，優選的是分化體B或D，更優選的是分化體B。HIV序列可以與HXB2參考序列(實施例8)比對，因此，不論採用哪個分化體，都可以識別g/p/n基因並且繪製其相應的表位。這項工作可以通過手工來進行，但優選採用Los Alamos資料庫的「HXB2 Numbering Engine」(http:www.hiv.lanl.gov/content/hiv-db/NUM-HXB2/HXB2.MAIN.html)實現此目的。
本文提到的「突變」包括在多肽的胺基酸或核酸中進行的任何添加，缺失或替代。通常突變改變所述多肽的胺基酸序列以使其與原序列或天然多肽序列不同。
在本發明中，經常引入突變來去除或改善病毒蛋白已知的生物學活性。因此，優選地，當上述序列相對於天然序列發生突變時，這意味著突變使病毒多肽減少了、優選去除了一個或多個生物學活性。本文描述了使病毒特有的生物學活性減少或去除的特定突變的例子。而且與病毒功能相關的基序或功能域在本領域是公知的。然而，如本文所述，本發明的重要之處在於，當用於減少或去除生物學活性的突變發生時，天然表位被保留了下來。
本文所述的「重組多肽」是與天然等價多肽序列不同的肽，它可以通過包括DNA合成和處理的基因重組技術而製得。重組多肽也包括不通過重組方式產生的多肽，而是包括通過已經設計並正在使用的重組DNA技術產生的多肽或者，優選地包括通過這種技術設計的與多肽相同的序列。
本文提到的「免疫反應」是針對抗原序列的細胞反應(包括但不限於CD4+和CD8+)或者體液反應，或者是兩者的組合。
本文用於定義核酸片段和/或多肽序列的基因名，例如『gag』、『pol』、『nef』等優選具有其通常的意思。通常大部分術語用來描述多肽序列，或編碼該多肽序列的相應的核酸序列。
本文所述的「保護性免疫反應」是指有預防和/或者治療效應的抗原特異性免疫反應。
病毒逃逸突變可以發生在任何表位並且能夠導致病毒逃逸。通過提供更多的表位，很有可能有一些表位保持未突變。此外，本發明通過有利地提供額外的輔助T細胞表位，使免疫反應擴大和/或者加強。
因此，在一個實施方案中，本發明有利地克服了了能夠影響傳統疫苗的優勢免疫效應。
已證明，本發明的GPN序列(SEQ ID NO1)中存在著HIV分子免疫學資料庫中所有已鑑定出的nef人表位(包括CD8+T細胞和輔助T細胞表位)。
正如上面所提到的，WO02/32943(Nabel and Huang)公開了很多HIV疫苗領域內的內容。從其說明書中可以明顯地看出，本發明與其所公開的顯著不同。在優選實施方案中，本發明涉及包含和/或編碼來源於HIV的蛋白的物質，它明顯排除了WO02/32943中所揭示的任何物質，優選排除了任何與WO02/32943中所揭示的有95％或更高一致性的物質。
正如上面所提到的，WO02/022080(Merck and Co.)在HIV疫苗領域中公開了很多內容。從其說明書中可以明顯地看出，本發明與其所公開的顯著不同。在優選實施方案中，本發明涉及包含和/或編碼來源於HIV的蛋白的物質，它明顯排除了WO02/022080中所揭示的任何物質，優選排除了任何與WO02/022080中所揭示的有95％或更高一致性的物質。
正如上面所提到的，WO03/025003在HIV領域公開了很多內容。從說明書中可以明顯地看出，本發明與其所公開的顯著不同。在優選實施方案中，本發明涉及包含和/或編碼來源於HIV的蛋白的物質，它明顯排除了WO03/025003中所揭示的任何物質，優選排除了任何與WO03/025003中所揭示的有95％或更高一致性的物質。
CD8+T細胞表位
CD8+T細胞表位可以通過實驗來鑑定，也可以通過對所關注的序列進行分析而預測。優選地可以應用ProPred程序(表位預測程序，採用基於矩陣的預測算法，此算法在Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和Singh and Raghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37中公開，例如可以從(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)找到)來預測/識別。
本發明的一個有益之處是在所關注的多肽或編碼它們的核酸中保留了天然表位。
在突變和基因構建過程中可以添加或者引入新的CD8+T細胞表位。
輔助T細胞表位輔助T細胞表位可以通過實驗來鑑定，也可以通過對所關注的序列進行分析而預測。優選地可以應用ProPred程序(表位預測程序，採用基於矩陣的預測算法，此算法在Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和SinghandRaghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37中公開，例如可以從(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)找到)來預測/識別。
優選地，本發明所關注的多肽或編碼它們的核酸中保留了天然輔助T細胞表位。
而且，本發明的有利之處在於提出了新的輔助T細胞表位，這些表位對含所述表位的抗原的免疫反應具有明顯加強和/或者擴大的作用。在本發明的一個優選實施方案中，增加了輔助T細胞表位數量的提供。
在本發明的另一個優選實施方案中，創建了新的輔助T細胞表位和/或將新的輔助T細胞表位引入到本發明的多肽中，因而增強了免疫反應。
在一些實施方案中，本發明包含重組禽痘株FP9和/或重組修飾的Ankara痘苗病毒(vaccinia virus)，(MVA)，每個均表達包含抗原肽序列的一個新的融合蛋白，此抗原肽序列可以在I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)，優選分化體B的gag、pol和nef基因的翻譯產物中找到。
本發明也涉及這些載體在例如基礎-加強免疫(包括單次基礎-多次加強的基礎-加強免疫策略)的免疫方法中的用途，。正如下面所討論的，這兩個重組病毒中任一個或兩者加強DNA質粒介導的基礎免疫(引發)的用途已經顯示了在哺乳動物例如齧齒動物中誘導產生了強的免疫反應，並且也發現在靈長目動物例如人中的這種應用。本發明也涉及HIV-1感染的人的治療性免疫療法，例如使用本發明的抗原基因與HAATR聯合進行，和/或HIV-1感染的高危人群的預防性免疫治療。
有益地，本發明的載體採用了合適的密碼子選擇來優化蛋白在哺乳動物細胞中的表達。有利的是採用了人的密碼子選擇。
在一個優選實施方案中，本發明的治療性抗原包括基於HIV-1(優選分化體B)產物、gag、pol和nef的基因產物的一種融合蛋白。優選地，所述抗原通過本文所述的兩個重組痘病毒(pox viruses)中的一個或兩個來傳遞。
本發明一方面提供包含抗原肽序列的新的融合蛋白，此抗原肽序列來源於I型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)，優選分化體B的gag、pol和nef基因的翻譯產物。
優選的融合蛋白的胺基酸序列如圖1所示。優選的編碼該胺基酸序列的核酸序列如圖6所示。由於遺傳密碼的簡併性，本領域技術人員能理解可能存在很多可能的核酸序列，而所述核酸序列只是其中一個優選的例子。
基因產物在融合蛋白中的順序優選是GAG-POL-NEF。這也是它們在HIV基因組中的排列方式。其它順序也同樣有效。本領域技術人員有能力改變此順序來滿足特定應用的需要，或者甚至只是為了更容易構建和/或試劑的處理。
在一個優選實施方案中，本發明的構建體對優勢免疫具有有益的效果。優勢免疫阻礙了現有技術的疫苗，尤其是對於gag表位。這在上面已經討論過。本發明在實例部分研究了優選的GPN構建中GAG的3個表位，每個均能產生免疫反應。在優選實施方案中將進一步揭示如何來監測整個融合蛋白的免疫反應(詳細描述如下)。
很明顯地，一些GPN蛋白是可以缺失的，例如通過缺失可以減少構建體的大小。實際上，某些個別基因是有其獨特應用的。優選地在此揭示的gpn構建體沒有被截短。沒有結合任何理論，作為一個比公開的基因內實體更小的單一蛋白如果單獨應用會有較低的免疫原性。因此在一個優選實施方案中，本文所揭示的gpn基因沒有截短/缺失。優選地，g/p/n基因中的每個均使用其全長。
本發明的免疫原性成分通常是多肽，這對本專業讀者來說是顯而易見的。然而，本發明涉及的是這些多肽和編碼多肽的核酸，無論它們採用的是DNA、質粒、病毒載體或其它實體形式。依據本發明提出的特定應用，本領域技術人員生產抗原多肽的實際方式可以有所不同。多肽可以是在體外生產，或者優選在體內生產，或者在細胞內或細胞外生產。本文描述了所採用的特定方式。
GAGGAG蛋白有兩個功能域，p17間質蛋白和p24核衣殼蛋白，兩者對HIV病毒樣顆粒的組裝的是必要和充分的。本發明的gag基因中，根據國際愛滋病疫苗倡議(International Aids VaccinationInitiative)(WO01/47955)，p17和p24的功能域已有利地被交換以破壞GAG蛋白的加工。只要保留天然CD8+T細胞表位，其它的破壞性重排也是可能的，例如將拼接(scrambling)應用到nef中(如下)。
p17功能域的豆蔻醯化位點被突變以利於阻礙GAG蛋白與細胞膜的結合，以及隨後的組裝和出芽。這種突變優選通過缺失或將此功能域中的第二個甘氨酸殘基用另一個胺基酸替代進行。更優選地，用惰性的非極性胺基酸替代該甘氨酸殘基，最優選採用丙氨酸來替代該第二個甘氨酸殘基。這會阻礙GAG與細胞膜結合的功能，還阻礙在病毒組裝和出芽中的功能。
有利地，在本發明的重組基因中，gag的免疫原性沒有得到不利的改變。
優選地，本發明的「全長」gag意味著包含p17和p24的功能域的全部序列。優選地，全長gag僅包含p17和p24的功能域的全部序列。
POLpol基因編碼一些蛋白，包括蛋白酶，(p10)，逆轉錄酶，(p51)，RNA酶H，(p15)和整合酶，(p31)。
對於逆轉錄酶活性的功能性胺基酸殘基在YMDD基序(見表位圖RT183-186)的中部，YMDD基序是一個包含許多記錄表位的區域。有利地，以下將詳細描述通過功能域交換突變使逆轉錄酶失活而沒有使表位缺失。因此，在本發明中，優選地，存在於p51亞單位的逆轉錄酶活性被破壞。這是優選通過編碼序列的重排來實現的，這樣得到了RT活性被破壞的改變了的p51多肽。最優選地，序列TPDKKHQKEPPF(鄰近於p51多肽的中部)被複製，編碼p51多肽的氨基端部分和羧基端部分的序列在複製序列之間發生了交換。
該新技術破壞了POL的活性位點，從而改進了逆轉錄酶活性。而且，有利的是，本發明的實施還保留了該基因產物的免疫原性。如果活性位點通過例如插入、缺失或其它已知的替代型突變進行突變，則T細胞表位將受到破壞，而本發明則保留了這些表位。
優選地，本發明的「全長」pol意味著包含pol的全部p51功能域(即胺基酸1-440)，pol通常被稱為逆轉錄酶(RT)。在實施例8中，逆轉錄酶和RNA酶在稱為RT CTL圖譜的部分被組合；當讀到這個例子的時候，應當引起適當的關注。有時也將其稱為「RT的1-440」。有時pol的胺基酸1-440是指截短的pol(p51)以表示全部病毒pol ORF的其它部分被省略，例如RNA酶單位。然而，所指的「pol」、「截短的pol」(p51)和「全長pol」優選意味著pol p51胺基酸1-440，正如本文所採用的，這也是上下文中所顯而易見的。
NEFnef基因編碼一種多功能蛋白，該蛋白可以促進病毒的生長及調節免疫逃脫。在本發明中，此基因所編碼的NEF蛋白已失活(就是其功能被破壞)。在一個優選實施方案中，通過把編碼區分割成8個亞區然後對這8個亞區進行排序而使其失活。優選地，這8個區包括26個胺基酸的6個區和25個胺基酸的2個區。更優選的拼接(scrambled)NEF序列如下所示(見圖2)。通過與天然nef序列(也如下所示)比較，很容易辨別出該序列中準確的結合界線。
本發明的拼接的目的在於破壞nef的功能，而保留其T細胞表位。
本發明在拼接的nef中，應當注意破壞nef的功能同時產生最少數量的無用的CD8+T細胞表位。
本文公開的8個亞區的優先選擇顯示了在保持CD8+T細胞表位和不產生過多新的接合的CD8+T細胞表位之間的一個有益平衡。在一個優選實施方案中，將新產生的接合的CD8+T細胞表位的數量減到最少。上下文所述的「新的」CD8+T細胞表位在天然nef序列中是不存在的表位。CD8+T細胞表位的平均長度是9個胺基酸。
根據本發明，所繪製的優選GPN融合蛋白的圖顯示了保留了哪些表位及產生了哪些新的接合的表位。這會在下面進一步討論。
根據本發明，當製備拼接基因時，優選引入接合連接體來保留跨越(span)所選接合點的任意表位。這項工作通過應用ProPred工具瀏覽序列並且根據需要進行相關修飾可很容易實現。
在一個優選實施方案中，跨越這些亞區接合點的12個殘基連接體被插入到重排序的亞區之間從而恢復位於原始NEF蛋白序列中8個亞區的接合點的T細胞表位。
優選地，本發明的「全長」nef意味著包括nef基因的全部胺基酸序列，優選包括nef多肽N端部分(即nef胺基酸1-65)，nef多肽包含現有技術nef構建體中缺失的表位。
序列特定的序列列於序列表中。簡言之，SEQ ID NO1包含代表性的全部gpn基因序列，包括標籤。在一個優選實施方案中，去除了標籤，例如用於人類，和一個代表性核GPN序列示於SEQ ID NO9。
SEQ ID NO2是p24gag片段，SEQ ID NO3是p17 gag片段。儘管天然或參考的p24序列不包含MA，但GAG p24的構建始於MAPIV。這是由於用於翻譯的優選的Kozak序列(GCC GCC ACC ATG G；SEQ ID NO14)。ATG是起始密碼子，它翻譯成甲硫氨酸(M)。脯氨酸(P)的DNA密碼子以C開始，因此插入一個具有始於G的DNA密碼子的附加胺基酸(丙氨酸)。
在一個實施方案中，根據本發明，SEQ ID NO2和SEQ ID NO3被連接起來(SEQ ID NO2的最後一個殘基與SEQ ID NO3的第一個殘基連接)產生優選的gag基因。
SEQ ID NO4表示短的pol p51序列，根據本發明，該序列在優選的pol構建體中被有利地複製。SEQ ID NO5是pol序列的N端和C端。在一個實施方案中，以SEQ ID NO4-SEQ ID NO5-SEQ ID NO4的順序構建了一個較大的序列，導致SEQ ID NO4的重複，SEQ ID NO5的每一端各重複一個(即一個在SEQ ID NO5的N端，一個在C端)，這樣製備了本發明的一個優選的pol基因。
根據本發明，SEQ ID NO6是一個拼接nef。
SEQ ID NO7是一個被鼠CD8+T細胞所識別的標籤，SEQ ID NO8是一個HA標籤。這些標籤的任一個或兩者都可以有利地整合到本發明的基因序列中，例如可以通過該蛋白的N-或C-端(優選通過C端)來監測該蛋白的表達和/或免疫反應和/或該蛋白的穩定性/加工。然而，對於涉及人類受試者的實施方案，這些標籤優選不被整合到本發明的基因序列中，或者從所述基因序列中去除，或者不為該基因序列所表達。
SEQ ID NO10是HIV分化體B共有序列蛋白的天然HIV nef序列。
SEQ ID NO11是編碼GPN的代表性核酸序列。本領域技術人員當然會了解由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的核酸序列可能同樣編碼本發明的GPN。尤其是與SEQ ID NO11相關並且只是在核酸序列中通過翻譯沉默差異而不同。
本文的術語「來源於」HIV基因產物的序列在本領域有其固定的意思。「來源於」只是表示基於HIV序列，例如作為起始點，不論其是利用計算機(in silico)還是例如通過克隆、PCR等實驗來源的。例如，該術語可以包括從HIV ORF預測的胺基酸序列，而不僅限於實驗來源的序列。如果技術人員能夠識別序列來自HIV，那麼不管它怎樣重排或突變，都將被認為來源於HIV。在一個優選實施方案中，來源於另一個序列的序列應具有一些與其來源的序列相同的連續殘基(胺基酸或核酸)。優選至少有5個這樣的殘基，優選至少有8個這樣的殘基，優選至少有10個這樣的殘基，優選至少有14個這樣的殘基，優選至少有18個這樣的殘基，優選至少有20個這樣的殘基，優選至少有22個這樣的殘基，優選至少有25個這樣的殘基。例如，本文給出的gag，pol和nef序列每個均源於HIV。
術語「突變」有其通常的意思，其包括缺失、插入、點突變、截短、替換以及本文所描述的定點突變和拼接。
應當理解，本發明也包括公開的核苷酸序列的核酸片段。優選地，核酸片段包含至少40個核苷酸，優選至少50個核苷酸，優選至少100個核苷酸，優選至少200個核苷酸，優選至少400個核苷酸，優選至少600個核苷酸，優選至少800個核苷酸，優選至少1000個核苷酸，優選至少1500個核苷酸，優選至少2000個核苷酸，優選至少2500個核苷酸，優選至少3000個核苷酸，優選至少3400個核苷酸，優選至少3410個核苷酸。
應當理解，本發明也涉及僅因為遺傳密碼簡併性而與所呈現的核酸不同的核酸。當鑑別與遺傳密碼簡併性有關的變異時，重要的開放讀碼框是編碼本發明多肽的核酸，尤其是編碼核心GPN(SEQ ID NO9和編碼它的核酸)的核酸。
非天然的核苷酸殘基或類似物或衍生部分在本發明的核酸中起到重要作用。
應該理解，本發明也包括公開的胺基酸序列的多肽片段。優選地，這些片段是基於逐個基因進行考慮的。優選的多肽片段包含至少8個胺基酸，優選至少9個胺基酸，優選至少10個胺基酸，優選至少12個胺基酸，優選至少15個胺基酸，優選至少20個胺基酸，優選至少25個胺基酸，優選至少26個胺基酸，優選至少30個胺基酸，優選至少40個胺基酸，優選至少60個胺基酸，優選至少80個胺基酸，優選至少100個胺基酸，優選至少150個胺基酸，優選至少200個胺基酸，優選至少300個胺基酸，優選至少400個胺基酸，優選至少600個胺基酸，優選至少800個胺基酸，優選至少1000個胺基酸，優選至少1108個胺基酸，優選至少1125個胺基酸。
應該理解，當考慮本發明的多肽和核酸片段時，同樣重要的在於保留表位。這就是說，如果本發明在構建體中只含有基因的一部分(例如，逆轉錄酶(pol)的胺基酸1-440)，那麼必需保留那部分基因產物的相應天然表位。這個同樣適用於適當的CD8+T細胞表位和輔助T細胞表位。通常，如上所示，優選的是單個基因的較長片段，最優選的是本文所描述的全長多肽和如序列表中所列出的序列。很明顯，同樣的原則擴大到考慮序列的一致性，這就是說，當評價本發明片段的序列一致性時，首先選擇片段的長度，然後通過天然或參考序列的相應片段長度部分進行序列比較。本發明要求保留片段長度上的所有表位。優先考慮的是本文描述的全長g/p/n基因。
在一個實施方案中，本發明涉及gag/pol/nef多肽，其包含成串的天然表位，並含有最少的連接序列。
非天然胺基酸或其類似物或其衍生部分在本發明多肽中可以起到重要作用。
通過電腦程式來測量序列的相對一致性，該程序採用確定一致性的適當算法例如採用默認參數來計算兩個或多個序列間的一致性的百分率。這種電腦程式的典型例子是CLUSTAL(見Thompson et al.，1994(NAR224673-80)或http://www.psc.edu/general/software/packages/clustal/clustal.html)。或者，可採用BLAST算法，其參數設置成默認值。BLAST算法在http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html中詳細描述，將其作為參考合併入本文。
其它電腦程式也被用於確定序列間的一致性和/或者相似性，其包括但不限於GCG程序包(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12387)、FASTA(Atschul et al 1990 J Mol Biol 403-410)和比對工具的GENEWORKS程序組。
FASTA採用Pearson和Lipman的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448(1988))來搜索一個序列(查詢序列)與任何序列組間的相似性。FASTA採用以下搜索參數其可以有利地設定為規定的默認參數矩陣關於BLAST(沒有通過FASTA用於核苷酸比對)。字長-連續的殘基或鹼基數目，其在初始比對時即被考慮；對於核苷酸序列默認值是6，對於胺基酸序列默認值是2。間隙罰分這是一個當新的間隙產生時從相似性得分中扣除的數值；對於核苷酸序列默認值是16，對於胺基酸序列默認值是12。間隙擴展罰分這是一個當現有間隙擴大時從相似性得分中扣除的數值；對於核苷酸序列默認值是4，對於胺基酸序列默認值是2。期望值根據統計學顯著性，其限定序列返回的數目，默認值是2。表其限定了被報告的的同源序列的數目；默認值是40。對比其限定了對比顯示的同源序列的數目；默認值是10。
FASTA可以通過University of Illinois的生物學工作平臺(http://biology.ncsa.uiuc.edu/)獲得，或由Genetics Computer Group(GCG)獲得。
BLAST(基本局部序列對比搜索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所採用的啟發式搜索算法；這些程序把顯著性歸於採用Karlin和Altschul的增強的統計學方法(見http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html)的發現。BLAST程序特定地用於序列相似性的搜索，例如鑑定查詢序列的同系物。序列資料庫的相似性搜索中基本問題的討論見Altschul et al(1994Nature Genetics 6119-29)。
BLAST採用以下搜索參數其可以有利地被設定為規定的默認參數條形圖(HISTOGRAM)-顯示每個搜索的得分的條形圖；默認值是yes。說明(DESCRIPTIONS)-限定報告的同源序列的描述數目；默認值是100。期望值(EXPECT)-根據Karlin和Altschul的隨機模型(1990PNAS872264-8)，用於序列比對的統計學顯著性閾值；默認值是10。對比(ALIGNMENTS)-限定了對比顯示的序列數；默認值是50。矩陣(MAATRIX)-指定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的一個得分矩陣。默認矩陣是BLOSUM62(Henikoff Henikoff 1992PNAS8910915-9)。鏈(STRAND)-限定序列的一條或另一條鏈的搜索，(如果是一個核苷酸序列)；默認值是雙鏈。過濾(FILTER)-屏蔽低複雜性的查詢序列的片段，它由Wootton Federhen的SEG程序(1993Computers inChemistry 17149-163)確定；或組成短周期性內部重複的片段，它由Claverie States的XNU程序(1993Computers and Chemistry 17191-201)或通過Tatusov和Lipman的DUST程序(見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定；BLASTN的過濾默認值是DUST，其它程序的默認值是SEG。
最優選地，採用FASTA對比工具進行序列比對。
儘管通常在此提到的序列比對技術是本領域公知的，當然也可特別參考Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley Sons，Inc。
本發明包括與本文公開的示例性序列有顯著一致性的序列。優選的序列至少與所公開的序列有40％的一致性，優選至少有45％的一致性，優選至少有50％的一致性，優選至少有55％的一致性，優選至少有60％的一致性，優選至少有65％的一致性，優選至少有70％的一致性，優選至少有75％的一致性，優選至少有76％的一致性，優選至少有78％的一致性，優選至少有80％的一致性，優選至少有85％的一致性，優選至少有90％的一致性，優選至少有91％的一致性，優選至少有92％的一致性，優選至少有93％的一致性，優選至少有94％的一致性，優選至少有95％的一致性，更優選至少有96％的一致性，優選至少有97％的一致性，優選至少有98％的一致性，優選至少有99％的一致性，或者更多。
對於本發明的多肽的胺基酸序列，要求保留表位是指序列一致性可以集中在已知表位的區域，其中實際表位序列中的序列一致性優選是100％。因此，表位之間的胺基酸序列區比實際的表位區有更大的變化，其優選與參考序列保持一致。優選地，通過比較相關序列的全部相應長度，包括表位和表位之間的區域，來判斷一致性的百分率數值。在另一個實施方案中，一致性數值僅涉及可變區，即僅涉及表位之間的區域，在該實施方案中，表位被100％地保留。
基因構建體的優化在一個優選實施方案中，一個「Kozak」共有序列GCC GCC ACC ATG G被安排到基因構建體的上遊。
在一個優選實施方案中，可修改序列密碼子使用來優化人細胞中gag-pol-nef轉錄物的翻譯效率。
在一個優選實施方案中，Apa I和Asc I限制性核酸內切酶識別位點被分別引入到gag-pol-nef(gpn)基因的5-prime端和3-prime端。這將有利地促進基因序列盒的亞克隆。在此實施方案中，限制性位點存在於重組病毒中而有利地處於GAG-POL-NEF融合蛋白的開放讀碼框之外。因而它們對融合蛋白的胺基酸序列沒有影響，對此蛋白產生的免疫反應也沒有影響。Apa I和AscI也被選擇允許直接克隆到pOPK6重組質粒中。更有利的是它們對基因功能產生了未知的影響。
在一個優選實施例中，將可以被gp160蛋白特異的鼠CD8-陽性T細胞識別的編碼報導子CD8+T細胞表位的序列PGPGRAFVTI(SEQ ID NO7)整合到本發明的重組基因中。這有利於監測含GPN的疫苗免疫之後的CD8+T細胞的誘導作用。有利的是表位的存在已知不會融合基因的功能。在一個更優選的實施例中，此報導子表位在用於靈長類動物免疫，如人類免疫的構建體/重組基因中不存在。
在一個優選實施例中，流感病毒血細胞凝集素蛋白特異抗體所識別的附加的抗體標籤YPYDVPDYA(SEQ ID NO8)被加到本發明的基因中(或者編碼其的核酸中)。優選地，添加到蛋白的羧基端以允許基於例如蛋白印跡分析的免疫測定的抗體的表達檢測。在更優選的實施例中，此標籤被整合到重組gag-pol-nef基因中的羧基端，例如在包含重組gag-pol-nef基因的重組載體中的羧基端。在更優選的實施例中，此抗體標籤在用於靈長類動物免疫，如人類免疫的構建體/重組基因中不存在。
藥物組合物本發明也提供一個包含施用有效治療劑量的本發明試劑(例如本文所述的重組gpn基因的重組HIV基因)和一個藥物可接受的載體、稀釋劑或者賦形劑(包括它們的組合)的藥物組合物。
藥物組合物包含兩種成分-其中第一種成分包括核酸載體，第二種成分包括它的病毒載體。第一和第二種成分可以相繼遞送，也可以同時或一起遞送，甚至可通過不同的給藥途徑遞送。
藥物組合物可以作為人或獸藥應用於人類或動物，它典型地包含任何一種或多種合適的藥物可接受的稀釋劑、載體或者賦形劑。治療用途的可接受的載體或稀釋劑在製藥領域是公知的，並且也描述在例如Remingtong’sPharmacetical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。藥物可接受的載體、賦形劑或稀釋劑可以根據預期的給藥途徑和標準製藥規範來選擇。藥物組合物可以包含如載體、賦形劑或稀釋劑，另外還包括合適的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、包衣劑或助溶劑。
藥物組合物中也可以包含防腐劑、穩定劑、染料、甚至是調味劑。防腐劑包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸的多種酯。也可以使用抗氧化劑和助懸劑。
不同的遞藥系統要求有不同的藥物組成/配方。例如，本發明的按配方製造可以通過袖珍泵遞藥或者通過黏膜途徑給藥，如鼻腔噴霧或氣霧劑吸入或可吸收的溶液，或者藥物組合物按注射形式製造經注射途徑給藥，如通過靜脈、肌肉或皮下途徑。替代性的，藥物組合物可以設計經多個途徑給藥。
不論藥物通過胃腸黏膜傳遞到何處，試劑經過胃腸道期間都應當能夠保持穩定；例如，它應當能抵抗蛋白水解的降解，在酸性pH條件下穩定而且能抵抗膽汁的洗滌作用。
在適當的地方，藥物組合物可以通過吸入施用，以栓劑或陰道栓劑的形式施用，以洗液、溶液、乳膏、油膏或撒粉形式外用(topically)，通過皮膚貼的形式施用，口服用藥形式為含賦形劑如澱粉或乳糖的片劑形式，或可單獨也可與賦形劑混合使用的膠囊或胚珠(ovule)形式，或者含調味劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液形式，或者可以經注射途徑，如通過靜脈、肌肉或皮下途徑給藥。對於注射途徑給藥，藥物組合物最好採用無菌水溶液的形式，可以包含其它物質，如足量的鹽或單糖使溶液與血液等滲。對於含服或舌下服用，藥物組合物可以採用片劑或錠劑，它們可以通過常規方法製造。
藥物的聯合本發明的試劑可以與一個或多個其它藥物活性物質施用。例如，本發明採用了本發明的試劑和一個或多個類固醇、鎮痛藥、抗病毒藥物或其它藥用活性成分進行同時或相繼的治療。
本發明也發現了對HIV例如HIV-1感染人的治療性免疫療法的應用。對HIV如HIV-1感染危險人群，本發明與HAART聯合使用，和/或與預防性免疫療法聯合使用。
可以理解這些方式包括藥物相繼、同時或一起施用。
現在通過具體實施例來描述本發明，這些實施例並沒有限制權利要求的保護範圍的含義，其中需要參照以下附圖


圖1顯示了優選的gpn基因構建體。序列是連續的，只是為了清楚而分開。粗體表示GPN序列與HIV分子免疫學序列的差異(NB.沒有顯示所有的序列差異)。
圖2顯示了用於MHC II類表位比較的拼接的和天然的nef基因序列。
圖3顯示了拼接nef(圖3A)和天然nef(圖3B)的輔助T細胞表位。
圖4顯示了用於構建表達gag-pol-nef的重組禽痘菌株FP9的重組質粒p29D.gpn結構示意圖。
圖5顯示了用於構建表達gag-pol-nef的重組MVA的重組質粒pOPK6.gpn結構示意圖。
圖6顯示了GPN的序列。GPN序列以正常文本形式顯示。上遊區用斜體字表示。5-prime Apa I和3-prime Asc I位點加下劃線表示。起始密碼子ATG和終止密碼子TGA用粗體表示。
圖7顯示了實施例3所描述的IFN-γELISpot的條形圖。
圖8顯示了實施例5所描述的IFN-γELISpot的條形圖。
圖9顯示了用於IFN-γELISpot分析的重疊的20mer肽。胺基酸長度顯示於括號中。
圖10顯示了實施例4的組4中的動物的GAG特異反應的條形圖。
圖11顯示了實施例4的組4中的動物的POL特異反應的條形圖。
圖12顯示了實施例4的組4中的動物的NEF特異反應的條形圖。
圖13顯示了IFN-γ反應的條形圖。
圖14顯示了gpn序列來源的選擇性多肽引發的IFN-γ反應的條形圖。
實施例實施例1GPN序列中CD8+T細胞表位和輔助T細胞表位的分析。
我們採用ProPred來比較天然NEF相對於拼接NEF的輔助T細胞表位差異。基於本發明，該程序預測在拼接NEF中存在更多的輔助T細胞表位。這證明拼接NEF至少與天然NEF一樣能有效引發輔助T細胞和CD8+T細胞反應。
CD8+T細胞表位CD8+T細胞能夠識別和消除病毒感染的T細胞，與控制人HIV感染和猴SIV感染的病毒血症有關。
GPN序列(圖1)和HXB2參考序列的比較發表在HIV分子免疫學資料庫(「HIV分子免疫學2002通過蛋白繪製CD8+T細胞表位位置圖」理論生物學和生物物理學，Los Alamos國家實驗室，2003年8月7日(」HIV MolecularImmunology 2002Maps of CTL Epitope Locations Plotted by Protein」；Theoretical Biology Biophysics，Los Alamos National Laboratory，August7，2003.)；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/maps/ctl/ctl.pdf)中。
上述比較揭示了天然gag(p17，p24)、截短的pol(p51)和nef中鑑定的所有已知鼠和人CD8+T細胞表位序列在GPN多肽序列中都存在。在GPN序列和HXB2參考序列間存在單個胺基酸差異。表位序列在HXB2蛋白序列中標明，而且提供了該表位的相對定位，儘管相對於限定的蛋白序列有所不同(參照HIV分子免疫學資料庫2002II-A-2部分-HIV蛋白表位圖，p56；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/pdf/2002/immuno2002.pdf)。
因此，GPN序列的洗牌(shuffling)和重排不會改變該分子本身針對存在於HIV中的天然gag(p17，p24)、截短pol(p51)和nef序列的誘導CD8+T細胞反應的能力。
構成GPN蛋白的天然多肽的拼接和重排可以產生新的該分子特有的CD8+T細胞表位。由於這些表位不可能存在於HIV病毒中的天然gag、pol或nef序列中，因此它們不可能是與HIV疫苗中新的抗原有生物學相關性的表位。因而，這些表位在這個例子中還沒有被進一步研究過。
輔助T細胞表位輔助T細胞免疫反應可以增強CD8+T細胞效應子反應的大小和幅度，因此也可以增強抗HIV感染的CD8+T細胞反應。
GPN序列和HXB2參考序列的比較發表在HIV分子資料庫(「HIV分子免疫學2002通過蛋白繪製輔助T細胞表位位置圖」理論生物學和生物物理學，Los Alamos國家實驗室，2003年8月7日；http://hiv-web.lanl.gov/content/immunology/maps/helper/helper.pdf)中，該比較揭示了天然gag(p17，p24)、截短的pol(p51)和nef中鑑定的所有人輔助T細胞表位序列在GPN多肽序列中都存在。因此，GPN序列的洗牌和重排不會減少該分子本身針對人類病毒分化體B中天然gag(p17，p24)、截短pol(p51)和nef序列的誘導輔助T細胞反應的能力。
由於輔助T細胞表位通常大於15個胺基酸，所以GPN中gag、截短的pol和nef序列的融合很可能會有益地產生新的表位來連接這些基因或基因部分融合的位點。而且，nef基因的洗牌可能會產生許多新的表位來連接產生多肽的改動部分。當GPN用作疫苗時這些新的輔助T細胞表位可以引發免疫反應，因而相對於天然GAG、截短的POL和NEF蛋白增強了本發明多肽引發的生物學相關的CD8+T細胞表位反應的幅度和強度。
為了證明洗牌產生了潛在的新的輔助T細胞表位，採用ProPred MHC II類預測程序比較天然NEF和拼接NEF多肽序列(圖2)，該程序採用基於Sturniolo et al.Nat.Biotechnol.17.555-561(1999)和Singh和Raghava(2001)Bioinformatics，17(12)，1236-37所述的預測算法，例如可以從(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)中獲得。
這些分子的比較揭示了預測的在人類MHC II類限制的輔助T細胞表位中的重要改變，與天然NEF序列(圖3A和3B)相比，在拼接NEF序列中存在更多的被預測的表位。
因而，nef序列的拼接導致了對本發明多肽的CD8+T細胞反應增強的附加的輔助T細胞表位的增加。這些有益的新的輔助T細胞表位包括圖3A中所含而在圖3B不存在的表位。
在包括GPN多肽的蛋白間的融合位點上產生相似的新的輔助T細胞表位。上述的比較可以用來進一步說明和研究這些。
實施例2DNA、MVA和禽痘中的重組GPN基因構建了重組gag-pol-nef(gpn)基因用來表達GPN融合蛋白。此基因構建於核酸載體中，例如DNA載體(例如質粒載體)、以及用於MVA和禽痘載體和用於這些構建的材料。
重組病毒載體例如MVA和/或禽痘載體用於加強DNA質粒介導的基礎免疫的應用顯示了在齧齒動物中誘導了很強的免疫反應。
本質的相同的構建也被發現在靈長類動物如人類中得到應用。
在這個實施例中，重組禽痘病毒攜帶的治療性抗原包括基於HIV-1分化體B的gag、pol和nef基因產物的融合蛋白。
重組gag-pol-nef基因被合成為一系列的重疊寡核苷酸並運用聚合酶鏈式反應擴增並且克隆入商品化質粒pUC19，產生pUC19.gpn(或02-213)，並且測定核酸序列。
gag-pol-nef基因被亞克隆到3個質粒載體以製備i)一個表達質粒pSG2.gpn，用作體內引發劑，例如含gpn的重組痘病毒載體的臨床前實驗；ii)一個重組質粒pOPK6.gpn，用於構建表達gag-pol-nef的重組MVA；iii)一個重組質粒p29D.gpn，用於構建表達gag-pol-nef的重組禽痘菌株FP9。
表達質粒pSG2.Mel3(Palmowski，MJ.et al 2002 J Immunol 168 p4391-4398)包含基於人巨細胞病毒即時早期啟動子和與牛生長激素基因多腺苷酸化信號結合的內含子的表達盒，用於表達包含黑素瘤抗原的合成表位簇。用Apa I和Asc I、酶切pUC19.gpn，平端鈍化，然後亞克隆到經Pst I消化平端鈍化後的pSG2.Mel3中，產生表達質粒pSG2.gpn。
MVA重組質粒pOPK6構建如下。該質粒基於商品化克隆質粒pSP72(Promega Inc.)；標準多克隆位點用一個含特定限制性酶切位點和牛痘病毒P7.5後期-早期啟動子及後期P11啟動子的合成接頭置換，它們在合成接頭中頭到頭朝向排列。此接頭也包含大腸桿菌LacZ(β-半乳糖苷酶)前20個核苷酸，該基因在牛痘病毒重組質粒pSC11(Chakrabarti et al 1985 Mol CellBiol 5 p3403-3409)中發現。合成接頭被合成為一系列的重疊寡核苷酸，運用聚合酶鏈式反應擴增並且克隆入商品化克隆質粒pcDNA3.1中，產生pLink(或02-363)。300個鹼基對的接頭序列如下agatctttaattaatgcctaggcaattgagacggcgcgcccgggcactagtaagggcccgtgcaataaattagaatatattttctacttttaccagaaattaattgtacaatttattatttatgggtgaaaaacttactataaaaagcgggtgggtttggaattagtggtaccatgcatcttagaatatatgtatgtaaaaatatagtagaatttcattttgtttttttctatgctataaatgaattcctcaagggatccgtctcctgcaggcatgctaagctagcggccggccctcgagpSC11來源的部分LacZ基因亞克隆到pLINK中構建pLinkLacZ。然後該接頭和LacZ被亞克隆到pSP72的Xho I-Bgl II之間，這樣在P11晚期啟動子3-prime形成完整編碼β-半乳糖苷酶的開放讀碼框來構建pSP72LinkLacZ。
採用下述引物對通過PCR從MVA中分離了MVA胸苷激酶(tk)基因中表示EcoR I酶切位點5-prime和3prime的1500個鹼基對的MVA側翼區。
(5-prime)tk的左側翼正向引物CAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGT反向引物CGTGCATGCGGCCGCAACAATGTCTGGAAAGAACTG(3-prime)tk的右側翼正向引物CAGGAATTCGCGGCCGCTGTGAGCGTATGGCAAACG反向引物TCATTTGCACTTTCTGGTTCGTA1500bp的PCR產物亞克隆到商品化克隆載體pTOPO-TA(Invitrogen)，並進行測序。
右側翼序列亞克隆到pSP72LinkLacZ的EcoR I-Mfe I之間，形成p72LacZR。然後左側翼插入片段亞克隆到p72LinkLacZR的Nhe I-Sph I之間，形成pOPK6。
隨後該質粒的序列分析表明由於Nhe I酶的非特異酶切，從含左側翼序列的pTOPO-TA載體中引入的pOPK6質粒主鏈序列中識別到了附加的174個鹼基對。
pUC19.gpn來源的gag-pol-nef開放讀碼框亞克隆到pOPK6的Apa I-AscI間，形成pOPK.gpn，gpn插入序列經測序表明在亞克隆步驟中沒有發生序列的改變。
質粒作為媒介在p7.5後-早期啟動子的控制下可以將gpn開放讀碼框引入到MVA的tk基因座。
FP9載體FP9禽痘菌株重組質粒pEFL29來自the Institute for Animal Health，Compton，UK的Mike Skinner博士發表的論文Qingzhong，Y.et al 1994，Vaccine 12(6)p569-573。
pUC19.gpn來源的gpn開放讀碼框作為平端Kpn I-Sac I片段亞克隆到pEFL29的SmaI位點形成pEFL29.gpn。該質粒測序表明在pEFL29構建過程中，LacY，部分LacA和LacZ標記基因被引入。因而，合成一個接頭，其通過pEFL29的BsrG I-Blp I消化形成p29Delta，允許所有LacY和大部分保留的LacA開放讀碼框缺失，接頭序列如下TGAGCGCCGGTAGATACCATTATCAGCTGGTGTGGTGTCAGAAGTAATGTA然後pEFL29.gpn的Aat II-Sph I片段間來源的gpn表達盒被亞克隆到AatII-Sph I切割的p29Delta中形成p29D.gpn。gpn插入序列然後經測序確定在亞克隆步驟中沒有發生序列的改變。
重組質粒pOPK6.gpn和p29D.gpn被用來將p7.5-gpn表達盒分別引入到MVA和FP9中。
通過病毒基因組與相關的雞胚成纖維細胞(CEF)的重組質粒的同源重組形成重組痘病毒，CEF採用標準分子生物學技術培養，見Current Protocols inMolecular Biology，Ed.F.M.Ausubel，John Wiley Sons；或根據供應商或製造商的說明書培養。
通過用非重組MVA(stock 575FHE-K)感染CEF細胞的融合培養物，感染複數為0.1的情況下感染1小時來形成MVA.gpn，非重組MVA來源於MVA傳代數575(Mayr et al.，(1978)Zentralbl Bakteriol[b].167(5-6)375-90)。然後根據製造商的規程，用混合有脂質體(Invitrogen)和0.5-2.0μg的pOPK6.gpn質粒DNA轉染感染細胞。在收集細胞之前，培養物孵育3天。收集的細胞凍融3次，10倍稀釋測定滴度，在含CMC的培養液中培養3天。然後去除培養液，用含X-Gal的CMC培養液替換，在此培養液中培養20小時。
通過藍色噬菌斑表型鑑定重組病毒，並用移液管轉移到含100μl培養液的低溫試管(cryotube)。挑取的病毒是可以確保其純度的純化5次以上的噬菌斑。當運用合適的引物篩選病毒DNA時，可以通過不含白色噬菌斑表型和WT PCR產物來確定非重組親代病毒的純度。
從2ml第五或第六輪MVA.gpn克隆感染的培養物中純化病毒DNA，並進行PCR純度篩查。
根據製造商規程，用Qiagen Blood and Cell Culture DNA min-kit(QiagenGmbH，Max Volmar str.4，40724 Hilden，Germany)純化病毒DNA。用Klentaq高保真聚合酶(Sigma)在合適的孵育條件進行PCR反應。
用下面的引物來篩選親代病毒，在野生型中產生471個鹼基對的條帶，而在MVA中不存在TKU CAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGTTKL TCATTTGCACTTTCTGGTTCGTA用引物TKL和下面的引物從MVA.gpn構建體中篩選MVA.gpn，產生大約2000個鹼基對的條帶。
HIV-UATACCCCCGTGTTCGCCATTAAGA通過下面所描述的免疫印跡確定來源於MVA.gpn的GPN蛋白的表達。
用MVA.gpn或MVA.LacZ對照病毒感染CEF細胞，感染複數是1。在收集細胞前培養物孵育3天。細胞在SDS上樣緩衝液中加熱到100℃，在4-20％丙稀醯胺凝膠上進行電泳，並電轉染到一個硝酸纖維素膜上。然後用血細胞凝集素標籤(Abcam)特異抗體或者HIV GAG p24(Dako)特異抗體來檢測轉移蛋白，選擇合適的過氧化物酶標記的第二抗體和色原使其可見。印跡分析表明感染MVA.gpn的細胞包含大約134kDa的含p24和HA表位的蛋白，134kDa蛋白在MVA.LacZ感染的細胞中不存在。GPN蛋白預測的分子量是128.5kDa，與MVA.gpn感染細胞產生的特異條帶接近一致。
通過免疫印跡驗證FP9.gpn來源的GPN蛋白的表達。用FP9.gpn或FP9.LacZ(「FP9.29D」)和對照病毒感染CEF細胞，感染複數是1。在收集細胞前培養物孵育5天。細胞在SDS上樣緩衝液中加熱到100℃，在4-20％丙稀醯胺凝膠上進行電泳，並電轉染到一個硝酸纖維素膜上。然後用血細胞凝集素標籤(Abcam)特異抗體或者HIV GAG p24(Dako)特異抗體來檢測轉移蛋白，選擇合適的鹼性磷酸酶標記的第二抗體和色原使其可見。印跡分析表明感染FP9.gpn的細胞包含大約134kDa的含p24和HA表位的蛋白，而134kDa蛋白在FP9.29D感染的細胞中不存在。GPN蛋白預測的分子量是128.5kDa，與FP9.gpn感染細胞產生的特異條帶接近一致。
採用「基礎-加強免疫」的免疫策略在BALB/c小鼠上測試MVA.gpn和FP9.gpn病毒的免疫原性。小鼠分組，每組4隻。實驗組和對照組如下pSG2.gpn(50μ)進行基礎免疫，14天後用1×106p.f.u.的MVA.gpn加強免疫。
pSG2.gpn(50μ)進行基礎免疫，14天後用1×106p.f.u.的FP9.gpn加強免疫。
1×106p.f.u.的MVA.gpn單獨免疫。
1×106p.f.u.的FP9.gpn單獨免疫。
病毒感染7天後，收集外周血淋巴細胞，用下列HIV T細胞表位(也見實施例3)通過ELISpot測定法確定GPN特異的γ幹擾素分泌的淋巴細胞數。
H2-D CD8表位AMQMLKETITTSTLQEQGp 160 H2-D CD8表位RGPGRAFVTIH2-D CD4表位NPPIPVGEIYKRWIILGLNKMVA.gpn和FP9.gpn都能在小鼠中顯示很強的誘導CD8+T細胞反應。
基礎-加強免疫的免疫策略與病毒單獨注射組相比能產生更強的免疫反應。
實施例3FP9.gpn和MVA.gpn免疫引發抗原特異的CD8+T細胞反應在此實施例中，證明了FP9.gpn和MVA.gpn單獨施用或與pSG2.gpn聯合用於基礎-加強免疫均可以引發增強的抗原特異的CD8+T細胞反應。在此實施例中通過小鼠進行驗證。
用50μg pSG2.gpn通過肌肉注射(im.)免疫雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)，2周後用1×106PFU的FP9.gpn或1×105PFU的MVA.gpn通過靜脈注射(iv.)加強免疫。另外一組同齡的首次用於實驗的雌性BALB/c小鼠，加強免疫同時用1×106PFU的FP9.gpn或1×105的MVA.gpn進行免疫。
加強免疫14天後，用頸脫位法處死所有小鼠，通過下面所描述的IFN-γELISpot測定法確定GPN多肽(表AAMQ，TTS，RGP)來源的3個H-2d限制性CD8+表位引發的T細胞反應。
鼠IFNγ ELISpot操作規程材料IFN-γELISpot ALP Kit Mabtech 3321-2A600μg抗IFN-γ純化的單克隆抗體AN1850μg抗IFN-γ生物素化的單克隆抗體R46A250μl抗生物素蛋白鏈菌素-鹼性磷酸酶α-MEM完全培養液500ml MEM α-修飾Sigma M-452650ml FCS[10％]Sigma F-24425ml青黴素/鏈黴素[100U青黴素100μg鏈黴素]Sigma P-078110ml L-穀氨醯胺[4mM]Sigma G-7513500μl 2-巰基乙醇[50μm]Gibco BRL 31350-010ACK緩衝液8.29g NH4Cl
(Sigma A-4514)1g KHCO3[1mM](Sigma P-9144)37.2mg Na2EDTA(Sigma ED2SS)800ml milli-Q水用HCl(Sigma S-7653)調pH到7.2-7.4加水至1000ml，高壓滅菌顯色緩衝液BioRad AP Conjugate Substrate kit(170-6432)。
一塊平板5ml去離子水200μl的25倍緩衝液50μl試劑A50μl試劑B混勻並立即使用規程1.平板製備1.1包被平板用抗小鼠IFNγ(單克隆抗體AN18)的大鼠抗體包被MAIPmultiscreen平板(Millipore MAIPS4510)。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；SigmaP-3813)稀釋到10μg/ml，每孔加50μl。在溼盒中4℃過夜孵育。
1.2封閉平板甩出包被抗體，用多通道移液器每孔加150μl無菌PBS(SigmaP-3813)洗板1次。甩出PBS，每孔加100μl α-MEM完全培養液，室溫孵育大約1小時。此步驟中保持平板無菌是很重要的。
2.脾細胞製備2.1.在2ml PBS中剪碎單個脾臟，在含70μm細胞濾器(Falcon 352350)的培養皿中用10ml注射器芯研磨，加5ml PBS，用移液器懸浮脾細胞，然後轉到50ml試管中。然後進一步用10ml PBS衝洗細胞濾器和培養皿，並加到上述50ml試管中。1500rpm離心5分鐘。
2.2.去除上清，輕拍試管重懸細胞，加入50ml ACK緩衝液，顛倒混勻。室溫孵育不超過5分鐘。加入25ml PBS，顛倒混勻，400Xg離心5分鐘。
2.3.去除上清，輕拍試管重懸沉澱，加入10ml PBS，渦旋振蕩混勻。用0.4％臺盼藍溶液(SigmaT-8154)以1∶10稀釋，用改良的Neubauer血細胞計數器進行細胞計數。Elispot分析所需的等份量1500rpm離心5分鐘，渦旋振蕩重懸在適當體積的α-MEM完全培養液中，終濃度為10million細胞/ml。
3.平板設置
50μl 50μl 50μl←→→→ ←→→→←→→→1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C C C注根據不同需要有不同的培養皿設置。該設置適合於本實施例。
3.1輕拍平板，去除封閉培養液，加入50μl完全αMEM培養基到3、4、7、8、11和12列。
3.2加入150μl脾細胞到2、6和10列雙復孔中。(每個平板至多12個樣品)3.3從2、6和10列中取50μl脾細胞，分別轉移到1、5和9列作為陰性對照孔。
3.4系列稀釋每個樣品，從2、6和10列取50μl樣品分別轉移到3、7和11列，混勻，然後轉移50μl到4、9和12列。最後一列稀釋混勻後去除50μl。
3.5加入檢驗肽和對照肽到完全α-MEM培養基中的天然脾細胞中，2倍於目標終濃度，細胞濃度為10million/ml。加入50μl對照肽和靶T細胞到1、5和9列。加入50μl檢驗肽和靶T細胞到其餘各列。
3.6將此板在37℃孵育18-20小時。
4.進行測定4.1用含0.05％Tween 20(Sigma P1379)的PBS洗平板兩遍，用蒸餾水洗一遍，用PBST洗兩遍。
4.2加入PBS稀釋的1μg/ml的生物素化大鼠抗小鼠γ幹擾素，50μl/孔。室溫孵育2h。
4.3用PBST洗平板4遍，然後加入50μl PBS稀釋的1μg/ml的抗生物素蛋白鏈菌素鹼性磷酸酶(Mabtech)。室溫孵育1h。
4.4用PBST洗平板4遍，加入顯色緩衝液50μl/孔，室溫孵育直至出現斑點(約10min)。用自來水清洗平板，將塑料底剝下放在紙巾上過夜晾乾。
計算用表位特異的IFN-γ點形成細胞/百萬個脾細胞(sfc/million)的量計算結果。組間差異用單向ANOVA和採用GraphPad Instat version 3.05對log10轉換的數據的Tukey-Karamer多重比較測試來測量。
結果如圖7所示，結果證明用FP9.gpn和MVA.gpn單獨免疫或者用pSG2.gpn基礎加強免疫能夠在小鼠中引發抗原特異的CD8+T細胞反應。如上面所描述的，用pSG2.gpn(DNA)肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠或者用PBS免疫作為陰性對照(-)，14天後用FP9.gpn(FP9)或MVA.gpn(MVA)加強免疫。加強免疫14天後用IFN-γELISpot分析確定脾細胞的CD8+T細胞反應。列表示每組4隻小鼠的CD8+反應性表位AMQ、TTS和RGP(見表A)引發的IFN-γ點形成的細胞/每百萬脾細胞的平均數±標準差。
表A研究中使用的GPN表位(1ND＝不確定)

用FP9.gpn或MVA.gpn單獨免疫或者基礎-加強免疫，與陰性免疫對照(圖7)相比較，能夠引發針對每個CD8+T細胞表位的顯著增強的抗原特異性T細胞反應(P＜0.01)。
另外用pSG2.gpn進行基礎免疫，用FP9.gpn或MVA.gpn加強免疫，與每種病毒單獨免疫相比較(圖7)，能夠引發針對每個CD8+T細胞表位的顯著增強反應(P＜0.01)。
應當注意的是，在這個實驗中病毒滴度是不相同的。因此沒有比較病毒的相對免疫效應。當然用相同病毒滴度進行實驗可以直接評價其相對免疫效應。
這樣，針對本發明的重組HIV基因，例如gpn基因的特異的CD8+T細胞反應通過用FP9.gpn或MVA.gpn免疫而被引發。這表明這些構建體在引發針對GPN多肽的免疫反應中都是有效的。
而且，有效的免疫反應是針對GPN多肽N末端和C末端區域的表位，表明經FP9.gpn或MVA.gpn傳遞的整個多肽被表達、加工和遞呈。
當將病毒注射到經pSG2.gpn進行基礎免疫的動物時，針對每個表位病毒均能引發顯著增強的免疫反應，表明在基礎-加強免疫策略中兩者均能作為加強劑。
實施例4FP9.gpn和MVA.gpn在靈長類動物中的免疫原性gpn免疫原在靈長類動物體內的免疫原性的證明描述如下。
在非人類的靈長類動物(獼猴)中測定含分化體B HIV-1的gag、pol和nef蛋白的GPN多肽的免疫原性。
多聚蛋白(採用人密碼子)通過重組MVA、雞痘病毒FP9、腺病毒和DNA疫苗載體表達。為了誘導高水平的抗原特異的CD8+和CD4+T細胞，多聚蛋白表達構建體採用異源免疫策略。
表B顯示的是免疫原性的研究設計表B

此例中獼猴研究的設計見表B.
免疫前、每次免疫後7天及最後一次免疫後4周採集血液樣品。外周血單核細胞冷藏保存並用ELISpot測定及用重疊多肽庫分析胞內細胞因子。
在研究中及研究結束時測定細胞免疫反應。通過IFN-γELISpot assay分析(使用的重疊多肽見圖9)IFN-γ分泌的T細胞頻率。
另外一組用於比較，分析用白細胞介素-2/Ig融合蛋白(Barouch，D.H.，A.Craiu，et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA97(8)4192-7)和重組腺病毒作為佐劑的DNA疫苗，研究設計見表B。
此研究中出現的一些參數(a)FP9和MVA的順序。證明了痘病毒載體基礎免疫和加強免疫的最有效組合。尤其集中在研究設計的組1和組2(見表B)。
(b)基礎免疫和加強免疫的頻率。證明了用單個痘病毒基礎免疫，單個異源的痘病毒載體加強免疫的有效性(免疫原性)，尤其集中在免疫組3的動物。
讀取此免疫策略的核心目的是誘導細胞免疫反應。因此下面的分析被用於監測細胞免疫反應用重疊多肽(如圖9所示的10個胺基酸重疊的20mers)的IFN-γELISpot，CD8+和CD4+T細胞胞內細胞因子染色。在ELISpot分析中CD4/8缺失實驗證實IFN-γ的分泌相應於CD4+和或CD8+T細胞多肽。
組4的資料如下。該資料表明了採用新的基礎-加強免疫策略在獼猴HIV免疫治療中的免疫原性。
表1免疫和取樣時間表

結果GPN插入片段是免疫原性的並且在病毒載體免疫獼猴後能夠誘導分泌γ幹擾素的T細胞。
在FP9.加強免疫之後7天能夠檢測到組4中4/5的動物的gpn-特異的T細胞反應。MVA加強免疫後可以維持該反應。
該資料表明採用重組載體傳遞的gpn融合蛋白在靈長類動物中是免疫原性的。
gpn的GAG、POL和NEF在經免疫的獼猴中可以被識別到。
圖10、11和12顯示的是單個動物對gpn蛋白不同部分的反應，其表明來源於gag、pol和nef蛋白的T細胞表位在同樣反應的動物中能夠被識別。例如組4中的動物N93顯示T細胞反應可以識別GPN蛋白的GAG、POL和NEF部分，表明運用GPN可以誘導T細胞反應。另外，不希望被理論所束縛，三個GPN多肽不同單元引發的免疫反應幅度表明本發明在避免優勢免疫效應方面的優勢，優勢免疫效應是單個表位引發的免疫反應在多肽其它表位的免疫反應中佔優勢。相反，本發明所述的多肽能更有利地產生平衡的免疫反應。
靈長類動物免疫原性的單個施用實驗GPN多肽(SEQ ID No.1)的免疫原性測試是採用10隻獼猴，標記為A-J，單個施用(「單獨射擊」)實驗。在此實驗中，多肽通過MVA或FP9載體傳遞。
如上所述進行ELISpot分析。119個重疊的約20mer的多肽(如實施例7所描述)的免疫反應被測量，然後相加產生一個總的反應。
在注射前和注射後28天測量其反應。結果如下。GPN在所有研究動物中均能夠引發免疫反應。


結果表明GPN多肽是能夠產生免疫性的並且在病毒載體免疫靈長類動物如獼猴後能夠誘導γ幹擾素分泌的T細胞。
因此本發明中重組基因在靈長類動物體內的有效性被證明。
實施例5異源的具有FP9.gpn和MVA.gpn基礎-加強免疫策略誘導了增強的T細胞反應此例證明在異源或同源的基礎-加強免疫策略中將FP9.gpn和MVA.gpn施用到受試者能夠誘導增強的抗原特異的CD4+和CD8+T細胞反應。在此例中，該效果在小鼠中被證實。
通過將1×105PFU的FP9.gpn或1×106的MVA.gpn靜脈注射免疫雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)。兩周後用病毒以與進行基礎免疫相同的方式進行加強免疫。
加強免疫14天後，用頸脫位法處死所有小鼠，通過上面實施例所描述的IFN-γELISpot測定法確定3個CD8+表位(表AAMQ，TTS，RGP)和1個CD4+表位(表ANPP)引發的T細胞反應。
用表位特異的IFNγ點形成細胞/百萬脾細胞(sfc/million)的總數來計算結果。組間差異用單向ANOVA和採用GraphPad Instat version 3.05對log10轉換數據的Tukey-Karamer多重比較測試來確定。
結果證明在基礎加強免疫中用FP9.gpn和MVA.gpn免疫能夠在小鼠中引發針對GPN的增強的T細胞反應，結果見圖8。雌性BALB/c小鼠用FP9.gpn(FP9)或MVA.gpn(MVA)靜脈注射免疫，陰性對照用PBS(-)免疫，14天後用上述病毒加強免疫。加強免疫後14天用IFN-γELISpot測定法確定脾細胞的CD8+T細胞反應。列代表每組4隻小鼠的AMQ、TTS、RGP和NPP(見表A)引發的IFN-γ點形成細胞/百萬脾細胞的平均數±標準差的總和。
異源的FP9.gpn和MVA.gpn以任意順序的基礎加強免疫與任一病毒對受體進行的同源免疫(圖8)相比較能夠引發針對GPN來源的表位的顯著增強的全部T細胞反應(P＜0.001)。
異源的FP9.gpn/MVA.gpn或MVA.gpn/FP9.gpn免疫，與用同源的FP9.gpn/FP9.gpn或MVA.gpn/MVA.gpn免疫相比較能夠引發針對GPN的顯著的更強的T細胞反應。
另外，有利的是，這些病毒可以在基礎免疫和加強免疫中互相替換。
因此證明了重組HIV基因例如gpn基因的有效性，尤其是當通過病毒載體例如禽痘或基於MVA的載體傳遞時。
實施例6異源的FP9.gpn和MVA.gpn基礎加強免疫引發針對gpn蛋白單個成分的增強的CD8+和CD4+T細胞反應證明異源的FP9.gpn和MVA.gpn或者FP9.gpn和MVA.gpn基礎加強免疫能夠引發針對GPN多肽構成部分的增強的抗原特異的CD4+和CD8+T細胞反應。此例是在小鼠中被證實。
用1×106PFU的FP9.gpn或1×106PFU的MVA.gpn靜脈注射免疫雌性BALB/c和C57/BL6小鼠(6-8周齡)。兩周後用病毒以與基礎免疫相同的方式對它們進行加強免疫。
加強免疫14天後，用頸脫位法處死所有小鼠，通過上述實施例所描述的IFN-γELISpot測定法確定GPN序列來源的多肽庫(20個胺基酸，重疊10個胺基酸)引發的T細胞反應。
用表位特異的IFNγ點形成細胞/百萬脾細胞(sfc/million)的總數來計算每個多肽的結果。
結果異源的FP9.gpn和MVA.gpn(或相反順序)基礎加強免疫，與採用相同載體同源免疫(圖8)相比較能夠引發針對GPN序列的增強的T細胞反應。
另外，這些T細胞反應包括針對GPN多肽不同區域來源的表位的CD8+和CD4+反應。
因此，異源的基礎加強免疫是本發明的重組基因的高度有效的應用。
實施例7GPN中小鼠的表位作圖編碼人類免疫缺陷病毒(HIV)的gag、pol和nef多聚蛋白(gpn；圖1；SEQID NO11)的基因插入到痘病毒載體修飾的痘苗病毒Ankara(MVA.gpn)和減毒的雞痘病毒(FP9.gpn)。評價在BALB/c小鼠中通過這些載體基礎加強免疫引發的針對gpn的免疫反應。這些研究表明運用重疊多肽池可以檢測針對多肽gag、pol和nef區域的T細胞反應。該研究的一個目的是要在反應的肽池中分離單個肽，並由此來確定在多肽gag、pol和nef區域的反應表位的位置。
此實施例中，從每個反應的肽池中識別免疫原性表位，描繪引發識別的多肽的特異的IFN-γ反應的T細胞亞型。識別表位的相應序列與其它研究相比較。
方法小鼠和免疫在全部實驗中均採用雌性BALB/c小鼠(H2d；6-8周齡)，與1986年theU.K動物法(科學規程)要求一致，在單獨的通風的籠子中飼養。1×106pfu的重組病毒靜脈注射(尾靜脈注射100μl)。
免疫分析如上面所描述的進行ELISPOT分析。陰性對照的3倍標準差作為截取值(反應＞60SFCs每百萬)用於檢測陽性反應。
CD4+和CD8+細胞的缺失在含1％胎牛血清的PBS中製備單個細胞懸液，根據製造商說明，與抗CD4或抗CD8的MACS磁珠(Miltenyi Biotech，Germany)一起4℃孵育15分鐘。完全孵育後，洗細胞一遍(PBS，1％胎牛血清)，然後裝到放置在MACS磁體的MACS柱上。通過雙色流式細胞儀確定細胞亞型缺失前後的CD4和CD8細胞含量。CD4+缺失的脾細胞含＜1％的CD4+細胞，而＞6％的CD8+細胞仍然存在於CD8+缺失的脾細胞中。
多肽共合成119條跨越整個gpn序列的重疊的約20mer的多肽(表1)，它們由Natural and Medical Sciences Institute(NMI；Reutlingen，Germany)合成。多肽被分成6個肽池。
表1研究中所使用的多肽







結果從每個反應肽池中識別免疫原性表位通過IFN-γ進行反應肽池的單個表位作圖。
運用每個肽池(見圖13)來源的重疊多肽進行ELISPOT分析。圖13顯示的是肽池引發的IFN-γ反應及重疊多肽片段覆蓋整個gpn序列(帶標記)。雌性BALB/c小鼠(H2d；n＝4隻小鼠)各組用1×106空斑形成單位(pfu)的MVA.gpn靜脈注射(i.v.)免疫。14天後，用1×106pfu的FP9.gpn靜脈注射加強免疫。加強免疫14天後，去除脾臟，收集(n＝4個脾臟)，通過IFN-γELISPOT確定每百萬個脾細胞的IFN-γ點形成細胞(SFC)數。列代表SFC/million數。
這些結果表明下面的反應肽池中單個多肽被識別肽池gag 1中肽7NTVGGHQAAMQMLKETI肽8AAMQMLKETINEEAAEWDRL肽15GEIYKRWIILGLNKIVRMY肽池pol1中肽50LKEPVHGVYYDPSKDLIAEI肽池pol2中肽66KQWPLTEEKIKALVEICTEM肽85TKIEELRQHLLRWGFTTPDK肽池nef2中肽118EPARGPGRAFVTIYPYDVnef2中加下劃線的序列相對應於報告表位，其被添加用於誘導IFN-γ反應的測量。倒數第二條多肽、序號118上的反應表明全部GPN多聚蛋白被表達。然而肽池nef2中檢測到的IFN-γ反應不是天然nef來源的表位序列引起的，而是插入的報告表位。對於BALB/c小鼠(H-2d)，實施例8nef中包含非常少的CD8+T細胞表位，因此在nef中沒有反應也不意外。
確定引發識別的多肽特異的IFN-γ反應的T細胞亞型圖14顯示的是從gpn序列中篩選的多肽引發的IFN-γ反應。雌性BALB/c小鼠(H2d；n＝4隻小鼠)各組用1×106空斑形成單位(pfu)的MVA.gpn靜脈注射(i.v.)免疫。14天後，用1×106pfu的FP9.gpn靜脈注射加強免疫。加強免疫14天後，去除脾臟，收集(n＝4個脾臟)，如所示的不處理或者缺失CD4+細胞或缺失CD8+細胞。通過IFN-γELISPOT確定每百萬個脾細胞的IFN-γ斑形成的細胞(SFC)數。列代表SFC數/百萬(million)。
CD4+細胞缺失研究證明用多肽15和66活體外刺激後IFN-γ分泌顯著減少，而多肽118刺激後觀察到適量的減少。這些發現表明CD4+T細胞引發針對多肽15、66和118的IFN-γ反應(見圖14)。
CD8+T細胞缺失觀察到針對多肽7、50、85和118的IFN-γ反應部分減少。這些多肽的IFN-γ反應部分減少表明它們被CD8+T細胞調節(見圖14)。
識別表位與其它描述的表位序列比較為了確定該研究中識別的多肽序列是否以前被定義過，它們與LosAlamos HIV序列資料庫(小鼠；見實施例8(BALB/c；H2d))中的序列進行比較。
根據實施例8，相應於多肽7、8、15和118序列的表位以前在BALB/c小鼠中被識別，而相應於多肽50、66和85序列的表位以前沒有被描述過。
相應於在此描述的全部7條多肽序列的表位被識別作為在HIV感染的人中的免疫原，如表2所示。
表2Los Alamos HIV資料庫搜索結果

這些結果表明用異源的MVA.gpn和FP9.gpn基礎-加強免疫能夠在BALB/c小鼠中引發針對gpn分子的gag和pol區域的有效的CD4+和CD8+IFN-γ分泌的T細胞反應。與以前對BALB/c小鼠進行的研究一致，在nef分子中沒有識別到免疫原性表位。
上述說明書中所公開的出版物作為參考併入本文。在不脫離本發明的精神和範圍內的各種修改以及對本發明所描述的方法和系統的變化，對本領域技術人員是顯而易見的。儘管本發明已結合詳細的優選實施例進行了描述，但應當理解為，本發明所要求保護的範圍不僅限於這些詳細的實施例。實際上，對實現本發明所描述的方式的各種修改，對生物化學、生物工藝學或相關領域的技術人員來說均是顯而易見的，可以認為是在本權利要求的範圍內。
實施例8通過蛋白繪製細胞毒性T淋巴細胞的表位位置圖此實施例提出優選的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位，HIV分子免疫2002通過蛋白繪製細胞毒性T淋巴細胞的表位位置圖；理論生物學和生物物理學，Los Alamos National Laboratory，2003年8月7日。顯示了小於22個胺基酸的線性的細胞毒性T淋巴細胞表位。而且還顯示了優選的輔助T細胞表位的表位圖。
p17 CTL表位圖1 p17 CTL表位圖p17 CTL圖aa 1-50 1/2
p17 CTL表位圖p17 CTL圖aa 1-50 2/2
p17 CTL表位圖p17 CTL圖aa 51-100 1/2
p17 CTL表位圖p17 CTL圖aa 51-100 2/2 圖5p17 CTL圖aa 101-132
p24 CTL表位圖2 p24 CTL表位圖p24 CTL圖aa 1-50 1/2
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p24 CTL表位圖p24 CTL圖aa 151-200 1/2
p24 CTL表位圖p24 CTL圖aa 151-200 2/2 圖14p24CTL圖aa 201-231
RT CTL表位圖5 RT CTL表位圖RT CTL圖aa 1-50 圖21RTCTL圖aa 51-100
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 101-150
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 101-150
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 251-300
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 301-350
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 351-400 圖28RT CTL圖aa 401-450 圖29RT CTL圖aa 451-500
RT CTL表位圖RT CTL圖aa 501-550 圖31RT CTL圖aa 551-560LVSAGIRKVL|560
Nef CTL表位圖13 Nef CTL表位圖Nef CTL 圖aa 1-50
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 51-100 1/3
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 51-100 2/3
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 51-100 3/3
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 101-150 1/2
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 101-150 2/2 圖78Nef CTL圖aa 151-200
Nef CTL表位圖Nef CTL圖aa 201-206
p17 T-輔助細胞表位圖1 p17 T-輔助細胞表位圖p17 T-輔助細胞圖aa 1-50 圖2p17 T-輔助細胞圖aa 51-100 圖3p17 T-輔助細胞圖aa 101-132
p24 T-輔助細胞表位圖2 p24 T-輔助細胞表位圖p24 T-輔助細胞圖aa 1-50 Figure 5p24T-Helper Map aa 51-100 圖6p24 T-輔助細胞圖aa 101-150
p24 T-輔助細胞表位圖p24 T-輔助細胞圖aa 151-200 圖8p24 T-輔助細胞圖aa 201-231ILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL| | |210 220 230
RT T-輔助細胞表位圖5 RT T-輔助細胞表位圖RT T-輔助細胞圖aa 1-50 圖15RT T-輔助細胞圖aa 51-100 圖16RT T-輔助細胞圖aa 101-150 圖17RT T-輔助細胞圖aa 151-200 圖18RT T-輔助細胞圖aa 201-250
RT T-輔助細胞表位圖RT T-輔助細胞圖aa 251-300 圖20RT T-輔助細胞圖aa 301-350 圖21RT T-輔助細胞圖aa 351-400 圖22RT T-輔助細胞圖aa 401-450 圖23RT T-輔助細胞圖aa 451-500KLGKAGYVTNRGRQKVVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQ| | | | |460 170 480 490 500圖24RT T-輔助細胞圖aa 501-550
RT T-輔助細胞表位圖RT T-輔助細胞圖aa 551-560LVSAGIRKVL|560
Nef T-輔助細胞表位圖13 Nef T-輔助細胞表位圖Nef T-輔助細胞圖aa 1-50 圖65Nef T-輔助細胞圖aa 51-100 圖66Nef T-輔助細胞圖aa 101-150 圖67Nef T-輔助細胞圖aa 151-200 圖68Nef T-輔助細胞圖aa 201-206
序列表SEQ ID NO1人工序列-GPNM A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N Y T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L HP D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q IY A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T E E A E L E L A EN R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y QI Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K IA T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T WI P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P IE T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I K A L V E I C T EM E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K D S T K W R K L VD F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K K K K S V T V L DV G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y QY N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V IY Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F TT P D K K H Q K E P P F L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y YK D C D P E K E V L V W K F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V P E K V E E A N E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V PV E P E K V E E W Q N Y T P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T QG Y F P D W Q N Y T P E G L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S HF L K E K G G L E G L I Y S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A QE E E E V G F P V R P Q V P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A VS R D L E K H G A I T S S N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G KW S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P A R G P G R A F V T I Y P YD V P D Y A
SEQ ID NO2人工序列-GAG P24M A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V LSEQ ID NO3人工序列-GAG P17M A A R A S V L S G G E L D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I VW A S R E L E R F A V N P G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q TG S E E L R S L Y N T V A T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I EE E Q N K S K K K A Q Q A A A D T G N S S Q V S Q N YSEQ ID NO4人工序列-POL P51重複序列T P D K K H Q K E P P FSEQ ID NO5人工序列-POL P51核心序列L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V GK L N W A S Q I Y A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T EE A E L E L A E N R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K QG Q G Q W T Y Q I Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K QL T E A V Q K I A T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W WT E Y W Q A T W I P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G AE T F P I S P I E T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I KA L V E I C T E M E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K DS T K W R K L V D F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K KK K S V T V L D V G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N NE T P G I R Y Q Y N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F RK Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R QH L L R W G F T
SEQ ID NO6人工序列-拼接的NEFL V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y Y K D C D P E K E V L V WK F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D D P E K E V P E K V E E AN E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V P V E P E K V E E W Q N YT P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T Q G Y F P D W Q N Y T P EG L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S H F L K E K G G L E G L IY S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A Q E E E E V G F P V R P QV P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A V S R D L E K H G A I T SS N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G K W S K R S V V G W P T VR E R M R R A E P ASEQ ID NO7人工序列-gp160鼠CD8標籤R G P G R A F V T ISEQ ID NO8人工序列-HA標籤Y P Y D V P D Y ASEQ ID NO9人工序列-GPN核心序列M A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N Y T P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L HP D K W T V Q P I V L P E K D S W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q IY A G I K V K Q L C K L L R G T K A L T E V I P L T E E A E L E L A EN R E I L K E P V H G V Y Y D P S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q
I Y Q E P F K N L K T G K Y A R M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K IA T E S I V I W G K T P K F K L P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T WI P E W E F V N T P P L V K L W Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P IE T V P V K L K P G M D G P K V K Q W P L T E E K I K A L V E I C T EM E K E G K I S K I G P E N P Y N T P V F A I K K K D S T K W R K L VD F R E L N K R T Q D F W E V Q L G I P H P A G L K K K K S V T V L DV G D A Y F S V P L D K D F R K Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y QY N V L P Q G W K G S P A I F Q S S M T K I L E P F R K Q N P D I V IY Q Y M D D L Y V G S D L E I G Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F TT P D K K H Q K E P P F L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y YK D C D P E K E V L V W K F D A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V P E K V E E A N E G E N G P G I R Y P L T F G W C F K L V PV E P E K V E E W Q N Y T P G P G I R Y Q K R Q D I L D L W V Y H T QG Y F P D W Q N Y T P E G L I Y S Q K R Q D I P M T Y K A A L D L S HF L K E K G G L E G L I Y S P Q V P L R P M T Y K A A D C A W L E A QE E E E V G F P V R P Q V P L R N T A A N N A D C A W L A D G V G A VS R D L E K H G A I T S S N T A A N N R R A E P A A D G V G A M G G KW S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P ASEQ ID NO10人類免疫缺陷病毒-天然NEFM G G K W S K R S V V G W P T V R E R M R R A E P A A D G V G A V S R D L E K H G A IT S S N T A A N N A D C A W L E A Q E E E E V G F P V R P Q V P L R P M T Y K A A L D LS H F L K E K G G L E G L I Y S Q K R Q D I L D L W V Y H T Q G Y F P D W Q N Y T P G PG I R Y P L T F G W C F K L V P V E P E K V E E A N E G E N N S L L H P M S L H G M D DP E K E V L V W K F D S R L A F H H M A R E L H P E Y Y K D C
SEQ ID NO11人工序列-gpn核苷酸序列C CG G G C C CG C C G C C A C C A T G G C C C C C A T C G T G C A GA A C C T G C A A G G C C A G A T G G T G C A C C A G G C C A T C A GC C C C A G A A C C C T G A A T G C C T G G G T G A A G G T G G T G GA G G A G A A G G C C T T C A G C C C T G A G G T G A T C C C T A T GT T C A G C G C C C T G A G C G A G G G C G C C A C C C C C C A G G AC C T G A A C A C C A T G C T G A A T A C C G T G G G C G G C C A T CA G G C C G C C A T G C A G A T G C T G A A G G A G A C C A T C A A CG A G G A G G C C G C C G A G T G G G A C A G A C T G C A C C C C G TG C A C G C C G G A C C T A T C G C C C C T G G C C A G A T G A G A GA G C C C A G A G G C A G C G A C A T C G C C G G C A C C A C C A G CA C C C T G C A A G A G C A G A T C G G C T G G A T G A C C A A C A AC C C C C C T A T C C C T G T G G G C G A G A T C T A C A A G A G A TG G A T C A T C C T G G G C C T G A A C A A G A T C G T G A G A A T GT A C A G C C C T A C C A G C A T C C T G G A C A T C A G A C A G G GA C C C A A G G A G C C C T T C A G A G A C T A C G T G G A C A G G TT C T A C A A G A C C C T G A G A G C C G A G C A G G C C A G C C A GG A A G T G A A G A A C T G G A T G A C C G A G A C C C T G C T G G TG C A G A A C G C C A A C C C C G A C T G C A A G A C C A T C C T G AA G G C C C T G G G A C C T G C C G C T A C C C T G G A G G A G A T GA T G A C C G C C T G C C A G G G C G T G G G C G G A C C T G G C C AC A A G G C C A G A G T G C T C A T G G C C G C C A G A G C C A G C GT G C T G A G C G G C G G A G A G C T G G A T A G A T G G G A G A A GA T C A G A C T G A G A C C T G G C G G C A A G A A G A A G T A C A AG C T G A A G C A C A T C G T G T G G G C C T C T A G G G A G C T G GA G A G A T T C G C C G T G A A T C C T G G C C T G C T G G A G A C CA G C G A G G G C T G T A G A C A G A T C C T G G G C C A G C T G C AA C C C A G C C T G C A A A C C G G C T C T G A G G A G C T G A G A TC C C T G T A C A A C A C C G T G G C C A C C C T G T A C T G C G T GC A C C A G A G A A T C G A G G T G A A G G A C A C A A A G G A G G CC C T G G A G A A G A T C G A G G A G G A G C A G A A C A A G T C C AA G A A G A A G G C C C A G C A G G C C G C T G C C G A C A C C G G CA A C A G C A G C C A G G T G A G C C A G A A C T A C A C C C C C G AC A A G A A G C A C C A G A A G G A G C C C C C T T T C C T G T G G AT G G G C T A C G A G C T G C A C C C C G A T A A G T G G A C C G T GC A G C C C A T C G T G C T G C C T G A G A A G G A T A G C T G G A CC G T G A A C G A C A T C C A G A A G C T G G T G G G C A A G C T G A
A C T G G G C C A G C C A G A T C T A C G C C G G C A T C A A G G T GA A G C A G C T G T G T A A G C T G C T G A G A G G C A C C A A G G CC C T C A C A G A A G T G A T C C C C C T C A C A G A G G A G G C C GA G C T G G A G C T G G C C G A G A A C A G A G A G A T C C T G A A AG A G C C C G T G C A C G G C G T G T A C T A C G A C C C C A G C A AG G A T C T C A T C G C C G A G A T T C A G A A G C A G G G C C A G GG C C A G T G G A C C T A C C A G A T C T A C C A G G A G C C T T T CA A G A A C C T G A A A A C C G G C A A G T A C G C C A G A A T G A GA G G C G C T C A C A C C A A C G A C G T G A A G C A G T T G A C C GA G G C C G T G C A G A A A A T C G C C A C C G A G A G C A T C G T GA T C T G G G G C A A G A C C C C C A A G T T C A A G C T G C C T A TC C A G A A G G A G A C C T G G G A G G C C T G G T G G A C C G A G TA T T G G C A G G C C A C C T G G A T T C C T G A G T G G G A G T T CG T G A A C A C C C C C C C T C T G G T G A A G C T G T G G T A T C AG C T G G A G A A G G A G C C T A T C G T G G G C G C C G A G A C C TT C C C C A T C A G C C C T A T C G A G A C C G T G C C C G T G A A GC T G A A G C C C G G C A T G G A C G G C C C C A A G G T G A A A C AG T G G C C T C T C A C C G A G G A G A A G A T T A A G G C C C T G GT G G A G A T T T G C A C C G A G A T G G A G A A G G A A G G C A A GA T C A G C A A G A T C G G C C C C G A G A A T C C C T A C A A T A CC C C C G T G T T C G C C A T T A A G A A G A A G G A C T C C A C C AA G T G G A G A A A G C T G G T G G A C T T C A G A G A G C T G A A CA A G A G A A C C C A G G A C T T C T G G G A G G T G C A G C T G G GC A T C C C C C A C C C T G C C G G C C T G A A G A A G A A G A A G AG C G T G A C C G T G C T G G A C G T G G G C G A C G C C T A C T T CA G C G T G C C C C T G G A C A A G G A C T T C A G A A A G T A C A CC G C C T T C A C C A T C C C C A G C A T C A A C A A C G A G A C C CC C G G C A T C A G A T A C C A G T A C A A C G T G C T G C C C C A GG G C T G G A A G G G C A G C C C C G C C A T C T T C C A G A G C A GC A T G A C A A A G A T C C T G G A G C C C T T C C G G A A G C A G AA C C C C G A T A T C G T G A T C T A C C A G T A C A T G G A C G A CC T G T A C G T G G G C A G C G A T C T G G A G A T C G G C C A G C AC A G A A C C A A G A T C G A A G A G C T G A G A C A G C A C C T G CT G A G A T G G G G C T T C A C C A C A C C A G A T A A G A A A C A TC A G A A A G A A C C A C C A T T C C T G G T G T G G A A G T T T G AC A G C A G A C T G G C C T T C C A C C A T A T G G C C A G A G A G CT G C A T C C T G A G T A C T A C A A G G A C T G C G A T C C C G A GA A G G A G G T G C T G G T C T G G A A A T T C G A C G C C A A C G AG G G C G A G A A C A A C A G C C T G C T G C A C C C C A T G A G C C
T G C A C G G C A T G G A T G A T C C T G A G A A A G A A G T G C C CG A G A A G G T G G A A G A G G C C A A T G A G G G A G A A A A C G GC C C T G G C A T T A G A T A T C C C C T C A C C T T C G G C T G G TG C T T C A A G C T G G T G C C T G T G G A G C C T G A G A A A G T GG A G G A A T G G C A G A A T T A C A C A C C C G G C C C A G G C A TC C G G T A T C A G A A G A G A C A G G A C A T T C T G G A C C T G TG G G T G T A C C A C A C C C A G G G C T A C T T C C C C G A C T G GC A G A A C T A T A C T C C T G A G G G C C T C A T C T A C A G C C AG A A G C G G C A G G A T A T C C C C A T G A C C T A C A A G G C C GC C C T G G A T C T G A G C C A C T T T C T G A A A G A G A A G G G CG G C C T G G A G G G C T T G A T C T A C T C C C C A C A G G T G C CA C T G A G A C C T A T G A C A T A T A A G G C T G C C G A C T G C GC C T G G C T G G A G G C C C A G G A A G A G G A G G A A G T G G G CT T C C C T G T G A G A C C C C A G G T G C C C C T G C G G A A C A CC G C C G C C A A T A A T G C C G A T T G T G C T T G G C T C G C C GA C G G C G T G G G A G C C G T G A G C A G a G A C C T G G A A A A GC A C G G C G C C A T C A C C A G C A G C A A T A C A G C C G C C A AC A A C A G A A G A G C C G A G C C T G C C G C C G A T G G A G T G GG C G C C A T G G G C G G C A A G T G G A G C A A G A G A T C C G T GG T G G G C T G G C C C A C C G T G A G A G A A A G A A T G A G A A GG G C C G A A C C C G C C A G A G G A C C C G G C A G A G C C T T C GT G A C C A T C T A C C C C T A C G A C G T G C C C G A C T A C G C TT G A T G AG G C G C G C CC T5-prime ApaI和3-prime AscI位點用下劃線標出。起始密碼子ATG和終止密碼子TGA用粗體標出。
SEQ ID NO12人工序列-破壞的polT P D K K H Q K E P P F L W M G Y E L H P D K W T V Q P I V L P E K DS W T V N D I Q K L V G K L N W A S Q I Y A G I K V K Q L C K L L R GT K A L T E V I P L T E E A E L E L A E N R E I L K E P V H G V Y Y DP S K D L I A E I Q K Q G Q G Q W T Y Q I Y Q E P F K N L K T G K Y AR M R G A H T N D V K Q L T E A V Q K I A T E S I V I W G K T P K F KL P I Q K E T W E A W W T E Y W Q A T W I P E W E F V N T P P L V K LW Y Q L E K E P I V G A E T F P I S P I E T V P V K L K P G M D G P KV K Q W P L T E E K I K A L V E I C T E M E K E G K I S K I G P E N PY N T P V F A I K K K D S T K W R K L V D F R E L N K R T Q D F W E VQ L G I P H P A G L K K K K S V T V L D V G D A Y F S V P L D K D F RK Y T A F T I P S I N N E T P G I R Y Q Y N V L P Q G W K G S P A I FQ S S M T K I L E P F R K Q N P D I V I Y Q Y M D D L Y V G S D L E IG Q H R T K I E E L R Q H L L R W G F T T P D K K H Q K E P P FSEQ ID NO13人工序列-破壞的gagM A P I V Q N L Q G Q M V H Q A I S P R T L N A W V K V V E E K A F SP E V I P M F S A L S E G A T P Q D L N T M L N T V G G H Q A A M Q ML K E T I N E E A A E W D R L H P V H A G P I A P G Q M R E P R G S DI A G T T S T L Q E Q I G W M T N N P P I P V G E I Y K R W I I L G LN K I V R M Y S P T S I L D I R Q G P K E P F R D Y V D R F Y K T L RA E Q A S Q E V K N W M T E T L L V Q N A N P D C K T I L K A L G P AA T L E E M M T A C Q G V G G P G H K A R V L M A A R A S V L S G G EL D R W E K I R L R P G G K K K Y K L K H I V W A S R E L E R F A V NP G L L E T S E G C R Q I L G Q L Q P S L Q T G S E E L R S L Y N T VA T L Y C V H Q R I E V K D T K E A L E K I E E E Q N K S K K K A Q QA A A D T G N S S Q V S Q N YSEQ ID NO14用於Gag p24的Kozak序列GCC GCC ACC ATG G
權利要求
1.一種重組多肽，其包含的胺基酸序列來源於(i)HIV gag基因產物；(ii)HIV pol基因產物；和(iii)HIV nef基因產物，其中胺基酸序列相對於所述基因產物的天然序列發生突變並且基本上保留了如詳述於實施例8的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1-440和nef的所述基因產物的全部天然CD8+T細胞表位，該多肽包含的胺基酸序列與SEQ IDNO9至少有75％的一致性。
2.根據權利要求1所述的重組多肽，其中所述多肽包含與SEQ IDNO9至少有95％的一致性的胺基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的重組多肽，其中所述序列的一致性是指表位間序列的一致性。
4.根據權利要求3所述的重組多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO9。
5.根據權利要求1至4任意一項所述的重組多肽，其基本上包含了如詳述於實施例8中的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1-440和nef的所述基因產物的全部天然T輔助表位。
6.一種包含來源於至少下面兩個基因產物的胺基酸序列的重組多肽(i)HIV gag基因產物；(ii)HIV pol基因產物；或(iii)HIV nef基因產物，其中胺基酸序列相對於所述基因產物的天然序列產生突變並且基本上保留了如詳述於實施例8的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1-440和nef的所述基因產物的相應部分的全部天然CD8+T細胞表位。
7.根據權利要求6所述的重組多肽，其包含來源於(i)、(ii)和(iii)的胺基酸序列。
8.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，所述多肽包含來源於HIV nef基因產物的胺基酸序列，所述重組多肽序列被突變以破壞所述nef序列的功能，所述nef序列進一步包含一個或多個天然nef基因中不存在的T輔助表位。
9.根據權利要求8所述的重組多肽，其包含一個或多個天然nef序列中不存在的並顯示於圖3A中的T輔助表位。
10.根據權利要求8或要求9所述的重組多肽，其包含一個或多個表3A顯示的而表3B不存在的T輔助表位。
11.根據權利要求8至10任一所述的重組多肽，其進一步包含如實施例8中詳述的nef基因產物的全部天然CD8+T細胞表位。
12.根據權利要求8至11任一所述的重組多肽，其進一步包含如實施例8中詳述的全部天然nef人T輔助表位。
13.根據權利要求8至12任一所述的重組多肽，其中所述多肽包含如SEQ ID NO6所示的序列，或者包含與其至少有95％一致性的序列。
14.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，其中該多肽包含來源於HIVpol基因產物的胺基酸序列，該重組多肽序列被突變以破壞pol序列的逆轉錄酶活性，其中該重組多肽保留了如實施例8中所示的RT(pol)胺基酸1-440的天然pol序列的基本上全部的CD8+T細胞表位。
15.根據權利要求14所述的重組多肽，其中通過天然pol基因中央序列來源的內部序列的重複及該pol序列的氨基端和羧基端的交換使pol序列的逆轉錄酶活性突變。
16.根據權利要求15所述的重組多肽，其中所述重複的內部序列包含TPDKKHQKEPPF(SEQ ID NO4)。
17.根據權利要求15或要求16所述的重組多肽，其中該多肽包含SEQID NO12所示的序列，或者包含與其至少有95％一致性的序列。
18.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，該多肽包含來源於HIV gag基因產物的胺基酸序列，該重組多肽序列被突變以破壞gag基因產物的加工，並且該gag序列進一步包含一個被破壞的豆蔻醯化位點，其中該重組多肽基本上保留了如實施例8詳述的p17和p24(gag)的天然gag序列的全部CD8+T細胞表位。
19.根據權利要求18所述的重組多肽，其中通過p17和p24區域的交換來破壞gag的加工，通過將第二個甘氨酸突變成丙氨酸來破壞豆蔻醯化位點。
20.根據權利要求18或19所述的重組多肽，其中該多肽包含如SEQID NO13所示的序列，或者包含與其至少有95％一致性的序列。
21.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，其進一步包含抗體識別標籤，其中該標籤是包含如SEQ ID NO8所示序列的HA標籤。
22.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，其進一步包含CD8+T細胞表位標籤，其中該標籤是gp160來源的包含如SEQ ID NO7所示序列的標籤。23.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO1所示的序列。
24.根據上述任一權利要求所述的重組多肽，其中HIV是HIV分化體B。
25.一種編碼根據上述任一權利要求所述的多肽的重組核酸編。
26.一種重組核酸序列，其包含SEQ ID NO11，或者與其僅區別在遺傳密碼的沉默突變的序列，或者與其至少有95％的一致性的序列。
27.一種編碼根據權利要求1至24任一所述的多肽的病毒載體，該病毒載體選自痘病毒、腺病毒、AAV、α病毒、VSV、HSV和仙臺病毒。
28.根據權利要求27所述的病毒載體，其中該載體是MVA或MVA來源的載體。
29.根據權利要求27所述的病毒載體，其中該載體是禽痘或禽痘來源的載體。
30.根據權利要求29所述的病毒載體，其中該載體是FP9禽痘病毒載體。
31.一種核酸載體，其包含根據權利要求25或26所述的核酸序列，或者編碼根據權利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
32.一種腺病毒載體，其包含根據權利要求25或26所述的核酸序列，或者編碼根據權利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
33.一種痘病毒載體，其包含根據權利要求25或26所述的核酸序列，或者編碼根據權利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
34.一種選自p29D.gpn、pOPK6.gpn和pSG2.gpn質粒。
35.根據權利要求1至24任一所述的多肽在藥物中的應用。
36.根據權利要求1至24任一所述的多肽在製備治療或預防HIV感染的藥物中的用途。
37.根據權利要求1至24任一所述的多肽在製備抗HIV感染的免疫的藥物中的用途。
38.根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體應用於藥物。
39.根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體應用於製備治療或預防HIV感染的藥物。
40.根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體在製備抗HIV感染的免疫用藥物中的用途。
41.一種使受試者獲得抗HIV感染的免疫的方法，其包含向受試者施用根據權利要求1至24任一所述的多肽，或者根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體。
42.根據權利要求1至24任一所述的多肽，或者根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體在基礎-加強免疫策略中作為引發劑或免疫加強劑的用途。
43.根據權利要求1至24任一所述的多肽，或者根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體在誘導免疫反應中的用途。
44.根據權利要求43所述的用途，其中免疫反應選自CD8+T細胞反應、CD4+T細胞反應和體液反應。
45.一種在受試者中誘導免疫反應的方法，其包含向受試者施用根據權利要求1至24任一所述的多肽，或者根據權利要求25至34任一所述的核酸或載體。
46.根據權利要求45所述的方法，其中免疫反應選自CD8+T細胞反應、CD4+T細胞反應和體液反應。
47.一種重組多肽，其包含與SEQ ID NO9所示胺基酸序列至少有95％一致性的胺基酸序列。
48.一種單純皰疹病毒載體，其包含根據權利要求25或要求26所述的核酸序列，或者編碼根據權利要求1至24任一所述的多肽的核酸序列。
49.一種參考附圖且基本上如上文中所描述的重組多肽、重組多聚核酸或病毒載體。
全文摘要
本發明涉及一種重組多肽，其包含的胺基酸序列來源於HIV gag基因產物、HIV pol基因產物、或HIV nef基因產物中的至少一種，該胺基酸序列與上述基因產物的天然序列相比較被突變並且保留了如詳述於實施例8所示的p17和p24(gag)、RT(pol)的胺基酸1－440和nef的基因產物的每個天然CD8+T細胞表位。本發明還涉及編碼上述多肽的核酸和病毒載體及它們在藥物、免疫和疫苗中的應用。
文檔編號C07K14/16GK1886509SQ200480034684
公開日2006年12月27日 申請日期2004年9月23日 優先權日2003年9月24日
發明者約爾根·施奈德 申請人:奧克森治療有限公司