彈力素的重組製備和應用的製作方法

2023-11-05 19:09:12

專利名稱：彈力素的重組製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白酶抑制劑的製備和應用，特別是涉及彈力素(Elafm)在酵 母細胞表達系統中的製備和其在生產用於預防和治療急性胰腺炎和急性胰腺炎 合併肺損傷的藥物中應用，以及以彈力素為基本活性成分的藥物組合物。
背景技術：
急性胰腺炎(AP)是外科急腹症中常見的疾病之一。其發生率繼急性闌尾 炎、急性腸梗阻、急性膽囊炎和胃十二指腸潰瘍急性穿孔之後，居急腹症疾病的 第5位。多數AP為輕型，可經非手術療法治癒，但有10%—20%的重型病人， 胰腺發生出血、壞死，又稱急性出血壞死性胰腺炎(AHNP)，臨床表現重，非手 術療法的病死率高，病人大多死於嚴重感染和多器官功能不全症候群(MODS)， 重症AP病人如獲及時和合理的手術治療，可降低病死率。
急性肺損傷(ALI)是急性胰腺炎的常見併發症之一，急性胰腺炎早期死亡患 者中大部分合併有肺損傷或死於嚴重肺損傷。急性胰腺炎相關性肺損傷發病機制 複雜，近年來很多實驗性研究集中在炎症細胞及炎症介質的激活途徑上，認為 肺損傷是全身炎症反應症候群在肺部的局部表現，而肺部因其組織特異性易於 發生炎症性損傷。
彈力素(Elafin)是一種分子量為6kDa的低分子量彈性蛋白酶抑制劑，具 有抑制胰彈性蛋白酶、人中性粒細胞蛋白酶(HNE)和蛋白酶3的作用(Molhuizen HO, Schalkwijk J. Structural, biochemical, and cell biological aspects of the serine proteinase inhibitor SKALP/彈力素/ESI. Biol Chem Hoppe Seyler. 1995 Jan;376(l):l-7)。主要由肺泡巨噬細胞、Clara細胞及II型肺泡細胞在炎性刺激下 合成分泌(Sallenave JM， Silva A, Marsden ME, Ryle AP. Secretion of mucus proteinase inhibitor and彈力素by Clara cell and type II pneumocyte cell lines. Am
J Respir Cell Mol Biol. 1993 Feb;8(2): 126-33.)。
彈力素通過抑制體內廣泛分布的絲氨酸蛋白酶活性，起到調節炎性細胞因 子釋放、抑制血細胞激活和白細胞跨內皮遷移、減少炎細胞浸潤及組織毒性物質 釋放等作用，表現為多層次的抗炎效應。體外循環(ECC)、器官移植等大手術中， 器官的缺血再灌注損傷和炎性損傷常常常與術後的器官功能障礙密切相關。因而 彈力素以抗炎為核心的器官保護作用受到外科臨床的重視。彈力素能通過抗蛋白 酶活性、抑制炎性介質釋放和直接抗微生物活性等多種方式發揮減輕炎症性肺部 疾病的作用。雖然目前己對白細胞彈力蛋白酶抑制劑的治療肺部疾病中的應用已 進行了較多研究，但迄今國內外尚未見有關在畢赤酵母表達系統中的製備彈力素 和將彈力素用於急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷的報導。
本發明人將基因工程方法應用於彈力素的研究，利用高效的酵母表達系統成 功地獲得了高活性的彈力素蛋白。同時利用牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射法建立大 鼠急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷的模型，通過給動物投用彈力素，觀察其 對動物急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷的保護和治療作用，證實了彈力素在 生產急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷治療藥物的可行性，從而完成了本發 明。

發明內容
本發明的一個目的是提供生產彈力素的方法，特徵在於所說的彈力素是在畢 赤巴斯特德酵母表達系統中重組產生的。
本發明的另一個目的是提供一種由彈力素或其結構類似物以及一種或多種 醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。
本發明的再一個目的是提供彈力素在生產用於治療急性胰腺炎和急性胰腺 炎合併肺損傷的藥物中應用。
可以利用常規的DNA重組和分子克隆技術製備重組人彈力素(EIafin)。 根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的彈力素可以是由原核、真核或酵母 表達系統產生的。然而，為了本發明目的，優選的表達系統是巴斯德畢赤酵母表 達系統。
畢赤酵母(/VcWa; aWo^^)是近十餘年來發展起來的極具潛力的一種表達系
統，它是一種單細胞的真核生物，兼具有原核和真核細胞的優點，因而發展很快， 據統計至今已有近千種外源蛋白在此系統中表達。畢赤酵母表達體系具有如下優 點(l)含特有的醇氧化酶基因(AOXl)啟動子，用甲醇可以嚴格地調控表達；(2) 培養基成分簡單，組分包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉價而無 毒；(3)畢赤酵母菌為單細胞真核生物，生長快，易於分子遺傳學操作；(4)具有 真核細胞的翻譯後修飾功能；(5)無致病性，不產生內毒素等有害物質；(6)具有 強烈的好氧生長偏愛性，可進行細胞高密度培養，利於大規模工業化生產重組蛋 白。
以下簡單地描述使用優化的發酵培養條件，在80 L發酵罐中工業化大規模生 產彈力素的方法。
(1) 酵母表達載體的構建以人HeLa細胞DNA為模板，使用合成的引物 1:5'-CgATCTAgAgCgCAAgAgCCAgTCAA-3' (SEQ ID NO: 1)和引物2: 5'— gCTAAgCTTCTggggAACgAAACAgg-3'(SEQ ID NO: 2)，經聚合酶鏈反應(PCR) 擴增得到長度約190bp的產物。酶切後與用同種酶消化的pBKS載體連接，得到 重組質粒pBKS/Ws/Y/ 。酶切分析和測序鑑定表明，重組質粒攜帶 了預期的重組人彈力素基因序列。然後，以pBKS/^a/Y/7重組質粒為模板，使用 合成的引物3: 5'-AgCCTCgAgAAgAgAgCgCAAgAgCCAgTCA-3' (SEQIDNO: 3)和引物4: 5'-gCgTCTAgATTACTggggAACgAAACAggCC-3'(SEQ ID NO: 4)， 經聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到長度約195bp的產物。酶切後與用同種酶消化 的pPICZ a載體連接，得到重組質粒pPICZ a /e"/Y/7。。酶切分析和測序鑑定結 果表明，pPICZci / e^/Y/J，重組質粒攜帶了預期的a因子信號肽和重組人彈力素 基因序列。
(2) 重組質粒的轉化、陽性克隆的篩選和表達採用電轉化法將pPICZ a 轉化到酵母菌株X-33中。在YPD zeocin陽性培養基中28 。C培養36
小時後，挑取單克隆菌落接種於BMGY培養基中，待細菌處於對數生長期(006。。=2 6)時，重懸於BMMY培養基中繼續培養。每隔24小時補加100 %甲醇至終濃度 為0.5 %，以誘導重組人彈力素的表達。誘導後，每隔24小時取上清，用豬胰 彈性蛋白酶(PPE)和底物Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-PNA進行活性測定，篩選相對 高表達量的菌株。 (3) 大規模發酵工藝將高密度的(0D6。。=14)酵母工程菌接種於含甘油(5 %,V/V)加痕量鹽(4.34 ml PTM1/L)和生物素(0.08 mg/L)的FM21培養基中， 在溫度28 °C、 pH5.2、溶解氧濃度20%、攪拌速度800轉/分鐘,罐內壓力10psi 條件下,在發酵罐罐內發酵培養26小時。當溼細胞重量〉180 220g/L時，以漸增 的速度添加含1.2 % PTM1的100%甲醇，誘導重組人彈力素的表達，其甲醇補 加速率為3.6 ml/h/L—7.3 ml/h/L—10.9 ml/h/L，直至發酵結束。
(4) 表達產物的純化70L發酵液離心取上清，用NaOH (lmol/L)調pH 4.0，添加NaAc-HAc緩衝液(終濃度為20國ol/L)和去離子水稀釋後，通過預 先用緩衝液A (20 raraol/L NaAc-HAc， pH 4.0)平衡過的S印harose SP陽離子 交換柱。然後連續加樣，檢測穿透液的活性，待樹脂飽和後用3倍於柱體積的緩 衝液A洗柱。用緩衝液B (20mraol/LNaAc-HAc力卩lmol/LNaCl， pH4.0)洗脫。 洗脫液經AKATA Explore多功能純化系統中疏水層析樹脂及兩次Mono S陽離 子交換樹脂得以進一步的純化，最後，上述洗脫液用AKATA Explore多功能純 化系統中疏水層析樹脂除鹽得到純品，純化率可達95%。
為了深入研究重組人彈力素對大鼠急性壞死性胰腺炎和急性壞死性胰腺炎 合併肺損傷的治療作用，在本研究中，我們觀察了重組人彈力素對大鼠急性急性 壞死性胰腺炎或急性壞死性胰腺炎合併肺損傷動物模型的多種血清生化指標的 影響，同時對各實驗組動物的胰腺組織進行了病理學觀察和統計學分析。在急性 壞死性胰腺炎和急性壞死性胰腺炎合併肺損傷動物模型的實驗中發現，與對照組 相比，接受彈力素治療的實驗組動物，彈力素低、中、高劑量組與模型組比較， 胰腺壞死和損傷幾功能均可見明顯改善(P<0.01),且隨著劑量的增加改善明顯。
基於這些實驗結果，我們初步認定重組人彈力素(Elafm)有可能作為一種 新的細胞保護劑，用於預防和治療急性壞死性胰腺炎和急性壞死性胰腺炎合併肺 損傷。
因此，本發明的一個目的是提供彈力素在生產用於預防和治療急性壞死性胰 腺炎和急性壞死性胰腺炎合併肺損傷的藥物中的應用。
根據本發明的優選實施方案，其中所說的彈力素是人源化的，並且是以DNA 重組技術製備的。
本發明的另一個目的是提供一種具有急性壞死性胰腺炎和急性壞死性胰腺
炎合併肺損傷的、由重組人彈力素及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組 成的藥物組合物。
用於本發明的重組人彈力素可以是具有天然野生序列的生物學活性多肽，但 也可以是為改善產物的生物學活性，或為提高產物的產率或藥物動力學性質目的 而在基因水平上進行了必要的修飾的重組人彈力素類似物或突變體。這裡所說的 修飾可以是內部或末端個別或部分胺基酸的加入、缺失或取代。
本發明涉及的重組人彈力素可以單獨使用，也可以作為有各種不同劑型的藥 物組合物的形式使用。可以使用製藥工業領域已知的方法(參見Remington's Pharmaceutical Sciences , Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)，以適於口服或非口服 給藥的單位計量形式製備本發明的藥物組合物。例如，可將作為活性成分的有效 量的重組人彈力素與醫藥上可接受的載體或賦形劑均勻地混合，製成溶液或懸浮 液形式的適於靜脈內、肌肉內、器官腔內、皮內和皮下等胃腸道外途徑給藥的藥 物組合物。
根據本發明的藥物組合物，其中所使用的醫藥上可接受的載體或賦形劑將依 據所製備的本發明藥物組合物的劑型而有不同的選擇。
適於胃腸道外給藥的製劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油和氫化萘等常 用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交 酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，以控制活性成分的緩 慢釋放。在其他適於胃腸道外給藥的製劑中，還包括含有水楊酸的直腸給藥製劑 和含有甘膽酸鹽的含服給藥製劑。
具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑， 澱粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤 滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結劑， 和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、 分散劑等輔助成分，以常規方法製備片劑。
可以使用乳糖和甘露醇等賦形劑，澱粉等崩解劑，明膠等黏結劑，以常規方 法製備顆粒劑。
或者，可以使用乳糖和蔗糖等賦形劑，以常規方法製備粉末劑。使用明膠、 水、蔗糖、阿拉伯膠、山梨醇、甘油、結晶纖維素、硬脂酸鎂和滑石等，以常規
方法製備膠囊劑。
可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇 等溶劑，苯甲酸鈉，水楊酸鈉和氨基甲酸乙酯等增溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲 劑，青黴素和鏈黴素及其他抗真菌劑等抗生素，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、 三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常 規方法製備注射劑。
本發明的藥物組合物對胰腺細胞具有良好的保護作用。雖然有關作用機理目 前尚不明確，但我們推測可能與重組人彈力素或其類似物作用於胰腺細胞並抑制 細胞表面上的絲氨酸蛋白酶類有關。
一般說來，本發明藥物組合物的給藥劑量約為0.01-500 mg/kg,較好為 0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、靜脈內注射等多種途 徑藥給。當然，本領域技術人員可以理解到，為有效地治療病人所需的確切的給 藥劑量，應根據待治療的病症或病理狀態的性質、嚴重程度、病人的年齡、體重 和一般健康狀態，所用藥物的劑型、病人對所用藥物的敏感性和耐受性，以及所 使用給藥途徑等因素，按照個體化的原則由臨床醫生確定。


圖1顯示重組彈力素純化後的SDS-PAGE圖譜，其中1為6 KDa蛋白標準品
(10iig) ; 2、 3、 4為不同濃度的洗脫樣品；5為蛋白質分子量標準(由下至上
14KDa， 20 KDa， 31 KDa， 43 KDa， 66 KDa， 97 KDa)。
圖2顯示假手術組胰腺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見假手術 組動物的胰腺實質的外分泌部及內分泌部結構正常，胞漿淺粉色，核圓染色深。 細胞形態清晰。
圖3顯示模型組胰腺組織HE染色，IOO倍光鏡下觀察結果，可見模型組胰 腺腺泡呈大片凝固性壞死，小葉結構破壞，界限模糊不清，間質小血管壁也有壞 死。在壞死的胰腺組織內及周圍可見大片出血灶，中性及單核細胞浸潤。
圖4顯示高劑量組胰腺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見大、中、 小劑量治療組可見胰腺組織結構清晰，小葉間隔為疏鬆結締組織，間質輕微水腫， 少量炎細胞浸潤，血管變化不明顯。 圖5顯示抑肽酶組胰腺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見抑肽酶 組可見胰腺細胞結構完整，細胞結構清楚，小葉界限明確，無壞死，間質無炎性 細胞浸潤及水腫，外分泌部及內分泌部結構正常，核圓染色深。
圖6顯示假手術組胰腺組織，10k透射電鏡觀察結果，可見腺泡細胞，胞質 內可見線粒體，粗面內質網，高爾基體，下部分泌顆粒，細胞連接清晰可見。
圖7顯示模型組胰腺組織4k透射電鏡觀察結果，可見核不規則，線粒體腫 脹，腺泡結構破壞嚴重，細胞器空化。中性粒細胞中間有顆粒，分葉核。。
圖8顯示高劑量組胰腺組織75k透射電鏡觀察結果，可見腺泡細胞頂部分泌 顆粒增多，核不規則，基質緻密。胞質內可見髓樣小體，細胞間隙輕度擴大，下 方粗面內質網擴張。
圖9顯示假手術組肺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見假手術組 肺組織結構清晰，肺泡壁薄,肺泡腔內偶見巨噬細胞,未見中性粒細胞浸潤。
圖IO顯示模型組肺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見肺間質可見 大量中性粒細胞浸潤，以血管和小支氣管周圍最明顯；肺組織水腫加重、肺泡間 隔明顯增寬。
圖ll顯示大劑量組肺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見肺泡結構 尚完整，炎症細胞輕度浸潤，間隔明顯變薄。
圖12顯示抑肽酶組肺組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見對照藥物 抑肽酶組可見肺泡結構尚完整，間隔明顯變薄，炎症細胞輕度浸潤，肺泡腔縮小。
具體實施例方式
實施例1:重組人彈力素的重組製備
1、酵母表達載體的構建以人HeLa細胞DNA為模板，使用合成的引物1: 5'-CgATCTAgAgCgCAAgAgCCAgTCAA-3' (SEQ ID NO: 1)和引物2: 5'-gCTAAgCTTCTggggAACgAAACAgg-3'(SEQ ID NO: 2)，經聚合酶鏈反應(PCR) 擴增得到長度約190bp的產物。擴增程序為①94°C 4min;②94°C 40s, 58 °C 30s,72。C 40s,30個循環；③72°C 8min。而後，回收PCR擴增的目的片段， 經Jftal禾n ///w/ni酶切後與用同種酶消化的pBKS載體連接，得到重組質粒 pBKS/eh/Y/7。酶切分析和測序鑑定表明，pBKS/"a力V 重組質粒攜帶了預期的
重組人彈力素基因序列。然後，以pBKS/eh/Y/7重組質粒為模板，使用合成的引 物3: 5'-AgCCTCgAgAAgAgAgCgCAAgAgCCAgTCA-3' (SEQIDNO: 3)和引 物4: 5'- gCgTCTAgATTACTggggAACgAAACAggCC -3' (SEQIDNO: 4)， 經聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到長度約195bp的產物。常規方法回收PCR產物， 用，0/和1fl/酶切後與用同種酶消化的pPICZa載體連接，得到重組質粒 pPICZ a /e"/Y;7。 。 ///mffll和^YZ^ I雙酶切分析和測序鑑定結果表明，pPICZ a / eh/Y;7,重組質粒攜帶了預期的a因子信號肽和重組人彈力素基因序列。
2、重組質粒的轉化、陽性克隆的篩選和表達以限制性內切酶Sad消化重 組表達載體pPICZ a /^s/Y/7，使其線形化後，採用電轉化法將pPICZ a /eJs/Y/ 轉化到酵母菌株X-33中。在YPDzeocin陽性培養基中28 。C培養36小時後，挑 取單克隆菌落接種於BMGY培養基中，待細菌處於對數生長期(0D6。。=2 6)時， 重懸於BMMY培養基中繼續培養。每隔24小時補加100%甲醇至終濃度為0. 5%， 以誘導重組人彈力素的表達。誘導後，每隔24小時取上清，用豬胰彈性蛋白酶 (PPE)和底物Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-PNA進行活性測定。通過測定發酵液上清 中重組Elafin對豬胰彈性蛋白酶作用後的A4K)值大小來檢測Elafm活力，篩選相 對高表達量的菌株。
3、大規模發酵工藝將YPD培養基培養的高密度(0D6。。=14)酵母工程菌2L 接種於含甘油(5 %,V/V)加痕量鹽(4.34mlPTMl/L)和生物素(0.08mg/L) 的40LFM21培養基中，在溫度28 °C、 pH 5.2、溶解氧濃度20 %、攪拌速度800 轉/分鐘,罐內壓力10 psi條件下，在發酵罐罐內發酵培養26小時，待FM21培養 基中的甘油消耗完畢後，此時溼細胞重量大於180 220g/L，即轉入甲醇誘導表 達階段，以漸增的速度添加含1.2 % PTM1的100%甲醇，誘導重組人彈力素的 表達，其甲醇流加速率為3.6ml/h/L以此速率維持2 3h，以使酵母適應以甲醇 為唯一碳源的環境。而後將甲醇流加速率增加為7.3 ml/h/L以此速率維持2h， 最後甲醇流加速率增加為10.9ml/h/L,直至發酵結束。在發酵過程中監測DO 值(維持在20%~30%)和發酵液溫度(維持在28 °C)並判斷甲醇是否過量(停 補甲醇觀測DO值變化，若停補甲醇後，DO值在lmin內上升幅度大於10%， 說明碳源受限，反之說明甲醇過量)，若碳源受限，則加快補甲醇的速率，若甲 醇過量則應調慢補甲醇的速率，直到合適的速度。開始誘導表達後，每隔6h取 樣1次，測0D6(X)和細胞溼重，分析酵母菌生長狀態，肉眼和鏡下觀察菌液，排 除雜菌汙染，並留上清用於蛋白分析。應用前述的活力測定方法分析各個時間點 的發酵液上清，時刻監測蛋白表達情況。誘導發酵48h後，結束髮酵。
4、表達產物的純化70 L發酵液離心取上清，用NaOH (lmol/L)調pH 4. 0， 添加NaAc-HAc緩衝液(終濃度為20 mmol/L， pH4. 0)和去離子水稀釋後，通過 預先用緩衝液A (20誦ol/L NaAc-HAc， pH 4.0)平衡過的S印harose SP陽離 子交換柱。然後連續加樣，檢測穿透液的活性，待樹脂飽和後用3倍於柱體積的 緩衝液A洗柱。用緩衝液B (20 mmol/L NaAc-HAc加1 mol/L NaCl， pH4.0)洗 脫。將上述洗脫液加入1/10終體積的溶液E (1%TFA)，而後通過預先用溶液F
(0.1%TFA)平衡的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析樹脂，加樣結束後， 用溶液F衝洗，洗至OD28o值降至基線。用溶液G (80%甲醇+0.P/。TFA)進 行洗脫，應用旋轉蒸發儀，在5(TC條件下，除去洗脫液中的甲醇和TFA,洗脫液 同上調節其pH4.0，經兩次Mono S陽離子交換樹脂得以進一步的純化，最後， 上述洗脫液用同樣方法經疏水層析樹脂除鹽,再經同上條件的旋轉蒸發後，除去 洗脫液中的甲醇和TFA。得到純品，純化率可達95%(圖1)。
實施例2:重組人彈力素對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎的治療作用
1、 急性胰腺炎動物模型的建立
大鼠禁食12 h後,用10 %水合氯醛(3 ml/ kg)腹腔注射麻醉。麻醉顯效後， 切開腹腔並暴露胰腺，在靠近肝門處用無損傷動脈夾夾閉膽胰管，在膽胰管距十 二指腸壁2mm處插入4.5號針頭並夾閉十二指腸側膽胰管，再向膽胰管內勻速 注入3.5 %牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/ kg體重)，注射完畢後放開兩端動脈夾,關閉腹 腔。假手術組不注入牛磺膽酸鈉，僅注入等體積生理鹽水。
2、 動物分組及給藥
取Wistar大鼠60隻(體重220 250g,雌雄各半)，隨機分為6組，每組 10隻第1組為僅剖腹組(假手術組)股靜脈注射等體積生理鹽水。第2組為 急性胰腺炎模型組(模型組)股靜脈注射等體積生理鹽水。第3組為彈力素小 劑量組股靜脈注射彈力素(5RJ/kg)。第4組為彈力素中劑量組股靜脈注射 彈力素(10IU/kg)。第5組為彈力素大劑量組股靜脈注射彈力素(20IU/kg)。
第6組為抑肽酶組(陽性組)股靜脈注射抑肽酶40000幻U/kg。
於模型建立後，第3 5組大鼠經股靜脈注射彈力素，第6組大鼠股靜脈注 射抑肽酶，每8小時給藥一次，連續6次。第1 2組注入等體積生理鹽水。於 模型建立後48小時後，3%戊巴比妥麻醉，腹主動脈採血。
3、樣品製備和檢測
造成模型後48h再次麻醉並切開腹腔，觀察腹腔滲液性質，並稱量和計算腹 腔滲出液的量。腹主動脈採血分離血清，測定血清中澱粉酶、脂肪酶、 一氧化氮、 LPO和SOD含量。取同部位胰腺組織製成10%胰腺組織勻漿，用於測定組織蛋 白含量及組織中澱粉酶、脂肪酶及LPO和SOD含量。另取剩餘胰腺製備病理切 片進行光學和電鏡病理學觀察。同時，以免疫組化方法檢測胰腺組織NF-KB的 表達和活性水平。
(1) 蛋白質含量分析蛋白質分子具有^113+基團，當棕紅色的CBBcj2M)
顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，〔88(}25染料上的陰離子與蛋白^}13+結合， 使溶液變為藍色，通過測吸光度可按照下列公式計算出蛋白含量。
蛋白含量(g/L)=測定管吸光度標準管吸光度x標準管濃度
(2) 血清酶的測定
A、 血清澱粉酶的測定取血清50pl，用日本東芝一2700型全自動生化分析 儀測定血清澱粉酶。
B、 胰腺組織澱粉酶的測定腹主動脈取血後，取胰腺組織製成10%的勻漿， 離心取上清5(Hil，用日本東芝一2700型全自動生化分析儀測定胰腺組織澱粉酶。
C、 血清和胰腺組織脂肪酶的測定
取血清50pl，用脂肪酶測試盒(南京建成生物工程研究所提供)測定脂肪酶 含量並按下列公式計算脂肪酶活力。 脂肪酶活力(U/L)=(測定管吸光度,一測定管吸光度2) + (標準管吸光度值) x標準管濃度(^riol/L) x樣本在反應體系中的稀釋倍數+反應時間 腹主動脈取血後，取同一部位的胰腺組織加冷的生理鹽水製成10%的勻漿， 離心收集上清50pl，按照脂肪酶測試盒(南京建成生物工程研究所提供)的使用 說明書測定脂肪酶含量。
胰腺組織脂肪酶活力=(測定管吸光度l一測定管吸光度2) + (標準管吸光度值) (U/gprot)標準管的濃度(pmol/L) x樣本在反應體系中的稀釋倍數+ 反應時間+待測液蛋白濃度(gprot/L)
(3)血清一氧化氮的測定 腹主動脈取血，離心(3500rpm) 10分鐘，取血清O.lml。用南京建成生物 工程研究所提供的一氧化氮測試盒測定一氧化氮含量。原理NO化學性質活潑， 在體內代謝很快轉為NO,和N03—,而N02—又進一步轉化為N03—，本法利用 硝酸還原酶特異性將N03—還原為N02—，通過顯色深淺按下列公式計算濃度。 NO含量(pmol/L)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)+ (標準管吸光度一 標準空白管吸光度)x標準品濃度x樣品測試前稀釋倍數 (4)血清和胰腺組織LPO含量測定 按照丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)說明書 測定LPO含量並計算血清LPO含量 血清LPO含量(測定管吸光度-測定空白管吸光度)+ (標準管吸光度-標準空
白管吸光度)x標準品濃度x樣品測試前稀釋倍數。 胰腺組織中1^0含量=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)+ (標準管吸光度-標準空白管吸光度)x標準品濃度+蛋白含量。 (5)血清和胰腺組織SOD活性的測定 按照SOD測試盒(南京建成生物工程研究所提供)說明書所述方法進行血 清和胰腺組織中SOD活性的測定和SOD活性計算。
血清SOD:(對照管吸光度-測定管吸光度)+對照管吸光度+50%><稀釋倍數 胰腺組織勻漿SOD:(對照管吸光度-測定管吸光度)+對照管吸光度+50%x 反應液總體積+取樣量(ml) +組織中蛋白含量
(6) 胰腺病理組織學檢查
常規植被胰腺病理組織切片並染色，光學透射電子顯微鏡下觀察各組動物胰 腺組織的形態學改變。
(7) 免疫組化法檢測胰腺組織中NF-kB p65的表達
使用抗k- p65單克隆抗體，以免疫組化SP(鏈黴素抗生物素蛋白一過氧化 酶免疫組化)方法評價胰腺組織的NF- k B活性。該抗體與NF- k B的亞單位p65 區域結合，在正常情況下此區域被抑制蛋白I-kB所覆蓋。當IKB釋放後，抗k -P65單克隆抗體才能結合，因此該抗體能夠在原位識別活化的NF-kB。用PBS 緩衝液取代一抗為陰性對照，所用一抗的稀釋倍數為l: 100。具體歩驟如下以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判斷:細胞漿或胞核染色呈棕黃色為陽
性。陽性積分計算法隨機觀察3個高倍視野，分別計算陽性細胞數N,，總細胞數
N;同時進行陽性細胞著色強度(F)判斷淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，
最終的陽性積分zN,/N xF。
實驗數據以均數士標準差表示(7士S)，藉助SPSS10.0統計軟體對各組均
數進行顯著性檢驗，PO.05具有顯著性差異。
2.結果
(1)彈力素對大鼠急性胰腺炎腹腔滲液量的影響
結果表明假手術組未見血性滲出外，其餘各組均可見明顯不等量的血性滲
出液。模型組與假手術組比較腹腔滲液量明顯增高(PO.001)。彈力素中、高
劑量組與模型組比較腹腔滲液量明顯降低(PO.Ol、 PO.001)，其中彈力素高
劑量組作用優於抑肽酶組(參見表l)。
表l彈力素對大鼠急性胰腺炎腹腔滲液量的影響(f±s,w = 10) H 腹腔滲液量(ml)
與模型組比較*p<0. 05, **p<0. 01， ***p<0. 001
(2)彈力素對大鼠急性胰腺炎血清澱粉酶和脂肪酶的影響
結果表明模型組與假手術組比較血清澱粉酶和脂肪酶明顯增高(PO.OOl)。 表明大鼠急性胰腺炎模型複製成功。與模型組比較，彈力素低、中、高劑量組血 清澱粉酶和脂肪酶明顯降低(P<0.05、 PO.01或P〈0.001)，其中彈力素中劑量 組與抑肽酶組作用相近，大劑量組作用優於抑肽酶組(參見表2)。 表2彈力素對大鼠急性胰腺炎血清澱粉酶和脂肪酶的影響(7±s,w = 10)
組別
假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素 lOIU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
澱粉酶(U/U 2434 ±447*** 5209 ±633 4272 ±672" 3781 ±519'" 3206 ±498"' 3636 ±644"'
脂肪酶(U/L)
0. 413±0, 064*'
1. 587±0. 628 1.058±0. 289 0. 878±0. 369" 0. 760±0. 191*' 0. 833±0. 153*'
與模型組比較*p<0. 05， **p<0. 01， ***p<0. 001
0. 47±0. 10 4. 80±0, 81
5IU/kg 4. 11 ±0.76
lOIU/kg 3. 61 ±0.57
20IU/kg 3. 04 ±0,59
40000KIU/kg 3. 42 ±0.66
* *■ *
經 自
術組素素素酵
手型力力力肽
假模彈彈彈抑(3)彈力素對大鼠急性胰腺炎胰腺組織澱粉酶和脂肪酶的影響
結果表明模型組與假手術組比較胰腺組織澱粉酶和脂肪酶明顯增高 (PO.OO])。與模型組比較，彈力素低、中、高劑量組胰腺組織澱粉酶和脂肪酶
明顯降低(P<0.05、 PO.01或PO.OOl)，其中彈力素中高劑量組與抑肽酶組作 用相近(參見表3)。
表3彈力素對大鼠急性胰腺炎胰腺組織澱粉酶和脂肪酶的影響(7±s,w = 10)
組別
假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素lOIU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
澱粉酶(U/gprot) 15378 士1709一 33917±6497 28718 ±4464' 27087±3123" 3206±498w 25791 ±2819**
脂肪酶(U/gprot) 211 ±24*** 439 ±66 390±47 359 ±58' 319 ±48*'* 350 ±84*
與模型組比較*p<0.05, **p<0. 01，林承p〈0. 001
(4)彈力素對大鼠急性胰腺炎血清和胰腺組織SOD的影響
結果表明模型組與假手術組比較血清和胰腺組織SOD含量明顯降低
(PO.001 )。與模型組比較，彈力素中、高劑量組血清SOD含量明顯升高(P<0.05、 PO.01 )，彈力素低、中、高劑量組胰腺組織SOD含量明顯升高(P0.05、 P<0.01 )， 其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作用相近(參見表4)。
表4彈力素對大鼠急性胰腺炎血清和胰腺組織SOD的影響(3f ±= 10)
組別
假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素 lOIU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
血清S0D(nmo1/1) 236 ±58" 172±24 198 ±32 205 ±21" 212±17** ' 208 ±17"
組織S0D(nmol/g wet wt) 28. 0±4. 5*** 18. 8±3. 1 21.3±4. 4* 23. 2±2. 9* 25. 1±3. 9** 23. 0±3. 2*
與模型組比較*p<0. 05, **p<0. 01， ***p<0. 001
(5)彈力素對大鼠急性胰腺炎血清和胰腺組織LPO的影響
結果表明模型組與假手術組比較血清和胰腺組織LPO含量明顯降低 (PO.OOl)。與模型組比較，彈力素中、高劑量組血清LPO含量明顯降低 (P<0.05)，彈力素中、高劑量組胰腺組織LPO含量明顯降低(參見表5)。
表5彈力素對大鼠急性胰腺炎血清和胰腺組織LPO的影響(jf±s,"=10)
組別
假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素 10IU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
血清LPO(,Vl)
9. 1±0. 7*" 12. 7±1. 5 11. 1±1, 3
10. 39±1. 3* 10. 03±0. 7" 10. l土l.(T
組織LPO(nmol/g wet wt)
2. 2±0. 3 **'
3. 4±0.5 2. 9±0. 5 2. 7±0. 5* 2. 5±0. 3" 2. 7±0. 5"
與模型組比較*p<0. 05, **p<0, 01, ***p<0. 001
(6)彈力素對大鼠急性胰腺炎血清一氧化氮的影響
結果表明模型組與假手術組比較血清一氧化氮明顯增高(PO.OOl)。與模 型組比較，彈力素中、高劑量組血清一氧化氮明顯降低(P<0.05、 P<0.01), 其中彈力素中劑量組與抑肽酶組作用相近(參見表6)。
表6彈力素對大鼠急性胰腺炎血清一氧化氮的影響(7±&" = 10)
組別
NO (腦l/ral)
假手術組35, 1±3. 3***
模型組76, 5±12. 8
彈力素5IU/kg66.8±13. 9
彈力素 10IU/kg62. 2 ±15. 8*
彈力素20IU/kg52. 3 ±16. 7"
抑肽酶組40000KIU/kg60. 7±15. 3*
與模型組比較*p<0. 05, **p<0. 01， ***p<0. 001
(7)彈力素對大鼠急性胰腺炎胰腺組織NF-KBp65蛋白的變化
陽性染色分布在胞漿和胞核，以胞漿為主。模型組與假手術組比較， NF-kB p65表達明顯增強，差異有顯著性(PO.Ol)。與模型組比較，小劑量組 陽性染色程度減弱(P<0.05)，彈力素中、高劑量組陽性染色程度顯著漸弱，差 異有顯著性(PO.Ol)。其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作用相近(參見表7)。 表7彈力素對大鼠急性胰腺炎胰腺組織NF-KBp65蛋白的變化(3f±s,w = 10)
組別 NF-kB p65
假手術組0. 14 ±0. 03"*
模型組0. 86 ±0. 28
彈力素5IU/kg0. 65 ±0. 29
彈力素 lOIU/kg0. 63 ±0. 24*
彈力素20IU/kg0. 58 ±0. 28"
抑肽酶組40000KIU/kg0. 56±0. 31*
與模型組比較*p<0. 05， **p<0. 01， ***p<0. 001
(8)彈力素對大鼠急性胰腺炎胰腺組織病理性改變的影響
光鏡下可見，假手術組動物的胰腺實質的外分泌部及內分泌部結構正常， 胞漿淺粉色，核圓染色深。細胞形態清晰(圖2)。模型組胰腺腺泡呈大片凝固 性壞死，小葉結構破壞，界限模糊不清，間質小血管壁也有壞死。在壞死的胰腺 組織內及周圍可見大片出血灶，中性及單核細胞浸潤(圖3)。大、中、小劑量 治療組可見胰腺組織結構清晰，小葉間隔為疏鬆結締組織，間質輕微水腫，少量 炎細胞浸潤，血管變化不明顯。胰腺實質結構正常，無壞死，外分泌的細胞染色 較深，核圓染色深(圖4)。對照藥物抑肽酶組可見胰腺細胞結構完整，細胞結 構清楚，小葉界限明確，無壞死，間質無炎性細胞浸潤及水腫，外分泌部及內分 泌部結構正常，核圓染色深(圖5)。
電鏡下觀察可見，胰腺炎假手術組腺泡細胞和核仁正常，核邊緣消失。可見 細胞連接，分泌顆粒多而大。腺泡細胞，胞質內可見線粒體，粗面內質網，高爾 基體，下部分泌顆粒，細胞連接清晰(圖6)。胰腺炎模型組可見壞死腺細胞， 核空化，腫脹。大量炎細胞，壞死的組織碎片。周圍有中性粒細胞浸潤(圖7)。
彈力素小、中和大劑量組可見核不規則，內質網擴張，可見腺胞細胞輪廓，腺泡
分泌顆粒明顯減少。核輕度緻密狀。細胞雙核，胞質粗面內質網增多。腺細胞頂
部分，周圍間質毛細血管清晰，腺泡小，炎細胞明顯減少(圖8)。
本實驗通過膽胰管逆行注入牛磺膽酸鈉建立大鼠急性胰腺炎模型，觀察了
彈力素對急性胰腺炎的影響，得出如下結論
1.彈力素能明顯降低急性胰腺炎大鼠血清和胰腺組織的澱粉酶和脂肪酶，
表明其具有抑制蛋白酶活性。2.彈力素能使急性胰腺炎大鼠血清和肝組織LPO 含量明顯降低，SOD活性明顯升高，提示其可通過抑制脂質過氧化物的產生及 提高自身的抗氧化酶活性。3.彈力素能明顯抑制急性胰腺炎大鼠血清NO的釋 放，阻止細胞炎症因子與白細胞之間的相互作用，減輕急性胰腺炎的發展。4.從
病理學觀察，彈力素能明顯減輕急性胰腺炎大鼠胰腺組織的水腫、出血及壞死， 提示其具有促進機體修復和保護器官的作用。
綜上所述，彈力素能明顯抑制急性胰腺炎胰酶的分泌和釋放，同時通過抑制 炎症介質和細胞因子的釋放，發揮彈力素治療急性胰腺炎的作用。
實施例3:重組人彈力素對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷的治療作用
1、 急性胰腺炎動物模型的建立
大鼠術前禁食12 h ,不禁水,用10 %水合氯醛(3 ml/ kg)腹腔注射麻醉。麻醉 顯效後,常規消毒鋪巾,腹正中切口逐層切開入腹,於十二指腸內側找到片狀分布 的胰腺,在靠近肝門處用無損傷動脈夾夾閉膽胰管，在膽胰管距十二指腸壁2 mm 處用4. 5號針尖逆行進針,進入膽胰管後,用無損傷金屬夾夾閉十二指腸側膽胰 管，再以0. 2ml/ min的速度向膽胰管內勻速注入3.5 %牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/ kg 體重)，注射完畢,停留5min後拔針,並放開兩端動脈夾,連續縫合關閉腹腔。假手 術組不注入牛磺膽酸鈉，僅膽胰管注入等量生理鹽水。
2、 動物分組及給藥
取Wistar大鼠60隻(體重220 250g，雌雄各半)，隨機分為6組，每組 10隻第1組為僅剖腹組(假手術組)股靜脈注射等量生理鹽水。第2組為急 性胰腺炎模型組(模型組)股靜脈注射等量生理鹽水。第3組為彈力素小劑量
組股靜脈注射彈力素5IU/kg。第4組為彈力素中劑量組股靜脈注射彈力素
10IU/kg。第5組為彈力素大劑量組股靜脈注射彈力素20IU/kg。第6組為抑肽 酶組(陽性組)股靜脈注射抑肽酶40000 KlU/kg。
於模型建立後，第3 5組大鼠經股靜脈注射彈力素，第6組大鼠股靜脈注 射抑肽酶，每8小時給藥一次，連續6次。第1 2組注入等量生理鹽水。於模 型建立後48小時後，3%戊巴比妥麻醉，腹主動脈採血。 3、組織樣品的製備和檢測
各組動物取血後，取左肺葉稱溼質量，置60。C烤箱連續烘烤24h，去除水 分稱肺幹質量，計算肺溼/幹質量比值。然後解剖胸腔暴露肺，夾閉右肺下葉支 氣管。自主支氣管插管灌入無菌生理鹽水，每次8ml，共5次，收集灌洗液。取 少量灌洗液，以考馬斯亮蘭法測定支氣管肺泡灌洗液蛋白含量。
(1) 肺組織勻漿髓過氧化物酶(MPO)測定取同一部位肺組織100mg制 成10%的肺組織勻漿，用於測定組織蛋白含量及組織中MPO的含量。
(2) 肺組織勻漿腫瘤壞死因子的測定取10%的肺組織勻漿，採用雙抗體 夾心ABC-ELISA法，按照腫瘤壞死因子檢測試劑盒(上海森雄科技實業公司)
測定腫瘤壞死因子。
(3) 肺組織光鏡觀察取同一部位肺組織，12%甲醛溶液固定後，製備病 理切片觀察肺組織病理變化。
實驗數據以均數土標準差表示(X土S)，通過SPSSIO. O統計軟體統計，採 用單因素方差分析，對各組均數進行顯著性檢驗，PO.05具有顯著性差異。 4、結果
(1 )彈力素對大鼠急性胰腺炎肺幹/溼重比值的影響
結果顯示，模型組與假手術組比較肺乾濕重比值明顯增高(P<0.001)。彈 力素低、中、高劑量組與模型組比較肺乾濕重比值明顯降低(P<0.05、 PO.Ol、 PO.001)，其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作用相近(參見表8)。
表8彈力素對大鼠急性胰腺炎肺損傷肺乾濕重比值的影響(3f ± = 10)
組另ij Lung wet/dry ratio
假手術組5. 15 ±1. 19
模型組6. 99±1, 54
彈力素5IU/kg6. 03±2.01*
彈力素10IU/kg5. 71 ±1. 61"
彈力素20IU/kg5. 38±1. 59***
抑肽酶組40000KIU/kg5. 75 ±1. 41***
與模型組比較*p<0, 05, **p<0. 01, ***p<0. 001
(2)彈力素對大鼠急性胰腺炎肺支氣管肺泡灌洗液蛋白含量(BLAF)的影
響
結果表明模型組與假手術組比較支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯升高 (PO.OOl)。與模型組比較，彈力素低、中、高劑量組支氣管肺泡灌洗液蛋白含
量明顯降低(P<0.05、 PO.Ol或PO.OOl)，其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作 用相近(參見表9)。
表9彈力素對大鼠急性胰腺炎肺BLAF的影響(5±s,w = 10)
組別BLAF mg/L
假手術組28. 51 ±9, 7『
模型組50. 15±17. 54
彈力素5IU/kg41.83±2. 01*
彈力素lOIU/kg38. 09±1.61"
彈力素20IU/kg36. 28 ±1. 59***
抑肽酶組40000KIU/kg38. 55±1.4廣*
與模型組比較*p<0. 05， **p<0. 01， ***p<0. 001
(3)彈力素對大鼠急性胰腺炎肺組織髓過氧化物酶(MPO)的影響 結果顯示，模型組與假手術組比較肺組織髓過氧化物酶MPO明顯升高 (PO.OOl)。與模型組比較，彈力素低、中、高劑量組支氣管肺組織MPO明顯 降低(P<0.05、 PO.01或PO.OOl)，其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作用相近 (參見表10)。
表10彈力素對大鼠急性胰腺炎肺組織MPO的影響(3^±s，n = 10) 組別 MPO U/g
~假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素10IU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
與模型組比較*p<0. 05, **p<0. 01， ***p<0. 001
(4)彈力素對大鼠急性胰腺炎肺組織勻漿腫瘤壞死因子的影響 結果顯示，模型組與假手術組比較肺組織勻漿腫瘤壞死因子明顯增高 (PO.OOl)。與模型組比較，彈力素中、高劑量組血清腫瘤壞死因子明顯降低 (P<0.05、 PO.Ol)，其中彈力素高劑量組與抑肽酶組作用相近(參見表ll)。
表11彈力素對大鼠急性胰腺炎肺組織勻漿TNF-d的的影響(i土s，w-10)
組另j_TNF-a (證ol/gpro)_
~~假手術組 模型組
彈力素5IU/kg 彈力素10IU/kg 彈力素20IU/kg 抑肽酶組40000KIU/kg
與模型組比較*p<0. 05，林p〈0.01， ***p<0. 001
(5)彈力素對大鼠急性胰腺炎肺組織病理性改變的影響 組織學檢査結果可見，假手術組肺組織結構清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內偶見巨 噬細胞，未見中性粒細胞浸潤(圖9)。模型組肺間質可見大量中性粒細胞浸 潤，以血管和小支氣管周圍最明顯；肺組織水腫加重、部分肺泡滲出嚴重、腔內 可見積液和中性白細胞，肺泡間隔明顯增寬，可見肺泡萎縮或擴張融合成肺大泡、 肺泡破裂等結構破壞表現，呈現肺組織實性變和部分囊泡樣變並存的現象(圖
0. 37±0. 16' 1.34±0. 44 0. 93±2. 01' 0.81土1.61' 0. 76±1. 59' 0. 79士1.41'
0. 14±0. 05' 0. 65±0. 34 0, 53±2. 01' 0. 49±2. 11' 0. 45士1.97' 0. 48±2. 41'
10)。
大、中、小劑量治療組可見間質毛細血管高度充血。肺泡結構尚完整，炎症
細胞輕度浸潤，間隔明顯變薄。對照藥物抑肽酶組可見肺泡結構尚完整，間隔明
顯變薄，肺泡腔縮小(圖11和12)。
本實驗通過膽胰管逆行注入牛磺膽酸鈉建立大鼠急性胰腺炎模型，觀察了彈
力素對急性胰腺炎肺損傷的影響，得出如下結論
1.彈力素能明顯降低急性胰腺炎大鼠肺乾濕重比值。2.能使急性胰腺炎大
鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯降低。3.使急性胰腺炎大鼠肺組織髓過氧化 物酶MPO明顯降低。4.彈力素可明顯抑制急性胰腺炎大鼠肺組織勻漿TNF-a 的釋放，阻止細胞炎症因子與白細胞之間的相互作用，減輕急性胰腺炎的發展。 5.從病理學觀察，彈力素能明顯減輕急性胰腺炎大鼠肺組織的炎細胞浸潤、出 血及壞死，提示其具有促進機體修復和保護器官的作用。
綜上所述，彈力素能明顯明顯降低急性胰腺炎大鼠肺乾濕重比值，使急性胰 腺炎大鼠支氣管肺泡灌洗液蛋白含量明顯降低，大鼠肺組織髓過氧化物酶MPO 活性降低，抑制急性胰腺炎大鼠肺組織勻漿TNF-a的釋放，同時通過抑制炎症 介質和細胞因子的釋放，發揮彈力素治療急性胰腺炎的作用。序歹U表
吉林聖元科技有限公司 彈力素的重組製備和應用
4 1 26 DNA 人工序列
根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。 1
CGATCTAGAG CGCAAGAGCC AGTCAA
2 26 DNA 人工序列
根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。 2
GCTAAGCTTC TGGGGAACGA AACAGG
3 31 DNA 人工序列
根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。 3
AGCCTCGAGA AGAGAGCGCA AGAGCCAGTC A
4
31 DNA 人工序列
根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。 4
GCGTCTAGAT TACTGGGGAA CGAAACAGGC C
權利要求
1、生產彈力素的方法，特徵在於所說的彈力素是在畢赤巴斯特德酵母表達系統中分泌表達產生的。
2、 一種由根據權利要求1的彈力素以及一種或多種醫藥上可接受的載體或 賦形劑組成的藥物組合物。
3、 重組人彈力素在生產用於治療急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷的藥 物中應用。
全文摘要
本發明涉及蛋白酶抑制劑的製備和應用，特別是涉及彈力素(Elafin)在酵母細胞表達系統中的高效分泌表達和其在生產用於預防和治療急性胰腺炎和急性胰腺炎合併肺損傷的藥物中應用，本發明進一步涉及以重組人彈力素為基本活性成分的藥物組合物。
文檔編號C07K14/81GK101338281SQ200710055838
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月4日 優先權日2007年7月4日
發明者張馨木, 顏煒群 申請人:吉林聖元科技有限責任公司