新羰基還原酶、其基因及它們的使用方法

2023-11-02 23:51:22 4

專利名稱:新羰基還原酶、其基因及它們的使用方法
技術領域：
本發明涉及具有不對稱地還原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以產生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇 的活性的多肽(羰基還原酶)，其中該多肽分離自具有所述活性的微生物；編碼該多肽的DNA；含有該DNA的載體，及用該載體轉化的轉化體。
本發明還涉及使用所述多肽或轉化體製備光學活性醇，特別是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇是一種作為藥劑等的合成起始原料有用的化合物。
背景技術：
作為(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的製備方法，已知的一種方法包括用還原劑例如硼氫化鈉等化學地還原氨基被保護的(3S)-1-滷-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物(專利文獻1，非專利文獻1)。但是，這種方法需要相對昂貴的還原劑，而且其立體選擇性從實用上說是不足的。
另外，作為使用微生物的方法，已知的一種方法包括使屬於假絲酵母(Candida)屬的微生物等作用於(3S)-1-滷-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物以產生(2R，3S)-1-滷-3-氨基-4-苯基-2-丁醇衍生物(專利文獻2)，已知另一種方法包括使屬於紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物等與(3S)-1-滷-2-氧-3-被保護的氨基-4-取代的丁烷接觸，以產生(2R，3S)-1-滷-2-羥基-3-被保護的氨基-4-取代的丁烷(專利文獻3，非專利文獻2)。但是，使用這些方法，反應混合物中可積累的產物濃度從實用上來說是不足的。
專利文獻1JP-A-2-42048專利文獻2JP-A-9-285專利文獻3WO2002/014528非專利文獻1Tetrahedron，50，6333(1994)非專利文獻2TetrahedronAsymmetry，14，3105(2003)。
發明的公開本發明要解決的問題考慮到上面所述，本發明旨在提供用於生產(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的多肽，編碼該多肽的DNA，含有該DNA的載體，和用該載體轉化的轉化體。
另外，本發明旨在提供使用所述多肽或轉化體高效地製備多種光學活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
解決問題的手段本發明人從具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的微生物中分離了具有該活性的多肽。而且，他們成功地闡明了編碼該多肽的DNA的鹼基序列，並使用該序列生成了大量產生該多肽的轉化體。另外，他們還發現通過使用該多肽或轉化體能夠高效地生產光學活性醇，例如(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，由此完成了本發明。
即，本發明涉及具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
此外，本發明提供編碼該多肽的DNA。另外，本發明還提供含有該DNA的載體。此外，本發明還提供含有該載體的轉化體。另外，本發明還提供使用所述或轉化體製備光學活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
發明的效果根據本發明，可以提供製備有用的光學活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的實用的方法。
圖1顯示重組載體pNTOM4G1的製備方法和結構。
發明的優選實施方式下面詳細地說明本發明。
本說明書中描述的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮可以通過例如JP-A-62-126158或JP-A-2-42048中公開的方法來製備。另外，除非另有說明，本發明中所述的DNA的分離、質粒的製備、基因操作例如轉化等，可根據Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等書中描述的方法來進行。而且，除非另有說明，本說明書的描述中所用的「％」指「％(w/v)」。
本發明的多肽是具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。這種多肽可以從具有所述活性的微生物中分離。
作為本發明的多肽的來源的微生物沒有具體限制，例如，可以使用屬於Ogataea屬的酵母。特別優選Ogataea minuta var.minuta，NBRC0975菌株。該微生物可以從國立製品評價技術局生物技術本部生物遺傳資源部門(NBRC，2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu-shi 292-0818，Chiba Japan)獲取。
培養作為本發明的多肽的來源的微生物的培養基可以使用包含碳源、氮源、無機鹽、有機營養物等的一般液體營養培養基，只要該微生物能生長。
本發明的多肽可以通過合適地組合一般公知的蛋白純化方法從作為該多肽來源的微生物中分離。例如，分離可如下述進行。
首先，在合適的培養基中培養微生物，再通過離心或過濾從培養基(cultured medium)中收集細胞。通過物理手段用超聲破碎器(ultrasonicdisintegrator)、玻璃珠等破碎所得的細胞，然後通過離心去除細胞碎片而得到無細胞的提取物。然後，通過單獨或組合例如鹽析(salt-out)(硫酸銨沉澱，磷酸鈉沉澱等)、溶劑沉澱(通過丙酮、乙醇等分級沉澱蛋白質)、透析、凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相色譜、超濾等的方法，從無細胞的提取物中分離本發明的多肽。
還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性的測定，可以通過例如下列步驟在含0.33％(v/v)二甲亞碸的100mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中加入0.2mM底物(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，0.25mM輔酶NADPH，以及粗酶，使該混合物在30℃反應1分鐘，由反應後340nm波長的吸光度的下降速率來計算所述活性。
另外，由上述反應生成的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的絕對構型的確定和非對映體過量(diastereomeric excess)的測量可以通過高效液相色譜來進行(柱子COSMOSIL 5C8-MS(4.6mm×250mm；由NacalaiTesque生產)，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
本發明的DNA是編碼上述的本發明的多肽的DNA，而且只要能在根據下面敘述的方法轉化的宿主細胞中表達該多肽，其可以是任何DNA，並可以包含任何非翻譯的區域。一旦能夠獲得多肽，本領域普通技術人員即可以通過已知的方法從作為該多肽來源的微生物中獲得這樣的DNA。例如，可以用下面的方法獲得。
首先，用合適的內肽酶消化本發明的分離的多肽，並通過反相HPLC將所得的肽片段分級。然後，例如，使用ABI492蛋白質測序儀(由AppliedBiosystems製造)測定所述肽片段的部分或全部胺基酸序列。
根據這樣獲得的胺基酸序列的信息，合成用於擴增編碼所述多肽的DNA的一部分的PCR(聚合酶鏈式反應)引物。然後，通過一般的DNA分離方法，例如Visser的方法等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))製備作為所述多肽來源的微生物的染色體DNA。使用該染色體DNA作為模板以及上述的PCR引物進行PCR來擴增編碼所述多肽的DNA的一部分，並測定其鹼基序列。鹼基序列可以用例如ABI373 DNA測序儀(由Applied Biosystems製造)等來測定。
一旦清楚了編碼所述多肽的DNA的一部分鹼基序列，就可以通過例如i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))來測定全長序列。
以這種方式獲得的本發明的DNA的例子包括含有SEQ ID NO1所示的鹼基序列的DNA和含有SEQ ID NO2所示的鹼基序列的DNA。此外，本發明的DNA還涵蓋在嚴緊條件下與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的鹼基序列的互補鹼基序列組成的DNA雜交的DNA，其編碼具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
所述在嚴緊條件下與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的鹼基序列的互補鹼基序列組成的DNA雜交的DNA是指當進行菌落雜交方法、噬菌斑雜交方法、Southern雜交方法等時，與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的鹼基序列的互補鹼基序列的DNA特異性地形成雜交體的DNA。
本文所用的嚴緊條件是指例如在65℃，在75mM檸檬酸三鈉，750mM氯化鈉，0.5％十二烷基硫酸鈉，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％Ficoll 400(由Amersham Biosciences製造)的組合物的水溶液中進行雜交，然後在60℃，用15mM檸檬酸三鈉150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液洗滌的條件。優選地，它們指在上述條件下雜交後，在65℃，用15mM檸檬酸三鈉，150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液進行洗滌的條件。更優選地，它們指在以與上述相同的方式雜交後，在65℃，用1.5mM檸檬酸三鈉，15mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液進行洗滌的條件。
本發明的多肽的例子包括由SEQ ID NO1所示鹼基序列編碼的、具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的多肽，和由SEQ ID NO2所示鹼基序列編碼的、具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的多肽。
此外，與這兩種多肽的任一種顯示至少一定水平的同源性，並具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽，在功能上等價於上述兩種多肽，並包括在本發明中。
如本文中所用的，序列的同源性是通過，例如當使用同源性搜索程序FASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman；Pro.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988))比較性分析兩個胺基酸序列時，相對於全部序列的同一性(identity)的值來表示的。與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的多肽等價的多肽的例子，包括與這兩種多肽的任一種顯示不少於78％(SEQ ID NO3所示的多肽和SEQ ID NO4所示的多肽之間的同源性是78％)，優選不少於80％，更優選不少於85％，還更優選不少於90％的同源性的多肽。
這樣的多肽可以，例如，通過將DNA連接到合適的載體中，並將載體導入合適宿主細胞中以讓其表達而得到，其中所述DNA在嚴緊條件下可以與由上述SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的鹼基序列的互補鹼基序列組成的DNA雜交。另外，這樣的多肽可以通過，例如，根據Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.，1989)等中所述的已知的方法，在具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示胺基酸序列的多肽中造成胺基酸的取代、插入、缺失或添加而得到。
通過後一方法得到的多肽的例子包括在SEQ ID NO4所示的胺基酸序列中，用甘氨酸取代第42位的丙氨酸、用丙氨酸取代第43位的穀氨酸、用穀氨酸取代第46位的賴氨酸、和/或用賴氨酸取代第49位的天冬醯胺而得到的多肽。具有所有這4種突變的多肽(突變體多肽1)在SEQ ID NO16中顯示，編碼該多肽(突變體多肽1)的DNA在SEQ ID NO15中顯示。
用於將本發明的DNA導入到宿主微生物，以使DNA在該宿主微生物中表達的載體沒有具體的限制，只要該DNA能夠在合適的宿主微生物中表達編碼基因。這樣的載體的例子包括質粒載體，噬菌體載體，黏粒(cosmid)載體等。另外，還可以使用能夠與其他宿主細胞交換基因的穿梭載體。
這樣的載體一般含有調控因子(regulator)，例如lacUV5啟動子，trp啟動子，trc啟動子，tac啟動子，lpp啟動子，tufB啟動子，recA啟動子，pL啟動子等，而且還可優選地用作含有與本發明的DNA可操作地連接的表達單元的表達載體。例如，可以優選地使用pUCNT(WO94/03613)。
本說明書中所用的術語「調控因子」指具有功能性啟動子和任何相關的轉錄元件(例如增強子，CCAAT盒，TATA盒，SPI部分等)的鹼基序列。
本說明書中所用的術語「可操作地連接」是指在宿主細胞中，控制基因表達的不同的調控元件例如啟動子、增強子等，與基因以可操作的狀態連接。對本領域的普通技術人員而言所熟知的是，調控因子的類型和種類可能依據宿主而變化。
本發明的表達載體的例子包括後面所述的pNTOM3，其中SEQ ID NO1所示的DNA已被導入pUCNT；pNTOM4，其中SEQ ID NO2所示的DNA已被導入pUCNT；及pNTOM5，其中SEQ ID NO15所示的DNA已被導入pUCNT，等等。
作為其中導入了含有本發明的DNA的載體的宿主細胞，可以使用細菌、酵母、絲狀菌(filamentous bacterium)、植物細胞、動物細胞等等。由於導入和/或培養容易，細菌是優選的，且特別優選大腸桿菌(Escherichia coli)。含有本發明的DNA的載體可以通過已知的方法導入宿主細胞。當使用大腸桿菌作為宿主細胞時，例如商業上可獲得的大腸桿菌HB101感受態細胞(由TAKARA BIO生產)可以用於將載體導入宿主細胞。
本發明的轉化體的例子包括後面所述的大腸桿菌HB101(pNTMO3)FERM BP-10368，其中上述pNTMO3已被導入大腸桿菌HB101；大腸桿菌HB101(pNTMO4)FERM BP-10369，其中上述pNTMO4已被導入大腸桿菌HB101；及大腸桿菌HB101(pNTMO5)FERM BP-10370，其中上述pNTMO5已被導入大腸桿菌HB101，等等。這些轉化體已經分別以上述的登錄號被保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(IPODCentral 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566日本)(在日本的原保藏日為2004年6月3日，國家保藏菌株已根據布達佩斯條約於2005年7月6日轉為國際保藏)。
當使用本發明的多肽不對稱地還原具有羰基的化合物以產生光學活性醇時，需要輔酶例如NADH、NADPH等。但是，通過在同時存在可將氧化的輔酶轉變為還原形式(以下稱其為輔酶再生能力)的多肽、作為多肽底物的化合物和本發明的多肽的條件下進行反應，可以顯著地減少所使用的昂貴的輔酶的量。
作為具有輔酶再生能力的多肽，可使用例如氫化酶、甲酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶等。優選使用葡萄糖脫氫酶。
如下可以使用本發明的多肽製備光學活性醇。首先，將作為底物的具有羰基的化合物、輔酶例如NADPH等，以及所述多肽加入合適的溶劑，並在調節的pH下攪拌該混合物以進行反應。當組合使用本發明的多肽和具有輔酶再生能力的多肽進行反應時，將具有輔酶再生能力的多肽(例如葡萄糖脫氫酶)和作為其底物的化合物(例如葡萄糖)進一步添加到上述反應組合物中。
可以使用水性溶劑進行反應，或者可以使用水性溶劑和有機溶劑的混合物進行反應。有機溶劑的例子包括甲苯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、己烷、異丙醇、二異丙基醚、甲醇、丙酮、二甲亞碸等。反應在10℃到70℃的溫度下進行，且反應混合物的pH保持在4-10。可以通過分批的過程或連續的過程來進行反應。對於分批過程，反應底物以0.1％到70％(w/v)的進料濃度加入。作為底物的具有羰基的化合物的例子包括(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮。但是只要該化合物能夠在上述反應條件下被還原並轉變為光學活性醇，對其沒有具體限制。
即使當使用含有編碼所述多肽的DNA的轉化體或者其處理過的產物來代替本發明的多肽時，也可以類似地進行反應。而且，即使當使用既含有編碼本發明的多肽的DNA，又含有編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉化體或者其處理過的產物時，也可以類似地進行反應。「轉化體的處理過的產物」是指，例如，用表面活性劑或有機溶劑處理過的細胞，乾燥的細胞，破碎的細胞，細胞的粗提取物等，以及用已知的手段固定的那些。
具體地，當使用同時含有編碼本發明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉化體，或者其處理過的產物時，不需要單獨製備和添加用於再生輔酶的酶，且可以高效率地生產光學活性醇。
同時含有編碼本發明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉化體可通過下述來獲得將編碼本發明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA摻入到單個載體中，並將該載體導入宿主細胞，或者將這兩種DNA分別摻入到屬於不同的不相容的組的兩種載體中，並將這兩種載體導入單個宿主細胞中。
同時摻入編碼本發明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的載體的例子包括pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1，其中來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脫氫酶基因已被導入上述各個表達載體pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5等。同時含有編碼本發明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉化體的例子包括大腸桿菌HB101(pNTMO3G1)、大腸桿菌HB101(pNTMO4G1)和大腸桿菌HB101(pNTMO5G1)，其中大腸桿菌HB101已經用這些載體所轉化，等等。
轉化體中具有輔酶再生能力的多肽的活性可以用常規方法來測定。例如，當在1M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中加入100mM葡萄糖，2mM輔酶NADP或NAD，及所述酶，並將混合物在25℃下反應1min時，可由340nm波長處吸光度的增加速率計算葡萄糖脫氫酶的活性。
含有編碼本發明的多肽的DNA的轉化體可以在含有碳源、氮源、無機鹽、有機營養物等的常規液體營養培養基中培養，只要其能生長。
反應所得的光學活性醇可以用常規方法純化。例如，當反應所得的光學活性醇是(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇時，用有機溶劑例如乙酸乙酯、甲苯等提取反應混合物，然後減壓蒸發掉有機溶劑。另外，它可以通過如結晶析出(crystal precipitation)、色譜等處理來純化。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非對映體過量的測量可使用高效液相色譜(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生產)，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
如上所述，根據本發明，可以高效率地製備本發明的多肽，而且，使用該多肽，可以提供多種有用的光學活性醇包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的優異的製備方法。
實施例本發明在下面的實施例中得到詳細的說明，這些實施例不應被理解為限制性的。下面的實施例中所用的與重組DNA技術相關的具體操作方法等描述於下面的書籍中Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience)實施例1 多肽的純化根據下面所述的方法，從Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株中分離並純化了具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。除非另有說明，純化是在4℃下進行的。
通過下述測定對於(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的還原活性在含有0.33％(v/v)二甲亞碸的100mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中溶解底物[(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮]至終濃度0.2mM及輔酶NADPH至終濃度0.25mM，再加入粗酶溶液，在30℃進行反應1min，並由反應混合物在340nm波長處的吸光度的減少速率來計算所述還原活性。在所述反應條件下經過1分鐘將1μmol NADPH氧化為NADP的活性定義為1個單位。
(微生物的培養)將含葡萄糖5％，聚腖0.5％，酵母提取物0.1％，磷酸氫二鉀0.1％，磷酸二氫鉀0.2％和七水合硫酸鎂0.02％的液體培養基(18L)(pH 6.5)製備於30L釜式發酵罐(jar-fermentor)(由B.E.Marubishi Co.，Ltd製造)中，並在120℃用蒸汽滅菌20min。
向該培養基中接入180ml預先在相同的培養基中預培養的Ogataeaminuta var minuta NBRC0975菌株的培養基，然後在250rpm攪拌、5.0NL/min通氣量和28℃的條件下將混合物培養48小時。
(無細胞提取物的製備)通過離心從上述培養基中收集細胞，並用2000ml的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)洗滌，以得到907g該菌株的細胞。在1800ml的含0.1mM二硫蘇糖醇(DTT)的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)中重懸這些細胞，並用UH-600超聲分散器(由SMT製造)破碎細胞。通過離心從破碎物中去除細胞碎片以得到無細胞提取物。
(硫酸銨分級)用氨水將上述得到的無細胞提取物的pH調節到7.5，加入硫酸銨並溶解到40％飽和度同時保持pH，然後通過離心除去得到的沉澱。以和上述相同的方式向上清中再加入硫酸銨並溶解到60％飽和度，同時保持在pH 7.5，並通過離心收集得到的沉澱。將沉澱溶解在含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)中，並對相同的緩衝液透析過夜以得到活性級分。
(DEAE-Sephacel柱色譜)將通過硫酸銨分級得到的活性級分上樣到預先用含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)平衡的DEAE-Sephacel(由Amersham Biosciences製造)柱(29×290mm)上，以使活性級分吸附。用相同的緩衝液洗滌柱子後，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分並對相同緩衝液透析過夜。
(MonoQ HR柱色譜)將由DEAE-Sephacel柱色譜得到的活性級分上樣到預先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 10/10柱(由Amersham Biosciences製造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩衝液洗滌柱子後，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分並對相同緩衝液透析過夜。
(Phenyl-Superose柱色譜)將氯化鈉溶於通過MonoQ HR柱色譜所得的活性級分中至終濃度4M，再將該溶液上樣到預先用含4M氯化鈉和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)平衡的Phenyl-Superose HR 10/10柱(由Amersham Biosciences製造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩衝液洗滌柱子後，用氯化鈉線性梯度(4M到0M)洗脫活性級分。收集活性級分並對含0.1mM DTT的10mMTris-HCl緩衝液(pH 7.5)透析過夜。
(MonoQ HR柱色譜)將通過Phenyl-Superose柱色譜得到的活性級分上樣到預先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 5/5柱(由Amersham Biosciences製造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩衝液洗滌柱子後，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分並用Centricon YM-10(由Millipore生產)濃縮。
(凝膠過濾色譜)將通過上述MonoQ HR柱色譜得到的活性級分上樣到預先用含0.2M氯化鈉和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)平衡的Superdex 200HR 10/30柱(由Amersham Biosciences製造)上，並用相同的緩衝液以0.5ml/min的流速洗脫活性級分。收集活性級分並用Centricon YM-10(由Millipore生產)濃縮。再將其上樣到預先用相同緩衝液平衡的Superdex 200 HR 10/30柱(由Amersham Biosciences製造)上，並用相同的緩衝液以0.5ml/min的流速洗脫活性級分。收集活性級分並用作所述多肽的純化標準樣品。
(實施例2)基因克降(PCR引物的製備)
使實施例1中所得的純化多肽在8M脲存在下變性，然後用源自無色桿菌屬(Achromobacter)的賴氨醯內肽酶(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd製備)消化。然後，通過ABI492蛋白質測序儀(由Perkin Elmer製造)測定所得的肽片段的胺基酸序列。根據從該胺基酸序列推測的DNA序列，合成了引物15』-acngtntayttyathgcngg-3』(SEQ ID NO5)和引物25』-atnggdatrtcraaytgrtc-3』(SEQ ID NO6)，用來通過PCR擴增編碼該多肽的基因的一部分。
(通過PCR擴增基因)從以與實施例1相同的方式培養的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的細胞中，根據Visser的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))等提取染色體DNA。用上面製備的DNA引物1和2並使用所得的染色體DNA作為模板進行PCR。結果，擴增了被認為是目標基因的一部分的約700bp的DNA片段。用TaKaRa Ex Taq(由TAKARA BIO製造)作為DNA聚合酶進行PCR，其中反應條件遵照其指導手冊。將該DNA片段克隆到質粒pT7Blue T-載體(由Novagen製造)，並用ABI PRISM染料終止物循環測序即用反應試劑盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(由Perkin Elmer製造)和ABI 373A DNA測序儀(由Perkin Elmer製造)分析其鹼基序列。PCR的結果顯示，擴增了具有不同鹼基序列的兩種DNA片段。其鹼基序列在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中顯示。
(通過i-PCR鑑定目標基因的全長序列)用限制酶XbaI完全消化上面製備的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的染色體DNA，用T4連接酶使所得的DNA片段的混合物分子內環化。使用其為模板，通過i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))確定了含有上述SEQ ID NO7所示的鹼基序列的基因的全長鹼基序列。結果在SEQ ID NO1中顯示。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARA BIO製造)作為DNA聚合酶進行i-PCR，其中反應條件根據其指導手冊。通過類似的操作還確定了含有上述SEQ ID NO8所示的鹼基序列的基因的全長鹼基序列，其結果在SEQ ID NO2中顯示。另外，由SEQ ID NO1所示的鹼基序列編碼的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO3中，由SEQ ID NO2所示的鹼基序列編碼的胺基酸序列顯示在SEQ ID NO4中。
(實施例3)表達載體的構建使用引物35』-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3』(SEQ ID NO9)和引物45』-gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa-3』(SEQ ID NO10)，並以實施例2中得到的Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株的染色體DNA作為模板進行PCR。結果得到了這樣的雙鏈DNA其中在具有如SEQ ID NO2所示的鹼基序列的基因的起始密碼子處添加了NdeI識別位點，而在緊接著該基因的終止密碼子之後添加了EcoRI識別位點。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARABIO製造)作為DNA聚合酶進行PCR，其中反應條件根據其指導手冊。用NdeI和EcoRI消化該DNA，並將其插入質粒pUCNT(WO 94/03613)的lac啟動子的下遊的NdeI識別位點和EcoRI識別位點之間，以構建重組載體pNTOM4。
類似地，使用引物55』-gtgcatatggctaagactgtctatttca-3』(SEQ ID NO11)和引物65』-gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa-3』(SEQ ID NO12)得到了這樣的雙鏈DNA其中在具有如SEQ ID NO1所示的鹼基序列的基因的起始密碼子處添加了NdeI識別位點，而在緊鄰該基因的終止密碼子之後添加了EcoRI識別位點。以與上面相同的方式將該DNA插入質粒pUCNT以構建重組載體pNTOM3。
(實施例4)突變體基因的構建使用Mutan-SuperExpress Km(由TAKARA BIO製造)並遵照其指導手冊中描述的操作方法，製備了這樣的突變體基因其中在具有如SEQ ID NO2所示的鹼基序列的基因中，第125位的C被G取代，第128位的A被C取代，第136位的A被G取代，且第147位的C被G取代。該突變體基因編碼這樣的多肽，其中在SEQ ID NO4所示的胺基酸序列中，第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，第43位的穀氨酸被丙氨酸取代，第46位的賴氨酸被穀氨酸取代，第49位的天冬醯胺被賴氨酸取代。該突變體基因的鹼基序列在SEQ IDNO15中顯示，且由該基因編碼的突變體多肽的胺基酸序列在SEQ ID NO16中顯示。以和實施例3相同的方式將該突變體基因插入載體pUCNT中以構建重組載體pNTOM5。
(實施例5)進一步包含葡萄糖脫氫酶基因的表達載體的構建使用引物75』-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3』(SEQ ID NO13)和引物83』-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-5』(SEQ ID NO14)，並以質粒pGDK1(Eur.J.Biochem.，186，389(1989))作為模板進行PCR，得到了這樣的雙鏈DNA其中，在源自巨大芽孢桿菌IAM1030菌株的葡萄糖脫氫酶(以下稱為GDH)基因中，起始密碼子上遊5個鹼基處添加了大腸桿菌核糖體結合序列，該核糖體結合序列的緊鄰前方添加了EcoRI切割位點，且終止密碼子緊鄰後方添加了SalI切割位點。
所得的DNA片段用EcoRI和SalI消化，並插入實施例3和4中構建的pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5的EcoRI和SalI位點，以構建重組質粒pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1。作為示例，pNTOM4G1的產生方法和結構顯示在圖1中。
(實施例6)轉化體的製備使用實施例3和4中構建的重組載體pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5轉化大腸桿菌HB101感受態細胞(由TAKARA BIO製造)得到大腸桿菌HB101(pNTOM3)、大腸桿菌HB101(pNTOM4)和大腸桿菌HB101(pNTOM5)。這些轉化體已經分別以登錄號FERM BP-10368、FERMBP-10369和FERM BP-10370被保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(IPOD)。
類似地，使用實施例5中構建的重組載體pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1轉化大腸桿菌HB101感受態細胞(由TAKARA BIO製造)得到大腸桿菌HB101(pNTOM3G1)、大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)和大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)。
(實施例7)轉化體中的基因表達將實施例6中獲得的6種轉化體和含有載體質粒pUNCT的轉化體大腸桿菌HB101(pUNCT)接種到50ml的含有200μg/ml氨苄青黴素的2×YT培養基(胰蛋白腖1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％，pH7.0)，37℃下振蕩培養24小時。通過離心收集細胞，並重懸於50ml的100mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)中。用UH-50超聲均質器(由SMT製造)破碎細胞，通過離心去除細胞碎片以得到無細胞提取物。測量了無細胞提取物的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性和GDH活性，並作為比活性表示在表1中。在所有6種實施例6中獲得的轉化體中都觀察到了(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性的表達。在含有GDH基因的大腸桿菌HB101(pNTOM3G1)、大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)和大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)中也觀察到了GDH活性的表達。(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性是通過實施例1中描述的方法測定的。當在1MTris-HCl緩衝液(pH 8.0)中加入0.1M葡萄糖，2mM輔酶NADP，以及粗酶溶液，並使該混合物在25℃反應1min時，由340nm波長處的吸光度的增加速率計算GDH活性。在所述反應條件下經過1分鐘將1μmol的NADP還原成NADPH的酶活性定義為1個單位。另外，用蛋白質測定試劑盒(由BIO-RAD製造)測定無細胞提取物中的蛋白質濃度。
表1
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮
(實施例8)使用轉化體反應將葡萄糖脫氫酶(由Amano Enzyme製造)2000U，葡萄糖2g，NADP 6mg和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g加入50ml實施例7中製備的大腸桿菌HB101(pNTOM3)的無細胞提取物中，30℃下攪拌所述混合物22小時並通過滴加5M氫氧化鈉將pH調節到6.5。反應完成後，用甲苯提取反應混合物，去溶劑，並分析該提取物。結果得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產率86.3％、非對映體過量96.4％d.e.)。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非對映體過量的測定使用高效液相色譜來進行(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生產)，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
(實施例9)使用轉化體反應向22.5ml實施例7中製備的大腸桿菌HB101(pNTOM4)的無細胞提取物中加入葡萄糖脫氫酶(由Amano Enzyme製造)1250U、葡萄糖3g、NADP4mg、(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮0.25g，在30℃下攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調節到6.5。反應開始後2小時、4小時和6小時添加0.25g、及反應開始後8小時添加1.25g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，反應31小時。反應完成後，用甲苯抽提反應混合物，脫溶劑後，和實施例8一樣分析提取物。結果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產率99.0％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實施例10)使用轉化體反應向25ml實施例7中製備的大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)的無細胞提取物中加入葡萄糖3g、NADP 3mg、甲苯0.25ml及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，在30℃下攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調節到6.5。反應完成後，用甲苯提取反應混合物，脫溶劑，以與實施例8相同的方式分析提取物。結果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產率99.1％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實施例11)使用轉化體反應向以與實施例7中相同的方式製備的大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)的培養基中加入葡萄糖6g、NADP 1.4mg、甲苯0.25mI及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，將混合物在30℃攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調節到6.5。反應開始後1小時添加2.5g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，使混合物反應20hr。反應完成後，用甲苯提取反應混合物，脫溶劑，並以與實施例8相同的方式分析提取物。結果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產率99.0％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實施例12)多肽的底物特異性在含有0.33％(v/v)二甲亞碸的100mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中，分別溶解作為底物的羰基化合物到1mM的終濃度，及輔酶NADPH到0.25mM的終濃度。向其中加入實施例7中製備的大腸桿菌HB101(pNTOM4)或大腸桿菌HB101(pNTOM3)無細胞提取物，並使該混合物在30℃反應1小時。由反應混合物在340nm波長處的吸光度的減少速率來計算對每種羰基化合物的還原活性，並在表2中顯示為相對於對(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性(其作為100％)的值。由所述轉化體產生的、由SEQ IDNO3和SEQ ID NO4所示胺基酸序列組成的多肽，對於多種羰基化合物都顯示了還原活性。
表2轉化體產生的多肽的底物特異性
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮.
序列表110株式會社鍾化(Kaneka Corporation)120新羰基還原酶、其基因及它們的使用方法130B040342WO01150JP2004-2312261512004-08-0616016170PatentIn version 3.12101211756212DNA213Ogataea minuta var.minuta4001atggctaaga ctgtctattt cattgccgga gcatcgagag ggattggcct cgagattgca 60acccaattga gtgcaaaccc agagaaccat gtgattgcct cgtacagatc tgaaaagact 120gctggtgcac tcctggaact tgccaagaag gacaacgtgg acactgttgt gttggatatt 180gcaatccagg agtcgattga gggtttgtcc caacagattg tgaagctgac ggacggaatt 240gatattgctc tgatcaatgc cggagttgga tactcaatgt actctctact cgaatgttcc 300agagaagcat tcattgacca ctggactaca aattctctgg gtccaatcct ggtgtataag 360gaaatccacc aattcatgct gaagagagaa actcgaaaag tgttcttcat gtctagcgga 420gcagggtcta ttcagggcca cttgcctgtt tccgtgagtg catacggtat gtcgaaggca 480gcactgaact acgcggcccg gaaactttct gacgaatgct acaaagacgg ctttactatt 540gtggcgcttc acccaggtat ggttctgaca gacatgggta tggagagtat tgagattatg 600gcaaacggag acgagcagct tgccgcgtcc atcaacagta ttgcaattag tacagacact 660agtgccgcac aatgcattgg tgcaatgcag agtcttacaa agcagagcaa cggtagattc 720attaatgttg cagaccagtt tgacattcca ttctag 7562102211756212DNA213Ogataea minuta var.minuta4002atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcagctgagc tgctcaaact ggccaacaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480
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213Ogataea minuta var.minuta4004Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ala35 40 45Asn Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Ash Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phc Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250210521120212DNA213人工的220
223引物1220
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223引物2220
221misc_feature222(3)..(3)223n代表a，t，g或c4006atnggdatrt craaytgrtc 202107211703212DNA213Ogataea minuta var.minuta4007agcatcgaga gggattggcc tcgagattgc aacccaattg agtgcaaacc cagagaacca 60tgtgattgcc tcgtacagat ctgaaaagac tgctggtgca ctcctggaac ttgccaagaa 120ggacaacgtg gacactgttg tgttggatat tgcaatccag gagtcgattg agggtttgtc 180ccaacagatt gtgaagctga cggacggaat tgatattgct ctgatcaatg ccggagttgg 240atactcaatg tactctctac tcgaatgttc cagagaagca ttcattgacc actggactac 300aaattctctg ggtccaatcc tggtgtataa ggaaatccac caattcatgc tgaagagaga 360aactcgaaaa gtgttcttca tgtctagcgg agcagggtct attcagggcc acttgcctgt 420ttccgtgagt gcatacggta tgtcgaaggc agcactgaac tacgcggccc ggaaactttc 480tgacgaatgc tacaaagacg gctttactat tgtggcgctt cacccaggta tggttctgac 540agacatgggt atggagagta ttgagattat ggcaaacgga gacgagcagc ttgccgcgtc 600catcaacagt attgcaatta gtacagacac tagtgccgca caatgcattg gtgcaatgca 660gagtcttaca aagcagagca acggtagatt cattaatgtt gca 7032108211703212DNA213Ogataea minuta var.minuta4008agcttctaga ggtattggcc ttgaggttgc cactcagctg agtgccaacc cagataatta 60
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223引物540011gtgcatatgg ctaagactgt ctatttca 282101221130212DNA213人工的220
223引物640012
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223引物740013gccgaattct aaggaggtta acaatgtata aa 322101421128212DNA213人工的220
223引物840014gcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg 2821015211756212DNA213人工的220
223突變DNA 140015atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcaggtgcgc tgctcgaact ggccaagaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 75621016211251212PRT213人工的220
223突變多肽140016Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phe Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250
權利要求
1.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO1中所示鹼基序列的DNA，(b)與由SEQ ID NO1所示鹼基序列的互補鹼基序列組成的DNA在嚴緊條件下雜交，並編碼多肽的DNA，所述多肽具有不對稱地還原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以產生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性
2.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO2中所示的鹼基序列的DNA，(b)與由SEQ ID NO2所示的鹼基序列的互補鹼基序列組成的DNA在嚴緊條件下雜交，並編碼多肽的DNA，所述多肽具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
3.一種多肽，其由權利要求
1或2的DNA所編碼，並具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
4.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO3中所示的胺基酸序列的多肽，(b)包含與SEQ ID NO3中所示的胺基酸序列顯示不少於78％的同源性的胺基酸序列，並具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
5.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列的多肽，(b)包含與SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列顯示不少於78％的同源性的胺基酸序列，並具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
6.一種在SEQ ID NO4中所示的胺基酸序列中、具有下列1)到4)中的至少一種突變的多肽1)第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，2)第43位的穀氨酸被丙氨酸取代，3)第46位的賴氨酸被穀氨酸取代，4)第49位的天冬醯胺被賴氨酸取代。
7.權利要求
6所述的多肽，其包含前述1)到4)的所有突變。
8.編碼權利要求
4-7中任一項所述的多肽的DNA。
9.包含權利要求
1、2或8的DNA的載體。
10.權利要求
9所述的載體，其是質粒pNTOM3。
11.權利要求
9所述的載體，其是質粒pNTOM4。
12.權利要求
9所述的載體，其是質粒pNTOM5。
13.權利要求
9所述的載體，還包含編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的多肽的DNA。
14.權利要求
13所述的載體，其中所述具有葡萄糖脫氫酶活性的多肽是源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脫氫酶。
15.用權利要求
9-14中任一項所述的載體轉化宿主細胞而獲得的轉化體。
16.權利要求
15所述的轉化體，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。
17.權利要求
16所述的轉化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM3)FERMBP-10368。
18.權利要求
16所述的轉化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM4)FERMBP-10389。
19.權利要求
16所述的轉化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM5)FERMBP-10370。
20.一種光學活性醇的製造方法，其包括使權利要求
3-7中任一項所述的多肽或權利要求
15-19中任一項所述的轉化體，或其處理過的產物，與具有羰基的化合物反應。
21.權利要求
20所述的方法，其中所述具有羰基的化合物是由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，所述光學活性醇是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。
專利摘要
分離自屬於Ogataea屬的微生物，並具有不對稱地還原(3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁酮以產生(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的活性的多肽；編碼該多肽的DNA；產生該多肽的轉化體；和使用上述多肽或轉化體生產(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的方法。通過使用上述多肽或轉化體，可以高效地生產光學活性醇，例如(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇。
文檔編號C12N5/10GK1993464SQ200580026643
公開日2007年7月4日 申請日期2005年8月1日
發明者木崎憲之, 矢野美穗, 船木正大, 武居輝明, 八十原良彥, 守川壯一, 中井孝尚, 片岡道彥, 清水昌 申請人:株式會社鍾化導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan